ES2855133T3

ES2855133T3 - Factores de coagulación de acción prolongada y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2855133T3
Application number: ES18150731T
Authority: ES
Inventors: Udi Eyal Fima; Gili Hart
Original assignee: Opko Biologics Ltd
Current assignee: Opko Biologics Ltd
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2021-09-23
Anticipated expiration: 2033-02-05
Also published as: DK3326642T3; ES2665319T3; EP3791890B1; JP2015508771A; EP3791890A1; PL3791890T3; BR122021004014B1; AU2017219044B2; PE20142290A1; EA201790960A2; KR102310704B1; BR112014020198A2; JP2018065815A; EP2822576B1; AU2013219935B2; MX362446B; EP2822576A4; KR20140134673A; CO7131365A2; WO2013121416A1

Abstract

Un factor de coagulación modificado con péptido del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal de dicho factor de coagulación, y en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es: a. un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31, b. un polipéptido del factor VII (FVII) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25, o c. un factor VII activado (FVIIa) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25; para su uso en la reducción de hemorragias o hematomas excesivos en un sujeto

Description

DESCRIPCIÓN

Factores de coagulación de acción prolongada y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los usos médicos de los polipéptidos que comprenden un péptido del carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica unido al carboxilo terminal de un factor de coagulación.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de la terapia de reemplazo con factores de coagulación ha transformado las vidas de muchos individuos con hemofilia. La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que deteriora la capacidad del cuerpo para controlar la formación de coágulos o coagulación de la sangre. Los pacientes con hemofilia no producen cantidades adecuadas de proteínas del Factor VIII o el Factor IX, que son necesarias para una eficaz coagulación de la sangre. En los pacientes hemofílicos graves incluso una lesión pequeña puede dar como resultado una pérdida de sangre que se prolonga durante días o semanas, y puede no ocurrir la curación completa, lo que conduce a un posible daño permanente y debilitante de las articulaciones y otros órganos, y a la muerte prematura. Un tipo de hemofilia, la hemofilia B, es un trastorno hemorrágico unido al cromosoma X provocado por una mutación en el gen del Factor IX (FIX), que resulta en una deficiencia de la actividad procoagulante del FIX. Los pacientes con hemofilia B tienen hemorragias espontáneas en el tejido blando y hemartrosis recurrentes que frecuentemente conducen a una artropía paralizante. El tratamiento actual para estos pacientes incluye una administración intravenosa del FIX recombinante. Sin embargo, los aspectos de costo y aclaramiento relativamente rápido del FIX de la circulación hacen que el desarrollo de un FIX de acción prolongada sea una tarea desafiante.

La disponibilidad comercial del FVIII y el FIX ha conducido a un mejor control de los episodios de hemorragias con peligro para la vida. Muchos pacientes reciben terapia profiláctica, que reduce el riesgo de hemorragia y sus complicaciones asociadas. Sin embargo, una proporción significativa de pacientes (10-30 %) desarrollan anticuerpos inhibitorios contra FVIII y FIX administrados de manera exógena. La administración del FVIIa, que es un producto de derivación, puede inducir homeostasis y proporcionar un tratamiento eficaz para los pacientes con Ac inhibitorios. El FVIIa recombinante (NovoSeven®) está disponible comercialmente y se aprobó en 1996 para el tratamiento de episodios de hemorragia en los pacientes de hemofilia con inhibidores. Sin embargo, el rFVIIa se aclara rápidamente con un tiempo de vida media terminal de 2,5 horas. Como resultado, los pacientes generalmente requieren infusiones múltiples y frecuentes (2-3 dosis administradas en intervalos de 2-3 horas) para lograr la homeostasis adecuada después de un sangrado ligero a moderado. En consecuencia, existe mucho interés en el desarrollo de una forma de acción prolongada del FVIIa que prolongaría la duración de la actividad hemostática después de una dosis única y permitiría una dosificación mucho menos frecuente. Un FVIIa de acción prolongada aumentaría, además, la factibilidad de una terapia profiláctica a largo plazo.

Actualmente se desarrollan diversas tecnologías para prolongar el tiempo de vida media del FVIIa. Sin embargo, el reto es lograr una prolongación del tiempo de vida media de esta proteína a la vez que se conserve su actividad biológica y asegurar que las modificaciones no induzcan una inmunogenicidad significativa.

Resumen de la invención

La invención proporciona un factor de coagulación modificado con el péptido del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP), que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal de dicho factor de coagulación, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es:

un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o de los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31;

un polipéptido del factor VII (FVII) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25; o

un factor VIIa activado (FVIIa) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25,

para su uso en la reducción de hemorragias o hematomas excesivos en un sujeto.

La invención también proporciona un factor de coagulación modificado con el péptido carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al extremo carboxilo de dicho factor de coagulación, en el que dicho factor de coagulación modificado con CTP es: un

polipéptido del Factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o de los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31;

un polipéptido de Factor VII (FVII) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N^o: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la SEQ ID NO: 25; o

un Factor VIIa (FVIIa) activado modificado por CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos 39-528 de la SEQ ID NO: 25, para su uso en el mantenimiento de la hemostasia durante la cirugía o durante las intervenciones quirúrgicas en un sujeto.

En una modalidad, al menos uno de los CTPs unidos está glicosilado.

En una modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido FIX modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o de los aminoácidos 47-545 de SEQ ID NO: 31.

En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido del FVII modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25.

En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido FVIIa modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácido de los aminoácidos 39-528 de la SEQ ID NO:.25

En una modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es administrado a un sujeto en una forma de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es administrado por vía subcutánea

En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es administrado por vía intravenosa.

En otra modalidad, el sujeto es un sujeto hemofílico, o es un sujeto que sufre una deficiencia de vitamina K o una enfermedad hepática

En otra modalidad de la invención, el sujeto es un niño.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos y figuras. Debe comprenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la invención se proporcionan a manera de ilustración solamente, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A. Presenta un gráfico de barras que muestra las células de cosechas limitadas, diluidas, transfectadas y seleccionadas con variantes de FIX-CTP y FIX-CTP-CTP en presencia de vitamina K3 a 5 pg/ml. El nivel de FIX se cuantificó mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. núm. FIX-AG RUO), y la concentración de proteínas calculada (pg/ml) es el promedio de dos ejecuciones independientes. La Figura 1B muestra fotomicrografías de un gel de SDS-PAGE del reconocimiento con Ac para FIX; la fotomicrografía A representa el reconocimiento de un anticuerpo anti-FIX en una transferencia Western; la fotomicrografía B representa el reconocimiento de un anticuerpo anti-y carboxilación en una transferencia Western. El carril 1 en A-B se cargó con una muestra que contenía FIX recombinante, el carril 2 en A-B se cargó con una muestra que contenía cosechas de FIX-CTP. El carril 3 en A-B se cargó con una muestra que contenía una cosecha de FIX-(CTP)².

Figura 2. Presenta un gráfico que muestra la actividad cromogénica comparativa de cosechas de FIX-CTP y FIX-(CTP)²(medida mediante la concentración EC⁵⁰.) en comparación con rhFIX (American Diagnostics).

Figura 3. Presenta un gráfico que muestra el perfil PK de rhFIX, de la cosecha de FIX-CTP-CTP y de la cosecha de FIX-CTP.

Figura 4. Presenta un gráfico de barras que muestra el nivel del antígeno FIX en las cosechas de FIX-CTP y las cosechas de FIX-CTP-CTP y la proteína purificada FIX-CTP-CTP según se determinó mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano (Affinity Biologicals; cat. núm. FIX-AG RUO). La concentración de proteínas calculada (pg/ml) es el promedio de dos ejecuciones independientes.

Figura 5. Muestra fotomicrografías de geles de SDS-PAGE del reconocimiento con Ac para FIX. La fotomicrografía A representa una tinción con azul de Coomassie; la fotomicrografía B representa el reconocimiento de un anticuerpo anti-FIX en una transferencia Western; la fotomicrografía C representa el reconocimiento de un anticuerpo anti-y carboxilación en una transferencia Western. El carril 1 en A-C se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)². El carril 2 en A-C se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)²no unido. El carril 3 en A-C se cargó con una muestra que contenía un a elución concentrada de FIX-(CTP)².

Figura 6. Presenta un gráfico que muestra la actividad cromogénica de FIX-(CTP)²(concentración de la muestra/D.O.) en comparación con el plasma mezclado normal humano y rhFIX (American Diagnostics).

Figura 7. Presenta un gráfico que muestra el perfil PK de FIX-CTP-CTP purificado, rhFIX, cosecha de FIX-CTP-CTP, y cosecha de FIX-CTP.

Figura 8. Muestra transferencias Western con anticuerpos anti-CTP y anti-gamma carboxilación del FIX fusionado a tres, cuatro o cinco CTP. Las cosechas de FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precisión plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del Ac policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ac anti-Gla (American Diagnostica).

Figura 9. Muestra una detección con azul de Coomassie de FIX-CTP³, FIX-CTP⁴, y FIX-CTP⁵. Después de un proceso de purificación con la utilización de una columna de jacalina (purificación por inmunoafinidad de las proteínas glicosiladas), FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precisión Plus (Bio-Rad). El gel de SDS-PAGE se tiñó mediante el colorante azul de Coomassie para la detección de las muestras.

Figura 10. Muestra la actividad cromogénica del FIX. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5 completamente purificados (columna HA) frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, que está disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Todas las muestras se diluyeron en serie y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano.

Figura 11. Muestra el perfil farmacocinético (PK) comparativo de FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵. La concentración del FIX en las muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de estuches de Elisa para FIX humano (Affinity Biologicals). Se calculó el perfil farmacocinético y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo. Los tiempos de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK Solutions 2.0.

Figura 12. Muestra el análisis de FIX-CTP³por SDS-PAGE - Coomassie SDS-PAGE. La proteína enriquecida ycarboxilada FIX-CTP³, rhFIX y rFIXa (FIX activado) se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis del SDS-PAGE y Coomassie se realizó mediante la tinción del gel con el reactivo azul de Commasie (800 ng de proteína) (figura 12A). Se realizó una inmunotransferencia Western mediante el uso de 100 ng de proteína con Ac policlonal anti-FIX humano (figura 12B), anticuerpo monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics Cat #499, 3570) (figura 12C), Ac policlonal anti-propéptido de FIX (figura 12D), y Ac policlonal anti-CTP (figura 12E).

Figura 13: Muestra la actividad cromogénica de FIX-CTP³. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FIX-CTP³y de la proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP³, frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). La cosecha de FIX-CTP³y la proteína se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano.

Figura 14: Muestra el tiempo de coagulación de manera comparativa. Se realizó un ensayo de aPTT (tiempo de trombina parcial activada) in vitro que comparó la actividad de coagulación del FIX-CTP³con BeneFIX. Las proteínas se diluyeron en serie y se adicionaron al plasma agotado de FIX humano, y se evaluó el tiempo de coagulación. Figura 15. Muestra el perfil PK comparativo de FIX-CTP³. La concentración del FIX se cuantificó mediante el uso de estuches de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo.

Figura 16. Muestra los parámetros del perfil de actividad. En paralelo al muestreo de PK, los animales deficientes del FIX administrados con BeneFIX® o FIX-CTP³, las muestras plasmáticas citratadas, se evaluaron en cuanto a su actividad de coagulación mediante el ensayo de aPTT, que se tradujo a % de actividad. El % de actividad en cada punto de muestreo se calculó como el tiempo de coagulación actual/tiempo de coagulación del plasma mezclado de ratones normales * 100.

Figura 17. Muestra los parámetros de un primer reto de sangrado. Los ratones deficientes de FIX se administraron con una única inyección intravenosa de 100 UI/Kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se comprimió ligeramente 48 horas después de la dosificación y se evaluaron el tiempo de sangrado por la vena de la cola (TVBT) y la intensidad del sangrado (DO de hemoglobina). Un segundo reto de sangrado se realizó 15 minutos después de alcanzar la homeostasis, y se midieron los mismos parámetros.

Figura 18. Muestra los parámetros de un segundo reto de sangrado. Una vez que el primer sangrado descrito en la leyenda de la figura 19 se detuvo espontánea o manualmente, un segundo reto de sangrado se realizó 15 minutos después del primero, y se volvieron a medir el tiempo y la intensidad del sangrado.

Figura 19. Muestra un diagrama que ilustra la construcción de rFVII-CTP (A), la construcción de rFVII-CTP-CTP (B), la construcción de rFIX-CTP (C), y la construcción de rFIX-CTP-CTP (D).

Figura 20A. Presenta un gráfico de barras que muestra cosechas de células limitadas diluidas transfectadas con clones y seleccionadas con variantes de FVII-CTP en presencia de vitamina K3 a 5 pg/ml. El nivel de FVII se cuantificó mediante el uso de ELISA para FVII (AssayPro).

Figura 20B. Presenta un gráfico de barras que muestra cosechas de células limitadas, diluidas, transfectadas y seleccionadas con variantes de FVII-CTP en presencia de 5 pg de vitamina K3. actividad. La actividad de FVII se cuantificó mediante el uso de un ensayo de actividad cromogénica de FVII (AssayPro).

Figura 20C. Presenta un gráfico de barras que muestra cosechas de células limitadas diluidas transfectadas y seleccionadas con variantes de FVII-CTP en presencia de 5 pg de vitamina K3. La actividad específica del FVII se calculó para cada versión mediante la división del valor de la actividad por la concentración de FVII de la cosecha. Figura 20D. Presenta un gráfico que muestra el perfil PK de FVII, las cosechas de FVII-CTP-CTP y FVII-CTP.

Figura 21. Muestra transferencias Western del FVII fusionado a tres, cuatro y cinco CTP, detectado mediante el uso de anticuerpos anti-FVII, anti-CTP y anti-gamma carboxilación. Las cosechas de FVII-CTP³, FVII-CTP⁴, y FVII-CTP5 se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % (expedeon) mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso de Ac anti-FVII, Ac policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ac anti-Gla (American Diagnostica).

Figura 22. Muestra la actividad de FVII - actividad cromogénica. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FVII-CTP³, FVII-CTP⁴y FVII-CTP5 purificados en HA (fracción altamente gamma carboxilada) frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Todas las muestras se diluyeron en serie y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano.

Figura 23. Muestra un primer perfil farmacocinético (PK) comparativo-FVII 3, 4 y 5 CTP. FVII-CTP³, FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵(grupos A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague Dawley (seis ratas por tratamiento) en una dosis de 250 pg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. FVII-CTP⁵demostró un perfil superior en comparación con las otras dos versiones.

Figura 24. Muestra un segundo perfil PK comparativo-FVII 3, 4 y 5 CTP. FVII-CTP³, FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵después de la selección del FVII y el proceso de purificación en HA (grupos A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague Dawley (tres ratas por sustancia) en una dosis de 29,45 pg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital a las 0,083, 0,5, 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis.

Figura 25. Muestra un diagrama esquemático del proceso de purificación de FVII-CTP³. El lote 31 se produjo para el estudio de PK/PD. El lote 38 se produjo para el estudio de supervivencia.

Figura 26. Muestra un SDS -PAGE y transferencia Western de FVII Final y FVIIa. Se cargaron 10 pg (lote 31) o 5 pg (lote 38) en cada carril de SDS-PAGE teñido con Coomassie. Se cargó 1 pg de proteína en cada carril de la transferencia Western. 1. Polipéptido FVII-CTP³; 2. Cadena pesada, que incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera. Los tres anticuerpos detectaron FVII. La cadena pesada de FVIIa se detectó mediante a-CTP, y la cadena ligera se detecta tanto con a-FVII como con a-Gla.

Figura 27. Muestra que la actividad cromogénica de FVII-CTP³aumenta como resultado de la purificación en una columna de hidroxiapatita (HA) cerámica. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FVII-CTP³, de las fracciones durante el proceso, y del FVII-CTP³purificado frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). La cosecha de FVII-CTP³y la proteína se diluyeron en serie y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia de plasma normal humano.

Figura 28. Muestra el perfil PK de FVIIa-CTP3 frente a NovoSeven® en ratones deficientes de FVIII. FVIIa-CTP3 se produjo después de la selección de FVII, el proceso de purificación en HA y la activación. FVIIa-CTP3 o NovoSeven® se administró en una única inyección intravenosa a los ratones hemofílicos FVIII-/-. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital a las 0,083, 0,5, 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis, y se estableció un perfil PK basado en la actividad de coagulación del FVIIa mediante el uso de un estuche comercial STACLOT.

Figura 29. Muestra que se produjo FVIIa-CTP3 después de la selección de FVII, el proceso de purificación en HA y la activación. FVIIa-CTP3 o NovoSeven® se administró en una única inyección intravenosa a los ratones hemofílicos FVIII-/-. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital a las 0,083, 0,5, 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Los parámetros de generación de trombina se evaluaron durante el experimento de PK, y se evaluaron parámetros como la cantidad máxima hasta el pico, la cantidad de trombina hasta un punto de tiempo y la velocidad de generación de trombina.

Figura 30. Muestra las curvas de supervivencia de los ratones hemofílicos después del corte de la vena de la cola (TVT). El TVT se realizó (A) a los 15 min, (B) 24 horas o (C) 48 horas después de la administración. La supervivencia de los ratones se observó durante 24 horas después del TVT y se registró en cada hora durante las primeras 12 horas, y después de 24 horas. La Figura 33D resume la supervivencia de los ratones según se registró 24 horas después del TVT. Los datos del grupo control (vehículo) es la suma de los 3 experimentos con 5 ratones/experimento.

Figura 31. Muestra las inmunotransferencias de FVII - 3- CTP y FVII- 5 CTP. A) con transferencia para GLA. B) con transferencia para FVIIa. C) con transferencia para CTP.

Figura 32. Muestra un perfil PK comparativo-FVII 3 y 5 CTP- a partir de la purificación en columna Select y HA (FVIIS frente a FVII HA).

Figura 33. Muestra un perfil PK comparativo-FVII 3 y 5 CTP-El segundo estudio (IV frente a SC).

Figura 34. Muestra las curvas de supervivencia de los ratones hemofílicos después del corte de la vena de la cola (TVT). El TVT se realizó 12 horas después de la administración SC. La supervivencia de los ratones se observó durante 24 horas después del TVT y se registró en cada hora durante las primeras 12 horas, y después de 24 horas. Figura 35. Muestra el perfil PK de MOD-5014 frente a NovoSeven® después de la administración IV o SC. A) muestra la administración IV; B) muestra la administración SC.

Figura 36. Muestra el perfil PK de MOD-5014 (Clon 61 #75, #81) frente a NovoSeven® después de una sola administración SC.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a los usos médicos de los factores de coagulación de acción prolongada. Los factores de coagulación de acción prolongada comprenden tres péptidos del carboxilo terminal (CTP, referidos además como unidades CTP) de la gonadotropina coriónica humana (hCG). Se describe que el CTP actúa como un protector contra la degradación del factor de coagulación, aumenta la Cmáx de un factor de coagulación, aumenta el Tmáx de un factor de coagulación, aumenta el tiempo de vida media en circulación de un factor de coagulación, y/o mejora la potencia de los factores de coagulación.

La invención además proporciona un factor de coagulación modificado por un péptido carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica que consiste en un factor de coagulación, y tres CTP unidos al carboxilo terminal de dicho factor de coagulación, en el que dicho factor de coagulación modificado con CTP es:

un polipéptido del Factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No : 31 o de los aminoácidos 47-545 de la SEQ ID NO: 31

un polipéptido del Factor VII (FVII) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la SEQ ID NO: 25; o

un Factor VIIa (FVIIa) activado modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos 39-528 de la SEQ ID NO: 25,

para su uso en la reducción de hemorragias o hematomas excesivos en un sujeto, o para su uso en el mantenimiento de la homeostasis durante una cirugía o durante una intervención quirúrgica en un sujeto

El factor de coagulación VII (FVII) es una glicoproteína de 444 aminoácidos (50 KDa) secretada por los hepatocitos al torrente sanguíneo como una proenzima inactiva. Tras un daño tisular y exposición a la sangre circulante, el FVII forma un complejo con el factor tisular (TF) que es una verdadera proteína receptora del FVII y se expresa por diversas células localizadas en las capas más profundas de la pared del vaso. La formación de este complejo FVIITF conduce a la activación del FVII. El FVII activado (FVIIa) inicia la vía de coagulación extrínseca mediante la activación del Factor IX y el Factor X.

FVII pertenece a un grupo de glicoproteínas dependientes de la vitamina K, asociadas con el sistema de coagulación. Además del FVII, este grupo consiste en el Factor IX, el Factor X, la Proteína C y la protrombina. Estas proteínas tienen similares organizaciones de los dominios y se sintetizan como precursores con un propéptido N-terminal seguido por una secuencia de aminoácidos madura. El propéptido contiene un sitio de entrada para la gammacarboxilasa que convierte ácidos glutámicos (Glu) en ácidos gamma carboxi glutámicos (Gla). Este dominio es seguido por dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), una región de conexión (CR) y un dominio C-terminal de serina proteasa. Antes de la secreción, el propéptido del FVII se escinde para formar una glicoproteína del FVII, zimógeno monocatenario de 406 aminoácidos. Después de la secreción, la proteína puede activarse como un heterodímero de dos cadenas unidas por enlaces disulfuro, FVIIa, mediante escisión en la CR. La concentración plasmática del FVII es 10 nM y aproximadamente el 1 % circula en la forma activa en los individuos saludables.

El factor IX (FIX) es una glicoproteína de 415 aminoácidos (55 KDa); pertenece a un grupo de glicoproteínas dependientes de la vitamina K, asociadas con el sistema de coagulación. El FIX tiene una organización de los dominios similar al factor FVII, el Factor X, la Proteína C y la protrombina que se sintetizan como precursores con un propéptido N-terminal seguido por una secuencia de aminoácidos madura.

El FIX se secreta como una molécula monocatenaria que experimenta complejas modificaciones postranscripcionales, muchas de las cuales son críticas para sus propiedades bioquímicas y farmacocinéticas. Entre todas las modificaciones postranscripcionales, 12 residuos de ácido glutámico cerca del amino terminal del FIX que se gamma carboxilan mediante la gamma carboxilasa dependiente de la vitamina K son las más cruciales. La carboxilación es necesaria para la interacción del FIX con las superficies fosfolipídicas y para una actividad óptima del FIX. El propéptido amino terminal sirve como un sitio de reconocimiento para la gamma carboxilasa y, por lo tanto, después de la gamma carboxilación, se escinde por la serina proteasa del aparato de Golgi conocida como enzima de escisión de aminoácidos básicos apareados (PACE/Furina). Otras cuatro modificaciones postranscripcionales podrían ocurrir en el aparato de Golgi: sulfación de la tirosina 155, fosforilación de la serina 158, O-glicosilación en Ser 63 y en 61 y finalmente, N-glicosilación en Asn 157 y 16, pero se demostró que no son necesarias para la actividad adecuada del FIX.

El FIX circula en el plasma (concentración promedio de 5 gg/ml) como un zimógeno inactivo monocatenario. Tras la escisión proteolítica en dos enlaces peptídicos: Arg 145 y Arg 180 mediante uno o dos activadores fisiológicos, el complejo FVIIa-TF o FIXa, el péptido de activación se elimina, lo que convierte al FIX en una enzima completamente activa que consiste en una cadena ligera y pesada que se mantienen unidas mediante un único enlace disulfuro. La cadena ligera N-terminal contiene el ácido gamma carboxiglutámico no catalítico (Gla) y dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico, mientras que la cadena pesada C-terminal contiene el dominio catalítico de la molécula, similar a la tripsina. El FIXa solo se caracteriza por poca actividad catalítica. Sin embargo, cuando está en forma de complejos con FVIII, su actividad proteolítica aumenta en 4-5 órdenes de magnitud hacia su sustrato natural FX.

En consecuencia, se describen en la presente un método para prolongar el tiempo de vida media biológica o mejorar el área bajo la curva (AUC) de un factor de coagulación, que comprende la etapa de unir tres CTP al carboxilo terminal del factor de coagulación, para prolongar así el tiempo de vida media biológica o mejorar el AUC del factor de coagulación. Se describe en la presente un método para prolongar el tiempo de vida media biológica o un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) del FVII o FVIIa, que comprende la etapa de unir tres CTP al carboxilo terminal del FVII o FVIIa, para prolongar así el tiempo de vida media biológica o mejorar el AUC del FVII o FVIIa. La presente solicitud también describe un método para prolongar el tiempo de vida media biológica de un polipéptido del factor IX (FIX), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para prolongar así el tiempo de vida media biológica de dicho polipéptido del FIX.

La solicitud también describe un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de un polipéptido del factor IX (FIX), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para mejorar así el AUC de dicho polipéptido del FIX. La presente solicitud también describe un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de un polipéptido del factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa, para mejorar así el AUC de dicho polipéptido de FVIIa.

En otra modalidad, un factor de coagulación de la invención es una proteína. En otra modalidad, un factor de coagulación de la invención es un péptido. En otra modalidad, un factor de coagulación de la invención es un polipéptido. En otra modalidad, el factor de coagulación es una enzima. Se describe que el factor de coagulación es una serina proteasa. Se describe que el factor de coagulación es una glicoproteína. Se describe que el factor de coagulación es una transglutaminasa. Se describe que el factor de coagulación es un zimógeno inactivo.

En una modalidad, el factor de coagulación es el Factor VlIa (FVIIa). En otra modalidad, el factor de coagulación es el Factor VII (FVII). En otra modalidad, el factor de coagulación es el Factor IX (FIX). En otra modalidad, el factor de coagulación es el Factor IXa (FIXa).

En una modalidad de la invención, el factor de coagulación es una glicoproteína. Se describe que el factor de coagulación es una glicoproteína dependiente de la vitamina K.

En otra modalidad de la invención, el factor de coagulación es una proteína recombinante. En otra modalidad de la invención, el factor de coagulación es una glicoproteína recombinante. En otra modalidad, el factor de coagulación comprende un péptido señal.

En otra modalidad de la invención, el factor de coagulación comprende tres repeticiones de CTP unidas al extremo C-terminal y sin CTP unidos al extremo N-terminal.

En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en un polipéptido del FIX y tres péptidos del carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina, unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX modificado con CTP.

En otra modalidad, la presente invención proporciona además un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP que consiste en un polipéptido de FVIIa y tres péptidos del carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina, unidos al carboxilo terminal de dicho FVIIa.

En otra modalidad, el factor de coagulación se sintetiza como un precursor con un propéptido N-terminal. En otra modalidad, el factor de coagulación como se usa en la presente está en una forma proenzimática inactiva. En otra modalidad, el factor de coagulación se produce en hepatocitos. En otra modalidad, el factor de coagulación comprende un sitio de entrada para la gammacarboxilasa que convierte ácidos glutámicos (Glu) en ácidos gamma carboxi glutámicos (Gla). En otra modalidad, el factor de coagulación como se usa en la presente es un factor de coagulación disponible comercialmente.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

c tc g a g g a c fltg g tc tc c c a g g c ro c tc a g g c tc c tc tg c c ttc tg c ttg g g c ttc flg g g c Lg c c tg g c tg c a g tc ttc g ta B c c c a g g a g gaügcccücngcgtcctgcaeí.’ggcgocggcgcgccaücgegllL’ctggangiigctjiL’ggccgggrtccctggagagggantiií;

aaggaggagcagtgctccr tcgaggaggcccgggaga rcttcanggacgcggag aggacga agctgttctggaíf tcttac agtgat ggggaccíigtgtgcctcaíigtccatgocagaatgggggctcctgcaaggaccíigctccagtcctatatctgcrtcrgcctccctgccttc gagggpcggaactgtgíigacgcacaagg^lgaccagclgBtctgtgtgBHCgagaacggcggctgtgjigcagtactgcagtgajcca t-’ücgggcacc aagc ge tc-ctgtcggtgec LLt’gügggg taclí:t£:tg(:tgge;i¡;¡icggggtgtcc tgeacacc L’íicaglt£¡iatatL:í: atgtggaaaaatacctatteragaaaaaagaaatgc:cagcaaacqccaaggccgaattgtggggggqaaggtgtgcqccaaagggg agtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggce cactgíncgacaaafltcaagaactggaggaacc^atcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgiigca gQgutggcgggtggogt: aggtcateatccccagcacg tacgtt:L:c:gg”t accaí-caaccacgacatcgcgctgctcc gcctgcac cagoocgtggtcctc actgacc atgrggrgcccctc tgcctgccegaacggacgttctctgagaggacgerggccttcgtgcgc ttc te attggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggetgatgaccc aggactgcctgcagcagtcacggaaggtggg^actccccaafltatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggñtggcflgca agfiajctc!c(g:aagggggacagtggaggcccacate0cacccac:ta0cggggcaí;gtggtacctgia)cgggcatcgtcagctgggg ccagggctgegcaaccgtgggceactttggggtgtacaceagggtcrercagtaeategagtggetgcüüíiagctcütgcgereüga gccacgcccaggagtcctcctgcgagcoccatttccctgaggatgcggccgc (SEC. CON NÚM. DEIDENT.: 11).

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: MVSQALRLLCLLLCLQGCtAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFL€ELRPGSLERÉ€KE

EQCSFEEAREIFKDABRTKLFW1SYSDGDQCASSPCQNGGSC K DQLQ5 YICFCLPAFE

GRNCETIIKDDQLICV NENGGCEQYCSDIITGTKRSCRCIIEGYSLLADGVSCTPTVEY

HCGKIP1LEKRN ASKHQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLiNTIWVVS

AAE1CFDKIKNWRNLÍAVLGEH DLSEHDGDEQSERVAQVUPSTYVFGTTNHDIALLRL

H QPVVLTDHWPLC LPE RTFSERTLAFVRFS LV SGWG QLLDRGAT ALE LM VLNVPRL

MTQDC LQQS RKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATH YRÜT W YLTG il VSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP ^{[sec.con núm deident g)}

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKE

BQCSFEEARBÍFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNQGSCKDQLQSYICFCLPAEE

GRNCETEIKDDQUCVNENGGCEQYCSDI JTGTKRSCRCl JEGYSLLADG VSCTPT VEY PCGiOPILElí RN ASKPQGRTVGGK VCPKGECPWQ VLLLVNCJAQLCGGTLt N TIW V VS

A AHCFDKIKN WRNLtAVLGEHDLSEH DGDEQSRRV AQV1IPSTY VPGTTNHDIALLR L

HQPWLTDHVVPLCLPERTFSERILAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVFRL

MTQ DC LQQ S RKVGD5 PNITEYM FCAGY S DGS KD SCKGDSGGPHATH YR GTWYLTGI

VSWGQGCATVGHEGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPEP GCGR (SEC. CON

NÚM. DEIDENT.: 10}.

Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

ctcgaggacatggtctcccaggc'cctc aggctcctc tgccttc tgcttgggc rtcagggctgcctggc [gcagtctt cgtaacccagg ag gaageccacggegiccigcae cggegccggcgcgccaac gcgttcctggaggagctgcggccgggciccc tggag agggagigc aaggaggagcag tgctcc ttcgaggaggoccgggagatcttca aggacgcgg agagg acga age tg tlctggatttc ttacagtgat ggggacca^gtgectcaagtcc atgceagaatgggggetce tgcaaggaccagc tceagtcctaLatctge uctgcc rece igce t te gagggccggaac Lglgag acgcacaaggatgaecagc Lgalc Lg Lg tgaacgagaacggeggc Lgtgagc agtac tgeaglgacca cacgggcaccaagcgctcctgí cgg tgccac gaggg gtEctctctgctgg ca gacg gggtgtcctgcacaeccflcag rtg aata toe atgtggaaaaatacc tatué tagaaaaaagaaaJtgpcag¡caaaccccaaggocgaatigt;ggggggcaaggtgfigcccc aaagggg agtgtccatggcag gtcctgttgttgg lg aatggagc tcagttgtgtg gggggaccctg atcaacacc atetggg rgg tctccgcggcc cactgtttcgacaa aatc aagaac tggaggaacc tgatcgcggtgctg ggcgagcacgaoctca gcgageacgacggggatg agea g agccggcgggtg gege aggtc atcatccccagcacgtacgte ccgggc ac cae caacc acgacatcgcgctgetccgcctgcac cag cccgtggtcc reactg acc£itgtggtgcccctctgcctgcocga acggacg etc tetgag aggacgc tggccttc gtgcgc ticte attggte agCggCtg&ggCeágCtgC tggaccgtgge gccacggc ec tggüge Leatggtc CtC ááCgt gCCCCggC tgatgaccc aggac tgeet gcagcagtc acgg aagg tgg gagac tccccaaatatcaeggagtae atgtietgtge eggetaeteggatggeagc a agg aetcetgcaaggggg acagtggagg cceacatgccacccac taccg gggcacgtggtacc

tgacc £ ge ategtg agctggggce agggc tgegcc aCCgtgegCCaC tfcggcgtgtacacc agggtg tÜCC ¡ígtacategjiglgg ctgcagaaac tgatg agaageg agcecag acccggcg tgctgagagagccccc t tcccc ageageage tccaaggcccctccccc tagcctgcceagccc tagea gac tgcctgggcccagcgacaccccc atcctgcccc agtgaggatecgcggccgc S EC. CO N NÚM DE IDENT.:12j.

Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

M V S Q ALRLLCLLLGLQGCLA A VFVT QEE AHG VLHRRRRAN AFLEELRPGS LERECKE

EQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFE

GRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEY

PCGKIPILEKRN ASKPQGRIV GGK V CPKGECPW Q VLLLVN G AQLCGGTLINTIW V V S

A A HCEDKIK M WR N LIA V U ’p EH D LS EH1X 1DEQSRR V AQ V11PST Y V PGTTN H E IA L LR L

E4QPVVLTDHV VPLCLPERTFSERTLAP VR F$L V SG WGQIX D R G A 1ALELM VEN VPR L

MTQDCLQQS RKVGDS PN1TE YM PC AGYSDGS KDSCECGD SOGPH AT H Y R GTW Y í T G I

VSWGQGCATVGEIFGVYTRVSQY1EWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPS

PSRLPGPSDTPfLPQ* (SEC. CON NÚM. DE IDENT. :13).

Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

ctcgaccac atggtctc cc aggccc te aggetcctc tgeette tgcttgggc rrcagggctgccfggc tgcagtcrrcgta acceqgg ag gaage ce a¿: ggc gte ctgc acc ggc g ccggc ge ge c a aege gt (ectgg aggagctgc ggc c g ggctcc etgg agagggag tgc aag gaggagcag rgctccrrcgaggaggoccgg gagatettea nggacgcgg agagg acgaagctg tictggatttc ttacag tgat gggga cea gtgtgectca agtcc atgee aga atgggggcrcctgcanggaecagc tccagtccta tatctgc ttctgcc tcccrgccttc gagggccggaae tgigag aege araaggjugaccage rgaictg tg tgaaegagaaeg gcggetgtgagc agtae rgcagtgacca cacgggcaccaagcgctcctgtcgg tg ccacgag gggtactctctgctggcagacg g ggtgtcctgcacacccacagttgaatatcc íitgtggaaaaütai.Lctatt]cl:agaaaaaagaaütgccagcaaaccccaaggeí:gaallglggggggcaaggtgtgc;c£:caaagggg agtgte caLggcaggLcctgttgt tggtgaatggagc te agttgtg tgggggg acce tgatcaac accatc t g ggtggtc te cgcg gee cactgtttcgacaaaatc aagaac tgg aggaacc t gatcgcggtgcrgg gegagcacgacctcagcgag cacg acg gggatg agea gagee ggcg gg t g g c ge agg t catcat c ecc agcacgtacgttccgggc acc ac caacc acg aca te gege tgc tecgcetgc ac cagccc glg gtcc teaclgacca Lglggtgeccelc tgcctgcccgaacggacg tic tclgagaggacgc tggec l le glgcgc uctc a t tgg te agcggctggggecagetgclg gaccgtggc gccaeggccc tgg age tcatgg te ctcaacg tgccceggc tgatgaccc aggactgcctgca gcagrcacggaaggtgggagactecccaaa raf cacgga grac atgnctgtgecggctactcggatggcagca aggaciccigcaagggggatagiggüggtctacaLgccacccac Laccggggcatg tgg tacetgac eggca teg t gagetg g gg cea gggcfgcgccaccgtgggccactccggcg rgracaccagggtgtcccag tacarcgag tggctgeaga aac rg atgag aagcg agccca gacccggcgtgctgcrgag agccccetrccecagcage age tccaa ggcccctccccctagcctgcccagccc tageaga

c tgee t g ggccc tccgac ac ac c aatceigceacagagcagc teetctaaggce ce tcctcc atece tgoc atcccc etc ccggc tgc caggcccctcrgacaccectatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc (SEC. CON NÚM. DEIDENT.: 14).

Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

M V S Q ALRLLCLLLGLQGCLA A VFVT QEE AHG VLHRRRRAN AFLEELRPGS LERECKE

EQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFE

GRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEY

PCGKIPILEKRN ASKPQGRIV GGK V CPKGECPW Q VLLLVN G AQLCGGTLINTIWV V S

AAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRL

HQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRL

MTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGI

VSWC 3 QGCATVC iHFGV YTRVSQYI EWLQKLMRSE PRFt iVLURAPFPSSSSKAPPPS EPS

PSRLPGPSDTPILPQ5SSSK APPPSLPSPSRLPGPSDTTPILPQ** (SEC. CON NÚM. DE

IDENT.: 15).

En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-CTP-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

ctcgaggacatggtcrcccaggc'cctc aggcrcctc tgccttc tgcttgggc rrcagggctgcctggc tgcagtcttcgtaacccaggag gaagcccacggcgtcctgcaccggcgpcggcgcgccaacgcgítcctggíggagptgcggccgggctccc tgg ag agggagtgc aaggaggagcag tgctccttcgagg aggcccgg gagatcttcaag gacgcgg íigagg acgaagc tg ttctggatttc ttacag tg at ggggaecagt gtgcclca agtecat gecagaat jígggiictcctgcEiaggaccEiiictccagrcetalatctgc ttotgec toce tgccttc gagggccggaac tglgagacgc acaaggatg accagc rgalctg tg tgaacgagaacggcggc tgtgagc agtac tgeag tgacea cacgg g cae c aagc ge tcctg tcggtgccac gaggg gtac tetetgctggc ag acgggg tg tcc tgc ac □ c c c ac agttgaa t atoe atgtggaaaaataí: ctatK: [agaaaaaagaaat «ccagcaaaccceaüggccgaaltglggggggcüaggtgtgcccc aaag ggg agig tccatggeaggtcetg i tg t tgg ig aatgg age tcag t tgig tg g ggggaccc tg atcaacíiccíitetggg tgg tetccgeggcc cae rgtttcgacaaaatc aagaac tggaggaacc t gatege ggtgc rgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagca gagccggcgggtggcgcaggtcatcatcccc ageaeg tacglcccgggc accaccaaceacgacalegcgclgc tccgcclgcac cagcccgtggtccrcactg accatgtgg tgcecctctgcctgcctgaticgg acg t te tctgag aggacgc tggcettc gtgcgc trote attggtc ügcggctggggoca getgc tggacogtggc gecacggc ce tggagc tcatggtc ctcaae g t gccccggc tgatgacec agg actgcclgcagcagleacg gaag gtgggag ac tcc cea aatafcacggag tac atgüctgtgc cggctactc ggatggcagoa aggactoctgca agggggacagtggaggcccac atgccacccac toccggggcacgtggtaco tgacc ggcatcgtgagctgggg ccagggc igogco accgtgggccac ttcggc gtgtacacc&gggtgtcocagtacatcgagtggctgc agaaac tgatgagaagcg agcocag ace cggog tgctgotgag agccocottcccoagoagcagctcoaagg cocctccecctagcctgcocagccotagcaga Ctgcctgggcccagtgacacccctatoctgcctcagtccagctccagcaaggccccaiocccctagcctgccttctcicttctcggctgcct ggccccagcgatac tccaattcigccccag tcc tccagcag taaggc tcccccicoatc tetgee atccccc age agac tgccaggcc cttctgatacacccatcctcccacag tg atgagg ateo gcggccgcttaattaa (SEC. CON NUM. DE IDENT.: 24}.

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKE

EQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFE

GRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEY

PCGKIPILEKRN ASKPQGRIV GGK V CPKGECPW Q VLLLVN G AQLCGGTLINTIW V V S

AAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRL

HQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRL

MTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGI

V S WGQGC ATV GHFG V YTRV S Q YIEWLQKLMRSEPRPG VLLRAPFPS S S S K APPPSLPS

PSRLPGPSDTPILPQSSSSICAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGP

SDTPILPQ** (SEC CON NÚM. DE IDENT.: 25}.

Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-(CTP)4 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

ctcgaggacatggtcrcccag garete aggctcctc tgeette tgcttgggc rrcagggctgccrggc tgcagtcttcgtaacccaggag gaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccc tggag agggagigc aaggaggagcag [gctccttcgagg aggcccgg gagatcttcaaggacgcgg agagg acgaagctgttctggatttc ttacagtg at ggggaecagtgtgcctca agt[:cütgt:cag JialgggggL‘lt;ctigt:a JiggactagctctiU" H-’ctalatL’tgc tCelgcc teca tgeette gagg gccggaac tgigagaege acaaggaLg accagc tg atetg tg [g aacgagaacggcggctgtgagcagtac Lgcag tgacca cacgg g cae c auge ge tcc t g tcggtgccac gaggg gtactctctgctggc agaegg g g tgtcctgcac ac ce ac agttgaa t atcc a tgtgguaaaatat etatte tagaaaaaagaaat "tcagcaaacccL’aaggccgaattgtggggggcaaggtgtgLCL’t: aaag ggg agig tccatggeagg icctg i Lg t tgg tg aatgg age tcag t tgig tg g ggggaccc tg atcaacacc atctggg tgg tctccgeggcc cae Igtttcgacaaaatc aagaac tggaggaacc tgatege ggtgc tgggcgagcacgacetcagcgagcacgacggggatgagca gagccggcg ggtggcgcagg tea tcatccc es gcac gtacgtcccg ggc acc accaaceacgacalcgcgclgc Lccgcclgcac cagcccgtggtcctcactg accatgtgg tgcccctctgcctgcocga acggacg ttc tctgag aggacgc tggccttc gtgcgc ticte attggtc agcggctggggccagetgc tggaecgtggc gecaeg ge ce tggagc teatggtc ctcaacgtgcceeggctgatgaccc agg actgcclgcagcag icacgg aag glgggagac tcc ccaaalalcacggag ta catg t te tgtgcc ggctactcgg atggcagca aggactcclgca agggggacagrggaggeccac atgecacccac taccggggcacgtggtacc tgacc ggcarcgtgagctgggg eeaggge tgegce accgtgggccat ttcggegtgtaeüceagggtgtceeagtücaEcga” tggctge agaaac tgatgagaageg agcccagacccggcgtgctgctgag agcccccttccccagcagcagc tccaaggcccctccecctagcctgcccagccc tageaga ctgcctcggcecagtgacacccctatcctgcctcagtccagctecagcaaggccccaccccctagcetgcettctccttctcggctgcct ggccccagcgalac tccaattctgccccagtcc tceageag taaggc lecocclccatc iclgcc atcoccc age agac tgccaggcc cttctgatacacccatcctcce acag tg atgEgg atcc ge (SEC. CON NÚM. DE IDENT. :26).

Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor VII-(CTP)4 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

LEDM V S Q ALRLLCLLLGLQGCLA A VFVT QEE AHG VLHRRRRAN AFLEELRPGS LERE

CKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLP

AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPT

VEYPCGKIPILEKRN AS KPQGRIV GGKV CPKGECPW Q VLLLVN G AQLCGGTLINTIW

VVS AAHCFDKIKNWRNLIA VLGEHDLSEHDGDEQSRR V AQVIIPSTYVPGTTNHDIAL

LRLHQPYVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNV

PRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYL

TGIV S WGQGC AT Y GHFG V YTRV S Q YIEWLQKLMRSEPRPG VLLR APFPS S S S KAPPPS

UPS PSR LPG PS DTPILPQ SS S SKAPPPSLPS PSRUPGPS DTPIL PQS SS S KAPPP SLPS PS RLP

GPS DTPIJ .PQ* *G (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 27).

Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-(CTP)5 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

ctcgaggacatggtctcccaggccctc aggetcctc tgccttc t gct t gggc ttcagggctgcctggct gcngtcttcgtaacceagg ag gaagcccacggcgjccrgcaccggcgccggcgc gccaac gcgttcctggflggagc tgcggctgggctccc Lggag agggagtgc aagg aggagcagtgc te e ttc g agga ggccc gggagatctlcaflgg ac geggagagg acgaagc tguelggüiuc LLíicaglgat gggga ccagtgtgcctca agtcc atgcc asa atgggggctcctgcaaggaccagc tccagtccta tatctgc ttctgcc tcccfgccttc gagggccggaae rgtgagacgc acaaggtugacc age rgalctg tg Lgaacgagaacggeggc tgtgagcaglae Lgcagtgacera cacgggcaccaagegctcctgtcgg tg ccacgag gggtactctctgctggcagacg gggtgtcctgcacacccacag rrg aatatc c atgtggaaa aataccta ttetaga aaaaagaaatgocagcaaacccca aggecgna ttgtggggggcaa ggtgtgcccc aaagggg agtgte eaLggcaggtcctg t tgt tggtgaatggagc tcagttgtg tggggggaccc tgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcc cactgtttcgacaaaatc aagaac tgg aggaacc tgategcggtgcrgggcgagcacgacctcagcgag cacg acg gggatg agea gagrcggcgggtggcgcaggtcatc&coccagcacgtacgtcccggg]caccáccaBCcacgacatcgcgctgctccg)CCt£Các cagcec giggtee [cae tgaecatgtgg tgCCCC ictgcctgcecgaacgg a cgtte te tg agag gacgctggc c ttc gigcge ticte a t tgg tcagegg ctggggccagctgctg gaccgtggc g ccacggccc tgg age tcatgg te ctcaacg tgccccggc tgatgaccc aggac tget t ge ageagtc acgg aaggtg s gaga ctcec ca aatatc ac g gag tac atg t te tg tg cc s getac tegg at g geagea aggaciceigcaagggggacagiggaggcccacaigccacceüe Laccggggcacgiggtacc tgacc ggcatcgigagcigggg ccag ggc tgcgccaccgtgggccac iicggegtglacaccagggtglcecag tacalcgag tggctgeagaaac igatgagaagcg agccca gacccggcgtgcigctgag agccccc ttccccagcascagc tccaa g ge cectccc ce tflgce t g cce agee c rageaga c tgoctgggocc te tgae acccclaLccigcctcagLccagclce ictaaggc teeaccaectícectgce tagcccllcaagactgcca ggccc tagcgatacaccaattctgccccagtcaocagcageaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcc ca tccga tacccca attttgcc rcaga gcag cteta gcaaggc acc tcceccca gtc tgccc tctcca age agac tcccrggcccttca gatac tetaatcctetcacagtcctc tagcictaaagctccacc tcccagcc igccc agccctagtagacteceegg ¡ice t te igatacc cccatcrtgccccagtgatgaggatccgc (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 28).

Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor VII-(CTP)5 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

LEDM V S Q ALRLLCLLLGLQGCLA A VFVT QEE AHG VLHRRRRAN AFLEELRPGS LERE

CKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLP

AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPT

VEYPCGKIPILEKRN AS KPQGRIV GGKV CPKGECPW Q VLLLVN G AQLCGGTLINTIW

VVS AAHCFDKIKNWRNLIA VLGEHDLSEHDGDEQSRR V AQVIIPSTYVPGTTNHDIAL

LRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNV

PRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYL

TG IVSWGQGC ATVGH FG V YTR V5Q Yl EWLQKLMRSEPRPG VLLRA PFPSSSSK APPPS

LPS PS R LPG PS DTPIL PQSS S5 K APP PSL PS PS K LPG PS DTP ILPQS SSS K A PPPSLPS PSR LH

GPSDTPILPQSSS5KAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOSSSSKAPPPSLP$PSRLPGPSDTPIL

PQ**GS (SEC CON NÚM. DE IDENT.: 29).

En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

gcgatcgccatgc agcgcgtgaacatgtUcarggcagaatc accaggcctcarcaccattgc’cttttagg atatc tactca gtgctg aat gt ac a gtt t ttcttga le atgaaaac gee aac aaaattetgaateggc caaaga ggt ataatteagg tnaa 11 ggaagagtttgttcaaggg aaccttga gagagaatg tatggaa gaaa agtgt agttttgaagaagcacgaga agtttttgaa aac actgaaag aac aacrgaattttgg aagcag uiigugatggagate ag tgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgaeattaattcctatgaatgttggtg tcectttggatttgaaggaaagaaetgtgaattagatgtaflcatgtaacattaagnatggcagalgcgagcagttttgtaaaaatagtgcrg ata acaaggtggtttgctcctgtactgagggata tcgacttgcagaaa accagaagtcctgtgaaccagcag tgcca tttccatgtggaa gagt t te tgtttcacaaaettetaagetcaeccgtgctgagactgtttttec igalglggaciatg taaat te [actgaage tgaaaceattttg gataacatcactcaaagc acccaatcatttaatgacttcactc gagttgttgg tgg aga agatgccaaaccaggtcaattcccttggcag gttgttttgaarggtaa agttgatgcattctg tggaggctctatc gttaa tga aaaatgga ttgtaactgctgoccactgtgttga aactggtg uaaaa tlac agttgtcgcaggLgaaeataala ttgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattegaattattcetcacc* caactacaatgcagctattaataagtacaacc atgacattgcccttctggaac tggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacc t at t tge uttgctg;icüaggaiitueai:g;iaca[jí:tU:ctje aaatttggatc iggctatgiaüg tggttggggaagagtettecacaaaggga gatcagctttagtíctceagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtctiEgatctacaaagttcaccatctataacaacatgtt ctgtgcrggcttccatgaaggaggtag agatte atgtcaaggagatag tgggggaccccatgttactgaa gtgga agggaccagtttct t jactggaattattagctgggg tgaagagtgtgcaatgaaaggcaaaiütggaatataiacc aagg t atceeggtatgte aactggat taa ggaaaaaacaaagctcacttgaacgcggccgc (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 16).

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor IX comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

MQRVNM MAJES PGLITÍCLLGYLLSAECTVFLDHENANKtLNRPKRYNSGKXEEFVQG

NLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDODQCESNPCLNGGSCKODINSY

ECWCPFGFEGKNCEI .D VTC NIKNGRjCEQFCKNS ADNKWCSCTEG YRLAENQKSCE

PAV PFPOGRVS VSQTS KLTRAETVFPDVDYV N S TEAET1 LD NITQSTQS FKDFTRV VG

GEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKnWAGEHNIE

ETEHTEQKRN VIR1IPHHKYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYV IPICIADKEYTNIF

LKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHE

GORDSCQGDSGaPHVTEVEGTSFLTGHSWGEECAMKGKYCJYTKVSRYVNWfKEKT KLT* (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 17).

Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

gcgafcgccatgcagcgcgtgaacatgatc arggcagaatcaccaggcctcafcac ca tcrgccttttaggata rctac tcag tgctgaa tglac ag L L tticttgjilcatgjiaaacgecaacaaaat tcigaatcggcc aaagaggtataattc aggtaaattggaagagtttgttcaagg gaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagtmgaagaagcacgagaagtttttgaaaacacrgaaagaacaactgaatmg ga4gcagtatgttgatggagatc^agígtgagtEcaatccatgt t ta¡iaiggcggeagttgejiagg¡itgae ¡íttaaitcetatgjiatgttggi gtccctttggatttgaaggaaagáactg(gafittagatgtflflCBlgtaacattaagaaLggcagatgcgagcagttt(g(aaaaatagtgct gataacaaggtggtttgctcc tgractga gggata rcgacttgcagaa aaccagaagtcctgtgaa ccagca grgccamccatgtgga agaglttctgtttcacaaac t te taage tcacccgLgctgagac tg LLLLtcctgangLggae Latgtaaat tctactgaagctgaaaecatttt ggataacatcactcaaagcacocaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggca ggttgttttgaatggtaaagttga rgca rrcrgtggaggctctatcgttaafgaaaaa rggattgtaactgcrgcccac tg rg ttgaaactggt gttaaaat tac ag t tgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatae agagcaaaage gaaatgtgaLtcgaaLLattcc tcac cacaactaeaatgcagcrattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacac ctalltgcattgctgacuaggaatacacgaacatcttcctcüaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtctticeacaüagg gagatcagclttag t te itc ag taccttagagttccac LLgt tgacegagccae atgtctte gatctacaaagttcace atctaLaae aac atg ttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagttt cttaactggaattattagctgggglgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatatacc’aaggtatcccggtatgteaactggatt aaggaaaaaacaaagcteaciagc tccagcagcaaggeccctcceccgagcetgccc tocccaagcaggcigec tgggccctccga cacaccaatcctgocacagtgatgaaggtctggatccgcggccgc [SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 18).

Se describe, además, que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

MQRVNMlMAESPGLITÍCLU3YLL$ABCrVFLDHENANKlLMlPKRYNSGKLEEFVQG

NLEREC MEE KC S FE E A RE V FE NTE RTTE F WK Q YV DG DQCES N PC LNGG SC KDDINS Y

EC WC P FG FEG K NCR I VTC M K N GR CEQFCK N S A DN K V VCSCTEG Y R L A EN Q KSCE

pavpfpcgrvsvsqtskltraetvfpdvdyvnsteaetildnitqstqsfndftrvvg GEDAKPGQFPW QVVLNGKVDAFCGGSIVNEKW IVTAAHCVETGVKnVVAGEHNIE

ETEHTEOKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTMF

LKPGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFnYNNMFCAGFHB GORDSCQGDSGG Pl IVT E V RG TSFLTGHSWGEECA M KGK YG IY TKVS R Y V N W 1KH K r

KLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ+* (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 13).

Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaa tgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagg gaaecttgagqgagaa tgtatggaagaaaqgtg tágttttgaagaagcacgagaagNtttgaaaac actgaaagaaca actg aattttg gaagcagratgttgatggagatc agig tgagtccaatcc atgtttaaatggcggcagttgcaaggatg acat taattcc taigaaigLtggi gtccctttg g atttgaa gga aaga actg ig aat tag atgtaacatg taacnttaagaütggctigatgcgagcagtmg tanaaatagtgct gataacaaggtggtttgí:n:ctgtat;tgagggütatt; gac itgcagiiaiiacc agaagtcctgtgaaccagc agtgccatttccatgtggíi agagutctgtttcacaaacttc tange tcacccg t ge tgagac tgttttt cctgatgtggacta tg taaallc tac tgaage tg aaaccatttt ggat aacaicactcaaagc aeccaa De atttaatgacttc actcgagttgttggtggaga agatgeeaa ace aggtcaattcccttggca gg 11 gt t ttg aa tggt ¡mgttgatgc atte tgtgg aggc tétate gttaatgaaa aatggaiigtüai: tgctgcc c ac tg tgttg aaactggt gttaaaa ttac agttgtcg cagg tg aac ataatattgagg agac agaacatacagagc aaaagcg aaatg tg attcgaattattcclcac CÜCaaCt acaatgC agctattaataagtac aactratgat-’attgcccttctggaajCtggacgaajCL’ettagtgctaaac aget acgttacat: ctatttgeattgc tacaaggaaiacacgaacatcitcc tcaaat t tggatc Lggciatg taagtggctg gggaagag teuccacaaaggg agatcagcf ttagttcttc agtaccttag agttccacttgttgaccgagcc acatg tcttcgatctacaaag ttcaocatctataacaacatgt t c tgt gctggc tt c c atgaa ggaggta g agatt c atg te aaggaga t agtg gggg accccatg 11 ac tga agtggaaggg acca gtttc ttaactggaattattagclgg ggtgaagag tgt gcaalg aaaggc aaatatg g aatatataccaaggtatcccgg taigtcaactggatta aggaaaaaaeaaagctc áCtagctCCagCágC&ággccCCtCCCCCgagCCtgcCctC eccaagcaggctgec tgggccctccgac ae accaatectgccacagagcagctcctctaaagcc ce tcctcc afccctgccatccccc tcc cggctgcc tggccc c tctgaeacccc tatoctgcctcagtgatgaaggrctggatccgcggccgc (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 20}.

Se describe, además, que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

MQRVNMIMAESFGLITlCLLGYLLSAEiCTVFLDHENAJ'IKíLJNRPKRYNSGKLEEF'VQG

NLERECMBEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDODQCESNPCLNGGSCKDDINSY

EC WCPFGFEGKKCELD VTCN [KNGRCEQFCKN5ADNK V VCSCTEOYRLAENQKSCE

P A V PFPCOR VS VSQTS KLTR AETVFPD V D V VNSTE ABT1LDNITQSTQSFNDFTRV VG

GEDAKJPGQFPWQVYLNGKVDAPCGGSlVKEKWrVTAABCVETGVKrrvVAGEHNIE HTEm^KRNVIBIIPHHNYNAAENKYNHDlALLELDEPLVLNSYVTPIClADKEYTNIP LKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATtXRSTKFTIYMNMFCAGFHE GGRDSCQGDSCOPHVTÉVEGTSFLTGnSWGEECAMKGíCYGIYTKVSRYVNWiKEKT

K LTS SSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPí LPQSSSSK A PPPSLPSPS RLPGPS OTP1LPQ*+

(SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 21}.

En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-(CTP)3 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactc agtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtt tgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaa ctgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctat

ga argff ggfgtccctttggarrtgaaggaaagaac rgrgaattagatgt aac argtaacattaagaa rggca gatgcgagc agttttgtaa aaaiagigciga laacaagg iggiüge ice tgtactgagggatatcgacttgcag aaaacc ag aa gtc ctgtg aacc age ag tgccatt tccatglggaagagt t tctgtttc acaaacttc taagc icacccg tgclgaggcagll Ulcclga Lg tggac ta Ig taaaííct ac tgaagc t ga aaccattttgea taacatcactcaa agcacccaa rcatttaargac tt-cac rcgagtrg rrggrggagaaga tgccaaaccaggtcaar teccttggcaggttgttttgaatgg taaagttgatgcat le igrggaggelc tatcgttaalgaaaaatggattgtaactgE tgccc actgigt tgaaactgg rg tlaaaattacngttgtcgcaggtgnacataatniigagg agacagaacaraca gagcaaa ageg aaat grgattcgaat tattcc rcaccacaactaca arge ageta rraata agracaac ca tgacattgc ce t te t c ga actggacgaacccrtngtgctaa aca ger acgttaeacetatttgcattgc Lgacaagg aatatacgaac ate t tccicaaat t tggaiciggciatg laagiggc tggggaagagtttic cacaaaggg agatc agctttag ttcttcag race rragagttctacttgttgaocgagccacatgtetrcgarctac aaag ttcaocatctat Íiacaac atg ttC(gtgCtggCttCCa(gaaggagg tagagattea tgtc aa ggagatagtgggggaccceatgttae Lgaagtggaagg gaccaguicttaac tggaattatlagc LggggtgaagagLgigcaaigaaaggtaaaiatggaaiaLaiact aaggLatcecggtaLgLt aactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgg gcccagtgacacccctatcctgcc tcagLceagctceagt: aaggccccaccccctagcctgcc ttctecttcteg "ctgcc tggcccca gcg atac tceaattctgc'cccagtcc tceagcagtaaggctcccec tccatctctgccatcccccagcagactgccaggctcttc tgata cacccatcetcccacagtgatgaggatccgcggccgc (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 30).

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)3 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

MQfWNMIMAESPGLmCLLGYLLSAECTWLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQG

NLERECMEBKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESKPCLNGOSCKDDINSY

ECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCrBGYRLAENQKSCE p a v pfpc g r v sv sq t sk l t r a e a v fpd v d y v n st e a e t il d n it q st q sfn d ft r v v g

G ED A KPGQFPWQV VLNC KVDAFCGGSIVN EK WIVTAA11C V CTG V K ITVVAG EH N IE

ETEH TEQ KR N VIR IIPM M NYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPIC IADKEYTNIF

LKFG SG YVSG W G RVFHKG RSAIVLQ YLRVPLVDRArCLRSTKFTIYNNM FCAG FHE GC R D SCQG DSGG Pl ] V TEV EGTSF LTC ] IS W G BECA M KG K YG IYTK V SR Y VN W IK E K T

KLTS S S S KAPPPSLPSPSR LPG PS DTPILPQS $55 K A PPPSLP3 P3 R LPU P$ DTPILPGSSSS

K A PPPSLPSPSRLPGPSL>TPILPQ** (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 31).

Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-(CTP)4 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactc agtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtt tgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaa ctgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctat gaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaa

aa afqgtgcrgataaca aggtggt ttgctcc tgtactgagggata rcgacttgcagqqa accaga agtccrgtgaacca gcag tgcca rr fccatg tggaag agtttc fgtttc acaaac ttc tange tcacecg tgctgaggcag tttttüctggtgtggactatgtaaattctac igaagcl gaaac cattttg g ata aea te actc aaa gcacceaatc a l Ltaalgac ttcacicgagt tg ttggtggagaagatgccaBaccaggtcaat tcccttggcaggttgttttgaa tgstaaasttgatgcattctgt ggaggctcta tcgtraa rgaaaantggarrgtaactgctgcccactgtgt IgáájCtgglgUááááUjCágüglCgCággtgááCáláatáUgággágaCágaáCaiáCagágCááajgCgáüacglgjUCgáát tattccrcaccacaactacaatgcagctarraataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagct acgtta caceta rrrgcattgcrgacaagg aat acacganc atcrrcctcaaatttgga tcrggctatgtaagrggc tggggaa gagtette cae aaa gggagatcagc tttagttc t te agtac ctta g agltec actig t tg aec gagee ac atgtcttc ga te t aca aagt te ace ate tat aacnacatg ttctg rgctggcttcc atgaagg aggtagagattcatgtcaag gagaragtgggg gacccc atgttac tg aagtg gaagg gaccagLUjcttaae tggaaHaüagc tggggtgaagaglgtgL’aatgaaaggC aaalatggaatatatacc aaggtatcccggtat gle aaciggaLLaaggaaaaüJiC aaageteac tagciccagc agea aggccc etc ceee g ag c c tgc ce te cee aa g c agg c tgtctgg gccctctgacacccctatcctg ce fcagtocagctcctctaaggccccaccaccttcoctgcctagoccttc aagactgccaggccc tag c gatac acca attctgcc c c agtc c tccagcsgc aagg c tcccccac cta gc ctgc cttctcc ate aaggc tgee tgg c ce atcc gata ccccaatmgcc tcagagcagctctagc üaggcacctcecctcagtctgct cictccaagc agaciccc tggcccttcagacactecc attctgccacagtgatgaggatccgcggocgc [SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 32).

Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)4 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SRVDPAMQRVNMIMAESPGUTTCUjGYLLSAECTVFLDHENANKJLNRFKRYNSGKL

EHFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCUíGOSC

KDDIN S Y ECWCPFGFEGKNCELDVTCNI KN G RC EQFC KN S A DN K V VCSCTEG Y R L A

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DFTRW GG E D AKPGQFPWQWLNG KVDAFCGG SIV NEKWTVTAA HCVETGVKTTW

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WIK E KTK LTSSS5 K A PPPS LPSPSR LPÜ PS DTPÍLPQSSSSK A PPPS LPSPSR LPÜ P S DTP ÍL

PQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSrnPILPQ**GSA A (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 33).

Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-(CTP)5 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

ctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactca gtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagttt gttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaac tgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatg

aa rgrrggrgtccctttggarttg aaggaaagaac t grgaa iragatg raaca rgraacattaagaa tggcagatgcgagca grrrtgta aa aaiagtgc tgalaaeaagglggl Ltgc tcelgtac igagggalalcgac tlgcag a aaac mg aag tce tglg a acc age ag tgccat 11 ccatgtggaagagt t tctgtttcacaaacttc taagc tcacccg tgctgaggcagütllcclgalg tggacta tgt aaa ttctactgaagctg aa acc attttggattáta tcac rcaaagc acccaa tcatttaatgac ttcac tcgagttgttggrggagaagatgccaaacc aggtcaattc cc r rggc aggttg t ttígflfltggta aa g (tg atgc ati c tglgg aggc teta leg l ra a rga aaa atggaífgtaac rgcigccc ac t gtgl tg aa actgg tg rraaaattaca gttgtcgcagg rg aac atna ra rrgagg agacaga acaraca gagc aaa agcgaaa rgt gattcg aatta ttec tcaccacaac tacaa rgcagctana ataagracaaccatga cattgccc rrcrggaa ctgg acga acccf f agtgcraaacagcta cg L tacaccta ittgcallgc tg acaaggaalac acgaacatcticcieaaalUggaLciggc latgiaagiggctgggg aagaglc ^llccacaaa gggag atcagctttagttc trcagtaccttag agttccacttgttgaccgagccneatgtcttcgatct acaaagttcaccatcta ta ae aaeaigttetg tgctggc t tecaTgaaggaggtegagattcatgtraaggagat jigtgggggaceccaLguaetgaagtggjiaggg aceagt t te uaac tggaal tauage iggggigaagag tgigcaaigaaaggcaaat alggaal atataccaagg laieccggtatg tea acrggattaaggaa aa aaca aagctcactagetcca gcagcaa ggcccctoccccgagcctgccc rccccaagcaggctgcctggg cectctgacaecceiatcc tgccte agtecage rcctctaaggctccaceace ucee Lgcctagcecttcaagae tgccaggecctagc gatacaccaattctgccccagtcetccagcagcaaggctcccccaoctagoctgccttctccatcaaggctgectggcccatccgatac cccaattttgcctcagagcagctctagcaa ggcacctcccccca gtctgccctc tccaa gcagactocctggccettcagacactcca at ce tcccaeagtccte lago te taaageteeace iceeagectgcecagcce tagtagaetcecc ggaccttetgaiacecceatcttgec ccagtgatgaggatccgcggccgc (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 34).

Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)5 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

R V CPA.MQR VN M1M AESPGLTTICLLGY LLSAECTV h'LDH EN AN Kl I .N KPKRYNSGKI.

EEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVPENTERTTEFWKQYVDGDQCBSNPCLNGGSC

K DDIN5 Y ECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRC FQFC KNSADNKV VCSCTEG Y R LA

ENQKSCEPAV PFPCGRVS VSQTS KLTRAEA VFPD VD Y VNSTEAETILDNrrQSTQ&FN DFTRV VGGEDA K PG QFPWQV V LNG K V D AFCGGS l V N E K W IV T A A IICV ETC, V KITV'V

AGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIAD

KEYTNIKLKhGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMF CAO Fl IEGGR DSCQG DSGG Pl IVTEVEGTS FLTGIIS WG E EC AM KG K YGIYTK V S R Y V N

WIKE KTKLTSSSS K A PPPS LPSPSR LPG P S DT PILPQSS S S K A P P P S LPSPSR LPGPS DTP IL

PQSSSSKAPPPSLPSFSRLPGPSDTP1LPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSK

A PPPS LPSPSR LPG PS DTP ILPQ* *G S A A (SEC. CON NÚM. DE IDENT.: 35).

En otra modalidad, puede añadirse furina a una célula que expresa el factor de coagulación-CTP de la invención. Se describe que la furina aumenta la eficiencia de la producción de un factor de coagulación-CTP de la invención en una célula. En otra modalidad, la furina se cotransfecta con el vector que comprende la secuencia codificante del factor de coagulación-CTP de la invención. En otra modalidad, la furina está codificada por un vector separado. En otra modalidad, la furina y un factor de coagulación-CTP están codificados por un vector. En otra modalidad, la secuencia codificante de furina se inserta en pCI-DHFR. En otra modalidad, la secuencia codificante de furina se modifica genéticamente en pCI-dhfr/smaI+NotI, Furina/AsisI F.I.+NotI.

La secuencia de ácido nucleico que codifica la furina comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:

tctagagtcgaccccgecqtgg agctgaggccctggttgctatggg tggtagcageaaca ggaaccttgg tcctgc tagc agctga tg ctcagggccagaaggtcttcaccaacacgtgggctgtgc^ratccctggaggcccíigcggtggccaacagtgtggcacggaagcat gggttcctca acctgggceagatctfcgggg actattaccacttctggca tcgaggagtgac gaa gcggtccctgtc gcc tcaccgcoc gcggcac^gccggctgcagagggagcctcaagtacagtggctgg^ac^caggtggcaaagcgacggactaaacgggacgtgta ccaggagcccacagaccecaag ¹¹tcctcagcag tg gtacctg tctgg tg tcac tcagcg ggacctgaatgtga aggcggcctgg ge ecagggctacacagggcacggcattgtggtctccaüctpgacgatg¡gcatcgagaagarircarr~j:0'gacttgg&affgcaattatgaf c ctggg gcc agttttg atg te aatg acc aggac cctg accc ccagcc t cggtac acac ag atgaatgac aac aggc acggc ac acgg tgtgcg gggga agtggctgcggtggcca acaacggtg tctgtggtgtag gtgtggcctac aacgcccgcattggagggg tg cgcatg ctygatggcpaggtfiacagatgeagtggappcaicgetcgctgggcctgaaccccaaccacatocaicatctaicagtgiccagctggyg coccgaggatg acggcaagacag tg gatgggccagcccgcc tcgccgaggaggocttcttccg tggggttag ccagggocgag g g g ggetgg gotee ate» tg tctgggcctc ggg g aacgg gggc e ggg aac atg acagctgcaactgeg acggctaca ce aacagt a tetacacgctgtecatEagcagcgecjicgcagtttggcaaegtgccgtggtacagcgaggcetgctcgtccaeactggccacgaccta cagcagtggea acca gaa tgaga age agatcg tgacgactgacttgcggcagaagtgcac ggagtctcac acgggcaoctca geet ctpcccocttagcagocggcatcatlpctctcaccctggagpccaataagaacctcacatgpcggpacatpcaacacctggtggtaca gacctcgaagccagecc acc tcaatgeca acgactgggccacca atggtgtgggccggaaag tgagccactcatatggctacgggc ttttggacgcaggcgccatggtggccctggcocagaattggaccacagtggccoeccagcggaagtgcatcatcgacatcctcaccg agcccaaagac ateg gga a acggc teg aggtgcgg aagaccg tgaccgcgtgc ctgggc gagcccaaccac atcacte ggc t gg agcacgctcaggcgcggctcaccctgtcctataatcgecgtggcgacctggccarccacctggtcagocccatgggcacccgcrcca c cc tgctggc agee aggccac atgac tac tcc ge aga tg g gt 11 aatgacfgggccttc atgac a ac te atte ctgggatgaggatc cc t ctggcgagtgggtcc tagaga ttgaa aaca cc agega agccaacaactatggg acgctgaccaagttcaccctc gtac tctatggcac cgí.vcclgaggggctgcccgtacctíX’agaaagí.’agtggi.’tgcaagaí.’cctfacgti.’cagtcüggfctgtgtggtgtgcgaggaag gette tccctgeac cag aagag ctgtgtccagc ac tgccc tceaggcttcgceccccaagtcctcgatacgcac tfilagcaccg agaat gacgtggagaccatccg£gttagcgtctEC£ccccctgCíacgcctcat£teccacatgccpg£££cc£gccctgacagactgcct cagetgccccagccacgectccuggacectgtggagcagacttgetcccggcaaagccagageagcegügagtccccgceacag cagcagccacctcggctgcccccggagg tg gaggcggggcaacggctgcgggcagggctgctgccc tcacacctg cctgaggtg gtggccggcctcagótgcgccttcatcgtgctggtcttcgtcactgtcttcctgglcctgcagctgcgctcíggctttagttttcggggggt gaaggtgtacaccatggaccgtggcctcatctcctacaaggggctgccccctgaagcctggcaggaggagtgcccgtctgactcaga

agaggacgagggccggggí.-gagaggafcgcetttatcaaagaccagagcgccctctgaacgcggccgc (SEC. COM NÚM. DEIDENT.: 22}.

La secuencia de aminoácidos de furina comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

MLLR PW LLW V V A ATGTLV LLAAD AQGQ K V F I'NTW A V RIPGG PAVAN S VARKHGFL

N i .GQ IKJDYYh FW h r G VTK r.S i .S i ’H r pr h $ r lQr EPQ VQ W i .l QQv a k r RT k r D V y

QEPTDPKFPQQW Y LSG VTQRDLN V K A A WAQG YTGHGIV VSILDDG1E K N HPDLAGN

ydpgasfdvndqdpdpqprytqmndnrhgtrcagevaavanngvcgvgvaynar

IGGVRMLDGEVITJAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRG

VSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDG YTNSIYTLSIS 5 ATQFGNVPW YSEACS

STLATT YSSG N QN E KQIVTT D LR Q KCTESHTGTS A S A PL A AG11A LTLE AN KN LTWR D

MQH LWQTTSKPAHLNAWD W ATOGVGRKVSHS YGYGLLD AGAMV ALAQNWTTV A

PORKCHDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIH

L VSPMCTRSTLL A A R P H D YS A DC FN D W A F M TTH S W D E D PSG E W VLEIEN TS E A NN Y

GTLTKETL V LYGTAPEGLP VPPESSGCKTLTSSQAC V VCEEGFSLI IQKSCVQl ICPPGE

APQVLDTHYSTEND VETIR AS VCAPCHASC ATOQGPALTDCLSCPSHASLDP VEQTCS

RQSQS S RESPPQQQPP RLPPEVEAG QRLRAGLLPS HLP E V VAGLS CAFTVLVFVTV FLV

LQLRSGFSFRGVKV YTMDRGUS Y KGLPPE A WQEEC PS DS EE D EG RGERTA El K D QS A L* (SEC. CON NÚM. DEIDENT.: 23).

En una modalidad de la descripción, el término factor de coagulación incluye además un homólogo del conocido factor de coagulación que tiene actividad coagulante. En algunas modalidades, la homología de acuerdo con la presente descripción abarca, además, variantes de deleción, inserción o sustitución, que incluye una sustitución de aminoácidos, de estos y fragmentos polipeptídicos biológicamente activos de estos. En una modalidad, la variante comprende sustituciones conservadoras, o deleciones, inserciones o sustituciones que no alteran significativamente la estructura tridimensional del factor de coagulación.

En otra modalidad, los homólogos, por ejemplo, son polipéptidos que son al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 87 %, al menos 89 %, al menos 91 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % homólogos según se determina mediante el uso del programa informático BlastP del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) mediante el uso de parámetros predeterminados.

En otra modalidad, en la presente se describe un polipéptido que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal del factor de coagulación.

Debe entenderse que las composiciones para su uso de acuerdo con la presente invención que comprenden los elementos o etapas como se describen en la presente pueden consistir en esos elementos o etapas, o consisten en esos elementos o etapas. En algunas modalidades, el término "comprender" se refiere a la inclusión del agente activo indicado, tal como el factor de coagulación modificado con CTP, así como a la inclusión de otros agentes activos, y portadores, excipientes, emolientes, estabilizadores farmacéuticamente aceptables, etcétera, como se conocen en la industria farmacéutica. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a una composición, cuyo único ingrediente activo es el ingrediente activo indicado, sin embargo, pueden incluirse otros compuestos que son para estabilizar, preservar, etcétera, la formulación, pero no están implicados directamente en el efecto terapéutico del ingrediente activo indicado. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente en" puede referirse a componentes que facilitan la liberación del ingrediente activo. En algunas modalidades, el término "que consiste" se refiere a una composición, que contiene el ingrediente activo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables.

que consiste en un factor de coagulación que tiene tres CTP en su carboxilo terminal como se describe en la presente y no tiene CTP en su amino terminal.

En una modalidad, la presente invención utiliza un factor de coagulación recombinante como se describió anteriormente. En una modalidad, la presente invención utiliza un factor de coagulación modificado genéticamente como se describió anteriormente. En una modalidad, el factor de coagulación modificado genéticamente como se describió anteriormente se refiere como un factor de coagulación modificado con CTP.

En una modalidad, los CTP que se unen al carboxilo terminal del factor de coagulación se unen en tándem al carboxilo terminal.

En una modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente como se describe en la presente tiene una actividad biológica equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente como se describe en la presente tiene medidas farmacológicas equivalentes o mejoradas en comparación con el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente como se describe en la presente tiene una farmacocinética equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente como se describe en la presente tiene una farmacodinámica equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación sin modificación con CTP. En una modalidad, el sujeto a tratar es un sujeto hemofílico. En una realización, la hemofilia es la hemofilia B. En una realización, la hemofilia B se conoce como deficiencia de factor IX o enfermedad de Christmas. En una modalidad, la hemofilia es hemofilia grave, que, en una modalidad, describe la hemofilia en la cual los niveles del factor de coagulación son 0-1 %. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia moderada, que, en una modalidad, describe la hemofilia en la cual los niveles del factor de coagulación son 1-5 %. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia ligera, que, en una modalidad, describe la hemofilia en la cual los niveles del factor de coagulación son 5 50 %.

En otras modalidades, el factor de coagulación modificado genéticamente puede reducir la cantidad de infusiones necesarias para un paciente, reducir las dosis necesarias para un paciente, o una combinación de estas.

En una modalidad, el factor de coagulación IX que comprende 3 CTP en tándem en su carboxilo terminal muestra un mejor perfil PK a la vez que mantiene su actividad de coagulación frente a la cosecha de FIX-CTP-CTP, la cosecha de FIX-CTP o rhFIX. En una modalidad, el tiempo de vida media de eliminación de rFIX-CTP3 es de 2,5 a 4 veces mayor que para rFIX en ratas y en ratones deficientes de FIX. En la presente se describe que la administración de rFIX-CTP3 prolongó significativamente el efecto de procoagulación en ratones deficientes de FIX durante al menos 76 horas después de la dosificación. En la presente se describe además que la administración de rFIX-CTP3 produjo un mayor pico de actividad que rFIX en ratones deficientes de FIX. Se describe, además, que el factor de coagulación IX que comprende 2 CTP en tándem en su carboxilo terminal muestra un mejor perfil PK a la vez que mantiene su actividad de coagulación frente a la cosecha de FIX-CTP o rhFIX y que el factor de coagulación IX que comprende 2 CTP en tándem en su carboxilo terminal muestra un aumento de 3 veces en el tiempo de vida media y un AUC 4,5 veces mayor en comparación con rhFIX.

En otra modalidad de la invención, la administración subcutánea (SC) da como resultado una mayor biodisponibilidad del FVII modificado con CTP en comparación con el FVII recombinante. Se describe que el tiempo de vida media es más prolongado y la biodisponibilidad (AUC SC/AUC IV) es mayor después de la administración SC de FVIIa-CTP3 y 5 en comparación con la administración SC de NovoSeven®. Se describe que MOD-5014 y MOD-5019 inyectados por vía subcutánea muestran una mejor supervivencia de los ratones en comparación con el FVII recombinante (NovoSeven®) (véase el Ejemplo 8 más adelante).

En otra modalidad, los términos "péptido CTP", "péptido del carboxilo terminal" y "secuencia de CTP" se usan indistintamente en la presente. En otra modalidad, el péptido del carboxilo terminal es un CTP de longitud completa. En otra modalidad, un péptido señal puede unirse al amino terminal del CTP, como se describe en el documento US 7,553,940.

En otras modalidades, el término factor de coagulación modificado genéticamente se refiere a la secuencia de aminoácidos de un factor de coagulación maduro. En otras modalidades, el término factor de coagulación modificado genéticamente se refiere a la secuencia de aminoácidos del factor de coagulación que incluye su secuencia señal o péptido señal.

En otra modalidad, "secuencia señal" y "péptido señal" se usan indistintamente en la presente. En otra modalidad, "secuencia" cuando hace referencia a una molécula polinucleotídica puede referirse a una parte codificante.

Se describe en la presente que un factor de coagulación modificado genéticamente que comprende al menos un CTP como se describe en la presente tiene una mayor actividad biológica in vivo en comparación con el mismo factor de coagulación sin al menos un CTP. En una modalidad, la actividad biológica mejorada se deriva del tiempo de vida media más prolongado del factor de coagulación modificado genéticamente a la vez que mantiene al menos alguna actividad biológica. En otra modalidad, la actividad biológica mejorada se deriva de la actividad biológica mejorada que resulta de la modificación con CTP. En otra modalidad, la actividad biológica mejorada se deriva tanto de un tiempo de vida media más prolongado como de una mejor funcionalidad del factor de coagulación modificado con CTP.

Como se describe en la presente, al menos una secuencia CTP en el extremo carboxilo terminal del factor de coagulación proporciona mayor protección contra la degradación de un factor de coagulación, proporciona mayor protección contra el aclaramiento, proporciona un tiempo de aclaramiento prolongado, aumenta su Cmáx, aumenta su Tmáx, y/o prolonga su T1.

En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de esta invención se usa de la misma manera que un factor de coagulación conjugado no modificado. En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de esta invención tiene un mayor tiempo de vida media en circulación y tiempo de residencia en el plasma, menor aclaramiento, y una actividad clínica in vivo aumentada. En otra modalidad, debido a las propiedades mejoradas del factor de coagulación conjugado como se describe en la presente, este conjugado se administra menos frecuentemente que la forma no modificada del mismo factor de coagulación.

En otra modalidad, una disminución en la frecuencia de administración dará como resultado una mejor estrategia de tratamiento, que, en una modalidad, conducirá a una mayor satisfacción del paciente lo que conduce a mejores resultados del tratamiento, así como una mejor calidad de vida del paciente. En otra modalidad, en comparación con los conjugados convencionales de factores de coagulación, se ha encontrado que los conjugados que tienen el peso molecular y la estructura de enlazador de los conjugados de esta invención tienen una mejor potencia, mejor estabilidad, elevados niveles de AUC, y mayor tiempo de vida media en circulación.

En una modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo a la invención está en la forma de una composición farmacéutica que comprende un portados farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una cantidad con eficacia terapéutica del factor de coagulación conjugado. En una modalidad, una cantidad con eficacia terapéutica de un factor de coagulación conjugado se determina de acuerdo con factores como la afección específica que se trata, la afección del paciente que se trata, así como los otros ingredientes en la composición.

En una modalidad, un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención tiene usos terapéuticos. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención tiene usos profilácticos.

En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado para su uso de acuerdo a la invención es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de hemorragia excesiva o hematomas o que tienen un prolongado tiempo de protrombina (PT) o tiempo de tromboplastina parcial (PTT). En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado para su uso de acuerdo a la invención es útil en el tratamiento de sujetos que tienen una afección adquirida que provoca hemorragias, como la deficiencia de vitamina K o enfermedad hepática. En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado para su uso de acuerdo a la invención es útil en el tratamiento de sujetos que tienen deficiencias en factores de coagulación que se adquieren (debido a otras enfermedades) o se heredan, ligeras o graves, permanentes o temporales. En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado para su uso de acuerdo a la invención es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de hemofilia A. En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado para su uso de acuerdo a la invención es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de hemofilia B. En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado para su uso de acuerdo a la invención es útil en el tratamiento de sujetos que tienen deficiencias adquiridas debido a enfermedades crónicas, como una enfermedad hepática o cáncer; a una afección aguda como la coagulación intravascular diseminada (DIC), que utiliza factores de coagulación a una velocidad rápida; o a una deficiencia de la vitamina K o un tratamiento con un antagonista de la vitamina K como la warfarina (la producción de los factores II, VII, IX y X requiere de vitamina K). En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado para su uso de acuerdo a la invención es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de una enfermedad que provoca desequilibrios en la coagulación tales como pero sin limitarse a: una enfermedad hepática, uremia, un cáncer, un trastorno de la médula ósea, una exposición al veneno de serpiente, una deficiencia de vitamina K, una terapia anticoagulante, una ingestión accidental del anticoagulante warfarina, múltiples transfusiones de sangre (las unidades almacenadas de sangre pierden algunos de sus factores de coagulación), o una combinación de estos.

En una modalidad, las composiciones para su uso de acuerdo a la presente invención proporcionan tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemorragia, que, en una modalidad, es una hemorragia incontrolable y, en otra modalidad, hemorragia intracerebral. En otra modalidad, las composiciones para su uso de acuerdo a la presente invención proporcionan tratamiento terapéutico o profiláctico de coagulopatías neonatales; enfermedad hepática grave; procedimientos quirúrgicos de alto riesgo; pérdida de sangre por trauma; trasplante de médula ósea; trombocitopenias y trastornos de la función plaquetaria; reversión urgente de la anticoagulación oral; deficiencias congénitas de los factores V, VII, X, y XI; enfermedad de von Willebrand, en una modalidad, enfermedad de von Willebrand con inhibidores del factor de von Willebrand.

En una modalidad, el sujeto es un ser humano. En otra modalidad, el sujeto es un animal domesticado. En otra modalidad, el sujeto es un mamífero. En otra modalidad, el sujeto es un animal de granja. En otra modalidad, el sujeto es un mono. En otra modalidad, el sujeto es un caballo. En otra modalidad, el sujeto es una vaca. En otra modalidad, el sujeto es un ratón. En otra modalidad, el sujeto es una rata. En otra modalidad, el sujeto es un canino. En otra modalidad el sujeto es un felino. En otra modalidad, el sujeto es bovino, ovino, porcino, equino, murino o cervino. En una modalidad, el sujeto es macho. En otra modalidad el sujeto es hembra. En una modalidad, el sujeto es un niño, en otra modalidad, un adolescente, en otra modalidad, un adulto o, en otra modalidad, un sujeto anciano. En otra modalidad, el sujeto es un sujeto pediátrico, en otra modalidad, un sujeto geriátrico.

Un [(CTP)n>1-factor de coagulación] como se describe en la presente puede comprender un factor de coagulación de longitud completa o un fragmento activo de este conectado por medio de un enlace peptídico en su carboxilo terminal a al menos una unidad de CTP, sin CTP en su amino terminal. Un [(CTP)n>1-factor de coagulación] como se describe en la presente puede comprender, además, un factor de coagulación o un fragmento activo de este conectado por medio de un enlace peptídico a al menos una unidad de CTP que se conecta a una unidad de CTP adicional por medio de un enlace peptídico sin CTP en su amino terminal. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico codifica un factor de coagulación modificado genéticamente que comprende al menos un CTP unido a su extremo C-terminal y sin CTP en su amino terminal.

En otra modalidad, el CTP se une al factor de coagulación por medio de un enlazador. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia CTP al factor de coagulación es un enlace covalente. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia CTP al factor de coagulación es un enlace peptídico. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia CTP al factor de coagulación es un enlace peptídico sustituido. En otra modalidad, la secuencia CTP comprende: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPiL (sec. con núm. de ident.: 1). En otra modalidad, la secuencia CTP comprende: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (sec. con núm. de ident.: 2). En otra modalidad, la secuencia CTP comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias expuestas en la sec. con núm. de ident.: 1 y la sec. con núm. de ident.: 2.

En otra modalidad, el péptido del carboxilo terminal (CTP) de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido 112 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se expone en la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la secuencia CTP de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido 118 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se expone en la sec. con núm. de ident.: 2. En otra modalidad, la secuencia CTP además comienza a partir de cualquier posición entre las posiciones 112-118 y termina en la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana. En algunas modalidades, la secuencia del péptido CTP es de 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 aminoácidos de longitud y comienza en la posición 112, 113, 114, 115, 116, 117 o 118 de la secuencia de aminoácidos del CTP.

En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 1-5 sustituciones de aminoácidos conservadoras como se describe en la patente de EE.UU. núm. 5,712,122. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 1 sustitución de aminoácidos conservadora. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 2 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 3 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 4 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 5 sustituciones de aminoácidos conservadoras.

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 70 %, o al menos 80 %, o al menos 90 %, o al menos 95 %, o al menos 98 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de este.

En otra modalidad, el polinucleótido que codifica al péptido CTP de la presente invención es al menos 70 %, o al menos 80 %, o al menos 90 %, o al menos 95 %, o al menos 98 % homólogo a la secuencia de ADN del CTP nativo o un fragmento codificante del péptido de esta.

En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica puede estar truncada. En otra modalidad, 2 de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están truncadas. En otra modalidad, las 3 secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están truncadas. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 10 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3. La sec. con núm. de ident.: 3 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLP. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 10 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4. La sec. con núm. de ident.: 4 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.

En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 11 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o los primeros 12 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 8 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o la sec. con núm. de ident.: 3. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 13 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o los primeros 14 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 6 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o la sec. con núm. de ident.: 3. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 5 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o la sec. con núm. de ident.: 3.

En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica está glicosilada. En otra modalidad, 2 de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están glicosiladas. En otra modalidad, las 3 secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están glicosiladas.

En una modalidad, la secuencia CTP de la presente invención comprende al menos un sitio de glicosilación. En una modalidad, la secuencia CTP comprende 2 sitios de glicosilación. En una modalidad, la secuencia CTP comprende 3 sitios de glicosilación. En una modalidad, la secuencia CTP comprende 4 sitios de glicosilación. En una modalidad, una o más de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están completamente glicosiladas. En otra modalidad, una o más de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están parcialmente glicosiladas. En una modalidad, parcialmente glicosilado indica que uno de los sitios de glicosilación del CTP está glicosilado. En otra modalidad, dos de los sitios de glicosilación del CTP están glicosilados. En otra modalidad, tres de los sitios de glicosilación del CTP están glicosilados.

En algunas modalidades, la modificación de la secuencia del CTP es ventajosa porque permite el uso de menores dosificaciones. En algunas modalidades, la modificación de las secuencias del CTP es ventajosa porque permite menos dosificaciones. En algunas modalidades, la modificación de las secuencias del CTP es ventajosa porque permite un efecto seguro, de acción prolongada.

En algunas modalidades, "polipéptido", "factor de coagulación modificado genéticamente" o "proteína" como se usan en la presente, abarca polipéptidos nativos (productos de degradación, polipéptidos sintetizados sintéticamente o polipéptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, polipéptidos sintetizados sintéticamente), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de polipéptidos, que tienen, en algunas modalidades, modificaciones que hacen que los polipéptidos que comprenden un factor de coagulación sean incluso más estables mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar a las células.

Como se usa en la presente, los términos "aminoácido" o "secuencia de aminoácidos" se entiende que incluyen los 20 aminoácidos de origen natural; los aminoácidos frecuentemente modificados postraduccionalmente in vivo, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero sin limitarse a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. En una modalidad, "aminoácido" incluye D- y L-aminoácidos.

En algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención se utilizan en agentes terapéuticos que requieren que los polipéptidos que comprenden un factor de coagulación estén en una forma soluble. En algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención incluyen uno o más aminoácidos polares naturales o no naturales, que incluyen, pero sin limitarse a serina y treonina que son capaces de aumentar la solubilidad del polipéptido debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.

En algunas modalidades, los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención se sintetizan bioquímicamente tal como mediante el uso de técnicas estándar en fase sólida. En algunas modalidades, estos métodos bioquímicos incluyen síntesis exclusiva en fase sólida, síntesis parcial en fase sólida, condensación de fragmentos, o síntesis clásica en solución.

En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para generar los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención. En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para la generación de polipéptidos relativamente largos (por ejemplo, más largos que 18-25 aminoácidos). En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para la generación de grandes cantidades de los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención. En algunas modalidades, las técnicas recombinantes se describen por Bitter y otros, (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier y otros (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson y otros (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu y otros (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi y otros (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli y otros, (1984) Science 224:838-843, Gurley y otros (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp 421-463.

La presente solicitud describe un método para producir un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP, que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para producir así un polipéptido del FIX modificado con CTP. La presente solicitud describe un método para producir un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP, que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa, para producir así un polipéptido del FVIIa modificado con CTP.

En otra modalidad, los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención pueden sintetizarse mediante el uso de una molécula polinucleotídica que codifica al polipéptido. En algunas modalidades, la molécula polinucleotídica que codifica a los factores de coagulación modificados genéticamente se liga a un vector de expresión, que comprende un control de la transcripción de una secuencia reguladora en cis (por ejemplo, secuencia promotora). En algunas modalidades, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión constitutiva de un factor de coagulación modificado genéticamente, o para dirigir la expresión inducible de los factores de coagulación modificados genéticamente.

