ES2858600T3 - Dispositivos para la agregación, de alto rendimiento, y la manipulación de células de mamífero - Google Patents

Abstract

Dispositivo (1) para agregar células que comprende por lo menos una cavidad (2), en el que dicha cavidad comprende una pluralidad de micropocillos (3) para recibir por lo menos una célula, en donde cada uno de dichos pocillos comprende una pared lateral vertical y un fondo curvado, en donde dichos micropocillos (3) están realizados en una capa de hidrogel.

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivos para la agregación, de alto rendimiento, y la manipulación de células de mamífero

Campo de la invención

[0001] La presente solicitud se refiere a dispositivos para la agregación de alto rendimiento de células y a su cultivo a largo plazo así como a su manipulación dentro del dispositivo. Dichos agregados celulares se usan en biología básica, especialmente biología del desarrollo y del cáncer, medicina regenerativa y cribados farmacéuticos.

Antecedentes de la invención

[0002] Los tejidos se autoorganizan en forma de entidades tridimensionales complejas de células especializadas, células de soporte adyacentes, componentes de matriz extracelular y otros elementos estructurales y dimensionales que se intercomunican continuamente para garantizar y mantener la función (Li et al. 2005). Este microentorno multicomponente, denominado nicho, se ha simplificado mínimamente en sistemas de cultivo celular bidimensional clásicos que sirven como plataformas normalizadas para una investigación básica que va desde la biología del desarrollo que estudia la diferenciación de tipos de célula de interés hasta los cribados farmacológicos de, por ejemplo, células tumorígenas. No obstante, los resultados de estos ensayos bidimensionales carecen críticamente del aspecto translacional que nos devuelve al entorno in vivo tridimensional (Griffith et al. 2006). Como consecuencia, los diseños experimentales se han derivado fuertemente durante la última década hacia la implementación de modelos 3D más relevantes, tales como cultivos de agregados celulares (Abbott 2003, Zhang 2004, Pampaloni et al. 2007).

[0003] Para la formación de esferoides, se han establecido sistemas de gotas colgantes con el fin de formar de manera fiable conglomerados celulares de una forma bien controlada (Keller 1995). De manera resumida, se suspenden células en gotas de medio de la tapa de una placa de cultivo para inducir una agregación celular por fuerzas gravitatorias. Este método es enormemente laborioso, consume mucho tiempo y, en general, no es apto fácilmente para cultivos escalables. Aunque se garantiza la entrega de nutrientes a la superficie completa del esferoide generado, en este formato es imposible el cambio del medio para permitir un cultivo de los agregados a largo plazo. Además, con este sistema solamente se puede cubrir un cierto intervalo de tamaños para los conglomerados celulares (Lin et al. 2008).

[0004] Se han introducido placas convencionales de 96 pocillos de poliestireno de fondo redondo en cultivos celulares biológicos normalizados con vistas a una agregación celular simplificada. Aunque este formato de cultivo permite una conformación casi natural, es decir, una cavidad de suelo esférico, para la producción de conglomerados celulares de un amplio intervalo de tamaños, los inconvenientes incluyen la dificultad del cambio del medio sin perturbaciones del esferoide formado e incluso la carencia de rendimiento. No obstante, las placas de fondo redondo de 96 pocillos son el formato de cultivo usado más ampliamente para ensayos de organogénesis in vitro (Eiraku et al. 2011, Suga et al. 2011, Nasu et al., 2012, Lancaster et al. 2013).

[0005] Para superar este problema en relación con el campo de la biología del desarrollo temprano, área de investigación en la que normalmente se cultivan células madre embrionarias y las mismas se diferencian en agregados celulares, se ha propuesto recientemente un dispositivo para la producción a gran escala de conglomerados de células madre embrionarias (Ungrin et al. 2008). El dispositivo comercializado como AggreWell™ (STEMCELL Technologies, Canadá, PCT/CA08/00397) se publicita como un planteamiento sencillo y normalizado con respecto a la producción reproducible a gran escala de cuerpos embrionarios (EBs) uniformes y de tamaño controlado. Los EBs se generan centrifugando una suspensión celular de concentración definida en una matriz de alta densidad de micropocillos piramidales con un diámetro de la base de la pirámide dimensionado a 400 u 800 micras con el fin de iniciar la agregación celular antes de 24 horas. De hecho, el sistema AggreWell™ 800 alberga micropocillos con un plano de fondo liso, que representa una estructura final de troncos piramidales, lo cual de manera parcial, cuando no totalmente, frustra la finalidad de la invención inicial correspondiente a proporcionar un dispositivo de recolección de células en el que todas las células se recojan en un punto central de fuerzas gravitatorias sumadas. Además, el sistema en general presenta múltiples limitaciones, que hacen que su aplicación para un cultivo a largo plazo de esferoides celulares resulte difícil. Los EBs de mayor tamaño formados en placas AggreWell™ o bien mediante una densidad de siembra celular inicial elevada o bien mediante agregación celular seguida por crecimiento de esferoides durante más de 24 h tienden a formar estructuras de tipo cono que reflejan la arquitectura del micropocillo AggreWell™. La restricción de células en conformaciones no naturales tiene efectos desconocidos sobre su función biológica y en la actualidad se sugiere que la forma del sustrato del cultivo puede inducir un compromiso de linaje incontrolado e inespecífico (Shiku et al. 2013). Por otra parte, las placas AggreWell™ están limitadas a un cambio de medio óptimo durante el cultivo ya que las etapas de manipulación, tales como el pipeteado, alteran la restricción de los esferoides dentro de los micropocillos debido a las grandes aberturas en dirección al plano expuesto al medio en bloque.

[0006] Se comercializan placas AggreWell™ en forma de matrices de micropocillos moldeadas por colada en polidimetilsiloxano (PDMS), un elastómero de silicona que no permite la difusión de nutrientes, lo cual afecta al crecimiento y la supervivencia de células en el lado expuesto a superficies de PDMS (Lee et al. 2004). Además, es bien sabido que el PDMS tiene tendencia a la adsorción de biomoléculas en su superficie (Toepke et al. 2006), un factor con riesgo de sesgar los resultados finales de experimentos de señalización celular y cribado de fármacos.

[0007] La carencia de sustratos de cultivo celular adecuados se ha afrontado en técnicas recientes que hibridan la biología y las ciencias de los materiales a través de la aplicación de andamios biocompatibles, tales como hidrogeles de origen natural o sintéticos (Rowley et al., 1999, Lutolf et al., 2005, Tibbitt et al., 2009). Tecnologías recientes han comenzado a explorar el uso de dichos biomateriales para la entrega de moléculas bioactivas mediante micromatrices de nicho a través de micropocillos de fondo plano en 2d (Gobaa et al. 2011) o a través de andamios 3D (Ranga et al.

2014).

[0008] Existe en la técnica una necesidad de un método de interacción de técnicas de agregación celular reproducibles para generar esferoides celulares de un tipo de célula dado individual o múltiple con biomateriales funcionales inteligentes. Existe en la técnica una necesidad de generar estos agregados celulares en cavidades en miniatura que imitan especificaciones geométricas del esferoide formado y donde las geometrías son totalmente personalizables para satisfacer requisitos individuales de un sistema biológico dado. Existe en la técnica una necesidad de aplicar todos los requisitos antes mencionados a producciones a gran escala de esferoides celulares con el fin de proporcionar números clínicamente relevantes. Existe también en la técnica una necesidad de permitir la experimentación y la manipulación local de los agregados celulares producidos en el mismo dispositivo.

[0009] Otras publicaciones de la técnica anterior dan a conocer microestructuras similares. Por ejemplo, el documento KR 20130013537 A se refiere a un método de fabricación de microestructuras y a un método para recolección celular usando dichas microestructuras.

[0010] No obstante, en el documento KR 20130013537 el proceso dado a conocer presenta varias limitaciones y desventajas tales como: -) la forma del pocillo es de semiesfera o elipsoide;

-) el ángulo de contacto en la abertura de los pocillos es como mínimo 20°;

-) es imposible materializar pocillos pequeños;

-) el paso (separación entre pocillos) es idéntico al diámetro de los pocillos;

-) el material usado se limita a PDMS;

-) el rendimiento está limitado debido a la separación entre pocillos (paso);

-) es imposible un cultivo a largo plazo.

