ES2847230T3 - Sistema, aparato y procedimiento de espectroscopía RAMAN para analizar, caracterizar y/o diagnosticar un tipo o naturaleza de una muestra o un tejido, tal como un crecimiento anómalo - Google Patents
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Abstract
Aparato de espectroscopía Raman (2100), que comprende: una primera fuente de iluminación (2106), configurada para dirigir una salida de iluminación colimada a un tejido (2104); un espectrógrafo Raman (2108), configurado para detectar simultáneamente espectros Raman de huellas (FP) y alto número de onda (HW) a partir de iluminación dispersada por el tejido; y un módulo informatizado de control y análisis (2116), que comprende, como mínimo, una unidad de procesamiento y memoria que almacena instrucciones de programa ejecutables por la, como mínimo, una unidad de procesamiento, para analizar subintervalos espectrales discretos de los espectros Raman en rangos de números de onda de FP y HW para identificar una coincidencia con picos específicos en los espectros Raman detectados de uno o ambos rangos de números de onda, caracterizado por que comprende, además: una fuente de iluminación adicional (2118) configurada para emitir iluminación adicional al tejido mientras la primera fuente de iluminación dirige la iluminación colimada al tejido y un filtro de espejo caliente (2120) configurado para compensar la interferencia de iluminación entre la iluminación colimada emitida por la primera fuente de iluminación (2106) y la iluminación adicional emitida por la fuente de iluminación adicional (2118).
Description
DESCRIPCIÓN
Sistema, aparato y procedimiento de espectroscopia RAMAN para analizar, caracterizar y/o diagnosticar un tipo o naturaleza de una muestra o un tejido, tal como un crecimiento anómalo
Estado de la técnica anterior
Los aspectos de la presente invención se refieren a un sistema de espectroscopía Raman y a un procedimiento para la identificación de precisión mejorada de un tipo o naturaleza de una muestra o un tejido al que se dirige la energía de excitación (por ejemplo, iluminación colimada), tal como un crecimiento anómalo o aparentemente anómalo (por ejemplo, tal como cáncer). En concreto, pero no exclusivamente, los aspectos de la presente invención permiten un diagnóstico de precisión mejorada, en tiempo real, de tejidos anómalos tales como crecimientos gastrointestinales, in vivo y ex vivo.
Es altamente deseable caracterizar e identificar con precisión y rapidez la naturaleza de tejidos tales como crecimientos gastrointestinales neoplásicos por medio de técnicas mínimamente invasivas, tales como la endoscopía. Por ejemplo, el cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad común con una alta tasa de mortalidad cuando se descubre en una etapa tardía. La identificación y erradicación de pólipos neoplásicos es una de las medidas más importantes para reducir la mortalidad y la morbilidad colorrectal. La diferenciación entre pólipos hiperplásicos que presentan poco o ningún riesgo de transformación maligna y adenomas con latencia de malignidad prominente sigue siendo un reto clínico utilizando técnicas de colonoscopia convencionales.
Con más de 1,2 millones de nuevos casos de cáncer y estimándose que anualmente se producen 608.700 muertes, el CCR es un problema importante en el mundo moderno. La identificación temprana de pólipos precancerosos (es decir, adenoma) en las etapas curables, junto con intervenciones terapéuticas apropiadas, tales como polipectomías o resecciones endoscópicas de la mucosa (REM), siguen siendo las medidas más importantes para reducir la mortalidad y la morbilidad colorrectal. Los enfoques colonoscópicos existentes adolecen de una serie de limitaciones clínicas fundamentales. Esto se debe a que la colonoscopia convencional se basa por completo en la visualización de las características mucosales macroscópicas de los pólipos, tales como patrones de fosas, patrones vasculares, etc., y proporciona poca o ninguna información biomolecular acerca del tejido. Por lo tanto, los estándares de atención médica actuales recomiendan la resección de todas las lesiones polipoides sospechosas o crecimientos anómalos identificados durante los exámenes colorrectales. Este enfoque requiere mucha mano de obra, da lugar a evaluaciones histopatológicas de alto coste, y tiene como resultado un riesgo innecesario para el paciente, ya que entre un tercio y la mitad de todas las lesiones polipoides resultan ser hiperplásicas. Aunque el riesgo absoluto de polipectomía se considera relativamente pequeño, sigue siendo la causa más común de complicaciones, tales como sangrado, perforación, etc. durante la colonoscopia. Teniendo en cuenta los retos clínicos existentes y la reciente introducción de programas poblacionales extendidos de cribado colorrectal, la necesidad de enfoques endoscópicos avanzados nunca ha sido mayor. Por lo tanto, la investigación reciente se ha dirigido al desarrollo de técnicas de formación de imágenes y espectroscopía molecular más sofisticadas para mejorar el diagnóstico y análisis in vivo.
La evidencia ha confirmado que la aplicación de la espectroscopía Raman ex vivo en muestras de tejido de colon proporciona precisiones alentadoras, que van del 89 % al 99 % para la discriminación entre diferentes tipos patológicos (es decir, pólipos normales, hiperplásicos, adenoma y adenocarcinoma). Esto todavía requiere la extirpación de los pólipos para que la espectroscopía Raman identifique la naturaleza de los tipos patológicos y, por lo tanto, tiene los mismos problemas que las técnicas endoscópicas convencionales mencionadas anteriormente. Además, ha habido muchas barreras para la traducción de la espectroscopía Raman en diagnósticos clínicos in vivo. Estas, incluyen limitaciones técnicas tales como dispersión Raman inherentemente débil de un tejido, tiempos de obtención prolongados (> 5 s) y una necesidad fundamental para desarrollar diseños de sonda de fibra óptica miniaturizados largos (> 1,9 m) con baja interferencia de sílice fundida, alta eficiencia de recogida y capacidad de resolución en profundidad. La sonda tiene que estar fabricada con un bajo contenido de sílice fundida, ya que la sílice fundida tiene una señal Raman fuerte y un fondo de fluorescencia que interferirá con la señal Raman débil de un tejido. Hasta la fecha, estas limitaciones técnicas siguen sin ser resueltas.
Los recientes avances tecnológicos, incluido el desarrollo de técnicas de espectroscopía Raman rápida y sondas Raman de fibra óptica miniaturizadas con capacidad confocal, han permitido evaluaciones histopatológicas en tiempo real in vivo (es decir, biopsia óptica) durante la endoscopía en curso. Los estudios de espectroscopía Raman de pólipos colorrectales han tendido a limitarse al llamado rango espectral de huellas (FP, fingerprint) (por ejemplo, entre 800 y 1800 cm-1). Se ha dirigido cierta atención hacia la utilización de un régimen de alto número de onda (Hw, high-wavenumber) (por ejemplo, entre 2800 y 3600 cm-1) ya que este rango espectral presenta señales Raman de tejido más fuertes, así como menos interferencias del fondo de sílice de las sondas Raman de fibra óptica. Los documentos de Patente WO2014/129970 A y US2013231573 A1 dan a conocer ejemplos de dichas técnicas.
En la actualidad, no obstante, no existen técnicas que permitan la identificación de células cancerosas in vivo que tengan suficiente precisión para hacer de este tipo de técnica una opción viable. Existe una necesidad de técnicas espectroscópicas Raman que permitan una identificación de mayor precisión de células cancerosas in vivo y ex vivo.
Un objetivo de las realizaciones según la presente invención es superar, como mínimo, algunos de los problemas asociados con la técnica anterior y las técnicas endoscópicas actuales para caracterizar, identificar y/o diagnosticar el tipo y/o la naturaleza del tejido o tejidos tales como crecimientos anómalos, por ejemplo, cánceres y similares en prácticamente cualquier parte del cuerpo. Otro objetivo es dar a conocer un sistema y un procedimiento de precisión mejorada basados en espectroscopía Raman para caracterizar, identificar y/o diagnosticar rápidamente el tipo o la naturaleza de tejidos anómalos, tales como pólipos y precáncer, in vivo durante investigaciones endoscópicas (por ejemplo, investigaciones endoscópicas gastrointestinales, tales como la colonoscopia).
Características de la invención
Según la presente invención, se da a conocer un aparato de espectroscopía Raman, según la reivindicación 1 adjunta, y un procedimiento de espectroscopía Raman, según la reivindicación 8 adjunta.
Diversas realizaciones según la presente invención describen un sistema y un procedimiento para la espectroscopía Raman de fibra óptica, que proporcionan una técnica espectroscópica vibratoria sin etiquetas que permite una biopsia óptica de mayor precisión a nivel biomolecular in vivo. Múltiples realizaciones permiten una combinación de mediciones simultáneas de rangos espectrales de FP y HW durante la endoscopía en curso. La justificación para combinar los rangos espectrales FP y Hw para las mediciones Raman in vivo y ex vivo son diversas:
(i) Para tejidos que podrían mostrar una autofluorescencia intensa (por ejemplo, tejido gástrico, pulmón, colon, hígado) que superan las señales Raman tisulares en el rango de FP, el rango de hW aún puede contener picos Raman tisulares intensos con información de diagnóstico.
(ii) Los rangos de FP y HW contienen información biomolecular complementaria (por ejemplo, de proteínas, lípidos, ADN y agua) y, por lo tanto, pueden mejorar la caracterización y el diagnóstico de los tejidos.
(iii) Los diferentes enlaces vibran en diferentes rangos espectrales, por lo que la utilización de dos rangos espectrales diferentes (de FP y HW) aumenta la información biomolecular obtenida en un solo escaneo.
Según una realización de la presente invención, una técnica de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW combinada (por ejemplo, que implica la obtención simultánea de espectros de FP y HW) puede mejorar el diagnóstico en tiempo real de cáncer, precáncer y/u otros crecimientos anómalos in vivo durante los exámenes del cuerpo. La técnica combinada de FP y HW también se puede utilizar ex vivo en muestras de tejido, para identificar con mayor precisión los tipos de crecimiento anómalo presentes en las muestras de cualquier parte del cuerpo. Según un aspecto de la presente invención, un aparato de espectroscopía Raman incluye: una primera fuente de iluminación configurada para dirigir la iluminación hacia un tejido; un espectrógrafo Raman, configurado para detectar simultáneamente espectros Raman de FP y HW a partir de iluminación dispersada por el tejido; y un módulo de análisis y control informatizado, que comprende, como mínimo, una unidad de procesamiento y una memoria que almacena instrucciones del programa ejecutables por la, como mínimo, una unidad de procesamiento para analizar subintervalos espectrales discretos (por ejemplo, aproximadamente entre 3 y 15 o aproximadamente entre 5 y 10 subintervalos espectrales discretos, donde uno determinado, o cada subintervalo espectral puede tener un ancho espectral de entre aproximadamente 10 y 30 cm-1 o de aproximadamente 20 cm-1) de los espectros Raman detectados en rangos de longitud de onda de FP y HW para identificar una coincidencia con uno o varios marcadores de referencia en uno o en ambos rangos de longitud de onda.
En múltiples realizaciones, el espectrógrafo Raman tiene una única rejilla de difracción de banda ancha. La primera fuente de iluminación incluye una fuente de iluminación colimada para generar una energía de excitación para aplicar al tejido, y el aparato incluye, además, una sonda, para transmitir la iluminación colimada al tejido y devolver los espectros Raman detectados desde el tejido al espectrógrafo Raman.
El uno o varios marcadores de referencia pueden incluir, o ser picos específicos en los espectros Raman detectados. El módulo de análisis y control informatizado puede incluir instrucciones de programa ejecutables por la, como mínimo, una unidad de procesamiento para diagnosticar un crecimiento anómalo en base a la coincidencia. La sonda puede incluir, o ser una sonda de fibra óptica confocal. El aparato puede incluir, además, un endoscopio que tiene un cuerpo cilíndrico alargado que tiene un canal de instrumentos en cuyo interior está alojada la sonda. El módulo informatizado de control y análisis puede incluir instrucciones de programa ejecutables por la, como mínimo, una unidad de procesamiento para ajustar dinámicamente la potencia de la iluminación colimada, y/o ajustar dinámicamente el tiempo durante el cual el tejido está expuesto a la iluminación colimada.
El aparato puede incluir un aparato de calibración, configurado para estandarizar la sonda o todo el aparato Raman con respecto a, como mínimo, una referencia de calibración.
El aparato puede incluir una fuente de iluminación adicional configurada para emitir iluminación adicional al tejido; y un filtro de espejo caliente configurado para compensar la interferencia de iluminación entre la iluminación emitida por la primera fuente de iluminación y la iluminación adicional emitida por la fuente de iluminación adicional.
Según un aspecto de la presente invención, un procedimiento realizado por un aparato de espectroscopia Raman incluye: dirigir la iluminación emitida por una primera fuente de iluminación a un tejido; detectar simultáneamente por medio de una sonda espectros Raman de FP y HW a partir de iluminación dispersada por el tejido; y analizar subintervalos espectrales discretos en los espectros Raman detectados (por ejemplo, entre aproximadamente 3 y 15 o entre aproximadamente 5 y 10 subintervalos espectrales discretos, donde uno determinado, o cada subintervalo espectral puede tener un ancho espectral comprendido entre aproximadamente 10 y 30 cm-1 o de aproximadamente 20 cm-1) en los rangos de longitud de onda de FP y HW para identificar una coincidencia con uno o varios marcadores de referencia en uno o ambos rangos de longitud de onda.
La detección simultánea de espectros Raman de FP y HW puede incluir iluminación difractante en los rangos de longitud de onda de FP y HW utilizando una única rejilla de difracción de banda ancha.
El procedimiento puede incluir diagnosticar la naturaleza de un crecimiento anómalo basándose en la coincidencia. El uno o varios marcadores de referencia pueden incluir, o ser picos específicos en los espectros Raman detectados.
El procedimiento puede incluir, además, ajustar dinámicamente la potencia de la iluminación y/o ajustar dinámicamente el tiempo durante el cual el tejido está expuesto a la iluminación.
El procedimiento puede incluir realizar un procedimiento de calibración o estandarización para estandarizar la sonda o todo el aparato Raman con respecto a, como mínimo, una referencia de calibración antes de iluminar el tejido. El procedimiento puede incluir, además, dirigir iluminación adicional hacia el tejido utilizando una fuente de iluminación adicional, dirigiendo al mismo tiempo la iluminación emitida por la primera fuente de iluminación al tejido; y compensar la interferencia de iluminación entre la iluminación emitida por la primera fuente de iluminación y la iluminación adicional emitida por la fuente de iluminación adicional utilizando un filtro de espejo caliente.
A continuación, se hará referencia, a modo de ejemplo, a los dibujos adjuntos para proporcionar una mejor comprensión de las realizaciones según la presente invención. Los dibujos no deben ser interpretados como limitativos y las dimensiones pueden no estar a escala.