En una modalidad, después de la expresión y la secreción, los péptidos señal se escinden de los factores de coagulación modificados genéticamente precursores lo que resulta en los factores de coagulación modificados genéticamente maduros.

En algunas modalidades, los polinucleótidos pueden prepararse mediante el uso de técnicas de PCR, o cualquier otro método o procedimiento conocido por un experto en la técnica. En algunas modalidades, el procedimiento implica la ligadura de dos secuencias de ADN diferentes (véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel y otros, John Wiley & Sons, 1992).

En una modalidad, los polinucleótidos que codifican los factores de coagulación modificados genéticamente se insertan en los vectores de expresión (es decir, una construcción de ácido nucleico) para permitir la expresión del polipéptido recombinante. En una modalidad, el vector de expresión incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación y la integración en procariotas. En otra modalidad, el vector de expresión incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación y la integración en eucariotas. En una modalidad, el vector de expresión incluye un vector lanzadera que hace que este vector sea adecuado para la replicación y la integración en procariotas y eucariotas. En algunas modalidades, los vectores de clonación comprenden secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (por ejemplo, señales de poliadenilación).

Puede usarse una variedad de células procariotas o eucariotas como sistemas de expresión en un huésped para expresar los factores de coagulación. Estas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o vector de expresión de ADN cósmido que contiene la secuencia codificante del polipéptido; levadura transformada con vectores de expresión recombinante en levaduras que contienen la secuencia codificante del polipéptido; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión recombinantes en virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes, como el plásmido Ti, que contiene la secuencia codificante del polipéptido.

En algunas modalidades, se usan sistemas de expresión no bacterianos (por ejemplo, sistemas de expresión en mamíferos, como las células CHO) para expresar los factores de coagulación de la presente invención. En una modalidad, el vector de expresión usado para expresar los polinucleótidos en células de mamífero es el vector pCI-DHFR que comprende un promotor de CMV y un gen de resistencia a la Noemicita. La construcción del vector pCI-dhfr se describe, de acuerdo con una modalidad, en el ejemplo 1.

En los sistemas bacterianos puede seleccionarse ventajosamente una serie de vectores de expresión en dependencia del uso previsto para el polipéptido expresado. En una modalidad, se desean grandes cantidades de polipéptido. Pueden ser convenientes los vectores que dirigen la expresión de altos niveles del producto proteico, posiblemente como una fusión con una secuencia señal hidrofóbica, que dirige el producto expresado hacia el periplasma de las bacterias o el medio de cultivo donde el producto proteico se purifica fácilmente. Ciertas proteínas de fusión se modifican genéticamente con un sitio de escisión específico para ayudar a recuperar el polipéptido. Los vectores que pueden adaptarse a dicha manipulación incluyen, pero no se limitan a, la serie pET de los vectores de expresión de E. coli [Studier y otros, Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].

En una modalidad, se usan sistemas de expresión en levaduras. Una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles puede usarse en levaduras como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. núm.: 5,932,447. También pueden usarse los vectores que promueven la integración de secuencias de ADN foráneo en el cromosoma de levadura.

El vector de expresión puede incluir, además, secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de numerosas proteínas a partir de un único ARNm tal como un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y secuencias para la integración genómica del promotor-polipéptido quimérico.

Los vectores de expresión adecuados para mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, que están disponibles de Invitrogen, pCI que está disponible de Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles de Strategene, pTRES que está disponible de Clontech, y sus derivados. En la presente invención se usan vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus de eucariotas tal como los retrovirus. Los vectores de SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. Se describe, además, que los vectores derivados del virus de papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein Bar incluyen pHEBO y p205. Otros vectores ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus, y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de metalotioneína, promotor del virus de tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de la polihedrina, u otros promotores que han demostrado su eficacia para la expresión en células eucariotas.

En algunas modalidades, los vectores virales recombinantes son útiles para la expresión in vivo de los factores de coagulación ya que ofrecen ventajas tales como la infección lateral y la especificidad dirigida. En una modalidad, los vectores virales se producen de manera que no son capaces de propagarse lateralmente; esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen específico solamente en un número localizado de células diana. Pueden usarse diversos métodos para introducir el vector de expresión a las células. Dichos métodos se describen generalmente en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang y otros, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega y otros, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa y otros [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véase las patentes de EE.UU. núms. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positiva-negativa.

Se apreciará que aparte de contener los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica al polipéptido), la construcción de expresión de la presente invención puede incluir, además, secuencias modificadas genéticamente para optimizar la estabilidad, la producción, la purificación, el rendimiento o la actividad del polipéptido expresado.

En algunas modalidades, las células transformadas se cultivan en condiciones eficaces, que permitan la expresión de grandes cantidades de factores de coagulación recombinantes modificados genéticamente. En algunas modalidades, las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero no se limitan a, medios eficaces, condiciones del biorreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. En una modalidad, un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el cual se cultiva una célula para producir el polipéptido recombinante de la presente invención. En algunas modalidades, un medio típicamente incluye una solución acuosa que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes adecuados, como las vitaminas. En algunas modalidades, las células pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. En algunas modalidades, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno adecuados para una célula recombinante. La determinación de las condiciones de cultivo está dentro de la experiencia de un experto en la técnica.

En dependencia del sistema de vector y huésped usado para la producción, los factores de coagulación modificados genéticamente resultantes de la presente invención lo mismo permanecen dentro de la célula recombinante, se secretan hacia el medio de fermentación, se secretan hacia un espacio entre dos membranas celulares, tal como el espacio periplasmático en E. coli; o son retenidos en la superficie externa de una membrana celular o viral.

En una modalidad, después de un tiempo predeterminado en cultivo, se lleva a cabo la recuperación del factor de coagulación recombinante modificado genéticamente. La frase "recuperar el factor de coagulación recombinante modificado genéticamente" que se usa en la presente puede referirse a recolectar todo el medio de fermentación que contiene el polipéptido y no necesariamente implica etapas adicionales de separación o purificación.

En una modalidad, los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención se purifican mediante el uso de una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía por interacciones hidrofóbicas, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.

En una modalidad, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada puede modificarse genéticamente para codificar el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención y un resto escindible fusionado. En una modalidad, una proteína de fusión puede diseñarse de manera que el polipéptido se pueda aislar fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, mediante inmovilización en una columna específica para el resto escindible. En una modalidad, un sitio de escisión se modifica genéticamente entre el factor de coagulación modificado genéticamente y el resto escindible y el polipéptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante el tratamiento con una enzima o agente adecuados que escindan específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, véase Booth y otros, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella y otros, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].

En una modalidad, el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención se recupera en una forma "sustancialmente pura". En una modalidad, la frase "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína en las aplicaciones descritas en la presente.

En una modalidad, el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención puede sintetizarse, además, mediante el uso de sistemas de expresión in vitro. En una modalidad, los métodos de síntesis in vitro se conocen bien en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente.

En algunas modalidades, los factores de coagulación recombinantes modificados genéticamente se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica puede analizarse in vivo o in vitro. En una modalidad, las actividades de unión de los factores de coagulación recombinantes modificados genéticamente pueden determinarse mediante el uso de diversos ensayos como conoce el experto en la técnica.

En la presente se describe que el factor de coagulación modificado genéticamente puede proporcionarse al individuo per se. En una modalidad, el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención puede proporcionarse al individuo como parte de una composición farmacéutica donde se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente con otros componentes químicos como los portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

En otra modalidad, "ingrediente activo" se refiere a la secuencia polipeptídica de interés, que es responsable del efecto biológico.

La descripción proporciona preparaciones combinadas donde "una preparación combinada" define especialmente un "estuche de partes" en el sentido de que las parejas de combinación como se definió anteriormente pueden dosificarse independientemente o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades características de las parejas de combinación, es decir, de manera simultánea, concurrente, separada o secuencial. Las partes del estuche de partes pueden administrarse después, por ejemplo, simultánea o cronológicamente escalonadas, o sea, en puntos de tiempo diferentes y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del estuche de partes. La relación de las cantidades totales de las parejas de combinación puede administrarse en la preparación combinada. La preparación combinada puede variarse, por ejemplo, para hacer frente a las necesidades de una subpoblación de pacientes que se va a tratar o a las necesidades del paciente individual en el cual las diferentes necesidades pueden deberse a una enfermedad en particular, a la severidad de una enfermedad, la edad, el sexo, o el peso corporal como puede realizar fácilmente un experto en la técnica.

En otra modalidad, las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" que se usan indistintamente se refieren a un portador o un diluyente que no provoca una irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado. En estas frases se incluye un adyuvante. En una modalidad, uno de los ingredientes incluidos en el portador farmacéuticamente aceptable puede ser por ejemplo polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con un amplio intervalo de solubilidad tanto en medios orgánicos como acuosos (Mutter y otros (1979)).

En otra modalidad, "excipiente" se refiere a una sustancia inerte que se añade a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. En una modalidad, los excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados celulósicos, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas para la formulación y la administración de fármacos se encuentran en "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Esta invención contempla varias modalidades de los intervalos de dosificación. La dosificación del factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención, en una modalidad, está en el intervalo de 0,005 100 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,005-5 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,01-50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,1-20 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,1-10 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,01-5 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,001-0,01 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,001-0,1 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,1-5 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,5-50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,2-15 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,8-65 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 1-50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 5-10 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 8-15 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 10-20 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 20-40 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 60-120 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 12-40 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 40-60 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 50-100 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 1-60 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 15-25 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 5-10 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 55-65 mg/día.

En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 50-500 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 50-150 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 100-200 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 150-250 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 200-300 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 250-400 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 300-500 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 350-500 mg/día.

En una modalidad, la dosificación es 20 mg/día. En una modalidad, la dosificación es 30 mg/día. En una modalidad, la dosificación es 40 mg/día. En una modalidad, la dosificación es 50 mg/día. En una modalidad, la dosificación es 0,01 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 0,1 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 1 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 0,530 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 0,05 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 10 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 20 70 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 5 mg/día.

En una modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es 1-5 mg/día. En una modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es 1-3 mg/día. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es 2 mg/día.

En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/2 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/3 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/4 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/5 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/6 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/semana. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/9 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/11 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/14 días.

En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación es 10-50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/2 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/3 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/4 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 microgramos mg/5 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/6 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/semana. En otra modalidad, la dosificación es 10 50 mg/9 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/11 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/14 días.

En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se formula en una forma de dosificación intranasal. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se formula en una forma de dosificación inyectable. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,0001 mg a 0,6 mg. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,001 mg a 0,005 mg. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,005 mg a 0,01 mg. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,01 mg a 0,3 mg. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,2 mg a 0,6 mg. En otra modalidad, el factor de coagulación está libre de CTP en su amino terminal.

Se describe que un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 1-100 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 10-80 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 20-60 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 10-50 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 40-80 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 10-30 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 30-60 microgramos.

En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,2 mg a 2 mg, o en una dosis en el intervalo de 2 mg a 6 mg, o en una dosis en el intervalo de 4 mg a 10 mg, o en una dosis en el intervalo de 5 mg y 15 mg.

En una modalidad, la dosificación del FIX modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de FIX administrado en la dosificación recomendada del FIX recombinante (por ejemplo, Benefix®, Wyeth o Mononine®, CSL Behring) a los pacientes durante el mismo periodo de tiempo. En otra modalidad, la dosificación del FVIIa modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de FVIIa administrado en la dosificación recomendada del FVIIa recombinante (por ejemplo, NovoSeven®) a los pacientes durante el mismo periodo de tiempo. En una modalidad, la dosificación del FVII modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de FVII administrado en la dosificación recomendada del FVII recombinante a los pacientes durante el mismo periodo de tiempo. Por ejemplo, si NovoSeven® se administra a una dosis de 90 mcg/kg cada dos horas a un paciente pre- o postoperativamente (es decir, 7,65 mg cada dos horas o 45,9 mg en seis dosis en un periodo de 12 horas, para un paciente de 85 kg), un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención puede administrarse a una dosis que es el 50 % de la dosis de FVIIa recombinante en 12 horas de un paciente (es decir, a una dosis de 23 mg administrados una vez en un periodo de 12 horas).

En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 45 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 10 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 25 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 35 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 75 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 100 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. Sin embargo, incluso si la dosificación contiene la misma cantidad del factor de coagulación (por ejemplo, FIX) que el factor de coagulación sin modificación con CTP, todavía es ventajosa para los sujetos en el hecho de que se administrará menos frecuentemente debido a su mayor tiempo de vida media en comparación con los factores de coagulación recombinantes.

En otra modalidad, una cantidad con eficacia terapéutica de un factor de coagulación conjugado está entre 50-500 UI por kg de peso corporal administrada una vez al día a una vez a la semana para FIX o 10 gg/Kg-500 gg/Kg para FVIIa. En otra modalidad, una cantidad con eficacia terapéutica de un factor de coagulación conjugado es 150-250 UI por kg de peso corporal, administrada una vez al día. En otra modalidad, una composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado se formula a una concentración eficaz para la administración mediante diversos medios a un paciente humano.

En una modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 20-30 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 25-50 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 50-100 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 100-200 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 10-50 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 20-100 UI/dl en un sujeto.

En una modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto semanalmente. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto dos veces a la semana. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto bisemanalmente (una vez cada dos semanas). En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto dos veces al mes. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto una vez al mes. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto diariamente. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto cada dos días.

En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días, una vez cada 7-14 días, una vez cada 10-20 días, una vez cada 5-15 días, o una vez cada 15-30 días.

Se describe que, la presente invención proporciona una manera para reducir la frecuencia requerida de dosificación de un polipéptido del factor IX (FIX) o de un polipéptido del factor VIIa (FVIIa).

Se describe que la invención da como resultado aumentar la satisfacción en el uso de la terapia con factores de coagulación. El término satisfacción comprende adherencia. Se describe, además, que la invención aumenta la satisfacción de los pacientes con necesidad de una terapia con factores de coagulación mediante la reducción de la frecuencia de administración del factor de coagulación. Se describe, además, que la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra debido a las modificaciones con CTP que hacen que el factor de coagulación modificado con CTP sea más estable. Se describe, además, que la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra como resultado de aumentar el T14 del factor de coagulación. Se describe, además, que la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra como resultado de aumentar el tiempo de aclaramiento o reducir la velocidad de aclaramiento del factor de coagulación. Se describe que, la reducción en la frecuencia requerida de administración del factor de coagulación se logra como resultado de aumentar la medida de AUC del factor de coagulación.

En otra modalidad, la presente invención muestra que las composiciones proporcionadas en la presente sorprendentemente se absorben más eficazmente hacia el torrente sanguíneo después de la administración SC (véase los ejemplos 7-9 en la presente). La posibilidad de administrar el FVIIa por vía subcutánea constituye una ventaja ya que puede usarse para aplicaciones profilácticas. Además, es mucho más fácil que los pacientes se inyecten ellos mismos las inyecciones subcutáneas, y son una ventaja cuando los pacientes son muy jóvenes y sus venas son pequeñas y difíciles de encontrar.

La administración oral, en una modalidad, comprende una forma de dosificación unitaria que comprende tabletas, cápsulas, pastillas, tabletas masticables, suspensiones, emulsiones y similares. Dichas formas de dosificación unitaria comprenden una cantidad segura y eficaz del factor de coagulación deseado de la invención, cada una de las cuales es, en una modalidad, de aproximadamente 0,7 o 3,5 mg a aproximadamente 280 mg/70 kg, o en otra modalidad, aproximadamente 0,5 o 10 mg a aproximadamente 210 mg/70 kg. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de las formas de dosificación unitaria para la administración peroral se conocen bien en la técnica. En algunas modalidades, las tabletas comprenden típicamente adyuvantes farmacéuticamente compatibles convencionales como diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, manitol, lactosa y celulosa; aglutinantes como almidón, gelatina y sacarosa; desintegrantes como almidón, ácido algínico y croscarmelosa; lubricantes como estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. En una modalidad, los deslizantes como el dióxido de silicio pueden usarse para mejorar las características de flujo de la mezcla en polvo. En una modalidad, pueden añadirse agentes colorantes, tal como los colorantes FD&C para la apariencia. Los agentes edulcorantes y saborizantes, tales como aspartamo, sacarina, mentol, menta y saborizantes de frutas, son adyuvantes útiles para las tabletas masticables. Típicamente las cápsulas comprenden uno o más diluyentes sólidos descritos anteriormente. En algunas modalidades, la selección de los componentes portadores depende de consideraciones secundarias como el gusto, el costo y la estabilidad en almacenaje, que no son críticos para los propósitos de esta invención, y puede realizarse fácilmente por un experto en la técnica.

En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende un perfil de liberación predefinido. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende tabletas, cápsulas, pastillas o tabletas masticables de liberación prolongada. En una modalidad, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende tabletas, cápsulas, pastillas o tabletas masticables de liberación lenta. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende tabletas, cápsulas, pastillas o tabletas masticables de liberación inmediata. En una modalidad, la forma de dosificación oral se formula de acuerdo con el perfil de liberación deseado del ingrediente activo farmacéutico como conoce un experto en la técnica.

Las composiciones perorales, en algunas modalidades, comprenden soluciones, emulsiones, suspensiones líquidas, y similares. En algunas modalidades, los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de tales composiciones se conocen bien en la técnica. En algunas modalidades, las composiciones orales líquidas comprenden de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,933 % del compuesto o compuestos deseados, o en otra modalidad, de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 10 %.

En algunas modalidades, las composiciones para uso médico de esta invención comprenden soluciones o emulsiones, que pueden ser soluciones o emulsiones acuosas que comprenden una cantidad segura y eficaz de los compuestos de la presente invención y opcionalmente, otros compuestos, previstos para una administración intranasal tópica. En algunas modalidades, las composiciones h comprenden de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 10,0 % en p/v de un compuesto objetivo, con mayor preferencia de aproximadamente 00,1 % a aproximadamente 2,0, que se usa para la administración sistémica de los compuestos mediante la vía intranasal. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP puede inyectarse en el músculo (inyección intramuscular), o puede inyectarse debajo de la piel (inyección subcutánea), o inyectarse en la piel, o administrarse por medio de administración sistémica, o administrarse por inyección intravenosa. En otra modalidad, la administración puede ser administración parenteral, pulmonar, oral, tópica, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, transnasal, intraocular, oftálmica, epidural, bucal, rectal, transmucosal, intestinal o parenteral, que incluye inyecciones intramedulares, así como administración intratecal o intraventricular directa.

En otra modalidad, la preparación se administra de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, por medio de la inyección de la preparación directamente en una región específica del cuerpo de un paciente.

En una modalidad, la vía de administración puede ser enteral. En otra modalidad, la vía puede ser conjuntival, transdérmica, intradérmica, intraarterial, vaginal, rectal, intratumoral, paracanceral, transmucosal, intramuscular, intravascular, intraventricular, intracraneal, intranasal, sublingual, o una combinación de estas.

En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por inyección intravenosa, intraarterial, o intramuscular de una preparación líquida. En algunas modalidades, las formulaciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa, y se formulan por lo tanto en una forma adecuada para la administración intravenosa. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intraarterial y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intraarterial. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intramuscular, y se formulan por lo tanto en una forma adecuada para la administración intramuscular.

Además, en otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran de manera tópica a las superficies corporales, y se formulan por lo tanto en una forma adecuada para la administración tópica. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen geles, ungüentos, cremas, lociones, gotas y similares. Para la administración tópica, los compuestos de la presente invención se combinan con un agente o agentes terapéuticos adecuados adicionales, preparados y aplicados como soluciones, suspensiones o emulsiones en un diluyente fisiológicamente aceptable con o sin un portador farmacéutico.

En una modalidad, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, producción de grajeas, levigación, emulsión, encapsulado, atrapamiento o liofilización.

En una modalidad, las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente invención se formulan de una manera convencional mediante el uso de uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en las preparaciones, las cuales pueden usarse farmacéuticamente. En una modalidad, la formulación depende de la vía de administración escogida. En una modalidad, los inyectables de la invención se formulan en soluciones acuosas. En una modalidad, los inyectables de la invención se formulan en tampones fisiológicamente compatibles como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón de solución salina fisiológica. En algunas modalidades, para la administración transmucosal, en la formulación se usan penetrantes adecuados para la barrera que se va a penetrar. Dichos penetrantes generalmente se conocen en la técnica.

En una modalidad, las preparaciones descritas en la presente se formulan para una administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección por bolo o infusión continua. En algunas modalidades, las formulaciones para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis con opcionalmente, un conservante adicionado. En algunas modalidades, las composiciones son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las composiciones comprenden, además, en algunas modalidades, conservantes, tales como cloruro de benzalconio y timerosal y similares; agentes quelantes, como edetato de sodio y otros; tampones como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfito de sodio y otros; agentes aromáticos; agentes de ajuste de la viscosidad, tales como polímeros, que incluyen celulosa y derivados de esta; y polivinil alcohol y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según se necesite. Las composiciones comprenden, además, en algunas modalidades, anestésicos locales u otros activos. Las composiciones pueden usarse como aerosoles, neblinas, gotas y similares.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los ingredientes activos, en algunas modalidades, se preparan como suspensiones adecuadas para inyección basadas en aceite o agua. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen, en algunas modalidades, aceites grasos como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección contienen, en algunas modalidades, sustancias, que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. En otra modalidad, la suspensión contiene, además, estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.

En otra modalidad, el compuesto activo puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y otros, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; J. E. Diederichs y al., Pharm. /nd. 56 (1994) 267- 275).

En otra modalidad, la composición farmacéutica suministrada en un sistema de liberación controlada se formula para la infusión intravenosa, bomba osmótica implantable, parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, se usa una bomba (véase Langer, más arriba; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald y otros, Surgery 88:507 (1980); Saudek y otros, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). En otra modalidad, pueden usarse materiales poliméricos. Aún en otra modalidad, un sistema de liberación controlada puede colocarse próximo al blanco terapéutico, por ejemplo, el cerebro, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, más arriba, vol. 2, pp. 115 138 (1984). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (Science 249: 1527-1533 (1990).

En algunas modalidades, el ingrediente activo está en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, solución a base de agua, estéril, libre de pirógenos, antes del uso. Las composiciones se formulan, en algunas modalidades, para la administración por atomización e inhalación. En otra modalidad, las composiciones están contenidas en un contenedor con medios de atomización adheridos.

En una modalidad, la preparación de la presente invención se formula en composiciones rectales tal como supositorios o enemas de retención, mediante el uso, por ejemplo, de bases convencionales de supositorios tal como manteca de cacao u otros glicéridos.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos se contienen en una cantidad eficaz para lograr el propósito deseado. En algunas modalidades, una cantidad con eficacia terapéutica significa una cantidad de ingredientes activos eficaces para usar en la prevención, alivio o mejoría de los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se trata.

En una modalidad, la determinación de una cantidad con eficacia terapéutica está dentro de la habilidad de los expertos en la técnica.

Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables o componentes de estos son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, y metilcelulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, tales como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de theobroma; polioles tales como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico; emulsionantes, tales como los emulsionantes de la marca Tween™; agentes humectantes, tales como lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes; agentes de formación de tabletas, estabilizadores; antioxidantes; conservantes; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; y soluciones tampón de fosfato. La elección de un portador farmacéuticamente aceptable para usarse junto con el compuesto se determina básicamente por la manera en que el compuesto se va a administrar. Si el compuesto objetivo es para inyectar, en una modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable es solución salina fisiológica, estéril, con un agente de suspensión compatible con la sangre, cuyo pH se ha ajustado a aproximadamente 7,4.

Adicionalmente, las composiciones pueden comprender además aglutinantes (por ejemplo acacia, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma de guar, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil metil celulosa, povidona), agentes desintegrantes (por ejemplo almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa sódica, crospovidona, goma de guar, glicolato de almidón sódico), tampones (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) de varios pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de proteasas, tensoactivos (por ejemplo, lauril sulfato de sodio), potenciadores de la permeación, agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, glicerol de polietileno), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito sódico, hidroxianisol butilado), estabilizantes (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa), agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo, carbómero, dióxido de silicio coloidal, etilcelulosa, goma de guar), edulcorantes (por ejemplo aspartamo, ácido cítrico), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (por ejemplo ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, lauril sulfato de sodio), adyuvantes de flujo (por ejemplo, dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por ejemplo ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (por ejemplo carbómero, hidroxipropilcelulosa, laurilsulfato sódico), recubrimientos de polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), agentes de recubrimiento y formadores de película (por ejemplo etilcelulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.

Los componentes típicos de los portadores para jarabes, elíxires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes de suspensión típicos incluyen metil celulosa, carboximetilcelulosa sódica, celulosa (por ejemplo, Avicel™, RC-591), tragacanto y alginato de sodio; los agentes humectantes típicos incluyen lecitina y sorbitán de óxido de polietileno (por ejemplo, polisorbato 80). Los conservantes típicos incluyen metil parabeno y benzoato de sodio. En otra modalidad, las composiciones líquidas perorales contienen, además, uno o más componentes tales como edulcorantes, agentes saborizantes y colorantes descritos anteriormente.

En algunas modalidades, la preparación de una cantidad o dosis eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. En una modalidad, una dosis puede formularse en modelos animales y dicha información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en los seres humanos.

En una modalidad, la toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritas en la presente puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales experimentales. En una modalidad, los datos obtenidos a partir de estos ensayos in vitro y en cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para usar en el ser humano. En una modalidad, las dosificaciones varían en dependencia de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y dosificación puede ser elegida por el médico individual teniendo en cuenta la afección del paciente. (Ver, por ejemplo, Fingl y otros, 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", C. 1 p.1].

En dependencia de la severidad y la capacidad de respuesta de la afección que se va a tratar, la dosificación puede ser de una única administración o una pluralidad de ellas, donde un curso de tratamiento puede durar de varios días a varias semanas o hasta que se logre la cura o la diminución del estado de la enfermedad.

La cantidad de una composición que se va a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que se trata, la severidad de la afección, la manera de administración, el criterio del médico responsable, etcétera.

En una modalidad, las composiciones que incluyen la preparación de la presente invención formulada en un portador farmacéutico compatible se preparan, además, colocadas en un contenedor adecuado, y marcado para el tratamiento de una afección indicada.

En otra modalidad, un factor de coagulación como se describe en la presente es una preparación liofilizada (es decir, secada por congelación) en combinación con excipientes orgánicos complejos y estabilizadores tales como agentes tensoactivos no iónicos (es decir, surfactantes), diversos azúcares, polioles orgánicos y/o albúmina sérica humana. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en agua estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en PBS estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en NaCl al 0,9 % estéril para inyección.

En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende el factor de coagulación modificado con CTP como se describe en la presente y portadores complejos como albúmina sérica humana, polioles, azúcares y agentes estabilizantes tensoactivos aniónicos. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende el factor de coagulación modificado con CTP como se describe en la presente y ácido lactobiónico y un tampón de acetato/glicina. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende el factor de coagulación modificado con CTP como se describe en la presente y aminoácidos, tal como arginina o glutamato que aumentan la solubilidad de las composiciones de interferón en agua. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación modificado con CTP, liofilizado, como se describe en la presente y glicina o albúmina sérica humana (HSA), un tampón (por ejemplo, acetato) y un agente isotónico (por ejemplo, NaCl). En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación modificado con CTP, liofilizado, como se describe en la presente y tampón fosfato, glicina y HSA.

En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente se estabiliza cuando se coloca en soluciones tamponadas que tienen un pH entre aproximadamente 4 y 7,2. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación está en una solución tamponada que tiene un pH entre aproximadamente 4 y 8,5. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación está en una solución tamponada que tiene un pH entre aproximadamente 6 y 7. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación está en una solución tamponada que tiene un pH de aproximadamente 6,5. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente se estabiliza con un aminoácido como un agente estabilizante y en algunos casos una sal (si el aminoácido no contiene una cadena lateral cargada).

En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente es una composición líquida que comprende un agente estabilizante entre aproximadamente 0,3 % y 5 % en peso el cual es un aminoácido.

En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente proporciona precisión de la dosificación y seguridad del producto. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente proporciona una formulación líquida, estable, biológicamente activa, para usar en aplicaciones inyectables. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación no liofilizado como se describe en la presente.

En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente proporciona una formulación líquida que permite el almacenamiento durante un periodo de tiempo largo en un estado líquido que facilita el almacenamiento y el envío antes de su administración.

En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente comprende lípidos sólidos como material de matriz. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente comprende lípidos sólidos como material de matriz. En otra modalidad, la producción de micropartículas de lípidos mediante congelación por pulverización se describió por Speiser (Speiser y al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) seguido por nanogránulos de lípidos para la administración peroral (Speiser e P 0167825 (1990)). En otra modalidad, los lípidos que se usan se toleran bien por el cuerpo (por ejemplo, glicéridos compuestos de ácidos grasos que están presentes en las emulsiones para la nutrición parenteral).

Las composiciones para su uso de acuerdo a la presente invención pueden presentarse en un envase o dispositivo dispensador, tal como un estuche aprobado por la FDA, que contiene una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. En una modalidad, el envase, por ejemplo, comprende una lámina de metal o plástico, tal como un blíster. En una modalidad, el envase o dispositivo dispensador se acompaña de instrucciones para la administración. En una modalidad, el envase o dispensador incluye un aviso asociado con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de los productos farmacéuticos, dicho aviso es reflejo de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. Dicho aviso, en una modalidad, es el etiquetado aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para los fármacos controlados, o el prospecto del producto aprobado.

Se apreciará que los factores de coagulación para su uso de acuerdo a la presente invención pueden proporcionarse al individuo con agentes activos adicionales para lograr un mejor efecto terapéutico en comparación con el tratamiento con cada agente por sí mismo. En una modalidad, se toman medidas (por ejemplo, la dosificación y la selección del agente complementario) para evitar los efectos secundarios adversos que se asocian con las terapias de combinación.

Como se conoce generalmente en la técnica, los péptidos y proteínas modificados de la invención pueden acoplarse a marcajes, fármacos, agentes de direccionamiento, portadores, soportes sólidos y similares, en dependencia de la aplicación deseada. Las formas marcadas de los agentes biológicos modificados pueden usarse para seguir su destino metabólico; los marcajes adecuados para este propósito incluyen, especialmente, marcajes con radioisótopos tales como yodo 131, tecnecio 99, indio 111, y similares. Los marcajes pueden usarse, además, para mediar la detección de las proteínas o péptidos modificados en sistemas de ensayo; en este caso, también pueden usarse los radioisótopos, así como marcajes con enzimas, marcajes fluorescentes, marcajes cromogénicos y similares. El uso de tales marcajes es particularmente útil si el péptido o la proteína es en sí mismo un agente de direccionamiento tal como un anticuerpo o un ligando de un receptor.

