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ES2842595T3 - Vacuna contra la rinitis equina - Google Patents

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ES2842595T3
ES2842595T3 ES12710420T ES12710420T ES2842595T3 ES 2842595 T3 ES2842595 T3 ES 2842595T3 ES 12710420 T ES12710420 T ES 12710420T ES 12710420 T ES12710420 T ES 12710420T ES 2842595 T3 ES2842595 T3 ES 2842595T3
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virus
erbv
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equine
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Phillip Wayne Hayes
Kristina J Hennessy
Laurent Viel
Andres Diaz-Mendez
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Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende el virus A de la rinitis equina inactivado (ERAV), en la que el ERAV es ERAV/ON/05 depositado bajo la ATCC acceso No. PTA-11828.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra la rinitis equina
Antecedentes de la invención
Las infecciones respiratorias virales equinas se asocian comúnmente con el movimiento de caballos y se informan anualmente brotes respiratorios en todo el mundo. La influenza equina 2 (AE2-H3N8), el herpesvirus equino 1 y 4 (EHV1/4) y los virus de la rinitis equina A y B (ERAV y ERBV, respectivamente) se encuentran entre los virus más importantes aislados del tracto respiratorio superior durante los brotes respiratorios.
En particular, se ha informado de ERAV en la enfermedad respiratoria febril aguda en caballos (Li y col., J. Clin. Microbiol. 35: 937-943; 1997). De manera similar, un estudio reciente en Ontario encontró que ERBV y ERAV son altamente prevalentes en la población de caballos (Diaz-Mendez y col., The Canadian Journal of Veterinary Research 74: 271-278; 2010). Los signos clínicos de la infección por ERAV son inespecíficos y difíciles de diferenciar de otras infecciones virales respiratorias, incluidas la influenza equina y las infecciones por virus del herpes. Se han identificado cepas no citopáticas de este virus en brotes respiratorios equinos (Li y col., J. Clin. Microbiol. 35: 937-943; 1997), lo que dificulta su diagnóstico. Además, ERAV y ERBV, al ser virus de ARN monocatenario, tienen el potencial de mutación, lo que hace que la capacidad del sistema inmunológico para proteger a un animal contra una enfermedad causada por una determinada cepa de ERAV/ERBV sea poco clara.
Además, Campbell y col., 1982 (Vet Microbiol.; 7 (6): 535-44) describen la inactivación del rinovirus equino de tipo 1 (ERhV1).
Existe una necesidad de métodos y medicamentos para prevenir enfermedades respiratorias o para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con tales enfermedades, incluyendo los asociados con los virus A y B de la rinitis equina.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende el virus A de la rinitis equina inactivado (ERAV), en el que el ERAV es ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828).
Se describen composiciones inmunogénicas que comprenden una o más cepas de ERAV inactivado o vivo, atenuado, que cuando están vivos y activos y no atenuados son virulentos (es decir, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso el 100% de los caballos seronegativos, cuando se exponen intencionalmente al virus, presentan una enfermedad respiratoria observable, particularmente secreción nasal y/u ocular), se pueden cultivar a títulos altos en cultivo para producir una vacuna que es capaz de inducir títulos altos de anticuerpos séricos contra ERAV cuando se administran, por ejemplo, a un equino, por ejemplo dando como resultado un título en suero de al menos 1:112, y preferiblemente, al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Además, las cepas crecen bien en cultivo y son altamente eficientes para producir, por ejemplo, hasta un título de al menos 106 TCID50/mL, más preferiblemente al menos 107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL, o incluso 109 TCID50/mL. De manera similar, también se encontró que las composiciones que comprenden una o más cepas de ERBV inactivado, que cuando están vivas y activas y no atenuadas también son virulentas (como se definió anteriormente para ERAV), crecen bien en cultivo, hasta un título de al menos 106 TCID50/mL, más preferiblemente 107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL o incluso 109 TCID50/mL, para ser altamente eficiente de producir e inducir altos títulos de anticuerpos séricos en animales después de la inmunización, por ejemplo, dando como resultado un título en suero de al menos 1:120 y preferiblemente al menos 1:200, 1:500, 1: 750 o 1:1000. Tanto las composiciones de ERAV como de ERBV, y sus combinaciones, son capaces de reducir la duración, la gravedad y la incidencia de la enfermedad en un animal, tal como un caballo, que ha sido inmunizado con las composiciones y posteriormente expuesto.
En consecuencia, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende una o más cepas de ERAV o ERBV inactivado o vivo, atenuado, en las que la cepa de ERAV o la cepa de ERBV, antes de la inactivación o atenuación, causa enfermedad respiratoria detectable en al menos 50% de los caballos seronegativos expuestos a la cepa, o crece en cultivo celular hasta 106 TCID50/mL o más, o, cuando se usa como vacuna en equinos a una dosis de 106 TCID50 o más, da como resultado un título en suero de al menos 1:112.
En ciertos aspectos, la cepa, cuando está viva y no atenuada, causa una enfermedad respiratoria detectable (por ejemplo, secreción ocular y/o nasal detectable) en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100 % de caballos seronegativos tras la exposición a la cepa.
La cepa se puede hacer crecer en cultivo celular hasta un título de al menos 106 TCID50/mL, más preferiblemente 107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL o incluso 109 TCID50./mL. La administración de una composición inmunogénica que contiene la cepa da como resultado un título en suero de al menos 1:120 y preferiblemente al menos 1:200, 1:500, 1: 750 o 1:1000.
En las composiciones inmunogénicas de la divulgación, una o más cepas de ERAV o ERBV incluyen preferiblemente ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828) y/o cepa de ERBV 07-103042 (ATCC acceso No. PTA-11829). Además, las composiciones inmunogénicas de la divulgación contienen al menos una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 3, en la que dicha cepa de ERAV, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicarse en células huésped. La composición inmunogénica de la divulgación también puede incluir una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
Las composiciones inmunogénicas de la divulgación también pueden incluir una cepa de ERBV que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una identidad superior al 95% con la transcripción inversa de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene un ATCC No. de acceso PTA-11829 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene un ATCC No. de acceso PTA-11829, en la que dicha cepa de ERBv , cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicarse en células huésped. La cepa de ERBV también puede comprender una secuencia genómica que es la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene un ATCC No. de acceso. PTA-11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829.
En un aspecto específico, la composición inmunogénica de la divulgación comprende el virus A de la rinitis equina (ERAV) y el virus de la rinitis B equina (ERBV), en la que la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 y la cepa de ERBV tiene una ATCC acceso No. PTA. -11829.
En paricular, la divulgación incluye además composiciones inmunogénicas multivalentes que comprenden virus inactivados o vivos atenuados o antígenos de virus distintos de ERAV o ERBV que causan enfermedades en équinos. En particular, la divulgación proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden, además de ERAV y/o ERBV inactivados o vivos atenuados, al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva atenuada del virus del herpes equino (EHV) y, en aspectos particulares, el EHV se selecciona del grupo que consiste en EHV-1 y EHV-4, y una combinación de los mismos, más específicamente, el virus del herpes equino se selecciona del grupo que consiste en EHV-1, EHV-4, cepas depositadas en la ATCC bajo los números de acceso PTA-9525 y PTA-9526, y una combinación de los mismos.
La divulgación proporciona además una composición inmunogénica que, además de la cepa inactivada o viva atenuada de ERAV y/o ERBV, al menos una cepa inactivada o viva atenuada de o al menos un antígeno del virus de la influenza equina. En aspectos específicos, el virus de la influenza equina se selecciona del grupo que consiste en virus Clado 1, virus Clado 2, influenza A/Sudáfrica/2003, influenza A/equina-2/Ohio/03, influenza A/equina-2/New Market/2/93, influenza A/equina-2/Kentucky/95, influenza A/equina-2/Richmond/1/2007, cepas depositadas en la ATCC con los números de acceso PTA-9522, PTA-9523 y PTA- 9524 y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunogénicas pueden incluir, además de ERAV y/o ERBV inactivados o vivos atenuados, al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva atenuada del virus del herpes equino y al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva atenuada del virus de la influenza equina.
Las composiciones inmunogénicas de la divulgación pueden incluir, además de ERAV y/o ERBV inactivados o vivos atenuados, al menos un virus inactivado o vivo atenuado o al menos un antígeno de una o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en virus del Nilo Ooccidental, el virus de la encefalomielitis equina del este, el virus de la encefalomielitis equina occidental, el virus de la encefalomielitis equina venezolana y el toxoide tetánico, y combinaciones de los mismos. Alternativamente, la composición inmunogénica, además de ERAV y/o ERBV inactivados o vivos atenuados, comprende una o más cepas inactivadas o vivas atenuadas de o antígenos de cepas de encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. En aspectos específicos, el virus del Nilo Occidental es una de las cepas seleccionadas del grupo que consiste en la originada en caballos 2005, depositada en la ATCC con el acceso No. PTA-9409; NAEE159, depositada en el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos aislada bajo el acceso No. 405330; NY2002Nassau; NY2002Clinton; NY2002Queens; GA20021; GA20022; TX20021; TX20022; IN 2002; NY2003Albany; NY2003Suffolk; NY2003Chatauqua; CO20031; CO20032; TX2003; TX2003Harris4; TX2003Harris6; TX2003Harris7; TX2003Harris10; AZ2004; y TX2004Harris4; y combinación de los mismos. En las composiciones inmunogénicas que comprenden el virus de la encefalomielitis equina occidental, la cepa puede ser la cepa depositada en la ATCC con el acceso No. PTA-9410. En las composiciones que comprenden el virus de la encefalomielitis equina venezolana, la cepa puede ser la cepa depositada en la ATCC con el acceso No. PTA-9411. En las composiciones inmunogénicas que comprenden el virus de la encefalomielitis equina del este, la cepa puede ser la cepa depositada en la ATCC con el acceso No. PTA-9412. Y, en las composiciones inmunogénicas que comprenden el virus del herpes equino, la cepa puede seleccionarse del grupo que consiste en las cepas depositadas en la ATCC con los números de acceso PTA-9525 o PTA-9526, y combinaciones de los mismos.
En aspectos específicos, una o más de las cepas en la composición inmunogénica están presentes en una cantidad de aproximadamente 1020 TCID50/mL a aproximadamente 10100 TCID50/mL por dosis. La composición puede incluir además un vehículo farmacéutico adecuado, tal como un diluyente, adyuvante, agente antimicrobiano, conservante, agente inactivante o una combinación de los mismos. En aspectos particulares, la composición inmunogénica comprende un adyuvante, específicamente, HRA-5.
La divulgación proporciona además métodos para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados o causados por el virus A de la rinitis equina o el virus B de la rinitis equina en un animal o una manada de animales que comprenden la etapa de administrar una composición inmunogénica que comprende una o más cepas de ERAV o ERBV inactivado o vivo, atenuado, en el que la cepa de ERAV o la cepa de ERBV, antes de la inactivación o atenuación, causa enfermedad respiratoria detectable en al menos el 50% de los caballos seronegativos expuestos a la cepa, o crece en el cultivo celular hasta 106 TCID50/mL o más, o, cuando se usa como vacuna en equinos a una dosis de 106 TCID50 o más, da como resultado un título en suero de al menos 1:112. En particular, la una o más cepas de ERAV o ERBV incluyen preferiblemente ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828) y/o cepa de ERBV 07­ 103042 (ATCC acceso No. pTA-11829). Además, la cepa de ERAV puede comprender una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 3, en la que dicha cepa de ERAV, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped, o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de laSEQ ID NO: 3. Además, o alternativamente, la cepa de ERBV puede comprender una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene más del 95% de identidad con el transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene ATCC acceso No. PTA-11829, en la que dicha cepa de ERBV, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en células huésped. La cepa de ERBV también puede comprender una secuencia genómica que es la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829.