[0011] El documento US20140227784 A1 describe también micropocillos con fondo curvado y paredes laterales verticales.

Sumario de la invención

[0012] Es una finalidad de la presente invención mejorar los sistemas conocidos de agregados celulares.

[0013] Es otra finalidad de la presente invención proponer un sistema que permita una mejor personalización a las necesidades del usuario con respecto al rendimiento, al tamaño y a la geometría y que interaccione con técnicas de manipulación in situ.

[0014] Otra de las finalidades es proponer un sistema que sea cómodo para el usuario, reproducible y fiable.

[0015] Se propone según la presente invención una familia novedosa de sistemas de agregación celular que posibilitará también el cultivo a largo plazo de los esferoides celulares formados dentro del mismo formato de cultivo.

[0016] Según la presente invención, un sistema de cultivo 3D está compuesto por una matriz de micropocillos conformados con fondo en U así como fondo redondo con una alta relación de aspecto y con dimensiones bajas del paso y paredes laterales altas, que se puede reproducir en varios materiales no limitados al PDMS y otros materiales poliméricos tales como plásticos, pero, lo que es más importante, en hidrogeles tales como aquellos basados en polímeros hidrófilos sintéticos, preferentemente poli(etilenglicol) (PEG), o componentes de origen natural tales como Matrigel, agarosa, gelatina o colágenos.

[0017] Para fabricar estas matrices, la presente invención se aprovecha de la evaporación del disolvente de soluciones poliméricas diluidas para crear estructuras con forma redonda así como en U. La forma de fondo redondo está incluida en la forma de fondo en U. Los micropocillos de fondo redondo se refieren a micropocillos conformados con fondo en U en los que la altura del micropocillo es igual al radio del fondo esférico. En lo sucesivo, únicamente se usará el término fondo en U ó con forma de U.

[0018] A continuación, las estructuras de micropocillos formadas con fondo en U se moldean en el sustrato de interés. Las ventajas de usar como materiales de sustrato especialmente hidrogeles basados en PEG residen en la alta permeabilidad de los nutrientes, y en una bioactividad óptima y hecha a medida al tiempo que se garantiza, por otro lado, que sean inertes biológicamente (Lutolf et al. 2005). Además, los sustratos basados en PEG permitirán la conjugación selectiva de biomoléculas deseadas en el fondo de los micropocillos representados, permitiendo el estudio también de factores no solubles sobre el comportamiento celular y el desarrollo dentro de agregados. Actuando sobre la arquitectura de los micropocillos con fondo en U, especialmente la relación de aspecto de la profundidad con respecto al diámetro del pocillo, se pueden incrustar esferoides por debajo del plano superficial del sustrato del cultivo para minimizar las perturbaciones a través de procedimientos de manipulación tales como cambios de medio o movimiento. Unas dimensiones de paso mínimas en el intervalo de unos pocos diámetros celulares entre los pocillos es suficiente para impedir que células individuales reposen sobre estos límites, proceso que puede alterar la igualdad de la distribución celular en cada pocillo y que puede presentar una señalización incontrolada. Además, la integración de redes microfluídicas en íntima proximidad con el plano de los micropocillos con vistas a la entrega local y temporizada de moléculas de interés permite la manipulación selectiva de los agregados formados durante un cultivo a largo plazo. Adicionalmente, esta plataforma se puede aplicar para un encapsulado completo de agregados formados a través de un moldeo por colada (sandwich casting) de una segunda capa de sustrato encima de los esteroides formados, lo cual permitirá una localización plana y facilitará drásticamente la formación automatizada de imágenes durante el cultivo.

[0019] Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para generar agregados celulares compuestos por uno o múltiples tipos de célula, a través de:

(1) Centrifugación o sedimentación gravitacional de uno o múltiples tipos de células simultáneamente.

(2) Centrifugación o sedimentación gravitacional de un tipo de célula seguida por la adición de otro tipo de célula subsiguientemente a través de sedimentación gravitacional en cualquier momento dado después de la agregación del previo.

[0020] En resumen, la presente invención propone una plataforma novedosa de cultivo celular 2D y 3D del tipo todo en uno que ofrece una formación de alto rendimiento de esferoides celulares al tiempo que permitiendo su cultivo a largo plazo sin necesidad de cambiar el formato del cultivo y al tiempo que posibilitando también la manipulación de los agregados formados mediante entrega local de moléculas bioactivas deseadas para estudios funcionales.

Descripción detallada de la invención

[0021] En una realización, la invención se refiere a un dispositivo para agregar células, comprendiendo dicho dispositivo por lo menos una cavidad en la que dicha cavidad comprende una pluralidad de micropocillos para recibir por lo menos una célula, en donde cada uno de dichos pocillos comprende una pared lateral vertical y un fondo curvado. Los micropocillos están realizados en una capa de hidrogel.

[0022] Preferentemente, el dispositivo comprende una pluralidad de cavidades, comprendiendo cada una de dichas cavidades una pluralidad de micropocillos.

[0023] En una realización, el diámetro (d), la altura (h) y la distancia interpocillo (paso, p) de los micropocillos no están vinculados y pueden variar de manera independiente uno con respecto a otro.

[0024] En una realización, los micropocillos tienen un diámetro de abertura de 1 pm a 3 mm.

[0025] En una realización, los micropocillos tienen alturas (h) de 1 pm a 3 mm.

[0026] En una realización, los micropocillos tienen cavidades de tamaños o formas diferentes.

[0027] En una realización, la separación (dimensión de paso) entre los micropocillos es mínima de tal manera que las células que caigan dentro del área del pocillo caerán en un micropocillo y participarán en la formación del agregado.

[0028] En una realización, la separación entre los micropocillos está en el intervalo de 1 pm a 100 pm.

[0029] En una realización, el dispositivo comprende una red microfluídica con canales.

[0030] En una realización, la red de canales está por debajo del plano de los micropocillos.

[0031] En una realización, la red de canales está alineada con los micropocillos.

[0032] En una realización, la distancia entre la red de canales y el fondo de los micropocillos es inferior a 500 pm.

[0033] En una realización, la capa de hidrogel está basada en polímeros hidrófilos sintéticos, o componentes de origen natural o híbridos de polímeros sintéticos y componentes de origen natural.

[0034] En una realización, el polímero hidrófilo sintético se selecciona del grupo que comprende poli(etilenglicol), poliuretanos polialifáticos, poliuretanos de poliéter, poliuretanos de poliéster, copolímeros de polietileno, poliamidas, alcoholes polivinílicos, poli(óxido de etileno), óxido de polipropileno, poletilenglicol, polipropilenglicol, óxido de politetrametileno, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, poli(acrilato de hidroxi etilo), poli(metacrilato de hidroxietilo), o mezclas de los mismos.

[0035] En una realización, el hidrogel se prepara mediante el mezclado y la reticulación de por lo menos dos componentes precursores usando una reacción química, en la que el primer componente precursor comprende n grupos nucleofílicos y el segundo componente precursor comprende m grupos electrofílicos, en donde n y m son al menos dos y la suma n+m es al menos cinco, y en donde la reticulación se lleva a cabo preferentemente entre

- un macrómero de PEG multi-brazo, preferentemente un macrómero de PEG de cuatro brazos, funcionalizado en los extremos con grupos nucleofílicos, preferentemente tiol, con

- un macrómero de PEG multi-brazo, preferentemente un macrómero de PEG de ocho brazos, funcionalizado en los extremos con grupos electrofílicos, preferentemente vinilsulfona, en concentraciones y condiciones adecuadas tales que se permita que la capa de hidrogel reticulada presente un módulo de cizalladura entre 0.1 y 100 kPa.

[0036] En una realización, el hidrogel comprende un exceso de grupos funcionales libres, preferentemente grupos nucleofílicos, más preferentemente seleccionados del grupo que comprende aminas y tioles, y - de manera adicional o alternativa - grupos electrofílicos, preferentemente seleccionados del grupo que comprende acrilatos, metacrilatos, acilamidas, metacrilamidas, acilo-nitrilos, quinonas, vinil-sulfonas, maleimidas y sus derivados.

[0037] En una realización, los micropocillos se pueden funcionalizar con uno o más tipos de biomoléculas.

[0038] En una realización, las biomoléculas son proteínas, oligopéptidos, oligonucleótidos o azúcares.