Pueden emplearse técnicas de unión similares, junto con otras, para acoplar los péptidos y proteínas modificados de la invención a soportes sólidos. Cuando se acoplan, estos péptidos y proteínas modificados pueden usarse después como reactivos de afinidad para la separación de componentes deseados con los que se muestra una reacción específica.

Otros objetos, ventajas y características novedosas de la presente invención resultarán evidentes para una persona experta en la técnica luego del análisis de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención tal como se expone en la presente descripción y como se reivindica en la sección de reivindicaciones más abajo encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Generalmente, la nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican ampliamente en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y otros, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y otros, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y otros, "Recombinant ADN", Scientific American Books, Nueva York; Birren y otros (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se exponen en las patentes de EE.UU. núms. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera Edición; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y otros (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8va Edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura científica y de patentes, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. núms. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y otros, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales.

Ejemplo 1

Generación y utilización del Factor de coagulación IX

Clonaje y expresión de la molécula de FIX recombinante:

Los clones del factor IX se construyeron en nuestro vector de expresión en eucariota pCI-neo (Promega, núm. de catálogo E1841). El clon del ORF del factor de coagulación IX de Homo sapiens se solicitó a "OriGene" (RC219065). Los cebadores se solicitaron a Sigma-Genosys.

Construcción de 301-1-pCI-neo-p200-11 (Factor IX-ctp x2):

Cebador 101: 5' GTTTAGTGAACCGTCAGAAT 3' (sec. con núm. de ident.: 36)

Cebador 103R: 5' TTGAGGAAGATGTTCGTGTA 3' (contiene el sitio de SspI del factor IX) (sec. con núm. de ident.: 37)

Se realizó una reacción de PCR con el cebador 101 y el cebador 103Ry ADN plasmídico, el clon de ADNc del factor IX (OriGene" RC219065) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 1085 pb (pcr 10) y se purificó a partir del gel (el fragmento que contenía el amino terminal de la secuencia del factor IX). Cebador 98: 5' ATTACAGTTGTCGCAGGTGA 3' (sec. con núm. de ident.: 38)

Cebador 99R: 5' GCTGGAGCTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT 3' (sec. con núm. de ident.: 39)

Cebador 100: 5' GCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3' (sec. con núm. de ident.: 40)

Cebador 27R: 5' TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG 3' (sec. con núm. de ident.: 41)

Se realizaron tres reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 98 y el cebador 99R y ADN plasmídico, el clon de ADNc del factor IX (OriGene", RC219065) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 540 pb.

La segunda reacción se realizó con el cebador 100 y el cebador 27R y ADN plasmídico de 402-2-p72-3 (hGH-CTP-CTP) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 258 pb.

La última reacción (pcr 3) se realizó con los cebadores 98 y 27R y una mezcla de los productos de las dos reacciones anteriores como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 790 pb y se ligó en el vector de clonación TA (Invitrogen, catálogo K2000-01). Se aisló el fragmento de SspI -EcoRI (TA 3-3). Otra reacción de PCR se realizó (pcr 12) con el cebador 101 y el cebador 27R y una mezcla de los productos de la pcr 10 y el fragmento de SspI-EcoRI de la pcr 3 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 1700 pb (Factor IX-ctp-ctp) y se ligó al vector de clonación TA (Invitrogen, catálogo K2000-01) (lig 180).

Se encontró un error en la secuencia del factor IX por lo que los fragmentos se volvieron a colocar para formar un inserto del Factor IX-ctp-ctp con la secuencia de ADN correcta.

TA- pcr 3-3 se digirió con SspI y XbaI y se aisló el fragmento grande (vector). TA 180-4 se digirió con SspI y XbaI y se aisló el fragmento pequeño (inserto) y se ligó al fragmento grande aislado de TA-pcr-3-3digerido con SspI y Xbal. El nuevo plásmido TA-183-2 se digirió con Sal I y NotI, y se aisló el inserto Factor IX-CTP-CTP (-1575 pb). Este fragmento se insertó en el vector de expresión pCI-neo de eucariotas (digerido con Sal I y Not I) para producir el clon 301-2-p200-11.

Construcción pCI-dhfr -Factor 9- ctpx2 (p223-4): El vector pCI-dhfr (p6-1) se digirió con SmaI y NotI. Factor IX-CTP-CTP (p200-11) se digirió con ASisI F.I. y Notl. Los dos fragmentos se ligaron.

Construcción pCI-dhfr Factor 9-ctp x3 (p225-7): El vector pCI-dhfr OXM-CTP*3 (p216-4) se digirió con XbaI y Apal. El factor IX-CTP-CTP (223-4) se digirió con XbaI y Apal. Los dos fragmentos se ligaron.

Construcción pCI-dhfr Factor 9-ctp x3 T148A (p243-2): El plásmido p225-7 contenía treonina en la posición 148, dado que la versión más común del FIX contiene alanina en esta posición, la Thr se reemplazó por Ala mediante el uso del método de mutagénesis dirigida a un sitio.

Cebador 75: ctcccagttcaattacagct (sec. con núm. de ident.: 42)

Cebador 122r: ggaaaaactgcctcagcacgggtgagc (sec. con núm. de ident.: 43)

Cebador 123: gtgctgaggcagtttttcctgatgtggactat (sec. con núm. de ident.: 44)

Cebador 124r: caacacagtgggcagcag (sec. con núm. de ident.: 45)

Se realizaron tres reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 75 y el cebador 122r y ADN plasmídico p225-7 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de - 692 pb y se purificó a partir del gel. Una segunda reacción de PCR se realizó con el cebador 123 y el cebador 124r y ADN plasmídico p225-7 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de -237 pb y se purificó a partir del gel. La tercera reacción de PCR de superposición se realizó con los cebadores 75 y 124r, y una mezcla de los productos de las dos reacciones anteriores como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 910 pb. Este producto de PCR de superposición se digirió con XbaI y NsiI y se volvió a ligar al plásmido p225-7 (digerido con XbaI y Nsil) para producir el Factor IX-ctpx3 T148A designado p243-2.

Construcción FIX-4CTP (p259-4): El fragmento 3,5CTP se aisló a partir de oxym-4CTP (p254-3) mediante las enzimas de restricción Apa1 y Xbal. El fragmento FIX+0,5CTP se aisló a partir de FIX-3CTP (p243-2) con las enzimas de restricción Apa1 y Xbal. Los dos fragmentos se ligaron.

Construcción FIX-5CTP (p260-18): El fragmento 4,5CTP se aisló a partir de oxym-5CTP (255-1) mediante las enzimas de restricción Apa1 y Xbal. El fragmento FIX+0,5CTP se aisló a partir de FIX-3CTP (p243-2) mediante el uso de las enzimas Apa1 y Xbal. Los dos fragmentos se ligaron.

Las células Dg44 se sembraron en placas para cultivo de tejidos de 100 mm y se cultivaron hasta una confluencia del 50-60 %. Un total de 2 pg (microgramo) de ADNc de FlX se usó para la transfección de una placa de 100 mm mediante el uso del reactivo FuGene (Roche) en medio libre de proteína (Invitrogene CD Dg44). El medio se eliminó 48 horas después de la transfección y se reemplazó con un medio libre de proteína (Invitrogene CD Dg44) sin nucleósidos y en presencia de 800 pg/ml de G418 (neomicina). Después de 14 días, la población celular transfectada se transfirió a matraces para el cultivo de tejidos T25, y la selección continuó durante otros 10-14 días hasta que las células comenzaron a crecer como clones estables. Se seleccionaron clones con alta expresión. Se usaron aproximadamente 2x107 células para inocular 300 ml de medio de crecimiento en una botella de rodillo de 1700 cm2 (Corning, Corning NY), suplementado con vitamina K3 a 5 ng/ml (menadiona bisulfato de sodio; Sigma). El medio de producción (cosecha) se recogió después de una disminución rápida en la viabilidad celular a aproximadamente 70 %. El medio de producción se clarificó primero y después se concentró aproximadamente 20 veces y se dializó con PBS mediante el uso de un casete de filtración de flujo (10 KDa MWCO; Millipore Corp.).

Determinación del nivel del antígeno FIX: los niveles de antígeno en la cosecha de FIX-CTP se determinaron mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano AssayMax (AssayPro-EF1009-1). La concentración de proteínas calculada es el promedio de tres diluciones diferentes en dos ejecuciones independientes (figura 1A, tabla 1).

Tabla 1; Concentración de proteínas calculada

F IX -C T P F IX -C T P -C T P

SD 8,76 3,67

rv ( ' W f l H H Ü 20,92

FIX SDS-PAGE - inmunotransferencia: las cosechas de FIX-CTP o rhFIX purificado (American Diagnostics), 100 ng de proteína, se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del anticuerpo policlonal anti-FIX humano y anticuerpo monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics). Como se informó previamente, rhFIX migró a 55 KDa, mientras que FIX fusionado a dos CTP migró a 75 KDa. Ambas variantes de las proteínas FIX-CTP se mostraron estar gamma carboxiladas, una modificación postraduccional esencial para la actividad y la función de FIX (figura 1B).

Determinación de la actividad cromogénica de FIX: Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de las cosechas de FIX-CTP frente a la proteína rhFIX (American Diagnostics) se realizó mediante el uso del estuche de prueba para la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En la presencia de trombina, fosfolípidos, calcio, cantidades en exceso de FXIa activa el FIX muestreado a FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina, FVIII activado:C (suministrado en cantidades en exceso), fosfolípidos, y calcio y activa el Factor X, presente en el sistema de ensayo, a FXa. La actividad se correlaciona directamente con la cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se mide después mediante su actividad específica sobre un sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generado es directamente proporcional a la actividad de FIXa. rhFIX y las cosechas de FIX-CTP se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de las cosechas de FIX con una preparación de referencia que consistió en rhFIX o plasma humano. La EC50 promedio del FIX fue 21 ng/ml, mientras que la EC50 calculada para la cosecha de FIX-(CTP²) fue 382 ng/ml, y la EC50 calculada para la cosecha de FIX-CTP fue 1644 ng/ml. Se observó una disminución de aproximadamente 15 veces en la actividad enzimática de la cosecha de FIX-(CTP²) (figura 2).

Actividad de coagulación de FIX (aPTT): El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) es una medida de la integridad de las vías intrínseca y común de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo, en segundos, para que el plasma se coagule después de la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípido y calcio. El reactivo de aPTT se denomina una tromboplastina parcial porque el factor tisular no se incluye con el fosfolípido ya que está con el reactivo protime (PT). El activador inicia el sistema y después tiene lugar el resto de las etapas de la vía intrínseca en presencia de fosfolípido. El intervalo del aPTT de referencia varía entre los diferentes laboratorios, pero usualmente está en el intervalo de 27-34 segundos.

Lo importante del ensayo fue cuantificar la capacidad de las cosechas de FIX-CTP para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano con agotamiento de FIX mediante la adición de rhFIX. Se mezclaron 300 gl de plasma humano deficiente de FIX con 100 gl de rhFIX o las cosechas de FIX-CTP y diluidas en serie. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadieron tromboplastina, CaCl²y fosfolípidos a la mezcla, y se determinó el tiempo de coagulación en segundos (realizado por American Medical Laboratories). La potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de las cosechas de FIX con una preparación de referencia que consistió en rhFIX o plasma humano. Una unidad de actividad de FIX corresponde a la concentración del FIX que iguala la actividad de un ml de plasma humano normal. Los resultados de aPTT presentados indican que FIX-(CTP⁾²muestra una reducción de 5,7 veces en su actividad específica de coagulación en comparación con rhFIX (tabla 2). Además, los resultados de aPTT junto con el ensayo de la actividad cromogénica in vitro sugieren que la cosecha de FIX-(CTP⁾²tiene una actividad enzimática mejorada frente a la cosecha de FIX-CTP (tabla 2). Una mejor actividad de las proteínas FIX-CTP puede obtenerse después de la optimización del sistema de expresión (es decir cotransfección con furina y optimización de la concentración de vitamina K3 en el medio), que se fortaleció después de la super-transfección con furina (datos no mostrados).

Tabla 2: Actividad de coagulación de FIX

rtiMXf A prr<seg) FIX-CTP PTT (¡jcg) FIX-CTP-CTP PTTfacg)

D) tpg/mli (gg/ml)

(pg/mli

5 31,3 9 45,2 4 47,5

1,25 35,7 2,25 53,3 1 55,9

0,3125 43 0,5625 64,1 0,25 67

0,07812 52,1 0,140625 76,3 0,0625 77,4

5

Estudio farmacocinético: rhFIX (American Diagnostic) y las cosechas de FIX-CTP se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague-Dawley (seis ratas por sustancia) a una dosis de 75 gg/kg de peso corporal (tabla 3).

Tabla 3: Plan de o eración del estudio PK

Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 1,5, 4, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. La concentración del FIX se cuantificó mediante ensayo ELISA específico para FIX (AssayPro). Se calculó un perfil farmacocinético para cada proteína y representa la media de 3 animales en cada punto de tiempo (figura 3). Los tiempos de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK solutions 2.0. La tabla 4 resume las concentraciones observadas de FIX en los diferentes puntos de tiempo de muestreo.

T ab la 4: Concentraciones de F IX observadas

Tiempo H X 'A D i ng/mb HX-CTP ing/mb H \ CTP C IP

(horas) i ng/ml)

0,083 1506,7 1477,5 1914,8

0,5 1949,8 1150,1 1830,1

1,5 2189,4 1009,0 1264.3

4 733,90 709,33 1000,00

8 319,80 167,20 1234.67

24 BLQ 54,625 230

48 BLQ BLQ 120,9

El perfil PK y el resumen de los tiempos de vida media terminal se resumen en la tabla 5. Las cosechas de FIX-CTP muestran mejores valores de T%p en comparación con rhFIX (aumentos de 2 y 5 veces, respectivamente). Dado que en la recolección de la dosificación del FIX, las concentraciones séricas en el animal del FIX a las 24 horas estaban por debajo del límite de cuantificación (BLQ), no se calcularon otros parámetros PK.

Tab la 5: R esum en de los parám etros PK

En este estudio, se describió un novedoso enfoque para prolongar el tiempo de vida media del FIX mientras que se retiene la potencia terapéutica. La adición de un péptido CTP a una proteína activa tiene un potencial perjudicial al interferir con la actividad de la proteína. Por lo tanto, la generación de un FIX-CTP recombinante activo mediante la adición de una secuencia CTP en el extremo C-terminal del FIX es inesperada.

Caracterización de un FIX-CTP-CTP purificado por inmunoafinidad

Purificación del FIX-CTP-CTP

Para evaluar una proteína en un contenido de alto grado con aumento de la actividad cuyo perfil PK imita y puede extrapolarse a un entorno clínico, FIX-CTP-CTP es un FIX modificado con 2 unidades de CTP en tándem en su carboxilo terminal. FIX-CTP-CTP se purificó mediante el uso de un anticuerpo monoclonal unido a la matriz contra residuos y carboxiglutamilo (Gla) presentes en la región N-terminal del FIX (American Diagnostics Cat. # 3570MX). El anticuerpo monoclonal se unió a sefarosa CL-4B. La cosecha de FIX-CTP-CTP a una concentración de 88 gg/ml se dializó contra Tris 20 mM, NaCl 150 Mm y EDTA 10 mM a pH =7,4. La velocidad de carga fue 0,5 ml/min, la elución se realizó mediante el uso de Tris-HCl 20 Mm, NaCl 350 mM y CaCl 50 mM, y la fracción no unida se recicló cinco veces. Finalmente, la fracción de elución se dializó con PBS, se mezcló bien y se concentró.

Determinación del nivel del antígeno FIX: los niveles de las cosechas de FIX-CTP, las cosechas de FIX-(CTP)², y la proteína purificada FIX-(CTP)²se determinaron mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. #FIX-AG RUO). La concentración de proteínas calculada (gg/ml) es el promedio de dos ejecuciones independientes (figura 4, tabla 6).

Tab la 6: Concentración de proteínas calculada

FIX-CTP FIX-CTP-CTP FIX-CTP-CTP (purificada)

125.78

88,53

172,9

17 ,28 21,31 2 ,63

13,74

24,08

1,52

Adicionalmente, FIX-CTP-CTP se cuantificó mediante el ensayo de Bradford. La concentración calculada fue 202 gg/ml, que es similar a la concentración obtenida por el ELISA para FIX humano.

Transferencias de SDS-PAGE: la cosecha de FIX-CTP-CTP, la fracción no unida y la proteína purificada, se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis del SDS-PAGE Coomassie se realizó mediante tinción del gel con el reactivo azul de Coommasie (800 ng de proteína). Se realizó una inmunotransferencia Western con 100 ng de proteína, anticuerpo policlonal anti-FIX humano (Ac), y Ac monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics Cat #499 y #3570). El procedimiento de purificación por inmunoafinidad enriqueció significativamente la porción FIX-CTP-CTP mientras que se redujeron las impurezas (figura 5).

Secuenciación del N-terminal: La proteína purificada FIX-CTP-CTP se separó mediante SDS-PAGE en Tris-glicina al 12 % y posteriormente se electrotransfirió a una membrana de PVDF. La banda de interés se cortó y se colocó sobre un filtro de fibra de vidrio tratada Biobrene, purificado. El análisis de la secuencia N-terminal se llevó a cabo mediante degradación de Edmann con el uso de un secuenciador de proteína líquida por pulsos equipado con un sistema de microgradientes de HPLC 140 C. La secuenciación del N-terminal reveló que FIX-CTP-CTP es una mezcla de proteínas escindidas completas e incompletas del propéptido. Se demostró que la escisión no adecuada del propéptido reduce la actividad de coagulación del FIX. Mediante cotransfección con furina, el proceso de escisión del propéptido puede mejorarse.

Determinación de la actividad cromogénica de FIX: Se realizó una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la proteína purificada FIX-CTP-CTP frente a rhFIX (American Diagnostics) y una mezcla de plasma humano normal mediante el uso del estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En la presencia de trombina, fosfolípidos y calcio, cantidades en exceso de FXIa activan FIX a FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina (suministrada en cantidades en exceso), fosfolípidos y calcio activan el Factor X, presente en el sistema de ensayo, a FXa. La actividad se correlaciona directamente con la cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se midió por su actividad específica sobre un sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generada fue directamente proporcional a la actividad de FIXa. rhFIX, plasma humano y FIX-CTP-CTP se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta (figura 6). La EC⁵⁰promedio de rhFIX fue 68,74 ng/ml mientras que la EC⁵⁰calculada de FIX-CTP-CTP fue 505 ng/ml. Se observó una disminución de aproximadamente 7 veces en la actividad enzimática de FIX-CTP-CTP frente a FIX recombinante y una disminución de 16,5 veces frente al plasma normal humano bien mezclado. Esta actividad reducida puede explicarse por la escisión inadecuada del propéptido N-terminal, que se identificó mediante análisis del N-terminal.

Actividad de coagulación de FIX (aPTT): El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) es una medida de la integridad de las vías intrínseca y común de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo (medido en segundos) necesario para que el plasma coagule después de la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípido y calcio.

El ensayo cuantificó la capacidad de la proteína FIX-CTP-CTP para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano con agotamiento del FIX mediante la adición de rhFIX. 300 gl de plasma humano deficiente de FIX se mezcló con 100 gl de rhFIX, FIX-CTP-CTP (FIX-CTP-CTP (los CTP están en tándem en el C-terminal)), o plasma humano normal mezclado que se diluyó adicionalmente. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadió el factor tisular (TF), CaCl², y fosfolípidos a la mezcla. Se determinó el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de FIX-CTP-CTP con una preparación de referencia de rhFIX o plasma humano. Una unidad de FIX se definió como la cantidad de FIX que iguala la actividad de 1 ml de plasma humano normal.

Los resultados de aPTT indican que la actividad de coagulación de FIX-CTP-CTP es solo 1,4 menor que el plasma humano normal mezclado y similar al rhFIX. Los resultados de aPTT junto con el ensayo de actividad cromogénica in vitro sugieren que la purificación de FIX-CTP-CTP no afectó su actividad.

Actividad farmacocinética de FIX-CTP-CTP: FIX-CTP-CTP purificado, rhFIX (American Diagnostic) y las cosechas que contenían FIX-CTP-CTP y FIX-CTP se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague-Dawley (ocho ratas por sustancia) en una dosis de 100 gg/kg de peso corporal (tabla 7).

Tabla 7: Descri ción del estudio de PK

Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 4 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 4, 7, 10, 24, 48, y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. La concentración del FIX se cuantificó mediante el uso de un estuche de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína como la media de 4 animales en cada punto de tiempo (figura 7). El tiempo de vida media terminal se calculó mediante el uso del programa informático PK Solutions 2.0. La tabla 8 resume las concentraciones observadas de FIX en diferentes puntos de tiempo de muestreo.

Tab la 8: Concentraciones de F IX observadas

Tiempo Cosecha de Cosecha de rhFIX ng/ml FIX-CTP-CTP (horas) FIX-CTP FIX-(CTP): purificada

llg/llll ng/ml ng/nü

0,085

1038,97

1123,62

325.05

886,48

0,5 939,12 956,80 274,58 670,92

1

2 304,98 673,31 186.00 503,91

4

7 171,45 384,36 67,62 257,02

10

50,34

250,73

40,20

158,66

24 10,07 78,50 BLQ 52,13

En la tabla 9 se presenta un resumen de los parámetros PK.

T ab la 9: R esum en de los parám etros PK

TVi(hr) Al'C njj- MKI 'hr* Vd C'L

Tiempo

(horas) hr/ml ml/Kg Ml/hr/Kg

Cosecha de 10,44 9105,7 12 165,4 10,9

FIX-(CTP):

rhFIX

3,72

1416,8

5,1

373,8

70.183

FIX-CTP-CTP

purificada 11,14 6314,2 12,3 254,5 15,83

La cosecha de FIX-CTP-CTP demostró un mejor perfil PK en comparación con la cosecha de FIX-CTP. Además, FIX-CTP-CTP purificado mostró un aumento de 3 veces en el valor de T%p y un aumento de 4,5 veces en el AUC en comparación con rhFIX.

La cantidad reducida del FIX secretado fusionado a las moléculas CTP en tándem frente a la fusión de un único CTP parece deberse a la adición de un CTP adicional y no a la detección reducida del ELISA, porque la concentración calculada de FIX-CTP-CTP purificado por Bradford fue similar a la concentración calculada por ELISA.

La actividad de coagulación de FIX-CTP-CTP fue similar al plasma humano mezclado; sin embargo, su actividad cromogénica in vitro fue significativamente menor cuando se comparó con rhFIX o el plasma humano mezclado. El ensayo de actividad cromogénica se reportó como un ensayo muy sensible en comparación con el ensayo de coagulación. El motivo de la actividad reducida de FIX-CTP-CTP puede variar. La adición de CTP puede disminuir la afinidad de FIX por el FXIa o reducir las modificaciones postranscripcionales (por ejemplo 12-10 residuos GLA y la escisión del propéptido). El análisis del N-terminal reveló que la escisión proteolítica del propéptido de FIX-CTP-CTP no se completó totalmente antes de la secreción. Dado que esta modificación postranscripcional es crucial para la actividad enzimática normal de la proteína, la cotransfección con el plásmido de furina-PACE es favorable y puede mejorar la actividad de FIX-CTP-cTp .

Finalmente, el estudio PK comparativo de FIX-CTP-CTP en ratas demostró que la fusión de dos CTP en tándem al C-terminal del FIX generó un FIX con un tiempo de vida media prolongado.

Modelo de ratón con agotamiento de FIX: Para evaluar la actividad in vivo, se obtienen ratones con inactivación del FIX, y se establece una colonia de reproducción. Se inyectaron 10 gg de hFIX recombinante comercial (BeneFIX®) o de rFIX-(CTP)²(FIX-CTP-CTP) en la vena de la cola de un ratón con inactivación del FIX, anestesiado (22-28 g). La cantidad de proteína inyectada es igual a la concentración requerida de FIX en el plasma normal (5 gg/ml). Las muestras de sangre se toman de la cola comprimida a los tubos capilares heparinizados en puntos de tiempo específicos. Las muestras de plasma se evalúan en cuanto a los niveles de FIX mediante ELISA y se mide la eficacia mediante el ensayo de coagulación de aPTT.

Aumento de la eficacia de la escisión del propéptido de FIX: El ADNc del péptido CTP se fusionó al extremo 3’ del ADNc del FIX humano. Las construcciones de expresión de rFIX y Furina correspondientes se co-transfectaron en células Dg44; un ADNc de rFIX humano también se co-transfectó con el plásmido de furina como control. La secreción de un alto nivel de FIX conduce a la secreción de una mezcla del pro-factor y un factor FIX maduro, debido a la cantidad limitada de la proteasa de furina en la célula. La cotransfección de un vector de expresión de furina con un vector de expresión del pro-factor aumenta la recuperación y da como resultado la secreción de FIX completamente procesado al medio.

Después de la cotransfección de FIX-(CTP)²y furina, los clones estables se generan y la cosecha se recolecta para la evaluación de la escisión del propéptido. Se cargan 100 ng de proteína en gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realiza mediante inmunotransferencia Western con el uso de Ac policlonal anti-FIX humano (American Diagnostics) y anticuerpo policlonal anti-propéptido. Como se informó previamente, el rhFIX migró a 55 KDa, mientras que el FIX fusionado a dos CTP migró a 75 kDa. Se muestra que ambas variantes de proteínas FIX experimentan una adecuada escisión completa del propéptido.

Para determinar si la escisión adecuada del propéptido mejora la actividad enzimática de FIX-(CTP)², se realiza una evaluación comparativa de la actividad cromogénica y de coagulación de la cosecha de FIX-(CTP)²cotransfectada con furina. Se observa una mejora significativa de la actividad específica de FIX-(CTP)², que es similar a rhFIX. En conclusión, los resultados descritos en la presente sugieren que FIX-CTP-CTP puede usarse eficazmente para el tratamiento de pacientes con hemofilia B. El FIX fusionado a las construcciones de CTP tiene el beneficio de un mejor rendimiento farmacológico in vivo que supera el inconveniente en determinadas medidas in vitro. Este tratamiento propuesto es ventajoso respecto a los tratamientos anteriores ya que se reduce la tasa de infusiones y la cantidad de dosis requeridas.

Es importante señalar que cuando se usó una estrategia de una molécula fusionada a la albúmina para mejorar el tiempo de vida media del FIX, el FIX recombinante se inactivó. El novedoso enfoque actual conduce al diseño y la purificación de una novedosa proteína fusionada con FIX recombinante que presenta una mejor actividad a largo plazo. Dado que las modificaciones de tamaño solas no mejoraron la farmacocinética del FIX inyectado, el hallazgo de que el CTP fusionado al FIX facilita los parámetros farmacocinéticos fue inesperado. La presencia de residuos de ácido siálico en el péptido altamente glicosilado estabilizó la proteína y la protegió de las interacciones con los receptores vasculares sin anular los determinantes principales de la función de FIX.

FIX-CTP tiene una eficacia terapéutica similar al rFIX en los pacientes con hemofilia B y se necesitó una dosificación menos frecuente. Una única inyección de FIX-CTP es suficiente para controlar los episodios de hemorragia y reducir la cantidad de inyecciones que se necesitan durante una intervención quirúrgica en pacientes con hemofilia B. La tecnología de CTP se utilizó para el desarrollo de un FIX de acción prolongada. Específicamente, la prolongación del tiempo de vida media de la molécula de rFIX recombinante se realizó mediante la fusión de al menos un CTP humano al FIX. El FIX recombinante-CTP se expresó en células de mamífero y se caracterizó in vitro e in vivo. Se demostró que la actividad in vitro de rFIX-CTP fue comparable con rFIX. Los estudios de farmacocinética y eficacia en ratas demostraron propiedades mejoradas del rFIX-CTP. Los resultados de este estudio demuestran que es posible desarrollar una molécula de rFIX con un tiempo de vida media prolongado que tenga propiedades hemostáticas similares a la enzima de tipo silvestre.

Ejemplo 2

Evaluación comparativa del FIX-CTP³purificado vs. FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵

2.1 Objetivo del estudio

Una evaluación comparativa de los parámetros farmacocinéticos de FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵frente a FIX-CTP³después de un proceso de purificación parcial.

2.2 Producción de cosechas de FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵

El ADNc de FIX (OriGene RC219065) fusionado en el extremo C-terminal a cuatro o cinco secuencias de CTP en tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de vitamina K3 a 10 ng/l (Sigma, Mennadion). Las cosechas se recolectaron (300 ml), filtraron y congelaron.

2.3 Producción de la cosecha de FIX-CTP3

FIX-CTP³se expresó en el laboratorio en células CHO mediante el uso del vector pCI-DHFR, clon 196, BR-9 en presencia de vitamina K3 a 25 ng/l (Sigma). Las cosechas se recolectaron y filtraron.

Todas las muestras de FIX-CTP (3, 4 y 5 CTP) se purificaron solo mediante una columna de jacalina debido a la falta de material.

2.4 Determinación del nivel del antígeno FIX

El nivel del antígeno FIX se determinó mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). La concentración de proteínas calculada es el promedio de cuatro ejecuciones independientes. La concentración de FIX-CTP³fue ligeramente mayor en comparación con las dos versiones adicionales (tabla 10).

Tabla 10: Nivel del Ag FIX

Prom

1016.69 4644.11 1686,82

(ng/mli

22S.41 925,63 160,07

*C V 22,17 19,93 9,49

2.5 Tinción de Coomassie e inmunotransferencia de FIX-CTP

Las cosechas de FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del Ac policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ac anti-Gla (American Diagnostica).

Como se informó previamente, el FIX fusionado a tres CTP migró a 80 kDa mientras que el FIX fusionado a cuatro o cinco CTP migró a 85 KDa o 90 KDa, respectivamente. Como se esperaba, las cosechas de FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵de Excellgene mostraron muy bajos niveles de gamma carboxilación en comparación con la cosecha de FIX-CTP³, que se produjo en Prolor (figura 8).

Después de un proceso de purificación con la utilización de una columna de jacalina (purificación por inmunoafinidad de las proteínas glicosiladas), FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El SDS-PAGE se tiñó mediante el colorante azul de Coomassie para la detección de las muestras. Todas las variantes mostraron perfiles de bandas mucho más limpios (figura 9), lo que sugiere una mayor pureza.

2.6 Determinación de la actividad cromogénica de FIX

Se realizó una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵completamente purificados (columna HA) frente al plasma mezclado normal humano mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Todas las muestras se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia de plasma normal humano. La reducción de la actividad cromogénica de FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵(figura 10) en comparación con el plasma puede ser una consecuencia de modificaciones postranscripcionales inadecuadas de las proteínas FIX, por ejemplo, gamma carboxilación y escisión del propéptido inapropiadas o, alternativamente, debido a la adición de los casetes de CTP. La fluctuación en la actividad de FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵(tabla 11) podría estar causada por las inapropiadas capacidades de cuantificación del ELISA para FIX debido al enmascaramiento del CTP del sitio antigénico.