Además de proporcionar métodos para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o causados por ERAV o ERBV en un animal o una manada de animales, los métodos de la divulgación pueden reducir aún más la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o causados por uno o más de los patógenos seleccionados del grupo que consiste en virus del Nilo Occidental, virus de la encefalomielitis equina del Este, virus de la encefalomielitis equina Occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana y Clostridium tetani en un animal o una manada de animales administrando una composición inmunogénica de la divulgación. Los métodos de la divulgación también incluyen métodos para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o causados por ERAV o ERBV en un animal o una manada de animales junto con la reducción de la incidencia o la disminución de la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o causados por uno o más de los patógenos seleccionados del grupo que consiste en: virus de la encefalomielitis equina del este, virus de la encefalomielitis equina occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana, virus del herpes equino y Clostridium tetani en un animal o una manada de animales mediante la administración de una composición inmunogénica de la divulgación.
La divulgación también proporciona métodos para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o causados por ERAV y/o ERBV, así como uno o más de los patógenos seleccionados del grupo que consiste en: virus del Nilo Occidental, virus de la encefalomielitis equina del Este, virus de la encefalomielitis equina Occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana, virus del herpes equino, virus de la influenza equina y Clostridium tetani en un animal o una manada de animales, que comprende la etapa de administrar una composición inmunogénica de la divulgación.
En relación con los métodos de la divulgación, la incidencia de síntomas clínicos causados por uno o más de dichos patógenos en una manada de animales se reduce desde aproximadamente un 10% - 50% en comparación con una manada que no recibe la composición inmunogénica. Los métodos de la divulgación, en aspectos particulares, proporcionan una duración de inmunidad de al menos 12 meses contra uno o más de los patógenos presentes en la composición inmunogénica. En los métodos de la divulgación, la composición inmunogénica se administra a un équido, preferiblemente un caballo. El esquema de dosificación puede incluir la administración de la composición inmunogénica en una o más dosis. Las dosis para los métodos de la divulgación se pueden formular en formas de dosificación de 0,5 mL a 2,5 mL. Preferiblemente, los métodos de la divulgación administran composiciones inmunogénicas que son seguras para su uso en potros o caballos de 4 meses de edad o más.
La divulgación también proporciona métodos para producir una composición inmunogénica que comprende una o más cepas del virus A de la rinitis equina (ERAV) o del virus B de la rinitis equina (ERBV) inactivado de la siguiente manera:
a) infectar una línea celular susceptible con ERAV o ERBV;
b) hacer crecer la línea celular infectada en medio de crecimiento hasta que se logre un efecto citopático (CPE); c) recolectar el medio;
d) filtrar el medio para producir un medio filtrado; y
e) poner en contacto el medio filtrado con un agente inactivante para obtener ERAV o ERBV inactivado.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación gráfica de la proporción de virus positivos a lo largo del tiempo.
La Figura 2 es una representación gráfica de la proporción de capa leucocitaria positiva a lo largo del tiempo.
La Figura 3 es una representación gráfica de los títulos de neutralización del suero a lo largo del tiempo.
La Figura 4 es una representación gráfica de las puntuaciones nasales medias a lo largo del tiempo.
La Figura 5 es una representación gráfica de las puntuaciones oculares medias a lo largo del tiempo.
La Figura 6 es una alineación de ClustalW de una porción del virus A de rinitis equina ERAV/ON/05 (porción UTR 5', SEQ ID NO: 1) con ERAV/PERV-1 (acceso No. d Q272578 (SEQ ID NO: 14) ). Las inserciones de los nucleótidos de ERAV/ON/05 se muestran en negrita y las eliminaciones sombreadas.
La Figura 7 es un gráfico de la media de puntuación clínica total de los grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4.
La Figura 8 es un gráfico de la media de la temperatura corporal de los grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4.
La Figura 9 es una tabla que muestra los títulos del virus A de la rinitis equina (ERAV) y el virus B de la rinitis equina (ERBV) en los grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4. Se utilizó la prueba de neutralización del virus (VN) para medir los títulos del anticuerpo en muestras de suero.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende el virus A de la rinitis equina inactivado (ERAV), en el que el ERAV es ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. pTa -11828). El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
Se describen composiciones inmunogénicas que comprenden una o más cepas de ERAV inactivado, que cuando están vivas y activas son virulentas (es decir, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100% de caballos seronegativos, cuando se exponen intencionalmente al virus, presentan enfermedad respiratoria observable, particularmente secreción nasal y/u ocular), se puede cultivar a títulos altos en cultivo para producir una vacuna que es capaz de inducir títulos altos de anticuerpos en suero contra ERAV cuando se administra, para por ejemplo, a un equino, por ejemplo dando como resultado un título en suero de al menos 1:112, y preferiblemente, al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Además, las cepas crecen bien en cultivo y son altamente eficientes para producir, por ejemplo, hasta un título de al menos 106 TCID50/mL, más preferiblemente 107 TCID50/ 1T1L, 108 TCID50/ 1T1L, o incluso 109 TCID50/mL. De manera similar, también se encontró que las composiciones que comprenden una o más cepas de ERBV inactivado, que cuando están vivas y activas y no atenuadas también son virulentas (como se definió anteriormente para ERAV), crecen bien en cultivo, hasta un título de al menos 106 TCID50/ 1T1L, más preferiblemente 107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL o incluso 109 TCID50/ 1T1L, para ser altamente eficiente de producir e inducir altos títulos de anticuerpos en suero en animales después de la inmunización, por ejemplo, dando como resultado un título en suero de al menos 1:120 y preferiblemente al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Tanto las composiciones de ERAV como de ERBV, y sus combinaciones, son capaces de reducir la duración, la gravedad y la incidencia de la enfermedad en un animal, tal como un caballo, que ha sido inmunizado con las composiciones y posteriormente expuesto.
En un aspecto, se describe una composición inmunogénica que comprende una o más cepas de ERAV y/o ERBV inactivados. Alternativamente, las cepas se pueden atenuar por medios rutinarios y el virus vivo atenuado se puede usar en la composición de la vacuna. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células del huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En ciertos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 que tiene una ATCC acceso No. PTA-11828, depositado en la American Type Culture Collection el 14 de abril de 2011.
En algunos aspectos, el ERBV es la cepa 07-103042, que tiene un ATCC con acceso No. PTA-11829, depositado en la American Type Culture Collection el 14 de abril de 2011. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivado o atenuado, es activo para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas funcionales de ERBV, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No.
PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral).
En un aspecto, se describe una composición inmunogénica que comprende ERAV y ERBV inactivados (o, alternativamente, vivos, atenuados). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (ATCC número acceso PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene funcional Proteínas ERBV (es decir, activas en la infección y replicación viral).
En un aspecto, junto con una o más cepas inactivadas o vivas atenuadas de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento comprenden además al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o viva atenuada del virus del herpes equino (EHV). En algunos aspectos, las composiciones comprenden al menos un antígeno de EHV. En algunos aspectos, el EHV se selecciona del grupo que consiste en EHV-1, EHV-4, cepas depositadas en la ATCC con los números de acceso PTA-9525 y PTA-9526, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral).
En un aspecto, junto con una o más cepas inactivadas (o atenuada) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento comprenden además al menos un antígeno o una cepa inactivada o atenuada adicional del virus de la influenza equina (EIV). En algunos aspectos, las composiciones comprenden al menos un antígeno de EIV. En algunos aspectos, el EIV se selecciona del grupo que consiste en virus de Clado 1, virus de Clado 2, Influenza A/Sudáfrica/2003, Influenza A/equina-2/Ohio/03, Influenza A/equina-2/New Market/2/93, Influenza A/equina-2/Kentucky/95, Influenza A/equina-2/Richmond/1/2007 y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral).
En un aspecto, junto con una o más cepas inactivadas (o vivas, atenuadas), de ERAV y/o ERBV las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento comprenden además al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva adicional atenuada del virus de la influenza equina y al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva adicional atenuada del virus del herpes equino. En algunos aspectos, las composiciones comprenden al menos un antígeno de EHV y al menos un antígeno de EIV. En algunos aspectos, el EHV es EHV-1 o EHV-4 o una combinación de los mismos y el EIV se selecciona del grupo que consiste en virus de Clado 1, virus de Clado 2, influenza A/Sudáfrica/2003, influenza A/equina-2/Ohio/03, influenza A/equina-2/New Market/2/93, Influenza A/equina-2/Kentucky/95, Influenza A/equina-2/Richmond/1/2007 y combinaciones de las mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ErAV es ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación viral).
En un aspecto, junto con una o más cepas inactivadas (o vivas, atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunogénicas descritas en este documento comprenden además al menos un antígeno o virus inactivado de una o más cepas adicionales seleccionadas del grupo que consiste en virus de la influenza equina, virus del herpes equino, virus del Nilo occidental, virus de la encefalomielitis equina del este, virus de la encefalomielitis equina occidental y virus de la encefalomielitis equina venezolana y/o toxoide tetánico y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no se inactiva, está atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células del huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAv /o N/05 (ATCC acceso No. PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral).
En un aspecto, junto con las cepas inactivadas (o vivas, atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunogénicas descritas en este documento comprenden además al menos un virus inactivado o vivo adicional atenuado de una cepa seleccionada del grupo que consiste en virus del Nilo Occidental, virus de encefalomielitis Equina del Este, virus de encefalomielitis Equina Occidental y virus de encefalomielitis Equina Venezolana, y/o Toxoide Tetánico, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en céluas huésped y/o codifica proteínas ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral).
En un aspecto, se describe un método para preparar la composición inmunogénica de la presente divulgación. El método generalmente comprende las etapas de combinar un ERAV y/o ERBV inactivado o vivo, atenuado y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas del ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ErAV es ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, el método comprende además la etapa de añadir uno o más antígenos de virus equinos adicionales o virus equinos inactivados o vivos atenuados. En otro aspecto, el método comprende además la etapa de añadir un adyuvante adecuado a la composición.
En un aspecto, se describe un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados o causados por ERAV o ERBV en un animal o una manada de animales que comprende administrar una composición inmunogénica como se describe en el presente documento a un animal que requiera de la misma. En algunos aspectos, el animal es un caballo.
Los aspectos mencionados anteriormente pueden contener además una o más de las siguientes características que se describen a continuación.
En un aspecto, se describe una composición que comprende al menos una cepa de ERAV y/o ERBV inactivados (o, alternativamente, vivos, atenuados) y que además contiene muchos o todos los componentes antigénicos relevantes y proteínas del virus patógeno del Nilo Occidental (WNV) o una cepa inactivada o viva atenuada de WNV.
En un aspecto, se describe una composición de vacuna que comprende una o más cepas de ERAV y/o ERBV inactivados (o vivos, atenuados) en combinación con una o más cantidades inmunológicamente efectivas de componentes antigénicos o uno o más cepas inactivadas o vivas, atenuadas seleccionadas del grupo que consiste en virus del Nilo Occidental (WNV), encefalomielitis equina venezolana (VEE), encefalomielitis equina del este (EEE), encefalomielitis equina occidental (WEE), toxoide tetánico (T), virus del herpes equino (EHV) incluidos los tipos 1 y 4, virus de la influenza equina (EIV) y combinaciones de los mismos, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, tales aspectos incluirán un adyuvante, tal como un carbómero, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos, el adyuvante es HRA-5, un carbómero o aceite mineral.
En algunos aspectos, las composiciones también incluyen ERAV y/o ERBV inactivados o vivos atenuados en combinación con las siguientes cepas o antígenos virales inactivados o vivos atenuados y combinaciones de cepas y antígenos: virus del Nilo Occidental; encefalomielitis equina del este; encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina venezolana; toxoide tetánico; encefalomielitis equina del este y encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina del este y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina del este y toxoide tetánico; encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; y encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico, o antígenos o componentes antigénicos de los mismos. Una combinación preferida de estas combinaciones especificadas incluye ERAV y/o ERBV en combinación con antígenos o componentes antigénicos de virus inactivados del virus del Nilo occidental, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. Otra combinación preferida incluye ERAV y/o ERBV en combinación con antígenos o componentes antigénicos de encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. Los ERAV preferidos incluyen ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828), cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos de más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más que 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación viral). La cepa de ERAV también puede comprender una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. El ERBV preferido es una cepa que tiene una ATCC acceso número No: PTA-11829, o que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene Proteínas ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En cada una de dichas combinaciones especificadas, se puede usar un adyuvante o combinación de adyuvantes, tal como HRA-5, carbómero o con carbopol. La cepa NJO de encefalomielitis equina del este, la cepa Fleming de encefalomielitis equina occidental y la cepa tC-83 de encefalomielitis equina venezolana son todas cepas representativas de estos componentes de la vacuna.
