ES2860952T3

ES2860952T3 - Proteína anti-garp y usos de la misma

Info

Publication number: ES2860952T3
Application number: ES14748185T
Authority: ES
Inventors: Sophie Lucas; Pierre Coulie; Villasur Julia Cuende; Laure Dumoutier; Jean-Christophe Renauld; Der Woning Sebastian Van; Michael Saunders; Haard Hans De; Boeck Gitte De
Original assignee: Universite Catholique de Louvain UCL; ArgenX BVBA; Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Current assignee: Universite Catholique de Louvain UCL; ArgenX BVBA; Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2021-10-05
Anticipated expiration: 2034-08-01
Also published as: ZA201601085B; IL276106A; MX377091B; KR102362609B1; US20200181276A1; IL243899B; IL243899A0; CN105658666A; US10822424B2; JP2022070946A; US20160251438A1; MX2016001356A; SG11201600741SA; AU2019268046A1; US20160272717A1; JP2016529892A; CA2919765C; EA035550B1; KR20160056880A; MX2019011952A

Abstract

Un anticuerpo que se une a un complejo de glicoproteína A en repeticiones predominantes humana (hGARP) y TGF-β1 latente, en donde el anticuerpo se une a un epítopo que comprende los restos Y137, S138 y G139 de la secuencia de aminoácidos de hGARP de la SEQ ID NO: 1 cuando GARP forma un complejo con TGF-β1 latente.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína anti-GARP y usos de la misma

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una proteína contra la glicoproteína A en repeticiones predominantes (GARP) humana que inhibe la señalización de TGF-p. La presente invención también se refiere al tratamiento de trastornos inmunitarios y enfermedades como cáncer.

Antecedentes de la invención

Desde la identificación molecular de los primeros antígenos tumorales humanos a principios de la década de 1990, se completaron varios ensayos clínicos para evaluar los efectos de la vacunación terapéutica de pacientes con cáncer con antígenos específicos de tumores compartidos (Boon, T. et al. Annu. Rev. Immunol. 2006, 24:175-208). Se observó evidencia de regresión tumoral en aproximadamente el 20 % de los pacientes, con respuestas clínicas objetivas en 5 10 %. Por lo tanto, la vacunación con antígenos específicos de tumores representa una nueva terapia prometedora para el tratamiento del cáncer. Se necesitan estrategias para mejorar la proporción de pacientes que responden a la vacunación. El principal factor limitante de la eficacia clínica de las vacunas terapéuticas contra el cáncer actuales no parece ser la vacuna en sí, sino factores locales que controlan el microambiente tumoral en el que tienen que trabajar los linfocitos T antitumorales.

Los linfocitos T reguladores, o Treg, son un subconjunto de linfocitos T CD4+ especializados en la inhibición de respuestas inmunitarias. La función Treg insuficiente da como resultado patología autoinmunitaria, mientras que la función excesiva de Treg puede inhibir las respuestas inmunitarias antitumorales en pacientes con cáncer. Los mecanismos exactos por los cuales los Treg inhiben las respuestas inmunitarias no se comprenden completamente.

Debido a sus funciones inmunosupresoras, los Treg representan posibles inhibidores de respuestas inmunitarias antitumorales espontáneas o inducidas por vacunas. En modelos murinos, el agotamiento de los Treg puede mejorar las respuestas inmunitarias contra tumores experimentales (Colombo et al. Nat. Rev. Cancer 2007, 7:880-887). Por tanto, el direccionamiento a los T reg en seres humanos podría mejorar la eficacia de la inmunoterapia contra el cáncer.

Como los inventores demostraron previamente que TGF-p activo se produce por Treg humanos, pero no por otros tipos de linfocitos T humanos (Stockis, J. et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39:869-882), TGF-p podría ser una diana de interés.

Sin embargo, los anticuerpos contra hTGF-p no resultaron prometedores. Se han realizado ensayos clínicos de fase 1 en glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS, por sus siglas en inglés), fibrosis pulmonar idiopática (IPF, por sus siglas en inglés) y melanoma maligno avanzado o carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés) (Lonning S et al. Current Pharmaceutical Biotechnology 2011, 12:2176-2189). Dependiendo del ensayo, se observaron eventos adversos en algunos pacientes. Las principales reacciones adversas notificadas consistieron en la aparición de queratoacantoma (KA) y carcinoma de células escamosas (SCC, por sus siglas en inglés) en pacientes con melanoma. Es posible que las lesiones de KA o SCC en pacientes con melanoma evolucionaran a partir de células precancerosas cuya proliferación estaba inhibiéndose por TGF-p endógeno (Lonning S et al. Current Pharmaceutical Biotechnology 2011, 12:2176-2189). Por lo tanto, una de las principales preocupaciones con respecto al uso de anticuerpos anti-TGF-p en el contexto del cáncer es que pueden favorecer la aparición de nuevas lesiones neoplásicas, debido a la inhibición del efecto supresor de tumores que ejerce TGF-p endógeno sobre las células precancerosas. La técnica anterior muestra que TGF-p1 latente puede inmunoprecipitarse junto con GARP, utilizando anticuerpos disponibles comercialmente producidos contra los componentes individuales de dicho complejo (Stockis J et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39(12):3315-3322; Wang R et al. Mol. Biol. Cell, 2012, 23(6):1129-1139).

Un objeto de la invención es proporcionar una nueva estrategia para mejorar el tratamiento contra el cáncer dirigiéndose a los Treg a través de su producción de TGF-p.

Anteriormente se demostró que la producción de TGF-p está estrictamente regulada por un proceso de varias etapas. El precursor denominado pro-TGF-p1 se homodimeriza antes de la escisión por la proproteína convertasa FURlN. El producto resultante se llama TGF-p1 latente, en el que el fragmento carboxiterminal, o TGF-p1 maduro, permanece unido de forma no covalente al fragmento aminoterminal conocido como péptido asociado a latencia, o lAp (por sus siglas en inglés). Este complejo latente es inactivo porque LAP evita que el TGF-p1 maduro se una a su receptor.

En la presente invención, los inventores muestran que el TGF-p latente se une a la superficie de los Treg a través de la proteína transmembrana GARP (glicoproteína A en repeticiones predominantes).

Por tanto, la presente invención tiene como objetivo proporcionar una nueva estrategia para dirigirse a Treg basándose en una proteína anti-GARP que inhibe la señalización de TGF-p.

Sumario

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un anticuerpo que se une a un complejo de glicoproteína A en repeticiones predominantes humana (hGARP) y TGF-p1 latente, en donde el anticuerpo se une a un epítopo que comprende los restos Y137, S138 y G139 de la secuencia de aminoácidos de hGARP de la SEQ ID NO: 1 cuando GARP forma un complejo con TGF-p1 latente.

Un objeto de la divulgación es una proteína que se une a la glicoproteína A en repeticiones predominantes (GARP) en presencia de TGF-p. En un aspecto, dicha proteína se une a GARP solamente en presencia de TGF-p. En otro aspecto, dicha proteína se une a GARP cuando GARP forma un complejo con TGF-p. En otro aspecto, dicha proteína se une a un complejo de GARP y TGF-p.

Los presentes inventores describen que dicha proteína puede ser una molécula de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo completo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo monocatenario dimérico, un Fv, un Fab, un F(ab)'2, un anticuerpo defucosilado, un anticuerpo biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo.

En otra divulgación, dicha proteína es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un unicuerpo, un dominio de anticuerpos y un nanocuerpo.

En otra divulgación, dicha proteína es un mimético de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un aficuerpo, una afilina, una afitina, una adnectina, una atrimer, una evasina, una DARPin, una anticalina, un avímero, un finómero, versacuerpo y duocalina.

Otro aspecto de la divulgación es una proteína como se describe anteriormente en el presente documento o una proteína que se une a GARP e inhibe la señalización de TGF-p.

En un aspecto de la divulgación, dicha proteína es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo conformacional que comprende uno o más aminoácidos de GARP o un epítopo de GARP modificado como resultado de formar GARP un complejo con TGF-p latente.

En otro aspecto, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une además a uno o más aminoácidos de TGF-p latente. En otro aspecto, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo que comprende uno o más restos de 101 a 141 restos de GARP como se establece en la SEQ ID NO: 1.

También se describe una proteína que tiene la región variable de la cadena pesada que comprende al menos una de las siguientes CDR:

VH-CDR1: GFSLTGYGIN (SEQ ID NO: 2) o GYGIN (SEQ ID NO: 52);

VH-CDR2: MIWSDGSTDYNSVLTS (SEQ ID NO: 3); y

VH-CDR3: DRNYYDYDGAMDY (SEQ ID NO: 4),

o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 2-4 o 52,

o que tenga la región variable de cadena ligera que comprende al menos una de las siguientes CDR:

VL-CDR1: KASDHIKNWLA (SEQ ID NO: 5);

VL-CDR2: GATSLEA (SEQ ID NO: 6); y

VL-CDR3: QQYWSTPWT (SEQ ID NO: 7),

o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 5- 7;

o la región variable de cadena pesada comprende al menos una de las siguientes CDR:

VH-CDR1: SYYID (SEQ ID NO: 13);

VH-CDR2: RIDPEDGGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 14);

VH-CDR3: o NEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 15),

o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 13- 15;

o en donde la región variable de la cadena ligera comprende al menos una de las siguientes CDR:

VL-CDR1: QASQX1IX2SX3LA (SEQ ID NO: 16), en donde X1 es S o T, X2 es S o V, X3 es Y o F;

VL-CDR2: X1X2SX3X4X5T (SEQ ID NO: 17), en donde X1 es G o R; X2 es A o T; X3 es R o I; X4 es L o P; X5 es Q o K;

VL-CDR3: QQYX1SX2PX3T, en donde X1 es D, A, Y o V; X2 es A, L o V; X3 es V o P (SEQ ID NO: 18); o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 16-18.

También se describe que, la región variable de la cadena pesada puede comprender al menos una de las siguientes CDR:

VH-CDR1: GFSLTGYGIN (SEQ ID NO: 2) o GYGIN (SEQ ID NO: 52);

VH-CDR2: MIWSDGSTDYNSVLTS (SEQ ID NO: 3); y

VH-CDR3: DRNYYDYDGAMDY (SEQ ID NO: 4),

y la región variable de cadena ligera comprende al menos una de las siguientes CDR:

VL-CDR1: KASDHIKNWLA (SEQ ID NO: 5);

VL-CDR2: GATSLEA (SEQ ID NO: 6); y

VL-CDR3: QQYWSTPWT (SEQ ID NO: 7),

VH-CDR1: SYYID (SEQ ID NO: 13);

VH-CDR2: RIDPEDGGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 14);

VH-CDR3: o NEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 15);

o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 13-15,

VL-CDR3: QQYX1SX2PX3T, en donde X1 es D, A, Y o V; X2 es A, L o V; X3 es V o P (SEQ ID NO: 18);

o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 16-18.

En otra divulgación, la región variable de cadena pesada comprende las siguientes CDR: GFSLTGYGIN (SEQ ID NO: 2), MIWSDGSTDYNSVLTS (SEQ ID NO: 3), DRNYYDYDGAMDY (SEQ ID NO: 4) y la región variable de cadena ligera comprende las siguientes CDR: KASDHIKNWLA (SEQ ID NO: 5), GATSLEA (SEQ ID NO: 6), QQYWSTPWT (SEQ ID NO: 7) o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con dicha SEQ ID NO: 2-7;

o la región variable de cadena pesada comprende las siguientes CDR: GYGIN (SEQ ID NO: 52), MIWSDGSTDYNSVLTS (SEQ ID NO: 3), DRNYYDYDGAMDY (SEQ ID NO: 4) y la región variable de cadena ligera comprende las siguientes CDR: KASDHIKNWLA (SEQ ID NO: 5), GATSLEA (SEQ ID NO: 6), QQYWSTPWT (SEQ ID NO: 7) o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con dicha SEQ ID NO: 52 y 3-7; o en donde la región variable de cadena pesada comprende las siguientes CDR: SYYID (SEQ ID NO: 13), RIDPEDGGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 14), o NEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 15); y la región variable de cadena ligera comprende las siguientes C^dR: QASQX1IX2SX3LA (SEQ ID NO: 16), en donde X1 es S o T, X2 es S o V, X3 es Y o F; X1X2SX3X4X5T (SEQ ID NO: 17), en donde X1 es G o R; X2 es A o T; X3 es R o I; X4 es L o P; X5 es Q o K; QQYX1SX2PX3T, en donde X1 es D, A, Y o V; X2 es A, L o V; X3 es V o P (SEQ ID NO: 18); o cualquier CDR que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad con dichas SEQ ID NO: 16-18.

En otra divulgación, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 50 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 51, o la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 34 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera es una de las sEq ID NO: 35-39 o cualquier secuencia que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta al menos el 60 % de identidad. con dichas SEQ ID NO: 8-9, 50 51 o 34-39.

Otro aspecto de la divulgación es una proteína como se define anteriormente en el presente documento que se une a un epítopo en el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 reconocida por un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 8 o en la SEQ ID NO: 50 y una región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 9 o en la SEQ ID NO: 51, o por un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 34 y una de la región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 35-39.

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno producido por un hibridoma registrado con el número de acceso LMBP 10246CB el 30 de mayo de 2013.

Otro aspecto de la divulgación es una secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describe anteriormente en el presente documento.

Otro aspecto de la divulgación es un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación como se describe anteriormente en el presente documento.

Otro aspecto de la divulgación es una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo contra GARP registrado con el número de acceso LMBP 10246CB el 30 de mayo de 2013.

Otro aspecto de la divulgación es una composición farmacéutica que comprende la proteína como se describe anteriormente en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la divulgación es una composición farmacéutica como se describe anteriormente en el presente documento para tratar un trastorno relacionado con TGF-p en un sujeto que lo necesite. En una realización, el trastorno relacionado con TGF-p se selecciona del grupo que consiste en enfermedades inflamatorias, infección crónica, cáncer, fibrosis, enfermedades cardiovasculares, enfermedad cerebrovascular (p. ej., accidente cerebrovascular isquémico) y enfermedades neurodegenerativas.

En otro aspecto, la composición farmacéutica como se describe anteriormente en el presente documento debe administrarse en combinación con otro tratamiento para el cáncer o con otro agente inmunoterapéutico tal como una vacuna antitumoral o un anticuerpo inmunoestimulador. En otra realización, la composición farmacéutica como se describe anteriormente en el presente documento se administrará como un anticuerpo inmunoestimulador para el tratamiento de pacientes con cáncer.

Definiciones

En la presente divulgación, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

"Anticuerpo" o "Inmunoglobulina" - Como se usa en el presente documento, el término "inmunoglobulina" incluye un polipéptido que tiene una combinación de dos cadenas pesadas y dos ligeras, posea o no alguna inmunorreactividad específica pertinente. "Anticuerpos" se refiere a dichos conjuntos que tienen una actividad inmunorreactiva específica conocida significativa para un antígeno de interés (p. ej., GARP humana). La expresión "anticuerpos contra GARP" se usa en el presente documento para referirse a anticuerpos que muestran especificidad inmunitaria por la proteína GARP humana. Como se explica en otra parte en el presente documento, la "especificidad" para GARP humana no excluye la reacción cruzada con especies homólogas de GARP. Además, tampoco excluye los anticuerpos que reconocen un epítopo que abarca restos de proteína GARP y restos de proteína TGF-p. Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente intercadena entre ellos. Las estructuras básicas de inmunoglobulinas en sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien. El término genérico "inmunoglobulina" comprende cinco clases distintas de anticuerpos que pueden distinguirse bioquímicamente. Las cinco clases de anticuerpos están dentro del alcance de la presente invención, el siguiente análisis se dirigirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulinas. Con respecto a IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular aproximadamente 23.000 Dalton y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular de 53.000-70.000 Dalton. Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración "Y" en donde las cadenas ligeras rodean las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable. Las cadenas ligeras de un anticuerpo se clasifican como kappa o lambda ([k], [A]). Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las regiones de la "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, linfocitos B o células hospedadoras modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo N en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el extremo C en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (p. ej., y1 - Y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), p. ej., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la materia en vista de la presente divulgación y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención. Como se indica anteriormente, la región variable de un anticuerpo permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos en antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura cuaternaria de anticuerpo forma el sitio de unión a antígeno presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno está definido por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las cadenas VH y VL.

"Un anticuerpo aislado" - Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo aislado" es uno que se ha separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros componentes proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purifica: (1) hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos del extremo N o internos mediante el uso de un secuenciador de cubeta giratoria; o (3) hasta la homogeneidad como se muestra por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras y usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

"Variantes de afinidad" - Como se usa en el presente documento, la expresión "variante de afinidad" se refiere a un anticuerpo variante que muestra uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en comparación con un anticuerpo contra GARP de referencia, en donde la variante de afinidad muestra una afinidad alterada por la proteína GARP humana o por el complejo GARP/TGF-p en comparación con el anticuerpo de referencia. Generalmente, las variantes de afinidad mostrarán una afinidad mejorada por GARP humana o por el complejo GARP humana/TGF-p, en comparación con el anticuerpo contra GARP de referencia. La mejora puede ser bien una KD menor, para GARP humana, o una constante de disociación más rápida para GARP humana o una alteración en el patrón de reactividad cruzada con homólogos de GARP no humanos. Las variantes de afinidad normalmente muestran uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en las CDR, en comparación con el anticuerpo contra GARP de referencia. Dichas sustituciones pueden dar como resultado el reemplazo del aminoácido original presente en una posición dada en las CDR con un resto de aminoácido diferente, que puede ser un resto de aminoácido de origen natural o un resto de aminoácido de origen no natural. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas.

"Sitio de unión" - Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de unión" comprende una región de un polipéptido que es responsable de la unión selectiva a un antígeno diana de interés (p. ej., GARP humana). Los dominios de unión o las regiones de unión comprenden al menos un sitio de unión. Los dominios de unión ilustrativos incluyen un dominio variable de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpos de la invención pueden comprender un único sitio de unión a antígeno o múltiples (p. ej., dos, tres o cuatro) sitios de unión a antígeno.

"Sustitución de aminoácidos conservativa" - Como se usa en el presente documento, una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que se reemplaza el resto de aminoácido por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, puede reemplazarse un resto de aminoácido no esencial en un polipéptido de inmunoglobulina por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. En otra realización, puede reemplazarse una serie de aminoácidos por una serie estructuralmente similar que difiere en orden y/o composición de los miembros de la familia de cadenas laterales.

"Quimérico/a" - Como se usa en el presente documento, una proteína "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos unida a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no está unida de manera natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se juntan en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Puede crearse una proteína quimérica, por ejemplo, mediante síntesis química o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada. Los anticuerpos contra GARP quiméricos ilustrativos incluyen proteínas de fusión que comprenden dominios VH y VL derivados de camélidos, o variantes humanizadas de los mismos, fusionados a los dominios constantes de un anticuerpo humano, p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas.

"CDR" - Como se usa en el presente documento, el término "CDR" o "región determinante de la complementariedad" significa los sitios de combinación con antígenos no contiguos hallados en la región variable de los polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. Estas regiones particulares se han descrito por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609 6616 (1977) y Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), y por Chothia et al., J. Mol. Biol.

196:90l-9 l7 (1987) y por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) donde las definiciones incluyen restos de aminoácidos solapantes o subconjuntos de estos cuando se comparan entre sí. Los restos de aminoácidos que abarcan las CDR tal como se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a modo de comparación. Preferentemente, el término "CDR" es una CDR como la define Kabat basándose en comparaciones de secuencias.

T l 1: D fini i n DR

"Dominio CH2" - Como se usa en el presente documento, la expresión "dominio CH2" incluye la región de una molécula de cadena pesada que se extiende, p. ej., desde aproximadamente el resto 244 al resto 360 de un anticuerpo usando esquemas de numeración convencionales (restos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y restos 231 340, sistema de numeración EU, Kabat EA et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH. 1991). El dominio CH2 es exclusivo ya que no está emparejado de forma cercana con otro dominio. Más bien, dos cadenas de hidratos de carbono ramificadas unidas a N se interponen entre los dos dominios CH2 de una IgG natural, intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el extremo carboxiterminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 restos.

"Derivado de camélidos" - En determinadas realizaciones preferidas, las moléculas de anticuerpo contra GARP de la invención comprenden secuencias de aminoácidos de la región marco y/o secuencias de aminoácidos de CDR derivadas de un anticuerpo convencional de camélido producido por inmunización activa de un camélido con antígeno GARP. Sin embargo, los anticuerpos contra GARP que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de camélidos pueden modificarse por ingeniería para comprender secuencias marco y/o de regiones constantes derivadas de una secuencia de aminoácidos humana o de otras especies de mamíferos no camélidos. Por ejemplo, una región marco de primates humanos o no humanos, una región de cadena pesada y/o una región de bisagra se pueden incluir en los anticuerpos contra GARP objeto. En una realización, uno o más aminoácidos no de camélidos pueden estar presentes en la región marco de un anticuerpo contra GARP "derivado de camélidos", p. ej., una secuencia de aminoácidos del marco de camélidos puede comprender una o más mutaciones de aminoácidos en las que está presente el correspondiente resto de aminoácido de primate humano o no humano. Por otra parte, los dominios VH y VL derivados de camélidos, o variantes humanizadas de los mismos, puede estar unidos a los dominios constantes de anticuerpos humanos para producir una molécula quimérica, como se describe ampliamente en otra parte en el presente documento.

"Derivado de" - Como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de" una proteína designada (p. ej., un anticuerpo contra GARP o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se refiere al origen del polipéptido. En una realización, el polipéptido o la secuencia de aminoácidos que deriva de un polipéptido de partida particular es una secuencia de CDR o una secuencia relacionada con la misma. En una realización, la secuencia de aminoácidos que deriva de un polipéptido de partida particular no es contigua. Por ejemplo, en una realización, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR derivan de un anticuerpo de partida. En una realización, la secuencia polipeptídica o de aminoácidos que deriva de un polipéptido o secuencia de aminoácidos de partida particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la de la secuencia de partida, o una región de la misma en donde la región consiste en al menos 3-5 aminoácidos, 5-10 aminoácidos, al menos 10-20 aminoácidos, al menos 20-30 aminoácidos o al menos 30-50 aminoácidos o que de otro modo un experto en la materia puede identificar que tiene su origen en la secuencia de partida. En una realización, las una o más secuencias de CDR derivadas del anticuerpo de partida se alteran para producir secuencias de CDR variantes, p. ej., variantes de afinidad, en donde las secuencias de CDR variantes mantienen la actividad de unión a GARP.