T ab la 11: Relación de E C 50 m uestra/p lasm a

4 CTP Final HA 535

5 CTP Final HA 2,73

2.7 Estudio farmacocinético

FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵purificados en jacalina (Grupo A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague-Dawley (seis ratas por grupo de tratamiento) a una dosis de 250 pg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación (tabla 12). El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis.

Tabla 12: Plan de o eración del estudio PK

La concentración del FIX en las muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de estuches de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals). El perfil farmacocinético se calculó y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo. Los tiempos de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK Solutions 2.0 x. La tabla 13 más adelante resume las concentraciones de FIX calculadas en los diferentes puntos de tiempo de muestreo.

Tab la 13. Concentraciones de F IX calculadas

El perfil PK y un resumen de los parámetros PK se presentan en la tabla 14 más adelante y en la figura 11. Un perfil del análisis PK en todos los puntos de tiempo sugirió que la adición de 4 o 5 casetes de CTP al FIX no aumentó su tiempo de vida media en comparación con FIX-CTP³. El AUC después de la administración de FIX-CTP⁵aumentó en 1,4 a 1,6 veces frente a FIX-CTP³, el cual no fue estadísticamente significativo.

T l 14: P rfil PK r m n l ^ r m r PK

Dado que se demostró que las muestras a las 96 horas después de la dosificación tenían concentraciones de FIX muy bajas, que estaban por debajo del límite de cuantificación del ensayo, el tiempo de vida media terminal se recalculó para proporcionar un cálculo más preciso y científicamente adecuado (tabla 15). De acuerdo con este cálculo, se obtuvieron incluso las diferencias más pequeñas entre el tiempo de vida media de FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP5.

Tabla 15: Tiem o de vida media terminal recalculado

2.8 Conclusiones:

En este estudio, se evaluaron los parámetros farmacocinéticos y la actividad de coagulación potencial de FIX-CTP³, FIX-CTP⁴y FIX-CTP⁵. La fusión de 4 y 5 CTP al FIX no proporcionó una superior o mayor extensión del tiempo de vida media, en comparación con FIX-CTP³, y se observó una reducción de la actividad cromogénica. La tabla 16 más adelante resume la mejora en por ciento del tiempo de vida media para las diferentes variantes fusionadas FIX-CTP (1 a 5 CTP). La fusión de CTP al FIX mejoró su comportamiento farmacocinético, pero, de manera impredecible, esta mejora fue limitada. Sorprendentemente, después de la fusión de 3, 4 o 5 CTP en tándem al FIX, se calculó un valor similar del tiempo de vida media.

Tabla 16: Resumen del por ciento de mejora del tiempo de vida media

_______ _______

Estos datos sugieren que la fusión de 3 CTP al FIX produce una mejora máxima en el tiempo de vida media de la proteína, lo que confirma que FIX-CTP³es la variante óptima en términos de tiempo de vida media, estructura y actividad potencial de coagulación para el desarrollo clínico futuro.

Ejemplo 3

Tratamiento con FIX-CTP³del modelo de ratón hemofílico FIX-/-Como se describió anteriormente, se realizó un estudio que probó el perfil PK de las cosechas de FIX-CTP, FIX-CTP²y FIX-CTP³y la actividad de coagulación frente a rhFIX. FIX-CTP³mostró un mejor perfil PK a la vez que mantuvo su actividad de coagulación frente a las cosechas de FIX-CTP¹y FIX-CTP²o rhFIX. Para evaluar adicionalmente este resultado, se purificó la proteína FIX-CTP³Y-carboxiglutamato. FIX-CTP³muestra un aumento de 3 veces en el tiempo de vida media y un AUC 4,5 veces mayor en comparación con rhFIX en las ratas normales después de una única administración IV. FIX-CTP³demostró una reducción de la actividad cromogénica y de coagulación in vitro, muy probablemente debido a la escisión insuficiente del propéptido N-terminal y a modificaciones postranscripcionales (PTM) inadecuadas, tal como la gamma carboxilación adecuada.

En el estudio actual, se analizaron las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del FIX humano recombinante fusionado a tres CTP en tándem en ratones deficientes de FIX.

Propósito del estudio:

Determinar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de rFIX-(CTP)3 frente al rhFIX comercial (BeneFIX®) en ratones deficientes de FIX después de una única administración IV de FIX-(CTP)3 a una actividad específica y dosis similares (actividad específica similar a la PD y similar constante de FIX para la PK).

Producción de la cosecha de FIX-CTP³:

El ADNc de FIX (OriGene RC219065-Thr 148) fusionado en el extremo C-terminal a tres secuencias de CTP en tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de vitamina K3 a 25 ng/ml (Sigma, Mennadion). Se cultivaron cinco lotes separados que contenían 5 litros de suspensión celular (total de veinticinco litros) y se cosecharon después que la viabilidad disminuyó a 60-70 %. La cosecha se filtró y congeló a -70 °C.

Determinación del nivel del antígeno FIX de la cosecha:

El nivel del antígeno FIX de la cosecha se determinó mediante el uso de un estuche de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). El nivel del antígeno se calculó por cada lote. La concentración del FIX se mantuvo entre los diferentes lotes (tabla 17).

Tabla 17: Nivel del antígeno FIX

Nivel de antígeno FIX

l .n te

#1 Lot #2

Lot #3

P r . íp g /m J t 28,81 32,74 42,9

f tC V 3,34 3.38.2 9,4

Proceso de purificación de FIX-CTP³:

Después de un corto estudio de purificación, se realizó un proceso de purificación mediante el uso de las siguientes 3 columnas: DEAE sefarosa, Heparina sefarosa e hidroxiapatita cerámica HA Bio Rad tipo 1 (40 gm), FIX-CTP³. Se purificó la proteína enriquecida Y-carboxilada. En resumen: Se descongelaron cinco litros de cosecha clarificada a 4 °C durante un periodo de 4 días. Para cada lote de purificación, la cosecha clarificada (2 litros) se concentró 4 veces y se dializó contra Tris-HCl 20 mM pH 8,2 mediante el uso de un cartucho desechable de fibra hueca con un valor de corte del peso molecular nominal de 10 KDa. Este proceso (UFDF1) se realizó dos veces, y se cargó un litro de UFDF1 en columna de DEAE sefarosa, y el Factor IX se eluyó con Tris-HCl 20 mM, NaCl 200 mM, CaCl210 mM pH 8,2. El producto se diluyó 1:1 con Tris-HCl 20 mM, CaCl2 10 mM pH 7,5, y el pH se ajustó a 7,5 antes de cargar en la columna de Heparina sefarosa. La elución se realizó con Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, y CaCl2 10 mM pH 7,5. El producto eluido se concentró y dializó contra fosfato 10 mM pH 6,8 mediante el uso de una membrana con valor de corte de 10 KDa del casete Pellicon XL (UFDF2). El producto se cargó en una columna HA, y la fracción activada del Factor IX se eluyó con fosfato 150 mM pH 6,8. El producto de purificación se concentró hasta una concentración objetivo de 2 mg/ml y se dializó contra TBS pH 7,45, se dividió en alícuotas y se almacenó a -70 °C.

El proceso de purificación se repitió cinco veces, de manera semanal para purificar el volumen total (25 litros). Los procesos de purificación se denominaron HA# 6-10. Cada producto de purificación se evaluó separadamente (App # 1-5). Al final del proceso de purificación, los diferentes lotes se combinaron y se concentraron adicionalmente hasta una concentración objetivo de 4 mg/ml.

Propiedades analíticas de FIX-CTP³:

Determinación del nivel del antígeno FIX

El nivel del antígeno de la proteína FIX-CTP³enriquecida Y-carboxilada se determinó mediante el uso de un estuche de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). La concentración de proteínas calculada es el promedio de dos ejecuciones independientes (tabla 18).

Tabla 18: Nivel del antígeno FIX-CTP3

Transferencias de SDS-PAGE:

La proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP³, rhFIX y rFIXa (FIX activado) se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de Coomassie en SDS-PAGE se realizó mediante tinción del gel con el reactivo azul de Coomassie (800 ng de proteína) (figura 12). Una inmunotransferencia Western se realizó mediante el uso de 100 ng de proteína con Ac policlonal anti-FIX humano (figura 12B), anticuerpo monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics Cat #499, 3570) (figura 12C), Ac policlonal anti-propéptido de FIX (figura 12D), y Ac policlonal anti-CTP (figura 12E). Como se informó previamente, el FIX-CTP³migró a 75 KDa.

El procedimiento de purificación enriqueció significativamente la porción FIX-CTP³a la vez que redujo impurezas. El rendimiento del proceso de purificación fue muy bajo en el intervalo de alrededor de 2-3 % (datos no mostrados) debido al requisito de recolectar solo las fracciones FIX-CTP³Y-carboxiladas, como se demuestra en la inmunotransferencia anti-Gla (figura 12B). Basado en la tinción de Coomassie y la inmunotransferencia de FIX, la porción de FIX-CTP3 es solo de alrededor de 60-70 %, y también se detectaron bandas adicionales de menor peso molecular, presumiblemente con menos formas de glicosilación.

Actividad de coagulación de FIX-CTP3:

Actividad cromogénica de FIX-CTP3:

Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FIX-CTP³y de la proteína enriquecida ^y-carboxilada FIX-CTP³, frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). La cosecha de FIX-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano. Como se demostró previamente, la cosecha de FIX-CTP³fue 50 veces menos activa que el plasma humano mezclado (tabla 19, figura 13). Después de la purificación de FIX-CTP³, la actividad cromogénica mejoró significativamente y fue solo 4,72 veces menos activa que el plasma humano mezclado (tabla 19, figura 13). La actividad cromogénica reducida de la cosecha puede ser una consecuencia de inadecuadas modificaciones postranscripcionales de las variantes de la proteína FIX, por ejemplo, inapropiadas gamma carboxilación y escisión del propéptido. Después de la purificación y enriquecimiento de la fracción Y-carboxilada FIX-CTP3, la actividad fue mejor, lo que demuestra la contribución importante de la Y-carboxilación a la actividad del FIX.

Tab la 19: Actividad crom ogénica de F IX -C T P 3

Muestra EC» Relación de

1 ^H&/111Ii EC50

mu estro/piasen a

FIX-CTP³64,6 4,72

pur.

Ensayo de coagulación de una etapa (aPTT):

El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) es una medida de la integridad de las vías intrínseca y común de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo, en segundos, para que el plasma se coagule después de la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípido y calcio. Lo importante del ensayo fue cuantificar la capacidad de FIX-CTP3 para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano con agotamiento de FIX mediante la adición de rhFIX. Se mezclaron 200 gl de plasma humano deficiente de FIX con 25 gg/ml de FIX-CTP³y se diluyeron adicionalmente en TBS. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadieron 50 gl del activador de PTT (Actina FS) y 50 gl de calcio 25 mM a la mezcla, y se determinó el tiempo de coagulación en segundos mediante el uso de un Coagulador Sysmex® CA 1500 (realizado por Sheba hospital, Centro Nacional de Coagulación, mediante el uso de un ensayo de aPTT validado). La potencia se evaluó mediante la comparación de FIX-CTP3 con la curva de dosis-respuesta de una preparación de referencia de plasma mezclado normal humano. Los resultados se expresan en por ciento de actividad interpolada a partir de la curva estándar que incluye niveles de FIX de <1-110 %. FIX-CTP³mostró una reducción de 15-20 veces en su actividad de coagulación frente al plasma mezclado normal humano ya que la actividad de 5 gg/ml, que es el valor normal de FIX en el cuerpo, se demostró que fue de 6,5 % (tabla 20).

Tabla 20: Actividad de coa ulación de FIX-CTP³

FIX-CTP³también mostró aumento del tiempo de coagulación en comparación con BeneFIX® (tabla 21 y figura 14).

T ab la 21: T iem po de coagulación com parativo (a P T T )

Tiem o de coa ulación

Se realizó un ensayo de coagulación adicional de manera independiente en ratones deficientes de FIX por el Dr. Paul Monahan en la Universidad de Carolina del Norte antes de iniciar el estudio PK-PD. Los resultados de aPTT sugirieron que la actividad de coagulación de FIX-CTP³es 40 veces menor que el plasma humano mezclado normal como se demuestra por el periodo más prolongado (según se midió en segundos) y la mayor concentración necesaria para la actividad de coagulación adecuada (tabla 22).

T ab la 22: Actividad de coagulación com parativa

Actividad de FIX (unidades)

FIX-CTP 1 BeneFIX®

38ug/ml ^13,9

19 ug/ml

8,8

7,6 ug/ml _{4 116,8}

3,8 ug/ml

1,6

67,4

1,9 ug/ml _{0 ,9 41 ,7}

0,95 ug/ml 0,4

22,4

0,475 ug/ml _{8 ,5}

0,238 ug/ml

3,7

La actividad específica (u/ml), que se basó en el nivel del antígeno FIX según se calculó mediante ELISA para FIX-CTP³y BeneFIX®, fue de 4,46 y 198,9 respectivamente.

La inconsistencia en la actividad calculada de FIX-CTP³como se demuestra en los ensayos cromogénicos frente a aPTT puede explicarse por la sensibilidad superior del ensayo de aPTT y la relevancia in vivo. En el ensayo de actividad cromogénica, está presente una cantidad en exceso de los reactivos y enzimas lo que puede activar versiones de FIX menos potentes. La diferencia en los valores de actividad específica de FIX-CTP puede explicarse por el uso de diferentes reactivos y equipos automatizados. El valor de actividad según se calculó en la Universidad de Carolina del Norte se usó para el diseño del estudio PK-PD.

Detección de la proteína FIXa:

Para confirmar que después del proceso de purificación, no se produjo activación de FIX (FIXa), se realizó un ensayo de detección de FIXa mediante el uso del ensayo cromogénico de FIXa Biophen (Cat. # Ref. 221812). El ensayo mide la cantidad de FIXa presente en una muestra específica mediante el uso de la cascada de actividad cromogénica, como se describió previamente. FIX-CTP³y rhFIX se diluyeron y se evaluaron los niveles de FIXa. FIX-CTP³no se activó durante la purificación o el almacenamiento (tabla 23).

Tab la 23: Detección de FIXa

.Muestra ^FIX-rhFIX

CTP.

rFIXa BLQ 0.00487

img/ml)

Estudio PK-PD de FIX-CTP³: FIX-CTP³y rhFIX (BeneFIX®) se administraron en una única inyección intravenosa a los ratones C57BI deficientes de FIX en una dosis de 625 pg/kg de peso corporal que contenía 100 UI de FIX/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratones alternativamente a las 0,25, 4, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Se evaluó el nivel del antígeno hFIX, y se realizó un análisis PK detallado. Para evaluar la capacidad de FIX-CTP³de prolongar la actividad de coagulación de los animales deficientes del FIX en comparación con BeneFIX®, se calculó la actividad del FIX en muestras plasmáticas citratadas, extraídas de ratones tratados FIX-/-, mediante el uso de un ensayo automatizado de la actividad del FIX (tabla 24).

Tabla 24: Descri ción del estudio

Perfil farmacocinético de FIX-CTP³en ratones FIX-/-

La concentración del FIX se cuantificó mediante el uso de estuches de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y es la media de tres animales en cada punto de tiempo. La tabla 25 más adelante y la figura 15 resumen las concentraciones de FIX calculadas en los diferentes puntos de tiempo de muestreo para las cohortes 1 y 3. Más adelante se presentan el perfil PK y un resumen de los parámetros PK (tablas 26 y 27). También se realizó un análisis PK para la cohorte #2 para verificar la exposición (datos no mostrados).

T ab la 25: Concentraciones de FIX

Punto de KIX-CTP^jBeneFIX®

tiempo (horas) ni*/ml njj/nil

6,25 3645,397 2823,023

1 2411,06 2416,248

4 1703,205 1506,228

8 1139,736 864,764

16 415,32 347,465

24 238,37 158,7973

36 141,0105 94,40067

48 95.461 42,28833

72 76.90953 11,87567

% 24.955 81 Q

Se usó un módulo de dos compartimentos (programa informático WinLin) para determinar AUC0-inf, Tterminal y aclaramiento (CL). Los parámetros PK se describen más adelante en la tabla 26.

Tabla 26: Propiedades PK

Versión T4« 174 p A ir CL

del FIX (IThr) 1 J/hrl ng/nil hr ml/K)i/hr MRTihr) Yss

{inl/h£ ¹

BeneFIX® 3,4 12J 2242B 29 11,5 _{320 ,a}

FLX-CTPi 4 23,7 ₃₁₇₇₀19 22 425,2

La adición de los tres "casetes" de CTP al rhFIX prolongó el tiempo de vida media in vivo de FIX en al menos 2,5 veces. El AUC después de la administración in vivo de FIX-CTP³aumentó 2 veces frente a rhFIX. Los ratones inyectados con FIX-CTP³demostraron un mejor perfil PK en comparación con los ratones inyectados con BeneFIX®. Perfil farmacodinámico de FIX-CTP³en ratones deficientes de FIX:

En paralelo al muestreo de PK, los animales deficientes del FIX administrados con BeneFIX® o FIX-CTP³, las muestras plasmáticas citratadas, se evaluaron en cuanto a su actividad de coagulación mediante el ensayo de aPTT, que se tradujo a % de actividad. El % de actividad en cada punto de muestreo se calculó como el tiempo de coagulación actual/tiempo de coagulación del plasma mezclado de ratones normales * 100. La tabla 27 resume los valores de actividad después de la administración de BeneFIX® o FIX-CTP³.

Después de la administración de FIX-CTP³, se detectó una actividad de coagulación significativa una hora después de la administración que alcanzó el 96 % de actividad a las cuatro horas después de la dosificación, mientras que el mayor valor de actividad de BeneFIX® fue de 40 % (tabla 27, figura 16). La actividad de coagulación de FIX-CTP³se mantuvo durante un periodo de tiempo más prolongado, lo que demuestra una actividad prolongada. La actividad de coagulación para los ratones tratados con BeneFIX® no se detectó en los puntos de tiempo después de las 36 horas, mientras que los ratones tratados con FIX-CTP³mantuvieron una actividad medible a las 72 horas después de la dosificación (tabla 27, figura 16). El análisis del perfil farmacocinético del % de coagulación sugiere que la actividad de coagulación de FIX-CTP³se mantiene durante un periodo significativamente más prolongado y su tiempo de vida media es casi 2 veces mayor que para Benefix® (tabla 28).

Tab la 27: % de actividad de FIX

Horas después de BeneFlX® FIX-CTPj

la dosificación % de aclis idad % de actis idad

0,25 39,9 1,0

1 ^{33 ,4 15 ,5}

4 24,9 93,6

8 ^{18,8 65 ,2}

16 10,3 39,9

24 ^{1,7 11 ,9}

36 1,4 11,0

48 <l ^{4 ,6}

72 <l 1,4

Tabla 28: Actividad de coagulación

Versión T fx t T / t |1

dd FIX íl/hr) U/lir)

BeneFIX® 5,7

H X - C T P s 7 ,3 16

9.3 Reto de sangrado en ratones deficientes de FIX

Los ratones deficientes de FIX se administraron con una única inyección intravenosa de 100 UI/kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se comprimió ligeramente 48 horas después de la dosificación, y se evaluaron el tiempo de sangrado por la vena de la cola (TVBT) y la intensidad del sangrado (DO de hemoglobina). Un segundo reto de sangrado se realizó 15 minutos después de alcanzar la homeostasis, y se midieron los mismos parámetros. Después del primer reto de sangrado, el sangrado de los animales administrados con FIX-CTP3 fue significativamente menos intenso que el sangrado para BeneFIX® como se demuestra por los valores de DO de hemoglobina (figura 17).

Dado que se informó previamente que, durante el primer reto de sangrado en ratones hemofílicos, el tiempo de sangrado no necesariamente se correlaciona con la eficacia del tratamiento, se recomienda evaluar la homeostasis después de un sangrado adicional. Una vez que el primer sangrado se detuvo espontánea o manualmente, se realizó un segundo reto de sangrado 15 minutos después del primero, y se volvieron a medir el tiempo y la intensidad del sangrado. Durante el episodio del segundo sangrado los animales administrados con FIX-CTP³tuvieron una reducción del tiempo de sangrado y de la intensidad, lo que demuestra que FIX-CTP3 fue potente en puntos de tiempo más tardíos (figura 18).

Finalmente, los animales también se observaron durante las 12 horas después del segundo reto de sangrado, y se registraron todos los eventos de sangrado recurrentes. Los animales administrados con FIX-CTP³fueron capaces de mantener la homeostasis sanguínea durante las próximas 12 horas sin que volvieran a ocurrir eventos de sangrado. Por el contrario, el 50 % de los ratones tratados con BeneFIX® tuvieron episodios espontáneos de sangrado por la cola (tabla 29).

Tabla^ 29: Resultado 12 horas des ués del corte de la cola

FIX-CTP³recombinante, una proteína de fusión compuesta de una única molécula de FIX fusionada a tres "casetes" de CTP en tándem se desarrolló para abordar el corto tiempo de vida media de los productos de FIX disponibles actualmente que se usan para tratar a los pacientes con hemofilia B. Nosotros hemos demostrado que el tiempo de vida media de eliminación de rFIX-CTP3 fue consistentemente 2,5 a 4 veces más prolongado que el de rFIX en ratas (como se informó previamente) y en ratones deficientes de FIX.

Sin estar atados por la teoría, la proteína de fusión reduce el aclaramiento del FIX y protege al FIX de la actividad de proteasas, la degradación por enmascaramiento y reduce la afinidad del FIX por los receptores hepáticos. En conjunto estas características del dominio CTP extienden el tiempo de vida media de FIX.

Además del análisis farmacocinético de rFIX-CTP3, examinamos las propiedades farmacodinámicas de FIX-CTP³en ratones deficientes de FIX. rFIX-CTP3 y rFIX, se administraron en dosis comparables (en unidades) para compensar los niveles de deficiencia en la coagulación en los ratones deficientes de FIX. Sin embargo, el efecto de rFIX-CTP3 en los ratones deficientes de FIX se prolongó significativamente a al menos 76 horas después de la dosificación, para alcanzar un pico de actividad mayor. La actividad de coagulación de FIX-CTP³comenzó después de un retraso de 1 hora en comparación con BeneFIX®. La activación de FIX puede requerirse ya que la adición de tres CTP en tándem podría enmascarar teóricamente el sitio de activación y retrasar el inicio de la cascada. Después de la administración de FIX-CTP³, se observó una actividad máxima del 100 %, mientras que la actividad de BeneFIX® fue de solo 40 %. La actividad inicial superior es un parámetro muy importante y demuestra que la adición de 3 CTP tiene el potencial de mejorar la recuperación.

La terapia de reemplazo de FIX de manera profiláctica para los pacientes con hemofilia B ayuda a mantener los niveles plasmáticos de 1-2 % de la actividad de coagulación normal. El ensayo de sangrado por la vena de la cola es una prueba in vivo sensible que mide la capacidad para mantener la homeostasis del sangrado a valores bajos de actividad lo cual imita el modelo de homeostasis del sangrado en humanos. En respuesta al reto de sangrado por la vena de la cola 48 horas después de la dosificación, los animales administrados con rFIX-CTP3 mantuvieron la homeostasis sanguínea con episodios de sangrado más cortos y menos graves, lo que demuestra una actividad de coagulación sostenida.

FIX es una proteína compleja que contiene una serie de dominios funcionales que experimentan grandes modificaciones postraduccionales. Una de las modificaciones postraduccionales esenciales para la actividad del FIX es la gamma-carboxilación de los primeros 12 ácidos glutámicos en el dominio Gla por la Y-glutamil carboxilasa dependiente de la vitamina K. Esta modificación facilita la unión de FIX a las membranas fosfolipídicas y, por lo tanto, es crítica para su función. El FIX que no está gamma-carboxilado no es funcional, y por tanto la gammacarboxilación es una etapa limitante de la velocidad.

Este estudio PK-PD se realizó mediante el uso de células transfectadas transitoriamente. Se realiza una amplia evaluación analítica de las modificaciones postraduccionales en la proteína FIX-CTP³estable producida y secretada por un clon optimizado estable.

Basado en los datos presentados, el factor de coagulación FIX-CTP³tiene el potencial de reducir la frecuencia de inyecciones en los pacientes que reciben dosis profilácticas de rutina de una terapia de reemplazo de FIX. Se anticipa que rFIX-CTP3 puede conferir una protección prolongada contra la hemorragia después de cada dosis del factor, disminución de las unidades totales del factor necesarias para tratar los episodios de hemorragia, y/o mantenimiento de la hemostasis adecuada durante los procedimientos quirúrgicos con menos inyecciones.

Ejemplo 4

Generación y utilización del Factor de coagulación FVII

Una versión de acción prolongada del factor de coagulación Factor VII activado (FVIIa) será útil para el tratamiento de pacientes con hemofilia A y B. La proteína recombinante FVIIa-CTP3 tiene el potencial clínico de mejorar el tratamiento de pacientes de hemofilia mediante la reducción de la frecuencia de infusiones e incluso mediante la reducción de la carga del fármaco, lo que permite un enfoque de tratamiento profiláctico que puede mejorar significativamente la calidad de vida del paciente, evitar episodios espontáneos de hemorragia y daño acumulado a la articulación y otros órganos.

En la presente se describe la generación de una molécula FVIIa recombinante-CTP con un tiempo de vida media prolongado basado en la fusión del FVII con un CTP humano. El FVIIa recombinante-CTP se expresó en células de mamífero y se caracterizó in vitro e in vivo. Se demostró que la actividad de rFVII-CTP fue comparable con rFVII. Los estudios farmacocinéticos y de eficacia en ratas demostraron mejores propiedades del rFVII-CTP. Los resultados de este estudio demostraron que es posible desarrollar una molécula de rFVIIa con tiempo de vida media prolongado con propiedades hemostáticas muy similares a la enzima de tipo silvestre.

Clonación y expresión de la molécula de FVII recombinante: Se construyeron numerosos clones del Factor VII en nuestro vector de expresión en eucariotas (pCI-dhfrr) (figura 19). El clon de ADNc de FL verificado MGC humano (IRCM) que contiene la secuencia del factor de coagulación VII de homo sapiens se solicitó a "Open Biosystems" (OB-MHS4426). Los siguientes cebadores se sintetizaron por Sigma-Genosys en la siguiente secuencia: Cebador 67: 5'CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCC3' (contiene el extremo 5’ del ADN del Factor VII y el sitio de restricción de XhoI) (sec. con núm. de ident.: 5); Cebador 68R: 5' TCTAGAATAGGTATTTTTCCACATG3' (contiene el sitio de restricción de Xbal) (sec. con núm. de ident.: 6); Cebador 69: 5' TCTAGAAAAAAGAAATGCCAGC3' (contiene el sitio de restricción de Xbal) (sec. con núm. de ident.: 7); y Cebador 70R: 5'GCGGCCGCATCCTCAGGGAAATGGGGCTCGCA3' (contiene el extremo 3’ del ADN del Factor VII y el sitio de restricción de NotI) (sec. con núm. de ident.: 8).

La clonación se realizó en dos conjuntos de reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 67 y el cebador 68R mediante el uso de un ADNc plasmídico con la secuencia del factor VII (OB-MHS4426) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de —534 pb, se aisló y se ligó al vector de clonación TA (Invitrogen, núm. de catálogo: K2000-01). Se aisló un fragmento de XhoI -Xbal que contenía el amino terminal de la secuencia del factor VII. La segunda reacción se realizó con el cebador 69 y el cebador 70R y de nuevo, un ADNc plasmídico con la secuencia del factor VII (OB-MHS4426) se usó como molde. Como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de —813 pb y se ligó al vector de clonación TA (Invitrogen, núm. de catálogo: K2000-01). Se aisló un fragmento de XbaI-NotI que contenía el carboxilo terminal de la secuencia del factor VII. Los dos fragmentos se insertaron en nuestro vector de expresión en eucariotas pCI-dhfr (triple ligadura) para producir el clon 501-0-p136-1.

El plásmido 501-p136-1 (Factor VII en el vector pCI-dhfr) se digirió con las enzimas de restricción XhoI y KpnI. Se aisló un fragmento de —1186 pb. Un clon parcial del Factor VII (1180 pb-1322 pb) seguido por una secuencia CTP, una secuencia de terminación y una secuencia de NotI que se sintetizó por GeneArt (0721543) se digirió con las enzimas de restricción KpnI y NotI. Se aisló un fragmento de —253 pb. Los dos fragmentos se insertaron en nuestro vector de expresión en eucariotas pCI-dhfr (triple ligadura) para producir el clon 501-1-p137-2. pCI-dhfr-701-2-p24-2 se digirió con las enzimas de restricción XhoI y ApaI, y el fragmento grande (vector) se aisló.

pCI-dhfr-501-2-p137-2 (Factor VII-ctp x1) se digirió con las enzimas de restricción XhoI y ApaI, y se aisló un inserto de —1200 pb. El vector y el inserto se ligaron para producir 501-2-p139-2. Las células Dg44 se sembraron en placas para cultivo de tejidos de 100 mm y se cultivaron hasta una confluencia de 50-60 %. Se usó un total de 2 pg de ADN para la transfección de una placa de 100 mm mediante el uso del reactivo FuGene (Roche) en medio libre de proteína (Invitrogen CD Dg44). El medio se eliminó a las 48 horas después de la transfección y se reemplazó con un medio libre de proteína (Invitrogen CD Dg44) sin nucleósidos. Después de 14 días, la población celular transfectada se transfirió a matraces T25 para el cultivo de tejidos, y la selección se continuó durante 10-14 días hasta que las células comenzaron a crecer bien como un clon estable. Los clones con alta expresión se seleccionaron y se usaron aproximadamente 2x107 células para inocular 300 ml de medio de crecimiento en una botella tipo rodillo de 1700cm2 (Corning, Corning NY), suplementado con vitamina K3 a 5 ng/ml (menadiona bisulfato de sodio; Sigma). El medio de producción (cosecha) se recogió después de una disminución rápida en la viabilidad celular hasta alrededor de 70 %. El medio de producción se clarificó primero y después se concentró aproximadamente 20 veces y se dializó con PBS mediante el uso de un casete de filtración de flujo (10KDaMWCO; Millipore Corp, Billerica, MA).

Determinación del nivel del antígeno FVII

El ADNc que codifica al péptido CTP se fusionó al extremo 3’ del ADNc que codifica al FVII humano. La construcción de rFVII correspondiente se transfectó a las células Dg44. Como control, se utilizó un ADNc de rFVII humano. El medio de producción (cosecha) se recogió, se concentró y el FVII recombinante secretado se evaluó adicionalmente. Se determinaron los niveles de los antígenos rFVII, rFVII-CTP y rFVII-CTP-CTP mediante un estuche de ELISA para FVII humano AssayMax (AssayPro) (figura 20A). No se encontraron diferencias significativas en el nivel de secreción de rFVII-CTP y rFVII-(CTP)²en comparación con rFVII nativo.