Otros aspectos preferidos de la presente divulgación incluyen composiciones inmunogénicas elaboradas utilizando cada una de las vacunas de combinación especificadas enumeradas anteriormente y añadiendo antígenos o virus inactivados o atenuados del virus del herpes equino, preferiblemente tipo 1, tipo 4, (EHV1 y/o EHV4) o combinaciones de los mismos.
Se pueden realizar aún más variaciones de cada una de las vacunas de combinación especificadas o composiciones inmunogénicas enumeradas anteriormente, incluidas aquellas que incluyen EHV1 y/o EHV4 añadiendo antígenos o virus inactivados o atenuados del virus de la influenza equina (EIV). Los aspectos preferidos que incorporan el virus de la influenza equina incluyen: ERAV y/o ERBV inactivados o vivos, atenuados y al menos una cepa inactivada o viva atenuada de cada uno de WNV, virus de la influenza equina y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa inactivada o viva atenuada de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, toxoide tetánico y encefalomielitis equina del este; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental; y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina y encefalomielitis equina del este; ERAV y/o ERBV y, al menos, una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina del este y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina del este y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina del este y toxoide tetánico, en los que las cepas mencionadas anteriormente están inactivadas o vivas, atenuadas. En cada aspecto especificado pueden estar presentes una o más cepas inactivadas o vivas atenuadas del virus de la influenza equina. Las cepas preferidas del virus de la influenza equina incluyen influenza A/equina-2/Ohio/03, influenza A/equina-2/New Market/2/93, influenza A/equina-2/Kentucky/95 y combinaciones de las mismas. En todas las combinaciones enumeradas anteriormente, se prefiere usar al menos dos cepas inactivadas o vivas atenuadas del virus de la influenza equina y aún más preferido usar al menos 3 cepas del virus de la influenza equina.
Los aspectos preferidos que incorporan el virus del herpes equino incluyen: ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, toxoide del tétanos y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina del este y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina venezolana y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina y encefalomielitis equina del este; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina occidental y virus del herpes equino; ERAv y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina venezolana y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina venezolana y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina occidental, toxoide tetánico y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina venezolana, toxoide tetánico y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina occidental, toxoide tetánico y virus del herpes equino; y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la influenza equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina del este, toxoide tetánico y virus del herpes equino, en los que las cepas mencionadas anteriormente están inactivadas o vivas, atenuadas. En todas las combinaciones enumeradas anteriormente, se prefiere usar al menos dos cepas de virus de la influenza equina inactivado o vivo atenuado y aún más preferido usar al menos 3 cepas de virus de la influenza equina inactivado o vivo atenuado. Además, en todas las combinaciones anteriores, se prefiere seleccionar "al menos una" cepa del virus del herpes equino del grupo que consiste en EHV-1 y EHV-4 inactivados. En algunas formas preferidas, tanto las cepas inactivadas como vivas atenuadas, EHV-1 y EHV-4, se incluirán en la composición inmunogénica. En otras formas preferidas, solo se incluirá EHV-1. En una combinación preferida, la cepa de ERAV inactivada o viva atenuada es ERAV/ON/05, una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, está activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). La cepa de ERAV también puede comprender una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En otras combinaciones preferidas, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11828, o que comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11828 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11828, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral).
Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se pueden administrar en cualquier dosis inmunogénicamente eficaz. En un aspecto preferido, la composición inmunogénica se administra como una dosis única. Preferiblemente, la dosis tiene un volumen total entre aproximadamente 0,5 mL y aproximadamente 2,5 mL, más preferiblemente entre aproximadamente 0,6 mL y aproximadamente 2,0 mL, incluso más preferiblemente entre aproximadamente 0,7 mL y aproximadamente 1,75 mL, aún más preferiblemente entre aproximadamente 0,8 mL y aproximadamente 1,5 mL, incluso más preferiblemente entre aproximadamente 0,9 mL y aproximadamente 1,25 mL, siendo la más preferida una dosis única de aproximadamente 1,0 mL.
En otro aspecto, la composición inmunogénica se suministra administrando una primera dosis antes de la administración de una segunda dosis (de refuerzo). Preferiblemente, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 15 días después de la primera dosis. Más preferiblemente, la segunda dosis se administra entre aproximadamente 15 y aproximadamente 28 días después de la primera dosis. Incluso más preferiblemente, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 17 días después de la primera dosis. Aún más preferiblemente, la segunda dosis se administra entre aproximadamente 17 y aproximadamente 25 días después de la primera dosis. Incluso más preferiblemente, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 19 días después de la primera dosis. Aún más preferiblemente, la segunda dosis se administra entre aproximadamente 19 y aproximadamente 23 días después de la primera dosis. Lo más preferiblemente, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 21 días después de la primera dosis. En un aspecto preferido, tanto la primera como la segunda dosis de la composición inmunogénica están en la misma cantidad. Preferiblemente, cada dosis está en las cantidades preferidas especificadas anteriormente, siendo más preferida una dosis de aproximadamente 1 mL para la primera y segunda dosis. Además del primer y segundo régimen de dosis, un aspecto alternativo comprende dosis posteriores adicionales. Por ejemplo, se podría administrar una tercera, cuarta o quinta dosis en estos aspectos. Preferiblemente, los regímenes de dosis posteriores tercera, cuarta y quinta se administran en la misma cantidad que la primera dosis, siendo el intervalo de tiempo entre las dosis coherente con el intervalo de tiempo entre la primera y la segunda dosis mencionadas anteriormente, aunque el intervalo de tiempo también puede variar.
En un aspecto, la composición inmunogénica se administra en tres dosis. En algunos aspectos, las tres dosis se administran a intervalos de tres semanas.
En un aspecto que comprende ERAV, preferiblemente ERAV/ON/05, la cantidad de ERAV en la composición inmunogénica es al menos aproximadamente 1020 TCID50/dosis. Más preferiblemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1020 TCIDsü/dosis y aproximadamente 10100 TCIDsü/dosis. Aún más preferiblemente, la cantidad de ERAV es al menos aproximadamente 1025 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1025 TCID50/dosis y aproximadamente 1095 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la cantidad de ERAV es al menos aproximadamente 1030 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1030 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la cantidad de ERAV es al menos aproximadamente 103,5 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1035 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1065 TCID50/dosis y aproximadamente 1085 TCID50/dosis. Más preferiblemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1070 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Los valores de TCID50 de un ERAV inactivado o atenuado o cualquier otra vacuna inactivada o atenuada se refieren en general al contenido viral en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido viral calculado para la composición de la vacuna antes de la inactivación de su virus. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la presente divulgación estimula los anticuerpos neutralizantes del suero frente a ERAV en un título de al menos 1:112, 1:300, 1:500, 1:700, 1:900, 1:1000 o 1:1500.
En un aspecto que comprende ERBV, preferiblemente una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 1020 TCID50/dosis. Más preferiblemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1020 TCID50/dosis y aproximadamente 10100 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 1025 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1025 TCID50/dosis y aproximadamente 1095 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 1030 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1030 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 1035 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1035 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1065 TCID50/dosis y aproximadamente 1085 TCID50/dosis. Más preferiblemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1070 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Los valores de TCID50 de un ERBV inactivado o cualquier otra vacuna inactivada se refieren en general al contenido viral en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido viral calculado para la composición de la vacuna antes de la inactivación de su virus. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la presente divulgación estimula los anticuerpos neutralizantes del suero frente a ERBV con un título de al menos 1:4 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11; 1:12, 1:13, 1:14 o 1:15 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:64, 1:256 o 1:512 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:1024 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:2048, 1:1536, 1:3072, 1:4096, 1:6144, 1:8192, 1:12288, o 1:32769 o superior. En algunos aspectos, el título no es más de 1:300, 1:1050, 1:32000, 1:70000 o 1:140000.
En un aspecto, en cada dosis de un aspecto de la presente divulgación que comprende uno o más antígenos equinos adicionales, la cantidad de encefalomielitis equina del este o encefalomielitis equina venezolana en cualquier dosis es preferiblemente de al menos aproximadamente 1055 TCIÜ50/dosis. Incluso más preferiblemente, la dosis está entre aproximadamente 1055 TCIÜ50/dosis y aproximadamente 1095 TCIÜ50/dosis. Aún más preferiblemente, la dosis es al menos aproximadamente 1060 TCIÜ50/dosis. Aún más preferiblemente, la dosis está entre aproximadamente 1060 TCIÜ50/dosis y aproximadamente 1090 TCIÜ50/dosis. Incluso más preferiblemente, la dosis es de al menos aproximadamente 1065 TCIÜ50/dosis. Aún más preferiblemente, la dosis está entre aproximadamente 1065 TCIÜ50/dosis y aproximadamente 1095 TCIÜ50/dosis. Incluso más preferiblemente, la dosis es al menos aproximadamente 1070 TCIÜ50/dosis. Lo más preferiblemente, la dosis está entre aproximadamente 1067 TCID50 y aproximadamente 1092 TCID50/dosis.
En un aspecto que comprende WNV inactivado o muerto o antígeno, la cantidad de WNV o antígeno es al menos aproximadamente 1020 TCID50/dosis. Más preferiblemente, el WNV o antígeno está entre aproximadamente 1020 TCID50/dosis y aproximadamente 10100 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, el WNV o el antígeno es al menos aproximadamente 1025 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, el WNV o el antígeno se encuentra entre aproximadamente 1025 TCID50/dosis y aproximadamente 1095 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, el WNV o el antígeno es al menos aproximadamente 1030 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, el WNV o el antígeno está entre aproximadamente 1030 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, el WNV o el antígeno es al menos aproximadamente 1035 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, el WNV o el antígeno está entre aproximadamente 1035 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Lo más preferiblemente, el WNV o el antígeno está entre aproximadamente 1070 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Los valores de TCID50 de una vacuna inactivada contra el WNV o cualquier otra vacuna inactivada se refieren en general al contenido de antígeno en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido de antígeno calculado para la composición de la vacuna antes de la inactivación de su antígeno. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la presente divulgación estimula los anticuerpos neutralizantes del suero frente a WNV con un título de al menos 1:4 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11; 1:12, 1:13, 1:14 o 1:15 o superior. En algunos aspectos, el título no es más de 1:300, 1:1050, 1:32000, 1:70000 o 1:140000. En un aspecto preferido, en cada dosis de un aspecto de la presente divulgación que comprende antígeno equino adicional, la cantidad de encefalomielitis equina del este o encefalomielitis equina venezolana en cualquier dosis es preferiblemente de al menos aproximadamente 1055 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la dosis está entre aproximadamente 1055 TCID50/dosis y aproximadamente 1095 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la dosis es al menos aproximadamente 1060 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la dosis está entre aproximadamente 1060 TCID50/dosis y aproximadamente 1090 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la dosis es de al menos aproximadamente 1065 TCID50/dosis. Aún más preferiblemente, la dosis está entre aproximadamente 1065 TCID50/dosis y aproximadamente 1095 TCID50/dosis. Incluso más preferiblemente, la dosis es al menos aproximadamente 1070 TCID50/dosis. Lo más preferiblemente, la dosis está entre aproximadamente 1067 TCID50 y aproximadamente 1092 TCID50/dosis.