"Diacuerpos" - Como se usa en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo de sFv) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10) restos) entre los dominios VH y VL de manera que se logra el emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "cruzados" en los que los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Se describen diacuerpos de manera más completa en, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 93/11161); y Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444-6448 (1993).

"Modificado por ingeniería" - Como se usa en el presente documento, la expresión "modificado por ingeniería" incluye la manipulación de moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos por medios sintéticos (p. ej., mediante técnicas recombinantes, síntesis de péptidos in vitro, por acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas). Preferentemente, los anticuerpos de la invención se encuentran modificados por ingeniería, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos humanizados y/o quiméricos y anticuerpos que se han modificado por ingeniería para mejorar una o más propiedades, tal como la unión al antígeno, la estabilidad/semivida o la función efectora.

"Epítopo" - Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a una disposición específica de aminoácidos localizados en un péptido o proteína o proteínas a las que se une un anticuerpo. Los epítopos, con frecuencia, consisten en agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales, es decir, que implican dos o más secuencias de aminoácidos en diversas regiones del antígeno que pueden no ser necesariamente contiguas.

"Región marco" - La expresión "región marco" o "región FR" como se usa en el presente documento, incluye los restos de aminoácidos que forman parte de la región variable, pero no forman parte de las CDR (p. ej., utilizando la definición de Kabat de CDR). Por lo tanto, una región marco variable tiene entre aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud, pero incluye únicamente a aquellos aminoácidos fuera de las CDR. Para el ejemplo específico de una región variable de cadena pesada y para las CDR definidas por Kabat et al., la región marco 1 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; la región marco 2 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; la región marco 3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94, y la región marco 4 corresponde al dominio de la región variable desde los aminoácidos 103 hasta el final de la región variable. Las regiones marco para la cadena ligera están separadas de manera similar por cada una de las CDR de región variable de cadena ligera. De forma similar, utilizando la definición de CDR de Chothia et al. o McCallum et al. los límites de la región marco están separados por los correspondientes extremos de CDR como se describe anteriormente. En realizaciones preferidas, las CDR son las definidas por Kabat. En los anticuerpos de origen natural, las seis CDR presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias de aminoácidos cortas, no contiguas que se colocan específicamente para formar el sitio de unión a antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los dominios variables pesados y ligeros muestran menos variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan regiones marco. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina [beta] y las CDR forman bucles que conectan y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina [beta]. Por tanto, estas regiones marco actúan para formar un armazón que proporciona el posicionamiento de las seis CDR en la orientación correcta por interacciones intercadena, no covalentes. El sitio de unión a antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al antígeno inmunorreactivo. La posición de las CDR puede identificarse fácilmente por un experto en la materia.

"Fragmento" - Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a una parte o región de un anticuerpo o una cadena de anticuerpo que comprende menos restos de aminoácidos que un anticuerpo o una cadena de anticuerpo intactos o completos. La expresión "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que proceden) por la unión al antígeno (es decir, unión específica a GARP humana). Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" de una molécula de anticuerpo incluye fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, por ejemplo, un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL), un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH), un anticuerpo monocatenario (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento de anticuerpo de dominio único (DAb), un anticuerpo de un solo brazo (monovalente), diacuerpos o cualquier molécula de unión a antígeno formada por combinación, ensamblaje o conjugación de dichos fragmentos de unión a antígeno. Los fragmentos pueden obtenerse, p. ej., mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpo o por medios recombinantes.

"Fv": como se usa en el presente documento, el término "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento del y de unión al antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de ligera en asociación estrecha, no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios, surgen seis bucles hipervariables (tres bucles de la cadena H y tres de la L) que aportan los restos de aminoácidos para la unión al antígeno y confieren al anticuerpo la especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

"Región de cadena pesada": Como se usa en el presente documento, la expresión "región de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de los dominios constantes de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una región de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, una bisagra (p. ej., región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante o fragmento de los mismos. En una realización, una molécula de unión de la invención puede comprender la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina (p. ej., una porción bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En otra realización, una molécula de unión de la invención carece de al menos una región de un dominio constante (p. ej., la totalidad o parte de un dominio CH2). En determinadas realizaciones, al menos uno, y preferentemente todos, los dominios constantes derivan de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, en una realización preferida, la región de cadena pesada comprende un dominio bisagra completamente humano. En otras realizaciones preferidas, la región de cadena pesada que comprende una región Fc completamente humana (p. ej., secuencias de dominios bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana). En determinadas realizaciones, los dominios constantes constituyentes de la región de cadena pesada son de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una región de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH2 derivado de una molécula de IgGI y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3 o IgG4. En otras realizaciones, los dominios constantes son dominios quiméricos que comprenden regiones de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una bisagra puede comprender una primera región de una molécula de IgGI y una segunda región de una molécula de IgG3 o IgG4. Como se expone anteriormente, un experto en la materia entenderá que los dominios constantes de la región de cadena pesada pueden modificarse de manera que varíen en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina de origen natural (tipo silvestre). Es decir, los polipéptidos de la invención divulgados en el presente documento pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los dominios constantes de cadena pesada (CH1, bisagra, CH2 o CH3) y/o en el dominio constante de cadena ligera (CL). Modificaciones ilustrativas incluyen adiciones, eliminaciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios.

"Región bisagra" - Como se usa en el presente documento, la expresión "región bisagra" incluye la región de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 restos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión a antígeno aminoterminales se muevan de manera independiente. Las regiones bisagra se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior (Roux et al. J. Immunol. 1998161:4083).

Las expresiones "bucle hipervariable" y "región determinante de la complementariedad" no son estrictamente sinónimos, debido a que los bucles hipervariables (HV, por sus siglas en inglés) se definen en función de la estructura, mientras que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se definen en función de la variabilidad de secuencia (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983) y los límites de los HV y las CDR pueden ser diferentes en algunos dominios VH y VL. Las CDR de los dominios VL y VH se pueden definir normalmente como que comprenden los siguientes aminoácidos: restos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en el dominio variable de cadena ligera y 31 35 o 31-35b (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en el dominio variable de cadena pesada; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Por tanto, los HV pueden estar incluidos dentro de las CDR correspondientes y las referencias en el presente documento a los "bucles hipervariables" de los dominios VH y VL deben interpretarse como que también abarcan las CDR correspondientes, y viceversa, a menos que se indique lo contrario. Las regiones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR, por sus siglas en inglés), como se define a continuación. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden, cada uno, cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan en gran parte una configuración de lámina [beta], conectados por los tres bucles hipervariables. Los bucles hipervariables en cada cadena se mantienen próximos entre sí por las FR y, con los bucles hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. El análisis estructural de anticuerpos reveló la relación entre la secuencia y la forma del sitio de unión formado por las regiones determinantes de la complementariedad (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)); Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215: 175-182 (1990)). A pesar de su alta variabilidad de secuencia, cinco de los seis bucles adoptan solamente un pequeño repertorio de conformaciones de la cadena principal, llamadas "estructuras canónicas". Estas conformaciones se encuentran determinadas en primer lugar por la longitud de los bucles y, en segundo lugar, por la presencia de restos clave en determinadas posiciones en los bucles y en las regiones marco que determinan la conformación a través de su empaquetamiento, enlaces de hidrógeno o la capacidad de asumir conformaciones inusuales de la cadena principal.

"Sustituciones de humanización" - Como se usa en el presente documento, la expresión "sustituciones de humanización" se refiere a sustituciones de aminoácidos en las que el resto de aminoácido presente en una posición particular en los dominios VH o VL de anticuerpo del anticuerpo contra GARP (por ejemplo, un anticuerpo contra GARP derivado de camélidos) se reemplaza con un resto de aminoácido que se produce en una posición equivalente en un dominio VH o VL humanos de referencia. El dominio VH o VL humano de referencia puede ser un dominio VH o VL codificado por la línea germinal humana, en cuyo caso, los restos sustituidos pueden denominarse "sustituciones de germinalización". Se pueden realizar sustituciones de humanización/germinalización en las regiones marco y/o en las CDR de un anticuerpo contra GARP, definido en el presente documento.

"Alta homología humana" - Se considerará que un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) tiene una alta homología humana si los dominios VH y los dominios VL, considerados en su conjunto, muestran al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana coincidentes más cercanas. Los anticuerpos que tienen una alta homología humana pueden incluir anticuerpos que comprenden dominios VH y VL de anticuerpos no humanos naturales que muestran un % de identidad de secuencia suficientemente alto con secuencias de la línea germinal humana, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos que comprenden dominios VH y VL de anticuerpos convencionales de camélidos, así como variantes modificadas por ingeniería, especialmente humanizadas, de dichos anticuerpos y también anticuerpos "completamente humanos". En una realización, el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana puede mostrar una identidad de secuencia de aminoácidos o una homología de secuencia del 80 % o más con uno o más dominios VH humanos a lo largo de las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4. En otras realizaciones, la identidad de secuencia o la homología de secuencia de aminoácidos entre el dominio VH del polipéptido de la invención y la secuencia del dominio VH de la línea germinal humana de coincidencia más cercana puede ser del 85 % o mayor, 90 % o mayor, 95 % o mayor, 97 % o mayor, o hasta 99 % o incluso 100 %. En una realización, el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana puede contener una o más (p. ej. 1 a 10) faltas de coincidencia de secuencias de aminoácidos a lo largo de las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, en comparación con la secuencia VH humana de coincidencia más cercana. En otra realización, el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana puede mostrar una identidad de secuencia o una homología de secuencia del 80 % o mayor con uno o más dominios VL humanos a lo largo de las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4. En otras realizaciones, la identidad de secuencia o la homología de secuencia de aminoácidos entre el dominio VL del polipéptido de la invención y la secuencia del dominio VL de la línea germinal humana de coincidencia más cercana puede ser del 85 % o mayor o del 90 % o mayor, 95 % o mayor, 97 % o mayor, o hasta 99 % o incluso 100 %.

En una realización, el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana puede contener una o más (p. ej. 1 a 10) faltas de coincidencia de secuencias de aminoácidos a lo largo de las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, en comparación con la secuencia VL humana de coincidencia más cercana. Antes de analizar el porcentaje de identidad de secuencia entre el anticuerpo con alta homología humana y las VH y VL de la línea germinal humana, se pueden determinar los pliegues canónicos, que permiten identificar la familia de segmentos de la línea germinal humana con idéntica combinación de pliegues canónicos para H1 y H2 o L1 y L2 (y L3). Posteriormente, el miembro de la familia de la línea germinal humana que tiene el mayor grado de homología de secuencia con la región variable del anticuerpo de interés se elige para la puntuación de la homología de secuencia. La determinación de las clases canónicas de Chothia de los bucles hipervariables L1, L2, L3, HI y H2 se pueden realizar con las herramientas bioinformáticas disponibles públicamente en la página web www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page. La salida del programa muestra los requisitos clave de los restos en un archivo de datos. En estos archivos de datos, las posiciones clave de los restos se muestran con los aminoácidos permitidos en cada posición. La secuencia de la región variable del anticuerpo de interés se proporciona como entrada y primero se alinea con una secuencia de anticuerpo consenso para asignar el esquema de numeración de Kabat. El análisis de los pliegues canónicos utiliza un conjunto de plantillas de restos clave derivadas de un método automatizado desarrollado por Martin y Thornton (Martin et al., J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Con el segmento V de la línea germinal humana particular conocido, que usa la misma combinación de pliegues canónicos para HI y H2 o L1 y L2 (y L3), se puede determinar el miembro de la familia con la mejor coincidencia en términos de homología de secuencia. Con herramientas bioinformáticas, se puede determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de aminoácidos del marco de los dominios VH y VL del anticuerpo de interés y las secuencias correspondientes codificadas por la línea germinal humana, pero en realidad también se puede aplicar la alineación manual de las secuencias. Las secuencias de inmunoglobulinas humanas se pueden identificar a partir de varias bases de datos de proteínas, tal como VBase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) o la base de datos Pluckthun/Honegger (http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germline s). Para comparar las secuencias humanas con las regiones V de los dominios VH o VL en un anticuerpo de interés, se puede utilizar un algoritmo de alineación de secuencias, tal como el disponible en sitios web como www.expasy.ch/tools/#align, pero también se puede realizar la alineación manual con el conjunto limitado de secuencias. Se seleccionan las secuencias de cadena ligera y pesada de la línea germinal humana de las familias con las mismas combinaciones de pliegues canónicos y con el mayor grado de homología con las regiones marco 1, 2 y 3 de cada cadena y se comparan con la región variable de interés; también se comprueba la FR4 contra las regiones JH y JK o JL de la línea germinal humana. Téngase en cuenta que en el cálculo del porcentaje total de homología de secuencia, los restos de FR1, FR2 y FR3 se evalúan utilizando la secuencia coincidente más cercana de la familia de la línea germinal humana con la combinación idéntica de pliegues canónicos. Solamente se puntúan los restos diferentes de los miembros coincidentes más estrechos u otros miembros de la misma familia con la misma combinación de pliegues canónicos (NB, excluyendo cualquier diferencia codificada por cebador). Sin embargo, con fines de humanización, los restos en regiones marco idénticas a miembros de otras familias de la línea germinal humana, que no tienen la misma combinación de pliegues canónicos, puede considerarse "humanos", a pesar del hecho de que estos se puntúan como "negativos" de acuerdo con las estrictas condiciones descritas anteriormente. Esta suposición se basa en el enfoque "mix and match" para la humanización, en el que cada una de FR1, FR2, FR3 y FR4 se comparan por separado con su secuencia de la línea germinal humana coincidente más cercana y, por lo tanto, la molécula humanizada contiene una combinación de diferentes FR como lo hicieron Qu y sus colegas (Qu et al., Clin. Cancer Res. 5:3095-3100 (1999)) y Ono y colegas (Ono et al., Mol. Immunol. 36:387-395 (1999)). Los límites de las regiones marco individuales pueden asignarse utilizando el esquema de numeración IMGT, que es una adaptación del esquema de numeración de Chothia (Lefranc et al., NAR 27: 209-212 (1999); http://im.gt.cines.fr). Los anticuerpos con alta homología humana pueden comprender bucles hipervariables o CDR que tienen pliegues canónicos humanos o similares a los humanos, como se analiza a continuación en detalle. En una realización, se puede obtener o derivar de un dominio VH o VL de un anticuerpo no humano al menos un bucle hipervariable o CDR en el dominio VH o en el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana, por ejemplo, un anticuerpo convencional de una especie de Camelidae, pero, muestran una estructura de pliegues canónicos real o prevista que es sustancialmente idéntica a una estructura de pliegues canónicos que se produce en los anticuerpos humanos. Está bien establecido en la técnica que aunque las secuencias de aminoácidos primarias de los bucles hipervariables presentes tanto en los dominios VH como en los dominios VL codificados por la línea germinal humana son, por definición, altamente variables, todos los bucles hipervariables, excepto CDR H3 del dominio VH, adoptan solamente unas pocas conformaciones estructurales distintas, llamadas pliegues canónicos (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Tramontano et al. Proteins 6:382-94 (1989)), que dependen tanto de la longitud del bucle hipervariable como de la presencia de los llamados restos de aminoácidos canónicos (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las estructuras canónicas reales de los bucles hipervariables en los dominios VH o VL intactos se pueden determinar mediante análisis estructural (p. ej., cristalografía de rayos X), pero también es posible predecir la estructura canónica basándose en los restos de aminoácidos clave que son característicos de una estructura en particular (analizado adicionalmente a continuación). Esencialmente, el patrón específico de restos que determina cada estructura canónica forma una "firma" que permite reconocer la estructura canónica en bucles hipervariables de un dominio VH o VL de estructura desconocida; por lo tanto, las estructuras canónicas pueden predecirse basándose únicamente en la secuencia de aminoácidos primaria. Las estructuras de pliegues canónicos previstas para los bucles hipervariables de cualquier secuencia VH o Vl dadas en un anticuerpo con alta homología humana pueden analizarse utilizando algoritmos que están disponibles públicamente en www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html,www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/antibodies.html y www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html. Estas herramientas permiten que las secuencias VH o VL de consulta se alineen con secuencias de dominios VH o VL humanas de estructura canónica conocida, y se realice una predicción de la estructura canónica para los bucles hipervariables de la secuencia de consulta. En el caso del dominio VH, los bucles HI y H2 pueden puntuarse como que tienen una estructura de pliegues canónicos "sustancialmente idéntica" a una estructura de pliegues canónicos que se sabe que se produce en anticuerpos humanos si al menos se cumplen el primero, y preferentemente ambos, de los siguientes criterios:

1. Una longitud idéntica, determinada por el número de restos, a la clase estructural canónica humana de coincidencia más cercana.

2. Al menos un 33 % de identidad, preferentemente al menos un 50 % de identidad con los restos de aminoácidos clave descritos para las clases estructurales canónicas de HI y H2 humanos correspondientes (téngase en cuenta que para los fines del análisis anterior, los bucles HI y H2 se tratan por separado y cada uno se compara con su clase estructural canónica humana de coincidencia más cercana). El análisis anterior se basa en la predicción de la estructura canónica de los bucles HI y H2 del anticuerpo de interés. Si se conocen las estructuras reales de los bucles HI y H2 en el anticuerpo de interés, por ejemplo, basándose en cristalografía de rayos X, entonces los bucles HI y H2 en el anticuerpo de interés también pueden puntuarse como que tienen una estructura de pliegues canónicos "sustancialmente idéntica" a una estructura de pliegues canónicos que se sabe que se produce en anticuerpos humanos si la longitud del bucle difiere de la de la clase estructural canónica humana de coincidencia más cercana (normalmente por 1 o 2 aminoácidos) pero la estructura real de los bucles HI y H2 en el anticuerpo de interés coincide con la estructura de un pliegue canónico humano. Los restos de aminoácidos clave que se encuentran en las clases estructurales canónicas humanas para el primer y segundo bucles hipervariables de los dominios VH humanos (HI y H2) se describen en Chotia et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992). En particular, la tabla 3 en la página 802 de Chothia et al., enumera los restos de aminoácidos preferidos en sitios clave para las estructuras canónicas de HI que se encuentran en la línea germinal humana, mientras que la Tabla 4 en la página 803, enumera los restos de aminoácidos preferidos en sitios clave para las estructuras canónicas de CDR H2 que se encuentran en la línea germinal humana. En una realización, tanto HI como H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana muestran una estructura de pliegues canónicos real o prevista que es sustancialmente idéntica a una estructura de pliegues canónicos que se produce en anticuerpos humanos. Los anticuerpos con alta homología humana pueden comprender un dominio VH en el que los bucles hipervariables HI y H2 forman una combinación de estructuras de pliegues canónicos que es idéntica a una combinación de estructuras canónicas que se sabe que se producen en al menos un dominio VH de la línea germinal humana. Se ha observado que solamente determinadas combinaciones de estructuras de pliegues canónicos en HI y H2 se producen realmente en los dominios VH codificados por la línea germinal humana. En una realización, pueden obtenerse HI y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana a partir de un dominio VH de una especie no humana, p. ej., una especie de camélidos, pero, forman una combinación de estructuras de pliegues canónicos previstas o reales que es idéntica a una combinación de estructuras de pliegues canónicos que se sabe que se producen en una línea germinal humana o en un dominio VH somáticamente mutado. En realizaciones no limitantes, pueden obtenerse HI y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana a partir de un dominio VH de una especie no humana, p. ej., una especie de Camelidae, y forman una de las siguientes combinaciones de pliegues canónicos: 1-1, 1-2, 1-3, 1-6, 1-4, 2-1, 3-1 y 3-5. Un anticuerpo con alta homología humana puede contener un dominio VH que muestra una alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VH humano, y que contiene bucles hipervariables que muestran homología estructural con VH humano. Puede ser ventajoso que los pliegues canónicos presentes en HI y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana, y la combinación de los mismos, sean "correctos" para la secuencia de la línea germinal de VH humana que representa la coincidencia más cercana con el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana en términos de identidad de secuencia de aminoácidos primaria general. A modo de ejemplo, si la secuencia más cercana coincide con un dominio VH3 de la línea germinal humana, entonces puede ser ventajoso que HI y H2 formen una combinación de pliegues canónicos que también se produce de manera natural en un dominio VH3 humano.

Esto puede ser particularmente importante en el caso de anticuerpos con alta homología humana que derivan de especies no humanas, p. ej., anticuerpos que contienen dominios v H y VL que derivan de anticuerpos convencionales de camélidos, especialmente anticuerpos que contienen dominios VH y VL de camélido humanizados. Por tanto, en una realización, el dominio VH del anticuerpo contra GARP con alta homología humana puede mostrar una identidad de secuencia o una homología de secuencia del 80 % o mayor, 85 % o mayor, 90 % o mayor, 95 % o mayor, 97 % o mayor, o hasta el 99 % o incluso el 100 % con un dominio VH humano en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, y además HI y H2 en el mismo anticuerpo se obtienen de un dominio VH no humano (p. ej., derivado de una especie de Camelidae), pero forman una combinación de estructuras de pliegues canónicos previstos o reales que es la misma que una combinación de pliegues canónicos que se sabe que se produce de manera natural en el mismo dominio VH humano. En otras realizaciones, L1 y L2 en el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana se obtienen cada uno de un dominio VL de una especie no humana (p. ej., un dominio VL derivado de camélidos), y cada uno muestra una estructura de pliegues canónicos prevista o real que es sustancialmente idéntica a una estructura de pliegues canónicos que se produce en los anticuerpos humanos. Al igual que con los dominios VH, los bucles hipervariables de los dominios VL de los tipos VLambda y VKappa pueden adoptar un número limitado de conformaciones o estructuras canónicas, determinado en parte por la longitud y también por la presencia de restos de aminoácidos clave en determinadas posiciones canónicas. Dentro de un anticuerpo de interés que tiene una alta homología humana, los bucles L1, L2 y L3 obtenidos de un dominio VL de una especie no humana, p. ej., una especie de camélidos, pueden puntuarse como que tienen una estructura de pliegues canónicos "sustancialmente idéntica" a una estructura de pliegues canónicos que se sabe que se produce en anticuerpos humanos si al menos se cumplen el primero, y preferentemente ambos, de los siguientes criterios:

1. Una longitud idéntica, determinada por el número de restos, a la clase estructural humana de coincidencia más cercana.