La figura 1 es un diagrama esquemático de un sistema de espectroscopía Raman confocal para el diagnóstico y la caracterización de tejidos in vivo, según una realización de la invención;
la figura 2 es un diagrama de bloques de un sistema de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de banda ancha, desarrollado para el diagnóstico y la caracterización de tejidos de precisión mejorada durante la endoscopía, según una realización de la invención;
la figura 3 es un gráfico de espectros Raman y de autofluorescencia concomitante in vivo de FP y HW de banda ancha, y obtenidos de mucosa gastrointestinal (GI) en tiempo real, según una realización de la invención;
la figura 4 es un gráfico que muestra un ejemplo de selección de intervalos aplicada a espectros Raman y de autofluorescencia concomitante in vivo de banda ancha, que comprenden zonas tanto de huella (FP) como de alto número de onda (HW), según una realización de la invención;
la figura 5 es un gráfico que muestra un ejemplo de selección de intervalos aplicada a espectros Raman de banda ancha in vivo después de la sustracción del fondo de autofluorescencia en la zona (a) entre 800 y 1800 cm-1 y (b) ente 2800 y 3100 cm-1 respectivamente, según una realización de la invención;
la figura 6 es un gráfico que muestra los espectros Raman más o menos una desviación estándar de tres lesiones y fotografías asociadas de las tres lesiones, según una realización de la invención.
la figura 7A es un gráfico de espectros de diferencia que resuelve las características espectrales, según una realización de la invención.
la figura 7B es un análisis de varianza (ANOVA) de tres categorías de tejido sobre un rango espectral completo, según una realización de la presente invención;
la figura 7C es un histograma de picos Raman significativos, según una realización de la presente invención; las figuras 8A a D son secciones histopatológicas teñidas correspondientes a diferentes tipos de tejido colorrectal, según las prácticas conocidas;
la figura 9A es una representación de la probabilidad a posteriori, según una realización de la presente invención.
la figura 9B es un gráfico de características operativas del receptor (ROC, Receiver Operating Characteristics) para diagnosticar adenoma y adenocarcinoma, según una realización de la presente invención.
la figura 10 es un gráfico de características operativas del receptor para distinguir un adenoma frente a pólipos benignos, según una realización de la presente invención;
la figura 11A muestra la desviación estándar promedio de espectros Raman de FP/HW in vivo ±1 de un conjunto de datos de aprendizaje (80 % de un conjunto de datos total) para el desarrollo de algoritmos de diagnóstico para carcinoma de células escamosas esofágicas (CCEE), según una realización de la presente invención;
la figura 11B muestra la desviación estándar de espectros de diferencia (CCEE - normal) ±1, que resuelve las características espectrales únicas del CCEE, e imágenes correspondientes de procedimientos Raman de FP/HW guiados por WLR sobre un esófago normal y un CCEE, según una realización de la presente invención;
la figura 12A muestra la prueba t de Student bilateral no apareada sobre intensidades de pico Raman de un conjunto de datos de aprendizaje (80 % del conjunto de datos total) (normal (n = 736); CCEE (n = 202)) sobre un rango espectral completo (es decir, entre 800 y 1800 cm-1 y entre 2800 y 3600 cm-1), donde múltiples (por ejemplo, siete) subzonas de espectros Raman que contienen la información de diagnóstico más relevante fueron identificadas según una realización de la presente invención;
la figura 12B muestra un histograma ±1 SD de los picos Raman más significativos para el diagnóstico (* p < 1E-10), según una realización de la presente invención;
la figura 13A muestra secciones histopatológicas teñidas con hematoxilina y eosina representativos, correspondientes a epitelio escamoso queratinizado superficial normal y a la capa basal;
la figura 13B muestra secciones histopatológicas representativas teñidas con hematoxilina y eosina correspondientes a carcinoma invasivo de células escamosas esofágicas que muestra una prominente atipia arquitectónica y citológica;
las figuras 14A a 14C muestran probabilidades a posteriori de espectros Raman in vivo pertenecientes a (i) un esófago normal (n = 736), y (ii) CCEE (n = 202) del conjunto de datos de aprendizaje (80 % del conjunto de datos total), utilizando un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales y una validación cruzada dejando un paciente fuera, basada en las técnicas Raman de FP, HW y FP/HW integradas o simultáneas, respectivamente ((O) normal, (▲) CCEE), según una realización de la presente invención;
la figura 15 muestra curvas de características operativas del receptor (ROC) para separar el CCEE frente a tejido esofágico normal para el conjunto de datos de aprendizaje (80 % del conjunto de datos total), donde las áreas bajo las curvas de ROC (AUC, Areas Under the ROC curves) son 0,972, 0,928 y 0,995, respectivamente, utilizando las técnicas Raman de Fp , HW y FP/HW integradas o simultáneas, según una realización de la presente invención; la figura 16A es un gráfico que muestra espectros compuestos NIR-AF y Raman medidos en pacientes cervicales, según una realización de la presente invención.
la figura 16A es un gráfico que muestra espectros compuesto NIR-AF y Raman medidos en pacientes cervicales, según una realización de la presente invención.
la figura 16B es un gráfico que muestra las zonas espectrales seleccionadas extraídas después del PLS-DA de intervalos, según una realización de la presente invención.
la figura 17 es un gráfico que muestra un error de clasificación representado como función de la complejidad del modelo para PLS-DA en todo el espectro y el PLS-DA de intervalos, que solo utiliza una fracción de ~10 % de todo el espectro, según una realización de la presente invención;
la figura 18 es un diagrama de dispersión de las probabilidades a posteriori (normal (n = 1001) y precáncer (n = 232)) pertenecientes al grupo precanceroso utilizando modelado de PLS-DA (a) en todo el espectro y (b) utilizando modelado de PLS-DA de intervalos, según una realización de la presente invención;
la figura 19 es un gráfico de un espectro Raman continuo y de zonas espectrales seleccionadas después del PLS-DA de intervalos medido en 90 pacientes gástricos (benigno (n = 1950) y cáncer (n = 108)), según una realización de la presente invención;
la figura 20 es un gráfico de error de clasificación representado como una función de la complejidad del modelo para PLS-DA en todo el espectro y el PLS de intervalos, según una realización de la presente invención;
la figura 21 es un diagrama de dispersión de las probabilidades a posteriori (normal (n = 1950) y cáncer (n = 108)) de pertenecer al grupo de cáncer utilizando (a) PLS en todo el espectro de Fp y HW y (b) en modelado PLS-dA de intervalos, según una realización de la presente invención;
la figura 22A muestra la desviación estándar (SD) promedio de espectros Raman de FP y HW in vivo ±1 de MI gástrica (n = 329) y mucosa normal (n = 1083) obtenidos en 63 pacientes durante un examen endoscópico clínico, según una realización de la presente invención;
la figura 22B muestra espectros de diferencia (es decir, MI-normal ±1 desviación estándar (SD)) que resuelven las características espectrales únicas entre tejidos gástricos normales y de MI, según una realización de la presente invención;
las figuras 23A y 23B muestran fotomicrografías de secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H y E) de tejidos gástricos: A, mucosa gástrica normal (aumentos X200); B, metaplasia intestinal extensa (aumentos X100);
la figura 24 muestra los primeros cinco componentes principales (PC, Principal Components) que representan ~88 % de la varianza total calculados a partir de espectros Raman de Fp y HW integrados de tejido gástrico (PC1 = 45,6 %; PC2 = 33,6 %; PC3 = 4,2 %; PC4 = 3,1 %; pC5 = 1,2 %;), según una realización de la presente invención;
las figuras 25A, 25B y 25C muestran diagramas de dispersión de valores de probabilidad a posteriori pertenecientes a categorías de tejido gástrico normal y de MI calculadas mediante (A) FP, (B) HW y (C) técnicas Raman de FP y HW integradas, respectivamente, utilizando PCA-LDA junto con procedimientos de validación cruzada dejando un sitio de tejido fuera, según una realización de la presente invención, donde las líneas de puntos (0,5) proporcionan sensibilidades diagnósticas del 96,3 % (26/27), 77,8 % (21/27) y 92,6 % (25/27), y especificidades del 87,5 % (77/88), 78,4 % (69/88) y 90,9 % (80/88), respectivamente, utilizando técnicas Raman de FP, HW y FP/HW integradas para separar una MI del tejido gástrico normal; ((O) normal, (▲) MI),
la figura 26 muestra curvas de características operativas del receptor (ROC) de resultados de clasificación para distinguir la MI del tejido gástrico normal para Raman de FP/HW integrados, FP y HW, respectivamente, junto con algoritmos de PCA-LDA con técnicas de validación cruzada dejando un sitio de tejido fuera, según una realización de la presente invención, donde las áreas de integración bajo las curvas de ROC son 0,96, 0,94 y 0,79, respectivamente, para las técnicas Raman FP/HW integradas, Raman de FP y Raman de HW;
la figura 27 es un ejemplo de PLS-DA de intervalos aplicado a espectros Raman medidos desde la cavidad bucal, en el que una zona de gran variabilidad interanatómica (por ejemplo, 956 cm-1 de hidroxiapatita, 1302 cm-1 y 1445 cm-1 de lípidos) es descartada mediante las técnicas de selección variable, según una realización de la presente invención;
la figura 28 es un diagrama de flujo de un procedimiento de procesamiento del espectro Raman para predicción cuando se utilizan intervalos espectrales discretos, según una realización de la presente invención;
las figuras 29A y 29B muestran gráficos de un espectro Raman in vivo obtenido en modo sin contacto: (a) ausencia de un espejo caliente; (b) integrado con un espejo caliente, delante de una fuente de luz de xenón, según una realización de la presente invención;
las figuras 30A y 30B muestran gráficos de un espectro Raman in vivo obtenido en modo de contacto: (a) ausencia de un espejo caliente; (b) integrado con un espejo caliente, frente a una fuente de luz de xenón, según una realización de la presente invención;
la figura 31 es un diagrama de bloques de un sistema generalizado para el filtrado de luz de iluminación para cualquier aplicación de espectroscopía Raman de fibra óptica en biomedicina, según una realización de la presente invención;
la figura 32 es un diagrama de flujo de un procedimiento de calibración, según una realización de la presente invención;
la figura 33 es un diagrama de bloques de un dispositivo de calibración utilizado para probar y calibrar la técnica de endoscopía Raman de fibra óptica antes de su utilización en pacientes, según una realización de la presente invención;
la figura 34 es un diagrama de una rutina de prueba para endoscopía Raman antes de su utilización en pacientes, según una realización de la presente invención;
la figura 35 es un gráfico de ejemplo de espectros de fondo obtenidos utilizando dos sondas de fibra óptica diferentes, según una realización de la presente invención.
la figura 36 es un diagrama de bloques que muestra una técnica o procedimiento para calibrar un recipiente de vidrio de estándar de fluorescencia en el dispositivo de calibración utilizando una lámpara de tungsteno estándar, según una realización de la presente invención;
la figura 37 es un gráfico que muestra un ejemplo de funciones de calibración para dos sondas de fibra óptica diferentes, según una realización de la presente invención;
la figura 38 es un gráfico que muestra un ejemplo de medición de un material con picos Raman bien definidos (por ejemplo, poliestireno), según una realización de la presente invención;
la figura 39 es un gráfico que muestra un ejemplo de medición de mapeo polinomial de número de onda frente a número de píxeles, según una realización de la presente invención;
la figura 40A es un gráfico que muestra una comparación de espectros Raman obtenidos de un fantoma de tejido de dos capas (es decir, poliestireno y polietileno) utilizando 2 sondas Raman diferentes, según una realización de la presente invención;
la figura 40B es un gráfico que muestra un espectro Raman representativo de una capa superior y una capa inferior en el fantoma de tejido, según una realización de la presente invención;
la figura 41 es un diagrama de bloques de una técnica o procedimiento para mejorar la relación S/N y evitar la saturación del CCD mediante el ajuste automático de la potencia de excitación del láser y las acumulaciones, según una realización de la presente invención;
la figura 42 es un diagrama de bloques de una técnica o procedimiento para mejorar la relación S/N y evitar la saturación del CCD mediante el ajuste automático del tiempo de exposición y de las acumulaciones, según una realización de la presente invención; y
la figura 43 es un diagrama de bloques que muestra una estructura de base de datos representativa para almacenar modelos de diagnóstico para diferentes sondas y diferentes órganos, según una realización de la presente invención.
La espectroscopía Raman representa una técnica vibratoria óptica única basada en el principio fundamental de la dispersión de luz inelástica. Cuando la luz láser incidente induce un cambio de polarización en las moléculas, una pequeña proporción de fotones incidentes (~1 en 108) se dispersa de manera inelástica con cambios de frecuencia correspondientes a los modos vibratorios activos Raman específicos de las moléculas en la muestra. Diferentes moléculas y diferentes enlaces vibran a diferentes frecuencias. La espectroscopía Raman es, por lo tanto, capaz de recoger una gran cantidad de información biomolecular específica de una gran cantidad de componentes inter y/o intracelulares, tales como proteínas, lípidos y ácidos desoxirribonucleicos (ADN), agua, etc. en los tejidos.
La figura 1 muestra un sistema o aparato de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica o un espectroscopio Raman 100 confocal de fibra óptica, según una realización de la presente invención. El sistema 100 es capaz de realizar simultáneamente mediciones de espectroscopía Raman en el rango espectral de huellas (FP, FingerPrints) y el régimen de número de ondas alto (HW, High Wave). La obtención y el análisis de mediciones de rango espectral FP y HW combinadas, según las realizaciones de la presente invención, permite una mayor precisión en análisis in vivo y ex vivo de información biomolecular, por ejemplo, para caracterizar, identificar y/o diagnosticar tejido o tejidos gastrointestinales.
El espectroscopio de Raman confocal de fibra óptica 100 incluye una fuente de iluminación colimada, tal como un láser de diodo del infrarrojo cercano (NIR, Near InfraRed) 102; un espectrógrafo 104 de formación de imágenes reflectantes de alto rendimiento; una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD, Charge Coupled Device) optimizada para NIR 106; y una sonda 108 acoplada ópticamente tanto al láser 102 como al espectrógrafo 104 por medio de una fibra óptica 110. La sonda 108 puede ser transportada por un cuerpo cilíndrico alargado 105 de un endoscopio (por ejemplo, en el interior de un canal del instrumento, proporcionado por el cuerpo cilíndrico alargado 105). El espectroscopio Raman 100 de fibra óptica puede incluir, además, un filtro de paso banda 112 para la eliminación del fondo de la iluminación de luz láser, y un filtro 114 de paso largo para pasar señales Raman de tejido mientras se elimina la luz láser dispersa y la interferencia del fondo de la fibra. Un sistema de ordenador o microcontrolador 124 puede proporcionar un módulo de análisis y control automatizado/informatizado para controlar aspectos del funcionamiento del espectroscopio Raman y realizar análisis espectrales Raman.
En una implementación representativa, el láser 102 de diodo del infrarrojo cercano puede tener una salida máxima de 300 mW y una longitud de onda de 785 nm, tal como sería coherente con el dispositivo fabricado, por ejemplo, por B&W Tek Inc. El láser NIR 102 genera una energía de excitación en la punta 116 de la sonda 108 que puede provocar vibración en cualquier especie “iluminada” por la sonda 108 y, de ese modo, dar lugar a un espectro Raman. Se pueden utilizar otros tipos de iluminación colimada para reemplazar el láser 102 de diodo. El espectrógrafo 104 puede estar equipado con enfriamiento termoeléctrico, por ejemplo, a aproximadamente -70 °C.
El espectrógrafo 104 puede ser compatible con un dispositivo tal como el Acton LS785 f/2, fabricado por Princeton Instruments Inc. La cámara 106 puede ser compatible con una Pixies 400BR eXcelon, fabricado por Princeton Instruments Inc. En dicha implementación representativa, el espectroscopio 100 puede obtener espectros Raman in vivo en el rango espectral de entre 400 y 3600 cm-1, con una resolución de aproximadamente 11 cm-1. Los dispositivos mostrados se presentan como ejemplos representativos y no pretenden ser limitativos. Las líneas de emisión atómica de las lámparas de calibración espectral de mercurio-argón se pueden utilizar para la calibración de longitudes de onda. Las lámparas pueden ser las compatibles con HG-1 y AR-1, fabricadas por Ocean Optics, Inc., Dunedin, FL. Todos los espectros calibrados en longitud de onda son corregidos para la dependencia del sistema con la longitud de onda, utilizando una lámpara de calibración de tungsteno, tal como una RS-10, fabricada por EG&G Gamma Scientific, San Diego, CA.
En algunas realizaciones, para medir los espectros de FP y HW, las señales Raman de tejido se pueden medir cambiando sucesivamente diferentes frecuencias de excitación del láser o utilizando una rejilla de transmisión dual para cubrir todo el rango espectral, (es decir, entre -150 y 1950 cm-1; entre 1750 y 3600 cm-1) en alta resolución, tal como se da a conocer en la Solicitud de Patente Internacional núm. PCT/SG2014/000063.
La figura 2 muestra una realización adicional detallada en el presente documento, que es un sistema o aparato 200 de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de banda ancha (por ejemplo, entre 400 y 3600 cm-1) que utiliza una única rejilla reflectante para medir simultáneamente espectros de FP y HW de una manera que mejore la precisión de la caracterización y el diagnóstico de tejidos, por ejemplo, en órganos y partes del cuerpo accesibles endoscópicamente.