Preferiblemente, el antígeno de encefalomielitis equina occidental, cuando está presente en la composición de la presente divulgación, está en una cantidad de al menos aproximadamente 1062 PFU/mL. Incluso más preferiblemente, la cantidad está entre aproximadamente 1062 PFU/mL y aproximadamente 10102 PFU/mL. Aún más preferiblemente, la cantidad es al menos aproximadamente 1067 PFU/mL. Incluso más preferiblemente, la cantidad está entre aproximadamente 1065 PFU/mL y aproximadamente 1097 PFU/mL. Aún más preferiblemente, la cantidad es al menos aproximadamente 1072 PFU/mL. Incluso más preferiblemente, la cantidad está entre aproximadamente 1072 PFU/mL y aproximadamente 1092 PFU/mL. Aún más preferiblemente, la cantidad es al menos aproximadamente 1077 PFU/mL, siendo la más preferida entre aproximadamente 1065 UFP/dosis y aproximadamente 1090 PFU/mL.
En otro aspecto preferido, la cantidad de toxoide tetánico, si está presente en la composición de la presente divulgación, está en una cantidad de al menos aproximadamente 3 CPU, más preferiblemente, entre aproximadamente 3 CPU y aproximadamente 20 CPU, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente 4 CPU, y lo más preferiblemente, al menos aproximadamente 5 CPU pero no más de aproximadamente 20 CPU.
En un aspecto alternativo, cuando están presentes una o más cepas del virus de la influenza equina, la cantidad de influenza equina presente en la composición está en una cantidad de al menos aproximadamente 1050 TCID50/ 1T1L. Más preferiblemente, la influenza equina está en una cantidad de entre aproximadamente 1050 TCID50/mL y aproximadamente 1090 TCID50/mL y, más preferiblemente, al menos aproximadamente 106 TCID50/mL. Aún más preferiblemente, la cantidad está entre aproximadamente 1060 TCID50/mL y aproximadamente 1080 TCID50/mL y, más preferiblemente, la cantidad es al menos aproximadamente 1065 TCID5ü/mL. Aún más preferiblemente, la cantidad está entre aproximadamente 1065 TCID50/mL y aproximadamente 1075 TCID50/mL, siendo la cantidad más preferida entre aproximadamente 1067 TCID50/mL y aproximadamente 1073 TCID50/mL. .
En un aspecto que comprende el virus del herpes equino, la cantidad de virus del herpes equino en cada dosis es de al menos aproximadamente 1060 TCID50/mL. Más preferiblemente, el virus del herpes equino está presente en la composición en una cantidad entre aproximadamente 1060 TCID50/mL y aproximadamente 1095 TCID50/mL y, más preferiblemente, en una cantidad de aproximadamente 1070 TCID50/mL. Aún más preferiblemente, el virus del herpes equino está presente en una cantidad entre aproximadamente 1075 TCID50/mL y aproximadamente 1090 TCID5ü/mL y, más preferiblemente, en una cantidad de aproximadamente 1080 TCID50/mL. Aún más preferiblemente, el virus del herpes equino está presente en una cantidad entre aproximadamente 1080 TCID50/mL y aproximadamente 1090 TCID50/ 1T1L y, lo más preferiblemente, en una cantidad de aproximadamente 1085 TCID50/mL.
En otro aspecto preferido más, se describe una composición de vacuna que comprende las cepas cronológicamente contemporáneas y epidemiológicamente prevalentes de ERAV y/o ERBV. Preferiblemente, la composición comprende ERAV/On /05 y/o una cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso número: PTA-11829. En aspectos específicos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, esta activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). Una composición de este tipo mejorará generalmente la eficacia de la composición.
La presente divulgación proporciona adicionalmente un método de reducción de la incidencia y/o la gravedad de los signos clínicos asociados con la infección por ERAV y/o ERBV en un animal, preferiblemente un caballo. Dichos métodos generalmente comprenden la etapa de administrar una composición de vacuna que comprende una cepa inactivada o viva atenuada de un ERAV y/o ERBV y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En aspectos particulares, el ERAV es ERAV/ON/05, o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, está activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codificar proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos preferidos, se añade a la composición un adyuvante, particularmente HRA-5, y en otras formas preferidas, no se proporciona adyuvante.
En un aspecto preferido alternativo, el método comprende administrar una composición de vacuna que comprende una o más cepas inactivadas o vivas atenuadas de ERAV y/o ERBV en combinación con cantidades inmunológicamente eficaces de componentes antigénicos o cepas inactivadas de otros patógenos equinos. Preferiblemente, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (ATCC acceso No. PTA-11828) y la cepa de ERBV tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En ciertos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAv comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95% , más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o viva, atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral).
En algunos aspectos del método, los patógenos en combinación con las cepas de ERAV y/o ERBV, se seleccionan del grupo que consiste en antígenos o cepas inactivadas o atenuadas de EHV y EIV y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, los patógenos son antígenos. En algunos aspectos, el EHV es EHV-1 o EHV-4 o una combinación de los mismos. En otros aspectos, el EIV se selecciona del grupo que consiste en virus de Clado 1, virus de Clado 2, Influenza A/Sudáfrica/2003, Influenza A/equina-2/Ohio/03, Influenza A/equina-2/New Market/2/93, Influenza A/equino-2/Kentucky/95, Influenza A/equino-2/Richmond/1/2007 y combinaciones de los mismos.
En otros aspectos más del método, los patógenos en combinación con las cepas de ERAV y/o ERBV, se seleccionan del grupo que consiste en antígenos o cepas inactivadas o atenuadas de WNV, encefalomielitis Equina Oriental, encefalomielitis Equina Occidental y encefalomielitis equina Venezolana y toxoide tetánico y combinaciones de los mismos, y más preferiblemente las combinaciones descritas anteriormente. En otro aspecto preferido, la vacuna de la presente divulgación se combina con un adyuvante adecuado y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente divulgación proporciona la reducción de la incidencia y/o la gravedad de los síntomas clínicos asociados con la infección por ERAv y/o ERBV en una manada. Preferiblemente, la gravedad y/o incidencia de los síntomas clínicos en los animales que reciben la composición inmunogénica de la presente divulgación se reducen al menos un 10% en comparación con los animales que no reciben dicha administración cuando ambos grupos (animales que reciben y animales que no reciben la composición) son desafiados o expuestos a la infección por ERAV y/o ERBv . Más preferiblemente, la incidencia o gravedad se reduce al menos un 20%, incluso más preferiblemente, al menos un 30%, aún más preferiblemente, al menos un 40%, incluso más preferiblemente, al menos un 50%, aún más preferiblemente, al menos un 60%, incluso más preferiblemente, al menos el 70%, aún más preferiblemente, al menos el 80%, incluso más preferiblemente, al menos el 90%, aún más preferiblemente, al menos el 95%, y lo más preferiblemente, al menos el 100%, en la que los animales que reciben la composición de la presente divulgación no presentan síntomas clínicos o, alternativamente, presentan síntomas clínicos de gravedad reducida. Ventajosamente, la presente divulgación también proporciona protección contra cepas heterólogas (en relación con la cepa usada en la composición) de patógenos.
La presente divulgación proporciona además un método para estimular anticuerpos neutralizantes o de hemaglutinación en suero contra un patógeno seleccionado del grupo que consiste en ERAV, ERBV, WNV, WEE, VEE, EEE, EHV, EIV y combinaciones de los mismos mediante la administración de una composición de acuerdo con la presente divulgación descrita en este documento. En aspectos particulares, el ERAV es e Ra V/ON/05, o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una UTR 5' que comprende la s Eq ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuya transcripción inversa tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de la transcripción inversa del genoma de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicarse en las células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con una ATCC acceso No. PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en la infección y replicación viral). Preferiblemente, las composiciones de la presente divulgación estimulan los anticuerpos neutralizantes en suero para ERAV y/o ERBV en un título de al menos 1:112, 1:120, 1:300, 1:500, 1:1000 o 1:1024 o superior.
La composición inmunogénica de la presente divulgación proporciona una duración prolongada de inmunidad contra todas las cepas presentes en la vacuna. Preferiblemente, la duración de la inmunidad contra ERAV y/o ERBV es al menos 1 mes, más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 2 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 3 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9­ 24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses, y lo más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 12-24 meses.
La composición inmunogénica de la presente divulgación también proporciona una duración prolongada de inmunidad contra todos los antígenos presentes en la vacuna. Preferiblemente, la duración de la inmunidad contra el Nilo Occidental es de al menos 1 mes, más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6­ 24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 9-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 10-24 meses, y lo más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 12 -24 meses.
Preferiblemente, la duración de la inmunidad contra EIV es al menos 1 mes, más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 2 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 3 meses, incluso más preferiblemente, la duración de inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7­ 24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses, y lo más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferiblemente, la duración de la inmunidad contra el EHV es al menos 1 mes, más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 2 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 3 meses, incluso más preferiblemente, la duración de inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses, y lo más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferiblemente, la duración de la inmunidad contra la encefalomielitis equina occidental es de al menos 1 mes, más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9­ 24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses, y lo más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferiblemente, la duración de la inmunidad contra la encefalomielitis equina del este es de al menos 1 mes, más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9­ 24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses, y lo más preferiblemente, la duración de la inmunidad tiene al menos 12-24 meses.
Preferiblemente, la duración de la inmunidad contra la encefalomielitis equina venezolana es de al menos 1 mes, más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9­ 24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses, y lo más preferiblemente, la duración de la inmunidad tiene al menos 12-24 meses.
Preferiblemente, la duración de la inmunidad contra el toxoide tetánico es de al menos 1 mes, más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferiblemente, la la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferiblemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses, y lo más preferiblemente, la duración de la inmunidad es al menos 12-24 meses.
Preferiblemente, la duración de la inmunidad de al menos 12 meses se refiere además a cualquier combinación de antígenos que forman la composición inmunogénica de la presente divulgación.
En un aspecto que comprende un ERAV y/o ERBV inactivados (o, alternativamente, vivos atenuados) como se describe en el presente documento, la composición inmunogénica mejora la diseminación de ERAV y/o ERBV infecciosos para prevenir la propagación del virus a otros animales susceptibles. En algunos aspectos, las composiciones evitan la diseminación del virus.
En un aspecto que comprende antígeno de EIV y/o EHV, como se describió anteriormente, la composición inmunogénica mejora la diseminación de EIV o EHV infeccioso para prevenir la diseminación del virus a otros animales susceptibles.
En un aspecto, las composiciones de acuerdo con la presente divulgación descrita en este documento superan la interferencia de la inmunidad materna adquirida pasivamente y estimulan la inmunidad activa y una reducción en la incidencia o la gravedad de los signos clínicos de la infección por EIV en animales vacunados contra el EIV.
En uno de los aspectos de la presente divulgación, una composición inmunogénica que comprende ERAV y/o ERBV, VEE, WEE, EEE, tétanos, w Nv , rinoneumonitis equina e influenza equina, todos como se describen en el presente documento, demuestra eficacia contra ERAV, ERBV, VEE, WEE, EEE, tétanos, WNV, rinoneumonitis equina e influenza equina después de la administración de acuerdo con la presente descripción. Preferiblemente, dicha composición incluirá además un adyuvante, preferiblemente HRA-5, aceite mineral y/o un carbómero, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En formas preferidas, la composición se administrará en una sola dosis de 1 mL. En algunos aspectos, la composición se administra en dos dosis o preferiblemente tres dosis, con cada dosis separada por 1, 2, 3 y 4 semanas.
Cada una de las composiciones inmunogénicas descritas en este documento que incluyen ERAV, particularmente ERAV/ON/05 (ATCC acceso No: PTA-11828) y otras cepas como se describió anteriormente, y/o ERBV, particularmente una cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No: PTA-11829, u otras como también se describieron anteriormente, se pueden administrar como se describe de manera que reduzcan la incidencia o disminuyan la gravedad de los síntomas clínicos asociados con ERAV y/o ERBV, tales como pirexia, elevaciones de temperatura, aumento de los ruidos pulmonares, linfadenopatía, secreción nasal, secreción ocular, faringitis, edema de patas, tos y, en el caso de ERAV, mayor incidencia de abortos en yeguas gestantes. En algunos aspectos, las composiciones disminuyen la cantidad o duración de la secreción nasal u ocular o el tiempo que se presentan tales síntomas. En algunos aspectos, los animales inoculados con las composiciones no muestran síntomas clínicos de infección por ERAV y/o ERBV una semana o más después de la exposición a ERAV y/o ERBV. En otros aspectos, los animales inoculados con las composiciones no muestran síntomas clínicos de infección por ERAV y/o ERBV cuando se exponen a ERAV y/o ERBV. Los síntomas clínicos de ERAV y ERBV pueden puntuarse de acuerdo con la Tabla 3 en el Ejemplo 2, la Tabla 14 en el Ejemplo 4 o la Tabla 17 en el Ejemplo 5.