[0039] En una realización, las proteínas o péptidos son derivados de ECM o miméticos de ECM y están fijados a los grupos nucleofílicos o electrofílicos, preferentemente los grupos tiol de la capa basada en PEG, usando un enlazador heterobifuncional, en donde un grupo funcional del enlazador es reactivo a los grupos funcionales fijados a los extremos de las cadenas poliméricas y el otro grupo funcional del enlazador seleccionado del grupo que comprende succinimidil éster activo tal como N-hidroxisuccinimida (NHS), alfa-metilbutanoato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, aldehído, tiol, un grupo selectivo ante tiol que comprende acrilato, maleimida o vinilsulfona, piridiltioésteres y piridildisulfuro, es capaz de ligarse de forma no específica a la biomolécula de interés por medio de sus grupos amina.

[0040] En una realización, las biomoléculas están etiquetadas de manera que se ligan a la superficie del hidrogel por afinidad.

[0041] En una realización, las biomoléculas etiquetadas tienen etiquetas para posibilitar la unión a dianas seleccionadas del grupo que comprende ProteínaA, ProteínaG, ProteínaA/G, Estreptavidina, NeutrAvidin, NTA, anticuerpos, fragmento S de la RNasaA, calmodulina, celulosa, quitina, glutatión, amilosa, u oligopéptidos y oligonucleótidos funcionalizados que tienen grupos funcionales nucleofílicos o electrofílicos que pueden reaccionar con los grupos funcionales en la red del hidrogel.

[0042] En una realización, los componentes de origen natural se seleccionan del grupo que comprende polisacáridos, proteínas gelatinosas, y componentes de ECM tales como agarosa, alginato, quitosano, dextrano, gelatina, lamininas, colágenos, hialuronano, fibrina o mezclas de los mismos o se seleccionan del grupo de matrices derivadas de tejido complejo que comprenden Matrigel, Myogel y Cartigel.

[0043] Según la presente invención, se describen plataformas de cultivo novedosas realizadas con micropocillos conformados con fondo en U, a escala micrométrica, de alta densidad, para la formación reproducible de agregados celulares y su cultivo a largo plazo. Dichas plataformas son altamente interesantes ya que se reveló que estos agregados forman estructuras autoorganizadas que presentan una función celular mejorada y, por lo tanto, una mayor relevancia por contraposición a sistemas de cultivo convencionales.

[0044] Aún cuando, durante la última década, se han descrito otras plataformas de agregación celular, tales como la AggreWell™ antes descrita (Ungrin et al. 2008) y otras (Giselbrecht et al. 2006, Chen et al. 2008, Choi et al. 2010, Liu et al. 2014), ninguna de ellas pudo fabricar microestructuras que ofrecieran una agregación celular satisfactoria. De hecho, la fabricación de patrones esféricos de escala micrométrica es uno de los cuellos de botella principales en las microtecnologías, ya que la mayoría de los procesos convencionales forman estructuras con bordes.

[0045] Un estudio reciente ha probado la fabricación de micropocillos casi esféricos a través del uso de litografía en hielo y una subsiguiente replicación en PDMS (Liu et al. 2014). Aunque esta técnica es sencilla y se produce de manera fácil con herramientas disponibles comúnmente, la misma sigue estando limitada por la interdependencia de la altura, el diámetro y la dimensión del paso de los micropocillos formados. Además, la escalabilidad de la plataforma es cuestionable, tal como reveló el bajo número de esferoides por matriz (por debajo de 25).

[0046] En contraposición, sacando provecho de la evaporación del disolvente de una solución polimérica diluida, tal como la fotorresina negativa SU-8 basada en epoxi, se forma un menisco de evaporación en la interfase del líquido en condensación sobre la superficie rígida, lo cual concede la capacidad de formar microestructuras esféricas con una compactación densa y con una alta reproducibilidad geométrica.

[0047] La fuerza principal de la presente invención es la desvinculación del diámetro de los micropocillos, la altura y la distancia interpocillo que garantiza una libertad total en la geometría de las matrices. La capacidad de variar estos tres parámetros de manera independiente, lo cual es imposible en las plataformas de la técnica anterior ya existentes antes mencionadas, es necesaria para desarrollar plataformas basadas en aplicaciones biológicas más que plataformas en busca de aplicaciones.

[0048] Además, las matrices propuestas de micropocillos conformados con fondo en U se forman, preferentemente, con sustratos blandos y altamente hidratados, tales como hidrogeles, más que elastómeros, tales como PDMS, para imitar al máximo posible el entorno fisiológico de las células.

[0049] Se demostró que la supervivencia de células individuales en el sustrato propuesto era significativamente mayor que en plataformas basadas en PDMS (tales como las dadas a conocer en la solicitud de la técnica anterior de KR antes citada) y que el crecimiento de los agregados celulares se catalizaba en el sustrato propuesto.

[0050] Por un lado, estos resultados se corroboran con las recientes demostraciones de la potencia del hidrogel para soportar un cultivo celular en comparación con sustratos no hidratados.

[0051] Por otro lado, ha parecido que los sistemas de cultivo celular tridimensionales son una respuesta importante a la carencia de relevancia de los sistemas bidimensionales.

[0052] Con la presente plataforma de matrices de micropocillos basadas en hidrogel, se demostró que se podía vincular la capacidad de agregar células en un modo de alto rendimiento y el potencial de proporcionar a estas células un entorno tridimensional encapsulándolas en una capa superior de hidrogel. Además, como la plataforma está realizada con hidrogel, se podía manifestar la posibilidad de integrar redes microfluídicas en la plataforma.

[0053] Además, como ventaja adicional del uso de hidrogel, se pudo demostrar la posibilidad de reticular químicamente un ligando biofuncional en la superficie de los micropocillos permitiendo la valoración de la influencia de factores ligados en los agregados cultivados. La integración de un cultivo tridimensional, las redes microfluídicas y la formación en patrones y la biofuncionalización de micropocillos en la misma plataforma abre un espacio fisicoquímico y espaciotemporal totalmente nuevo para cribados de alta resolución de microtejidos 3D.

[0054] Finalmente, se revela que la plataforma se pudo usar con cualquier tipo de célula, y, más específicamente, con tipos de célula que no forman esferoides tales como el MDA-MB231, células de cáncer de mama humano, que formaban agregados después de entre dos y tres días y se mantenían íntimamente agregadas durante al menos cinco días.

[0055] La presente invención ofrece la oportunidad única de permitir cocultivos celulares “controlables”. Los cocultivos son posibles o bien sembrando inicialmente múltiples tipos de célula de manera simultánea o a través de la adición de otros tipos de célula a un cultivo esferoide en marcha. Adicionalmente, se pueden adicionar más de dos tipos de célula en cualquier momento dado durante el cultivo para permitir el estudio sistemático de la autoorganización, la migración y la redistribución celular.

[0056] La tecnología presentada es una plataforma de cribado multidimensional innovadora y altamente versátil para cribados de alta resolución en el espacio y en el tiempo. El presente planteamiento consiste en el desarrollo de plataformas basadas específicamente en aplicaciones biológicas a diferencia de la mayoría de las plataformas antes mencionadas. Se cree que este tipo de tecnologías totalmente integradas soportarán avances de biología fundamental al mismo tiempo que catalizarán fuertemente la investigación traslacional hacia la clínica.