Transferencias de SDS-PAGE

El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante la carga de 50 ng de cada proteína rFVII de cosecha, purificada o activada. Las muestras se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se llevó a cabo mediante la realización de una inmunotransferencia Western con el uso de un anticuerpo monoclonal anti-FVII humano (Ac) (R&D systems) o un anticuerpo policlonal anti-CTP generado en conejo.

El nivel del antígeno rFVII se correlacionó con el nivel detectado de proteína en una inmunotransferencia de SDS-PAGE con Ac anti-FVII. El rFVII-CTP migró como una única banda, mientras que el peso molecular correspondiente del control de FVII fue de aproximadamente 52 KDa (datos no mostrados). Ambas proteínas reaccionaron con los anticuerpos específicos para FVII en las inmunotransferencias. El rFVII-CTP también reaccionó con anticuerpos específicos para CTP. rFVII se secretó en su forma de zimógeno sin traza de la proteína activada.

Actividad cromogénica de FVII:

Las actividades de rFVII, de la cosecha de rFVII-CTP y de rFVII-(CTP)²se determinaron mediante el uso de un estuche de prueba cromogénica disponible comercialmente (estuche de ensayo para la actividad cromogénica del FVII humano AssaySense (AssayPro). Para la caracterización funcional del rFVII-CTP y su capacidad para activarse adicionalmente (FVIIa), el rFVII-CTP concentrado (cosechas) se colocaron en un estuche de prueba cromogénica disponible comercialmente que mide la capacidad de TF/FVIIa para activar el Factor X a Factor Xa que en presencia del sustrato específico de FXa libera una señal cuantificable (AssayPro). La adición del péptido CTP en el extremo C-terminal de la proteína rFVII no deterioró la actividad de serina proteasa del FVII (figura 20B, 20C).

Actividad de coagulación del FVII:

El tiempo de protrombina (PT) mide la vía de coagulación extrínseca. El PT es el tiempo (medido en segundos) necesario para que el plasma coagule después de la adición de un activador de la vía extrínseca, fosfolípido y calcio. Se usa para determinar la tendencia de coagulación de la sangre, específicamente en la medida de la dosificación de warfarina, daño hepático, y estado de la vitamina K. El intervalo de referencia para el tiempo de protrombina está usualmente alrededor de 12-15 segundos. Específicamente, el ensayo cuantificó la capacidad de la cosecha de FVII-CTP y FVII-(CTP)²para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano con agotamiento de FVII mediante la adición de rhFVII. Se mezclaron 300 pl de plasma humano deficiente de FVII con 100 pl de FVII, cosechas de FVII-CTP y FVII-(CTP)²a concentraciones específicas, o plasma humano normal mezclado y se diluyeron adicionalmente. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadió el factor tisular (TF), CaCl², y fosfolípidos a la mezcla. Se determinó el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de las cosechas de FVII-CTP y FVII-(CTP)²con una preparación de referencia que consistió en rh FVII o plasma humano mezclado. Una unidad de FVII activo se definió como la cantidad de FVII que iguala la actividad de un ml de plasma humano normal. La actividad de coagulación por PT de rFVII y rFVII-CTP se midió en un coagulómetro (Instrumentation Laboratory).

Como se mostró previamente, la adición de un péptido CTP en el extremo C-terminal de la proteína rFVII no afectó su actividad de serina proteasa y condujo a la iniciación y activación de un Factor X nativo y Factor IX en plasma humano. Después de la inserción de un CTP adicional en el C terminal, hubo una reducción de tres veces en la actividad de serina proteasa (datos no mostrados).

Estudio farmacocinético:

Las cosechas de rFVII, rFVII-CTP, y rFVII-(CTP)²se administraron por vía intravenosa a las ratas Sprague-Dawley (seis ratas por sustancia) con una dosis de 100 pg/kg de peso corporal. Para todos los experimentos in vivo, la cantidad de la proteína respectiva se determinó sobre la base de un estuche de ELISA para FVII. Para cada sustancia de prueba FVII, la cantidad inyectada se calculó teniendo en cuenta las diferencias en el peso molecular de rFVII frente a rFVII-CTP, lo que conduce a una concentración molar diferente.

Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital mediante el uso de un esquema de muestreo alternante para minimizar la interferencia del procedimiento de muestreo en los niveles a cuantificar: de 3 ratas a los 30 y 90 min y a las 2, 6 y 48 horas, y de las tres ratas restantes a los 15 y 60 min y a las 1,5, 4, y 24 horas alternativamente. El plasma se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. La concentración de FVII se cuantificó mediante un ensayo específico ELISA para FVII. El tiempo de vida media y el área bajo la curva (AUC) se calcularon mediante el uso de una regla trapezoidal lineal. La comparación de estos parámetros de aclaramiento reveló que el tiempo de vida media in vivo y el AUC de rFVII-(CTP)²son significativamente mayores que los de rFVII (tabla 30).

Tab la 30: Parám etros del estudio PK

(•rupo Via l)osK ^{T / j}A IC im CL/F MRT min itg/tnin/mi. mL/miiWkg min

FVII IV 4,07 3314,7 6,195 6,2

FVII* IV 60 B=51,06 31353,9 0,287 73,7

CTP FVII- IV 60 ^b=13,66 7626,8 1,18 15,4 CTP*

CTP

Caracterización de FVIIa recombinante-CTP:

Durante la activación, el FVII se escinde en R152 lo que resulta en que los dominios de las cadenas pesada y ligera se mantienen juntos por un único puente disulfuro. rFVIIa-(CTP)²se purifica y activa mediante un proceso de purificación en una columna de intercambio iónico. Para evaluar completamente el rFVIIa-(CTP)², la proteína se carga en SDS-PAGE en condiciones reductoras para el FVIIa comercial (NovoSeven®). Los dominios de la cadena pesada y la ligera se separan y migran como bandas separadas de pesos moleculares 55 y 25 KDa. Ambas proteínas reaccionan con anticuerpos específicos para FVII, pero la cadena pesada del rFVIIa-CTP reacciona específicamente con anticuerpos específicos anti-CTP, lo que indica que esta banda representa la cadena pesada de FVII fusionada al CTP. La cadena ligera reacciona específicamente con Ac anti-gamma carboxilasa. La concentración de la proteína FVIIa se determina mediante el estuche de ELISA específico para FVIIa.

Secuenciación del N-terminal de FVIIa:

rFVII-CTP-CTP en proteínas purificadas activadas o como zimógeno se separa mediante SDS-PAGE (en Tris-glicina al 12 %) y posteriormente se electrotransfiere a una membrana de PVDF. Las bandas de interés se cortan y se colocan en un filtro de fibra de vidrio purificado y tratado con Biobrene. El análisis de la secuencia del N-terminal se lleva a cabo mediante degradación de Edmann con el uso de un secuenciador de proteína líquida con pulsos, equipado con un sistema de microgradientes HPLC 140C. La identidad de la proteína recombinante y la adecuada escisión del propéptido se verifican adicionalmente mediante secuenciación del N-terminal.

Actividad de coagulación del FVIIa:

Para evaluar la actividad de coagulación de FVII-(CTP)², se realiza un ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT). La muestra de plasma deficiente de FVII se sustituye con rFVIIa (NovoSeven®) o rFVIIa-(CTP)². Se mezclan 300 |jl de plasma humano deficiente de FVII con 100 |jl de FVIIa o rFVIIa-(CTP)²a las concentraciones específicas, o plasma humano mezclado normal que se diluye adicionalmente. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añaden el factor tisular (TF), CaCl²y fosfolípidos a la mezcla. Se determina el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evalúa mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de rFVIIa-(CTP)²con una preparación de referencia que consiste en rhFVIIa o plasma mezclado normal humano. Una unidad de FVIIa se define como la cantidad de FVIIa que iguala la actividad de 1 ml de plasma humano normal. La actividad de coagulación por aPTT del rFVII y rFVIIa-(CTP)²se mide en un coagulómetro (Instrumentation Laboratory). La actividad de coagulación por aPTT de rFVIIa y rFVIIa-(CTP)²es similar.

Estudios farmacocinéticos en ratas:

Para caracterizar la influencia de la adición de CTP al rFVIIa sobre su potencial de longevidad, se realiza un estudio farmacocinético comparativo en ratas. NovoSeven® (rFVIIa) y rFVIIa-(CTP)²en TBS se inyectaron IV a 6 ratas SD. Los niveles de FVIIa en el tiempo se detectan mediante el uso de un estuche de ELISA para FVIIa. El tiempo de vida media y el AUC se calculan para cada proteína. La comparación de estos parámetros de aclaramiento revela que las medidas del tiempo de vida media in vivo, la recuperación y el AUC del rFVIIa-(CTP)²son superiores a las de NovoSeven®.

Modelo de eficacia de FVIIa-CTP in vivo (modelo de hemofilia en ratón deficiente de FVIII):

Para evaluar el modelo de actividad in vivo, se obtienen ratones con inactivación del FVIII, y se establece una colonia de reproducción. 10 jg de hFVIIa recombinante comercial (NovoSeven®) o rFVIIa-(CTP)²se inyectaron en la vena de la cola de un ratón con inactivación del FVIII anestesiado (22-28 g). La cantidad de proteína inyectada es igual a la concentración requerida de FVIII en el plasma normal (5 jg/ml). Las muestras de sangre se toman de la cola comprimida a los tubos capilares heparinizados en puntos de tiempo específicos. Las muestras de plasma se evalúan en cuanto a los niveles de FVIIa mediante ELISA, y la eficacia se mide mediante un ensayo de coagulación de PTT.

En este estudio, se genera una construcción de fusión del FVII con CTP. Esta proteína recombinante es la base para un tratamiento que proporciona un tiempo de vida media prolongado y retención de la potencia terapéutica.

Estos resultados sugieren que rFVIIa-(CTP)²tiene una eficacia terapéutica similar al rFVIIa en pacientes de hemofilia. Además, esta tecnología requiere una dosificación menos frecuente. Parece que una única inyección de rFVIIa-(CTP)²es suficiente para controlar los episodios de hemorragia y reducir la cantidad de inyecciones que se necesitan durante una intervención quirúrgica. Esta proteína recombinante puede usarse como un tratamiento profiláctico a largo plazo.

Ejemplo 5

Evaluación comparativa de FVII-CTP³, FVII-CTP⁴, y FVII-CTP⁵purificados

5.1 Objetivo del estudio

Evaluación comparativa de los parámetros farmacocinéticos y la actividad de coagulación de FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵frente a FVII-CTP³.

5.2 Producción de las cosechas de FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵

El ADNc del FVII fusionado en el extremo C-terminal a cuatro o cinco secuencias de CTP en tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de vitamina K3 a 20 gg/L (Sigma, Mennadion). La cosecha se recogió (300 ml), se filtró y congeló.

5.3 Producción de la cosecha de FVII-CTP³

FVII-CTP³se expresó en el laboratorio en sistema de expresión en mamíferos, células CHO, mediante el uso del vector pCI-DHFR. La mezcla estable transfectada #71 se cultivó en matraces de agitación, en presencia de vitamina K3 a 25 ng/L (Sigma). Las cosechas se recolectaron y filtraron.

Todas las cosechas de FVII-CTP (3, 4 y 5 CTP) se concentraron y dializaron contra TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) mediante el uso de Pellicon XL MWCO 10 kDa.

5.4 Determinación del nivel del antígeno FVII

El nivel del antígeno FVII se determinó mediante el uso de un estuche de ELISA para FVII humano (Zymotest HyPhen) (tabla 31). La concentración de proteínas calculada es el promedio de dos ejecuciones independientes.

T ab la 31: Nivel del antígeno FVII

Pr. i njj/ml l 224357.3 ^87884.1589423

SU ^{44789,5 3248.7 5309}

_{1 % c v}20,0 ^3,79 '

5.5 Inmunotransferencia de FVII-CTP

Las cosechas de FVII-CTP³, FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % (expedeon) mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del Ac policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ac anti-Gla (American Diagnostica).

El FVII fusionado a tres, cuatro y cinco CTP migró a 80, 90 y 100 KDa, respectivamente. Como se esperaba, las cosechas de FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵de Excellgene contienen bajo contenido de gamma carboxilación en comparación con la cosecha de FVII-CTP3 que se produjo en Prolor ya que el proceso de producción no se optimizó (figura 21).

5.6 Evaluación comparativa de la potencia de FVII in vitro

Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FVII-CTP³, FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵purificadas en HA (fracción altamente gamma carboxilada) frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Todas las muestras se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano. FVII-CTP³y FVII-CTP⁵demostraron menor actividad cromogénica que el plasma normal mezclado (figura 22). FVII-CTP⁴demostró mayor actividad como se refleja por las relaciones de EC50, en comparación con FVII-CTP3 y FVII-CTP5 (tabla 32).

Tab la 32: Actividad de coagulación de FV II in vitro

M

P

FVII3CTP 0,12 2,72

FVII 4CTP 0,03 0,71

FVII 3CTP 0,06 1,35

5.7 Actividad de coagulación del FVII in vitro:

El ensayo de actividad del Factor VII (FVII), que se realizó en Sheba Medical Center, Centro Nacional de Coagulación de Israel, es un ensayo basado en la protrombina (PT) mediante el uso de plasma inmuno-adsorbido deficiente en el Factor VII (Siemens). El reactivo del PT es innovin, y el ensayo se realiza en el instrumento CA 1500 Sysmex®. El intervalo normal del FVII está dentro de 55-145 %.

Dado que el nivel normal de FVII circulante en el cuerpo es alrededor de 0,5 pg/ml, las cosechas de FVII-CTP³y FVII-CTP⁵muestran reducciones de 3 veces en su actividad de coagulación frente al plasma mezclado normal humano; este resultado se correlaciona con la actividad cromogénica obtenida (tabla 33).

La cosecha de FVII-CTP⁴muestra un aumento de 3 veces en su actividad de coagulación potencial frente al plasma mezclado normal humano como se observa en el ensayo de actividad cromogénica (tabla 33). El porcentaje de actividad de FVII-CTP⁴es mucho mayor en comparación con el porcentaje de actividad de FVII-CTP³y FVII-CTP⁵. Las limitaciones metodológicas del método de ELISA pueden limitar la precisión de los cálculos del nivel de Ag de FVII-CTP4.

5.8 Estudio farmacocinético

Se realizaron dos estudios farmacocinéticos para determinar los parámetros farmacocinéticos (PK) de FVII-CTP³, FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵. Durante el primer estudio, FVII-CTP³, FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵(Grupos A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague Dawley (seis ratas por tratamiento) en una dosis de 250 gg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación (tabla 34). El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis.

Tab la 34: Diseño del estudio farm acocinético - C osecha concentrada

Grupo Elemento Niim. Mi de Nivel de VoL Conc. Puntos de tiempo de de prueba animales/ dosifi dosis (pg ¡mee- (pg/ml) (horas después de trata grupo, cación or lado la dosificación

La concentración de FVII en las muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de estuches de Elisa para FVII humano (Zymutest FVII-Biophen). El perfil farmacocinético se calculó y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo. Los valores del tiempo de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK Solutions 2.0. La tabla 35 más adelante resume las concentraciones calculadas de FVII en los diferentes puntos de tiempo de muestreo. El perfil PK (Figuras 23-24) y un resumen de los parámetros PK (tabla 36) también se presentan más adelante. FVII-CTP⁵demostró un perfil superior en comparación con FVII-CTP3y FVII-CTP⁴(tabla 36).

Tab la 35: Prim er estudio farm acocinético - Concentraciones de FVII

T a b la 36 : A n á lis is fa rm a c o c in é tíc o

Tiempo de vida media 2,5 4,9 6,6

(0,083-8 hr) (hofas)

La adición de cuatro o cinco CTP prolongó significativamente el tiempo de vida media del FVII en comparación con 3 CTP en 2 y 3 veces, respectivamente (tabla 36). Esta superioridad fue más significativa en la parte inicial del estudio (0,083-8 horas), lo que sugiere una mejor recuperación potencial de la proteína y reducción del aclaramiento extravascular. El AUC después de la administración de FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵aumentó en 3 y 4 veces, respectivamente, frente a FVII-CTP³. El aclaramiento también se redujo cuando se añadieron 4 y 5 CTP al FVII (tabla 36).

Como se observó en el estudio, la adición de cuatro y cinco CTP prolongó significativamente el tiempo de vida media del FVII en comparación con 3 CTP, tanto del tiempo de vida media inicial como terminal. Los valores del tiempo de vida media en el primer y segundo estudios son diferentes debido a un enfoque diferente del análisis que se realizó por la dosis y la duración del estudio, sin embargo, se mantuvo la tendencia general. El AUC después de la administración de FVII-CTP⁴y FVII-CTP⁵aumentó en 2,5 y 7 veces, respectivamente, frente a FVII-CTP³.

5.9 Conclusiones:

En este estudio, se evaluaron los parámetros PK y la actividad de coagulación potencial de FVII-CTP³, FVII-CTP⁴, y FVII-CTP⁵. La fusión de 4 y 5 CTP al FVII proporcionó un superior y mejor tiempo de vida media, exposición y reducción del aclaramiento en comparación con FVII-CTP³a la vez que se mantuvo una similar actividad cromogénica y de coagulación in vitro. Estos resultados se observaron a diferentes concentraciones de proteína y fueron consistentes para la proteína de la cosecha y la purificada. Al evaluar el efecto general de la fusión de CTP en el extremo C terminal al FVII, la fusión de 1-5 CTP aumentó considerablemente el tiempo de vida media y el AUC de FVII de una manera proporcional a los CTP, lo que sugiere que a medida que aumenta la porción CTP de la molécula, la longevidad y la estabilidad del FVII mejoran significativamente a la vez que mantiene su actividad de coagulación inicial in vitro, como se resume en la tabla 37 a continuación.

Como se informó previamente, el tiempo de vida media del FVII se correlaciona con el tiempo de vida media de la forma activada del FVII (FVIIa) en humanos y animales. Por lo tanto, se prevé que se obtendrá una mejora similar en el tiempo de vida media para las versiones activadas después de la fusión de CTP.

Ejemplo 6

Estudios de factibilidad del FVII-CTP³en ratones hemofílicos deficientes de FVIII

Se realizaron los estudios descritos anteriormente que prueban el perfil PK y la actividad de coagulación de las cosechas de FVII-CTP, FVII-CTP²y FVII-CTP³frente a un FVII comercial. FVII-CTP³mostró un mejor perfil PK a la vez que mantuvo su actividad de coagulación frente a las cosechas de FVII-CTP y FVII-CTP²o rhFVII. Para caracterizar adicionalmente las propiedades de FVII-CTP³ in vitro e in vivo, se generó una mini mezcla estable que expresaba y secretaba la proteína, y se desarrollaron procesos de purificación y activación.

En este estudio, las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de FVIIa-CTP3 se analizaron en ratones deficientes de FVIII. Se evaluó el perfil PK de la proteína. Se estableció un perfil PK basado en la actividad específica de FVIIa y en comparación con el producto comercial NovoSeven®. Además, se analizaron las capacidades hemostáticas a largo plazo in vivo de FVIIa-CTP3 para inducir la coagulación en ratones deficientes de FVIII después de un corte de la vena de la cola (estudio de supervivencia).

Objetivos del estudio:

Evaluar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de FVIIa-CTP3 frente al rhFVIIa comercial (NovoSeven®) en ratones deficientes de FVIII después de una única administración IV a una dosis de actividad similar.

Determinar la capacidad in vivo del FVIIa-CTP3 para mantener la homeostasis en ratones deficientes de FVIII mediante una única administración IV de FVIIa-CTP3 y NovoSeven® a una dosis de la actividad similar seguido por un reto de corte de la vena de la cola (estudio de supervivencia).

Producción de la cosecha de FVII-CTP³:

FVII-CTP³se expresó en el laboratorio en células Dg44 mediante el uso de un vector pCI-DHFR. La mezcla estable transfectada #71 se cultivó en matraces de agitación, en presencia de vitamina K3 a 25 ng/L (Sigma). La suspensión celular se cultivó y cosechó después que la viabilidad disminuyó a 60-80 %. La cosecha se filtró y congeló a -70 °C. Determinación del nivel del antígeno FVII de cosecha:

El nivel del antígeno FVII se determinó mediante el uso de un estuche de ELISA para FVII humano (Zymotest HyPhen) (tabla 38). El nivel del antígeno se calculó por cada lote de cosecha mezclado.

Tab la 38: Nivel del antígeno F V II-C T P ³

_______________

Proceso de purificación de FVII-CTP³(figura 25)

Descripción del proceso

Después de un corto estudio de purificación, se realizó el siguiente proceso de purificación mediante el uso de 2 columnas. La proteína enriquecida Y-carboxilada FVII-CTP³se purificó en columna de afinidad VII-Select (GE) e hidroxiapatita cerámica tipo 1 (HA), 40 pm (Bio Rad). La autoactivación se indujo mediante incubación de FVII-CTP³purificado en presencia de CaCl²durante la noche a 2-8 °C. El proceso de purificación está en su etapa final de desarrollo y se está optimizando, por lo tanto, parte de las etapas de purificación no son idénticas en los dos lotes. Ultrafiltración/diafiltración (UFDF) mediante el uso del casete de fibra hueca de 10 KDa o Pellicon

La cosecha clarificada se descongeló a 4 °C durante el fin de semana (2-3 días).

En el lote 31, la cosecha clarificada (12 litros) se concentró 4 veces (en dos ejecuciones sucesivas) mediante el uso de un cartucho de fibra hueca (GE Healthcare catálogo núm. UFP-10-C-4X2MA) con un valor de corte del peso molecular de 10 KDa. La cosecha concentrada se diafiltró contra 1-2 volúmenes de TBS (Tris 50 mM NaCl 150 mM pH 7,4).

En el lote 38, la cosecha clarificada (8,5 litros) se concentró 4 veces mediante el uso de un casete Pellicon 2 (Millipore) con un valor de corte del peso molecular de 10 KDa. La cosecha concentrada se cargó directamente en una columna VII-Select.

Ambas ultrafiltraciones se realizaron en hielo con tampones fríos. Las muestras UFDF se filtraron por 0,22 pm antes de la carga.

Captura en la columna FVII-Select

La cosecha por UFDF o concentrada se cargó en la columna VlI-Select (XK16/20, CV 18 ml), equilibrada previamente con TBS pH 7,4. La columna se lavó con Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,5M, pH 7,5, y FVII-CTP³se eluyó con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M 50 % (v/v), propilenglicol pH 7,5. El proceso se realizó en dos ciclos sucesivos con la utilización de la misma columna.

Separación basada en la gamma carboxilación en una columna de hidroxiapatita cerámica

El producto eluido se diluyó 1:10 con fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8 y se cargó en columnas de hidroxiapatita cerámica (XK16/20, CV 24 ml). La columna se lavó con fosfato de sodio 59 mM, pH 6,8 y la fracción rica ^y-carboxilada del Factor VII se eluyó con fosfato de sodio 500 mM, pH 6,8. Este proceso se realizó en dos ciclos sucesivos en la misma columna. En cada lote, los eluatos de los dos ciclos se combinaron y concentraron a 1,7-2 mg/ml y se diafiltraron con Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM pH 8,2 para reducir el volumen y preparar el material para la etapa de activación.

Activación de FVII

El FVII-CTP³purificado se diluyó a 1 mg/ml y se incubó en Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM y CaCl²1 mM, pH 8,2 a 2 8 °C durante 24 horas. La activación se terminó mediante intercambio del tampón (UFDF) al tampón de formulación preliminar (citrato 20 mM, NaCl 240 mM, glicina 13,3 mM, pH 6,9).

Propiedades analíticas de FVII-CTP³y FVIIa-CTP3:

SDS-PAGE y transferencias Western

El FVII-CTP³purificado, y FVIIa-CTP3 se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis del SDS-PAGE Coomassie se realizó mediante tinción del gel con el reactivo azul brillante de Coomassie (5 o 10 gg de proteína/carril). Se realizó un análisis por transferencia Western (1 gg de proteína/ carril) mediante el uso del Ac policlonal anti-FVII humano (R&D systems; AF2338), anticuerpo monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics catálogo #499, 3570), y Ac policlonal anti-CTP. En condiciones reducidas, el FVII-CTP3migró a 75 KDa, y FVIIa-CTP3 migró como dos bandas principales: una cadena pesada a 50 kDa, y una cadena ligera a 25 kDa, representado en la figura 26 como las bandas 2 y 3, respectivamente.

El procedimiento de purificación enriqueció significativamente la porción FVII-CTP³a la vez que redujo las impurezas. El rendimiento del proceso de purificación fue de 25-30 % de FVII (de acuerdo con ELISA). La mayor parte de la proteína perdida durante la purificación tenía baja actividad cromogénica del FVII o no tenía actividad. Basado en SDS-PAGE teñido con Coomassie, el FVIIa-CTP3 reducido contiene más bandas que las predichas. Una banda que migra a alrededor de ~75 kDa representa el FVII no-activado (figura 26, Banda 1). Esta banda consiste en dos bandas con diferencias menores de PM, que podrían reflejar diferente contenido de Y-carboxilación. Se observaron bandas adicionales con PM menor que 20 kDa. Previamente se informó que estos son productos de degradación de la cadena pesada.

Actividad cromogénica de FVII-CTP3:

Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FVII-CTP³, las fracciones durante el proceso, y FVII-CTP³purificado frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). La cosecha de FVII-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosisrespuesta con una preparación de referencia de plasma normal humano. Después de la purificación de FVII-CTP3, la actividad cromogénica mejoró significativamente, y las fracciones no activas se separaron principalmente mediante columna HA (figura 27). Se observó una fuerte correlación entre la actividad cromogénica de FVII y la detección de FVII con anticuerpos monoclonales anti-Gla en la transferencia Western. La potencia de la actividad cromogénica de FVII como se refleja por el valor de EC50 en la cosecha se afecta por ambas fracciones de FVII carboxiladas y no carboxiladas. Después de la purificación y el enriquecimiento de la fracción Y-carboxilada de FVII-CTP³, la actividad mejoró, lo que demuestra la contribución importante de la Y-carboxilación para la actividad de FVII (figura 27). Este parámetro es crucial para una adecuada actividad de FVII in vivo y se abordará adicionalmente en un programa de desarrollo de clones.

Determinación de proteínas por A280

El coeficiente de extinción teórico de FVIIa-CTP3 y NovoSeven® se calculó mediante el uso del algoritmo ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). El cálculo se basa en la secuencia de aminoácidos. Los coeficientes de extinción calculados para FVII-CTP³y NovoSeven® son 1,186 y 1,406, respectivamente. Estos valores representan la absorbancia de 1 g/L a 280 nm.

La diferencia de los coeficientes de extinción entre las dos proteínas se deriva solamente del aumento en el peso molecular de FVIIa-CTP3 en comparación con NovoSeven®, dado que el CTP carece de residuos aromáticos y de cisteína, por lo tanto, no contribuye a la absorbancia.

La determinación de proteínas por A280 se usa para FVII final, y para las muestras purificadas durante el proceso, que inició desde la elución de la columna VII-Select.

Determinación del nivel del antígeno FVIIa

El nivel del antígeno FVIIa se determinó mediante el uso del estuche de ELISA para FVIIa humano (IMUBIND, American Diagnostica). El nivel del antígeno se calculó por cada lote. Sin embargo, esta herramienta no fue útil para la determinación de la dosis para la inyección, ya que no representa la cantidad de producto activo.

Ensayo de coagulación de FVIIa- Staclot® VIIa-rTF

FVIIa se deriva de una escisión intracatenaria del FVII monocatenario. El factor tisular nativo (TF) es un cofactor de FVIIa. Después de la unión a TF, el FVII media la activación del Factor X a Xa, mientras que él mismo se transforma a FVIIa. El factor tisular soluble es la parte extracelular del factor tisular nativo. Éste ya no puede activar el FVII por autoactivación, pero el FVIIa unido al factor tisular puede activar FX a FXa.

El factor tisular soluble recombinante (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad al FVIIa para construir una prueba de coagulación con FVIIa. El rsTF, en presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos conduce a la coagulación del plasma, sin activar FVII a FVIIa.

El tiempo de coagulación observado en este sistema tiene una relación inversa con el contenido de FVIIa en la muestra analizada, sin interferencia de la presencia de FVII en la muestra.

El ensayo se realizó por Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel). La actividad de FVIIa se evaluó para ambos NovoSeven® después de la reconstitución y FVIIa-CTP3 antes de cada estudio. La actividad de NovoSeven® no se correlacionó con la actividad anticipada como se informó en el frasco, pero la discrepancia puede deberse a un enfoque diferente en la evaluación de la actividad. La tabla 39 resume la actividad de coagulación del FVIIa por volumen sin considerar la concentración de proteínas.

Actividad específica de FVIIa-CTP3

La actividad específica del FVIIa (que se calcula como la actividad/ml dividida por la concentración de proteínas) se calculó basada en A280 y se presenta en la tabla 40. Cuando se compara la actividad específica de las dos moléculas, que difieren en PM, debe realizarse la compensación para normalizar la actividad (es decir debido a la diferencia de peso molecular, la cantidad de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces mayor que en FVIIa-CTP3). El cálculo del factor de conversión se presenta en la siguiente ecuación:

Estudio PK-PD de FVIIa-CTP3:

Descripción del estudio

FVIIa-CTP3 y rhFVIIa (NovoSeven®, NS) se administraron en una única inyección intravenosa a los ratones C57B deficientes de FVIII a una dosis de 6,4E6 U/kg de peso corporal (160,000 U/animal). Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 4 ratones alternativamente a las 0,166, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, y 72 horas después de la dosificación (tabla 41). El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Se evaluó la actividad de coagulación del nivel de FVIIa, y se realizó un análisis PK detallado. El estudio se realizó por Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel).

Tabla 41: Descri ción^ del estudio

Perfil PK de FVIIa-CTP3 en ratones deficientes de FVIII

Se cuantificó la actividad de FVIIa en muestras de sangre mediante el uso de un estuche para VIIa-rTF Staclot® (Stago, Parsippany, NJ). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y representa la media de 4 animales en cada punto de tiempo. La figura 28 presenta el perfil PK de FVIIa a lo largo del experimento. La recuperación de FVIIa se presenta en la tabla 42. En la tabla 43 se presenta un resumen de los parámetros PK.