Cada una de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento que incluyen antígeno de EIV o EIV inactivado y pueden administrarse como se describe de manera que reduzcan la incidencia o disminuyan la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus de la influenza equina.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus del herpes equino que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente que contienen antígeno del EHV o EHV inactivado o atenuado a un animal.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con el virus del Nilo Occidental que comprende la etapa de administrar a un animal cualquiera de las composiciones inmunogénicas que incluyen el antígeno del WNV o el WNV inactivado o atenuado, como se describe en el presente documento.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con el virus de la influenza equina que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente, que incluye un antígeno de EIV o EIV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona además un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con el virus del herpes equino que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente que incluye un antígeno de EHV o EHV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia de infección viral en una manada que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente a un animal, en el que la reducción de la incidencia de infección, en comparación con manadas que no reciben la composición inmunogénica, es de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 50% de reducción. En un aspecto, las composiciones descritas en el presente documento reducen la infección por ERAV entre un 10% y un 50%. En otros aspectos, las composiciones descritas en el presente documento reducen la infección por ERBV entre un 10% y un 50%.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con el virus de la influenza equina que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente a un animal, en el que la reducción de los signos clínicos, en comparación con los animales que no reciben la composición inmunogénica, es al menos un 10% de reducción de los signos clínicos.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia y la gravedad de los síntomas clínicos de ERAV o ERBV en una manada, en el que los síntomas clínicos se seleccionan del grupo que consiste en pirexia, elevaciones de temperatura, aumento de ruidos pulmonares, linfadenopatía, secreción nasal, secreción ocular, faringitis, tos, edema de patas y, en el caso de ERAV, mayor incidencia de abortos en yeguas gestantes.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia y la gravedad de los síntomas clínicos de EHV en una manada, en el que los síntomas clínicos se seleccionan del grupo que consiste en enfermedad respiratoria, aborto, complicaciones reproductivas, enfermedad neurológica, enfermedad del sistema nervioso central y combinaciones de los mismos.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus del herpes equino que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento, que incluye un antígeno de EHV o e Hv inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus de la influenza equina en una manada, que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en este documento, que incluye un antígeno de EIV o EIV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus del Nilo Occidental en una manada, que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en este documento, que incluye un antígeno del WNV o WNV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con la encefalomielitis equina del este en una manada, que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento que incluye un antígeno del virus EEE o un virus EEE inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona además un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con la encefalomielitis equina occidental en una manada, que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento, que incluye un virus WEE, antígeno o un virus WEE inactivado o atenuado, en un animal.
La presente divulgación proporciona además un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con la encefalomielitis equina venezolana en una manada, que comprende la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en este documento, que incluye un antígeno del virus VEE o un virus VEE atenuado inactivado, a un animal.
Los aspectos mencionados anteriormente pueden usarse en una terapia de combinación o como parte de un programa de inmunización en combinación con otros agentes inmunogénicos y vacunas. En un aspecto, las composiciones descritas en este documento se usan en combinación con los agentes inmunogénicos y las vacunas descritas en el documento WO 2010/025469.
La presente divulgación también proporciona un método para preparar cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente y en el presente documento, que comprende las etapas de combinar un ERAV o ERBV inactivado o vivo, atenuado con un vehículo farmacéutico adecuado. En formas preferidas, este método comprende además la etapa de añadir uno o más antígenos equinos o virus inactivados o atenuados. Un grupo preferido de antígenos y virus equinos se selecciona del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina venezolana, EHV y EIV, y toxoide tetánico y combinaciones de los mismos. En algunas formas preferidas, los métodos descritos en este documento pueden comprender además una etapa de filtración, en la que el producto final está en una forma más pura.
"Aproximadamente" se refiere a 10% de la cantidad especificada.
"Animales", como se usa en este documento, incluye animales domesticados que incluyen perros y animales con pezuñas que incluyen équidos, y específicamente caballos. En algunos aspectos, el término también se refiere a un ser humano.
Los "adyuvantes", como se usan en este documento, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), aceite no metabolizable, aceites minerales y/o vegetales/vegetales y/o animales, polímeros, carbómeros, tensioactivos, compuestos orgánicos naturales, extractos de plantas, carbohidratos, colesterol, lípidos, emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite en agua, HRA-3 (polímero entrecruzado de sacárido de ácido acrílico), HRA-3 con aceite de semilla de algodón (CSO), o preferiblemente HRA-5 (polímero entrecruzado de poliol de ácido acrílico). La emulsión se puede basar en particular en aceite de parafina líquida ligera (tipo Farmacopea Europea); aceite isoprenoide tal como escualano o escualeno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, en particular ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferiblemente tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, de maniuro (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, eventualmente etoxilado, y bloques de copolímero de, polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, DES) John Wiley and Sons, NY, páginas 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15: 564-570 (1997). En un aspecto preferido, el adyuvante está en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50%, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 2% a 30%, más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, aún más preferiblemente a una concentración de aproximadamente un 7% a aproximadamente un 22%, y lo más preferiblemente a una concentración de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 20% en volumen del producto final.
Como se usa en este documento, "un vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéutico" incluye todos y cada uno de los excipientes, disolventes, medios de crecimiento, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes inactivantes, antimicrobianos, antibacterianos y agentes antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción y similares. Dichos ingredientes incluyen aquellos que son seguros y apropiados para su uso en aplicaciones veterinarias. En algunos aspectos preferidos, y especialmente aquellos que incluyen composiciones inmunogénicas liofilizadas, los agentes estabilizantes para usar en la presente divulgación incluyen estabilizadores para liofilización o secado por congelación.
Los "diluyentes" pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizadores incluyen albúmina y sales alcalinas del ácido etilendiaminotetracético, entre otros.
En un aspecto preferido, la composición inmunogénica de la presente divulgación se prepara comprendiendo un conservante y un estabilizador; y, más preferiblemente, la composición inmunogénica de la presente divulgación se prepara comprendiendo anfotericina, formaldehído, gentamicina, EDTA, glicerol y combinaciones de los mismos.
Una "composición inmunogénica o inmunológica" se refiere a una composición de materia que comprende al menos un antígeno, que provoca una respuesta inmunológica en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Por lo general, una "respuesta inmunológica" incluye, entre otros, uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células T gamma-delta, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped presentará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de manera que se potenciará la resistencia a una nueva infección y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o ausencia de los signos clínicos que normalmente presenta un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o una duración más baja o título bacteriano en los tejidos o fluidos corporales o excreciones del huésped infectado.
El término "que requiere de tal administración" o "que requiere de tal tratamiento de administración", como se usa en el presente documento, significa que la administración/tratamiento está asociado con el refuerzo o mejora en la salud o con cualquier otro efecto medicinal positivo sobre la salud de los animales que reciben la composición inmunogénica de acuerdo con la presente divulgación, tales como la reducción de la incidencia o la gravedad de una infección o enfermedad viral.
El "virus de la rinitis equina A (ERAV)" se refiere a un Aphthovirus de la familia Picornaviridae, y se conocía previamente como rinovirus equino 1. "ERAV", como se usa en este documento, incluye formas inactivadas. En un aspecto, el ERAV es la cepa de ERAV/ON/05 que tiene el número acceso PTA-11829 depositada el 14 de abril de 2011 en la ATCC (American Type Culture Collection, PO Box 1549 Manassas, VA 20108 EE. UU.) de acuerdo con el Tratado de Budapest, y que se recuperó del cultivo de células de riñón de conejo 13 (RK-13) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá en 2005. El ERAV/ON/05 cuando se transcribe y secuencia de manera inversa tiene la SEQ ID NO: 1 en su región UTR 5'.
La secuencia genómica de transcripción inversa de ERAV/ON/05 es la SEQ ID NO: 2.
La poliproteína codificada por la secuencia genómica de ERAV/ON/05 es la SEQ ID NO: 3.
Las cepas de ERAV útiles en las composiciones inmunogénicas de la divulgación tienen secuencias de nucleótidos UTR 5' transcritas de forma inversa que tienen una identidad de secuencia superior al 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, las cepas de ERAV tienen secuencias genómicas que cuando se transcriben de forma inversa en ADN son más del 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idénticas a la sEq ID NO: 2 o tienen secuencias codificantes de poliproteínas que son más del 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a la secuencia codificante de poliproteína en la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, el ERAV tiene poliproteínas con una secuencia de aminoácidos superior al 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID nO: 3 o a la secuencia de VP1 dentro de la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos, el ERAV tiene una proteína L, VP2, VP3, VP4, VP0, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C o 3D, que tienen una secuencia de aminoácidos con más del 80%, más del 90%, más del 99% o 100% de identidad con la misma proteína encontrada en la SEQ ID NO: 3. Todas las cepas de ERAV son, cuando no están inactivadas o atenuadas, infecciosas y capaces de replicarse en las células huésped.
El "virus de la rinitis equina B (ERBV)" se refiere a un erbovirus de la familia Picornaviridae, y se conocía previamente como rinovirus equino 2. "ERBV", como se usa en este documento, incluye formas inactivadas. En un aspecto, el ERBV es una cepa depositada con la ATCC que se recuperó del cultivo de células de riñón de conejo 13 (RK-13) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá (ATCC acceso No: PTA-11828) que fue depositado en la ATCC (American Type Culture Collection, PO Box 1549 Manassas, VA 20108 USA) el 14 de abril de 2011 en virtud del Tratado de Budapest. Las cepas de ERBV útiles en las composiciones inmunogénicas de la divulgación tienen secuencias genómicas que cuando se transcriben de forma inversa en ADN son más del 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idénticas a la transcripción inversa de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829, o tiene secuencias codificantes de poliproteínas que son más del 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a la secuencia codificante de poliproteína de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA- 11829. En algunos aspectos, las cepas de ERBV útiles tienen poliproteínas con una secuencia de aminoácidos superior al 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de poliproteínas de la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. En otros aspectos, el ERBV tiene una proteína L, VP4, VP2, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A (Vpg), 3B, 3Cpro, 3Dpol que tienen una secuencia de aminoácidos con más del 80%, mayor que 90%, más del 99% o 100% de identidad con la misma proteína encontrada en la cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829. Todas las cepas de ERBV son, cuando no están inactivadas o atenuadas, infecciosas y capaces de replicarse en las células huésped.
El término antígeno del "virus del Nilo Occidental" significa, pero no se limita a, los componentes del virión del WNV que son inmunogénicos cuando están presentes en un animal, y más particularmente los componentes proteicos, tales como las proteínas de la envoltura y no estructurales, del wNv que provocan respuestas inmunitarias humorales o celulares cuando están presentes en un animal. Dichos antígenos pueden incluir ADN, subunidades de proteínas, virus vivos modificados y virus inactivados. En formas preferidas de la divulgación, el antígeno o antígenos de WNV comprenden cepas de WNV inactivadas o muertas, e incluso más preferiblemente, dominantes en América del Norte.