[0057] La invención se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción de los dibujos en los que

las Figuras 1Aa 1D ilustran el principio de la presente invención;

la Figura 2 ilustra una geometría (invertida) tridimensional de matrices de micropocillos según la presente invención;

la Figura 3 ilustra una geometría en vista superior de una matriz de micropocillos;

la Figura 4 ilustra una vista general de una matriz de micropocillos con fondo en U;

la Figura 5 ilustra una descripción conceptual del proceso de fabricación de pocillos con fondo en U;

las Figuras 6A a 6C ilustran una vista teórica y real de la geometría de un micropocillo con fondo en U;

la Figura 7 ilustra una descripción conceptual del moldeo por colada de hidrogel;

las Figuras 8A a 8D ilustran diferentes tamaños de micropocillo conformado en U;

las Figuras 9A a 9B ilustran micropocillos conformados en U reproducidos en materiales con rigidez diferente; la Figura 10 ilustra ejemplos de micropocillos conformados en U producidos en una variedad de materiales según se indica;

la Figura 11 ilustra ejemplos de micropocillos de tamaño pequeño;

las Figuras 12A-N ilustran limitaciones de la plataforma AggreWell™ convencional;

las Figuras 13A-G ilustran un ejemplo de densidad celular variable;

las Figuras 14-G ilustran un ejemplo de crecimiento de agregados, distribución de tamaños y mantenimiento de la pluripotencia;

la Figura 15 ilustra un ejemplo del potencial de agregación de tipos de célula variables según se indica;

la Figura 16 ilustra un ejemplo del potencial de agregación de tipos de células que no forman esferas según se indica;

las Figuras 17A-C ilustran un ejemplo de un formato de cultivo tridimensional;

las Figuras 18A-F y la ampliación 18 G ilustran un ejemplo de matrices de micropocillos con fondo en U con integración microfluídica;

la Figura 19 ilustra un ejemplo de una biofuncionalización del fondo de los micropocillos;

la Figura 20 ilustra ejemplos de micropocillos en formas diferentes (vistas superiores y vistas en sección).

[0058] Las Figuras 1Aa 1D ilustran el principio de la presente invención. Según este principio, una placa 1 está provista de una serie de pocillos 2. Los tamaños típicos de dichos pocillos 2 disponibles comercialmente son de aproximadamente 6.4 a 34.8 mm de diámetro y 1.76 cm de profundidad y con una capacidad de volúmenes de líquido total de 0.36 a 16.8 ml correspondientes a volúmenes de trabajo de 0.1-0.2 ml a 1.9-2.9 ml. Evidentemente, esto es un ejemplo y pueden usarse otras placas 1 con otros tamaños, ya sea placas disponibles comercialmente o placas realizadas de forma específica.

[0059] La Figura 1B muestra una vista en sección lateral de la placa 1 de la figura 1A con sus pocillos 2. En esta figura 1B se ve un conjunto de micropocillos 3 que están situados en el fondo de cada pocillo 2 lo cual constituye una característica de la presente invención.

[0060] Dichos micropocillos 3 se ilustran con mayor detalle en la figura 1C la cual es una vista ampliada tomada de un pocillo 2 de la figura 1B.

[0061] Por consiguiente, la presente invención en una de las realizaciones propone proporcionar un conjunto de micropocillos 3 en un conjunto de pocillos 2 más grandes de una placa 1.

[0062] La figura 2 muestra una matriz 4 de micropocillos 3 con una geometría tridimensional (invertida). A efectos de la visualización, la geometría tridimensional de la matriz 4 de micropocillos se muestra invertida. Esta ilustra la estructura genérica de micropocillos 3 con fondo en U en una ilustración en perspectiva de una estampa negativa de PDMS (por ejemplo) usada para moldear por colada una matriz de micropocillos con fondo en U.

[0063] La Figura 3 ilustra un ejemplo de una matriz 4 de micropocillos en geometría de vista superior. Aquí se muestra la vista superior teórica de estas matrices 4. Los micropocillos 3 se han organizado con el fin de maximizar la densidad de pocillos para un área dada de la matriz 4. Además, esta organización de micropocillos 3 permite minimizar la distancia interpocillo, con lo cual se evita el crecimiento de células entre micropocillos 3.

[0064] Las distancias d, h y p, que se definen en la figura 1C, se pueden seleccionar de manera independiente con las técnicas de fabricación que se describen en la presente solicitud. Como ejemplos, el tamaño de d y h puede oscilar de 1 |jm a 3000 jm (3 mm); el intervalo de tamaños de p se puede seleccionar libremente. Para un uso óptimo del dispositivo, h debe ser siempre superior o igual a d y p debe ser lo más pequeño posible, mucho menor que d (p<<d) y típicamente en el intervalo de 1 jm a 100 jm . Si es necesario, se puede materializar una p mayor de 100 jm sin restricciones.

[0065] La Figura 1D ilustra el porcentaje del área de captura celular (área cubierta por micropocillos) en función de la relación de dimensión del paso con respecto a diámetro de pocillo. Con una relación de 10:1, los micropocillos ya cubren el 74.95% del área total. Este porcentaje no se puede incrementar de manera significativa reduciendo más la dimensión del paso.

[0066] La figura 4 ilustra una vista general de una matriz de micropocillos 3 con fondo en U. Una matriz con un diámetro del fondo de 8 mm se moldea por colada en un pocillo 2 de una placa 1 de 12 pocillos (véase la figura 1A). se muestra la representación por campo claro y fluorescente (inserción pequeña, izquierda) de un área de la matriz 4 con 72 micropocillos 3 que contienen conglomerados de células madre embrionarias ESC Oct4::GFP. El tamaño de los agregados es monodisperso y el marcador de pluripotencia Oct4 se visualiza en cada conglomerado celular. Esta homogeneidad del agregado ilustra la fuerte reproducibilidad de la plataforma de micropocillos 3 con fondo en U.

[0067] La siguiente tabla 1 proporciona ejemplos de placas 1 de pocillos (véase la figura 1A) con diferentes números de pocillos 2 por placa (6, 12, 24, 48 y 96), de manera que el área del fondo del pocillo y el diámetro de los micropocillos 3 depende del número de micropocillos 3 por pocillo 2.

Tabla 1

[0068] Una de las ventajas de la presente invención es que permite una reposición sencilla del medio en los micropocillos 3. De hecho, mejor que la reposición de cada uno de dichos micropocillos 3 individualmente, lo cual es, además, imposible por debajo de un tamaño de micropocillo dado. Con la presente invención, es posible actuar en el nivel de los pocillos 2 que son más grandes que los micropocillos 3 y, por lo tanto, más sencillos de reponer.

[0069] La figura 5 ilustra una representación conceptual de un proceso de fabricación de micropocillos 3 con fondo en U según la presente invención. Los micropocillos 3 con fondo en U se forman a través de una deposición de volumen definido de materiales líquidos diluidos, por ejemplo, polímeros, tales como la fotorresina basada en epoxi SU-8, para permitir la constitución de formas de fondo esférico a través de la evaporación del disolvente. Durante la evaporación del disolvente, el material depositado se condensa y humedece la pared del micropocillo 3 para constituir una forma 5 de fondo semiesférico invertido en el fondo de los pocillos a través de las fuerzas de tensión superficial. Después de la solidificación del material depositado, las estructuras se pueden usar para moldeo por réplica con el fin de fabricar las matrices 4 de micropocillos 3.

[0070] La figura 6A ilustra una descripción teórica de la geometría final de un micropocillo post-evaporación, según se ha descrito anteriormente en relación con la figura 5. Se muestra una ilustración en perspectiva de un pocillo 3 individual de Si con casquete 5 de SU-8 invertido en el fondo del pocillo, que incluye una sección transversal por el centro. r representa el radio del casquete invertido, que es igual al radio del pocillo antes del ataque químico. h1 se refiere a la profundidad del pocillo igual a la profundidad antes del ataque químico en Si. h2 se refiere a la altura total de SU-8 impresa antes de la evaporación del disolvente, que es una aproximación del radio del pocillo antes del ataque químico (figura 6B). En la imagen de la figura 6C se ofrece un ejemplo de un micropocillo 3 con deposición de SU-8 para formar un fondo de pocillo con forma de U (parte inferior izquierda) o sin (parte inferior derecha) moldeado por réplica en hidrogel de PEG.

[0071] La figura 7 ilustra un ejemplo de una descripción conceptual del molde por colada de PDMS & hidrogel correspondiente a una placa 1 según la presente invención. Después de la silanización de la estampa de silicio de plantilla para conseguir que la superficie sea hidrófoba, las estructuras del fondo en U se moldean por réplica en PDMS. El negativo de micropocillo con fondo en U de PDMS formado se usa, a continuación, para moldear por colada cualquier material deseado sobre cubreobjetos o directamente en el fondo de pocillo 2 de placas 1 de cultivo de tejido. Los cubreobjetos, cuando se utilicen, se pueden fijar de cualquier manera adecuada en los pocilios 2, por ejemplo a través de películas finas adhesivas biocompatibles, tales como capas finas de hidrogel de PEG.