2. Al menos un 33 % de identidad, preferentemente al menos un 50 % de identidad con los restos de aminoácidos clave descritos para las clases estructurales canónicas humanas L1 o L2 correspondientes, del repertorio de VLambda o VKappa (téngase en cuenta que para los propósitos del análisis anterior, los bucles L1 y L2 se tratan por separado y cada uno se compara con su clase estructural canónica humana de coincidencia más cercana). El análisis anterior se basa en la predicción de la estructura canónica de los bucles L1, L2 y L3 en el dominio VL del anticuerpo de interés. Si se conoce la estructura real de los bucles L1, L2 y L3, por ejemplo, basándose en cristalografía de rayos X, entonces los bucles L1, L2 y L3 derivados del anticuerpo de interés también pueden puntuarse como que tienen una estructura de pliegues canónicos "sustancialmente idéntica" a una estructura de pliegues canónicos que se sabe que se produce en anticuerpos humanos si la longitud del bucle difiere de aquella de la clase estructural canónica humana de coincidencia más cercana (normalmente por 1 o 2 aminoácidos) pero la estructura real de los bucles de Camelidae coincide con un pliegue canónico humano. Los restos de aminoácidos clave que se encuentran en las clases estructurales canónicas humanas para las CDR de los dominios VLambda y VKappa humanos están descritos por Morea et al. Methods, 20: 267-279 (2000) y Martin et al., J. Mol. Biol., 263:800-815 (1996). El repertorio estructural del dominio VKappa humano también se describe por Tomlinson et al. EMBO J. 14:4628-4638 (1995), y el del dominio VLambda por Williams et al. J. Mol. Biol., 264:220-232 (1996). L1 y L2 en el dominio VL de un anticuerpo con alta homología humana pueden formar una combinación de estructuras de pliegues canónicos prevista o real que es idéntica a una combinación de estructuras de pliegues canónicos que se sabe que se producen en un dominio VL de la línea germinal humana. En realizaciones no limitantes, LI y L2 en el dominio VLambda de un anticuerpo con alta homología humana (p. ej., un anticuerpo que contiene un dominio VL derivado de camélidos o una variante humanizada del mismo) puede formar una de las siguientes combinaciones de pliegues canónicos: 11-7, 13-7(A,B,C), 14-7(A,B), 12-11, 1411 y 12-12 (como se define en Williams et al. J. Mol. Biol. 264:220 -32 (1996) y como se muestra en http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html). En realizaciones no limitantes, L1 y L2 en el dominio Vkappa pueden formar una de las siguientes combinaciones de pliegues canónicos: 2-1, 3-1, 4-1 y 6-1 (como se define en Tomlinson et al. EMBO J. 14:4628-38 (1995) y como se muestra en http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html).

En una realización adicional, los tres de L1, L2 y L3 en el dominio VL de un anticuerpo con alta homología humana pueden mostrar una estructura sustancialmente humana. Se prefiere que el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana muestre tanto una alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VL humana, como también que los bucles hipervariables en el dominio VL muestren homología estructural con VL humano.

En una realización, el dominio VL del anticuerpo contra GARP con alta homología humana puede mostrar una identidad de secuencia del 80 % o mayor, 85 % o mayor, 90 % o mayor, 95 % o mayor, 97 % o mayor, o hasta el 99 % o incluso el 100 % con un dominio VL humano en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, y además el bucle hipervariable L1 y el bucle hipervariable L2 pueden formar una combinación de estructuras de pliegues canónicos prevista o real que es la misma que una combinación de pliegues canónicos que se sabe que se produce de manera natural en el mismo dominio VL humano. Se prevé, por supuesto, que los dominios VH que muestran alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VH humano, y también homología estructural con bucles hipervariables de VH humanos se combinarán con dominios VL que muestran alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VL humano, y también homología estructural con bucles hipervariables de VL humano para proporcionar anticuerpos con alta homología humana que contienen emparejamientos VH/VL (p. ej., emparejamientos VH/VL derivados de camélidos) con secuencia máxima y homología estructural con emparejamientos VH/VL codificados por seres humanos.

"Inmunoespecífico", "específico para" o para "unirse específicamente" - Como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo es "inmunoespecífico", "específico para" o para "unirse específicamente" a un antígeno si reacciona a un nivel detectable con el antígeno, preferentemente con una constante de afinidad, Ka, de mayor que o igual a aproximadamente 104 M-1, o mayor que o igual a aproximadamente 105 M-1, mayor que o igual a aproximadamente 106 M-1, mayor que o igual a aproximadamente 107 M-1, o mayor que o igual a 108 M-1', o mayor que o igual a 109 M-1, o mayor que o igual a 1010 M-1. La afinidad de un anticuerpo por su antígeno afín también se expresa comúnmente como una constante de disociación Kd, y en determinadas realizaciones, un anticuerpo se une específicamente al antígeno si se une con una Kd menor que o igual a 10-4 M, menor que o igual a 10-5 M, menor que o igual a 10-6 M, menor que o igual a 10-7 M, o menor que o igual a 10-8 M, o menor que o igual a 5.10-9 M, o menor que o igual a 10-9 M, o menor que o igual a 5.10-10 M, o menor que o igual a 10-10 M. Las afinidades de los anticuerpos se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard G et al. (The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann NY Acad Sci 1949;51:660-672). Las propiedades de unión de un anticuerpo a antígenos, células o tejidos de los mismos generalmente se pueden determinar y evaluar usando métodos de inmunodetección que incluyen, por ejemplo, ensayos basados en inmunofluorescencia, tales como inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) y/o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés).

"Ácido nucleico aislado" - Como se usa en el presente documento, es un ácido nucleico que está sustancialmente separado de otras secuencias de ADN del genoma, así como de proteínas o complejos tales como ribosomas y polimerasas, que acompañan de manera natural a una secuencia natural. La expresión abarca una secuencia de un ácido nucleico que se ha eliminado de su entorno natural e incluye aislados de ADN recombinante o clonado y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Un ácido nucleico sustancialmente puro incluye formas aisladas del ácido nucleico. Por supuesto, esto se refiere al ácido nucleico como originalmente aislado y no excluye genes o secuencias añadidas posteriormente al ácido nucleico aislado por la mano del hombre. El término "polipéptido" se usa en su significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no se limitan a una longitud específica del producto. Los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido, y dichos términos pueden usarse indistintamente en el presente documento a menos que se indique específicamente lo contrario. Este término tampoco se refiere ni excluye modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilación, acetilación, fosforilación y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural. Un polipéptido puede ser una proteína completa o una subsecuencia de la misma. Los polipéptidos particulares de interés en el contexto de esta invención son subsecuencias de aminoácidos que comprenden CDR y que son capaces de unirse a un antígeno. Un polipéptido "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. En realizaciones preferidas, el polipéptido aislado se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso de polipéptido determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos aminoterminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante una SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. Un polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ con células recombinantes, ya que no estará presente al menos un componente del entorno natural del polipéptido. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

"Identidad" o "idéntico" - Como se usa en el presente documento, el término "identidad" o "idéntico", cuando se usa en una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, se refiere al grado de relación de secuencia entre polipéptidos, determinada por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más restos de aminoácidos. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineamientos de huecos (si existen) dirigidos por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de polipéptidos relacionados puede calcularse fácilmente por métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. En programas informáticos disponibles públicamente se describen métodos para determinar la identidad. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). También puede usarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.

"Anticuerpo modificado" - Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo modificado" incluye formas sintéticas de anticuerpos que están alterados de tal manera que no son de origen natural, p. ej., anticuerpos que comprenden al menos dos regiones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tales como anticuerpos o minicuerpos con dominio eliminado); formas multiespecíficas de anticuerpos (p. ej., biespecífico, triespecífico, etc.) alterados para unirse a dos o más antígenos diferentes o a diferentes epítopos en un solo antígeno); moléculas de cadena pesada unidas a moléculas scFv y similares. Las moléculas ScFv son conocidas en la técnica y se describen, p. ej., en la Patente de EE. UU. 5.892.019. Además, la expresión "anticuerpo modificado" incluye formas multivalentes de anticuerpos (p. ej., anticuerpos trivalentes, tetravalentes, etc., que se unen a tres o más copias del mismo antígeno). En otra realización, un anticuerpo modificado de la invención es una proteína de fusión que comprende al menos una región de cadena pesada que carece de un dominio CH2 y que comprende un dominio de unión de un polipéptido que comprende la región de unión de un miembro de un par de ligandos de receptor.

"Mamífero" - Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o de compañía, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es ser humano.

"Anticuerpo monoclonal" - Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales comprendidos en la población son idénticos salvo por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Asimismo, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin estar contaminados por otros anticuerpos. No debe interpretarse que el modificador "monoclonal" requiera la producción del anticuerpo por cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridomas descrita por primera vez por Kohler. et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse utilizando métodos de ADN recombinante en bacterias, células eucariotas animales o vegetales (véase, p. ej., la Patente de EE.UU N.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

"Secuencia natural" - Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia natural" se refiere a un polinucleótido que tiene la misma secuencia de nucleótidos que un polinucleótido derivado de la naturaleza. Un polipéptido de "secuencia natural" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (p. ej., un anticuerpo) derivado de la naturaleza (p. ej., de cualquier especie). Dichos polipéptidos y polinucleótidos de secuencia natural se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes o sintéticos. Una "variante" de polinucleótidos, como se usa el término en el presente documento, es un polinucleótido que normalmente difiere de un polinucleótido divulgado específicamente en el presente documento en una o más sustituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones. Tales variantes pueden ser de origen natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias de polinucleótidos de la invención y evaluando una o más actividades biológicas del polipéptido codificado como se describe en el presente documento y/o usando cualquiera de varias técnicas bien conocidas en la técnica. Una "variante" de polipéptido, como se usa el término en el presente documento, es un polipéptido que normalmente difiere de un polipéptido divulgado específicamente en el presente documento en una o más sustituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones. Tales variantes pueden ser de origen natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias polipeptídicas anteriores de la invención y evaluando una o más actividades biológicas del polipéptido como se describe en el presente documento y/o usando cualquiera de varias técnicas bien conocidas en la técnica. Se pueden realizar modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente divulgación y aún obtener una molécula funcional que codifique un polipéptido variante o derivado con características deseables. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear un equivalente, o incluso una variante o región mejorados, de un polipéptido de la invención, un experto en la materia cambiará normalmente uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante. Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de su capacidad para unirse a otros polipéptidos (p. ej., antígenos) o células. Debido a que es la capacidad de unión y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar determinadas sustituciones de secuencia de aminoácidos en una secuencia proteica, y, por supuesto, en su secuencia de ADN codificante subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Por tanto, se contempla que se pueden realizar diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones divulgadas, o en las secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. En muchos casos, una variante de polipéptido, contendrá una o más sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la materia de la química peptídica esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambien sustancialmente. Como se explica anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan, por lo tanto, en general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Los expertos en la materia conocen bien sustituciones ilustrativas que toman en consideración varias de las características anteriores e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Pueden realizarse sustituciones adicionales de aminoácidos basándose en la similitud de la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos de grupos de cabeza polares sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener también, o como alternativa, cambios no conservativos. En una realización preferida, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia natural por sustitución, eliminación o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes pueden modificarse también (o como alternativa) mediante, por ejemplo, la eliminación o adición de aminoácidos que tienen influencia mínima sobre la inmunogenicidad, estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido.

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" - Como se usa en el presente documento, la expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares. Dicho excipiente no produce una reacción adversa, alérgica o negativa distinta cuando se administra a un animal, preferentemente a un ser humano. Para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, y generales de seguridad y pureza requeridas por las normas de la Office of Biologics de la FDA.

"Especificidad" - Como se usa en el presente documento, el término "especificidad" se refiere a la capacidad de unirse específicamente (p. ej., inmunorreaccionar con) una diana dada, p. ej., GARP. Un polipéptido puede ser monoespecífico y contener uno o más sitios de unión que se unen específicamente a una diana, o un polipéptido puede ser multiespecífico y contener dos o más sitios de enlace que se unen específicamente a las mismas o diferentes dianas. En una realización, un anticuerpo de la invención es específico para más de una diana. Por ejemplo, en una realización, una molécula de unión multiespecífica de la invención tiene la especificidad de unión definida en las reivindicaciones y también se une a una segunda molécula expresada en una célula tumoral. Se conocen en la técnica anticuerpos ilustrativos que comprenden sitios de unión a antígeno que se unen a antígenos expresados en células tumorales y se pueden incluir una o más CDR de dichos anticuerpos en un anticuerpo de la invención.

"Sintético" - Como se usa en el presente documento, el término "sintético" con respecto a polipéptidos incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que no es de origen natural. Por ejemplo, los polipéptidos de origen no natural son formas modificadas de polipéptidos de origen natural (p. ej., que comprenden una mutación tal como una adición, sustitución o eliminación) o de polipéptidos que comprenden una primera secuencia de aminoácidos (que puede ser o no de origen natural) que está unida en una secuencia lineal de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos (que puede ser o no de origen natural) a la que no está unida de manera natural en la naturaleza.

"Fv monocatenario" también abreviado como" sFv "o" scFv " - Como se usa en el presente documento, las expresiones "Fv monocatenario", "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de los sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

"Región variable" o "dominio variable" - Como se usa en el presente documento, el término "variable" se refiere al hecho de que determinadas regiones de los dominios variables VH y VL difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular para su antígeno diana. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados "bucles hipervariables" en cada uno del dominio VL y del dominio VH que forman parte del sitio de unión a antígeno. El primero, el segundo y el tercer bucles hipervariables del dominio de cadena ligera VLambda se denominan en el presente documento L1 (A), L2 (A) y L3 (A) y pueden definirse como que comprenden los restos 24-33 (L1 (A), que consiste en 9, 10 u 11 restos de aminoácidos), 49-53 L2 (A), que consiste en 3 restos) y 90-96 (L3 (A), que consiste en 6 restos) en el dominio VL (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). El primero, el segundo y el ercer bucles hipervariables del dominio de cadena ligera VKappa se denominan en el presente documento L1 (k), l2 (K) y L3 (K) y pueden definirse como que comprenden los restos 25-33 (L1 (K), que consiste en 6, 7, 8, 11, 12 o 13 restos), 49-53 (L2 (K), que consiste en 3 restos) y 90-97 (L3 (K), que consiste en 6 restos) en el dominio VL (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). El primero, el segundo y el tercer bucles hipervariables del dominio VH se denominan en el presente documento HÍ, H2 y H3 y pueden definirse como que comprenden los restos 25-33 (HÍ, que consiste en 7, 8 o 9 restos), 52-56 (H2, que consiste en 3 o 4 restos) y 91-105 (H3, muy variable en longitud) en el dominio VH (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). A menos que se indique lo contrario, los términos L1, L2 y L3 se refieren respectivamente al primer, segundo y tercer bucles hipervariables de un dominio VL, y abarcan bucles hipervariables obtenidos a partir de los isotipos de Vkappa y Vlambda. Los términos HI, H2 y H3 se refieren respectivamente al primer, segundo y tercer bucles hipervariables del dominio VH, y abarcan bucles hipervariables obtenidos de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos, incluyendo [gamma], [épsilon], [delta], a o [mu]. Los bucles hipervariables L1, L2, l3, HI, H2 y H3 pueden comprender cada uno parte de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR", como se define a continuación.

"Valencia".-.Como se usa en el presente documento, el término "valencia" se refiere al número de posibles sitios de unión a la diana en un polipéptido. Cada sitio de unión a la diana se une específicamente a una molécula diana o a un sitio específico en una molécula diana. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de unión a la diana, cada sitio de unión a la diana puede unirse específicamente a la misma o diferentes moléculas (p. ej., puede unirse a diferentes ligandos o diferentes antígenos, o diferentes epítopos en el mismo antígeno). Las moléculas de unión en cuestión tienen preferentemente al menos un sitio de unión específico para una molécula GARP humana. En realizaciones particulares, los anticuerpos contra GARP proporcionados en el presente documento pueden ser al menos bivalentes.

"T ratar" o "tratamiento" o "alivio".- Como se usa en el presente documento, los términos "tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas; en donde el objetivo es prevenir o frenar (aminorar) la patología o el trastorno en cuestión. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. Un sujeto o mamífero es "tratado" con éxito por una infección si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, el paciente muestra una reducción observable y/o medible en o en ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el número de células patógenas; reducción del porcentaje de células totales que son patógenas; y/o alivio hasta cierto punto, de uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o afección específicos; morbilidad y mortalidad reducidas y mejora de la calidad de vida. Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora de la enfermedad se pueden medir fácilmente mediante procedimientos habituales familiares para un médico.

"TGF-p" - Como se usa en el presente documento, el término TGF-p se refiere a las tres isoformas denominadas TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3. Las estructuras peptídicas de las isoformas de TGF-p son muy similares (homologías del orden del 70-80 %). Todas están codificadas como grandes precursores de proteínas; TGF-p1 (Número de acceso de GenBank: NM_000660 contiene 390 aminoácidos y TGF-p2 (Número de acceso de GenBank: NM_001135599 y NM_003238) y TGF-p3 (Número de acceso de GenBank: xM_005268028) cada una contiene 412 aminoácidos. Cada una tiene un péptido señal aminoterminal de 20-30 aminoácidos que necesitan para la secreción a partir de una célula, una pro-región (llamada péptido asociado a latencia o LAP) y una región carboxiterminal de 112-114 aminoácidos que se convierte en la molécula TGF-p madura tras su liberación de la pro-región mediante escisión proteolítica.

Descripción detallada

Un aspecto de la divulgación es una proteína que se une a GARP en presencia de TGF-p. Otro aspecto de la divulgación es una proteína que comprende un dominio de unión a antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno se une específicamente a GARP en presencia de TGF-p.

En una divulgación, dicha proteína se une a GARP solamente en presencia de TGF-p.

GARP también se llama repetición rica en leucina que contiene 32 (LRRC32, por sus siglas en inglés) y pertenece a la familia de repeticiones ricas en leucina. La secuencia completa de aminoácidos de la variante 2 del transcrito de la proteína GARP humana (SEQ ID NO: 1) (Acceso de GenBank NM_001128922) es:

MRPQILLLLALLTLGLAAQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDTET

LDLSGNQLRSILASPLGFYTALRHLDLSTNEISFLQPGAFQALTHLEHLSLAHNR

FAMATAFSAGGFGPFPRVTSFDFSGNSFYSGFFERFFGEAPSFHTFSFAENSFT

RFTRHTFRDMPAFEQFDFHSNVFMDIEDGAFEGFPRFTHFNFSRNSFTCISDFSF

QQFRVFDFSCNSIEAFQTASQPQAEFQFTWFDFRENKFFHFPDFAAFPRFIYFN

FSNNFIRFPTGPPQDSKG1HAPSEGWSAFPFSAPSGNASGRPFSQFFNFDFSYNEI

EFIPDSFFEHFTSFCFFNFSRNCFRTFEARRFGSFPCFMFFDFSHNAFETFEFGA

RAFGSFRTFFFQGNAFRDFPPYTFANFASFQRFNFQGNRVSPCGGPDEPGPSGC

VAFSGITSFRSFSFVDNEIEFFRAGAFFHTPFTEFDFSSNPGFEVATGAFGGFEAS

FEVFAFQGNGFMVFQVDFPCFICFKRFNFAENRFSHFPAWTQAVSFEVFDFRN

NSFSFFPGSAMGGFETSFRRFYFQGNPFSCCGNGWFAAQFHQGRVDVDATQD

FICRFSSQEEVSFSHVRPEDCEKGGFKNINFIIIFTFIFVSAIFFTTFAACCCVRRQ

KFNQQYKA.

En una divulgación, la proteína se une a GARP cuando GARP forma un complejo con TGF-p.

En otra divulgación, la proteína se une a GARP cuando GARP forma un complejo con TGF-p latente.

En otra divulgación, la proteína se une a un complejo de GARP y TGF-p.

En una divulgación, la proteína se une a un complejo de GARP y TGF-p1; TGF-p2, isoforma 1; TGF-p2, isoterma 2; TGF-p3. Preferentemente, la proteína se une a un complejo de GARP y TGF-p1.

En otra divulgación, la proteína de la invención se une a un complejo de GARP y TGF-p1 latente, tal como se define en las reivindicaciones.

La expresión "TGF-p latente" como se usa en el presente documento comprende un complejo cuyo fragmento carboxiterminal, o TGF-p1 maduro, permanece unido de forma no covalente al fragmento aminoterminal conocido como LAP.

En otro aspecto, la proteína de la invención se une a un complejo de GARP y TGF-p latente a una KD (la constante de disociación en equilibrio entre el anticuerpo y su antígeno) de menos de l0 '10 M.

En una divulgación, dicha proteína es una molécula de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo completo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo monocatenario dimérico, un Fv, un Fab, un F(ab)'2, un anticuerpo defucosilado, un anticuerpo biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo.

Un dominio de anticuerpo es bien conocido en la técnica y se refiere a las unidades de unión funcionales más pequeñas de anticuerpos, que se corresponden con las regiones variables de cualquiera de las cadenas pesada o ligera de anticuerpos.

Un nanocuerpo es bien conocido en la técnica y se refiere a una proteína terapéutica derivada de un anticuerpo que contiene las propiedades estructurales y funcionales exclusivas de los anticuerpos de cadena pesada de origen natural. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un único dominio variable (VHH) y dos dominios constantes (CH2 y CH3).

Un monocuerpo es bien conocido en la técnica y se refiere a un fragmento de anticuerpo que carece de la región bisagra de los anticuerpos IgG4. La eliminación de la región bisagra da como resultado una molécula que es esencialmente de la mitad del tamaño de los anticuerpos IgG4 tradicionales y tiene una región de unión univalente en lugar de la región de unión bivalente de los anticuerpos IgG4.

Un aficuerpo es bien conocido en la técnica y se refiere a proteínas de afinidad basadas en un dominio de proteína de 58 restos de aminoácidos, derivado de uno de los dominios de unión a IgG de la proteína A estafilocócica.

Las DARPin (proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas) son bien conocidas en la técnica y se refieren a una tecnología d Rp (proteína con repeticiones diseñada) de miméticos de anticuerpos desarrollada para explotar las capacidades de unión de polipéptidos que no son anticuerpos.

Las anticalinas son bien conocidas en la técnica y se refieren a otra tecnología de miméticos de anticuerpos, en donde la especificidad de unión se obtiene de las lipocalinas. Las anticalinas también pueden formatearse como proteína de doble direccionamiento, llamada Duocalinas.