La expresión "virus del Nilo Occidental de América del Norte (cepas)" se refiere, pero no se limita a, cualquier cepa del virus del Nilo Occidental que se haya descubierto alguna vez en el continente norteamericano. Preferiblemente, una cepa del virus del Nilo Occidental de América del Norte tiene una identidad de secuencia con la cepa NY99 (GenBank acceso No. AF196835 o secuencia de referencia del NCBI NC_00942.1 de al menos 97%, incluso más preferiblemente, al menos 98%, aún más preferiblemente, al menos 98,5%, más preferiblemente, al menos 99%, incluso más preferiblemente, al menos 99,2% y, lo más preferiblemente, de al menos 99,4%. WN02 es un ejemplo representativo de una cepa de WNV que puede denominarse como cepa del virus del Nilo Occidental dominante en norteamericana. Específicamente, las cepas dominantes en América del Norte son aquellas que tienen al menos un cambio de nucleótido que resulta en un cambio de aminoácido de los aislados WN99. La cepa NY99 (GenBank acceso No. AF196835) sirve como cepa de referencia para determinar si una cepa es dominante en América del Norte. Además, estas cepas pueden tener uno o más cambios silenciosos de aminoácidos. En algunos aspectos, el cambio de nucleótidos da como resultado un cambio de aminoácidos en una proteína de la envoltura de la cepa y, más preferiblemente, el cambio de nucleótidos resulta en un cambio de aminoácido de valina a alanina. Preferiblemente, este cambio de aminoácidos está asociado con una mayor capacidad de replicarse en el huésped intermedio, a saber, el mosquito. Más preferiblemente, las cepas dominantes en América del Norte incluyen (y preferiblemente ambas) una mutación de U por C y una mutación de C por U en las posiciones 1442 y 2466 (en comparación con una cepa de América del Norte, por ejemplo, NY 99), respectivamente. Aún más preferiblemente, las cepas dominantes en América del Norte incluyen además una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína E y la mutación C por U en la posición 9352 en la secuencia que codifica la proteína NS5 (de nuevo en comparación con una cepa América del Norte, por ejemplo, NY 99). Estas mutaciones preferidas se muestran en Phylogenetic Analysis of North American West Nile virus Isolates, 2001-2004: Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype, C. Todd Davis, et. Al., Virology 342, páginas 252-265 (2005). Las cepas del virus del Nilo occidental, para los fines de la presente divulgación, no se limitan a las cepas del virus del Nilo occidental de caballos y equinos, sino que abarcan, aunque no se limitan a, las cepas del virus del Nilo occidental de origen en aves, origen en burros, origen en cerdos, origen en humanos, origen en mamíferos y origen en equinos.
"Identidad de secuencia", como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, a saber, una secuencia de referencia y una secuencia dada para comparar con la secuencia de referencia. La identidad de la secuencia se determina comparando la secuencia dada con la secuencia de referencia después de que las secuencias se hayan alineado de manera óptima para producir el grado más alto de similitud de secuencia, de acuerdo con lo determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. Tras tal alineación, la identidad de secuencia se determina posición por posición, por ejemplo, las secuencias son "idénticas" en una posición particular si en esa posición, los nucleótidos o residuos de aminoácidos son idénticos. El número total de tales identidades de posición se divide luego por el número total de nucleótidos o residuos en la secuencia de referencia para obtener el % de identidad de secuencia. La identidad de la secuencia se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos, entre otros, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, AN, ed., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad de secuencia se codifican en programas informáticos disponibles públicamente que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Ejemplos de tales programas incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, SF et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). El programa BLASTX está disponible públicamente a traves del NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, SF et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990)). Estos programas alinean de manera óptima las secuencias utilizando pesos de huecos predeterminados para producir el nivel más alto de identidad de secuencia entre las secuencias dadas y de referencia. Como ilustración, mediante un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de "identidad de secuencia" con una secuencia de nucleótidos de referencia, se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polinucleótido dada puede incluir hasta 15, preferiblemente hasta 10, incluso más preferiblemente hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad con respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 15%, preferiblemente 10%, incluso más preferiblemente 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden eliminarse o sustituirse por otro nucleótido, o pueden insertarse en la secuencia de referencia un número de nucleótidos hasta el 15%, preferiblemente el 10%, incluso más preferiblemente el 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De manera análoga, por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que tiene al menos, por ejemplo, 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, se pretende que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polipéptido dado puede incluir hasta 15, preferiblemente hasta 10, incluso más preferiblemente hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia polipeptídica dada que tenga al menos 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 15%, preferiblemente hasta 10%, incluso más preferiblemente hasta 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia se puede eliminar o sustituir con otro aminoácido, o un número de aminoácidos hasta el 15%, preferiblemente hasta el 10%, incluso más preferiblemente hasta el 5% del número total de los residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no son idénticos se diferencian por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Sin embargo, las sustituciones conservadoras no se incluyen como coincidencia cuando se determina la identidad de secuencia. En la presente divulgación, se entiende que la SEQ ID NO: 1 (UTR 5') y la SEQ ID NO: 2 son las secuencias de ADN que resultan de la transcripción inversa de la UTR 5' y el genoma completo de ERAV/ON/05, respectivamente. Asimismo, la SEQ ID NO: 3 se refiere a la secuencia de aminoácidos correspondiente a la poliproteína codificada por la secuencia genómica de ERAV/ON/05. Por lo tanto, el porcentaje de identidad de una cepa de ERAV dada en comparación con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 se refiere a la secuencia de ADN correspondiente resultante de la transcripción inversa y secuenciación.
"TCID50" se refiere a una dosis infecciosa de cultivo de tejidos que infecta al 50% de las células en un cultivo inoculado con el virus.
Para los propósitos de la presente invención, los términos "cepa" y "aislado" tienen el mismo significado y se usan indistintamente.
Los "signos clínicos" o "síntomas clínicos" de ERAV y ERBV incluyen, pero no se limitan a, pirexia, elevación de la temperatura, aumento de los ruidos pulmonares, linfadenopatía, secreción nasal, secreción ocular y tos y faringitis. Otros signos o síntomas incluyen anemia, anorexia, linfadenitis de cabeza y cuello, edema de las patas, letargo y dolor. Además, los signos clínicos de infecciones por ERAV y/o ERBV pueden incluir los asociados con el virus del herpes equino y el virus de la influenza equina. En un aspecto, los signos clínicos de ERAV incluyen tos, faringitis, pirexia, elevaciones de temperatura, aumento del tamaño de los ganglios linfáticos submandibulares, secreción nasal y secreción ocular. En ciertos aspectos, los signos clínicos de ERAV incluyen una mayor incidencia de abortos en yeguas preñadas. En otro aspecto, los signos clínicos que debe abordar una composición inmunológica descrita en el presente documento son los de infecciones respiratorias, tales como las causadas por uno o más de ERAV, ERBV, EIV, EHV-1 y EHV-4.
Los "signos clínicos" o "síntomas clínicos" del virus del Nilo Occidental, para los propósitos de esta descripción, incluyen, pero no se limitan a, síntomas o lesiones asociados con encefalitis, viremia, anorexia, depresión, fiebre, debilidad, marcha anormal, parálisis de las extremidades posteriores, alteración de la visión, ataxia, deambular sin rumbo, convulsiones, incapacidad para tragar, coma, debilidad posterior, parálisis, mala coordinación, depresión y comportamientos relacionados, temblores, convulsiones, chapoteo de las extremidades, problemas neurológicos, hinchazón del sistema nervioso central, muerte y combinaciones de los mismos. Los signos clínicos que presenta un animal infectado varían de acuerdo con la gravedad de la infección.
Los "signos clínicos" o "síntomas clínicos" del virus del herpes equino, para los fines de esta descripción, incluyen, entre otros, aborto, deficiencias neurológicas, enfermedad respiratoria, deficiencias y fallas del sistema reproductivo, y síntomas relacionados con el sistema nervioso. Además, los síntomas clínicos de EHV1 incluyen, pero no se limitan a, el fenómeno de potros infectados con EHV1, que exhiben complicaciones respiratorias, transmiten el virus a los miembros mayores de la manada que luego exhiben deficiencias reproductivas, incluido el aborto, y deficiencias neurológicas, normalmente exhibido en el sistema nervioso central.
"Signos clínicos" o "síntomas clínicos" de encefalomielitis equina del este, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana, para los propósitos de la presente divulgación, son aquellos síntomas que normalmente se sabe que están asociados con encefalomielitis, que incluyen, pero no se limitan a fiebre, signos nerviosos como sensibilidad al sonido, períodos de excitación e inquietud, lesiones cerebrales, somnolencia, orejas caídas, movimientos en círculos, marcha anormal, parálisis, pérdida del apetito, depresión, presión en la cabeza, falta de coordinación, discapacidad a largo plazo, daño cerebral, muerte y combinaciones de los mismos. "Seguridad", como se usa en el presente documento, se refiere a la ausencia de consecuencias adversas en el animal vacunado después de la vacunación, incluidas, entre otras, la posible reversión del virus de la vacuna a virulencia y efectos secundarios clínicamente significativos, tales como enfermedad sistémica persistente o inflamación inaceptable en el lugar de la administración de la vacuna.
"Reducción de la incidencia y/o gravedad de los signos clínicos" o "reducción de la incidencia y/o gravedad de los síntomas clínicos", como se hace referencia en este documento, significa reducir el número de animales infectados en un grupo, reducir o eliminar el número de animales que presentan signos clínicos de infección o que reducen la gravedad de cualquier signo clínico presente en los animales, en comparación con la infección de tipo silvestre. Por ejemplo, tales signos clínicos incluyeron viremia, fiebre, respuesta de anticuerpos, secreción ocular, secreción nasal e histopatología. Preferiblemente, estos se reducen en los animales que reciben la composición de la presente divulgación en al menos un 10% en comparación con los animales que no reciben la vacuna y que pueden infectarse. Más preferiblemente, los signos clínicos se reducen en animales que reciben la composición de la presente divulgación en al menos un 20%, más preferiblemente en al menos un 30%, incluso más preferiblemente en al menos un 40%, e incluso más preferiblemente en al menos un 50%.
"Duración de la inmunidad", como se usa en este documento, se refiere al número mínimo de días durante los cuales un animal produce una respuesta inmunogénica tal que el animal será relativamente inmune de contraer un virus y/o se beneficiará de la reducción de la incidencia y/o gravedad de los signos clínicos, como se describe en este documento.
El término "inactivado" y "virus inactivado" se refiere a un virus previamente virulento que se ha calentado o tratado químicamente para inactivar, matar o modificar de otro modo el virus para eliminar sustancialmente sus propiedades virulentas mientras conserva su inmunogenicidad. En un aspecto preferido, los virus inactivados descritos en el presente documento se inactivan mediante tratamiento con un agente inactivante. Los agentes inactivadores adecuados incluyen beta-propiolactona, etilenimina binaria, glutaraldenido y formaldehído. En algunos aspectos, el agente inactivante es formaldehído.
Los términos "vacuna" y "composición inmunogénica", cuando se usan en este documento, deben usarse indistintamente.