El sistema 200 incluye un láser de diodo del infrarrojo cercano (NIR) 202 (Aex = 785 nm), un espectrógrafo 204 reflectante de alto rendimiento equipado con una cámara 206 de dispositivo de carga acoplada (CCD) optimizada para NIR y refrigerada termoeléctricamente y una sonda Raman confocal de fibra óptica 208 de 1,8 mm (diámetro exterior) especialmente diseñada. El sistema 200 incluye, además, un sistema de ordenador/microcontrolador 124, configurado para proporcionar un control automatizado/informatizado y un módulo de análisis, para controlar aspectos del funcionamiento del espectroscopio Raman y realizar análisis espectrales Raman. Más concretamente, el sistema de ordenador/microcontrolador 124 puede incluir una o varias unidades de procesamiento, configuradas para ejecutar instrucciones de programa residentes en memoria para realizar operaciones, procedimientos o procesos de obtención y análisis de espectros Raman concretos, según una realización de la presente invención. Una rejilla reflectante personalizada, de banda ancha, recubierta de oro (por ejemplo, 830 g/mm, que tiene una eficiencia de difracción > 90 % a ~800 nm) está incorporada o integrada en el sistema 200 Raman confocal de fibra óptica para cubrir todo el rango espectral (es decir, entre 400 y 3600 cm-1) con una resolución espectral de ~11 cm-1. La sonda 208 endoscópica Raman confocal de fibra óptica se utiliza tanto para el suministro de luz láser como para la recogida de señales Raman de tejido in vivo. La sonda 208 endoscópica Raman confocal ha sido descrita previamente en la Solicitud de Patente Internacional núm. PCT/SG2014/000063, e incluye una pluralidad de fibras colectoras biseladas recubiertas de filtro de 200 pm (NA = 0,22) que rodean una fibra central de suministro de luz (200 pm de diámetro, NA = 0,22). Una lente de bola de zafiro en miniatura de 1,0 mm (NA = 1,78) está acoplada a la punta de la fibra de la sonda 208 confocal para enfocar estrechamente la luz de excitación en el tejido, que permite la recogida eficaz del espectro Raman del recubrimiento epitelial (profundidad del tejido < 200 pm). La sonda Raman confocal de fibra óptica 208 se puede insertar en el canal de instrumentos de endoscopios médicos y colocar en contacto suave con el epitelio para la caracterización y el diagnóstico de tejidos in vivo utilizando una técnica de endoscopía Raman confocal de banda ancha, según una realización de la presente invención.
La figura 3 muestra un ejemplo de espectro Raman y de autofluorescencia concomitante de FP y HW de banda ancha medido en mucosa gastrointestinal, que cubre las zonas de FP y HW. Se observan picos Raman de tejido de alta resolución sobre de la autofluorescencia concomitante en el rango de FP, con asignaciones moleculares provisionales, como sigue:
• 853 cm-1, que está relacionado con las proteínas v(C-C),
• 1004 cm-1, que está relacionado con el anillo aromático vs(C-C) de fenilalanina,
• 1078 cm-1, que está relacionado con las v(C-C) de lípidos,
• 1265 cm-1, que está relacionado con amida III v(C-N) y ó(N-H) de proteínas,
• 1302 cm-1, que está relacionado con la torsión y agitación de proteínas CH3CH2,
• 1445 cm-1, que está relacionado con la deformación de 5(CH2) de proteínas y lípidos,
• 1655 cm-1, que está relacionado con amida I v(C=O) de proteínas, y
• 1745 cm-1, que está relacionado con v(C=O) de lípidos.
También se ven picos Raman intensos en la zona de HW, tales como:
• entre 2850 y 2885 cm-1, que está relacionado con estiramiento simétrico y asimétrico de los CH2 de lípidos,
• 2940 cm-1, que está relacionado con estiramiento de CH3 de proteínas,
• 3400 cm-1 en la zona de entre 3100 y 3600 cm-1, que está relacionado con banda ancha Raman de vibraciones de estiramiento del OH del agua.
Esta técnica de banda ancha según una realización de la presente invención permite que el rango de FP o HW o ambas zonas espectrales FP y HW se utilicen simultáneamente para análisis, identificación, caracterización y/o diagnóstico de tejidos, y es, por lo tanto, especialmente útil en órganos accesibles endoscópicamente que muestran una intensa autofluorescencia, que satura rápidamente el CCD. El sistema de ordenador/microcontrolador 124 se puede configurar para utilizar selectivamente la zona espectral de FP, la zona espectral de HW o ambas zonas FP y HW juntas, para análisis, identificación, caracterización y/o diagnóstico de tejidos, por ejemplo, en respuesta a una entrada del usuario dirigida a una interfaz gráfica de usuario (GUI, Graphical User Interface).
Una realización incluye la utilización de la zona espectral de HW para diagnóstico si la zona de FP excede el rango dinámico del CCD. En otra realización, tanto las zonas espectrales de FP como de HW se utilizan para caracterización, identificación y/o diagnóstico de tejidos. La plataforma de endoscopía Raman confocal de fibra óptica de banda ancha permite cambiar entre diferentes zonas espectrales (por ejemplo, HW, FP o FP y HW simultáneas) según el nivel de saturación del CCD y/o el tipo de tejido medido.
Una técnica o procedimiento de caracterización, identificación o diagnóstico de tejidos según una realización de la presente invención utiliza la información de diagnóstico complementaria de los espectros de FP y HW de banda ancha. En general, los espectros biomédicos de los tejidos son extremadamente complejos. Para convertir las sutiles diferencias moleculares de espectros Raman entre diferentes tipos de tejidos en información de diagnóstico valiosa, se requieren sofisticadas técnicas de análisis estadístico multivariante, tales como el análisis de componentes principales (PCA, Principal Components Analysis). Esto se ha puesto en práctica ampliamente utilizando la totalidad de los espectros Raman (es decir, continuos) para diagnóstico y caracterización de tejidos en las zonas de FP o HW, respectivamente.
El PCA reduce la dimensión de los espectros Raman descomponiéndolos en combinaciones lineales de componentes ortogonales, tales como los componentes principales (PC), de tal manera que se maximizan las variaciones espectrales en el conjunto de datos. Por lo tanto, PCA se ha integrado habitualmente con algoritmos de agrupamiento eficaces tales como máquinas de vectores de soporte (SVM, Support Vector Machine), regresión logística (LR, Logistic Regression) y análisis discriminante lineal (l Da , Linear Discriminant Analysis) para la clasificación de espectros Raman biomédicos. El PCA es muy eficaz para la reducción y el análisis de datos.
Alternativamente, el análisis discriminante (DA, Discriminant Analysis) de mínimos cuadrados parciales (PLS, Partial Least Squares) se ha aplicado para problemas de clasificación, codificando la pertenencia de clase de ceros y unos, que representan afinidades de grupo en una matriz de indicador Y apropiada. El PLS-DA emplea el principio fundamental del PCA, pero rota aún más los componentes, tales como las variables latentes (LV, Latent Variables), maximizando la covarianza entre la variación espectral y la afinidad de grupo para que las LV expliquen las variaciones relevantes para el diagnóstico, en lugar de las variaciones más prominentes en el conjunto de datos espectrales. En la mayoría de los casos, esto garantiza que las variaciones espectrales significativas para el diagnóstico sean retenidas en los primeros LV.
La mayoría de los algoritmos multivariantes (por ejemplo, PCA o PLS-DA) no están diseñados originalmente para hacer frente a grandes cantidades de variables espectrales irrelevantes. En otras palabras, algunas zonas espectrales en espectros Raman pueden tener un efecto degradante en el modelo de diagnóstico, por ejemplo, debido a una gran varianza, a interferencias, a variabilidad interanatómica, etc.
En una realización, se da a conocer una técnica o procedimiento de diagnóstico novedoso, que utiliza la información complementaria de los rangos espectrales de FP y HW, por ejemplo, tal como se obtiene mediante mediciones espectrales de FP y HW realizadas utilizando un sistema 200 de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de banda ancha. Dicha realización hace uso de subintervalos espectrales discretos (por ejemplo, de aproximadamente 3 y 15 o de entre aproximadamente 5 y 10 subintervalos espectrales discretos, donde uno determinado, o cada subintervalo espectral, puede tener un ancho espectral de entre aproximadamente 10 y 30 cm-1 o aproximadamente 20 cm-1) en los espectros Raman de FP y HW de banda ancha, en lugar de los rangos espectrales continuos para el diagnóstico. La figura 4 muestra un ejemplo de mediciones Raman de banda ancha del gastro-intestino, en las que se ha extraído información complementaria de los rangos espectrales de FP, es decir, entre 800 y 1800 cm-1, y de HW, es decir, entre 2800 y 3600 cm-1. Las figuras 5A-5B muestran los mismos espectros Raman después de la resta de polinomios de 5° orden en el rango de FP y HW, respectivamente, revelando más claramente los picos Raman específicos. Según las realizaciones de la presente invención, se ha descubierto que la utilización de subintervalos espectrales de la zona de FP y HW mejora significativamente o mejora la precisión del diagnóstico endoscópico Raman in vivo de crecimientos anómalos, tales como precáncer y cáncer, tal como se describirá más adelante. Una realización según la presente invención se refiere al diagnóstico de crecimientos anómalos gastrointestinales, tales como crecimientos anómalos colorrectales. Los espectros Raman de FP y HW sin procesar medidos a partir de tejido colorrectal in vivo representan una combinación de señales Raman débiles de tejido, fondo de autofluorescencia intenso, y ruido. Con el fin de ver y analizar las señales Raman, el fondo y el ruido deben ser
tratados o eliminados. Por lo tanto, los espectros sin tratar son preprocesados mediante un filtro de suavizado de primer orden, para reducir el ruido espectral, tal como un filtro Savitzky Golay, que tiene un ancho de ventana de 3 píxeles. En la zona de FP (entre 800 y 1800 cm-1), se encuentra que un polinomio de quinto orden es óptimo para ajustar el fondo de autofluorescencia en el espectro suavizado en ruido y, por lo tanto, este polinomio se resta del espectro de FP calibrado, para producir el espectro Raman tisular solo. En el rango de HW (entre 2800 y 3600 cm-1) se encuentra que el ajuste lineal de primer orden es óptimo para eliminar la referencia de autofluorescencia más débil. Dicho preprocesamiento de cada señal recibida se completa en aproximadamente 30 ms y, por lo tanto, los espectros Raman procesados y los resultados de diagnóstico se pueden visualizar en un dispositivo de visualización, tal como una pantalla de ordenador, en tiempo real.
Después del preprocesamiento, se analizan los espectros Raman para determinar picos y/o marcadores. A continuación, estos picos o marcadores se utilizan para estimar, caracterizar o determinar la naturaleza del tejido (la naturaleza de la lesión o el crecimiento anómalo) del que se obtienen los espectros. Esto puede ser realizado mediante el sistema informático utilizando un medio apropiado de comparación con espectros de control conocidos, marcadores de referencia y similares. El término marcadores de referencia, tal como se utiliza en el presente documento, pretende incluir uno o varios picos individuales en el espectro Raman, o, de hecho, todo el espectro Raman. Si uno o varios marcadores de referencia Raman son indicativos de una cierta naturaleza de crecimiento celular anómalo, se puede realizar una comparación entre un espectro obtenido y un marcador de referencia utilizando una tabla de búsqueda o similar. Se apreciará que se pueden emplear muchos tipos diferentes de técnicas o procedimientos de comparación. Una vez que se ha realizado la comparación y se ha determinado la mejor coincidencia, el tipo de crecimiento celular anómalo que está presente puede ser indicado al usuario del sistema 200 por cualquier medio apropiado. Esto puede incluir una representación visual en una pantalla de ordenador y/o un mensaje audible.
En una prueba de una realización del sistema 200, se examinaron colonoscópicamente un total de 50 pacientes sintomáticos consecutivos. Los pacientes se habían presentado para exámenes, para vigilancia, o cribado, de diversas indicaciones colorrectales, tales como anemia, sangrado, etc. Antes de la colonoscopia, se administró a los pacientes una preparación intestinal de electrolitos de polietilenglicol (PEG). Se realizó sedación utilizando propofol administrado por vía intravenosa. Los endoscopistas limpiaron el colon durante la inspección y antes de los escaneos Raman confocales, a continuación, las lesiones colorrectales polipoideas y planas se enjuagaron con una solución salina fisiológica para reducir más los factores de confusión (es decir, heces y líquidos residuales, etc.). Durante un examen habitual, el endoscopio fue dirigido hacia el colon distal, y se realizó un escaneo Raman (espectros ñ 15) en lesiones sospechosas durante la retirada de la sonda del cuerpo. Cada medición Raman del tejido fue obtenida en un período comprendido entre aproximadamente 0,1 y 0,5 segundos. Esto permitió un estudio rápido de los pólipos colorrectales. Cualesquiera espectros Raman obtenidos sin contacto con pólipos colónicos (~10 %) fueron descartados automáticamente mediante un software clínico en línea que utiliza procedimientos de análisis de componentes principales (PCA) asociados con estadísticas de residuos Q y T(i) 2 de Hotelling. Los procedimientos de PCA están sujetos a la Solicitud de Patente Internacional núm. PCT/SG2014/000063 citada anteriormente, y funcionan como sigue:
• Se introduce un nuevo esquema de detección de valores atípicos basado en el componente principal (PCA) acoplado con estadísticas de los residuos Q y T2 de Hotelling, para que sirvan como una herramienta de retroalimentación específica del modelo de alto nivel en el marco en línea. Los residuos Q y T2 de Hotelling son los dos parámetros independientes que proporcionan información dentro y fuera del ajuste del modelo.
• Utilizando los parámetros de residuos Q y T2 de Hotelling como indicadores para controlar la calidad del espectro adquirida (es decir, modo de contacto sonda-tejido, variaciones de manipulación de la sonda, interferencia de luz blanca, interferencia de luz azul, factores de confusión, etc.), la retroalimentación de la auditoría ha sido integrada en el sistema de diagnóstico Raman en línea, facilitando la exploración espectroscópica en tiempo real y el asesoramiento de la manipulación de las sondas para los médicos.
• Si los espectros fuesen verificados para un análisis adicional, son alimentados en modelos probabilísticos para diagnósticos de cáncer in vivo. El software puede conmutar instantáneamente entre diferentes modelos estadísticos multivariantes renderizados previamente, incluyendo análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), análisis discriminante lineal (LDA) de pCa , LDA de optimización de colonia de hormigas (Ac O)-LDA (Ant Colony Optimization), árboles de clasificación y regresión (CART, Classification and Regression Trees), máquina de vectores de soporte (SVM, support vector machine), impulso adaptativo (Ada-Boost ) etc., basado en bases de datos espectrales de un gran número de pacientes.
Una vez completado el escaneo Raman y guardados los resultados, cada muestra de tejido se eliminó; se fijó en formalina; se seccionó; se tiñó con hematoxilina y eosina (H y E); y se envió para un examen histopatológico. Los tejidos colorrectales se clasificaron en las siguientes tres categorías clínicamente importantes:
(i) benignos (pólipos normales e hiperplásicos)
(ii) adenomas (tubulares, tubulovellosos, vellosos) de bajo y alto grado y,
(iii) adenocarcinomas.
La técnica Raman confocal de fibra óptica de FP y HW simultánea, según una realización de la presente invención, se comparó con las evaluaciones histopatológicas para determinar la capacidad para diferenciar lesiones colorrectales neoplásicas de no neoplásicas, in vivo.
La comparación incluyó la utilización de análisis estadístico de los resultados para validar si la técnica simultánea de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW era suficientemente precisa para reemplazar las técnicas actualmente utilizadas. Se calcularon estadísticas de k de Cohen para evaluar la concordancia para la caracterización histopatológica. Se utilizó análisis de varianza (ANOVA) con la prueba de diferencias menos significativas (LSD, Least Significant Differences) post hoc de Fisher para probar diferencias en las medias entre grupos. Se utilizó análisis estadístico multivariante para extraer las características espectrales Raman significativas para diagnósticos clínicos. Se aplicó un análisis discriminante (DA) probabilístico de mínimos cuadrados parciales (PLS) para diagnóstico de tejidos. Se utilizó validación cruzada “dejando un paciente fuera” para evaluar y optimizar la complejidad del modelo de PLS-DA reduciendo el riesgo de sobreajuste. Se generaron las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se calculó el área bajo las curvas (AUC) para evaluar la capacidad de la técnica de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW para diferenciar pólipos neoplásicos de no neoplásicos, in vivo.