Los avímeros son bien conocidos en la técnica y se refieren a otra tecnología de miméticos de anticuerpos. Los versacuerpos son bien conocidos en la técnica y se refieren a otra tecnología de miméticos de anticuerpos. Son pequeñas proteínas de 3-5 kDa con > 15 % de cisteínas, que forman un armazón de alta densidad de disulfuro, reemplazando el núcleo hidrófobo que tienen las proteínas habituales.

En otro aspecto, dicha proteína es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo conjugado con un agente terapéutico.

En otro aspecto, dicha proteína es un conjugado que comprende la proteína de la divulgación conjugada con un agente para obtención de imágenes. Dicha proteína podría usarse, por ejemplo, para aplicaciones de obtención de imágenes. Otro aspecto de la divulgación es una proteína que se une a GARP e inhibe la señalización de TGF-p.

En un aspecto, dicha proteína se une a GARP cuando GARP forma un complejo con TGF-p.

En otro aspecto, dicha proteína se une a GARP cuando GARP forma un complejo con TGF-p latente.

En otro aspecto, dicha proteína se une a un complejo de GARP y TGF-p.

En otro aspecto, dicha proteína se une a un complejo de GARP y TGF-p latente.

En un aspecto, dicha proteína es una molécula de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo completo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo monocatenario dimérico, un Fv, un Fab, un F(ab)'2, un anticuerpo defucosilado, un anticuerpo biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo. En otro aspecto, dicha proteína es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un unicuerpo, un dominio de anticuerpos y un nanocuerpo.

En otro aspecto, dicha proteína es un mimético de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un aficuerpo, una afilina, una afitina, una adnectina, una atrimer, una evasina, una DARPin, una anticalina, un avímero, un finómero, versacuerpo y duocalina.

En un aspecto, dicha proteína es un anticuerpo anti-hGARP (anti-GARP humana) o un fragmento de unión a antígeno del mismo que inhibe la señalización de TGF-p.

En un aspecto, dicha proteína evita o inhibe la liberación de TGF-p activo o inhibe la liberación de TGF-p maduro por los Treg.

En otro aspecto, dicha proteína inhibe o evita que TGF-p maduro se una a los receptores de TGF-p.

En otro aspecto, dicha proteína inhibe la actividad de TGF-p y/o la activación de moléculas de la vía de señalización de los receptores de TGF-p.

Como se usa en el presente documento, el término "inhibir" significa que la proteína es capaz de bloquear, reducir, prevenir o neutralizar la señalización de TGF-p o la liberación de TGF-p maduro por los Treg o la unión de TGF-p maduro a receptores de TGF-p o la actividad de TGF-p y/o la activación de moléculas de la vía de señalización de los receptores de TGF-p.

En una realización, dicha proteína es un anticuerpo monoclonal.

En otra realización, dicha proteína es un anticuerpo policlonal.

En un aspecto, dicha proteína se une a un epítopo conformacional.

En una realización, dicho epítopo conformacional comprende los aminoácidos de hGARP, tal como se define en las reivindicaciones.

Dicho epítopo conformacional comprende un epítopo de GARP modificado como resultado de que GARP forme un complejo con TGF-p latente. Dicho epítopo conformacional puede comprender aminoácidos de hGARP y aminoácidos de TGF-p latente.

Dicho epítopo conformacional puede ser un epítopo conformacional mixto y comprende aminoácidos tanto de GARP como de TGF-p.

En otra divulgación, dicho epítopo conformacional es un epítopo conformacional inducido por unión y comprende aminoácidos de GARP únicamente, pero que adopta una conformación diferente en presencia de TGF-p.

En un aspecto, dicho epítopo comprende uno o más restos de 101 a 141 restos de la secuencia de aminoácidos de hGARP (SEQ ID NO: 1).

Estos 101 a 141 restos son los que se establecen en la SEQ ID NO: 12: HLSLAHNRLAMATALSAGGLGPLPRVTSLD-LSGNSLYSGLL.

En otro aspecto, dicho epítopo comprende los restos 137, 138 y 139: YSG de la secuencia de aminoácidos de hGARP (SEQ ID NO: 1).

En la invención, dicho epítopo comprende los restos 137, 138 y 139: YSG de la secuencia de aminoácidos de hGARP (SEQ ID NO: 1) y requiere la presencia de TGF-p latente.

En otro aspecto de la divulgación, dicho epítopo comprende los restos 137, 138 y 139: YSG de la secuencia de aminoácidos de hGARP (SEQ ID NO: 1) y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 restos contiguos en el extremo N y/o en el extremo C de los restos 137, 138 y 139: YSG de la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto de la divulgación, dicho epítopo comprende los restos 137, 138 y 139: YSG de la secuencia de aminoácidos de hGARP (SEQ ID NO: 1) y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 restos contiguos en el extremo N y/o en el extremo C de los restos 137, 138 y 139: YSG de la SEQ ID NO: 1 y requiere la presencia de TGF-p.

En un aspecto de la divulgación, la proteína se une a epítopos preferentemente dentro de la región 101-141 de hGARP e inhibe la liberación de TGF-p latente a partir de GARP.

Un experto en la materia puede determinar la capacidad de una proteína para inhibir la señalización de TGF-p midiendo, por ejemplo, la activación de moléculas de la ruta de señalización de los receptores de TGF-p. Un ejemplo de tal prueba es normalmente la medida de la fosforilación de SMAD2 (como se muestra en el ejemplo 2 de la presente divulgación).

Un aspecto de la divulgación es un anticuerpo contra GARP humana o un fragmento de unión a antígeno del mismo en donde la región variable de la cadena pesada comprende al menos una de las siguientes CDR:

VH-CDR1: GFSLTGYGIN (SEQ ID NO: 2) o GYGIN (SEQ ID NO: 52);

VH-CDR2: MIWSDGSTDYNSVLTS (SEQ ID NO: 3); y

VH-CDR3: DRNYYDYDGAMDY (SEQ ID NO: 4).

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo anti-hGARP o un fragmento de unión a antígeno del mismo en donde la región variable de la cadena ligera comprende al menos una de las siguientes CDR:

VL-CDR1: KASDHIKNWLA (SEQ ID NO: 5);

VL-CDR2: GATSLEA (SEQ ID NO: 6); y

VL-CDR3: QQYWSTPWT (SEQ ID NO: 7).

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo contra GARP humana o un fragmento de unión a antígeno del mismo en donde la región variable de cadena pesada comprende al menos una de las siguientes CDR:

VH-CDR1: SYYID (SEQ ID NO: 13);

VH-CDR2: RIDPEDGGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 14); y

VH-CDR3: NEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 15).

Otro objeto de la divulgación es un anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo en donde la región variable de la cadena ligera comprende al menos una de las siguientes CDR:

VL-CDR2: X1X2SX3X4X5T (SEQ ID NO: 17), en donde X1 es G o R; X2 es A o T; X3 es R o I; X4 es L o P; X5 es Q o K; y

VL-CDR3: QQYX1SX2PX3T, en donde X1 es D, A, Y o V; X2 es A, L o V; X3 es V o P (SEQ ID NO: 18).

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo en donde la región variable de la cadena pesada comprende la VH-CDR1 de SEQ ID NO: 13, VH-CDR2 de SEQ ID NO: 14 y VH-CDR3 de SEQ ID NO: 15 y la región variable de la cadena ligera comprende al menos uno de VL-CDR1 como se establece en la SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 28; o SEQ ID NO: 31; al menos una de VL-CDR2 como se establece en la SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 29; o SEQ ID NO: 32 y al menos una de VL-CDR3 como se establece en la SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; o SEQ ID NO: 33.

VL-CDR1: QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 19);

VL-CDR2: GASRLQT (SEQ ID NO: 20); y

VL-CDR3: QQYDSLPVT (SEQ ID NO: 21).

VL-CDR1: QASQSIVSYLA (SEQ ID NO: 22);

VL-CDR2: GASRLQT (SEQ ID NO: 23); y

VL-CDR3: QQYASAPVT (SEQ ID NO: 24).

VL-CDR1: QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 25);

VL-CDR2: GTSRLKT (SEQ ID NO: 26); y

VL-CDR3: QQYYSAPVT (SEQ ID NO: 27).

VL-CDR1: QASQTISSFLA (SEQ ID NO: 28);

VL-CDR2: RASIPQT (SEQ ID NO: 29); y

VL-CDR3: QQYVSAPPT (SEQ ID NO: 30).

VL-CDR1: QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 31);

VL-CDR2: GASRLKT (SEQ ID NO: 32); y

VL-CDR3: QQYASVPVT (SEQ ID NO: 33).

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender el dominio CH1, región bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de un anticuerpo humano, en particular IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena pesada las siguientes CDR: VH-CDR1 GFSLTGYGIN (SEQ ID NO: 2), VH-CDR2 MIWSDGSTDYNSVLTS (SEQ ID NO: 3) y VH-CDR3 DRNYYDYDGAMDY (SEQ ID NO: 4).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena pesada las siguientes CDR: VH-CDR1 GYGIN (SEQ ID NO: 52), VH-CDR2 MIWSDGSTDYNSVLTS (SEQ ID NO: 3) y VH-CDR3 DRNYYDYDGAMDY (SEQ ID NO: 4).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena ligera las siguientes CDR: VL-CDR1 KASDHIKNWLA (SEQ ID NO: 5), VL-CDR2 GATSLEA (SEQ ID NO: 6) y VL-CDR3 QQYWSTPWT (SEQ ID NO: 7).

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena pesada las siguientes CDR: VH-CDR1 SYYID (SEQ ID NO: 13), VH-CDR2 RIDPEDGGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 14) y VH-CDR3 NEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 15).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena ligera las siguientes CDR: VL-CDR1 QASQX1I X2SX3LA (SEQ ID NO: 16), en donde X1 es S o T, X2 es S o V, X3 es Y o F; VL-CDR2 X1X2SX3X4X5T (SEQ ID NO: 17), en donde X1 es G o R; X2 es A o T; X3 es R o I; X4 es L o P; X5 es Q o K; y VL-CDR3 QQYX1SX2PX3T, en donde X1 es D, A, Y o V; X2 es A, L o V; X3 es V o P (SEQ ID NO: 18).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena ligera las siguientes CDR: VL-CDR1 QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 19), VL-CDR2 GASRLQT (SEQ ID NO: 20) y VL-CDR3 QQYDSLPVT (SEQ ID NO: 21).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena ligera las siguientes CDR: VL-CDR1 QASQSIVSYLA (SEQ ID NO: 22); VL-CDR2 GASRLQT (SEQ ID NO: 23); y VL-CDR3: QQYASAPVT (SEQ ID NO: 24).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena ligera las siguientes CDR: VL-CDR1 QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 25); VL-CDR2 GTSRLKT (SEQ ID NO: 26); y VL-CDR3 QQYYSAPVT (SEQ ID NO: 27).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena ligera las siguientes CDR: VL-CDR1 QASQTISSFLA (SEQ ID NO: 28); VL-CDR2 RASIPQT (SEQ ID NO: 29); y VL-CDR3 QQYVSAPPT (SEQ ID NO: 30).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su cadena ligera las siguientes CDR: VL-CDR1 QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 31); VL-CDR2 GASRLKT (SEQ ID NO: 32); y VL-CDR3 QQYASVPVT (SEQ ID NO: 33).

De acuerdo con la divulgación, Cualquiera de las CDR 1, 2 y 3 de las cadenas pesada y ligera puede caracterizarse por tener una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la CDR o conjuntos de CDR particulares enumerados en la SEQ ID NO correspondiente.

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo que tiene:

(i) las secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de cadena pesada (VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 2, 3 y 4; y

(ii) las secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 5, 6 y 7 respectivamente;

opcionalmente en donde uno, dos, tres o más de los aminoácidos en cualquiera de dichas secuencias pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.

(i) las secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de cadena pesada (VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 52, 3 y 4; y

(i) las secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de cadena pesada (VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 13, 14 y 15; y

(ii) las secuencias de aminoácidos de las c Dr 1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 16, 17 y 18 respectivamente;

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:

(ii) las secuencias de aminoácidos de las c Dr 1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 19, 20 y 21 respectivamente;

(ii) las secuencias de aminoácidos de las c Dr 1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 22, 23 y 24 respectivamente;

(ii) las secuencias de aminoácidos de las c Dr 1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 25, 26 y 27 respectivamente;

(ii) las secuencias de aminoácidos de las c Dr 1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 28, 29 y 30 respectivamente;

(ii) las secuencias de aminoácidos de las c Dr 1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) como se muestra en las SEQ ID NO: 31, 32 y 33 respectivamente;

En un aspecto, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una CDR3 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (DRNYYDYDGAMDY), o una variante de secuencia de la misma, en donde la variante de secuencia comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en la secuencia mencionada.

En un aspecto, el anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una CDR3 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o una variante de secuencia de la misma, en donde la variante de secuencia comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en la secuencia mencionada.

Otro aspecto de la divulgación es el anticuerpo anti-hGARP MHGARP8 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 9.

MAVLALLFCLVTFPSCILSQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGINW

VRQPPGKGLEWLGMIWSDGSTDYNSVLTSRLRISKDNSNSQVFLKMNSLQVDD

TARYYCARDRNYYDYDGAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 8).

MKFPSQLLLFLLFRITGIICDIQVTQSSSYLSVSLGDRVTITCKASDHIKNWLAWY

QQKPGIAPRLLVSGATSLEAGVPSRFSGSGSGKNFTLSITSLQTEDVATYYCQQY

WSTPWTFGGGTTLEIR (SEQ ID NO: 9).

Otro aspecto de la divulgación es el anticuerpo anti-hGARP MHGARP8 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 50 y una región variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 51, en donde la SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51 corresponden, respectivamente, a la SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 en donde se eliminaron las secuencias del péptido señal.

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGINWVRQPPGKGLEWLGMIWSD

GSTD YNS VLTSRLRIS KDNSNSQVFLKMNSLQVDDT ARYY C ARDRNYYD YDG

AMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 50).

DIQVTQSSSYLSVSLGDRVTITCKASDHIKNWLAWYQQKPGIAPRLLVSGATSL

EAGVPSRFSGSGSGKNFTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTTLEIR

(SEQ ID NO: 51).

Otro aspecto de la divulgación es el anticuerpo anti-hGARP LHG10 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 35.

EY QLV QPG AELRNSG AS VKVSCKASG YRFTS Y YIDW VRQ APGQGLEWMGRID

PEDGGTKYAQKFQGRVTFTADTSTSTAYVELSSLRSEDTAVYYCARNEWETVY

VGDLMYEYEYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 34).

DIQMTQSPTSLSASLGDRVTITCQASQSISSYLAWYQQKPGQAPKLLIYGASRLQ

TGVPSRFSGSGSGTSFTLTISGLEAEDAGTYYCQQYDSLPVTFGQGTKVELK

(SEQ ID NO: 35).

Otro aspecto de la divulgación es el anticuerpo anti-hGARP LHG10.3 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 36.

DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCQASQSIVSYLAWYQQKPGQAPKLLIYGASRLQ

TGVPSRFSGSGSGTSFTLTISGLEAEDAGTYYCQQYASAPVTFGQGTGVELK

(SEQ ID NO: 36).

Otro aspecto de la divulgación es el anticuerpo anti-hGARP LHG10.4 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 37.

DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCQASQSISSYLAWYQQKPGQAPKLLIYGTSRLK

TGVPSRFSGSGSGTSFTLTISGLEAEDAGTYYCQQYYSAPVTFGQGTKVELK

(SEQ ID NO: 37).

Otro aspecto de la divulgación es el anticuerpo anti-hGARP LHG10.5 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 38.

DIQMTQSPSSLSPSLGDRVTITCQASQTISSFLAWYHQKPGQPPKLLIYRASIPQT

GVPSRFSGSGSGTSFTLTIGGLEAEDAGTYYCQQYYSAPPTFGQGTKVELK

(SEQ ID NO: 38).

Otro aspecto de la divulgación es el anticuerpo anti-hGARP LHG10.6 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 39.

DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCQASQSISSYLAWYQQKPGQAPNILIYGASRLK

TGVPSRFSGSGSGTSFTLTISGLEAEDAGTYYCQQYASVPVTFGQGTKVELK

(SEQ ID NO: 39).

En un aspecto de la divulgación, uno, dos, tres o más de los aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada o de cadena ligera como se describe anteriormente en el presente documento pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.

En otro aspecto, un anticuerpo puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo MHGARP8 descrito en el presente documento, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de la proteína de la invención.

En un aspecto de la divulgación, la secuencia de la región variable de cadena pesada de un anti-hGARP abarca secuencias que tienen un 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 8 o con la SEQ ID NO: 50.

En un aspecto de la divulgación, la secuencia de la región variable de cadena ligera de un anti-hGARP abarca secuencias que tienen un 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 9 o con la SEQ ID NO: 51.

En otro aspecto, un anticuerpo de la divulgación comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo LHG10 descrito en el presente documento, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de la proteína de la invención.

En un aspecto de la divulgación, la secuencia de la región variable de cadena pesada de un anti-hGARP abarca secuencias que tienen un 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 34.

En un aspecto de la divulgación, la secuencia de la región variable de cadena ligera de un anti-hGARP abarca secuencias que tienen un 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 35; 36; 37; 38 o 39.

En cualquiera de los anticuerpos de la divulgación, p. ej., MHGARP8 o LHG10, las secuencias de la región variable especificada y CDR pueden comprender modificaciones de secuencia conservativas. Las modificaciones de secuencia conservativas se refieren a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos. Pueden introducirse modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son normalmente aquellas en las que un resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral con propiedades fisicoquímicas similares. Las secuencias de las regiones variables y CDR especificadas pueden comprender una, dos, tres, cuatro o más inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos. Cuando se hacen sustituciones, las sustituciones preferidas serán modificaciones conservativas. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la divulgación se pueden reemplazar con otros restos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado se puede probar para determinar la función conservada (es decir, las propiedades establecidas en el presente documento) usando los ensayos descritos en el presente documento. Los anticuerpos anti-hGARP también pueden ser anticuerpos con CDR injertadas en los que las CDR derivan de un anticuerpo de camélido, por ejemplo, un anticuerpo anti-hGARP de camélido producido por inmunización activa con hGARP.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo que el anticuerpo MHGARP8 o LHG10.

En algunos aspectos de la presente divulgación, Los anticuerpos anti-hGARP que comprenden dominios VH y VL, o las CDR de los mismos, pueden comprender dominios CH1 y/o dominios CL, cuya secuencia de aminoácidos es total o sustancialmente humana. Cuando el polipéptido de unión a antígeno de la invención es un anticuerpo destinado a uso terapéutico humano, es habitual para toda la región constante del anticuerpo, o al menos una parte de la misma, tener una secuencia de aminoácidos total o sustancialmente humana. Por lo tanto, uno o más o cualquier combinación del dominio CH1, región bisagra, dominio CH2, dominio CH3 y dominio CL (y dominio CH4 si está presente) pueden ser total o sustancialmente humanos con respecto a su secuencia de aminoácidos. De manera ventajosa, el dominio CH1, región bisagra, dominio CH2, dominio CH3 y dominio CL (y dominio CH4 si está presente) pueden tener una secuencia de aminoácidos total o sustancialmente humana. En el contexto de la región constante de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizados o quiméricos, la expresión "sustancialmente humano" se refiere a una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 97 %, o al menos el 99 % con una región constante humana. La expresión "secuencia de aminoácidos humana" en este contexto se refiere a una secuencia de aminoácidos que está codificada por un gen de inmunoglobulina humano, que incluye genes de la línea germinal, reorganizados y mutados somáticamente. La divulgación también contempla polipéptidos que comprenden dominios constantes de secuencia "humana" que se han alterado, mediante una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia humana, excepto aquellas realizaciones en las que se requiere expresamente la presencia de una región bisagra "completamente humana". La presencia de una región bisagra "completamente humana" en los anticuerpos anti-hGARP de la invención puede ser beneficiosa tanto para minimizar la inmunogenicidad como para optimizar la estabilidad del anticuerpo. Se considera que una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos pueden realizarse dentro de la región constante de la cadena pesada y/o de la ligera, particularmente dentro de la región Fc. Las sustituciones de aminoácidos pueden dar como resultado el reemplazo del aminoácido sustituido con un aminoácido de origen natural diferente, o con un aminoácido modificado o no natural. También se permiten otras modificaciones estructurales, tales como, por ejemplo, cambios en el patrón de glucosilación (p. ej., mediante la adición o eliminación de sitios de glucosilación unidos a N o a O). Dependiendo del uso previsto del anticuerpo, puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a sus propiedades de unión a los receptores de Fc, por ejemplo, para modular la función efectora. Por ejemplo, pueden introducirse uno o más restos de cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo, puede tener una función efectora mejorada. Véase Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191 - 1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol.

148:2918-2922 (1992). Como alternativa, un anticuerpo contra GARP que tiene regiones Fc duales puede modificarse por ingeniería y puede de este modo potenciarse la lisis por el complemento y las capacidades de ADCC. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). La divulgación también contempla inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Las regiones Fc también pueden modificarse por ingeniería para prolongar la semivida, como lo describen Chan y Carter, 2010 Nature Reviews: Immunology, 10:301-316. Los anticuerpos anti-hGARP variantes en los que la región Fc se modifica mediante ingeniería de proteínas, como se describe en el presente documento, también pueden mostrar una mejora en la eficacia (p. ej., en terapia/diagnóstico), en comparación con un anticuerpo equivalente (es decir, propiedades de unión a antígeno equivalentes) sin la modificación de Fc.

En otro aspecto más, se modifica la región Fc para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos. En otra realización más, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, que el anticuerpo carece de glucosilación). Se puede alterar la glucosilación para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno diana GARP. Dichas modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante; por ejemplo, la alteración de uno o más sitios de glucosilación en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región marco variable para eliminar de este modo la glucosilación en ese sitio. Dicha aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. También se contemplan anticuerpos anti-hGARP variantes que tienen un tipo de glucosilación alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo no fucosilado (como lo describe Natsume et al., 2009 Drug Design Development and Therapy, 3:7-16) o un anticuerpo que tiene estructuras GlcNac bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la actividad ADCC de los anticuerpos, produciendo normalmente una potenciación de 10 veces de ADCC con respecto a un anticuerpo equivalente que comprende un dominio Fc humano "natural". Dichas modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la expresión del anticuerpo en una célula hospedadora con maquinaria enzimática de glucosilación alterada (como lo describen Yamane-Ohnuki y Satoh, 2009 mAbs 1(3):230-236).