Se puede utilizar cualquier cepa o cepas o aislado o aislados del virus del Nilo Occidental de acuerdo con la presente divulgación. En un aspecto preferido, el aislado se selecciona de uno o más de los siguientes: aislado de Nueva York (noreste de América del Norte) (WN-NY 99), originada en caballos, 1999, aislado de Nueva York (noreste de América del Norte) (WN-NY 99), originado en cuervos, 1999, aislado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos 292206 (USDA 2004), originado en burros, aislado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos 405330 (USDA 2005), originado en caballos, aislado en América del Norte (WN-Texas-2002/2003), aislado en las costas del sureste de Texas 2002, aislado en Mejico (Tabasco) 2003, y combinaciones de los mismos, y en un aspecto más preferido, el aislado se selecciona de uno o más de los siguientes: aislado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2004), originado en burros, aislado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos 405330 (USDA 2005), origenado en caballo, Aislado en América del Norte (WN-Texas-2002/2003), aislado en las costas del sureste de Texas 2002, aislado en México (Tabasco) 2003 y combinaciones de los mismos. En un aspecto más preferido, el aislado es el aislado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos 405330 (USDA 2005), originado en caballos de forma individual o en combinación con uno o más aislados como se enumeran anteriormente. En un aspecto adicionalmente preferido, se incluyen aquellos aislado que forman parte de los aislados del virus del Nilo Occidental de América del Norte. En otro aspecto más preferido, se incluyen aislados del virus del Nilo Occidental dominantes en Norte América. Además de los enumerados anteriormente, los aislados específicos incluyen, pero no se limitan a, WN02 y los aislados que tienen al menos 1, preferiblemente al menos 2, e incluso más preferiblemente al menos 3 cambios de nucleótidos que dan como resultado al menos un cambio de aminoácido de los aislados de WN NY99, y los más preferidos son las cepas con el cambio de aminoácido de valina por alanina en la posición 159 de la proteína de la envoltura. Las cepas dominantes norteamericanas más preferidas incluyen, pero no se limitan a: NY2002Nassau, NY2002Clinton, NY2002Queens, GA20021, GA20022, TX20021, TX20022, IN2002, NY2003Albany, NY2003Suffolk, NY2003Chatauqua, CO20031, CO20032, TX2003, TX2003Harris4, TX2003Harris6, TX2003Harris7, TX2003Harris10, AZ2004, y TX2004Harris4 y combinaciones de las mismas. Las cepas del virus del Nilo Occidental útiles en la vacuna o composición inmunogénica de la presente divulgación pueden ser también cualquier cepa o aislado. En un aspecto preferido, la cepa del virus del Nilo Occidental dominante en Norte América usada es E-159 (originada en caballos) o E-159 (originada en burros). Una cepa representativa de tal cepa WNV dominante en América del Norte incluye la cepa originada en caballos 2005 depositada en la ATCC (ATCC acceso No: PTA-9409), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest. Las cepas de influenza equina útiles en la vacuna o composición inmunogénica de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Las cepas representativas incluyen Equi-2/Ohio/03, depositada como la ATCC acceso No: PTA-9522, Equi-2/Kentucky/95, depositada como la ATCC acceso No: PTA-9523 y Equi-2/New Market/2/93 , depositado como la ATCC acceso No: PTA-9524. Las cepas representativas de la ATCC accesos Nos. PTA-9522, PTA-9523 y PTA-9524 fueron depositadas cada una en la ATCC en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 el 23 de septiembre de 2008, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas del virus del herpes equino ("EHV") útiles en la vacuna o composición inmunogénica de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Las cepas representativas incluyen el subtipo 1 de EHV, depositado como ATCC acceso No: PTA-9525, y subtipo 4 de EHV, depositado como ATCC acceso No: PTA-9526. Las cepas representativas ATCC accesos Nos PTA-9525 y PTA-9526 se depositaron cada una en la ATCC en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 el 23 de septiembre de 2008, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas de encefalomielitis equina occidental útiles en la vacuna o composición inmunogénica de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa Fleming, depositada en la ATCC (ATCC acceso No: PTA-9410), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas de encefalomielitis equina venezolana útiles en la vacuna o composición inmunogénica de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa TC-83, depositada en la ATCC (ATCC acceso No: PTA-9411), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas de encefalomielitis equina del este útiles en la vacuna o composición inmunogénica de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa NJO, depositada en la ATCC (ATCC acceso No: PTA-9412), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas de toxoide tetánico útiles en la vacuna o composición inmunogénica de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa es la tomada de una semilla maestra de Clostridium tetani del Instituto de Laboratorios del Departamento de Salud Pública de Massachusetts en Boston, Massachusetts.
La vacuna o composición inmunogénica como se describe en este documento es segura para la administración en especies susceptibles a ERAV o ERBV, particularmente équidos, a cualquier edad. En un aspecto preferido, la presente divulgación es segura para la administración a potros de 12 meses de edad o más, más preferiblemente, es segura para la administración a potros de 10 meses de edad o más, más preferiblemente, es segura para la administración a potros de 8 meses o mayores, más preferiblemente, es seguro para la administración a potros de 6 meses de edad o más, más preferiblemente, es seguro para la administración a potros de 4 meses o mayores, más preferiblemente, es seguro para la administración a potros de 2 meses de edad o mayores, más preferiblemente, es seguro para la administración a potros de 1 mes de edad o más, incluso más preferiblemente, es seguro para la administración a potros entre 1 día y 1 mes de edad y, lo más preferiblemente, es seguro para la administración a potros de 1 día de edad o más.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar de cualquier manera convencional. Ejemplos de métodos de administración incluyen cualquiera que permita el acceso de las células del sistema inmunológico a la composición inmunogénica, incluyendo oral, transdérmico/intradérmico, intravenoso, subcutáneo, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intrarrectal, intravaginal, intranasal, intragástrico, intratraqueal, intrapulmonar o cualquier combinación de los mismos. En un aspecto preferido, la vacuna se administra por vía parenteral, preferiblemente intranasal, subcutánea o intramuscular, y en el aspecto más preferido la vacuna se administra por vía intramuscular.
En un aspecto, se describe un método para preparar una composición inmunogénica que comprende un ERAV y/o ERBV como se describe en el presente documento. En un aspecto, el método comprende:
a) infectar una línea celular susceptible con ERAV o ERBV;
b) hacer crecer la línea celular infectada en medios de cultivo hasta que se logre un efecto citopático (CPE);
c) recolectar los medios;
d) filtrar los medios para producir medios filtrados; y
e) poner en contacto los medios filtrados con un agente inactivante para obtener el ERAV o ERBV inactivado.
En un aspecto, el método comprende proporcionar la cepa ERAV/ON/05 o una cepa de ERBV que tiene el una ATCC acceso No: PTA-11829. Estas cepas se utilizan para infectar una línea celular susceptible que tiene propiedades ventajosas de crecimiento y secreción útiles para la preparación de vacunas. Una línea celular susceptible preferida es una línea celular Vero tal como una línea celular Vero76 o E-Vero.
Los medios de crecimiento adecuados incluyen E199. Este medio se puede complementar con una solución de L-glutamina y un antibiótico tal como una solución de sulfato de gentamicina. En algunos aspectos, el medio de crecimiento es E199 complementado con solución de L-glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de gentamicina (hasta 30 pg/mL). En algunos aspectos, los fluidos virales se recolectan cuando el efecto citopático CPE alcanza el 75% o más. Los medios recolectados se agrupan y filtran, por ejemplo, a través de cartuchos de filtro de polipropileno con un tamaño de poro de 5,0 micrones. Las cepas se inactivan químicamente, por ejemplo, mediante tratamiento con una solución de formaldehído al 0,1-0,2% durante un período de tiempo adecuado, por ejemplo, de 48 horas a 72 horas, y los fluidos resultantes se concentran. En algunos aspectos, se añaden a continuación conservantes y adyuvantes. Los conservantes adecuados incluyen uno o más de anfotericina B, sulfato de gentamicina y formaldehído. En otros aspectos, el adyuvante es HRA-5. En otros aspectos más, el adyuvante es HRA-3 con aceite de semilla de algodón (CSO).
En un aspecto y de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, se describe una composición inmunogénica que comprende ERAV/ON/05 y/o una cepa de ERBV que tiene una ATCC acceso No. PTA-11829 y anfotericina B, sulfato de gentamicina, formaldehído y h RA-5 preparado de acuerdo con los métodos descritos en este documento.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen a continuación para ilustrar realizaciones específicas de la presente invención. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y se entiende que no limitan el alcance o los principios subyacentes de la presente invención.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra una realización de una composición del virus A de la rinitis equina de acuerdo con la presente invención.
Materiales y métodos
Se recuperó la cepa de ERAV/ON/05 del virus A de la rinitis equina (ATCC acceso No: PTA-11828) a partir de un cultivo de células de riñón de conejo-13 (RK-13) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá. El virus se pasó una vez en células E-Vero para producir una reserva maestra de alta concentración previamente valorada, y luego se diluyó con medio de cultivo celular para producir el virus de la semilla maestra. La reserva maestra de células es una línea celular E-Vero cultivada y mantenida usando E199 complementado con solución de L-glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de gentamicina (hasta 30 pg/mL). ERAV/ON/05 inactivada se produjo de acuerdo con el siguiente procedimiento general.
La reserva maestra de células congeladas se descongela a temperatura ambiente (18-26 °C) y se usa para inocular una variedad de matraces de T-25 cm2 hasta T-150 cm2 preesterilizados o frascos preesterilizadas rotatorios de PETG de 850 cm2 o 1050 cm2. Las células descongeladas se suspenden en medio de crecimiento a una velocidad de 0,15 a 0,40 mL por cm2. Las células se incuban a 36-38 °C durante hasta siete días. Los cultivos sembrados a partir de material congelado se pueden realimentar con medio para eliminar el dimetilsulfóxido (DMSO) residual, para eliminar el exceso de desechos, para estimular el crecimiento de cultivos que no han alcanzado la confluencia o para mantener la viabilidad de los cultivos confluentes. Las células se pasan decantando el medio gastado y agregando 1-10 mL (dependiendo del tamaño del recipiente) de una solución de tripsina-EDTA al 25% a cada recipiente. Los recipientes se agitan suavemente hasta que las células se desprenden de la superficie. Las células se extraen de los recipientes enjuagando con medio de crecimiento y se combinan. El intervalo de pases de cultivo celular es de uno a veinte.
Antes de la inoculación, el medio de crecimiento celular se decanta de las células que son al menos un 90% confluentes. La lámina de células se enjuaga con 20-50 mL de medio de infección viral (E199 complementado con solución de L-glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de gentamicina (hasta 30 pg/mL), luego se vuelve a alimentar con medio de infección viral a una tasa de 0,15 a 0,40 mL/cm2. A continuación, los recipientes se inoculan con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,0005 a 0,005. Los cultivos en frascos rotatorios se incuban a 36-38 °C durante dos a cinco días a 0,2-0,4 rpm.
Durante el período de crecimiento, los cultivos se controlan microscópicamente para detectar CPE y macroscópicamente para detectar contaminación gruesa. Los cultivos inadecuados se descartan después de la esterilización.
Los fluidos de virus se recolectan cuando el CPE alcanza el 75% o más. Los frascos rotatorios se agitan para eliminar las células sueltas y los fluidos se mezclan en frascos estériles de vidrio, plástico o PETG de 2-20 L, recipientes de polipropileno estériles de 20 L o tanques de acero inoxidable estériles de 2-200 L apropiados para la clarificación. Los fluidos combinados pueden mantenerse hasta siete días a 2-8 °C antes de la clarificación.
Sólo se recogen los fluidos de cultivos de monocapa que muestran evidencia de infección viral. Los frascos que indican contaminación se desechan. Se recolecta una muestra de fluidos clarificados combinados antes de la inactivación para valoración por TCID50. Se pueden utilizar líquidos con un título de 1062 TCID50/mL o superior en la preparación del producto final. Se pueden mezclar varios lotes para lograr los títulos mínimos.
Los lotes recolectados se clarifican mediante filtración usando cartuchos de filtro de polipropileno con clasificación de tamaño de poro de 5,0 micrómetros. Los lotes de recolección clarificados pueden almacenarse hasta siete días a 2-8 °C. A continuación, los fluidos clarificados se inactivan con una solución de formaldehído, USP, 0,1-0,2% en volumen, se transfieren a un recipiente secundario y se mantienen a temperatura ambiente (18-26 °C) con agitación durante un mínimo de 48 a 72 horas. Se toma una muestra de fluidos inactivados para la prueba de garantía de inactivación antes de la concentración. El material del lote inactivado se mantiene a 2-8 °C antes de la concentración. Los fluidos de virus clarificados e inactivados se concentran por un factor de 5X a 50X utilizando cartuchos de membrana de ultrafiltración de flujo tangencial con índices de corte de peso molecular de no más de 10.000 Dalton de PM.
Se pueden añadir varios adyuvantes adecuados a la formulación de vacuna, lo más preferiblemente HRA-5. Otros adyuvantes incluyen HRA-3 con aceite de semilla de algodón (CSO). Pueden emplearse etapas de procesamiento típicas tales como mezcla, combinación, microfluidización y emulsificación del adyuvante y/o de los antígenos del virus recolectado con otros ingredientes.