En un experimento, que se presenta solo a modo de ejemplo, para mostrar los resultados de la utilización de una realización, según la presente invención, en un grupo concreto de sujetos o pacientes de prueba, cincuenta pacientes (27 hombres y 23 mujeres) con una edad promedio/rango de 52/(entre 23 y 83) fueron inscritos para el examen Raman confocal de fibra óptica. Trece pacientes presentaron displasia de bajo grado con adenomas ocultos (once adenomas tubulares, y dos tubulovellosos). Tres pacientes se asociaron con adenocarcinoma colorrectal en estadio avanzado. Una kappa de Cohen de 0,89 demostró un alto nivel de concordancia entre los hallazgos patológicos para los tres grupos de tejidos. Se obtuvieron con éxito un total de 1731 espectros Raman colorrectales in vivo a partir de 126 lesiones o crecimientos anómalos. De estas lesiones, 1397 fueron benignas, 235 fueron adenomas y 99 fueron adenocarcinomas. Esto fue confirmado por exámenes histopatológicos.
La distribución detallada de los pacientes y las lesiones, incluyendo subtipos patológicos y ubicaciones anatómicas, tales como ascendente, transversal, descendente, sigmoide, recto, se resumen en la Tabla 1.
La figura 6 muestra la desviación estándar (SD) promedio de espectros Raman confocales in vivo ±1 (sombreada en gris claro), medida para crecimientos anómalos benignos, de adenoma y de adenocarcinoma. Se pueden observar picos Raman de tejido prominentes, con asignaciones provisionales en el rango de FP de aproximadamente:
• 853 cm-1, que está relacionado con las proteínas v(C-C),
• 1004 cm-1, que está relacionado con el anillo aromático vs(C-C) de la fenilalanina,
• 1078 cm-1, que está relacionado con v(C-C) de los lípidos,
• 1265 cm-1, que está relacionado con la amida III v(C-N) y S(N-H) de las proteínas,
• 1302 cm-1, que está relacionado con la torsión y agitación de CH2 de los lípidos
• 1445 cm-1, que está relacionado con la deformación de 5(CH2) de proteínas y lípidos,
• 1618 cm-1, que está relacionado con v(C=C) de las porfirinas
• 1655 cm-1, que está relacionado con la amida I v(C=O) de las proteínas, y
• 1745 cm-1, que está relacionado con los v(C=O) de los lípidos.
Asimismo, se observan picos Raman intensos en la zona de HW tales como:
• entre 2850 y 2885 cm-1, que está relacionado con el estiramiento simétrico y asimétrico de los CH2 de los lípidos, respectivamente,
• 2940 cm-1, que está relacionado con el estiramiento de los CH3 de las proteínas,
• 3009 cm-1, que está relacionado con el estiramiento asimétrico de los =CH de las proteínas,
• ~3300 cm-1, que está relacionado con la Amida A (estiramiento de los NH de las proteínas), así como
• ~3200 y ~3400 cm-1 en la banda ancha Raman del agua, que está relacionado con las vibraciones de estiramiento de los OH que están directamente relacionadas con la conformación local y las interacciones de las uniones OH en el espacio intracelular y extracelular del tejido.
La figura 7A muestra los espectros de diferencia para adenoma benigno, adenocarcinoma benigno y adenomaadenocarcinoma ±1 SD (sombreado en gris claro) que resuelve las características espectrales distintivas, tales como la intensidad de pico, el desplazamiento y el ensanchamiento de la banda, etc. entre las diferentes lesiones colorrectales.
La figura 7B muestra un gráfico logarítmico de los valores p calculados (ANOVA) para cada una de las intensidades Raman en la totalidad del rango espectral (variando cada espectro Raman entre 800 y 1800 cm-1 y entre 2800 y 3600 cm-1 con un conjunto de 779 intensidades).
La figura 7C muestra un histograma de las intensidades de pico Raman más significativas para el diagnóstico (media ±1 SD) de los rangos de FP y HW alrededor de (i) 1078 cm-1 (ii) 1265 cm-1 (iii) 1335 cm-1 (iv) 1431 cm-1 (v) 1618 cm-1 (vi) 2885 cm-1 y (vii) 3200 cm-1.
Los espectros Raman in vivo se correlacionaron con secciones histopatológicas representativas de las diferentes categorías de patología. La figura 8A muestra la presencia extensa de células caliciformes en mucosa de tipo intestinal normal con infiltrado linfo-plasmocítico. La figura 8B muestra características polipoides con glándulas en forma de estrella en un pólipo hiperplásico de tipo caliciforme. La figura 8C muestra un adenoma tubular con displasia de bajo grado que muestra células apiñadas con núcleos hipercromáticos. La figura 8D muestra un adenocarcinoma invasivo con anomalías celulares y arquitectónicas prominentes. Las caracterizaciones histopatológicas en las figuras 8A-D revelan las características celulares y morfológicas de diferentes tipos de lesiones, mientras que la técnica de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW revela los cambios biomoleculares que ocurren en el epitelio, asociados con la carcinogénesis colorrectal que se muestra en las figuras 7A-C.
Utilizando la información biomolecular complementaria de los rangos espectrales de FP y HW, se aplica espectroscopía Raman de fibra óptica para el diagnóstico in vivo. La figura 9A muestra las probabilidades a posteriori generadas utilizando el PLS-DA probabilístico tricotómico de los 50 pacientes colorrectales pertenecientes a (i) benigno (n = 1397), (ii) adenoma (n = 235) y (iii) adenocarcinoma (n = 99), respectivamente, utilizando la técnica de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW, según una realización de la presente invención. Las relaciones entre sensibilidades y especificidades se determinaron mediante el desarrollo de las curvas de ROC, tal como se muestra en la figura 9B. Las áreas bajo las curvas (AUC) son 0,930 y 0,978, para distinguir adenoma de pólipos benignos, y adenocarcinoma de adenoma y pólipos benignos, respectivamente. El análisis de ROC muestra que el adenoma se puede distinguir de las lesiones planas y polipoides benignas con una sensibilidad del 88,5 % (208/235) y una especificidad del 80,0 % (1118/1397). Se detectaron adenocarcinomas con una sensibilidad del 92,9 % (92/99) y una especificidad del 96,51 % (1575/1632) para cada espectro. Se realizó un análisis de ROC adicional, tal como se muestra en la figura 10, para examinar si la información biomolecular de los regímenes de FP y HW era complementaria para el diagnóstico. El AUC fue de 0,908, en base al rango de FP (es decir, entre 800 y 1800 cm-1) y de 0,895 en base al rango de HW (es decir, entre 2800 y 3600 cm-1). Por otro lado, al utilizar la información complementaria de los rangos de FP y HW, la robustez se mejoró significativamente, conduciendo a un AUC de 0,930. A la luz de estos alentadores resultados in vivo, la técnica única de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW representa una modalidad óptica muy potente, que permite el diagnóstico objetivo en tiempo real de la neoplasia colorrectal in vivo.
Se conoce que un gran grupo de personas tiene ocultos pequeños pólipos hiperplásicos colorrectales o lesiones polipoides planas, que aumentan significativamente el coste de las evaluaciones histopatológicas. La motivación más importante para desarrollar y adoptar las modalidades endoscópicas avanzadas para exámenes colorrectales
es la capacidad de diferenciar pólipos hiperplásicos benignos de un adenoma. Las realizaciones, según la presente invención demuestran que, por primera vez, los espectros Raman confocales in vivo de alta calidad que cubren los rangos espectrales de FP y HW pueden ser medidos (por ejemplo, simultáneamente) a partir de pólipos colorrectales, y analizados en tiempo real, y esto puede ser utilizado para ofrecer una forma mejorada de identificar neoplasias tales como las que se muestran en la figura 6. La técnica de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica según las realizaciones de la presente invención descubre una pluralidad de cambios bioquímicos y biomoleculares que ocurren en el epitelio, que acompañan a la transformación neoplásica, tal como se muestra en las figuras 7A-C. Por ejemplo, los pólipos neoplásicos se asociaron con intensidades de pico Raman significativamente menores en 1078 cm-1 con respecto a v(C-C); 1431 cm-1 con respecto a 5(CH2); y 2850 y 2885 cm-1 con respecto al estiramiento simétrico y asimétrico del enlace CH2 , respectivamente (p < 0,001), lo que apunta a una reducción relativa en el contenido de lípidos. Los resultados muestran, asimismo, una proteína regulada al alza significativa, tal como indican los biomarcadores sensibles en 1004 cm-1 con respecto al anillo aromático vs(C-C) de la fenilalanina, y el ensanchamiento de la banda en 1655 cm-1 con respecto a la amida I v(C = O) de las proteínas, que apunta a una mayor proliferación celular en el epitelio neoplásico. La intensidad del pico Raman prominente en los pólipos neoplásicos en 1618 cm-1 (p < 0,001) también está muy relacionada con el contenido de hemoglobina asociado con el inicio antigénico y la neovasculación resultante.
Las intensidades de pico mencionadas anteriormente están relacionadas con vibraciones de enlaces específicos dentro de las moléculas. Cada tipo de enlace tiene una intensidad de pico diferente, y la identificación de una intensidad de pico que puede ser asociada con un enlace específico puede revelar información biomolecular. El hecho de que una lesión o un crecimiento anómalo incluya un enlace o enlaces específicos y dé lugar a un pico de intensidad asociado específico puede ser utilizado para diferenciar diferentes tipos de crecimiento anómalo. Por ejemplo, si un crecimiento anómalo que es benigno muestra un pico de intensidad específico, la detección posterior de ese pico de intensidad puede conducir a la determinación de que en la situación posterior la lesión, o el crecimiento anómalo, también es probable que sea benigna.
Según las realizaciones de la presente invención, el vínculo entre la intensidad de pico y los biomarcadores se puede aprovechar para identificar el tipo de crecimiento anómalo que está presente. Esto puede ocurrir tanto in vivo como ex vivo.
En algunos resultados, se encontró que el contenido de agua era marcadamente diferente en el adenoma. El aumento en la intensidad de la amplia vibración antisimétrica del estiramiento del enlace OH en 3200 cm-1 (p < 0,001) indica que el epitelio neoplásico presenta un aumento del contenido de agua intersticial que se podría explicar parcialmente por la expresión de acuaporinas que alteran la permeabilidad al agua, induciendo de este modo la hidratación de las células neoplásicas. El aumento de agua intersticial puede estar interrelacionado con la disminución simultánea de lípidos hidrófobos. La importancia de este hallazgo se analizó calculando la relación de intensidad de pico (es decir, I2885/I3200) asociada con los lípidos y el agua intersticial. Esta proporción de pico por sí sola puede distinguir el adenoma de pólipos benignos con una sensibilidad del 81,3 % (191/235) y una especificidad del 80,4 % (1132/1397). Por lo tanto, el contenido de lípidos y la perfusión de agua en los pólipos son biomarcadores muy útiles para la neoplasia colorrectal in situ. La correlación directa de las huellas espectrales Raman epiteliales con la bioquímica celular y tisular puede, por lo tanto, profundizar la comprensión de la carcinogénesis colorrectal a nivel biomolecular in situ. Se puede emplear la utilización de picos o marcadores para diagnosticar el tipo de crecimiento anómalo que está presente.
Aprovechando la amplia gama de biomarcadores ópticos complementarios que incluyen proteínas, lípidos, ADN y las conformaciones de agua no intersticial e intersticial en una proteína, por primera vez se ha demostrado que se puede realizar un diagnóstico preciso de adenoma in vivo, tal como se muestra en las figuras 9A-B. El adenoma se pudo distinguir de las lesiones planas y polipoides benignas con una sensibilidad del 88,5 % (208/235) y una especificidad del 80,0 % (1118/1397), para cada espectro. Aunque la sonda Raman de tipo confocal de fibra óptica interroga selectivamente la capa epitelial poco profunda, todavía era capaz de discriminar de manera eficiente los adenocarcinomas de los adenomas, lo que significa que las células cancerosas invasivas están asociadas con anomalías biomoleculares.
La eficacia de la técnica de colonoscopia Raman confocal de fibra óptica de FP y HW para la detección y el diagnóstico in vivo de la neoplasia colorrectal es clara a partir de los resultados. También se ha demostrado que utilizando los rangos espectrales de FP y HW se obtiene una AUC que era superior a la utilización cualquiera de los rangos de FP o HW individualmente. Estos resultados sustanciales establecen que la técnica de espectroscopía Raman de FP y HW puede reducir en gran medida la tasa de clasificación errónea, confirmando la adición de información biomolecular complementaria de los rangos de FP y HW para mejorar el diagnóstico colorrectal in vivo. Por ejemplo, el rango espectral de HW contiene información relacionada con la conformación local de agua, así como con las fracciones de estiramiento del enlace CH2 y CH3 que no están contenidas en el rango de FP. La combinación de los rangos de FP y HW también puede ser utilizada con fines de diagnóstico ex vivo.
Cabe señalar que la combinación de las técnicas de espectroscopía Raman de FP y HW es habitualmente un procedimiento de funcionamiento preferido, tal como por medio de mediciones espectrales simultáneas de FP y HW. No obstante, la utilización de FP o HW in vivo produce resultados que son capaces de identificar diferentes tipos de
crecimiento anómalo. Como resultado, las realizaciones según la presente invención pueden utilizar FP solo, HW solo o una combinación de FP y HW (por ejemplo, simultáneamente).
Asimismo, cabe señalar que la utilización de subintervalos espectrales discretos (que también se pueden denominar valores predeterminados y/o marcadores de referencia) en los espectros de FP y HW de banda ancha proporciona una técnica o procedimiento de diagnóstico mejorado.
La utilización de una única rejilla reflectante de banda ancha recubierta de oro (por ejemplo, para obtener simultáneamente espectros de FP y HW) es un desarrollo importante en el equipo para una caracterización y diagnóstico objetivos de mayor precisión del tejido, por ejemplo, para caracterizar/diagnosticar crecimientos potencialmente anómalos, o anómalos, in vivo, con mayor precisión en tiempo real durante un procedimiento endoscópico. La única rejilla reflectante de banda ancha recubierta de oro significa que no hay necesidad de cambiar entre rejillas de difracción durante las mediciones in vivo, como había sido el caso en la técnica anterior. Evidentemente, esto tiene muchas ventajas. Por lo tanto, un sistema o dispositivo según una realización de la presente invención es capaz de realizar todas las mediciones necesarias sin que se requieran procesos de cambio. El dispositivo es más compacto y rentable, ya que tiene solo una rejilla en lugar de múltiples rejillas. Aunque el diseño de rejilla única está un poco comprometido en resolución espectral en comparación con un diseño de doble rejilla, este sistema compacto no afectaría, o no afectaría significativamente, a los propósitos o resultados del diagnóstico ya que la resolución espectral del sistema compacto coincide con el ancho de banda espectral Raman del tejido, que suele estar en el rango de ~10 cm-1.
La espectroscopía Raman confocal de fibra óptica proporciona un diagnóstico objetivo informatizado e ininterrumpido en tiempo real, que es sencillo de operar y no requiere aprendizaje endoscópico adicional o administración de agentes de contraste. Al permitir la evaluación funcional y biomolecular/bioquímica del epitelio intestinal in vivo, la introducción de la espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW tendrá un impacto importante en la práctica de la endoscopía gastrointestinal, tal como la colonoscopia. Este nuevo enfoque endoscópico biomolecular permite una toma de decisiones objetiva e inmediata durante los exámenes clínicos colorrectales. Puede haber dos funciones clave para la espectroscopía Raman confocal de fibra óptica en los exámenes colorrectales, como sigue:
(i) Enfoques preventivos e intervencionistas, incluida la identificación de pequeños adenomas de alto riesgo para polipectomía inmediata o REM. Se pueden dejar in situ pólipos hiperplásicos o lesiones planas sospechosas que tienen claramente una naturaleza de bajo riesgo, lo que reduce de manera eficiente los costes médicos;
(ii) la espectroscopía Raman confocal de fibra óptica también se puede utilizar para confirmar o rechazar de manera eficiente la presencia de adenocarcinoma colorrectal con un alto grado de precisión.