[0072] Las Figuras 8A-8D ilustran ejemplos de diferentes tamaños de micropocillo conformado en U. Usando hidrogel de PEG (G'~12.5 kPa), se lograron diferentes combinaciones de los diversos parámetros (d, distancia, h, altura y p, paso). Se representan (A-D) imágenes con focales (vistas ortogonales) de micropocillos 3 de 100 pm, 250 pm, 400 pm y

1.25 mm de diámetro. El diseño exacto de estas tres muestras diferentes es el siguiente:

Fig. 8A: el micropocillo 3 tiene un diámetro de 100 pm, una altura de 200 pm y una distancia interpocillo de 4 Fig. 8B: el micropocillo 3 tiene un diámetro de 250 pm, una altura de 400 pm y

una distancia interpocillo de 4 Fig. 8C: el micropocillo 3 tiene un diámetro de 400 pm, una altura de 400 pm y una distancia interpocillo de 4 Fig. 8E: el micropocillo 3 tiene un diámetro de 1.25 mm, una altura de 1 mm y una distancia interpocillo de 40 pm.

[0073] Esto revela la enorme versatilidad de la plataforma de micropocillos de acuerdo con la presente invención.

[0074] La Figura 9A a 9D ilustra micropocillos con fondo en U con una rigidez diferente. Usando hidrogeles de PEG con un contenido polimérico variado (peso/volumen, 1.25%, 2.5%, 5%, 10%, según se indica en los dibujos) se demostró que se pudieron moldear diferentes rigideces absolutas en forma de matrices de micropocillos con fondo en U. Las estructuras de micropocillos con fondo en U de la presente invención se imprimieron fácilmente en hidrogeles con una rigidez de 150 Pa (G'), figura 9A, a aproximadamente 30 kPa (G'), figura 9D. Esta amplia cobertura es crucial para afrontar cuestiones biológicas referentes a las interacciones de agregados celulares con sustratos de rigidez variada.

[0075] La Figura 10 ilustra la variedad de materiales que se puede usar según se indica en los dibujos. A partir del molde negativo de PDMS, se imprimieron diversos materiales con el patrón antes descrito. El PDMS se puede moldear en réplicas para dar origen a matrices de micropocillos con fondo en U en PDMS. Preferentemente, las matrices de micropocillos con fondo en U se reproducen en polímeros biocompatibles blandos: se demostró que los hidrogeles sintéticos convencionales, tales como polietilenglicol (PEG), eran moldeables así como hidrogeles naturales, tales como agarosa, alginato, gelatina, matrigel y colágenos. Evidentemente, se pueden usar otros materiales equivalentes.

[0076] La figura 11 ilustra una realización de pocillos de pequeño tamaño. Se moldearon micropocillos 3 de tamaños comprendidos entre pocillos de 10 y 50 pm en hidrogel de PEG de 12.5 kPa para crear una plataforma de cultivo celular individual. Se sembraron satisfactoriamente células individuales en pocillos independientes.

[0077] La figura 12 (A) a (N) muestra las limitaciones de la plataforma AggreWell™ convencional. Representaciones por campo claro de agregados de células ESC Oct4::GFP recolectados (es decir, 500, 1000, 2000 y 3000 células por micropocillo) después de 24 h de cultivo en micropocillos con fondo en U de diámetro 400 pm (A-D) así como AggreWells™ dimensionados a 400 pm (E-H). Se observaron varias limitaciones de la plataforma AggreWell™. Tal como ya se ha sugerido, (Shiku et al. 2013) las células que se agregan en micropocillos con forma piramidal adoptan una forma piramidal (parte superior). Esto puede observarse con muchas densidades de siembra celular diferentes, por ejemplo 500, 1000, 2000 y 3000 células por micropocillo (flechas). No obstante, los agregados celulares formados en micropocillos con fondo en U eran significativamente más redondos. De hecho, se observó que la excentricidad de los esteroides (I), el factor de forma (J) y la compacidad (K) eran significativamente diferentes entre los micropocillos con fondo en U y los Aggrewells™ para la mayoría de las densidades celulares. Esta falta de compacidad se confirmó valorando el número de células flotantes después de una recolección entre las dos plataformas (L) y observamos que, después de la recolección, había más células individuales flotando en el sobrenadante de las condiciones de Aggrewells™ en comparación con las de micropocillos con fondo en U de la presente invención. Finalmente, usando la toma de imágenes a intervalos de tiempo, se observó que agregados celulares, tales como agregados de células ESC Oct4::GFP (M) y fibroblastos NIH3T3 (N), sembrados sobre superficie de AggreWell™ (superficies de PDMS) trepaban a lo largo de las paredes de los micropocillos. Estas observaciones demuestran la necesidad de plataformas de cultivo novedosas tales como la presente invención que usan sustratos de cultivo más inertes y sustratos de cultivo que presentan una mayor biocompatibilidad que el PDMS.

[0078] La figura 13 (A) a (G) ilustra ejemplos de densidad celular variable medida. Usando células ESC Oct4::GFP de ratón, se sembraron tres densidades celulares diferentes,

(A) una célula por micropocillo,

(B) 100 células por micropocillo

(C) 500 células por micropocillos,

en micropocillos con fondo en U de 400 pm de diámetro y 400 pm de altura. Se valoró la distribución de tamaño de cada densidad después de 24 h. Durante este periodo, los agregados crecieron a aproximadamente 25 pm, 110 pm y 140 pm para, respectivamente, una célula por micropocillo, 100 células por micropocillo y 140 células por micropocillo.

(D) Representaciones por campo claro del crecimiento de células individuales durante un periodo de 5 días. Puede observarse una diferencia en el potencial del crecimiento para diferentes células individuales. Por lo tanto, las

matrices de micropocillos de acuerdo con la presente invención son una herramienta potente para valorar la heterogeneidad de poblaciones de células madre al nivel de células individuales, tal como su diferente potencial de expansión clonal.

(E) Se valoró la viabilidad de células madre embrionarias individuales en matrices de micropocillos con fondo en U de acuerdo con la presente invención (PEG de RBW) y la misma se comparó con las matrices de AggreWell™ convencionales (PDMS de AW). Las matrices según la presente invención soportaron una supervivencia de células individuales significativa. *** se corresponde con p<0.001.

(F) Se valoró la distribución de tamaño de colonias en expansión clonal de células individuales después de 5 días en AggreWell™ y

(G) en matrices de micropocillos con fondo en U según la presente invención.

[0079] En comparación con la plataforma Aggrewell™, los agregados formados y cultivados en micropocillos con fondo en U según la presente invención son más homogéneos en cuanto a tamaño.

[0080] La figura 14 (A) a (G) ilustra el crecimiento de agregados, la distribución de tamaño y el mantenimiento de la pluripotencia. Se valoró el crecimiento de agregados de células ESC Oct4::GFP de ratón durante 5 días en la plataforma de micropocillos con fondo en U según la presente invención (PEG de RBW) en comparación con la plataforma de AggreWell™ (PDMS de AW) (A). Después de la compactación de las células, el crecimiento de los conglomerados mejoró significativamente en los micropocillos con fondo en U según la presente invención en comparación con AggreWells™ (B, C). La distribución de tamaño de los agregados se valoró el día 5. La plataforma de micropocillos con fondo en U según la presente invención (C) presenta una mayor monodispersión del tamaño de los agregados en comparación con AggreWells™ (B).

(D) Representaciones por campo claro del crecimiento de 500 células por micropocillo durante un periodo de 5 días en una matriz de micropocillos con fondo en U. El crecimiento de los agregados es prácticamente idéntico sobre la matriz. De este modo, la plataforma de micropocillos según la presente invención exhibe un fuerte potencial para la generación de alto rendimiento de agregados monodispersos.

(E) Además, se valoró la pérdida de agregados tras el cambio de medio para las dos plataformas. No se observó ninguna diferencia significativa. Por término medio, se perdió menos de un 7% de los agregados tras el cambio de medio.

(F) Se valoró también la recuperación de agregados de la plataforma. No se observó ninguna diferencia significativa. Puede recuperarse cerca del 100% de los agregados. Finalmente, se analizó por FACS cada día el mantenimiento del marcador de pluripotencia de células ESC principal Oct4 (no se muestran datos).

En el día 5 (G), todavía el 99.0% de las células se expresan en el marcador, lo cual es comparable con cultivos de mantenimiento convencionales.