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP comprende una región Fc que tiene la secuencia SEQ ID NO: 47.

PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP

EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 47).

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP comprende la región del dominio constante de cadena pesada que tiene la secuencia SEQ ID NO: 48, en donde X es N o está mutado en Q para inhibir la ADCC.

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV

DGVEVHNAKTKPREEQYXSTYRVVS VLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAP

IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 48).

En un aspecto de la divulgación, el resto 297 de SEQ ID NO: 48 está aglicosilado.

En otro aspecto de la divulgación, el resto N en la posición 297 de la SEQ ID NO: 48 está mutado en Q.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP comprende la región del dominio constante de cadena ligera que tiene la secuencia SEQ ID NO: 49.

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 49).

En aspectos adicionales de la divulgación, los anticuerpos anti-hGARP pueden carecer de función efectora, ya sea porque la región Fc del anticuerpo es de un isotipo que carece de manera natural de función efectora, o que muestra una función efectora significativamente menos potente que la IgG1 humana, p. ej., IgG2 humana o IgG4 humana, o porque la región Fc del anticuerpo se ha modificado por ingeniería para reducir o eliminar sustancialmente la función efectora, como se describe en Armour KL, et al., Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624.

En aspectos adicionales, la región Fc del anticuerpo anti-hGARP puede modificarse por ingeniería para facilitar la formación preferencial de anticuerpos biespecíficos, en los que dos cadenas pesadas de anticuerpos que comprenden dominios variables diferentes se emparejan para formar la región Fc del anticuerpo biespecífico. Ejemplos de dichas modificaciones incluyen las modificaciones de "botón en ojal" descritas por Ridgway JB, Presta lG, Carter P., 1996 Protein Eng. Jul; 9(7):617-21 y Merchant AM, et al. 1998 Nat Biotechnol. Jul; 16(7):677-81.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-hGARP puede mostrar una o más funciones efectoras seleccionadas de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP, por sus siglas en inglés) contra células que expresan proteína GARP humana en la superficie celular. El anticuerpo puede mostrar ADCC contra células disfuncionales relacionadas con GARP. El anticuerpo puede mostrar una función ADCC potenciada en comparación con un anticuerpo de referencia que es un anticuerpo equivalente que comprende un dominio Fc humano natural. En una realización no limitante, la función de ADCC puede potenciarse al menos 10 veces en comparación con el anticuerpo de referencia que comprende un dominio Fc humano natural. En este contexto, se puede considerar que "equivalente" significa que el anticuerpo con función ADCC potenciada muestra una especificidad de unión a antígeno sustancialmente idéntica y/o comparte una secuencia de aminoácidos idéntica con el anticuerpo de referencia, excepto por cualquier modificación realizada (en relación con Fc humano natural) con el fin de potenciar la ADCC. El anticuerpo puede contener la región bisagra, dominio CH1, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG humana, lo más preferentemente IgG1 humana. El anticuerpo puede incluir modificaciones en la región Fc, tal como por ejemplo sustituciones, eliminaciones o inserción u otras modificaciones estructurales para potenciar o reducir las funcionalidades dependientes de Fc.

Un objetivo de la presente divulgación se refiere a anticuerpos anti-hGARP o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben la señalización de TGF-p, y que pueden ser particularmente adecuados para aplicaciones terapéuticas que se benefician de la función efectora del anticuerpo, es decir, ADCC, CDC, ADCP y, en particular, de la función efectora potenciada. Por consiguiente, los anticuerpos contra GARP descritos en el presente documento que muestran función efectora (o función efectora potenciada ) y que inhiben TGF-p pueden ser particularmente ventajosos para determinadas aplicaciones terapéuticas, p. ej., cáncer, infección crónica, tratamientos de fibrosis que se benefician de la función efectora de los anticuerpos.

Otro aspecto de la divulgación es una secuencia polinucleotídica aislada que codifica la región variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID NO: 8 o de la SEQ ID NO: 50. Preferentemente, dicha secuencia de un ácido nucleico es la SEQ ID NO: 10:

ATGGCTGTCCTGGCATTACTCTTCTGCCTGGTAACATTCCCAAGCTGTATCCT

TTCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACA

GAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTATGGT

ATAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATG

ATATGGAGTGATGGAAGCACAGACTATAATTCAGTTCTCACATCCAGACTG

AGGATCAGTAAGGATAATTCCAATAGCCAGGTTTTCTTAAAAATGAACAGT

CTGCAAGTTGATGACACAGCCAGGTACTATTGTGCCAGAGATCGAAACTAC

TATGATTACGACGGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACC

GTCTCCTCA.

Otro aspecto de la divulgación es una secuencia polinucleotídica aislada que codifica la región variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO: 9 o de la SEQ ID NO: 51. Preferentemente, dicha secuencia de un ácido nucleico es la SEQ ID NO: 11:

ATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTCTTCCTGCTGTTCAGAATCACAGGCAT

AATATGTGACATCCAGGTGACACAATCTTCATCCTACTTGTCTGTATCTCTA

GGAGACAGGGTCACCATTACTTGCAAGGCAAGTGACCACATTAAAAATTGG

TT AGCCTGGT ATC AGC AGAAACC AGGAATTGCTCCT AGGCTCTTAGTTTCTG

GTGCAACCAGTTTGGAAGCTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGAT

CTGGAAAGAATTTCACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGTTGC

TACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACACCGTGGACGTTCGGTGGAGGC

ACCACTCTGGAGATCAGA.

Otro aspecto de la divulgación es un vector de expresión que comprende las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-hGARP de la invención. Un vector de expresión adecuado para su uso en la invención comprende al menos una de la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 11 o cualquier secuencia que tenga una secuencia de un ácido nucleico que comparta al menos un: 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con dichas SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.

Otro aspecto de la divulgación es una célula hospedadora aislada que comprende dicho vector. Dicha célula hospedadora puede usarse para la producción recombinante de los anticuerpos de la invención. En un aspecto, las células hospedadoras pueden ser células procariotas, de levadura, o eucariotas, preferentemente células de mamífero, tal como, por ejemplo: línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaubet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de mieloma de ratón SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) o NSO (colecciones de cultivos HpA n.° 85110503); células de riñón de mono (Cv I ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humanas (HELA, ATCC, CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, At Cc CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2), así como la línea celular PERC-6 de DSM. Los vectores de expresión adecuados para su uso en cada una de estas células hospedadoras también se conocen generalmente en la técnica. Cabe señalar que la expresión "célula hospedadora" generalmente se refiere a una línea celular cultivada. Los seres humanos completos en los que se ha introducido un vector de expresión que codifica un polipéptido de unión a antígeno de acuerdo con la invención están explícitamente excluidos de la definición de "célula hospedadora".

Otro aspecto de la divulgación es un método para producir un anticuerpo anti-hGARP o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende cultivar células hospedadoras que contienen la secuencia polinucleotídica aislada que codifica el anticuerpo anti-hGARP en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-hGARP, y recuperar el anticuerpo anti-hGARP expresado. Este proceso recombinante se puede utilizar para la producción a gran escala de anticuerpos contra GARP de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos monoclonales destinados a usos terapéuticos y de diagnóstico in vitro, ex vivo, in vivo. Estos procesos están disponibles en la técnica y serán conocidos por los expertos.

Otro aspecto de la divulgación es una línea celular de hibridoma que produce dicho anticuerpo de la divulgación.

Las líneas celulares de hibridoma preferidas de acuerdo con la invención se depositaron en la colección de plásmidos BCCM/LMBP, Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, 'Fiers-Schell-Van Montagu' building, Technologiepark 927, B-9052 Gante - Zwijnaarde BÉLGICA (Tabla 2):

T l 2

Los fragmentos y derivados de anticuerpos de la presente divulgación (que están abarcados por el término "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usa en la presente solicitud, a menos que se establezca lo contrario o se contradiga claramente con el contexto), preferentemente un anticuerpo similar a MHGARP8, se pueden producir mediante técnicas conocidas en la técnica. Los "fragmentos" comprenden una región del anticuerpo intacto, generalmente el sitio de unión a antígeno o la región variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tenga una estructura primaria que consiste en una secuencia ininterrumpida de restos de aminoácidos contiguos (denominada en el presente documento "fragmento de anticuerpo monocatenario" o "polipéptido monocatenario"), incluyendo, sin limitación (1) moléculas de Fv monocatenario, (2) polipéptidos monocatenarios que contienen únicamente un dominio variable de cadena ligera o un fragmento del mismo que contiene tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin ningún resto de cadena pesada asociado y (3) polipéptidos monocatenarios que contienen únicamente una región variable de cadena pesada o un fragmento de la misma que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin ningún resto de cadena ligera asociado; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Pueden obtenerse fragmentos de los presentes anticuerpos usando métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos Fab o F(ab')2 pueden producirse mediante digestión con proteasas de los anticuerpos aislados, de acuerdo con técnicas convencionales. Se apreciará que los fragmentos inmunorreactivos se pueden modificar usando métodos conocidos, por ejemplo, para ralentizar el aclaramiento in vivo y obtener un perfil farmacocinético más deseable, el fragmento puede modificarse con polietilenglicol (PEG). Métodos para acoplar y conjugar de forma específica del sitio PEG a un fragmento Fab' se describen en, por ejemplo, Leong et al, Cytokines 16 (3): 106-119 (2001) y Delgado et al, Br. J. Cancer 73 (2): 175-182 (1996).

Como alternativa, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo de la divulgación, preferentemente un anticuerpo similar a MHGARP8 o similar a LHG10, puede modificarse para codificar un fragmento de la divulgación. Después, el ADN modificado se inserta en un vector de expresión y se usa para transformar o transfectar una célula apropiada, que expresa después el fragmento deseado.

En determinados aspectos, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo de la presente invención, preferentemente un anticuerpo similar a MHGARP8 o similar a LHG10, se puede modificar antes de la inserción en un vector de expresión, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias homólogas no humanas (p. ej., Morrison et al., PNAS pág. 6851 (1984)), o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulina. De esa manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión del anticuerpo original. Generalmente, dichos polipéptidos que no son de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención.

Por tanto, de acuerdo con otro aspecto, se humaniza el anticuerpo de la presente invención, preferentemente un anticuerpo de tipo MHGARP8 o LHG10. Las formas de anticuerpos "humanizadas" de acuerdo con la presente invención son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por restos de una CDR del anticuerpo original (anticuerpo donante) mientras se mantiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas del anticuerpo original.

En algunos casos, los restos del marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los correspondientes restos no humanos. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las CDR o las secuencias marco importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de un anticuerpo original, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de una consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una región de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al., Nature, 321, pág. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pág. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 3, pág.

394 (1992); Verhoeyen et al. Science, 239, pág. 1534; y la patente de EE.UU. N.° 4.816.567. Los métodos para humanizar los anticuerpos de la presente divulgación son bien conocidos en la técnica.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de la presente invención se explora frente a la biblioteca completa de secuencias conocidas de dominio variable humanas. La secuencia humana que es cercana a la secuencia de ratón se acepta como marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol.

151, pág. 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196, pág. 901). Otro método utiliza un marco particular a partir de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., PNAS 89, pág. 4285 (1992); Presta et al. J. Immunol., 151 (1993)). Además, es importante que los anticuerpos se humanicen con la conservación de una alta afinidad por GARP y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles habitualmente y son familiares para los expertos en la materia. Están disponibles los programas informáticos que ilustran y exponen posibles estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del posible papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias consenso e importadas de manera que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad aumentada por el o los antígenos diana. En general, los restos de las CDR están directamente y más sustancialmente, implicados en la influencia de la unión al antígeno. Otro método para preparar anticuerpos monoclonales "humanizados" es utilizar un XenoMouse (Abgenix, Fremont, CA) como el ratón utilizado para la inmunización. Un XenoMouse es un hospedador murino cuyos genes de inmunoglobulina se han reemplazado por genes de inmunoglobulina humana funcionales. Por tanto, los anticuerpos producidos por este ratón o en hibridomas preparados a partir de los linfocitos B de este ratón, ya están humanizados. El XenoMouse se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6.162.963.

Los anticuerpos humanos también se pueden producir de acuerdo con diversas técnicas diferentes, tal como usar, para la inmunización, otros animales transgénicos que se han modificado por ingeniería para expresar un repertorio de anticuerpos humanos (Jakobovitz et al. Nature 362 (1993) 255), o mediante la selección de repertorios de anticuerpos usando métodos de presentación en fagos. Dichas técnicas son conocidas por los expertos y pueden implementarse partiendo de anticuerpos monoclonales como se divulga en la presente solicitud.

En un aspecto, los bucles hipervariables (o CDR) de Camelidae pueden obtenerse mediante inmunización activa de una especie de la familia Camelidae con un antígeno diana deseado. Como se analiza e ilustra en detalle en el presente documento, después de la inmunización de Camelidae (ya sea el animal natural o un animal transgénico modificado por ingeniería para expresar el repertorio de inmunoglobulinas de una especie de camélido) con el antígeno diana, pueden identificarse linfocitos B que producen anticuerpos (Camelidae convencionales) que tienen especificidad por el antígeno deseado y pueden aislarse polinucleótidos que codifican los dominios VH y VL de dichos anticuerpos usando técnicas conocidas.

En un aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de unión a antígeno recombinante inmunorreactivo con un antígeno diana, comprendiendo el polipéptido un dominio VH y un dominio VL, en donde al menos un bucle hipervariable o región determinante de la complementariedad en el dominio VH o en el dominio VL se obtiene a partir de un dominio VH o VL de una especie de la familia Camelidae, cuyo polipéptido de unión a antígeno se puede obtener mediante un proceso que comprende las etapas de:

(a) inmunizar una especie de la familia Camelidae con un antígeno diana o con un polinucleótido que codifica dicho antígeno diana y generar un anticuerpo contra dicho antígeno diana;

(b) determinar la secuencia de nucleótidos que codifica al menos un bucle hipervariable o una región determinante de la complementariedad (CDR) del dominio VH y/o VL de un anticuerpo convencional de Camelidae inmunorreactivo con dicho antígeno diana; y

(c) expresar un polipéptido de unión a antígeno inmunorreactivo con dicho antígeno diana, comprendiendo dicho polipéptido de unión a antígeno un dominio VH y uno VL, en donde al menos un bucle hipervariable o región determinante de la complementariedad (CDR) del dominio VH o del dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos determinada en la parte (a).

Los dominios VH y VL de Camelidae aislados obtenidos mediante inmunización activa se pueden usar como base para modificar por ingeniería polipéptidos de unión a antígeno de acuerdo con la invención. Partiendo de los dominios VH y VL de Camelidae intactos, es posible diseñar por ingeniería una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos que se desvíen de la secuencia de partida de Camelidae.

En un aspecto, dichas sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden estar presentes en las regiones marco del dominio VH y/o del dominio VL. El propósito de dichos cambios en la secuencia de aminoácidos primaria puede ser reducir propiedades presuntamente desfavorables (p. ej., inmunogenicidad en un hospedador humano (la denominada humanización), sitios de posible heterogeneidad o inestabilidad del producto (glucosilación, desamidación, isomerización, etc.) o para potenciar alguna otra propiedad favorable de la molécula (p. ej., solubilidad, estabilidad, biodisponibilidad, etc.).

En otro aspecto, los cambios en la secuencia de aminoácidos primaria pueden modificarse por ingeniería en uno o más de los bucles hipervariables (o CDR) de un dominio VH y/o VL de Camelidae obtenido mediante inmunización activa. Estos cambios pueden introducirse para potenciar la afinidad y/o especificidad de unión a antígeno, o para reducir propiedades presuntamente desfavorables, p. ej., inmunogenicidad en un hospedador humano (la denominada humanización), sitios de posible heterogeneidad y o inestabilidad del producto, glucosilación, desamidación, isomerización, etc., o para potenciar alguna otra propiedad favorable de la molécula, p. ej., solubilidad, estabilidad, biodisponibilidad, etc.

Los anticuerpos de la presente divulgación, preferentemente un anticuerpo similar a MHGARP8 o LHG10, también puede derivatizarse a anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los que una región de la o las cadenas pesada/ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en el anticuerpo original, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica y la especificidad de unión deseadas (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., pág. 6851 (1984)).

Un aspecto de la divulgación es una composición que comprende al menos una de las proteínas de la divulgación como se describe anteriormente en el presente documento.

Otro aspecto de la divulgación es una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas de la divulgación como se describe anteriormente en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en estas composiciones incluyen, pero sin limitación, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio), polietilenglicol, , poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietilenpolioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.

Otro aspecto de la divulgación es la proteína de la divulgación para inhibir la actividad de TGF-p en un sujeto que lo necesite.

Otro aspecto de la divulgación es un método para inhibir la actividad de TGF-p en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la proteína de la divulgación.

Otro aspecto de la divulgación es la proteína o la composición farmacéutica de la divulgación como se define anteriormente en el presente documento para tratar un trastorno relacionado con TGF-p en un sujeto que lo necesite.

Otro aspecto de la divulgación es un método para tratar un trastorno relacionado con TGF-p en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la proteína de la divulgación.

Las enfermedades o trastornos en los que se pueden usar los métodos de la divulgación incluyen todas las enfermedades en las que la inhibición de TGF-p puede ser beneficiosa.

Dicho trastorno relacionado con TGF-p incluye, pero sin limitación, enfermedades inflamatorias, infección crónica, cáncer, fibrosis, enfermedades cardiovasculares, enfermedad cerebrovascular (p. ej., accidente cerebrovascular isquémico) y enfermedades neurodegenerativas.

Para su uso en la administración a un sujeto, la composición se formulará para su administración al sujeto. Las composiciones de la presente divulgación pueden administrarse por vía oral, parenteral, mediante pulverización por inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término administración utilizado en el presente documento incluye subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión.

Las formas inyectables estériles de las composiciones de la presente divulgación pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes de dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, como disolvente o medio de suspensión se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite suave no volátil, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, así como los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente, en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan habitualmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables, incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados habitualmente, tales como los Tween, Span y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan habitualmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables también pueden usarse con fines de formulación.

Las pautas y dosis para la administración del anticuerpo en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden determinarse de acuerdo con métodos conocidos para estos productos, por ejemplo, utilizando las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, un anticuerpo presente en una composición farmacéutica de la presente invención se puede suministrar a una concentración de 10 mg/ml en viales de un solo uso de 100 mg (10 ml) o 500 mg (50 ml). El producto está formulado para administración intravenosa (IV) en 9,0 mg/ml de cloruro de sodio, 7,35 mg/ml de citrato de sodio dihidratado, 0,7 en g/ml de polisorbato 80 y agua estéril para inyección. El pH se ajustó a 6,5. Se apreciará que estas pautas son ilustrativas y que se puede adaptar una pauta y régimen óptimos teniendo en cuenta la afinidad y tolerabilidad del anticuerpo particular en la composición farmacéutica que debe determinarse en ensayos clínicos.

Otro aspecto de la divulgación es un método para reducir la inmunosupresión en el ambiente tumoral en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la divulgación.

Otro aspecto de la divulgación es un método para reforzar el sistema inmunitario en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la divulgación.

Otro aspecto de la divulgación es un método para inhibir la función inmunosupresora de los T reg humanos en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la divulgación.

Otro aspecto de la divulgación es un método para tratar cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la divulgación.

Otro aspecto de la divulgación es un método para tratar cáncer en un sujeto que lo necesite, en donde la composición farmacéutica de la divulgación se administrará como un anticuerpo inmunoestimulador para el tratamiento de pacientes con cáncer.

Otro aspecto de la divulgación es un método para tratar cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la divulgación en combinación con otro tratamiento para cáncer o un agente inmunoterapéutico.

Otro objetivo de la divulgación es una combinación de la proteína de la divulgación y otro tratamiento para cáncer u otro agente inmunoterapéutico para tratar o para su uso en el tratamiento de cáncer.

En un aspecto de la divulgación, dicho agente inmunoterapéutico es una vacuna antitumoral.

En otro aspecto de la divulgación, dicho agente inmunoterapéutico es un anticuerpo inmunoestimulador.

Sin desear quedar ligados a una teoría, los presentes inventores creen que la proteína de la divulgación evitará la inmunosupresión en el ambiente tumoral, aumentando así la eficacia del agente inmunoterapéutico.

Se pueden tratar diversos cánceres mediante la presente divulgación, tal como un carcinoma adrenocortical, cáncer de ano, cáncer de vejiga, tumor cerebral, glioma, carcinoma de mama, tumor carcinoide, cáncer de cuello de útero, carcinoma de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer del conducto biliar extrahepático, tumor de Ewing, tumor de células germinales extracraneales, cáncer ocular, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hipofaríngeo, carcinoma de células de los islotes, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de labios y de la cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, carcinoma de células de merkel, cáncer de cabeza y cuello escamoso metastásico, mieloma, neoplasia, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de seno y nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer de feocromocitoma, cáncer de la hipófisis, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, carcinoma de células renales, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de piel, sarcoma de Kaposi, linfoma de linfocitos T, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de vagina, cáncer de la vulva y tumor de Wilms.