Las realizaciones según la presente invención abren la posibilidad de su utilización en cirugía endoscopía y laparoscópica del CCR, ofreciendo, por lo tanto, al gastroenterólogo una herramienta objetiva para la evaluación y definición en tiempo real de los márgenes de resección, así como la evaluación del seguimiento de la eficacia postratamiento o la recurrencia a nivel molecular. Esto puede ayudar en la escisión completa del tumor y la evaluación posterior de los márgenes para reducir el riesgo de recurrencia. Por lo tanto, la espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW según las realizaciones de la presente invención se puede utilizar en el sector de la endoscopía gastrointestinal, así como en otros sitios corporales, tanto en entornos de detección como en aplicaciones colorrectales terapéuticas, al permitir evaluaciones objetivas del tejido in vivo en tiempo real.
Otro ejemplo clínico utilizó una realización, según la presente invención, para el diagnóstico in vivo en tiempo real del carcinoma de células escamosas esofágicas (CCEE) durante la endoscopía mediante la obtención simultánea de ambos espectros Raman de huellas (FP) (es decir, ente 800 y 1800 cm-1) y de alto número de onda (HW) (es decir, entre 2800 y 3600 cm-1) de tejido esofágico in vivo. En este conjunto de experimentos, se obtuvieron un total de 1172 espectros Raman de tejido de FP/HW in vivo de alta calidad (normal (n = 860); CCEE (n = 312)) de 48 pacientes esofágicos sometidos a examen endoscópico rutinario. El conjunto total de datos Raman in vivo se dividió en dos partes: es decir, el 80 % del conjunto de datos total fue para aprendizaje (938 espectros Raman de FP/HW in vivo [normal (n = 736); CCEE (n = 202)] de 34 pacientes esofágicos); mientras que el 20 % restante del conjunto de datos total fue para pruebas predictivas (234 espectros Raman de fP/HW in vivo [normal (n = 124); CCEE (n = 110)] de 14 pacientes esofágicos).
La figura 11A muestra la desviación estándar (SD) promedio de espectros Raman de tejido de FP/HW in vivo ±1 (área sombreada) del conjunto de datos de aprendizaje (80 % del conjunto de datos total) para el desarrollo de algoritmos de diagnóstico de tejidos. También se muestran las imágenes correspondientes de los procedimientos Raman de FP/HW guiados por WLR. Se pueden observar picos Raman prominentes del tejido esofágico con asignaciones provisionales en la zona de FP, es decir:
• 853 cm-1, que está relacionado con las proteínas v(C-C),
• 1004 cm-1, que está relacionado con el anillo aromático de la fenilalanina,
• 1078 cm-1, que está relacionado con las v(C-C) de los lípidos,
• 1265 cm-1, que está relacionado con la amida III v(C-N) y S(N-H) de las proteínas,
• 1302 cm-1, que está relacionado con la torsión y agitación del CH2 de los lípidos,
• 1335 cm-1, que está relacionado con la torsión de CH3CH2 de las proteínas y de los ácidos nucleicos,
• 1445 cm-1, que está relacionado con la deformación de los 5(CH2) de proteínas y lípidos,
• 1618 cm-1, que está relacionado con los v(C=C) de las porfirinas
• 1655 cm-1, que está relacionado con la amida I v(C=O) de las proteínas, y
• 1745 cm-1, que está relacionado con los v(C=O) de los fosfolípidos.
Asimismo, se observan picos Raman intensos en la zona de HW como sigue:
• entre 2580 y 2885 cm-1, que está relacionado con el estiramiento simétrico y asimétrico de los CH2 de los lípidos, • 2940 cm-1, que está relacionado con el estiramiento de los CH3 de las proteínas,
• ~3300 cm-1, que está relacionado con la amida A (estiramiento de los NH de las proteínas), y
• la banda ancha Raman de agua (vibraciones de estiramiento de los OH que alcanzan un máximo de entre ~3250 y ~3400 cm-1), que están relacionadas con la conformación local y las interacciones de las uniones OH en el espacio intracelular y extracelular del tejido esofágico.
La figura 11B muestra la diferencia de espectros Raman entre CCEE y tejido esofágico normal ±1 SD (área sombreada), reflejando los cambios del componente activo Raman asociados con la progresión cancerosa en el esófago. La significativa diferencia (p = 1,3E-8, prueba t de Student bilateral no apareada ) en los espectros Raman de un CCEE y el tejido normal discernido demuestra el potencial de la endoscopía Raman de FP/HW simultánea para el diagnóstico in vivo del cáncer de esófago.
Para dilucidar los componentes activos Raman de importancia diagnóstica, la figura 12A muestra un gráfico logarítmico de los valores p calculados (prueba t de Student bilateral no apareada) para cada una de las intensidades Raman en la totalidad del rango espectral (es decir, entre 800 y 1800 cm-1 y entre 2800 y 3600 cm-1). En concreto, se encontraron las siguientes subzonas espectrales con diferencia estadísticamente significativa (p < 1E-10) entre un CCEE y un esófago normal: entre 840- y 940 cm-1, entre 1025 y 1100 cm-1, ente 1310 y 1355 cm-1, entre 1585 y 1690 cm-1 y entre 2830 y 2975 cm-1 relacionados con proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. También se observaron diferencias espectrales significativas en agua intersticial en los rangos entre 3160 y 3260 cm-1 y entre 3370 y 3420 cm-1.
La figura 12B muestra un histograma de las intensidades de pico Raman más estadísticamente diferentes (media ±1 SD) para los rangos de FP y HW, es decir, (i) 853 cm-1, (ii) 1078 cm-1, (iii) 1335 cm-1, (iv) 1618 cm-1, (v) 1655 cm-1, (vi) 2850 cm-1, (vii) 2885 cm-1, (viii) 3250 cm-1 y (ix) 3400 cm-1. Tal como se indica en la figura 13, la histopatología identifica anomalías celulares y arquitectónicas prominentes en un CCEE, las bandas Raman de tejido de FP/HW relativamente más altas o más bajas que representan diferentes componentes activos de Raman revelan los cambios bioquímicos/biomoleculares específicos del tejido esofágico acompañados de transformación de CCEE. Los cambios de los espectros Raman de FP/HW relacionados con lípidos, proteínas, ADN y el contenido de agua en el tejido reconfirman la capacidad de la espectroscopía Raman de FP/HW simultánea para detectar un CCEE a nivel molecular.
Aprovechando la información bioquímica/biomolecular complementaria identificada en los rangos espectrales de FP y HW, se implementaron PLS-dA y LOPCV en el conjunto de datos de aprendizaje (80 % del conjunto de datos total), para desarrollar un modelo de diagnóstico robusto para mejorar el diagnóstico de CCEE in vivo. Una kappa de Cohen de 0,91 demostró un alto nivel de acuerdo entre los patólogos independientes para los agrupamientos de tejidos esofágicos. La figura 14 muestra los gráficos dispersos de la probabilidad a posteriori de PLS-DA con validación cruzada de cada predicción Raman para (a) FP, (b) HW y (c) FP/HW integrados, respectivamente. La precisión diagnóstica con espectroscopía Raman de FP/HW integrada es del 97,3 % [sensibilidad del 97,0 % (196/202) y especificidad del 97,4 % (717/736)], superior a la utilización de técnica Raman solo de FP (precisión-90,9 %; sensibilidad-93,6 % (189/202), y especificidad-90,2 % (664/736)) o solo de HW (precisión-85,5 %; sensibilidad-78,2 % (158/202) y especificidad-87,5 % (644/736)).
Las curvas de características operativas del receptor (ROC) también se generaron tal como se muestra en la figura 15, siendo las áreas de integración bajo las curvas de rOc de 0,972, 0,928 y 0,995, respectivamente, para las técnicas FP, HW y FP/HW integrada. Los resultados anteriores confirman que la técnica Raman de FP/HW integrada o simultánea proporciona los mejores resultados de diagnóstico para la detección de CCEE in vivo en comparación con la técnica Raman solo de FP o solo de HW.
A la luz de estos prometedores resultados de diagnóstico, los algoritmos de diagnóstico y espectroscopía Raman de FP/HW simultáneos desarrollados se aplicaron al diagnóstico predictivo del conjunto de datos de prueba independiente (20 % del conjunto de datos total). La precisión predictiva del 93,2 % [es decir, sensibilidad del 92,7 % (102/110) y especificidad del 93,6 % (116/124)] se puede conseguir con espectroscopía Raman de FP/HW integrada, lo que demuestra las ventajas de la espectroscopía Raman de FP/HW integrada sobre la técnica Raman
solo de FP (precisión predictiva-91,0 %; sensibilidad-90,9 % (100/110) y especificidad-91,9 % (113/124)) o solo de HW (precisión predictiva-80,3 %; sensibilidad-76,4 % (84/110), y especificidad-83,9 % (104/124)) para CCEE in vivo. En otra realización, se consideró la identificación de otros tipos de cáncer, por ejemplo, utilizando el sistema 200 de la figura 2, para identificar cánceres de cuello uterino u otros tipos de crecimientos anómalos.
Para seleccionar los intervalos espectrales complementarios de las zonas espectrales de FP y HW, se incorporan técnicas de selección de variables/características en la técnica de endoscopía Raman de banda ancha. Los beneficios de la selección de características/variables incluyen:
1. mejorar el rendimiento predictivo;
2. reducir la complejidad del modelo; y
3. obtener conocimientos acerca del proceso espectroscópico subyacente, tales como la importancia de las variables/características.
En una realización, se utiliza un algoritmo de PLS-DA de intervalos, pero en principio se pueden aplicar otras, múltiples o todas las técnicas o procedimientos de selección de características/variables para seleccionar las zonas espectrales complementarias para cualquier algoritmo de agrupamiento, tales como PCA-LDA, SVM, LR, etc. Las técnicas de selección de características/variables podrían ser algoritmos genéticos (AG), inteligencia de enjambre, relaciones de selectividad, etc. Brevemente, el PLS-DA de intervalos utilizado en este caso realiza una búsqueda secuencial y exhaustiva de la mejor combinación de intervalos en los espectros Raman. Por consiguiente, el PLS-DA de intervalos crea modelos de PLS individuales, cada uno de los cuales utiliza solo un subconjunto o ventana de variables. Si hay 200 intervalos para un conjunto de datos espectrales determinado, se calculan 200 modelos de PLS-DA (es decir, uno para cada intervalo).
Se realiza una validación cruzada dejando un paciente fuera para cada modelo y se selecciona el intervalo que proporciona la mayor precisión de diagnóstico. Este es el modelo óptimo de intervalo único. Si solo se desea un intervalo, el algoritmo se detiene en este punto. No obstante, si se desea más de un intervalo (para aumentar el contenido de la información y mejorar el rendimiento predictivo), se pueden realizar ciclos adicionales. En el segundo ciclo, el primer intervalo seleccionado se utiliza en todos los modelos, pero se combina con cada uno de los otros intervalos restantes, uno cada vez, creando un nuevo conjunto de nuevos modelos de PLS. De esta manera, las zonas de valor diagnóstico complementario del rango de FP y HW son extraídas, mientras que los rangos espectrales redundantes o irrelevantes, tales como las zonas de escaso poder predictivo, son excluidas del modelo. En determinadas aplicaciones, se pueden utilizar otros rangos espectrales (por ejemplo, el llamado rango silencioso Raman, entre 2000 cm-1 y 2800 cm-1) distintos de los rangos de FP y HW.
Para demostrar una aplicación de esta realización, se obtuvo un espectro de banda ancha de una serie de pacientes cervicales. Se reclutaron 44 pacientes mujeres no embarazadas (entre 18 y 70 años de edad) que fueron sometidas a un procedimiento de colposcopia debido a una prueba de Papanicolaou anómala. Antes de las mediciones espectrales Raman de tejido in vivo, se aplicó una solución de ácido acético al 5 % por vía tópica en el cuello uterino durante 2 minutos para evaluar el blanqueamiento del color en el tejido (el grado de decoloración blanca en el cuello uterino está relacionado con el grado de precáncer).
Se midieron espectros Raman de banda ancha confocal y de autofluorescencia concomitante colocando la sonda confocal de fibra óptica en contacto ligero con el tejido. La figura 16A muestra los espectros Raman y de autofluorescencia promedio compuestos en bruto de tejidos cervicales normales (n = 356) y precancerosos (n = 120). Los espectros de tejido del cuello uterino normal y precanceroso muestran bandas vibratorias Raman débiles en la parte superior de la autofluorescencia, cerca de:
• ~854 cm-1, que está relacionado con la deformación aromática del glucógeno (CCH) y el estiramiento de los (C-C) de la proteína estructural y del colágeno,
~937 cm-1, que está relacionado con el estiramiento de las v(C-C) de la prolina, la valina y el glucógeno,
~ 1001 cm-1, que está relacionado con el anillo aromático (C-C) de la fenilalanina,
~1095 cm-1, que está relacionado con fosfolípidos y ácidos nucleicos),
~1253 cm-1, que está relacionado con la amida III,
~1313 cm-1, que está relacionado con el modo de torsión de los CH3CH2 de los lípidos/proteínas (colágeno), ~1445 cm-1, que está relacionado con el modo de flexión de los CH2 de las proteínas y los lípidos, ~1654 cm-1, que está relacionado con el modo de estiramiento de los (C=O) de la banda de la amida I de las proteínas,
~2946 cm-1, que está relacionado con el estiramiento de los CH3 de las proteínas, y
~3400 cm-1, que está relacionado con el estiramiento de los (OH) del agua.
Para demostrar que la técnica Raman de banda ancha integrada con la selección de intervalos puede mejorar el diagnóstico de precáncer de cuello uterino, se aplica un PLS-DA convencional al espectro continuo (figura 16A) y se aplica PLS-DA de intervalos para extraer zonas complementarias tal como se describió anteriormente. La figura 16B
muestra las subzonas espectrales seleccionadas (es decir, entre 1000 y 1020 cm-1, ente 1640 y 1660 cm-1, entre 2890 y 2910 cm-1 y entre 3290 y 3310 cm-1) después del PLS-DA de intervalos.
La figura 17 muestra el error de clasificación en función de la complejidad del algoritmo (es decir, el número de LV) tanto para el modelo de PLS-DA como el de PLS-DA de intervalos. Los mínimos se pueden encontrar en 9 y 5 lV respectivamente. Es evidente que al utilizar esas zonas espectrales complementarias de la zona de FP y Hw en lugar de todo el espectro, la precisión aumenta significativamente (el error de clasificación se reduce del 25 % al 15 %). Este ejemplo muestra que eliminando las zonas que contienen poca información y seleccionando los subintervalos complementarios de los espectros de FP y hW, la precisión para la detección in vivo del precáncer se puede mejorar significativamente aproximadamente en un 10 %. De hecho, esto prueba que las zonas de FP y HW contienen información complementaria para la caracterización de tejidos. Los gráficos de dispersión de las figuras 18A y 18B muestran los resultados de la clasificación probabilística. Por consiguiente, los intervalos discretos de la técnica de endoscopio Raman confocal de banda ancha permite actualmente a los médicos obtener una medida probabilística más precisa del riesgo asociado con lesiones sospechosas, mejorando de este modo significativamente el guiado de las biopsias físicas.
Cabe señalar que se pueden imponer umbrales a las clasificaciones probabilísticas (figura 18A y 18B) incorporando información previa, tal como antecedentes familiares de enfermedades. Por ejemplo, si un paciente pertenece a un grupo de alto riesgo, el aparato puede seleccionar automáticamente un umbral que proporcione una mayor sensibilidad para un precáncer o un cáncer. Otros tipos de datos para generar probabilidades previas podrían ser genéticos, proteómicos, epidemiológicos, tales como la edad, la etnia, el sexo, los hábitos de bebida, etc., el resultado de la formación de imágenes (por ejemplo, CT, MRI, etc.), síntomas, etc. La opción para ajustar los umbrales ha sido integrada en el software del endoscopio Raman clínico, que controla las mediciones espectrales.