[0081] La Figura 15 ilustra un ejemplo de potencial de agregación de diversos tipos de células según se indica en la figura. Se sembraron varios tipos de célula sobre las matrices de micropocillos con fondo en U según la presente invención. Se muestran representaciones por campo claro de C2C12, HEK2937, fibroblastos NIH3T3, NMuMg /E9 y MSCs PT-2501 humanas. Los diferentes tipos de célula formaron satisfactoriamente agregados que se pudieron mantener durante 5 días. Además, todos ellos se recolectaron satisfactoriamente y se mantuvieron en conglomerados (datos mostrados únicamente para hMSCs PT-2501, como ejemplo representativo). Esta alta versatilidad de uso demuestra el fuerte potencial de la plataforma de micropocillos según la presente invención.

[0082] La figura 16 ilustra un ejemplo correspondiente al potencial de agregación de tipos de célula que no forman esferas según se indica en la figura. Se sembraron células que no forman esferas sobre matrices de micropocillos con fondo en U de acuerdo con la presente. Se muestran representaciones por campo claro en diferentes momentos del cultivo de MCF-7, MDA-MB231 y OP9 así como los agregados recolectados correspondientes en el día 5. Los diferentes tipos de célula formaron satisfactoriamente agregados y se pudieron mantener durante 5 días. Además, la totalidad de los tres tipos de célula se recolectaron de manera satisfactoria y se mantuvieron en conglomerados.

[0083] La figura 17 (A) a (C) ilustra un ejemplo de formato de cultivo tridimensional.

(A) Ilustración en perspectiva de agregados encapsulados 3D mediante moldeo por colada de tipo sándwich de una segunda capa 6 de sustrato, que muestra el potencial de la tecnología según la presente invención para combinar la localización de los agregados en un único plano z con el fin de posibilitar cultivos tridimensionales encapsulados.

(B) Ilustración de la prueba de concepto del moldeo por colada de tipo sándwich. Se fabrica una primera capa de micropocillos 3 con fondo en U (diámetro 400 pm, altura 400 pm y paso 40 pm). Se capturaron microperlas de PEG (“ 200 pm de diámetro, G' 10-40 kPa) en los micropocillos de esta primera capa por sedimentación gravitacional con el fin de mimetizar conglomerados celulares. Una segunda capa de hidrogel de PEG se moldea por colada encima de la matriz para formar un cultivo tridimensional, encapsulando completamente las microperlas de PEG.

(C) Representación confocal de planteamiento de moldeo por colada de tipo sándwich. Esto demuestra el potencial de una plataforma según la presente invención para fabricar un cultivo tridimensional plano de alto rendimiento.

[0084] Las figuras 18 (A) a (F) y 18G ilustran una matriz de micropocillos con fondo en U según la presente invención con integración microfluídica a través de canales de escala micrométrica perfundibles.

[0085] Vista superior (A) y vista en corte lateral (B) de la ilustración esquemática de una matriz de micropocillos 3 con fondo en U según la presente invención con la integración de una red microfluídica que comprende por ejemplo canales 15, 16 los cuales están conectados a entradas respectivas 15', 16' y salidas 15'', 16'', véase la vista en perspectiva de la figura 18G.

La red 5, 6 se puede colocar debajo del plano de los micropocillos 3 y alineada o no con el mismo.

[0086] En una variante, puede haber varias redes independientes una junto a otra o interconectadas.

[0087] La figura 19 ilustra un ejemplo de funcionalización del fondo del micropocillo. Representación confocal de un micropocillo 3 conformado con fondo en U (270 pm de diámetro, 400 pm de altura, paso de 40 pm). El fondo del micropocillo 3 está funcionalizado con una proteína modelo, en este caso BSA.

[0088] La Figura 20 ilustra ejemplos de micropocillos 3 según la presente invención, de diferentes formas. Representación esquemática de micropocillos 3 que tienen múltiples formas geométricas. Para producir micropocillos con fondo en U con la técnica antes descrita puede usarse cualquier forma, tal como triángulos, cuadrados, toroides y estructuras completamente irregulares. Estas se pueden usar para múltiples aplicaciones; en especial, puede ser una herramienta poderosa para valorar el impacto de la geometría del sustrato de cultivo sobre funciones celulares. Las figuras 20 ilustran vistas superiores y vistas en sección según A-A y B-B.

Fabricación/material y métodos

Fabricación de matrices de micropociMos con fondo en U

[0089] Usando un proceso de Bosch con Si, se obtuvieron por ataque químico en un sustrato de silicio micropocillos de fondo plano (en este caso, cilíndricos) de dimensiones deseadas. A continuación, en estos pocillos, usando impresión por chorros de tinta, se adicionó un volumen preciso de un material líquido diluido, por ejemplo, polímeros, tal como la fotorresina positiva SU-8. Otras técnicas de deposición pueden incluir dispensación automatizada de líquido, tal como estaciones de trabajo robóticas de manipulación de líquidos, dispensación manual, tal como pipeteado, o cualquier otro tipo de método de deposición. Después de la evaporación, el material forma un menisco de evaporación, y crea un fondo esférico para formar las estructuras conformadas en U (véase las figuras 5 y 6). El material finalmente se solidifica y se usa como patrón para el moldeo por réplica de PDMS, el cual, a continuación, se usó como patrón de moldeo para el sustrato final (por ejemplo, hidrogel). Este proceso de moldeo por réplica permite la replicación de la geometría del sustrato de silicio en el sustrato final deseado (véase la figura 7).

[0090] La microfabricación de ppocillos 3 con fondo en U según la presente invención dentro de cada intervalo de tamaños usando los planteamientos y valores antes mencionados resulta muy prometedora para crear matrices de micropocillos de densidad muy alta (véase la figura 4) para cultivos de una sola célula y cultivos de agregados según se muestra en las figuras 11 y 13-16.

Materiales moldeables

[0091] Cualquier tipo de hidrogel (es decir, hidrogeles sintéticos así como hidrogeles naturales o de origen natural) por ejemplo PEG, agarosa, alginato, gelatina, colágeno, matrigel, polímeros tales como PDMS, SU-8, etcétera ..., plásticos tales como PMMA, PLA, PPA, PP, PE y otros, cerámicas, metales, aleaciones, minerales, mineral no metálico y vidrio.

Cultivo celular

[0092] Células madre embrionarias de ratón (mESCs) Oct4::GFP proporcionadas por Austin Smith (Universidad de Cambridge) se expandieron de manera rutinaria sin células alimentadoras en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con factor inhibidor de leucemia (LIF), medio de suero bovino fetal (FBS, Gibco) cribado de células ESC (15%), aminoácidos no esenciales (NEAA) piruvato sódico (10 mM) y b-mercaptoetanol (0.1 mM), a lo que se hace referencia en lo sucesivo en la presente como medio de células ES (Smith 1991).

[0093] Células madre mesenquimales humanas (hMSCs, PT-2501, Lonza) y células estromales murinas OP9 se mantuvieron de manera rutinaria en alfa-MEM suplementado con FCS al 10% (Hyclone, lote AUA33984) y 1 ng/mL de FGF-2 (Peprotech).

[0094] Fibroblastos NIH3T3, células de cáncer de mama humanas MCF-7, células de cáncer de mama humanas MDA-MB231, células mioblásticas de ratón C2C12, células de cáncer de mama de ratón NMuMG E9 y células de riñón embrionario humano (HEK) 293 se mantuvieron de manera rutinaria en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, HEPES (10 mM) y piruvato sódico (1 mM).

Formación de agregados

[0095] Las células se despegaron con tripsina. Se preparó una suspensión celular con una densidad de interés (es decir, 3x105 células/mL, 6x104 células/mL, y 1000 células/mL para alcanzar 500 células/micropocillo, 100 células/micropocillo y 1 célula/micropocillo, respectivamente) en los medios específicos del tipo de célula. Las matrices de micropocillos conformados con fondo en U se moldearon por colada en el fondo de los pocillos de placas de 24 pocillos y se adicionaron 2 mL de la solución celular preparada en el pocillo. Las células se asentaron por sedimentación gravitacional.

[0096] Las células se cultivaron durante 5 días y los medios respectivos se cambiaron cada día.