La tabla 41 resume los valores de la actividad de coagulación después de la administración de NovoSeven® o FVIIa-CTP³. FVIIa-CTP3 y NovoSeven® alcanzaron la actividad máxima media hora después de la dosificación. El valor más alto de la actividad de NovoSeven® alcanzó solo el 43 % del valor máximo de actividad de FVIIa-CTP3. La actividad de coagulación de FVIIa-CTP3 se mantuvo durante un periodo de tiempo más prolongado, lo que demuestra una actividad prolongada. La actividad de coagulación para los ratones tratados con NovoSeven® no se detectó en los puntos de tiempo más tardíos que 12 horas, mientras que los ratones tratados con FVII-CTP³mantuvieron una actividad medible a las 48 horas después de la dosificación (tabla 41 y Figura 28).

La adición de tres copias de CTP en tándem al FVIIa elevó la recuperación en 100 % (tabla 42), según se midió por la actividad más alta después de la dosificación y en comparación con la actividad anticipada basada en el análisis in vitro, y aumentó el tiempo de vida media y el tiempo medio de residencia (MRT) 5 veces. El tiempo de exposición (AUC) se incrementó 3 veces (tabla 43).

Tab la 41: Actividad de coagulación de FV IIa después de una única inyección IV

Tabla 42: Recuperación de FVIIa-CTP3

T ab la 43: Parám etro P K de F V IIa -C T P 3 vs. N ovoSeven®

Ensayo de generación de trombina (TGA)

La generación de trombina es una parte fundamental de la cascada de coagulación y como tal un estimado de cuán bien un individuo particular puede generar trombina puede correlacionarse con un riesgo de hemorragia o trombosis. Las variables medidas comúnmente cuando se analiza la generación de trombina incluyen: el tiempo de retraso, el tiempo hasta la generación máxima de trombina, el máximo, el potencial de trombina endógena [ETP] (es decir, el área bajo la curva y la cola), el curso de tiempo del trombograma ("TG"). Después de un tiempo de retraso, se observa un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTP3. La figura 29 presenta los valores de los parámetros de TGA para el plasma de ratones después de la administración de FVIIa-CTP3 o NovoSeven®. Después de la administración de FVIIa-CTP3, los tres parámetros (velocidad de generación de trombina, cantidad máxima de trombina generada y KIIa) demuestran una ventaja del tratamiento con FVII-CTP³sobre NovoSeven®. Esto reafirma adicionalmente la noción de la superioridad de la acción prolongada potencial del FVII-CTP³en comparación con NovoSeven®.

Estudio de corte de la vena de la cola (TVT) y FVIIa-CTP3:

Descripción del estudio

Los datos obtenidos de la prueba PK/PD para FVIIa-CTP3 proporcionó información sobre la funcionalidad del FVIIa-CTP³, y demostró que FVIIa-CTP3 tiene una ventaja farmacocinética cuando se compara con NovoSeven®. Sin embargo, la capacidad de la proteína para inducir un coágulo in vivo, después de un evento traumático todavía no se ha demostrado. Para evaluar la capacidad de FVIIa-CTP3 para detener la hemorragia, el mismo modelo de ratones deficientes de FVIII se empleó para un reto de sangrado.

Los ratones deficientes de FVIII se administraron con una única inyección intravenosa de FVIIa-CTP3 o NovoSeven®. Los ratones se dosificaron con el fármaco en cantidades que proporcionan una actividad de FVIIa equivalente (1,6E05 unidades, 200 pl), calculada de acuerdo con la potencia de cada fármaco evaluado en el ensayo de actividad de coagulación para FVIIa (tabla 44). Las dosis administradas fueron 9 mg/kg de NovoSeven®, y 40 mg/kg de FVII-CTP³debido a la actividad reducida de FVIIa-CTP3. Un grupo control se inyectó con 200 pl de vehículo.

La vena de la cola se cortó 2,7 cm desde la punta de la cola a los 15 min (inyección 1), 24 horas (inyección 2) o 48 horas (inyección 3) después de la administración, y la supervivencia de los ratones se registró durante 24 horas.

Tabla 44: Evaluación de las muestras inyectadas

La concentración de proteínas se determinó por A280.

Resultados

Los datos de los grupos control inyectados con vehículo para las tres inyecciones (5 animales x 3 inyecciones), se resumieron y se presentan en la figura 30. Se observó 30 % de supervivencia a las 24 horas después del corte de la vena de la cola.

Los ratones tratados con NovoSeven® y FVIIa-CTP3 demostraron adecuada actividad hemostática después del corte de la vena de la cola realizado 15 min después de la administración de FVIIa. Se observó un 100 % de la tasa de supervivencia en los animales tratados con FVIIa-CTP3 y NovoSeven® (figura 30).

La reducción de la velocidad de aclaramiento de FVII-CTP³que se demostró en el estudio PK/PD se aprecia más claramente después de un corte de la vena de la cola realizado 24 horas después de la administración. Se observa una disminución en la tasa de supervivencia de NovoSeven®. Similar al grupo control, se observa 50 % de muerte dentro de las 10 horas. Mientras tanto, el 90 % de los ratones tratados con FVIIa-CTP3 sobrevivieron (figura 30). Este resultado enfatiza la eficacia a largo plazo del tratamiento con FVIIa-CTP3.

48 horas después de la administración, se demostró una disminución en la tasa de supervivencia en los grupos tratados con FVIIa-CTP3 o NovoSeven® (figura 30C). Se observó una ligera mejora en los ratones con FVIIa-CTP, pero la diferencia no alcanzó significación estadística.

Discusión:

La fusión de CTP a proteínas recombinantes aumenta el tiempo de vida media en circulación de las proteínas a la vez que mantiene una actividad comparable. A la vez que el mecanismo detrás de la reducción del aclaramiento de la proteína por encima de un valor umbral de 70 KDa se entiende bien con respecto al aclaramiento renal, se logra una protección adicional después de la fusión de CTP. Se considera que la fusión de CTP barre alrededor del escudo proteico y lo protege de la escisión proteolítica, para aumentar su peso molecular radial debido a la carga altamente negativa y para reducir su afinidad con los receptores hepáticos de eliminación.

El presente estudio tuvo como objetivo proporcionar información específica sobre el impacto de la fusión de CTP al FVII sobre el tiempo de vida media y el aclaramiento de la proteína y además aborda el paradigma de su actividad específica después de esta modificación. Los ratones deficientes de FVIII se administraron con una única inyección IV de FVIIa-CTP3 o FVIIa recombinante comercial (NovoSeven®) en dosis similar (basada en la unidad) y se realizó un análisis basado en la actividad PK. FVIIa-CTP3 demostró una longevidad superior como se refleja por el aumento de 5 y 3,5 veces en su tiempo de vida media y AUC, respectivamente. La actividad específica (U/mg) de FVIIa-CTP según se calculó por el estuche para la actividad Staclot® dividido por la concentración de proteínas medida por A280 se demostró que fue 4-5 veces menor que la actividad específica de NovoSeven®.

Para contribuir a la comprensión de cómo el CTP afecta los efectos hemostáticos de FVIIa in vivo, se investigó la capacidad de FVIIa-CTP3 para reducir una hemorragia. En el modelo de hemorragia por corte de la vena de la cola en el modelo de ratones hemofílicos, la administración de rFVIIa puede mejorar la tasa de supervivencia de los animales retados y evitar su sangrado hasta la muerte. En el estudio descrito en la presente, los animales se administraron con FVIIa-CTP3 o NovoSeven®. Ambas moléculas fueron capaces de mantener la homeostasis cuando el corte se realizó 0,25 horas después de la dosificación. Se demostró una duración significativamente prolongada de la actividad para el grupo tratado con FVIIa-CTP3 cuando el corte de la cola se realizó 24 horas después de la dosificación. La tasa de supervivencia del grupo tratado con vehículo fue mayor que la anticipada y mayor que la obtenida en estudios anteriores (50 % frente a 20 % en estudios anteriores, datos no mostrados). El por ciento de supervivencia de los animales tratados también se evalúa en puntos de tiempo más tempranos, que incluyen a las 36 horas después de la dosificación.

En conclusión, se demostró que FVIIa-CTP3 tiene una duración aumentada de la actividad en los ratones hemofílicos lo que se traduce en una duración más prolongada del efecto hemostático en comparación con NovoSeven®. Los datos reunidos sugieren que la fusión de CTP a FVII es una tecnología con el potencial de mejorar significativamente el tratamiento profiláctico en pacientes con hemofilia.

Ejemplo 7: Evaluación comparativa del perfil de FVII-CTP³purificado frente a FVII-CTP⁵después de una inyección única IV o SC a ratas SD

Objetivo del estudio

Se llevaron a cabo dos estudios:

El objetivo del primer estudio fue determinar los parámetros farmacocinéticos de rFVII-CTP3 frente a rFVII-CTP5 después de la purificación en columna FVII select y HA en ratas macho Sprague Dawley, después de una única administración intravenosa de 50 gg/animal.

En el segundo estudio, los parámetros farmacocinéticos de rFVII-CTP3-HA frente a rFVII-CTP5-HA se examinaron en ratas macho Sprague Dawley después de una única administración intravenosa o subcutánea de 100 gg/animal. Resultados

Determinación del nivel del antígeno FVII-CTP 3 y FVII-CTP 5

El nivel del antígeno FVII se determinó mediante el uso del estuche de ELISA para FVII humano (Zymotest HyPhen) (Véase la tabla 45). T

Tabla 45. Resumen de la concentración de proteínas calculada, que es el promedio de tres ejecuciones

inde endientes.

Análisis por transferencia Western de las muestras examinadas

Las muestras de FVII-CTP3,5 se cargaron en 4-12 % de bisTrisgel (NuPage, Invitrogene) mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del Ac policlonal anti-FVII (R&D systems), Ac policlonal anti-CTP (Adar biotech production) o Ac anti Gla (American diagnostica). En resumen, el FVII fusionado a tres y cinco CTP migró a 80 y 100 KDa, respectivamente (véase la figura 31).

Evaluación comparativa de la potencia de FVII in vitro

El ensayo de actividad de FVII, que se realizó en Sheba Medical Center, el Centro Nacional de Coagulación, es un ensayo basado en PT con el uso de plasma inmunoadsorbido deficiente en factor VII (Siemens). El reactivo de PT es innovin y el ensayo se realiza en el instrumento Sysmex CA 1500. El intervalo normal del FVII está dentro de 55 145 %. Las actividades de las muestras se resumen en la tabla 46.

Tabla 46: Actividad de las muestras

El nivel normal de FVII circulante en el cuerpo es alrededor de 0,5 |jg/ml. Ambos, FVN-CTP³y FVII-CTP⁵muestran reducciones de aproximadamente 5 veces en su actividad de coagulación frente al plasma mezclado normal humano.

Estudio farmacocinético

Se realizaron dos estudios farmacocinéticos para determinar el perfil y los parámetros farmacocinéticos (PK) de FVII-CTP³y FVII-CTP⁵(después de la columna select para FVII y HA para FVII). En el primer estudio, FVII-CTP³, y FVII-CTP⁵después de la purificación de FVII por select/ HA se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague Dawley (seis ratas por sustancia) en una dosis de 50 jg/rata.

Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 hasta su análisis.

En el segundo estudio, solo se analizaron las muestras después de la columna HA. Estas muestras se administraron en una única inyección intravenosa o subcutánea a las ratas Sprague Dawley (seis ratas por sustancia) mediante el uso de una dosis de 100 jg/rata. Las muestras de sangre se recolectaron en los mismos puntos de tiempo y condiciones como en el primer estudio anterior.

Tabla 47. Diseño del primer estudio (FVII select frente a FVI1HA).

Tabla 18. Diseño del segundo estudio (IV frente a SC)

Las diferencias principales entre estos dos estudios son las dosificaciones y la vía de administración. En el primer estudio, las ratas se inyectaron IV con 50 pg\rata, mientras en el segundo estudio, las ratas se inyectaron IV o SC con 100 pg\rata (total 500) pg/kg; peso de las ratas 200 g). El aumento en la dosificación se debe al cambio en el tipo de administración; la administración SC requiere mayores cantidades para lograr efectos similares a la administración IV.

Análisis del estudio de PK

La concentración de FVII en las muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de estuches de Elisa para FVII humano (zymutest FVII-Biophen). Los perfiles farmacocinéticos se calcularon y reflejan la media para 3 animales en cada punto de tiempo. Los valores del tiempo de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK solutions 2.0. La tabla más adelante resume las concentraciones calculadas de FVII en los diferentes puntos de tiempo de muestreo. El perfil PK y un resumen de los parámetros PK se presentan en una tabla más adelante.

Tabla 49. Primer estudio farmacocinético (FVII select frente a FVII HA) -concentraciones de FVII (ng\ml).

Tabla 50. Segundo estudio farmacocinético (IV frente a SC) -concentraciones de FVII (ng\ml).

Tabla 51. Análisis PK- primer estudio farmacocinético (FVII S frente a HA).

La adición de cinco CTP prolongó el tiempo de vida media de FVII en comparación con 3 CTP. Ambas formas de 5 CTP (es decir FVIIS y FVII HA) se detectaron en los mayores puntos de tiempo (96 y 120 horas), mientras que FVII-3 CTP HA y FVIIS -3 CTP se detectaron hasta las 72 horas y 96 horas, respectivamente. Basados en este hecho, el tiempo de vida media de FVII-5 CTP es más prolongado que las variantes de 3CTP (véase la figura 32). La comparación del tiempo de vida media de todos los materiales examinados (3 y 5 CTP) en los mismos puntos de tiempo (8-72 horas) mostró que los tiempos de vida media son similares, aunque los de 5 CTP son considerablemente más prolongados (figura 32).

Tabla 52: Análisis PK - segundo estudio farmacocinético (IV frente a SC).

De nuevo, como se observó en el primer estudio, la adición de 5 CTP prolongó el tiempo de vida media de FVII en comparación con la adición de 3 CTP, en el tiempo de vida media inicial y terminal y en ambas formas de administración (IV y SC, véase la figura 33). Como se esperaba, después de la administración SC, FVII se detectó primero en la sangre a un punto de tiempo más tardío en comparación a cuando se administró IV.

En lo anterior, se resumieron dos estudios PK. El propósito principal del primer estudio fue verificar la diferencia entre FVII-3CTP y FVII-5 CTP después de 2 columnas diferentes: FVII select y FVI1HA. En nuestros estudios anteriores, se verificaron las proteínas de cosecha frente a las purificadas y se encontró que la diferencia entre las versiones 3 y 5 CTP del FVII fue mayor cuando se inyectó la cosecha a las ratas.

No hubo diferencia significativa entre los resultados de FVII 3\5 CTP después de ambas columnas, por tanto, se decidió inyectar FVII HA 3\5 CTP en el segundo estudio.

Ejemplo 8: Estudio de supervivencia con FVIIa-CTP3 (MOD-5014) en ratones decientes de FVIII después de una inyección subcutánea

Objetivo del estudio

Evaluar la eficacia de NovoSeven®, MOD-5014 (FVIIA-CTP³) y MOD-5019 (FVIIA-CTP⁵) en un estudio con corte de la vena de la cola, después de una administración subcutánea.

Propiedades analíticas de FVIIa-CTP3(MOD-5014) y FVIIa-CTPs(MOD 5019): Determinación de proteínas por A280 El coeficiente de extinción teórico de NovoSeven® se calculó mediante el uso del algoritmo ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). El cálculo se basa en la secuencia de aminoácidos. El coeficiente de extinción calculado para NovoSeven® es 1,406, y para MOD-5019 es 1,075 (los valores representan la absorbancia de 1 g/l a 280 nm). El coeficiente de extinción de MOD-5014 se determinó mediante un análisis de aminoácidos en Mscan. El coeficiente de extinción para MOD-5014 es 1,27.

Ensayo de coagulación de FVIIa - STACLOT VIIa-rTF

FVIIa se deriva de una escisión intracatenaria del FVII monocatenario. El factor tisular nativo (TF) es un cofactor de FVIIa, tras la unión al TF, el FVII media la activación del Factor X a Xa, mientras que él mismo se transforma a FVIIa. El factor tisular soluble es la parte extracelular del factor tisular nativo. Éste ya no puede activar el FVII por autoactivación, pero el FVIIa unido al factor tisular puede activar FX a FXa.

El factor tisular recombinante soluble (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad al FVIIa para construir una prueba de coagulación del FVIIa. El factor tisular recombinante soluble (rsTF), en presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos, produce coagulación del plasma sin activar FVII a FVIIa.

La actividad de FVIIa se evaluó para NovoSeven® reconstituido, y para MOD-5014 y MOD-5019 antes de cada estudio.

La actividad específica de FVIIa (que se calcula como la actividad/ ml dividida por la concentración de proteínas) se calculó basado en A280 y se presenta en la tabla 53. Cuando se compara la actividad específica de las dos moléculas, que difieren en el peso molecular, debe realizarse la compensación para normalizar la actividad (es decir debido a la diferencia de peso molecular, la cantidad de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces mayor que en MOD-5014 y 1,307 veces mayor que en MOD-5019). Por tanto, el cálculo del factor de conversión se presenta en la siguiente fórmula:

AE(FVHa-CTPj)

AE_normaSzada * X PM(FVII_CTP3) *

PM.(FVII_nativo)

AE(FVHa-CTP3)

x 53419,50a = AE(FVHa-CTP3) * 1,185

45079,10a

Tabla 53- Actividad específica de MOD-5014 en comparación con NovoSeven®

Descripción del estudio

La medición más significativa es la capacidad de la proteína para inducir un coágulo in vivo, después de un evento traumático. Para evaluar la capacidad de MOD-5014 para detener una hemorragia, se empleó el mismo modelo de ratones deficientes de FVIII para un reto de sangrado.

Los ratones deficientes de FVIII se administraron con una única inyección subcutánea de MOD-5014, MOD-5019 o NovoSeven®. Los grupos A y B se dosificaron con NovoSeven® y MOD-5014 respectivamente, en cantidades equivalentes a la actividad de FVIIa. El grupo C se dosificó con MOD-5019 en una cantidad equivalente a la proteína FVIIa como MOD-5014, para evaluar el factor crítico (actividad o cantidad de proteína). Las dosis administradas fueron 4,2 mg/kg de NovoSeven®, y 8,6 mg/kg de MOD-5014 y MOD-5019. La vena de la cola se cortó 2,7cm desde la punta de la cola, 12 horas después de la administración, y la supervivencia de los ratones se registró durante 24 horas.

Tabla 54 - Designación de los grupos

Resultados

Los datos del experimento se resumen en la tabla 55 y en la figura 34.

Tabla 55. Resultados del estudio de TVT

24 horas después de TVT, solo 11 % de los ratones inyectados con NovoSeven® habían sobrevivido. El 30 % de MOD-5014 y el 40 % de MOD-5019 habían sobrevivido hasta este punto de tiempo. MOD-5014 y MOD-5019 inyectados por vía subcutánea muestran mejor supervivencia de los ratones en comparación con NovoSeven®. Sin embargo, los resultados no son óptimos ya que más del 50 % de los animales murieron durante el experimento. El factor VIIa, como otros factores de coagulación, se inyecta normalmente por vía intravenosa, para que esté disponible directamente en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la presente invención muestra que las composiciones proporcionadas en la presente sorprendentemente se absorben más eficazmente en el torrente sanguíneo después de la administración SC. La posibilidad de administrar el FVIIa por vía subcutánea constituye una ventaja ya que puede usarse para aplicaciones profilácticas. Además, es mucho más fácil que los pacientes se inyecten ellos mismos las inyecciones subcutáneas, y son una ventaja cuando los pacientes son muy jóvenes y sus venas son pequeñas y difíciles de encontrar.

Por tanto, la aplicación subcutánea puede usarse para un tratamiento profiláctico,

Ejemplo 9: Estudio de PK-PD comparativo de MOD-5014 recombinante vs. NOVOSEVEN® después de una administración subcutánea en ratas SD

Objetivos del estudio

Determinar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de MOD-5014 frente a rFVIIa comercial en ratas SD después de una única administración SC.

Comparar dos experimentos independientes (05010 y 05034) que contienen los productos MOD-5014 originados a partir de dos clones diferentes (clon núm. 28 frente al 61) según sus parámetros farmacocinéticos.

Métodos experimentales

Animales

24 ratas SD machos arribaron de Harlan Laboratories Israel, Ltd, al menos 4 días antes de iniciar las inyecciones. Los animales eran adultos jóvenes saludables, de -200 gr al inicio del estudio. La variación del peso corporal de los animales en el momento de iniciar el tratamiento no debía exceder ± 20 % de la media del peso de cada sexo. El estado de salud de los animales usados en este estudio se examinó a su llegada. Solo los animales con buen estado de salud se adaptan a las condiciones del laboratorio y se usan en el estudio.

Ensayo de coagulación de FVIIa - STACLOT VIIa-Rtf

El factor tisular recombinante soluble (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad al FVIIa para construir una prueba de coagulación de FVIIa. rsTF, en la presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos produce coagulación del plasma, sin activar FVII a FVIIa.

Se evaluó la actividad de FVIIa para NovoSeven® después de la reconstitución y para MOD-5014 antes de cada estudio. La actividad específica de FVIIa se calculó basada en A280. Cuando se compara la actividad específica de las dos moléculas, que difieren en PM, debe realizarse la compensación para normalizar la actividad (es decir debido a la diferencia de peso molecular, la cantidad de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces mayor que en MOD-5014).

Programa informático PK solver

Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante el uso del programa informático PK solver. La curva de administración IV se analizó como bolo CA de dos compartimentos, y la administración SC como análisis trapezoidal lineal Log - NCA Extravascular. Se calcularon las especificaciones del tiempo de vida media, el AUC, el aclaramiento y la distribución de volumen y los parámetros de salida se estudiaron en comparación entre los grupos de los experimentos.

Materiales experimentales

Experimento núm. 05010:

A. NovoSeven® RT: (Lote # AU61553 preparado el 31.7.12*) Concentración de FVIIa por A280: 0,86 mg/ml. Ensayo de actividad de FVIIa Staclot: 56867 U/mg. Dosis inyectada: 946 pg/kg. *Mezcla de alícuotas de NovoSeven®, todas del mismo lote núm.

B. Clon 28: MOD-5014 RS12-001: 0,77 mg/ml** basado en A280. Ensayo de actividad de FVIIa Staclot: 34 162 U/mg. Dosis inyectada: 850 pg FVIIa/kg.

Experimento núm. 05034:

A. NovoSeven® RT: (Lote #AU61347 preparado el 1.1.13) Concentración de FVIIa por A280: 0,82 mg/ml, diluida a 0,4 mg/ml con tampón NS estéril. Ensayo de actividad de FVIIa Staclot: 55688 U/mg. Dosis inyectada: 360 pg/kg y 20047,7 U/kg.

B. Clon 61: MOD-5014 Lote 75: 1,9 mg/ml** basado en A280, diluida a 0,89 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 20 047,7 U/kg. Actividad de coagulación del FVIIa: 25 002* U/mg basado en el ensayo de actividad de FVIIa Staclot.

C. Clon 61: MOD-5014 Lote 81A: 2,36 mg/ml basada en A280 (filtrado en la mañana del día del estudio y se volvió a medir a 280 nm), diluida a 0,4 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 360 pg FVIIa/kg. Actividad de coagulación del FVIIa: 24943U/mg basada en el ensayo de actividad de FVIIa Staclot.

D. Clon 61: MOD-5014 Lote 81A: 2,36 mg/ml basada en A280, diluida a 0,89 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 20047,7 U/kg. Actividad de coagulación del FVIIa: 24943 U/mg basada en el ensayo de actividad de FVIIa Staclot.

Descripción de los estudios

Experimento núm. 05010

MOD-5014 y NovoSeven® se administraron en una única inyección intravenosa o subcutánea a las ratas SD en una dosis de 0,9 mg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron a partir del seno orbital del ojo de 3 ratas alternativamente a las 0,5, 4, 8, 12, 24, 34, 48 y 58 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a - 20 °C hasta su análisis. El estudio se realizó en "Science in Action", Nes-Ziona. Se evaluó el nivel de actividad de coagulación del FVIIa y se realizó un análisis PK detallado en Prolor-Biotech.

Tab la 55: D iseño del estudio 05010

Experimento núm. 05034

MOD-5014 y NovoSeven® se administraron en una única inyección subcutánea a las ratas SD en una dosis de 0,9 mg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron del seno orbital del ojo de 3 ratas alternativamente a las 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. El estudio se realizó en "Science in Action", Nes-Ziona.

Se evaluó el nivel de actividad de coagulación del FVIIa y se realizó un análisis PK detallado en Prolor-Biotech.

Tabla 56: Diseño del estudio 05034

Resultados

La actividad del FVIIa en las muestras de sangre se cuantificó mediante el uso del estuche STACLOT VIIa-rTF (Stago). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo.

Experimento núm. 05010

Después de la reducción de fondo: 15 mU/ml.

La figura 35 presenta el perfil PK de FVIIa después de la administración IV y SC de NovoSeven® o MOD-5014. En la tabla 57 se presenta un resumen de los valores de actividad del FVIIa para cada punto de tiempo. La administración IV y SC tienen un patrón PK diferente (véase la figura 35; después de la reducción de fondo: 15 mU/ml). La Cmáx después de la inyección IV es mayor que la obtenida después de la inyección SC, debido a la presencia del fármaco en la sangre inmediatamente después de la administración (medida a las 0,5 hora, tabla 57 y tabla 58). Sin embargo, después de la administración SC las moléculas del fármaco se transfieren a la matriz intracelular y los tejidos, por lo tanto, la Cmáx puede medirse solo después de 2 horas de la inyección. La recuperación total del fármaco después de la administración SC es menor que el valor de Cmáx después de la inyección IV.

8 horas después de la inyección, NovoSeven® manifestó un patrón PK igual cuando se inyectó IV o SC, (después de la reducción de fondo: 15 mU/ml, figura 35). Además, no se detectó actividad de coagulación para los ratones tratados con NovoSeven® en los puntos de tiempo después de las 12 horas, mientras que los ratones tratados con MOD-5014 retuvieron la actividad medible a las 58 horas después de la dosificación (tabla 57; después de la reducción de fondo: 15 mU/ml; figura 35).

Tabla 57. Actividad de coagulación del FVIIa de MOD-5014 frente a NovoSeven® después de la administración IV o SC

Tabla 58: Parámetros PK de MOD-5014 vs. NovoSeven® después de la administración IV o SC

Experimento núm. 05034

La figura 36 presenta el perfil PK de FVII a después de la administración SC de NovoSeven® o MOD-5017. Dos lotes diferentes del clon núm. 61 (#75 y #81) se examinaron a la misma concentración o las mismas unidades de actividad, en comparación con NovoSeven®. En la tabla 59 se presenta un resumen de los valores de actividad del FVIIa para cada punto de tiempo.

Los resultados indican un patrón PK similar después de la administración SC correspondiente a los experimentos anteriores. Además, no se detectó actividad de coagulación para los ratones tratados con NovoSeven® en los puntos de tiempo después de las 12 horas, mientras que los ratones tratados con MOD-5014 retuvieron una actividad medible a las 24 horas después de la dosificación (tabla 59 y figura 36; y después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8, 12 horas) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 horas)).

El clon núm. 61 lote #81 (D) Cmáx (1,301 mU/ml) fue menor que los valores de Cmáx del clon núm. 61 lote #75 (B) y NovoSeven® (A) (3,521 mU/ml y 5,908 mU/ml respectivamente), aunque todos se inyectaron con la misma actividad unitaria (tabla 6). Sin embargo, el lote #75 (B) y #81 (D) tienen las mismas unidades de actividad (559 mU/ml y 478 mU/ml respectivamente) medidas 8 horas después de la inyección (figura 36 y tabla 59; y después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8, 12 horas) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 horas)).

Tabla 59: Actividad de coagulación del FVIIa de MOD-5014 (Clon 61 #75, #81) frente a NovoSeven® después de una única administración SC.

Después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8,12 horas) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 horas).

Tabla 60: Parámetros PK de MOD-5014 (Clon 61 #75, #81) frente a NovoSeven® después de una única administración SC.

Este informe resume dos estudios PK; 05010 y 05034. Nuestro objetivo fue proporcionar información específica sobre el impacto de la fusión de CTP a FVII en el tiempo de vida media y el aclaramiento de la proteína en una administración subcutánea y abordar el paradigma de su actividad específica después de esta modificación. En estos estudios, las ratas SD se administraron con una única inyección SC de MOD-5014 originado de dos clones, y dos lotes diferentes, en comparación con el FVIIa recombinante comercial (NovoSeven®). Los componentes se inyectaron a una concentración similar de FVIIa (gg/Kg) o al mismo nivel de actividad (U/Kg) y se realizó el análisis basado en la actividad PK.

El propósito principal del primer estudio fue verificar los diferentes parámetros PK después de una administración IV y SC. Basados en este estudio podemos concluir que existe una diferencia entre el patrón PK medido después de una administración IV o SC. A un t1/2 de 7,78 horas medido después de la inyección SC de MOD-5014, y solo 4,2 horas después de la inyección IV. Los valores de AUC fueron los mismos (tabla 58).

El segundo estudio, sin embargo, estuvo destinado a las diferencias entre dos lotes de MOD-5014 clon núm. 61, que se inyectaron con la misma concentración de FVIIa o en igual unidad de actividad, en comparación con NovoSeven®. En este estudio demostramos que el clon 61 lote #75 manifestó mejores parámetros PK que el lote #81. El lote #81, que se inyectó al mismo nivel de actividad unitaria, tuvo menor Cmáx por un motivo desconocido. Además, se midió la misma Cmáx cuando se inyectó el clon 61 lote #81 en dos dosis diferentes (por la concentración de FVIIa o por la actividad unitaria), en lugar de 2,5 veces entre los dos valores de actividad. Después del análisis de ambos estudios en conjunto, podemos concluir que el clon 28 manifestó un parámetro de t1/2 prolongado que el clon 61 #75 (el mejor lote) después de la inyección SC (7,78 horas y 5,7 horas respectivamente, tabla 60). Podemos concluir además que las muestras en puntos de tiempo diferentes crean un patrón PK diferente,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un factor de coagulación modificado con péptido del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal de dicho factor de coagulación, y en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es:

a. un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31,

b. un polipéptido del factor VII (FVII) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25, o

c. un factor VII activado (FVIIa) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25;

para su uso en la reducción de hemorragias o hematomas excesivos en un sujeto

2. Un factor de coagulación modificado con péptido del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal de dicho factor de coagulación, y en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es:

para su uso en el mantenimiento de la homeostasis durante una cirugía o durante una intervención quirúrgica en un sujeto.

3. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde al menos uno de dichos CTP unidos está glicosilado.

4. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido del FIX modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de de la sec. con núm. de ident.: 31 o los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31.

5. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido del FVII modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25.

6. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido del FVIIa modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25.

7. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP se administra al sujeto en forma de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

8. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, mediante administración subcutánea.

9. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, mediante administración intravenosa.

10. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicho sujeto es un sujeto hemofílico, o es un sujeto que padece de una deficiencia de vitamina K o una enfermedad hepática.

11. El factor de coagulación modificado con CTP para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicho sujeto es un niño.