En un ejemplo clínico adicional utilizando el endoscopio Raman confocal de banda ancha, se obtuvieron espectros Raman confocales de fibra óptica de una serie de pacientes gástricos, centrándose en el diagnóstico precoz de neoplasias malignas gástricas. La figura 19A muestra los espectros Raman promedio de FP y HW confocales in vivo medidos en 90 pacientes que presentaron diferentes tipos de tejido: benigno (n = 1950 espectros) y cáncer (n = 108 espectros) según lo confirmado por la caracterización histopatológica. Se pueden observar picos Raman tisulares prominentes de proteínas, ADN y lípidos en alrededor de:
936 cm-1, que está relacionado con las proteínas v(C-C),
1004 cm-1, que está relacionado con el anillo aromático vs(C-C) de la fenilalanina,
1078 cm-1, que está relacionado con las v(C-C) de los lípidos,
1265 cm-1, que está relacionado con la amida III v(C-N) y S(N-H) de las proteínas,
1302 cm-1, que está relacionado con la torsión y agitación del enlace CH2 de las proteínas,
1445 cm-1, que está relacionado con la deformación de los 5(CH2) de proteínas y lípidos,
1618 cm-1, que está relacionado con los v(C=C) de las porfirinas
1655 cm-1, que está relacionado con la amida I v(C=O) de las proteínas,
1745 cm-1, que está relacionado con los v(C=O) de los lípidos.
~2946 cm-1, que está relacionado con el estiramiento de los CH3 de las proteínas, y
~3400 cm-1, que está relacionado con el estiramiento de los (OH) del agua.
Para demostrar una realización según la presente invención, se aplica PLS-DA convencional al espectro continuo, así como PLS-DA de intervalos. La figura 19B muestra las zonas espectrales complementarias seleccionadas después del PLS-DA de intervalos (es decir, entre ~1050 y 1120 cm-1, entre ~1323 y 1490 cm-1 y entre ~2850 y 2870 cm-1).
La figura 20 muestra el error de clasificación en función de la complejidad del algoritmo (es decir, número de LV) tanto para PLS-DA como para PLS-DA de intervalos. Los errores mínimos en la clasificación se pueden encontrar utilizando 5 LV para ambos modelos. Es evidente que al elegir aquellas zonas espectrales significativas de diagnóstico complementario dentro del rango de FP y HW en lugar de en todo el espectro, el modelo se vuelve más preciso (el error de clasificación se reduce del 0,25 % al 0,18 %), tal como se muestra en el gráfico de dispersión en las figuras 21A y 21B. La sensibilidad aumenta del 72,2 % al 75,9 % y la especificidad aumenta del 74,7 % al 87,9 %, lo que muestra que la información complementaria mejora el diagnóstico del cáncer gástrico.
Otro ejemplo clínico más utilizó una realización según la presente invención en la que se utilizó una técnica endoscópica Raman de fibra óptica simultánea de FP y HW para la detección in vivo de lesiones precancerosas por metaplasia intestinal (MI) gástrica durante exámenes endoscópicos. En este ejemplo, el sistema 200 de espectroscopía Raman incluía un láser de diodo del infrarrojo cercano (NIR) (Aex = 785 nm) (salida máxima: 300 mW, B&W TEK Inc.), un espectrógrafo de formación de imágenes reflectantes de alto rendimiento (Acton LS-785 f/2, Princeton Instruments Inc.) equipado con una rejilla dorada de 830 gr/mm y una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) optimizada por NIR y enfriada de manera termoeléctrica (PIXIS: 400BR-eXcelon, Princeton Instruments Inc.). El sistema 200 obtuvo tejido Raman in vivo en el rango espectral de entre 400 y 3600 cm-1 con una resolución de ~9 cm-1. Se utilizó una sonda 108 Raman de fibra óptica de 1,9 m de largo con un diámetro exterior de
1,8 mm para el suministro de luz láser y la recogida de señales Raman de tejido epitelial in vivo. La sonda 108 endoscópica Raman diseñada para endoscopía incluye 18 x 200 pm fibras colectoras biseladas (NA = 0,22) que rodean una fibra central de suministro de luz (200 pm de diámetro, Na = 0,22). Se acopla una lente de bola de zafiro de 1,0 mm (NA = 1,78) a la punta de la fibra de la sonda para enfocar estrechamente la luz de excitación sobre la superficie del tejido gástrico, lo que permite la recogida efectiva del espectro Raman del recubrimiento epitelial. La capacidad selectiva en profundidad del sistema 200 Raman de espectroscopía de fibra óptica garantiza una interrogación del tejido menos profundo(< 200 pm) con volumen de sondaje microscópico (< 0,02 mm2), reduciendo de este modo las interferencias y la dilución de la señal de tejidos voluminosos más profundos, a la vez que se interroga de manera selectiva o preferencial el epitelio asociado con el inicio y la progresión neoplásicos. Las líneas de emisión atómica de las lámparas de calibración espectral de mercurio-argón (HG-1 y AR-1, comercializadas por Ocean Optics, Inc., Dunedin, FL) se utilizaron para la calibración de la longitud de onda. Todos los espectros calibrados en longitud de onda se corrigieron para la dependencia de la longitud de onda del sistema utilizando una lámpara de calibración de tungsteno (RS-10, EG&G, comercializados por Gamma Scientific, San Diego, CA). El sistema 200 endoscópico Raman de fibra óptica de FP/HW completo se puede controlar mediante un pedal y un marco de software intuitivo configurado para proporcionar una retroalimentación (por ejemplo, retroalimentación probabilística auditiva y/o visual) al gastroenterólogo en tiempo real.
Los espectros sin procesar fueron preprocesados mediante un filtro de suavizado Savitzky-Golay de tercer orden (un ancho de ventana de 3 píxeles) para eliminar ruido espectral. En la zona FP (entre 800 y 1800 cm-1), se encontró que un polinomio de quinto orden era óptimo para ajustar el fondo de AF en el espectro suavizado por ruido y, a continuación, este polinomio fue restado del espectro de FP medido para producir el espectro Raman de tejido de FP solamente. En el rango HW (entre 2800 y 3600 cm-1), se utilizó un ajuste polinomial de primer orden para eliminar el fondo de AF. Los espectros Raman de fP/HW fueron normalizados sobre el área integrada bajo los rangos de FP y HW, para permitir una mejor comparación de las formas espectrales y las intensidades relativas de la banda Raman entre tejido gástrico normal y MI. Todos los datos espectrales sin procesar fueron procesados en línea mediante un software desarrollado en el entorno de Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA). Se implementó análisis de componentes principales (PCA) y análisis discriminante lineal (LDA) para desarrollar algoritmos de diagnóstico robustos para la diferenciación entre tejidos gástricos normales y de iM. Se utilizó validación cruzada dejando un sitio de tejido fuera, para evaluar los modelos de diagnóstico desarrollados de manera imparcial. Se obtuvieron múltiples espectros Raman (ente 10 y 15) de cada sitio de tejido en 1 segundo, y se aplicó la estrategia de votación por mayoría para la clasificación final. Los resultados del diagnóstico se podían visualizar en un dispositivo de visualización tal como una pantalla de ordenador en tiempo real. También se generaron curvas de características operativas del receptor (ROC) cambiando sucesivamente los umbrales para determinar clasificaciones correctas e incorrectas para todos los tejidos. Todo el preprocesamiento de espectros y el análisis estadístico multivariante se realizaron en línea utilizando secuencias de comandos escritas en el entorno de programación Matlab.
Se obtuvieron con éxito un total de 1412 espectros Raman in vivo (es decir, normal (n = 1083 espectros) y MI (n = 329 espectros) de 115 sitios (es decir, normal (n = 88 sitios) y MI (n = 27 sitios)) según lo confirmado por exámenes histopatológicos de consenso.
La figura 22A muestra la desviación estándar (SD) promedio de espectros Raman in vivo ±1 (sombreada en gris claro) medida (es decir, normal y de MI). Se observan picos Raman de tejido prominentes con asignaciones provisionales en el rango de FP en:
• 875 cm-1, que está relacionado con las proteínas v(C-C),
• 1004 cm-1, que está relacionado con el anillo aromático vs(C-C) de la fenilalanina,
• 1078 cm-1, que está relacionado con las v(C-C) de los lípidos,
• 1302 cm-1, que está relacionado con la torsión y agitación de CH2 de los lípidos
• 1445 cm-1, que está relacionado con la deformación 8(CH2) de proteínas y lípidos, y
• 1655 cm-1, que está relacionado con la amida I v(C=O) de las proteínas.
Además, también se observan picos Raman intensos en la zona de HW en
• 2885 cm-1, que está relacionado con el estiramiento simétrico y asimétrico de los CH2 de los lípidos,
• 2940 cm-1, que está relacionado con el estiramiento de los CH3 de las proteínas,
• 3300 cm-1, que está relacionado con la amida A (estiramiento de los NH de las proteínas), y
• la banda ancha Raman del agua (vibraciones de estiramiento de los OH que alcanzan un máximo de ~3400 cm-1) que está relacionada con la conformación local y las interacciones de las uniones OH en el espacio celular y extracelular del tejido.
La figura 22B muestra los espectros de diferencia (es decir, MI - normal) ±1 SD (sombreada en gris claro) que resuelven las características espectrales distintivas (por ejemplo, intensidad de pico, desplazamiento y ensanchamiento de banda) asociadas con transformación de Mi, confirmando el potencial de la espectroscopía Raman de FP/HW para el diagnóstico precoz de una MI en la endoscopía.
Las figuras 23A-B muestran secciones representativas de hematoxilina y eosina (H y E) de los correspondientes sitios de tejido, utilizando endoscopía Raman, que incluye (a) mucosa gástrica normal (aumento x200); (b) metaplasia intestinal gástrica extensa, en la que el epitelio gástrico contiene células caliciformes aparentes (aumento x100). Las caracterizaciones histopatológicas revelan las características celulares y morfológicas de lesiones metaplásicas normales e intestinales en el tejido gástrico, mientras que la endoscopía Raman de FP/HW simultánea descubre los componentes bioquímicos específicos (por ejemplo, proteínas, lípidos y agua) del tejido epitelial a nivel molecular.
Para desarrollar sofisticados algoritmos de diagnóstico multivariante y comparar el rendimiento del diagnóstico de tejidos entre las tres técnicas Raman diferentes (es decir, FP, HW y FP/HW integrada), se implementó PCA-LDA junto con la prueba t de Student en los espectros Raman de tejido in vivo obtenidos, para evaluar las diferencias elusivas observadas en los espectros de diferentes tipos de tejidos. Los algoritmos de diagnóstico de PCA-LDA con validación cruzada dejando un sitio de tejido fuera se desarrollaron más basándose en PC significativos de diagnóstico (p < 0,01), tal como se muestra en la figura 24, que representan el 45,6 % (PC1), el 33,6 % (PC2), el 4,2 % (PC3), el 3,1 % (PC4) y el 1,2 % (PC5) de variaciones espectrales Raman, respectivamente. Las características de diferentes PC significativos son distintas; en concreto, algunas características de PC, tales como los picos, valles y formas espectrales de la figura 24, son similares a las de los patrones espectrales Raman de tejido. El primer PC significativo representa la mayor variación dentro de los conjuntos de datos espectrales (es decir, el 45,6 %), mientras que los PC sucesivos describen características que contribuyen a variaciones progresivamente menores. A continuación, los cinco PC de importancia diagnóstica son introducidos en el modelo de LDA, junto con una técnica de validación cruzada dejando un sitio de tejido fuera, para el diagnóstico y la clasificación del tejido gástrico.
La figura 25 muestra resultados de la clasificación de validación cruzada (probabilidades a posteriori) entre patologías normales y de MI mediante modelado del algoritmo de PCA-LDA calculado para la técnica Raman (a) FP, (b) HW y (c) FP/HW integrada o simultánea, respectivamente. Las líneas umbral (0,5) aplicadas a los gráficos de dispersión de probabilidad a posteriori conducen a precisiones de diagnóstico del 89,6 % (103/115), el 78,3 % (90/115) y el 91,3 % (105/115) (sensibilidades del 96,3 % (26/27), del 77,8 % (21/27), del 92,6 % (25/27), y especificidades del 87,5 % (77/88), el 78,4 % (69/88), el 90,9 % (80/88)), respectivamente, para las técnicas espectroscópicas Raman FP, HW y FP/HW integradas. Los resultados demuestran que la espectroscopía Raman de FP/HW integrada funciona mejor para el diagnóstico de una MI gástrica en comparación con la técnica solo de FP o la técnica solo de HW.
La figura 26 muestra curvas de ROC generadas para las técnicas Raman de FP, HW y FP/HW integradas, revelando las relaciones entre las sensibilidades diagnósticas y las especificidades de la identificación de una MI gástrica. Las áreas de integración bajo las curvas (AUC) son 0,94, 0,79 y 0,96, respectivamente, para las técnicas Raman FP, HW y FP/HW integradas, lo que vuelve a confirmar que la técnica Raman de FP/HW integrada proporciona el mejor rendimiento diagnóstico para detección de una MI gástrica in vivo. En general, los resultados anteriores demuestran el gran potencial de la técnica espectroscópica Raman de FP/HW simultánea desarrollada para mejorar el diagnóstico precoz de lesiones precancerosas gástricas in vivo durante un examen endoscópico.
La figura 27 muestra una realización adicional de espectros Raman medidos en la cavidad bucal en el rango solo de FP. Cabe señalar que existe una variabilidad interanatómica prominente entre diferentes sitios de tejido en la cavidad oral (por ejemplo, mucosa bucal y masticatoria). En esta realización, las zonas de gran variación interanatómica, tales como 956 cm-1 de hidroxiapatita y 1302 cm-1 y 1445 cm-1 de lípidos, se excluyen utilizando el procedimiento de selección de intervalos. Por lo tanto, se pueden utilizar técnicas de selección de variables/características para reducir el efecto de la variabilidad interanatómica en algoritmos de diagnóstico, al excluir zonas espectrales con gran variación. Este es un punto importante y tendrá aplicaciones en otros órganos, incluida la piel, la cavidad bucal, etc.
La figura 28 muestra un ejemplo de cómo se puede aplicar la predicción prospectivamente en tiempo real a nuevos espectros después de la implementación de un modelo de diagnóstico probabilístico basado en distintas subzonas espectrales.
Esto incluye varias etapas, que incluyen calibración de resta de fondo de fibra, truncamiento a los intervalos espectrales, preprocesamiento y, finalmente, aplicación del predictor para la clasificación de enfermedades.
Esta realización tiene varias ventajas importantes sobre la técnica anterior: en lugar de utilizar todo el espectro de banda ancha para el diagnóstico, esta técnica o procedimiento solo utiliza un subconjunto (por ejemplo, entre el 5 y el 20 %) de la información complementaria, simplificando en gran medida el modelo de diagnóstico. En segundo lugar, la selección de variables proporciona conocimientos cualitativos sobre la base bioquímica y biomolecular de la enfermedad. En tercer lugar, la precisión aumenta significativamente en comparación con el análisis espectral basado en todo el rango espectral. Además, si ciertos rangos espectrales tienen interferencias o factores de confusión (por ejemplo, sangre), etc., el efecto de estos se puede reducir de manera eficiente.
En un ejemplo, un paciente programado para un cribado endoscópico de síntomas sospechosos de reflujo esofágico es sometido a lo siguiente:
• Se lleva a cabo formación de imágenes endoscópicas WLR/NBI/AFI convencional en el esófago distal, que muestran una apariencia no concluyente de grandes segmentos de Barrett sospechosos de precáncer (es decir, displasia).
• Posteriormente, se aplica la técnica de endoscopio Raman confocal de banda ancha para dirigir objetivamente las biopsias a los segmentos de tejido sospechosos.
• La clasificación de Raman confocal se define en “normal” (ausencia de patología o gastritis), “bajo riesgo” (metaplasia intestinal) y “alto riesgo” (displasia/cáncer).
• La sonda Raman confocal es colocada contra el tejido en el esófago distal y el diagnóstico se da en tiempo real, en base a información complementaria extraída de la zona de FP y HW.
• La técnica de endoscopio Raman confocal es enfocada a sitios de tejido de alto riesgo en los que a continuación, se realiza una biopsia.