Resultados / aplicaciones y ejemplos

MicropociNos con fondo en U en varios sustratos y varios tamaños

[0097] Matrices 4 de micropocillos 3 con fondo en U de diferentes tamaños (figura 8) se moldearon en una variedad de sustratos compatibles con el cultivo celular, incluidos PDMS, PEG, agarosa, gelatina, alginato y matrigel. Para probar la replicabilidad en sustratos de rigidez diversa, las matrices 4 de micropocillos 3 con fondo en U se moldearon en PEG con un contenido de polímero (peso/volumen) que oscilaba entre un 2.5% y un 10% (figura 9). Se determinó que la rigidez de PEG más baja que se podía moldear por colada era 150 Pa, equivalente a un contenido de polímero de PEG del 2.5% (según se determinó por reología), por debajo de la cual ya no se puede garantizar en su totalidad la arquitectura de la estructura de micropocillos 3. Los micropocillos 3 con fondo en U se pueden reproducir eficientemente en los materiales antes mencionados lo cual se demuestra con la conservación de la arquitectura (véase la figura 10).

Expansión y viabilidad de células individuales

[0098] Se sembraron en placas densidades celulares bajas, inferiores al número de para maximizar la distribución de células individuales dentro de los pocillos 3. Se cuantificaron la expansión y la viabilidad de células individuales durante el periodo de tiempo de cinco días cada 24 horas (véase la figura 17D) entre micropocillos con fondo en U con un diámetro de 400 pm en PEG (PEG de RBW) y AggreWell™ 400 (PDMS de AW). La tasa de supervivencia de células ES Oct4::eGFP individuales cultivadas se incrementa significativamente (p<0.0001) desde 48.36%±31.74% en PDMS de AW a un 85.05%±8.51% en PEG de RBW (véase la figura 17E). Otras células individuales cultivadas en PEG de RBW crecen hasta poblaciones de agregados más grandes y más monodispersas después de cinco días de expansión en comparación con el PDMS de AW (véase la figura 17F-G).

Limitaciones de la plataforma comercial del estado de la técnica

[0099] Se compararon tamaños de agregados 24 h después de la siembra entre EBs generados en micropocillos con fondo en U con diámetros de 400 pm (véase la figura 12A-D) con respecto a AggreWells™ 400 del estado de la técnica (véase la figura 12E-H). Observamos que, en contraposición a los micropocillos con fondo en U, la forma piramidal de la cavidad de AggreWell™ condujo a la generación de EBs deformados provocada por la adaptación de los agregados a la forma del pocillo (figura 3.4 A-C, flechas negras). Observamos también que, con densidades de siembra mayores (2000 y 3000 células/EB), se observó una formación de esferoides más robusta para micropocillos con fondo en U en comparación con AggreWells™ (Figura 12 C-D con respecto a G-H), según demostraron los menores recuentos de células flotantes en el sobrenadante (Figura 12L). En general, los EBs formados en micropocillos con fondo en U presentaron unos índices de excentricidad (Figura 12I), un factor de forma y una compacidad (Figura 12I-K) mejores. Estos resultados incidan que la formación de esferoides se ven en general mejorada en los micropocillos con fondo en U.

[0100] Observamos además que las células ES agregadas y cultivadas en Aggrewells™ frecuentemente comenzaron a fijarse a la superficie de PDMs en menos de 24 h (Figura 12M, N). Los agregados fijados usan los márgenes de micropocillos piramidales en pendiente para trepar por los bordes. Esto conduce a la fusión de agregados y a la formación de poblaciones de esferoides más dispersas.

Tamaño de los agregados

[0101] Se usaron matrices 4 de micropocillos 3 con fondo en U en hidrogeles de PEG al 5% (peso/volumen) para agregar y cultivar células ES de ratón transgénico Oct4::eGFP. El tamaño inicial de los agregados se puede controlar ajustando la densidad de siembra celular. Se buscaron densidades de células individuales, de 100 células por EB y de 500 células por EB. Se determinaron los tamaños de los agregados 24 h después de la siembra y los mismos se compararon (véase la figura 13A-C). Las células individuales, las 100 células y las 500 células conducen a EBs de 10­ 40 |jm, 90-130 jim y 110-170 |jm de diámetro.

Crecimiento de los agregados

[0102] Se cuantificó el crecimiento de los agregados durante el transcurso de tiempo de cinco días a partir de EBs de una densidad inicial de 500 células (véase la figura 14D) entre micropocillos con fondo en U con un diámetro de 400 jm en PEG (PEG de RBW) y AggreWell™ 400 (PDMS de AW). La tasa de crecimiento se incrementa significativamente (p<0.0001) después de 48 h para el PEG de RBW (véase la figura 14A). Además, el cultivo de 500 células Oct4::eGFP por micropocillo conduce a poblaciones de agregados finales más grandes y más monodispersas en el PEG de RBW en comparación con el PDMS de AW (véase la figura 14C-D).

Cambio del medio y recuperación de agregados

[0103] Se cambió el medio tanto en el PDMS de AW como en el PEG de RBW cada 24 h para cada uno de los cinco días consecutivos aspirando el volumen completo de medio antiguo y cambiándolo por la misma cantidad a través de un pipeteado suave en la pared lateral de la placa de cultivo. Se tomaron imágenes de la superficie de la matriz completa después de cada cambio del medio y se cuantificó la pérdida de agregado. La pérdida de agregado tanto para el PDMS de Aw como para el PEG de RBW está claramente por debajo del 10% (véase la figura 14E).

[0104] Se recuperaron los agregados pipeteando hacia arriba y hacia abajo en el centro del pocillo tres veces con cambio de líquido completo en cada ronda y transfiriendo subsiguientemente el sobrenadante a una nueva placa de cultivo. Se tomaron imágenes de la matriz completa después de este procedimiento para cuantificar la recuperación del agregado. La recuperación del agregado tanto para el PDMS de AW como para el PEG de RBW está próxima al 100% (véase la figura 14F). Los agregados recuperados se pueden usar para otros análisis biológicos. Determinamos la expresión de Oct4 por células disociadas de EBs cultivados durante cinco días en PEG de RBW mediante citometría de flujo. El 99% de las células conservan su expresión de Oct4 después del cultivo (véase la figura 14G).

Agregación de varios tipos de célula

[0105] Se moldearon matrices de micropocillos con fondo en U en hidrogeles de PEG al 5% (peso/volumen). Dentro de estas matrices de micropocillos se formaron agregados de varios tipos de célula con una densidad inicial dada. C2C12, HEK293T, fibroblastos NIH 3T3, clon E9 de NMuMG y células madre mesenquimales humanas pueden formar eficientemente conglomerados en micropocillos con fondo en U en menos de 24 horas. Los conglomerados son estables y se pueden recolectar eficientemente después del cultivo, tal como se manifiesta para las MSCs humanas (figura 15).

[0106] Pueden usarse micropocillos 3 con fondo en U para analizar células que son inherentemente resistentes a la agregación, según se manifiesta con la línea celular de cáncer que no forma esferoides MDA MB231. En menos de 24 horas las células forman conglomerados poco apelmazados, que se compactan más durante los días posteriores en cultivo, de manera que, después de 120 horas, pueden recuperarse de las matrices 4 de micropocillos 3 incluso conglomerados estables (panel superior de la figura 16).

[0107] Las células OP9 de ratón forman conglomerados estables en menos de 24 horas. Mantenidas en cultivo en esta conformación, las células se diferencian eficientemente en adipocitos en menos de 3 días también en ausencia de factores de diferenciación adipogénica exógenos (Dexametasona, IBMX e insulina). En este instante de tiempo pueden recolectarse conglomerados de adipocitos de las matrices de micropocillos (véase la figura 16, panel inferior).

Encapsulado 3D plano

[0108] Para el encapsulado 3D plano de células y esferoides pueden usarse matrices de micropocillos con fondo en U con el fin de mejorar la calidad en la toma de imágenes y el consumo de tiempo. Como prueba de concepto, formamos matrices de micropocillos con fondo en U de PEG-Alexa546 al 5% (peso/volumen). Después de la polimerización, se distribuyeron 200 jm de perlas de PEG-Alexa488 al 10% encima de las matrices de micropocillos y las mismas se dejaron asentar en las cavidades. Posteriormente, las matrices llenas de perlas se sellaron con una segunda capa de PEG-Alexa647 al 5% (peso/volumen), encapsulando completamente las perlas en un plano focal en un entorno de EPG 3D (véase la figura 17).