Los antígenos tumorales adecuados para su uso como una vacuna antitumoral conocida en la técnica incluyen, por ejemplo: (a) antígenos de cáncer de testículo tal como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 así como polipéptidos de la familia RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que se pueden utilizar, por ejemplo, para abordar tumores de melanoma, pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, mama, gastrointestinales y de vejiga), (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con varios tumores sólidos, p. ej., cáncer colorrectal, de pulmón, de cabeza y cuello, p21/Ras (asociado con, p. ej., melanoma, cáncer de páncreas y cáncer colorrectal), CD 4 (asociado con, p. ej., melanoma), MUM 1 (asociado con, p. ej., melanoma), caspasa-8 (asociada con, p. ej., cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, p. ej., cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociada con, p. ej., melanoma), TCR (asociado con, p. ej., Linfoma no de Hodgkin de linfocitos T), BCR-abl (asociado con, p. ej., leucemia mielógena crónica), triosafosfato isomerasa, IA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT, (c) antígenos sobreexpresados, por ejemplo, galectina 4 (asociada con, p. ej., cáncer colorrectal), galectina 9 (asociada con, p. ej., enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada con, p. ej., leucemia mielógena crónica), WT 1 (asociado con, p. ej., varias leucemias), anhidrasa carbónica (asociada con, p. ej., cáncer de riñón), aldolasa A (asociada con, p. ej., cáncer de pulmón), PRAME (asociado con, p. ej., melanoma), HER-2/neu (asociado con, p. ej., cáncer de mama, colon, pulmón y ovario), alfafetoproteína (asociada con, p. ej., hepatoma), SA (asociado con, p. ej., cáncer colorrectal), gastrina (asociada con, p. ej., cáncer de páncreas y gástrico), proteína catalítica de telomerasa, MUC-1 (asociada con, p. ej., cáncer de mama y ovario), G-250 (asociada con, p. ej., carcinoma de células renales) y antígeno carcinoembrionario (asociado con, p. ej., cáncer de mama, cáncer de pulmón y cánceres del tracto gastrointestinal tal como cáncer colorrectal), (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocitos tal como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor de la hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, proteína-1/TRP1 relacionada con la tirosinasa y proteína-2/TRP2 relacionada con la tirosinasa (asociada con, p. ej., melanoma), (e) antígenos asociados a la próstata tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con, p. ej., cáncer de próstata, (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados con mieloma y linfomas de linfocitos B, por ejemplo), y (g) otros antígenos tumorales, tales como antígenos que contienen polipéptidos y sacáridos que incluyen (i) glucoproteínas tales como sialil Tn y sialil Le<x> (asociadas con, p. ej., cáncer de mama y colorrectal) así como diversas mucinas; las glucoproteínas se pueden acoplar a una proteína transportadora (p. ej., MUC-1 se puede acoplar a LH); (ii) lipopolipéptidos (p. ej., m UC-1 unida a un resto lipídico); (iii) polisacáridos (p. ej., hexasacáridos sintéticos Globo H), que pueden estar acoplado a proteínas portadoras (p. ej., a KLH), (iv) gangliósidos tales como GM2, GM12, GD2, GD3 (asociados con, p. ej., cáncer cerebral, de pulmón, melanoma), que también se puede acoplar a proteínas transportadoras (p. ej., k Lh ). Otros antígenos tumorales incluyen pi 5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-p Rl , H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos del virus del papiloma humano (VPH), que incluyen E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico de linfocitos T humanos, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23H 1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17,1, NuMa, K-ras, p 16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.

Los anticuerpos inmunoestimuladores adecuados incluyen, pero sin limitación: anti-CTLA-4, anti-PDl, anticuerpos anti-PDLI y anti-KIR.

En un aspecto de la divulgación, el método para el tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesite, comprende administrar al sujeto la proteína de la divulgación antes de, de manera simultánea y/o posterior a otro agente anticanceroso o tratamiento contra el cáncer, tal como tratamiento de quimioterapia.

Otro aspecto de la presente divulgación es un método para prevenir enfermedades infecciosas tales como el VIH, malaria o Ébola, o mejorar la vacunación contra estas infecciones, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la divulgación.

En un aspecto, la proteína de la divulgación se puede usar in vitro o in vivo para identificar muestras, tejidos, órganos o células que expresen GARP.

Ejemplos de ensayos en los que se puede usar la proteína de la invención, incluyen, pero sin limitación, ELISA, ELISA tipo sándwich, RIA, FACS, inmunohistoquímica tisular, transferencia de Western e inmunoprecipitación.

En un aspecto de la divulgación, la muestra es una muestra biológica. Ejemplos de muestras biológicas incluyen, pero sin limitación, fluidos corporales, preferentemente sangre, más preferentemente suero sanguíneo, plasma, líquido sinovial, líquido de lavado broncoalveolar, esputo, linfa, líquido ascítico, orina, líquido amniótico, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido pericárdico y macrófagos alveolares, lisados y extractos de tejidos preparados a partir de tejidos enfermos.

En un aspecto de la divulgación, el término "muestra" se refiere a una muestra tomada de un individuo antes de cualquier análisis.

En otro aspecto, la proteína de la divulgación puede marcarse con fines de diagnóstico o detección. Por marcado se entiende en el presente documento que un compuesto tiene al menos un elemento, isótopo o compuesto químico fijado para permitir la detección del compuesto. Ejemplos de marcadores incluyen, pero sin limitación, marcadores isotópicos tales como isótopos radiactivos o pesados; marcadores magnéticos, eléctricos o térmicos y colorantes de color o luminiscentes. Por ejemplo: complejos de lantánidos, puntos cuánticos, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarillo Lucifer, cascade Blue, rojo texas, colorantes alexa, colorantes cy.

Un aspecto de la divulgación es un método para identificar Treg activados en una muestra en función del uso de la proteína de la invención.

Otro aspecto de la divulgación es un método para identificar TGF-p latente soluble o en forma de complejo en función del uso de la proteína de la invención.

Otro aspecto de la divulgación es un kit que comprende al menos una proteína de la invención.

Por "kit" se entiende cualquier fabricación (p. ej., un paquete o un envase) que comprenda al menos un reactivo, es decir, por ejemplo, un anticuerpo, para detectar específicamente la expresión de GARP. El kit puede promocionarse, distribuirse o venderse como una unidad para realizar los métodos de la presente divulgación. Asimismo, cualquiera o todos los reactivos del kit se pueden proporcionar dentro de envases que los protegen del ambiente externo, tal como en envases sellados. Los kits también pueden contener un prospecto que describe el kit y los métodos para su uso.

Los kits para realizar los métodos ELISA sándwich de la divulgación generalmente comprenden un anticuerpo de captura, opcionalmente inmovilizado sobre un soporte sólido (p. ej., una placa de microtitulación) y un anticuerpo de revelación acoplado con una sustancia detectable, tal como, por ejemplo, HRP, un marcador fluorescente, un radioisótopo, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Nuevos anticuerpos monoclonales que reconocen GARP humana en la superficie celular.

Linfocitos T murinos BW5147, transfectados o no con GARP humana (hGARP) se tiñeron con anticuerpos biotinilados internos >hGARP (MHGARP1 a 9) y estreptavidina-PE (SA-PE, paneles superiores), o con un anticuerpo anti-hGARP comercial (clon Plato-1 ) y anti-IgG2b de ratón secundario acoplado a AlexaFluor 488 (AF488, paneles inferiores).

Figura 2. MHGARP8 inhibe la producción de TGF-p activo mediante un clon de Treg humano. El clon de Treg A1 se estimuló durante 24 horas con anticuerpos >CD3/CD28, solos o en presencia de los mAb(anticuerpos monoclonales, por sus siglas en inglés) >hGARP indicados (20 pg/ml). (A) Los lisados celulares se analizaron mediante TW con anticuerpos >pSMAD2 y >p-ACTINA. (B) Cuantificación de señales ECL de TW mostradas en A.

Figura 3.

(A) Regiones de la proteína hGARP necesarias para la unión de anticuerpos >hGARP. Se tiñeron linfocitos T murinos BW5147 que expresan las proteínas etiquetadas con HA esquematizadas a la izquierda con anticuerpos >hGARP (MHGARP1 a 9, como se indica en la parte superior de la figura) o >HA, y se analizaron mediante citometría de flujo. Los histogramas se seleccionaron en células vivas. De acuerdo con los resultados de FACS, se identificaron las regiones necesarias para la unión de los diversos mAb MHGARP y se indicaron mediante barras horizontales encima de las representaciones de las quimeras etiquetadas con HA.

(B) La abundancia del epítopo reconocido por MHGARP-8 aumenta con la sobreexpresión de TGF-p1.

Los linfocitos T BW5147 precursores (BW sin transfectar) o los clones transfectados de manera estable con hGARP solo (BW hGARP) o con hTGFBI (BW hGARP hTGF-b1) se tiñeron como en A, o con anticuerpos> mlAP-AF647 o >hLAP-APC, y se analizaron por citometría de flujo.

(C) Mh Ga RP-1, -2, -3, -4 y -5 reconocen hGARP libre, pero no hGARP unida a TGF-p1. Los lisados celulares de los linfocitos T BW5147 precursores o un clon transfectado de manera estable con hGARP y hTGFB1 se inmunoprecipitaron con mAb >hGARP (MHGARP1 a 9, como se indica en la parte superior de la figura). Los lisados celulares (30 % de entrada) o los productos IP se analizaron mediante transferencia Western con un mAb >hGARP comercial (clon Plato-1, paneles superiores) y con un anticuerpo dirigido contra un epítopo carboxiterminal de TGF-p1, que detecta pro-TGF-p1 como una banda de 50 kDa y TGF-p1 maduro como una banda de 13 kDa (paneles inferiores). * Producto inespecífico detectado en células no transfectadas.

(D) La sobreexpresión de hTGFB1 en células 293T transfectadas con hGARP disminuye la unión de MHGARP-1, -2, -3, -4 y -5, pero aumenta la unión de MHGARP-8. Se transfectaron conjuntamente células 293T con un plásmido que codifica hGARP (0,25 pg), las cantidades indicadas de un plásmido que codifica hTGFBI y un plásmido vacío para alcanzar la cantidad total de ADN transfectado a 2,5 pg en todas las condiciones. Las células transfectadas se tiñeron con mAb >hGARP (MHGARP1 a 9, como se indica en la parte superior de la figura) y se analizaron mediante citometría de flujo.

(E) El silenciamiento de hTGFB1 en células JURKAT transducidas con hGARP disminuye la unión de MHGARP-8. Se transfectaron células JURKAT, transducidas o no con hGARP, con ARNip específico para el ARNm de TGFB1 (TGFBlip) o un control de mezcla de ARNip. Las células transfectadas se tiñeron con mAb >hGARP (MHGARP1 a 9, como se indica en la parte superior de la figura) o con un anticuerpo >hLAP, y se analizaron mediante citometría de flujo.

Figura 4. La presentación de hTGF-p1 en la superficie celular no es suficiente para la unión de MHGARP8.

Las células 293T se transfectaron como se indica a continuación, teñidas con anticuerpos >hLAP o con MGARP8, después se analizaron mediante citometría de flujo.

(A) Transfección con construcciones que codifican las proteínas etiquetadas con HA esquematizadas a la izquierda, sin una construcción de hTGFBI.

(B) Transfección conjunta con construcciones que codifican las proteínas etiquetadas con HA esquematizadas a la izquierda, con una construcción hTGFBI.

Figura 5. La unión de MHGARP-2, -3 y -8 necesita los aminoácidos 137-138-139 de hGARP. Las linfocitos T BW5147 precursores (BW sin transfectar) o los clones transfectados de manera estable con plásmidos que codifican formas de hGARP etiquetadas con HA se tiñeron con los anticuerpos >hGARP o >HA indicados, y se analizaron mediante citometría de flujo. Las formas etiquetadas con HA de hGARP probadas en este caso, comprendían los aa 20-662 de hGARP (tipo silvestre, TS), o los aa 20-662 de hGARP en el que grupos de 3 aminoácidos ubicados en la región 101-141 se reemplazaron por los aminoácidos que se encuentran en la región correspondiente de mGARP (Mut I, Mut II y Mut III). Las secuencias de aminoácidos de la región 101-141 de hGARP -TS, -Mut I, -Mut II, -Mut III y mGARP se indican a la izquierda. Los aminoácidos que difieren entre GARP humana y de ratón están resaltados por recuadros verticales de color gris y los aminoácidos mutados en Mut I, Mut II y Mut III se indican mediante recuadros horizontales de color negro.

Figura 6. MHGARP8 inhibe la función de Treg in vivo. El día 0, los grupos indicados de ratones NSG recibieron inyecciones i.v. de PBMC humanas, en combinación o no con Treg humanos. Los ratones de los grupos III y IV se trataron con el anticuerpo MHGARP8, inyectado i.p. una vez a la semana, comenzando en el día -1. Los signos objetivos de la aparición de GvHD en los ratones receptores se monitorizaron quincenalmente. Se estableció una puntuación de GvDH en función de la pérdida de peso (0: <10 %; 1: 10 %- 20 %; 2: > 20 %; 3: > 30 %), anemia (0: cola roja o rosada; 1: cola blanca), postura (0: normal; 1: joroba), actividad general (0: normal; 1: limitada), caída de pelo (0: sin pérdida de pelo; 1: caída de pelo) e ictericia (0: cola blanca o roja; 1: cola amarilla). La gravedad máxima de la enfermedad o la muerte correspondió a una puntuación de 7. (A) Experimento 1. Los valores representan puntuaciones medias. (B) Experimento 2. Los valores representan puntuaciones medias SEM.

Figura 7. Nuevos mAb anti-hGARP. (A) Representación esquemática de las estrategias experimentales utilizadas para obtener mAb anti-hGARP. (B) Análisis por citometría de flujo del clon ThA2 (linfocitos Th CD4+ humanos que no expresan hGARP), o linfocitos ThA2 transducidos con hGARP, después de teñir con mAb MHG-1 a -14 biotinilados y estreptavidina acoplada a PE (SA-PE), con mAb LHG-1 a -17 y un anticuerpo secundario anti-hIgG1 acoplado a PE, o con un mAb anti-hGARP de ratón disponible comercialmente (clon Plato-1) y un anticuerpo secundario anti-mIgG2b acoplado a AF647.

Figura 8. Respuestas inmunitarias de llamas inmunizadas. (A) muestra respuestas inmunitarias de llamas inmunizadas con ADN. (B) muestra respuestas inmunitarias de llamas inmunizadas con células BW que expresan hGARP/hTGFp.

Figura 9. Reactividad cruzada con GARP-TGFp de cynomolgus medida en células mediante FACS. Se transfectaron células 293E con GARP humana/de cyno y TGFB humano/de cyno. LHG-10-D y las variantes optimizadas por afinidad tienen reactividad cruzada con GARP-TGFB de cynomolgus.

Figura 10. Secuencias de anticuerpos LHG-10 y sus variantes reordenadas.

Figura 11. MHGARP8 y LHG-10 inhiben la producción de TGF-p activo por Treg humanos. Después de una amplificación in vitro corta, las células humanas (Treg) CD4+CD25hiCD127lo se volvieron a estimular con perlas recubiertas de anti-CD3/CD28 durante 24 horas, en presencia o ausencia de los mAb indicados (10 pg/ml). Los lisados de células se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra SMAD2 fosforilado (pSMAD2), como una lectura para determinar producción de TGF-p activo, o p-ACTINA (control de carga).

Figura 12. MHGARP8 y LHG-10 inhiben la actividad supresora de Treg humanos in vitro. (A) Se sembraron células CD4+CD25-CD127hi humanas recién aisladas (Th; 2x104 por micropocillo) solas o con el clon de Treg A1 (Stockis, J. et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39:869-882) en una relación de Treg a Th de 1/1. Las células se estimularon con anti-CD3 recubierto y anti-CD28 soluble, en presencia o ausencia de los mAb anti-hGARP indicados (10 pg/ml). Se añadió 3H-timidina (3H-Thy) durante las últimas 16 horas de un cultivo de 4 días y se midió la incorporación en un contador de centelleo como una lectura de proliferación. Los histogramas de barras indican kcpm (media de triplicados SD). El clon de Treg A1 no proliferó en ausencia de linfocitos Th (Treg solamente: 0,5±0,04 kcpm). La supresión de la proliferación de Th en presencia de Treg se indica encima de cada barra negra y se calcula de la siguiente manera: % de supresión = 1-(kcpm (Th solamente)/kcpm (Th Treg). (B) Se sembraron células del clon ThA2 (Th; 1x104 por micropocillo) con el clon de Treg A1 en las relaciones de Treg a Th indicadas, en presencia o ausencia de Mh Ga RP8 (MHG-8), mAb anti-hTGF-p1 (clon 1D11) o un control de isotipo (mIgG1). Se realizaron la estimulación la medida de la proliferación y el cálculo de la supresión como en A.

Figura 13. Formas y regiones de GARP unidas por mAb anti-GARP. (A) Representaciones esquemáticas de los complejos GARP y GARP/TGF-B. La proteína GARP está representada por una línea gris curva gruesa. Los números indican las posiciones de los aminoácidos. TGF-p se representa con el péptido asociado a latencia (LAP) como líneas negras gruesas, y el péptido TGF-p1 maduro como líneas grises rectas gruesas. Las líneas negras delgadas representan enlaces disulfuro entre cadenas. (B) Clasificación de mAb anti-hGARP de acuerdo con sus necesidades de unión.

Figura 14. Tres grupos de mAb anti-hGARP se unen solamente a GARP libre, a complejos GARP libre y GARP/TGF-p1, o solamente a complejos GARP/TGF-p1, respectivamente. (A) Se inmunoprecipitaron lisados celulares de células BW transfectadas con hGARP y hTGFBI con los mAb anti-hGARP indicados. Los lisados totales (BW hGARP hTGFB1 o controles sin transfectar) y los productos IP se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra hGARP (clon Plato-1), LAP o el péptido TGF-p maduro. (B) Análisis por citometría de flujo de células 293T, sin transfectar o transfectadas con hGARP, hTGFBl o ambos, y teñidas como se indica con mAb anti-LAP-APC, MHG biotinilados y estreptavidina-PE, clon Plato-1 y mAb >mIgG2b-AF647, o LHG y >hIgG1-PE.

Figura 15. Aminoácidos de hGARP necesarios para la unión de los mAb MHG y LHG. (A) Análisis por citometría de flujo de células 293T transfectadas con plásmidos que codifican las quimeras mGARP/hGARP etiquetadas con HA esquematizados a la izquierda (los números representan posiciones de aminoácidos en hGARP). Las células se tiñeron con mAb MHG biotinilados y estreptavidina-PE, mAb LHG y >hIgG1-PE, o anti-HA y> mIgG1-AF647. Se transfectó conjuntamente hTGFBI con quimeras mGARP/hGARP para los análisis de mAb que se unen a complejos hGARP/hTGF-p1 solamente (LHG-3, MHGARP8 (MHG-8), LHG-10). (B) Como en el caso anterior, excepto que las células 293T se transfectaron con plásmidos que codifican formas mutadas de hGARP etiquetada con HA de longitud completa. En cada mutante, se reemplazaron 3 aminoácidos de hGARP por los 3 aminoácidos que se encuentran en mGARP, como se ilustra en la alineación de la izquierda (los números representan posiciones de aminoácidos en hGARP).

Figura 16. Inhibición de la función de Treg humana por anti-hGARP in vivo. (A) muestra el protocolo el día 0, los grupos indicados de ratones NSG recibieron inyecciones i.v. de PBMC humanas, en combinación o no con Treg humanos. (B) muestra los resultados de 4 experimentos independientes (I a IV), realizados con células de donantes A, B o C, con el número de ratones por grupo (n) indicado. El inicio de la enfermedad es el día en que la puntuación media de la enfermedad se convierte >1, y está indicado para 3 grupos experimentales en los que los ratones se injertaron solamente con PBMC (grupo a), PBMC y Treg (grupo b), o PBMc y Treg y se trataron con MHGARP8 (MHG-8) (grupo c). (C) Resultados detallados del experimento IV, que muestra la evolución de la puntuación media de la enfermedad (izquierda) y las curvas de supervivencia (derecha) en los grupos de ratones indicados. La significación estadística de las diferencias entre los grupos b (PBMC Treg) y (PBMCs Treg MHG-8) se calculó mediante el análisis Anova de 2 vías para la progresión de las puntuaciones de la enfermedad (p = 0,0001) y una prueba del rango logarítmico (Mantel-Cox) para la supervivencia (p = 0,0027).

Ejemplos

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Nuevos anticuerpos monoclonales dirigidos contra GARP humana (monoclonales >hGARP)

Se inmunizaron ratones DBA/2 o Balb/c con células P1HTR murinas transfectadas con GARP humana. Los sueros de ratones inmunizados se probaron para determinar la presencia de anticuerpos >hGARP, mediante la exploración de la unión a células BW que expresaban hGARP mediante FACS. Los esplenocitos de ratones con títulos de anticuerpos >hGARP altos se fusionaron con células SP2/neo. Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT y se clonaron en dilución limitante. Los sobrenadantes de clones de hibridoma /- 1600 se exploraron mediante FACS para determinar la presencia de anticuerpos que se unieron a células BW que expresaban hGARP. Se identificaron 38 clones que producían monoclonales >hGARP en esta exploración. Se seleccionaron y amplificaron nueve clones para la producción y purificación a gran escala de 9 nuevos monoclonales >hGARP (MHGARP1 a 9).

Como se muestra en la figura 1, MHGARP1 a 9 se unen a células BW5147 murinas transfectadas con hGARP, pero no a las células no transfectadas. MHGARP1 a 9 también se unen a células 293T transfectadas con hGARP y a dos líneas de linfocitos T humanos (clon Th A2 y Jurkat) transducidas con un lentivirus que codifica hGARP, pero no la as células precursores correspondientes (no mostrado). Este patrón de reconocimiento es idéntico al de un mAb >hGARP disponible comercialmente (clon Plato-1) utilizado en este caso, como control positivo. Estos resultados muestran que MHGARP1 a 9 reconocen hGARP en las superficies celulares.

Como se muestra en la Figura 7, se produjeron y purificaron 5 anticuerpos MHGARP adicionales. Los anticuerpos MHGARP (MHG-1 a -14 en la figura) no se unen al clon ThA2 (linfocitos T auxiliares CD4+ humanos, que no expresan hGARP), pero se unen a ThA2 transducido con hGARP.

Ejemplo 2: MHGARP8, pero ninguno de los otros 12 monoclonales >hGARP, inhibe la producción de TGF-B activo por linfocitos Treg humanos

Se estimuló un clon de Treg humano (1E+06 células/ml) en medio sin suero con anticuerpos anti-CD3 recubiertos (1 |jg/ml) y anti-CD28 solubles (1 jg/ml), en presencia o ausencia de 20 jg/m l de un anticuerpo monoclonal >hGARP. En esta ensayo se probaron trece monoclonales >hGARP: los 9 nuevos monoclonales (MHGARP1 a 9) de los presentes inventores y los clones de anticuerpos Plato-1 disponibles comercialmente (Enzo Life Sciences, número de catálogo ALX-804-867), 272G6 (Synaptic Systems, número de catálogo 221 111), 50G10 (Synaptic Systems, número de catálogo 221 011) y 7B11 (BioLegend, número de catálogo 352501). Las células se recogieron después de 24 horas, se lisaron y se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reductoras. Los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa con el sistema iBIot (Life Technologies). Después del bloqueo, las membranas se hibridaron con anticuerpos primarios dirigidos contra SMAD2 fosforilado (pSMAD2, Cell Signaling Technologies) o p-ACTINA (SIGMA), después se hibridaron con anticuerpos secundarios acoplados a HRP y se revelaron con sustrato quimioluminiscente potenciado (ECL, por sus siglas en inglés) (ThermoFisher Scientific). La presencia de pSMAD2 indica la producción de TGF-p1 activo por el clon de Treg estimulado. Las señales de ECL se cuantificaron midiendo la densidad de las bandas de pSMAD2 de 55 kDa y de p-ACTINA de 40 kDa en autorradiografías, utilizando el programa informático Image J.