Las realizaciones según la presente invención demuestran que la espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de huella (FP) y de alto número de onda (HW) simultánea en tiempo real se puede realizar durante el cribado de pacientes in vivo. La espectroscopía Raman confocal de fibra óptica descubre los cambios biomoleculares y bioquímicos, tales como las proteínas, ADN, lípidos y agua que se encuentran en el epitelio durante la carcinogénesis colorrectal. La utilización de información biomolecular complementaria del rango de FP y HW mejora la detección de crecimientos anómalos en comparación con la utilización de los rangos solo de FP o de HW. La técnica de espectroscopía Raman confocal de fibra óptica de FP y HW tiene un gran potencial para mejorar la detección y caracterización del cáncer y del precáncer. La utilización de un subconjunto de la totalidad del espectro tiene una ventaja notable en el procesamiento y en la identificación de crecimientos anómalos en muchas partes diferentes del cuerpo. Se ha identificado especialmente que los rangos de FP y HW producen buenos resultados para los tipos de detección explicados en el presente documento. Se apreciará que, para otros tipos de detección, otros rangos pueden resultar más útiles.
Las realizaciones según la presente invención no están limitadas a la espectroscopía Raman biomédica, sino que también pueden tener aplicación en otras áreas. Estas incluyen, por ejemplo, espectroscopía de fluorescencia, espectroscopía de dispersión elástica, espectroscopía Raman mejorada superficial, tecnología analítica de procesos, monitorización del agua y del medioambiente, control de procesos farmacéuticos/suministro de medicamentos, industria alimentaria, industria del control de calidad, medicina forense, etc. En dichas realizaciones, la energía de excitación proporcionada por una fuente de iluminación se dirige a una muestra objetivo (por ejemplo, una muestra de un producto químico, agua o material/sustancia medioambiental, una muestra farmacéutica/de fármaco o de alimento, u otro tipo de muestra), que no necesitan incluir un tejido ni ser un tejido. Además, dichas realizaciones no necesitan implicar un endoscopio o una endoscopía. La referencia al término Raman en el presente documento pretende incluir otros tipos de espectroscopía, incluidos los mencionados anteriormente.
Las realizaciones según la presente invención pueden servir como una plataforma de diagnóstico para cualesquiera órganos, tales como el pulmón, GI superior e inferior (por ejemplo, esófago, estómago, colon y recto), hígado, vejiga, cabeza y cuello (por ejemplo, nasofaringe, laringe, cavidad oral), cuello uterino, piel, hueso o cualquier otro lugar donde se pueda utilizar un endoscopio, laparoscopio o artroscopio convencional.
Algunos de los espectros Raman de tejido obtenidos utilizando ciertas realizaciones según la presente invención pueden sufrir interferencias de iluminación del endoscopio. Esto puede dificultar el diagnóstico de crecimientos anómalos. Como resultado, una realización adicional ofrece una solución para eliminar dichas interferencias.
Un sistema de formación de imágenes trimodales endoscópicas, según una realización de la presente invención, utilizado para guiar la sonda de fibra Raman confocal tal como se ha descrito anteriormente, incluye una fuente de luz de xenón de arco corto de 300 W, un endoscopio gastrointestinal (GI) y un procesador de señal de video. La fuente de luz de xenón se acopla con diferentes conjuntos de filtros para proporcionar una o varias luces de iluminación diferentes para la formación de imágenes endoscópicas trimodales en tándem (no mostrado). Los filtros pueden incluir, por ejemplo: WLR (filtro rojo, entre 585 y 655nm; filtro verde, entre 500 y 575nm; filtro azul, entre 390 y 495nm), AFI (filtro azul, entre 390 y 470nm; filtro verde, entre 540 y 560nm para la normalización de imagen reflectante) y NBI (filtro verde, entre 530 y 550nm; filtro azul, entre 390 y 445nm).
La luz reflejada o la fluorescencia emitida desde el tejido se detecta utilizando dos CCD diferentes montados en la punta distal del endoscopio GI (no mostrados): uno es un CCD convencional para WLR/NBI, y otro, un CCD de alta sensibilidad para la observación de AFI. La lámpara de xenón de arco corto del endoscopio emite luz continua de banda ancha que cubre los rayos UV/VIS/NIR con picos discretos prominentes en el rango espectral NIR > 700 nm. Puesto que la espectroscopía Stokes Raman de excitación del láser de 785 nm también cae en el rango de NIR, la luz ambiental de xenón puede interferir con la señal Raman del tejido y oscurecer completamente las mediciones y el diagnóstico de tejidos in vivo. Por esta razón, el diagnóstico endoscópico Raman se realiza convencionalmente con luz de iluminación de xenón apagada o atenuada, lo que es muy indeseable en entornos clínicos.
Para eliminar la interferencia de iluminaciones ambientales de xenón, se propone una realización en la que la integración de un filtro de paso bajo de espejo caliente (corte en ~700 nm, transmisión promedio del ~95 % en rango visible) frente a la fuente de luz de xenón en el sistema de endoscopio, permite la eliminación de interferencias ambientales.
Para demostrar la aplicación de esta realización, se miden espectros Raman in vivo en diferentes condiciones de iluminación endoscópica. La figura 29A muestra el espectro Raman de tejido sin contacto, obtenido durante endoscopía sin el espejo caliente integrado. Se pueden discernir interferencias importantes de la luz de xenón que sobrepasan completamente la señal Raman del tejido. La figura 29B muestra el espectro Raman de tejido en modo sin contacto después de la integración de un filtro de paso bajo de espejo caliente frente a la lámpara de xenón. Tal como se puede ver, las interferencias de xenón se eliminan sustancialmente. Ahora se pueden observar picos Raman de tejido de alta resolución con asignaciones moleculares provisionales como sigue:
• 853 cm-1, que está relacionado con las proteínas v(C-C),
• 1004 cm-1, que está relacionado con el anillo aromático vs(C-C) de la fenilalanina,
• 1078 cm-1, que está relacionado con las v(C-C) de los lípidos,
• 1265 cm-1, que está relacionado con la amida III v(C-N) y ó(N-H) de las proteínas,
• 1302 cm-1, que está relacionado con la torsión y la agitación de los CH3CH2 de las proteínas,
• 1445 cm-1, que está relacionado con la deformación de los 5(CH2) de proteínas y lípidos,
• 1655 cm-1, que está relacionado con la amida I v(C=O) de las proteínas, y
• 1745 cm-1, que está relacionado con los v(C=O) de los lípidos.
Los espectros Raman se midieron con la sonda en contacto con el tejido. La figura 30A muestra el espectro Raman de tejido medido en modo de contacto en ausencia del espejo caliente. La figura 30B muestra el espectro Raman de tejido en modo de contacto después de la integración de un filtro de paso bajo de espejo caliente frente a la lámpara de xenón. En general, estos resultados muestran que la integración del espejo caliente puede eliminar por completo las interferencias ambientales del xenón de los espectros Raman del tejido in vivo tanto en modo sin contacto como en modo de contacto de la sonda Raman confocal. Además, es evidente por las figuras que la interferencia del xenón es más prominente en el modo sin contacto de la sonda Raman con el tejido, ya que se acopla más luz al cabezal de la sonda. Por lo tanto, esta realización es de particular valor en órganos tales como laringe/bronquios, donde se prefiere el modo sin contacto debido a la estimulación del reflejo de la tos, o en pacientes con tumores avanzados donde el contacto de la sonda Raman con tejido puede inducir sangrado y riesgo de diseminación de células cancerígenas.
Cabe señalar que el filtrado de la luz de iluminación como guía utilizando un espejo caliente no está limitado a la aplicación endoscópica, sino que es más general, para filtrar cualquier luz o modalidad de formación de imágenes utilizada para guiar la espectroscopía de tejido de NIR (es decir, Espectroscopía Raman mejorada en superficie (SERS, Surface Enhanced Raman Spectroscopy), fluorescencia NIR o reflectancia NIR) para órganos internos o externos (por ejemplo, piel, cuello uterino, vejiga, estómago, esófago, nasofaringe, laringe, cavidad oral, colon, recto, pulmón, etc.).
Por lo tanto, el concepto se ha generalizado en la figura 31, que muestra un sistema 2100. El sistema 2100 incluye una sonda 2102, que puede ser puesta en contacto con un tejido 2104. El sistema incluye, además, un láser de NIR 2106, un espectrógrafo 2108 y un CCD 2110. Un filtro de paso largo de borde 2112 está situado entre la sonda y el espectrógrafo y un filtro de paso banda 2114 está situado entre la sonda y el láser. Se utiliza un PC 2116 y el software asociado para controlar el sistema. El tejido también está iluminado por una fuente de iluminación 2118 a través de un filtro de paso bajo de espejo caliente 2120. Se apreciará que este sistema puede variar en términos de los elementos que componen el sistema y la orientación y posición de dichos elementos, dependiendo de la aplicación precisa para la que se utilice esta realización.
Se sabe que la estandarización de los instrumentos se ha quedado muy por detrás del ritmo de los avances en la espectroscopía Raman clínica. Debido a que la espectroscopía Raman de tejidos se basa en picos inherentemente débiles y de alta resolución, la tecnología es muy sensible a los cambios instrumentales. Por lo tanto, es imperativo desarrollar y emplear técnicas para probar/calibrar y estandarizar la instrumentación de endoscopía Raman antes de las mediciones clínicas en pacientes humanos, para garantizar que el diagnóstico in vivo es fiable y coherente entre diferentes sistemas Raman.
La figura 32 muestra el principio básico de la prueba del endoscopio Raman antes de la aplicación en pacientes, que comprende (i) puesta en marcha del sistema, (ii) prueba del sistema de endoscopía Raman (iii) aplicación del endoscopio Raman en pacientes. Se propone un nuevo aparato y técnica o procedimiento para probar el sistema y calibrar un endoscopio Raman de fibra óptica. Esto incluye un dispositivo opto-mecánico y un conjunto de rutinas de instrucciones de programa implementadas en el software Raman para la prueba y calibración automáticas del sistema en aplicaciones de diagnóstico Raman de fibra óptica. El dispositivo de calibración consiste en fuentes de radiación de calibración espectral (por ejemplo, lámparas de mercurio y argón, emisores de espectros de NIR, luz láser, etc.), una fuente de radiación de intensidad de luz, un medidor de potencia láser, un fantoma de tejido, junto
con piezas opto-mecánicas automatizadas (por ejemplo, un motor paso a paso) y controladores para la estandarización del sistema de endoscopía Raman. El dispositivo de calibración es una parte integral de la plataforma clínica de endoscopía Raman, pero también se puede utilizar como dispositivo independiente, para pruebas generales y calibración de fibra óptica que comprende una rueda 2302 de filtros accionada por un motor paso a paso, tal como el FW102C, Thorlabs Inc. Newton, NJ, EE., que tiene diferentes muestras 2304 integradas en el mismo. La sonda 2306 Raman de fibra óptica flexible se puede montar en el dispositivo de calibración tal como se muestra esquemáticamente en la figura 33.
La rotación de la rueda de filtros ha sido sincronizada con la excitación y obtención del láser en el software clínico Raman. Se obtienen espectros de cada muestra en la rueda de filtros y se almacenan. Las etapas realizadas en las rutinas de calibración/prueba comprenden la medición de las características del CCD (es decir, temperatura, corriente de oscuridad), potencia de excitación del láser y fondo de fibra de sílice fundida, un material fluorescente para la calibración/prueba de la respuesta del sistema, un material para la calibración/prueba de la longitud de onda y, finalmente, un fantoma de tejido. Las señales medidas se pueden utilizar para recalibrar los parámetros (por ejemplo, respuesta de intensidad, precisión de longitud de onda, ruido de fondo, etc.) del sistema de endoscopio Raman.
A continuación, se describirán las rutinas y las muestras estándar que se han integrado en la rueda de filtros del dispositivo de calibración, junto con ejemplos de las señales obtenidas. La figura 34 muestra el procedimiento (2400) para probar el endoscopio Raman antes de su utilización en pacientes que utilizan el dispositivo de calibración. El análisis de señales (es decir, detección de fallos o calibración) se puede realizar después de cada medición o después de que se hayan completado todas las mediciones (tal como se muestra en este ejemplo específico). En un primer caso, se mide una señal de detector del CCD y se registra (2402) la temperatura. Esto puede incluir medir múltiples espectros (es decir, a un tiempo de exposición de entre 0 y 1 segundos) de la intensidad de la señal en ausencia de excitación del láser. Posteriormente, el sistema verifica que la corriente de oscuridad sea menor que un valor máximo que se almacenó anteriormente en un archivo de configuración de fábrica. Esta realización incluye, además, garantizar que el coeficiente de variación de la corriente de oscuridad, sobre una serie de espectros, es menor que un valor máximo que también se almacenó anteriormente en el archivo de configuración.
La potencia de excitación del láser en la punta de la sonda Raman de fibra óptica también se mide (2402) utilizando un medidor de potencia de láser integrado, para garantizar que esté dentro de un rango que es menor que el límite máximo permisible de exposición de la piel del Instituto Nacional Estadounidense de Estándares (ANSI - American National Standards Institute) (que se establece en un rayo láser de 785 nm). Esta realización incluye garantizar que la potencia del láser sea menor que un valor máximo que se almacenó anteriormente en el archivo de configuración. La rueda de filtros contiene una ranura vacía con un entorno oscuro para que se pueda medir (2404) una señal de fondo de la sonda de fibra de sílice fundida. Se miden múltiples espectros de los fondos de la sonda de fibra con excitación láser y diferentes tiempos de exposición (por ejemplo, entre 0,1 y 1,0 s). Estos espectros contienen información acerca del estado de la sonda de fibra óptica. Por ejemplo, si la fibra está dañada o la punta de la sonda está contaminada, esto se podría reflejar en un aumento en intensidad Raman o de fluorescencia.
En la figura 35 se muestra un ejemplo de señales de fondo para la sonda de endoscopía Raman de banda ancha para dos sondas de fibra óptica diferentes. Esta realización incluye, además, garantizar que el coeficiente de variación, sobre una serie de espectros, sea menor que un valor máximo que se almacenó anteriormente en el archivo de configuración. El fondo de la sonda de fibra óptica medido también se almacena en la memoria, para su procesamiento posterior (es decir, resta) de los espectros Raman de tejido in vivo durante el procesamiento en tiempo real.
Un vidrio fluorescente que presenta un amplio espectro de fluorescencia estable (por ejemplo, vidrio de borosilicato dopado con cromo, vidrio verde, kopp2412, etc.) también se mide y almacena para probar y/o calibrar eficiencia de la respuesta y de la recogida del sistema (2406) de endoscopía Raman. El vidrio de fluorescencia estándar está calibrado en fábrica previamente, utilizando una lámpara de tungsteno del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, National Institute of Standards and Technology), según el procedimiento detallado en la figura 36. La respuesta del sistema se puede comparar con una respuesta que se almacenó anteriormente en el archivo de configuración. Esta realización incluye, además, garantizar que el coeficiente de variación, sobre una serie de espectros, sea menor que un valor máximo que se almacenó anteriormente en el archivo de configuración. El espectro de la muestra estándar de respuesta se puede utilizar para recalibrar el sistema a la calibración de fábrica. La figura 37 muestra ejemplos de funciones de calibración derivadas de un vidrio estándar fluorescente (es decir, kopp2412) utilizando 2 sondas de fibra óptica diferentes.
También se mide (2408) un material con picos Raman estrechos bien definidos. Un ejemplo es el poliestireno, mostrado en la figura 38. El estándar de longitud de onda se utiliza para evaluar si ha habido una desviación en el eje de la longitud de onda debido a una desalineación óptica. El espectro se compara (por ejemplo, utilizando coeficientes de correlación o identificación de picos, etc.) con un espectro que se almacenó anteriormente en el archivo de configuración. Esto incluye prueba de resolución (es decir, ancho completo de la mitad del máximo
(FWHM, Full Width of Half Máximum)) y verificación de las posiciones de los picos. El espectro del material con picos Raman estrechos y bien definidos también se puede utilizar para realinear el sistema a la alineación de fábrica anterior almacenada en el archivo de configuración. La recalibración comprende un mapeo polinomial (por ejemplo, de un orden entre 3 y 5) entre picos predefinidos desde el eje de longitud de onda calibrado de fábrica y picos correspondientes del espectro desalineado. En la figura 39, se muestra un ejemplo que muestra el mapeo polinomial de picos después de la recalibración.