Microfluídica de los agregados

[0109] Para permitir la manipulación bioquímica local y temporal de esferoides celulares después de su formación sin la necesidad de transferencia a una placa de cultivo nuevo, se generaron canales microfluídicos por micromoldeo por debajo del plano de micropocillos 3 en proximidad íntima (distancia < 500 jm ) con el fin de garantizar la difusión de las moléculas deseadas antes de 24 h. Como prueba de principio, se perfundió dextrano de alto peso molecular (2000 kDa) etiquetado con FITC a través de canales debajo de matrices de micropocillos con fondo en U. El dextrano no se puede perfundir a través de la red de hidrogel, con lo cual se etiqueta de manera eficiente y selectiva solo el interior del canal microfluídico (véase la figura 18).

Funcionalización de los micropociMos

[0110] Los micropocillos 3 con fondo en U se pueden funcionalizar con diferentes proteínas de acuerdo con métodos previamente descritos (Kobel et al. 2012). En resumen, se forman películas delgadas de proteína sobre un portaobjetos de vidrio hidrófilo en el cual se coloca una estampa de PDMS para permitir la adsorción de la proteína en la superficie del PDMS. Durante la etapa subsiguiente de moldeo de PEG, la proteína se transfiere a la superficie de hidrogel donde se incorpora a la malla de hidrogel a través o bien de interacciones estáticas o bien de la formación de enlaces covalentes. Como prueba de principio, usamos BSA etiquetado con Alexa-647 para funcionalizar hidrogeles de PEG-Alexa488 al 5% (peso/volumen) (véase la figura 19).

MicropociMos de formas diferentes

[0111] Con la tecnología presentada, se pueden fabricar micropocillos 3 con fondo en U de cualquier forma para aplicaciones específicas (véase la figura 20). De hecho, se ha mostrado que en la función de las células o los agregados celulares influye fuertemente la geometría de sustrato de cultivo. Por lo tanto, la matriz 4 de micropocillos 3 presentada tiene un alto potencial para responder cómo se vincula la función con la geometría.

Referencias

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo (1) para agregar células que comprende por lo menos una cavidad (2), en el que dicha cavidad comprende una pluralidad de micropocillos (3) para recibir por lo menos una célula, en donde cada uno de dichos pocillos comprende una pared lateral vertical y un fondo curvado, en donde dichos micropocillos (3) están realizados en una capa de hidrogel.

2. Dispositivo según se define en la reivindicación 1, en donde dicho dispositivo comprende una pluralidad de cavidades (2), comprendiendo cada una de dichas cavidades (2) una pluralidad de micropocillos (3).

3. Dispositivo según se define en una de las reivindicaciones anteriores, en donde el diámetro (d), la altura (h) y la distancia interpocillo (paso, p) de los micropocillos (3) no están vinculados y pueden variar de manera independiente uno con respecto a otro.

4. Dispositivo según se define en una de las reivindicaciones anteriores,

- en donde los micropocillos (3) tienen un diámetro (d) de abertura de 1 pm a 3 mm, y/o - en donde los micropocillos (3) tienen alturas (h) de 1 pm a 3 mm, y/o

- en donde los micropocillos (3) tienen cavidades de tamaños o formas diferentes, y/o

- en donde la separación (dimensión de paso) entre los micropocillos (3) es mínima de tal manera que las células que caigan dentro del área del pocillo caerán en un micropocillo (3) y participarán en la formación del agregado, y/o

- en donde la separación entre los micropocillos está en el intervalo de 1 pm a 100 pm.

5. Dispositivo según se define en una de las reivindicaciones anteriores, en donde el mismo comprende una red microfluídica con canales (5, 6), en donde la red de canales preferentemente está por debajo del plano de los micropocillos (3).

6. Dispositivo según se define en la reivindicación 5, en donde la red de canales (5, 8) está alineada con los micropocillos (3).

7. Dispositivo según se define en una de las reivindicaciones 5 ó 6, en donde la distancia entre la red de canales (5, 6) y el fondo de los micropocillos (3) es inferior a 500 pm.

8. Dispositivo según se define en una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha capa de hidrogel está basada en polímeros hidrófilos sintéticos, o componentes de origen natural o híbridos de polímeros sintéticos y componentes de origen natural.

9. Dispositivo según se define en la reivindicación anterior, en donde el polímero hidrófilo sintético se selecciona del grupo que comprende poli(etilenglicol), poliuretanos polialifáticos, poliuretanos de poliéter, poliuretanos de poliéster, copolímeros de polietileno, poliamidas, alcoholes polivinílicos, poli(óxido de etileno), óxido de polipropileno, poletilenglicol, polipropilenglicol, óxido de politetrametileno, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, poli(acrilato de hidroxi etilo), poli(metacrilato de hidroxietilo), o mezclas de los mismos.

10. Dispositivo según la reivindicación 9, en donde el hidrogel se prepara mediante el mezclado y la reticulación de por lo menos dos componentes precursores usando una reacción química, en la que el primer componente precursor comprende n grupos nucleofílicos y el segundo componente precursor comprende m grupos electrofílicos, en donde n y m son al menos dos y la suma n+m es al menos cinco, y en donde la reticulación se lleva a cabo preferentemente entre

- un macrómero de PEG multi-brazo, preferentemente un macrómero de PEG de cuatro brazos, funcionalizado en los extremos con grupos nucleofílicos, preferentemente tiol, con

- un macrómero de PEG multi-brazo, preferentemente un macrómero de PEG de ocho brazos, funcionalizado en los extremos con grupos electrofílicos, preferentemente vinilsulfona, en concentraciones y condiciones adecuadas tales que se permita que la capa de hidrogel reticulada presente un módulo de cizalladura entre 0.1 y 100 kPa.

11. Dispositivo según una de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el hidrogel comprende un exceso de grupos funcionales libres, preferentemente grupos nucleofílicos, más preferentemente seleccionados del grupo que comprende aminas y tioles, y - de manera adicional o alternativa - grupos electrofílicos, preferentemente seleccionados del grupo que comprende acrilatos, metacrilatos, acil-amidas, metacrilamidas, acilonitrilos, quinonas, vinil-sulfonas, maleimidas y sus derivados.

12. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1a 11, en donde los micropocillos se funcionalizan con uno o más tipos de biomoléculas,

en donde las biomoléculas son preferentemente proteínas, oligopéptidos, oligonucleótidos o azúcares.

13. Dispositivo según la reivindicación 12, en donde las proteínas o péptidos son derivados de ECM o miméticos de ECM y están fijados a los grupos nucleofílicos o electrofílicos, preferentemente los grupos tiol de la capa basada en p Eg , usando un enlazador heterobifuncional, en donde un grupo funcional del enlazador es reactivo a los grupos funcionales fijados a los extremos de las cadenas poliméricas y el otro grupo funcional del enlazador seleccionado del grupo que comprende succinimidil éster activo tal como N-hidroxisuccinimida (NHS), alfametilbutanoato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, aldehído, tiol, un grupo selectivo ante tiol que comprende acrilato, maleimida o vinilsulfona, piridiltioésteres y piridildisulfuro, es capaz de ligarse de forma no específica a la biomolécula de interés por medio de sus grupos amina.

14. Dispositivo según una de las reivindicaciones 12 a 13, en donde las biomoléculas están etiquetadas de manera que se ligan a la superficie del hidrogel por afinidad, en donde las biomoléculas etiquetadas preferentemente tienen etiquetas para posibilitar la unión a dianas seleccionadas del grupo que comprende ProteínaA, ProteínaG, ProteínaA/G, Estreptavidina, NeutrAvidin, NTA, anticuerpos, fragmento S de RNasaA, calmodulina, celulosa, quitina, glutatión, amilosa, u oligopéptidos y oligonucleótidos funcionalizados que tienen grupos funcionales nucleofílicos o electrofílicos que pueden reaccionar con los grupos funcionales en la red del hidrogel.

15. Dispositivo según se define en la reivindicación 8, en donde los componentes de origen natural se seleccionan de grupos que comprenden polisacáridos, proteínas gelatinosas, y componentes de ECM tales como agarosa, alginato, quitosano, dextrano, gelatina, lamininas, colágenos, hialuronano, fibrina o mezclas de los mismos o se seleccionan del grupo de matrices derivadas de tejido complejo que comprenden Matrigel, Myogel y Cartigel.