Para examinar si se necesita hGARP para la producción de TGF-p activo por los linfocitos Treg estimulados con TCR, se estimuló un clon de Treg humano a través de su receptor de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés), solo o en presencia de mAb >hGARP. El TGF-p activo producido por Treg estimulados desencadena una señal autocrina, que conduce a la fosforilación y activación de los factores de transcripción SMAD2 y SMAD3. Se midió la presencia de SMAD2 fosforilado (pSMAD2) mediante transferencia Western (TW), como lectura para determinar la producción de TGF-p activo por el clon de Treg estimulado. Como se muestra en la figura 2, pSMAD2 se redujo más de 10 veces en presencia de MHGARP8. Esta reducción es similar a la observada en presencia de un mAb anti-TGF-p, utilizado en este caso, como control positivo. Ninguno de los otros 12 mAb >hGARP (otros 8 MHGARP producidos internamente y 4 anticuerpos anti-GARP disponibles comercialmente) inhibió la producción de TGF-p activo por el clon de Treg. En conjunto, los datos de los presentes inventores demuestran que se necesita GARP para la producción de TGF-p activo por Treg humanos, así como MHGARP8, un anticuerpo dirigido contra hGARP, impidió la producción de TGF-p activo.

Ejemplo 3: MHGARP8, pero no otros mAb >hGARP, reconoce un epítopo conformacional que necesita la presencia de TGF-p

Mapeo de las regiones reconocidas por monoclonales >hGARP

Se electroporaron linfocitos T murinos BW5147 con plásmidos que codifican las proteínas etiquetadas con HA esquematizadas en la figura 3A, que corresponde a hGARP, mGARP o quimeras mGARP/hGARP. Los clones estables seleccionados en neomicina se tiñeron con anticuerpos anti-hGARP biotinilados (>hGARP1 a 9) y estreptavidina-PE, con el anticuerpo anti-hGARP comercial (clon Plato-1) y un anti-mIgG2b-AF488 secundario, o con un anticuerpo anti HA e anti-IgG1-AF488 de ratón secundario. Los histogramas se seleccionaron en células vivas. Los histogramas de color negro muestran señales en células BW no transfectadas, los histogramas de color blanco muestran señales en células BW que expresan hGARP etiquetada con HA, y los histogramas de color gris muestran señales en células BW que expresan mGARP o quimeras mGARP/hGARP etiquetadas con HA.

Se tiñeron linfocitos T BW5147 precursores (BW sin transfectar) o clones transfectados de manera estable con hGARP solo (BW hGARP) o con hTGFBI (BW hGARP hTGF-p1) con anticuerpos anti-hGARP biotinilados ( >hGARP1 a 9) y estreptavidina-PE, con el anticuerpo anti-hGARP comercial (clon Plato-1) y con un anti-mIgG2b-AF488 secundario, o con anticuerpos >mlAP-AF647 o >hLAP-APC.

Se investigó el mecanismo por el cual MHGARP8, pero no otros mAb >hGARP, inhibe la producción de TGF-p activo por Treg. Los presentes inventores plantearon la hipótesis de que MHGARP8 puede reconocer un epítopo en hGARP que es distinto de los epítopos reconocidos por los otros mAb >hGARP.

Con la excepción de MHGARP-1, los mAb MHGARP de los presentes inventores no reconocen GARP murino (mGARP). Por tanto, se construyeron plásmidos que codificaban hGARP, mGARP o quimeras hGARP/mGARP etiquetadas con HA para mapear las regiones de hGARP reconocidas por los mAb de los presentes inventores. Se transfectaron células BW murinas y se obtuvieron clones estables que expresaban las proteínas etiquetadas con HA (representadas esquemáticamente en la figura 3). Todos los clones expresaron niveles similares de proteína etiquetada con HA en la superficie, como indican las intensidades de fluorescencia similares después de teñir con un mAb >HA (figura 3A). Como cabía esperar, todos los mAb MHGARP unidos al clon que expresaba hGARP etiquetada con HA, mientras que ninguno, excepto MHGARP-1, se unió al clon que expresaba mGARP etiquetada con HA. Cuatro grupos de mAb surgieron del análisis de la unión a las quimeras hGARP/mGARP etiquetadas con HA (figura 3A). Los anticuerpos monoclonales en el primer grupo (MHGARP-6, -7 y -9) no se unieron a ninguna de las quimeras, indicando que reconocen un epítopo ubicado entre los aa 20 y 101 de hGARP (región 20-101). Los mAb en el segundo grupo (MHGARP-2, -3 y -8) se unieron a solamente 1 de las 5 quimeras y, por lo tanto, reconocen un epítopo en la región 101-141. Un tercer grupo comprende MHGARP-5, que se unió a 2 de las quimeras y por lo tanto reconoce la región 141-207. Este grupo probablemente también contiene MHGARP-1, que tiene reactividad cruzada pero se unió a estas 2 quimeras de manera más eficaz a la que se unió a mGARP o las otras 3 quimeras. Finalmente, los mAb del cuarto grupo (MHGARP-4 y Plato-1) se unieron a 4 de las 5 quimeras y reconocen, por lo tanto, la región 265-333.

En función de lo anterior, se agruparon los mAb >hGARP en 4 familias de anticuerpos que reconocen 4 regiones distintas de la proteína hGARP. MHGARP-8, que muestra actividad neutralizante, se une a la región 101-141. Esta región también se reconoce por MHGARP-2 y -3, que no son neutralizantes. Por lo tanto, la capacidad para unirse a la región 101-141 no es suficiente para conferir actividad neutralizante.

Para definir adicionalmente los epítopos reconocidos por MHGARP-2, -3 y -8, se comparó la unión de los anticuerpos >hGARP a clones de células BW que expresan hGARP solamente (BW+hGARP), o hGARP y hTGF-p1 (BW+hGARP+hTGF-p1). Con la notable excepción de MHGARP8, todos los anticuerpos >hGARP tiñeron BW+hGARP+hTGF-p1 con la misma intensidad que BW+hGARP, lo que indica que los dos clones expresan los mismos niveles de hGARP en la superficie celular. Por el contrario, el anticuerpo MHGARP8, tiñó BW+hGARP+hTGF-Bl de manera más intensa que BW+hGARP (figura 3B). Esto indica que aunque los niveles de hGARP son similares en los dos clones, el epítopo reconocido por MHGARP8 es más abundante en las células BW+hGARP+hTGF-p1 que en las células BW+hGARP.

Una explicación plausible para esta observación es que el epítopo reconocido por MHGARP8 aparece solamente cuando hGARP está unida a TGF-p1 murino (m) o humano (h). Esto podría deberse a uno de dos mecanismos: o el epítopo comprende aminoácidos tanto de hGARP como de TGF-p1 (epítopo conformacional mixto), o comprende aminoácidos de hGARP solamente, pero que adoptan una conformación diferente en presencia de TGF-p1 (epítopo conformacional inducido por unión). Las células BW expresan TGF-p1 murino y el TGF-p1 murino se une a hGARP (figura 3B). Por lo tanto, la unión de MHGARP8 a BW+hGARP (en ausencia de hTGF-p1 transfectado) podría deberse al reconocimiento de complejos de hGARP/mTGF-p1.

Para explorar la hipótesis de que MHGARP8 reconoce GARP cuando está unida a TGF-p1, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación conjunta. Se usaron los diferentes anticuerpos anti-GARP para inmunoprecipitar GARP a partir de células BW+hGARP+hTGF-p1, después se verificó si TGF-p se inmunoprecipitó junto con GARP. Como se muestra en la figura 3C, todos los anticuerpos anti-GARP inmunoprecipitaron GARP de manera eficaz (figura 3C, paneles superiores). Se observó inmunoprecipitación conjunta de TGF-p1 con mAb MHGARP-6, -7, -8 y -9, lo que indica que estos anticuerpos se unen a GARP unida a TGF-p1. Por el contrario, MHGARP-1, -2, -3, -4 y -5 inmunoprecipitaron GARP de manera tan eficaz como los otros mAb anti-GARP, pero no inmunoprecipitaron junto con TGF-p (figura 3C, paneles inferiores). Esto indica que MHGARP-1, -2, -3, -4 y -5 reconocen GARP libre, pero no GARP que está unida a TGF-p. Es importante señalar que MHGARP-2 y -3, que necesitan la región GARP101-141 para la unión, reconocen solamente GARP libre, mientras que MHGARP8 neutralizante, que también necesita GARP101-141, reconoce a GARP unida a TGF-p.

Para confirmar esta observación, se utilizaron células 293T, que expresan niveles bajos de TGF-p1 endógeno, para transfectar hGARP de manera conjunta con cantidades crecientes de hTGFBI (figura 3D). La unión de MHGARP-1, -2, -3, -4 y -5 disminuyeron de manera dependiente de la dosis cuando hTGFBI se transfectó de manera conjunta con hGARP. Se anuló completamente a las dosis más altas de hTGFBI. Esto confirma que MHGARP-1 a -5 se unen solamente a GARP libre. La unión de MHGARP-6, -7 y -9 no se modificó por la transfección de manera conjunta de hTGFBI, lo que indica que estos mAb se unen a hGARP esté o no unida a TGF-p1 (es decir, se unen tanto a GARP libre como a GARP unida a TGF-p1). Sorprendentemente, la unión de MHGARP8 aumentó de forma dependiente de la dosis cuando hTGFBI se transfectó de manera conjunta con hGARP. Esto sugiere nuevamente que, en contraste con todos los otros anticuerpos, MHGARP8 no se une a GARP libre, sino solamente a GARP unida a TGF-p1.

Para demostrar que la unión de MHGARP8 necesita la presencia de TGF-p1, se utilizaron ARNip para silenciar la expresión de TGFB1 en células Jurkat transducidas con hGARP (figura 3E). El ARNip contra el ARNm de TGFB1 redujo de manera eficaz la expresión de TGF-p1, como se ilustra por la disminución de LAP en superficie detectada en las células Jurkat+hGARP (figura 3E, panel derecho). La expresión reducida de TGF-p1 en Jurkat+hGARP disminuyó la unión del anticuerpo MHGARP8, pero no modificó la unión de los otros anticuerpos anti-GARP (figura 3E, histogramas de primer plano). Esto confirma que, a diferencia de los otros anticuerpos anti-GARP, MHGARP8, no se une a GARP libre, sino que solamente se une a GARP en presencia de TGF-p1.

Finalmente, se buscó excluir la hipótesis poco probable de que la presentación de TGF-p en la superficie celular, independientemente de la expresión de hGARP, es suficiente para la unión por MHGARP8. En otras palabras, se buscó demostrar que MHGARP8 reconoce un epítopo conformacional mixto o inducido por unión que necesita la expresión tanto de hGARP como de TGF-p. Para esto, se transfectaron células 293T con construcciones que codifican hGARP, mGARP o las quimeras hGARP/mGARP descritas anteriormente, con o sin una construcción que codifica hTGF-p1. Las células transfectadas se analizaron mediante FACS para medir la unión del anticuerpo MHGARP8 y la presentación de hTGF-B1 en la superficie celular con un anticuerpo >hLAP (figura 4). En comparación con las células no transfectadas, transfección de las construcciones de hGARP, mGARP o hGARP/mGARP solas (sin hTGFB1) indujeron niveles bajos de LAP en superficie, debido a los bajos niveles de expresión de hTGFB1 endógeno (figura 4A, izquierda). Los niveles de LAP en superficie aumentaron drásticamente tras la transfección de hTGFB1 en células transfectadas con hGARP, mGARP, o cualquier construcción hGARP/mGARP (figura 4B, histograma izquierdo). Esto indica que hGARP presenta hTGF-p1 en la superficie celular, mediante mGARP y mediante todas las quimeras hGARP/mGARP. De manera importante, MHGARP8 se unió solamente a la superficie de las células transfectadas con hGARP, o con las construcciones de hGARP/mGARP que codifican los aminoácidos 101 a 141 de hGARP (figura 4A y 4B, derecha). No se unió a las células transfectadas con hTGFB1 y mGARP, ni a las células transfectadas con construcciones de hTGFB1 y de hGARP/mGARP que no codifican hGARP101-141 (figura 4B, derecha), aunque estas células presentaban altos niveles de LAP en su superficie (figura 4B, izquierda). Esto demuestra que la presentación de TGF-p1 en la superficie celular (por mGARP o quimeras hGARP/mGARP) no es suficiente para la unión por MHGARP8. La unión de MHGARP8 necesita la presencia tanto de hGARP (región 101-141) como de TGF-p1 en la superficie celular.

Como se indica anteriormente, MHGARP8 no se une a mGARP. Su unión a hGARP necesita una región que comprende los aminoácidos 101 a 141. Para definir adicionalmente el epítopo reconocido por MHGARP8, se compararon las secuencias de la región 101-141 en GARP humana y murina. En esta región, solamente 13 aminoácidos difieren entre hGARP y mGARP (figura 5, aminoácidos resaltados por recuadros grises). Se construyeron 3 formas mutantes etiquetadas con HA de hGARP. En cada mutante (Mut I, Mut II y Mut III), se reemplazaron 3 aminoácidos consecutivos por los correspondientes aminoácidos de la proteína mGARP (figura 5, recuadros negros). Se obtuvieron clones estables de células BW transfectadas con estas formas de hGARP de tipo silvestre (TS) o mutante etiquetadas con HA. Todos los clones expresaron niveles similares de proteína etiquetada con HA en la superficie, como se demuestra mediante la tinción con un anticuerpo >HA (figura 5, histogramas a la derecha). A continuación se analizaron los clones después de la tinción con MHGARP-2, -3 y -8, es decir, anticuerpos que necesitan la región 101-141 de hGARP para unirse. Los tres anticuerpos se unieron a las células que expresaban formas TS, Mut I y Mut II de hGARP. Por el contrario, la unión se redujo considerablemente en las células que expresaban la forma Mut III de hGARP, indicando que MHGARP-2, -3 y -8 necesitan los aminoácidos 137-138-139 de hGARP para unirse.

En conjunto, los datos de los presentes inventores muestran que MHGARP8 es el único anticuerpo anti-GARP disponible que inhibe la producción de TGF-p1 activo por Treg humanos. Esta actividad neutralizante está ligada a la unión de MHGARP8 a un epítopo que es distinto de aquellos unidos por todos los otros anticuerpos anti-GARP: La unión de MHGARP8 necesita tanto la región 101-141 de hGARP como la presencia de hTGF-p, mientras que la unión de anticuerpos no neutralizantes necesita otras regiones de hGARP (para MHGARP-1, -4, -5, -6, -7 y -9), o se produce solamente en ausencia de TGF-p1 (para MHGARP-2 y -3). En la región hGARP101-141, los aminoácidos 137 a 139 son necesarios para la unión de MHGARP-2, -3 y -8.

La afinidad del anticuerpo MHGARP8 con shGARP-TGFp inmovilizado se midió mediante análisis BIACOR: la Kd de dicho anticuerpo es 0,2 nM.

Ejemplo 4: MHGARP8 inhibe la función de los linfocitos Treg humanos in vivo

Para examinar si MHGARP8 también inhibe los Treg humanos in vivo, se utilizó un modelo de GvDH xenogénica inducida por la transferencia de PBMC humanas (células mononucleares de sangre periférica) a ratones NOD-Scid-IL2Rg_/' (NSG) inmunocomprometidos. Los ratones NSG carecen de linfocitos T, B y células NK funcionales. Esto permite el injerto eficaz de células madre hematopoyéticas humanas (HSC, por sus siglas en inglés), que proliferan y generan un sistema inmunitario humano funcional en ratones receptores. Cuando se utilizan PBMC humanas en lugar de HSC, se produce un injerto eficaz de linfocitos T, pero pronto está acompañado por la aparición de una enfermedad de injerto contra huésped xenogénica (GvDH, por sus siglas en inglés). En este modelo, la GvDH es el resultado de la actividad de los linfocitos T citotóxicos de donantes humanos que reconocen tejidos de los ratones NSG receptores como extraños (Shultz, et al. Nature 2012, 12:786-798). La gravedad de la GvDH se puede reducir mediante la transferencia conjunta de linfocitos Treg humanos con PBMC humanas (Hannon et al. Transfusion 2014).

Las PBMC humanas se aislaron de la sangre total de un donante de hemocromatosis mediante centrifugación en gradientes de densidad (LymphoprepTM) y se congelaron para su uso posterior. Los Treg autólogos se generaron de la siguiente manera: se aislaron linfocitos T CD4+ de la sangre del mismo donante utilizando el cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos RosetteSepTM (StemCell Technologies) y se tiñeron con anticuerpos anti-CD4, anti-CD25 y anti-CD127 acoplados a fluorocromos. Las células CD4+CD25hiCD127lo se clasificaron mediante citometría de flujo (> 99 % de pureza) y después se estimularon con perlas recubiertas con anti-CD3/CD28 (Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 para la expansión y activación de linfocitos T, Life Technologies) en presencia de IL-2 (120 UI/ml) durante 14 días. Estos linfocitos Treg expandidos se congelaron para su uso posterior.

Se irradiaron ratones NSG (2,5 Gy) el día -1, después se inyectaron en la vena de la cola con PBMC humanas (2,7x106 por ratón) solas, o mezcladas con Treg humanos expandidos (1,4x106 por ratón) el día 0. Los ratones también recibieron inyecciones i.p. semanales de anticuerpo MHGARP8 (400 |jg el día -1 (día menos 1), 200 |jg en puntos temporales posteriores) o PBS de control. Los ratones se monitorizaron cada dos semanas para determinar la aparición de GvDH como se indica en el texto.

Se transfirieron PBMC humanas con o sin Treg en ratones NSG y se trataron los ratones con inyecciones i.p. de anticuerpo MHGARP8 o PBS de control. La gran cantidad de linfocitos Treg humanos necesarios para las transferencias se obtuvo mediante una breve amplificación in vitrode células CD4+CD25+CD127lo clasificadas a partir de PBMC humanas mediante citometría de flujo. Los signos objetivos de la aparición de GvHD en los ratones receptores se monitorizaron quincenalmente. Se realizaron dos experimentos independientes, que produjeron resultados similares. En el experimento 1 (figura 6A), aparecieron signos de GvHD (puntuación media > 1) 29 días después de la inyección de PBMC humanas (grupo I; n=2). La gravedad de la enfermedad aumentó rápidamente y uno de los 2 ratones se sacrificó por razones éticas el día 55. En ratones inyectados con PBMC y Treg (grupo II; n=3), la aparición de GvDH se retrasó en comparación con las PBMC solas (puntuación media >1 alcanzada después de 58 días). Esto indica que los Treg, como cabía esperar, protegían parcialmente a los ratones NSG contra GvHD. De manera importante, el tratamiento de ratones que recibieron PBMc y Treg con el anticuerpo MHGARP8 (grupo III, n=6) agravó la enfermedad: los signos de GvDH aparecieron antes (36 días) que en los ratones del grupo II. El efecto de MHGARP8 parece depender de la presencia de Treg, ya que no se observaron diferencias en la puntuación de la enfermedad entre los ratones que recibieron PBMC solamente (grupo I) o PBMC y MHGARP8 (grupo IV; n=4). Se repitió este experimento con un mayor número de ratones por grupo (figura 6B). De nuevo, la inyección conjunta de Treg con PBMC retrasó la aparición de GvHD en comparación con PBMC solas (día 46 en el grupo II frente al día 28 en el grupo I), y el tratamiento con el anticuerpo MHGARP8 agravó la GvHD en ratones que recibieron PBMC y Treg (día 28 en el grupo III) mediante comparaciones con ratones no tratados (día 46 en el grupo II). En conjunto, esto muestra que MHGARP8 inhibe la función inmunosupresora de los Treg humanos in vivo.

Ejemplo 5: Nuevos anticuerpos monoclonales (mAb) anti-hGARP utilizando el enfoque de inmunización de llamas

Producción de complejo GARP-TGFp1 soluble recombinante

El complejo GARP-TGFp1 humano y murino se produjo como un complejo soluble usando una construcción de expresión de GARP truncada. La secuencia de la proteína GARP humana se truncó después de Leucina 628, seguido de una etiqueta TEV-3x strep escindible (EAAENLYFQGAAWSHPQFEKGAAWSHPQFEKGAAWSHPQFEKGAA*) (SEQ ID NO: 40). La secuencia de la proteína GARP murina se truncó después de la leucina 629, seguido de la misma etiqueta TEV-3x strep escindible. Los complejos GARP-TGFp1 se produjeron por expresión conjunta de GARP truncada y el TGFpl en células HEK293E, seguida de purificación mediante la etiqueta Strep.

Inmunización de llamas

Las inmunizaciones de llamas y la recogida de linfocitos de sangre periférica (PBL, por sus siglas en inglés), así como la posterior extracción de ARN y la amplificación de fragmentos de anticuerpos, se realizaron como lo describieron De Haard y colegas (De Haard H, et al., J. Bact. 187:4531-4541, 2005). Se inmunizaron cuatro llamas con células BW que sobreexpresaban GARP y TGF p1 humanos (figura 7A), como se confirmó mediante citometría de flujo utilizando el anticuerpo monoclonal MHGARP8 (MHG-8) descrito en la presente solicitud de patente. Las llamas se inmunizaron con inyecciones intramusculares en el cuello una vez por semana durante un período de seis semanas. Se inyectaron aproximadamente 107 células en los músculos del cuello y se inyectó adyuvante incompleto de Freund en una segunda región ubicada a pocos centímetros del lugar de inyección de las células. Otras cuatro llamas se inmunizaron con una mezcla de vectores de expresión de ADNc de GARP humana y ADNc de TGFp1 humano, una vez cada dos semanas, con cuatro inyecciones repetidas.

Se recogieron muestras de sangre de 10 ml antes y después de la inmunización para investigar la respuesta inmunitaria. De tres a cuatro días después de la última inmunización, se recogieron 400 ml de sangre para la extracción del ARN total de los PBL preparados utilizando un gradiente Ficoll-Paque y el método descrito por Chomczynski P, et al., Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987. En promedio, se alcanzaron rendimientos de ARN de 450 |jg, que se usó para la síntesis aleatoria de ADNc y la amplificación por PCR de las regiones V de las cadenas pesada y ligera (VA y VK) para la construcción de las bibliotecas de fagémidos que contienen Fab como lo describe De Haard H et al., (J Biol Chem. 25 de junio de 1999; 274(26): 18218-30), para obtener diversas bibliotecas de buena diversidad (1-7x108).