La rueda de filtros también contiene un fantoma de tejido en capas. El fantoma de tejido consiste en un material con propiedades difusas y/o fantomas de tejido en capas que presentan picos Raman bien conocidos que son medidos (2410). Esta realización incluye, además, garantizar que el coeficiente de variación, sobre una serie de espectros, sea menor que un valor máximo que se almacenó anteriormente en el archivo de configuración. En las figuras 40A-B, se proporciona un ejemplo que muestra una comparación de espectros Raman obtenidos del sándwich fantasma de dos capas de poliestireno y polietileno utilizando diferentes sondas Raman. Los espectros Raman de los fantomas de tejido en capas se utilizan para verificar la selectividad de profundidad de la sonda Raman de fibra óptica así como la calidad del espectro. La relación de la señal desde la capa superior a la inferior (por ejemplo, 1002 cm-1 y 1296 cm-1, respectivamente) se utiliza como indicador cualitativo y cuantitativo de la selectividad de profundidad para una sonda confocal de fibra óptica determinada. Esta realización incluye garantizar que la selectividad de profundidad sea menor que un valor máximo que se almacenó anteriormente en el archivo de configuración.
Una vez realizadas las diversas mediciones, se lleva a cabo (2412) el análisis de las señales. Esto es para identificar problemas tales como detección de fallos, problemas de calibración, etc. Si se detectan problemas, el sistema se define como no satisfactorio (2414). Alternativamente, el sistema se define como satisfactorio (2416) si no se encuentran problemas.
Otra realización incluye un conjunto de instrucciones de programa o marco de software integrado con, o como una GUI, que es capaz de mostrar y guardar datos Raman para cada espectro y lesión, en respuesta a la selección o selecciones/entrada o entradas del usuario, cuando se realiza el diagnóstico endoscópico Raman. Por ejemplo, si se realiza una primera selección o se presiona un primer pulsador, se guardarán los datos Raman de una primera lesión. Si se realiza una segunda selección o se presiona un segundo pulsador, se guardarán los datos Raman de una segunda lesión, etc. Dicho sistema también incluye el almacenamiento de información del paciente, tiempo de integración, potencia de excitación del láser, hora, fecha, diagnóstico, señal de fondo de la sonda, función de calibración del sistema, video de endoscopía y un archivo de registro que contiene detalles de la medición. Se puede disponer un dispositivo de pedal integrado para la interconexión y el almacenamiento de datos por el médico. Si se presiona el conmutador de pedal, los datos obtenidos se almacenarán como una primera lesión. Si se presiona una segunda vez, los datos se almacenarán como una segunda lesión, etc. El conmutador de pedal también puede contener un pedal de seguridad para encender y apagar la excitación del láser.
Otra realización incluye un conjunto de instrucciones de programa o marco de software para visualizar el diagnóstico clínico Raman junto con la formación de imágenes de vídeo de campo amplio grabada. Un sistema de formación de imágenes endoscópicas de video (es decir, WLR/NBI/AFI) y un sistema de grabación de video han sido integrados en el software del endoscopio Raman. Tanto el video endoscópico de campo amplio como el diagnóstico Raman in vivo del tejido del que se ha obtenido una imagen se pueden mostrar en un dispositivo de visualización, tal como una pantalla de ordenador. El video de la endoscopía se sincroniza en el tiempo con espectros Raman de tejido medidos. Por lo tanto, el diagnóstico espectral Raman se puede mostrar simultáneamente con la reproducción de video. Esto permite al médico hacer un seguimiento hacia atrás de la correlación precisa de cada paciente entre el diagnóstico endoscópico Raman y el sitio de tejido sospechoso muestreado. Este software de formación de imágenes y de endoscopía Raman integrado es una mejora sustancial en el sistema clínico, que permite la revisión de datos clínicos históricos.
El limitado rango dinámico de los CCD y las señales Raman débiles de tejido siguen siendo un reto en las aplicaciones endoscópicas Raman, dado que los tejidos in vivo presentan un grado variable de autofluorescencia. Para algunos tejidos (por ejemplo, estómago, pulmón, lengua dorsal, hígado), la saturación del detector puede ocurrir en 0,1 segundos, o incluso en menos de 0,05 segundos. Para estos tejidos, la señal Raman puede tener un ruido prominente en comparación con otros tipos de tejidos (por ejemplo, esófago, nasofaringe, laringe, cuello uterino, etc.). En general, la intensidad de la señal Raman del tejido escala linealmente con la potencia de excitación del láser y el tiempo de exposición. La relación señal/ruido (S/N, Signal to Noise) es proporcional a la raíz cuadrada del tiempo de exposición. Actualmente, el usuario ajusta manualmente el tiempo de exposición o las potencias de excitación del láser para cada espectro obtenido mediante la técnica de endoscopía Raman. Esto puede resultar muy poco práctico en aplicaciones en tiempo real. Por lo tanto, es fundamental definir procedimientos automatizados para prevenir la saturación del CCD y garantizar que el espectro Raman se obtiene con una relación de S/N óptima en tiempos que son aceptables en condiciones clínicas. Se requiere la realización de un verdadero diagnóstico en tiempo real para que la tecnología de endoscopía Raman obtenga una amplia aceptación en la medicina clínica. El nuevo procedimiento para ajustar automáticamente la potencia de excitación del láser, el tiempo de exposición y las acumulaciones de espectro para realizar un diagnóstico ininterrumpido en tiempo real durante mediciones clínicas
Raman con una alta relación de S/N es invaluable en esta búsqueda. Se exponen dos técnicas o procedimientos automatizados a modo de ejemplo representativo.
En una primera técnica o procedimiento, tal como se muestra haciendo referencia a la figura 41, el tiempo de exposición está fijado (por ejemplo, en 0,1 segundos) (3102) y la potencia de excitación del láser se asigna como variable y se ajusta según sea necesario (3104). Se miden (3106) los espectros Raman y se determina (3108) la relación señal/ruido. La estimación del ruido en los espectros se basa en transformada de Fourier, diferenciación u otros procedimientos para cuantificar el nivel de ruido. Si los espectros Raman tienen una mala relación señal/ruido (S/N) (3110), en la medición posterior, se acumulan varios espectros Raman (por ejemplo, N = 2 ... 3) (3112) antes de una lectura. Si el CCD está saturado para un espectro determinado (3114), la potencia de excitación del láser de la medición Raman posterior se reduce en un número según el grado de saturación (3116). Si el espectro no está saturado, se utiliza para el diagnóstico (3118). El grado de saturación se define como un % de los píxeles saturados. Si el espectro ha sido leído con recuentos de intensidad (< 70 % o > 90 % del rango dinámico) (3120) la potencia de excitación del láser de la medición Raman subsiguiente aumenta de manera que la intensidad de la señal se encuentre dentro del 70 al 90 % del rango dinámico (3122). Una realización impone un límite superior a la potencia de excitación del láser (por ejemplo, 25 mW). En otra realización, la acumulación de varios espectros (por ejemplo, n = 2) se realiza de manera coherente. Se puede llevar a cabo resta del fondo, preprocesamiento, detección de valores atípicos, predicción de enfermedades y visualización (3124).
En una segunda técnica o procedimiento tal como se muestra con respecto a la figura 42, la potencia de excitación del láser está fijada (por ejemplo, a 25 mW) (3202) y el tiempo de exposición se asigna como una variable (3204). Se miden (3206) los espectros Raman y se determina (3208) la relación señal/ruido. La estimación del ruido se basa en transformada de Fourier, diferenciación o en cualquier procedimiento para cuantificar el nivel de ruido. Si el espectro Raman presenta una relación de S/N deficiente (3210), en la medición posterior, se acumulan varios espectros Raman (por ejemplo, n = 2 ... 3) (3212) antes de la lectura. Si el CCD está saturado (3214) para un espectro dado, el tiempo de exposición de la medición Raman posterior se reduce (3216) con un número según el grado de saturación. Si el espectro no está saturado, se utiliza para el diagnóstico (3218). El grado de saturación se define como el % de píxeles saturados. Si el espectro tiene un número bajo de recuentos de intensidad (por ejemplo, < 70 % o > 90 % del rango dinámico) (3220), el tiempo de exposición de la medición Raman subsiguiente se aumenta (3222) para que la intensidad de la señal se encuentre dentro del 70 al 90 % del rango dinámico. Una realización impone un límite superior al tiempo de exposición (por ejemplo, 0,5 segundos). En otra realización, la acumulación de varios espectros se lleva a cabo de manera coherente si el tiempo de integración es muy bajo (por ejemplo, < 0,1 s). Se puede llevar a cabo resta del fondo, preprocesamiento, detección de valores atípicos, predicción de enfermedades y visualización (3224).
Las dos funciones anteriores detalladas con respecto a las figuras 36 y 37, respectivamente, están integradas en el software operativo. Ajustar solo la potencia del láser tiene la ventaja de que el tiempo de exposición se mantiene constante y puede ser muy bajo (por ejemplo, de 0,1 segundos). Los procedimientos anteriores son de gran valor en la endoscopía Raman clínica para realizar un diagnóstico ininterrumpido en tiempo real con una alta relación de S/N, pero también se generalizan a otras modalidades tales como la endoscopía Raman mejorada en superficie (SERS), espectroscopía de reflectancia y fluorescencia. La concepción general del ajuste automatizado del tiempo de exposición, la potencia de excitación del láser y la acumulación para mejorar la calidad de la señal, prevenir la saturación del CCD y realizar un diagnóstico en tiempo real es una característica importante de esta realización de la presente invención. Otra realización incluye la sincronización de la excitación del láser con la obtención. En otras palabras, antes de la obtención de la señal, la excitación del láser se conecta, y después de la obtención, la excitación del láser se desconecta.
Otra realización adicional según la presente invención incluye la capacidad de conmutar entre diferentes sondas de fibra óptica y diferentes órganos. Para cada tipo de sonda de fibra óptica (por ejemplo, una sonda confocal o de volumen), existe una base de datos con modelos de diagnóstico específicos para cada órgano (es decir, laringe, colon, nasofaringe, estómago, esófago, cavidad oral, piel, cuello uterino, vejiga, etc.). Por ejemplo, si un usuario elige la nasofaringe como órgano, se cargan en el sistema uno o varios modelos pertenecientes a la nasofaringe. En la figura 43 se muestra una estructura de base de datos representativa. El modelo o modelos pueden incluir algoritmos de diagnóstico multivariantes y/o modelos de detección de valores atípicos multivariantes.
Se apreciará que las diversas realizaciones descritas anteriormente no pretenden ser limitativas en su interpretación. Por el contrario, la invención está definida en las reivindicaciones adjuntas. Algunos de los procesos pueden ser implementados en hardware, software o cualquier combinación de los mismos.
Lista de signos de referencia
100 sistema - espectroscopio Raman confocal de fibra óptica
102 láser de diodo
104 espectrógrafo de formación de imágenes
105 cuerpo cilíndrico alargado
106 cámara
108 sonda
110 fibra óptica
112 filtro de paso banda
114 filtro de paso largo
116 punta
124 sistema de microcontrolador
200 aparato
202 láser de diodo
204 espectrógrafo reflectante
206 cámara
208 sonda Raman confocal de fibra óptica
ADN ácido desoxirribonucleico
HW régimen de número de ondas alto
FP huella
NIR Infrarrojo cercano
GUI Interfaz gráfica de usuario
PCA análisis de componentes principales
SVM máquina de vectores de soporte
LR regresión logística
LDA análisis discriminante lineal
PLS mínimos cuadrados parciales
DA análisis discriminante
LV variables latentes
PEG polietilenglicol
ACO optimización de colonia de hormigas
CART árboles de clasificación y regresión AdaBoost impulso adaptativo
H y E hematoxilina y eosina
ANOVA análisis de varianza
LSD diferencias menos significativas
ROC características operativas del receptor AUC área bajo las curvas
SD desviación estándar
MI metaplasia intestinal
CCD dispositivo de carga acoplada
GI gastrointestinal
SERS espectroscopía Raman mejorada en superficie NIST Instituto Nacional de Estándares y Tecnología FWHM ancho completo de la mitad del máximo
Claims (11)
1. Aparato de espectroscopia Raman (2100), que comprende:
una primera fuente de iluminación (2106), configurada para dirigir una salida de iluminación colimada a un tejido (2104);
un espectrógrafo Raman (2108), configurado para detectar simultáneamente espectros Raman de huellas (FP) y alto número de onda (HW) a partir de iluminación dispersada por el tejido; y
un módulo informatizado de control y análisis (2116), que comprende, como mínimo, una unidad de procesamiento y memoria que almacena instrucciones de programa ejecutables por la, como mínimo, una unidad de procesamiento, para analizar subintervalos espectrales discretos de los espectros Raman en rangos de números de onda de FP y HW para identificar una coincidencia con picos específicos en los espectros Raman detectados de uno o ambos rangos de números de onda,
caracterizado por que comprende, además:
una fuente de iluminación adicional (2118) configurada para emitir iluminación adicional al tejido mientras la primera fuente de iluminación dirige la iluminación colimada al tejido y
un filtro de espejo caliente (2120) configurado para compensar la interferencia de iluminación entre la iluminación colimada emitida por la primera fuente de iluminación (2106) y la iluminación adicional emitida por la fuente de iluminación adicional (2118).
2. Aparato (2100), según la reivindicación 1, caracterizado por que el espectrógrafo Raman (2108) tiene una única rejilla de difracción de banda ancha, y en el que el aparato (2100) comprende, además, una sonda (2102), para transmitir la iluminación colimada al tejido y devolver los espectros Raman del tejido al espectrógrafo (2108).
3. Aparato (2100), según la reivindicación 2, caracterizado por que el módulo informatizado de control y análisis (2116) incluye instrucciones de programa ejecutables por la, como mínimo, una unidad de procesamiento para diagnosticar un crecimiento anómalo en base a la coincidencia.
4. Aparato (2100), según la reivindicación 2, caracterizado por que la sonda (2102) comprende una sonda de fibra óptica confocal y, opcionalmente, un endoscopio que tiene un cuerpo cilíndrico alargado que tiene un canal de instrumentos en cuyo interior está alojada la sonda (2102).
5. Aparato (2100), según la reivindicación 2, caracterizado por que el módulo informatizado de control y análisis (2116) incluye instrucciones de programa ejecutables por la, como mínimo, una unidad de procesamiento para ajustar dinámicamente la potencia de la iluminación colimada.
6. Aparato (2100), según la reivindicación 2, caracterizado por que el módulo informatizado de control y análisis (2116) incluye instrucciones de programa ejecutables por la como mínimo una unidad de procesamiento para ajustar dinámicamente el tiempo durante el cual el tejido está expuesto a la iluminación colimada.
7. Aparato (2100), según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende, además, un aparato de calibración configurado para estandarizar la sonda (2102) o todo el aparato Raman con respecto a, como mínimo, una referencia de calibración.
8. Procedimiento de espectroscopía Raman, realizado por un aparato de espectroscopía Raman (2100), comprendiendo el procedimiento:
dirigir la iluminación colimada emitida por una primera fuente de iluminación (2106) a un tejido (2104); detectar simultáneamente por medio de un espectrógrafo Raman (2108) de huellas (FP) y alto número de onda (HW), espectros Raman de iluminación dispersada por el tejido;
analizar subintervalos espectrales discretos en los espectros Raman detectados en los rangos de longitud de onda de FP y HW; e
identificar una coincidencia con uno o varios marcadores de referencia en uno o ambos rangos de número de onda; caracterizado por que comprende, además:
dirigir una iluminación adicional al tejido utilizando una fuente de iluminación adicional (2118), dirigiendo al mismo tiempo la iluminación colimada emitida por la primera fuente de iluminación (2106) al tejido; y
compensar la interferencia de iluminación entre la iluminación colimada emitida por la primera fuente de iluminación (2106) y la iluminación adicional emitida por la fuente de iluminación adicional (2118) utilizando un filtro de espejo caliente (2120).
9. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por que la detección simultánea de espectros Raman de FP y HW comprende iluminación difractante en ambos rangos de longitud de onda de FP y HW utilizando una única rejilla de difracción de banda ancha.
10. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por que comprende, además, ajustar dinámicamente la potencia de la iluminación y/o ajustar el tiempo durante el cual el tejido está expuesto a la iluminación.
11. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por que comprende, además, realizar un procedimiento de calibración o estandarización para estandarizar el aparato Raman con respecto a, como mínimo, una referencia de calibración, antes de iluminar el tejido.
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