La respuesta inmunitaria al complejo GARP-TGF p1 se investigó mediante ELISA en complejo GARP-TGF p1 soluble recombinante recubierto (1 jg/ml). Se prepararon diluciones en serie de cinco veces de sueros, comenzando a partir de sueros al 10 % y se añadieron 100 j l de sueros diluidos a los pocillos recubiertos y se incubaron durante 1 hora a TA. Después de lavar con 3 x PBS/Tween, las placas se bloquearon con PBS complementado con caseína al 1 % (figura 8). La unión de IgG1 de llama convencional a su GARP-TGFp diana se midió en ELISA usando un anticuerpo anti-IgG1 de llama de ratón (clon 27E10, Daley LP, et al. Clin. Diagn Lab Immunol. 12, 2005) y un anticuerpo antimurino de burro conjugado con HRP (Jackson) para la detección.

Selecciones y exploraciones de Fab específicos de GARP-TGFp1

Los fagos que expresan Fab se produjeron de acuerdo con protocolos convencionales y las selecciones se realizaron en GARP-TGFB1 soluble recombinante inmovilizado con elución total del fago que se une a GARP-TGFB1 con tripsina de acuerdo con los protocolos de presentación en fagos convencionales.

Se realizaron de dos a tres rondas de selecciones para enriquecer los Fab específicos de GARP humana-TGF p1 expresados por el fago. Se utilizaron contraselecciones de hGARP y hTGF p1 (LAP) para enriquecer los Fab que se unen a los complejos hGARP-TGFp1. Se aislaron colonias individuales y se produjeron fracciones periplásmicas (peris) en placas de 96 pocillos mediante inducción de IPTG a partir de todas las bibliotecas de acuerdo con protocolos convencionales.

La selección de los Fab específicos de hGARP-TGFp se realizó usando ELISA. Se inmovilizó hGARP-TGF p1 en una placa maxisorb. Después de bloquear con caseína al 1 % en PBS durante 1 h, se permitió que Fab de 20 j l de extractos periplásmicos se uniera a hGARP-TGF p1.

Caracterización de anticuerpos monoclonales

Se secuenciaron clones específicos de GARP-TGFp1/GARP en las regiones VH y VL y se dividieron en familias VH basándose en la secuencia de la CDR3 en la VH. Se identificaron 17 familias. De cada familia de VH identificada, se clonaron al menos un clon representativo en una IgG1 humana completa (LHG1-LHG17). Estos anticuerpos monoclonales se analizaron en Biacore para determinar sus características de unión al complejo GARP-TGFp1 humano soluble. Se inmovilizó GARP-TGFp1 humano soluble recombinante a aproximadamente 4.000 UR en un chip CM5 (GE Healthcare).

La unión de anticuerpos monoclonales al complejo GARP-TGFp1 humano y de cynomolgus expresado en células HEK-293 se analizó mediante FACS. Las secuencias que codifican GARP de cynomolgus y TGFpl de cynomolgus se clonaron a partir de una muestra de ADNc de linfocitos de sangre periférica (PBMC) de cynomolgus. Los cebadores se basaron en las secuencias previstas de GARP de cynomolgus (XM_005579140.1; SEQ ID NO: 41) y TGF p1 de cynomolgus (XM_005589338.1; SEQ ID NO: 42) mediante amplificación de partes solapantes de la secuencia completa. Tanto para GARP de cynomolgus como para TGFpl de cynomolgus, se analizaron las secuencias de ADN de tres amplicones de PCR separados. Se alinearon completamente con las secuencias previstas. Se clonaron GARP de cynomolgus y TGFpl de cynomolgus en pCDNA3.1 para la sobreexpresión transitoria en células HEK293E. La unión a GARP-TGFp1 de cynomolgus se comparó con la unión a GARP-TGFp1 humano en FACS. LHG-10 y las variantes reordenadas (LHG-10.3 a LHG-10.6) pueden considerarse reactivas de forma cruzada con GARP-TGFp1 de cynomolgus (figura 9).

Cebadores utilizados:

> TGFB S1 de cyno: cgcctc CCCCATGCCG ccctccg (SEQ ID NO: 43)

> TGFB S2 de cyno: acaattcctg gcgatacctc (SEQ ID NO: 44)

> TGFB AS1 de cyno: CTCAACCACTGCCGCACAAC (SEQ ID NO: 45)

> TGFB AS2 de cyno: TCAGCTGCATTTGCAGGAGC (SEQ ID NO: 46)

Reordenamiento de VK para mejorar la afinidad

Se utilizó el reordenamiento de cadenas VK para mejorar la afinidad del mAb LHG-10 (figura 10). En este método, la cadena pesada del clon precursor (VHCH1 de LHG-10) se reintrodujo en la biblioteca de cadenas ligeras de fagémidos. La cadena pesada se extrajo de un vector de expresión, que carece del gen 3 derivado del bacteriófago necesario para la presentación, para evitar adicionalmente la contaminación de la cadena ligera precursora en el procedimiento de selección. La cadena pesada se clonó en la biblioteca de cadenas ligeras de fagémidos y el ADN unido se sometió a electroporación en células TG1 de E. coli para crear la biblioteca de cadenas ligeras reordenadas. El tamaño de las bibliotecas estaba por encima de 108.

Se realizaron selecciones de afinidad, combinadas con lavados de disociación, para seleccionar Fab de cadenas reordenadas con una afinidad mejorada por GARP-TGFp1 humano. Se eligió una configuración en la que los fagos que expresaban Fab se incubaron con diferentes concentraciones de GARP-TGFp1 humano soluble recombinante recubierto directamente en la placa de microabsorción.

Al añadir el GARP-TGFp1 humano soluble recombinante en exceso sobre el GARP-TGFp1 humano soluble recombinante recubierto, se favoreció la unión del fago de mayor afinidad. En cada ronda se incrementó el tiempo de lavado (tabla 3) para seleccionar los fagos con una mejor constante de disociación lavando las variantes de menor afinidad. Los fagos se eluyeron con tripsina y se usaron para la infección de células TG1 de E. coli. En total, se realizaron 5 rondas de selección. Además, la cantidad de fago de entrada se redujo en rondas posteriores para reducir el fondo por un lado y por otro lado para disminuir la concentración de mAb, aumentando de este modo la rigurosidad de la selección.

T l : P r m r m ifi r ^ r n l i n r l r r n mi n VK

(continuación)

Se realizaron exploraciones de al menos 24 clones de las rondas de selección III, IV y V. Los clones se cultivaron en placas de pocillos profundos (expresiones de 1 ml) y se prepararon fracciones periplásmicas. Estos extractos periplásmicos se analizaron en Biacore para mejorar las constantes de disociación. Los cuatro mejores clones de Fab con constantes de disociación mejoradas se clonaron en hIgG1 (serie LHG-10) y también en una variante efector inactivo hIgG1 con una sustitución N297Q en la región Fc (serie LHG-10-D), y se analizaron las IgG resultantes para determinar las características de unión mejoradas en Biacore (tabla 4). Además, se comprobó la reactividad cruzada de las IgG de LHG-10-D sobre GARP de cyno/TGF-p1 de cyno en un ensayo basado en FACS utilizando células HEK-293E transfectadas con GARP de cyno/TGFp1 de cyno o GARP humana/TGFpl humano. MHGARP8 también se probó en este ensayo de reactividad cruzada. Todos los LHG-10-D y MHG-8 tienen reactividad cruzada contra GARP de cyno/TGFpl de cyno (figura 9).

T l 4: r rí i ni n l l n r r n

Ejemplo 6: Dos mAb anti-hGARP (MHGARP8 y LHG-10) inhiben la producción de TGF-P1 activo por Treg humanos

Los Treg humanos estimulados producen TGF-p1 activo cerca de su superficie celular. La actividad de TGF-p1 autocrina y paracrina induce la fosforilación de SMAD2 en los propios Treg y en linfocitos Th cultivadas de manera conjunta con Treg (Stockis, J. et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39:869-882). Para probar si se necesita GARP para la activación de TGF-p1 por Treg, se estimularon Treg humanos en presencia o ausencia de mAb anti-hGARP, y se midió la fosforilación de SMAD2 mediante transferencia Western. Como fuente de Treg humanos se usaron células CD4+CD25hiCD127l° clasificadas a partir de PBMC y amplificadas in vitro durante 12-14 días (Gauthy E et al PLoS One. 30 de septiembre de 2013;8(9):e76186). Tal y como se determina mediante qPCR específica de metilo, las poblaciones de células amplificadas contienen 44 a 82 % de células con un alelo FOXP3Í1 desmetilado, lo que indica que todavía están muy enriquecidos en Treg.

Como cabía esperar, se detectó SMAD2 fosforilado en los Treg estimulados, pero no en Treg no estimulados, ni en Treg estimulados en presencia de un anticuerpo anti-TGF-p1 neutralizante (figura 11). El SMAD2 fosforilado se redujo en gran medida en Treg estimulados en presencia de MHGARP8 (denominado MHG-8 en la figura 11A) o LHG-10 (figura 11B), lo que indica que estos dos mAb anti-hGARP bloquean la producción de TGF-p activo. Los otros 29 nuevos mAb anti-hGARP, así como 4 mAb anti-hGARP disponibles comercialmente, no bloquearon la producción de TGF-p por Treg (figura 11).

La actividad inhibidora de MHGARP8 y LHG-10 muestra que se necesita GARP para la producción de TGF-p1 activo por Treg humanos.

Ejemplo 7: MHGARP8 y LHG-10 inhiben la actividad supresora de Tregs humanos in vitro

Anteriormente se mostró que los Tregs humanos suprimen otros linfocitos T al menos en parte a través de la producción de TGF-p1 activo (Stockis, J. et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39:869-882). Por lo tanto, se probó si MHGARP8 (MHG-8) y LHG-10 también inhiben la función de Treg humanos en ensayos de supresión in vitro. Se usó un clon de Treg como fuente de Treg, y células CD4+CD25'CD127hi o un clon de linfocitos T CD4+ (linfocitos Th) como dianas para la supresión. Las linfocitos Treg y Th se estimularon con >CD3 y >CD28 en presencia o ausencia de varios mAb adicionales. Como se muestra en la figura 12, el clon de Treg A1 inhibió la proliferación de los linfocitos Th CD4+CD25' CD127hi en un 66 % en ausencia de mAb anti-hGARP. La supresión se redujo al 36 % y al 32 % en presencia de MHG-8 o LHG-10, respectivamente, pero no se redujo en presencia de los otros 6 mAb anti-hGARP. También se midió la supresión por el clon de Treg A1 en otro Th diana (clon Th A2) en presencia de MHGARP8, un mAb anti-hTGF-Bl o un control de isotipo. MHGARP8 (MHG-8) inhibió la actividad supresora de Treg A1 in vitro de manera similar a la del anticuerpo anti-TGF-Bl, mientras que el control de isotipo no mostró ningún efecto (figura 12).

Ejemplo 8: Epítopos reconocidos por mAb anti-hGARP inhibidores

Solamente una minoría (2/35) de los mAb anti-hGARP bloquean la producción de TGF-p activo y la supresión por Treg. Esto podría deberse a su capacidad para unirse a un epítopo o epítopos que son distintos de los unidos por los mAb no inhibidores. Por lo tanto, se mapearon las regiones necesarias para determinar la unión por mAb inhibidores y no inhibidores.

GARP se asocia con pro-TGF-p1 o con TGF-p1 latente para formar complejos GARP/TGF-p1 unidos por disulfuro (figura 13 y Stockis 2009b Eur. J. Immunol. 2009. 39: 3315-3322 y Gauthy E et al). Primero se buscó determinar si los mAb anti-hGARP también se unen a los complejos GARP/TGF-p1, utilizando experimentos de inmunoprecipitación (IP) conjunta en células BW murinas transfectadas con hGARP y hTGFBI. Se probaron 32 mAb anti-hGARP: los 31 nuevos mAb de los presentes inventores y el mAb Plato-1 disponible comercialmente. Todos los mAb inmunoprecipitaron GARP de manera eficaz (panel superior de la figura 14A, que muestra la IP con 12 mAb representativos). Pro-TGF-p1, así como LAP y TGF-p1 maduro (es decir, TGF-p1 latente) se inmunoprecipitaron conjuntamente con 24 mAb, lo que indica que se unen a complejos GARP/TGF-p1 (6 mAb mostrados en la figura 14A, paneles medio e inferior). Por el contrario, 8 mAb (3 mostrados en la figura 14A) no inmunoprecipitaron conjuntamente con TGF-p1 latente, sugiriendo que se unen a GARP libre pero no a complejos GARP/TGF-p1.

Se confirmó esto mediante análisis FACS de células 293T transfectadas (figura 14B). Las células 293T no transfectadas no expresan GARP y tienen niveles muy bajos de TGF-p1 endógeno. No se detecta TGF-p latente en su superficie con un anticuerpo anti-LAP. La transfección de GARP o TGFB1 solamente induce LAP superficial nulo o bajo, respectivamente, mientras que la transfección conjunta de GARP y TGFB1 induce LAP de superficie elevado como resultado de la unión y presentación de TGF-p1 latente por GARP (figura 14B, histogramas de la izquierda). Tres grupos de mAb anti-hGARP surgieron del análisis de células 293T transfectadas y se clasifican en 3 columnas en la figura 13B. Un primer grupo (columna de la izquierda) comprende los 8 mAb que no inmunoprecipitaron conjuntamente con pro-TGF-p1 o con TGF-p1 latente: se unieron a células 293T transfectadas con hGARP solamente, pero no con hGARP y hTGFB1. Esto confirma que estos mAb se unen solamente a GARP libre, ya que la unión a GARP de superficie se pierde en presencia de TGF-p1 (la figura 14B muestra 3 mAb representativos de este grupo). Un segundo grupo comprende la mayoría de los otros mAb (19 mAb, columna central de la figura 13B): se unieron igualmente bien a las células 293T tras la transfección con hGARP sola o con hGARP y hTGFB1, lo que indica que se unen tanto a GARP libre como a complejos GARP/TGF-p1 (la figura 14B muestra 6 mAb de este grupo). Curiosamente, un tercer grupo de 5 mAb se unió a células 293T transfectadas con hGARP y hTGFB1, pero no a las células transfectadas con hGARP sola (columna derecha de la figura 13B). Estos mAb se unen a complejos GARP/TGF-p1 pero no a GARP libre, e incluyen MHGARP8 (MHG-8) y LHG-10 inhibidores (la figura 14B muestra 3 mAb de este grupo).

A partir de lo anterior, se llegó a la conclusión de que la mayoría de los mAb se unen solamente a GARP libre (8/32) o a GARP libre y a complejos GARP/TF-p1 (19/32). Solamente 5 mAb, incluyendo MHGARP8 (MHG-8) y LHG-l0 inhibidores pero también 3 mAb no inhibidores, se unen a complejos GARP/TGF-p1, pero no GARP libre. Este patrón de reconocimiento no explica por qué solamente MHGARP8 y LHG-10 son inhibidores.

A continuación, se buscó definir las regiones de hGARP necesarias para la unión de los diversos mAb. La gran mayoría de los mAb anti-hGARP no reaccionan de forma cruzada con GARP de ratón (mGARP). Por lo tanto, se construyeron plásmidos que codifican quimeras mGARP/hGARP etiquetadas con HA (figura 15A, panel izquierdo) y se transfectaron en células 293T, con o sin hTFG-BI, dependiendo de las necesidades de unión determinados anteriormente. Todas las quimeras se expresaron a niveles similares en la superficie de las células 293T, como se evidencia mediante tinción con un mAb anti-HA (figura 15A, histogramas a la derecha). Los patrones de unión a quimeras mGARP/hGARP (figura 15A, 10 mAb representativos) permitieron identificar la región de hGARP necesaria para la unión de cada mAb antihGARP. Esto se resume en la figura 15B, donde los mAb se distribuyen en filas correspondientes a varias regiones de hGARP: los mAb de la primera fila necesitan una región que comprenda los aminoácidos 20 a 101 (hGARP2o-ioi), los mAb de la segunda fila necesitan hGARP101-141, aquellos en la tercera necesitan hGARP141-207, en la cuarta, hGARP265-332, y finalmente, un quinto grupo necesita hGARP332-628. Sin embargo, incluso al considerar las regiones necesarias para la unión, el epítopo reconocido por MHGARP8 (denominado MHG-8 en la figura) y LHG-10 inhibidores no se pudo distinguir de aquel de los mAb no inhibidores: MHGARP8 y LHG-10, como LHG-3, -12 y -13, se unen a complejos GARP/TGF-p que contienen hGARP101-14r

Las secuencias de GARP101-141 de ratón y humana difieren en 14 posiciones de aminoácidos (aa), que comprenden 3 grupos de 3 posiciones contiguas (figura 15B, panel izquierdo). Se construyeron 3 versiones mutadas de hGARP. En cada mutante, una serie de 3 aa contiguos de la región 101-141 se reemplazaron por el aa encontrado en mGARP. Se transfectaron células 293T con los mutantes etiquetados con HA, solamente o con hTGFBI dependiendo de la necesidad para la unión de los mAb probados. Los patrones de unión a mutantes revelaron 3 tipos de mAb (figura 15B, panel derecho), que necesitaban los aminoácidos hGARPm -113, hGARP126-127o hGARPw -139 para la unión, respectivamente. Seis mAb, incluyendo MHGARP8 (denominado MHG-8 en la figura) y LHG-10, necesitaban hGARP137-139 (figura 13B). Mientras que 4 de 6 se pueden unir a hGARP libre, MHG-8 y lHg -10 son los únicos mAb que necesitan hGARPw -139 en el contexto de los complejos GARP/TGF-p1.

A partir de lo anterior, se llegó a la conclusión de que la inhibición de la producción de TGF-p por MHGARP8 y LHG-10 se asocia con la capacidad de unirse a un epítopo que es distinto de los reconocidos por todos los demás mAb anti-hGARP no inhibidores.

Ejemplo 9: Inhibición de la función de los Treg humanos mediante anti-hGARP in vivo

A continuación, se buscó evaluar si los mAb anti-hGARP inhibidores podrían inhibir la función de Treg humanos in vivo. Se usó un modelo de enfermedad de injerto contra huésped (GvDH) xenogénica inducida por la transferencia de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC) a ratones NOD/Scid/IL2Rg-/~ (NSG) inmunocomprometidos. Los ratones NSG tienen una señalización defectuosa de citocinas y carecen de linfocitos T, B y células NK funcionales, permitiendo un injerto muy eficaz de linfocitos T humanos tras la inyección i.v. de PBMC. Treinta a cuarenta días después de la transferencia de PBMC, los ratones receptores presentan GVHD xenogénica, debido a la actividad de los linfocitos T citotóxicos humanos contra los tejidos murinos Shultz, Nat Rev Immunol. noviembre de 2012;12(11):786-98. En este modelo, la transferencia conjunta de Treg humanos con PBMC humanas atenúa la GvDH (Hannon et al. Transfusion. febrero de 2014;54(2):353-63), proporcionando un modelo para probar la actividad inhibidora de mAb anti-hGARP en Treg humanos in vivo.

Se transfirieron PBMC humanas (3x106/ ratón) con o sin Treg autólogos (1.5x106/ ratón) en ratones NSG (figura 16A). Como fuente de Treg humanos, se usaron células sangre CD4+CD25hiCD127lD que se habían amplificado en de manera breve in vitro, tal como se describe anteriormente. Además, se inyectaron ratones con MHGARP8 (denominado MHG-8 en la figura), anti-TGF-Bl, un control de isotipo o PBS, un día antes del injerto y en lo sucesivo, semanalmente. Los signos objetivos de GvDH se monitorizaron cada dos semanas, para establecer una puntuación de enfermedad en función de pérdida de peso, movilidad reducida, anemia o ictericia y caída del pelo. Se realizaron cuatro experimentos independientes (figura 16B) y los resultados se muestran en detalle para uno (figura 16C). Dependiendo del experimento, se observó el inicio de la enfermedad (puntuación media de GvDH > 1) entre 28 y 41 días después de la transferencia de PBMC en grupos de ratones que no recibieron ningún mAb o un control de isotipo. La transferencia conjunta de Treg retrasó la enfermedad, que se produjo de 46 a 72 días después de la transferencia, lo que indica que los Treg humanos fueron capaces de suprimir las respuestas de los linfocitos T humanos contra los antígenos xenogénicos. La administración de MHGARP8 a ratones transferidos con PBMC y Treg anuló el efecto protector de los Treg: la enfermedad se produjo igual de pronto en los ratones que recibieron PBMC solamente (28 a 44 días después de la transferencia). La inhibición de la función supresora de Treg por MHGARP8 fue similar a la observada con un anticuerpo anti-TGF-BI neutralizante. Un control de isotipo no tuvo ningún efecto.

En conjunto, esto muestra que MHGARP8 inhibe la función inmunosupresora de los Treg humanos in vivo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a un complejo de glicoproteína A en repeticiones predominantes humana (hGARP) y TGF-p1 latente, en donde el anticuerpo se une a un epítopo que comprende los restos Y137, S138 y G139 de la secuencia de aminoácidos de hGARP de la SEQ ID NO: 1 cuando GARp forma un complejo con TGF-p1 latente.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprende:

(i) las secuencias de aminoácidos de la CDR1, 2 y 3 de cadena pesada (VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3) mostradas en las SEQ ID NO: 13, 14 y 15; y

(ii) las secuencias de aminoácidos de la CDR1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) mostradas en las SEQ ID NO: 31, 32 y 33.

4. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 34 y la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena ligera es una de las SEQ ID NO: 35-39.

5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 34 y la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 39.

6. El anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en donde el anticuerpo comprende:

(i) las secuencias de aminoácidos de la CDR1, 2 y 3 de cadena pesada (VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3) mostradas en las SEQ ID NO: 2, 3 y 4; y

(ii) las secuencias de aminoácidos de la CDR1,2 y 3 de cadena ligera (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) mostradas en las SEQ ID NO: 5, 6 y 7.

7. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 50 y la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 51.

8. Un anticuerpo producido por un hibridoma registrado con el número de acceso LMBP 10246CB en la colección de plásmidos BCCM/LMBP el 30 de mayo de 2013.

9. Una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo contra GARP registrada con el número de acceso LMBP 10246CB en la colección de plásmidos BCCM/LMBP el 30 de mayo de 2013.