A continuación, el producto se ensambla hasta la formulación final. En un método de dosificación en un ejemplo de realización, las cantidades requeridas de adyuvante y diluyente MEME se combinan en un recipiente estéril y el pH se ajusta a aproximadamente 6,3-6,7 con hidróxido de sodio. ERAV, sulfato de gentamicina, formaldehído y anfotericina B se agregan uno a la vez durante la mezcla constante. El pH se ajusta a 6,8-7,0 con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico y la serie se mezcla durante un mínimo de 18 horas a 2-8 °C. La serie completa a granel se transfiere a un recipiente de almacenamiento adecuado y se almacena a 2-8 °C. Puede añadirse anfotericina B a una concentración de hasta 2,5 pg/mL del volumen de diluyente como conservante. Se añade sulfato de gentamicina a una concentración de hasta 30 pg/mL del volumen de diluyente como conservante. Se añade formaldehído a una concentración del 0,1% del volumen de diluyente como conservante. Se añade un adyuvante tal como HRA-5 a una concentración del 10% v/v del volumen serial final.
La vacuna se administra mediante una inyección hipodérmica típica, con vacunaciones de refuerzo si se desea.
Ejemplo 2
Esta investigación se llevó a cabo para obtener una evaluación de la eficacia de una vacuna contra el virus A de la rinitis equina para proteger a los caballos de la exposición al virus A de rinitis equina.
Materiales y métodos
Se prepararon vacunas de ERAV de dosis alta A-9 (1075 TCID50/mL) y de dosis baja de A-10 (1070 TCID50/ 1T1L) de acuerdo con el Ejemplo 1.
Tabla 1: Formulación de la vacuna A-9 1 mL :
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Tabla 2: Formulación de vacuna A-10 1 1 mL :
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Se preparó una formulación de de 1 mL de placebo V-05 como en las vacunas A-9 y A-10 pero sin el antígeno de ERAV/ON/05.
Se dividió aleatoriamente un total de 44 caballos en uno de los tres grupos de tratamiento que consistían en un grupo de control con placebo V-05 de 15 caballos, un grupo de dosis baja de A-10 de 14 caballos y un grupo de dosis alta de A-9 de 15 caballos. Los caballos se vacunaron con un producto de dosis de 1 mL complementado con HRA-5 para tres dosis totales, con un intervalo de 21 días entre dosis. Posteriormente, los caballos se expusieron 21 días después de la tercera vacunación mediante aerosolización intranasal con una dosis nebulizada de virus A de Rinitis de 1070 TCID50/mL durante un período de cuatro minutos. Los caballos fueron evaluados diariamente por signos clínicos de temperatura, exudado nasal, secreción ocular. Se tomó semanalmente sangre para la neutralización del suero (NS).
Virus para la exposición
El virus para la exposición se produjo en cultivo de tejidos en células E-Vero. Se determinó que el título del virus para la exposición era 1 x 1069 TCID50/mL el día de la exposición. El virus para la exposición se diluyó 1:10 en la mañana de la exposicón con medio de cultivo de tejidos para obtener un título de 1 x 1059 TCID50/mL.
Método de exposición intranasal
Se administró por vía intravenosa Sedivet® (clorhidrato de romifidina), un sedante y analgésico, a cada caballo antes de la exposición a una dosis de 50 pg/kg de peso corporal. A continuación, cada caballo se expuso a aproximadamente 1062 TCID50 del virus A de rinitis equina. El virus para la exposición se administró por vía intranasal como un aerosol producido por un nebulizador en una AeroMask para equinos (Trudell Medical International, Ontario, Canadá) mediante el siguiente método.
Se colocaron cuatro mililitros de 1059 TCID50/mL del virus para la exposición en una copa nebulizadora del dispositivo AeroMask. Se instaló una manguera de presión desde un compresor de aire al puerto de entrada del nebulizador. A continuación, se insertó el tubo de salida en la AeroMask unida a la cabeza del caballo que estaba siendo expuesto y se aplicó aproximadamente 10 psi de presión de aire al puerto de entrada durante tres minutos. Durante este tiempo se aerosolizaron aproximadamente dos mililitros de fluido de virus de la exposoción directamente en las fosas nasales del caballo que se estaba siendo expuesto.
Neutralización del suero
En este estudio se empleó una prueba de neutralización del suero de microtitulación estándar. En este estudio se empleó una prueba de neutralización del suero de microtitulación estándar. Todos los sueros se analizaron en placas de microtitulación de fondo plano estériles utilizando cinco pozos por dilución y una serie de diluciones de 8 pozos para cada uno de los 5 pozos de prueba. Cada uno de los 5 pozos de prueba contenía 25 pL de dilución de suero mezclada con 25 pL del virus indicador y 150 pL de una suspensión de células eVero recién plantadas que contenían aproximadamente 5 x 104 células. El virus indicador de prueba utilizado fue el virus de la rinitis equina de tipo I. Los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero se expresan como títulos ID50 de Reed-Muench.
Para la realización de la prueba, se hicieron diluciones dobles de cada suero de prueba en una placa de microtitulación de fondo plano estéril usando cinco pozos replicados por suero de prueba y una serie de diluciones de 8 pozos. Las diluciones se realizaron con un instrumento de pipeteo de uno o varios canales de volumen ajustable utilizando puntas de microtitulación estériles. El volumen de suero añadido a cada uno de los 5 pozos de la primera fila fue de 50 pL. Todos los demás pozos contenían 25 pL de DMEM (sin FBS). Después de una dilución en serie abajo de la placa, se descartaron 25 mL de la última fila. Se agregaron 25 pL de una dilución predeterminada del virus indicador a cada pozo de prueba. A continuación, las placas se mezclaron y se incubaron durante una hora a 37 °C en CO2 al 5%. Al finalizar el período de incubación, se añadieron 150 pL de una suspensión que contenía 4 x 106/mL de células eVero a cada pozo de prueba y control celular. Las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 durante 5 días, momento en el que las placas se examinaron microscópicamente para determinar el CPE típico del virus de la rinitis equina.
Evaluación del exudado nasal
Todas las observaciones del exudado nasal se realizaron antes de la recogida de frotis nasofaríngeos. El día de la exposición y durante los 10 días posteriores a la exposición, se examinaron y clasificaron las fosas nasales y el hocico de cada uno de los 44 caballos vacunados y de control utilizando la descripción de clasificación y puntuación enumerada a continuación.
Las calificaciones de la puntuación de 0 a 6 se asignaron sobre la base de la gravedad de la enfermedad indicada por cada una de las siguientes clasificaciones:
T l lifi i n l n i n
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Evaluación ocular
La secreción ocular se evaluó diariamente en el momento de la evaluación del exudado nasal. Las puntuaciones de secreción ocular se registraron como 0 = normal; 1 = secreción ocular leve a moderada y 2 = secreción ocular grave.
Aislamiento viral nasofaríngeo
En cada día de prueba de observación, cada pasaje nasal de cada caballo vacunado y de control se limpió profundamente por medio de una lanza quirúrgica WECK-CELTM estéril (Edward Week and Company, Inc., Research Triangle Park, NC 27709) unida a una pipeta de plástica estéril 11 pulgadas de largo. En la recolección, cada una de las dos lanzas quirúrgicas se colocó inmediatamente en un solo tubo que contenía 4 mL de medio de transporte frío (E-199 complementado con gentamicina, L-glutamina, 2X Pen/Strep, 2X anfotericina B).
Para el aislamiento del virus, los tubos se mezclaron, los hisopos se retiraron asépticamente y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 a 15 minutos para eliminar las partículas. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pL antes de la inoculación en células de cultivo de tejidos. Después de la filtración, se añadió 4-6% de solución estéril de sacarosa al 85% a cada muestra para congelarla a -80 °C para que todas las muestras se analicen al mismo tiempo.
Para el aislamiento del virus, los tubos se mezclaron, los hisopos se retiraron asépticamente y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos para eliminar las partículas. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pL antes de la inoculación en células de cultivo de tejidos. Se utilizó un mL del medio de transporte clarificado para inocular una monocapa de 2 cm2 de dos días de edad de células E-Vero cultivadas en una placa de cultivo de tejido de 24 pozos de la que se había eliminado asépticamente el medio de crecimiento. Después de la inoculación, se dejó que el inóculo se adsorbiera en la monocapa celular durante una hora a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía una atmósfera de CO2 al 5%. Después del período de adsorción, se añadió a cada pozo 1 mL adicional de medio de realimentación (E-199 que contiene suero bovino fetal (FBS) al 7%, L-glutamina 2 mM, gentamicina 2X Pen-Strep y 2X de anfotericina B). Después de la adición de medio de realimentación, las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2. Cada pozo de cultivo de tejido de prueba y control se examinó microscópicamente durante 7 días en busca de signos de efecto citopático (CPE) típicos del virus para la exposición ERAV. Los pozos que dieron negativo al final del período de observación de 7 días se subcultivaron en células frescas y se observaron durante 7 días adicionales.
Métodos de evaluación estadística
Los datos de todos los caballos vacunados con A-9 o A-10 se combinaron para evaluación estadística. La influencia de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (número de días con puntuaciones nasales > 0) se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis y Hodges-Lehmann (el procedimiento NPAR1WAY en SAS, SAS Institute, Cary NC). La gravedad de la enfermedad se evaluó comparando el estado máximo de enfermedad entre los caballos vacunados y los caballos de control. Las puntuaciones nasales se dicotomizaron a < 1,5 y > 1,5 de acuerdo con la distribución de los resultados. Se estimaron la fracción prevenida (PF) y los intervalos de confianza (CI) del 95%. Las puntuaciones oculares se evaluaron como presentes o ausentes y se estimaron la fracción prevenida y los intervalos de confianza del 95% (el procedimiento f Re Q en SAS). Se utilizó un análisis de medidas repetidas apropiado para datos continuos para evaluar el efecto de la vacunación sobre la temperatura corporal y los títulos de neutralización del suero (el procedimiento MIXTO en SAS). La proporción de caballos que fueron positivos para el virus a lo largo del tiempo y a la capa leucocitaria positiva a lo largo del tiempo se evaluó utilizando la prueba exacta de Fisher en cada punto de tiempo (el procedimiento Freq). Las puntuaciones nasales y oculares se evaluaron mediante la prueba de suma de intervalos de Wilcoxon en cada punto de tiempo (el procedimiento NPAR1WAY).
Resultados y conclusiones
Aislamiento del virus de los frotis nasales (diseminación del virus) y las capas leucocitarias (viremia)
La proporción de animales que fueron positivos al virus fue significativamente menor en los grupos vacunados en los días 2 a 7 (Tabla 4 a continuación y Figura 1) en comparación con el grupo de control (P <0,05).
Tabla 4. Proporción de virus de frotis nasal positivos a lo largo del tiempo (* P <0,05 frente al control, prueba exacta de Fisher cada ^día
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Los animales con capa leucocitaria positiva fueron menos frecuentes en el grupo vacunado los días 4-7 en comparación con el grupo de control (Tabla 5 a continuación y Figura 2).
Tabla 5: Proporción de capa leucocitaria positiva a lo largo del tiempo (* P <0,05 frente al control, prueba exacta de Fisher cada día
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continuación
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Neutralización del suero
Tabla 6: Resumen de la tem eratura cor oral la neutralización del suero
Figure imgf000028_0004
Los valores medios de la temperatura corporal (temperatura rectal medida con la sonda de termómetro calibrada de GSA Electronics) en cada día de exposición estuvieron siempre dentro de los parámetros normales de temperatura corporal. Se encontraron grandes aumentos en los títulos de SN resultantes de la vacunación (véase también la Figura 3) tras la exposición.
Evaluación nasal y ocular
Los intervalos medios para las puntuaciones nasales fueron menores los días 4 a 10 y los días 12-13 en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control (Tabla 7 a continuación y Figura 4). Los intervalos medios para las puntuaciones oculares fueron menores el día 7 en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control (véase también la Figura 5).
Tabla 7: Intervalo medio para la puntuación nasal y ocular a lo largo del tiempo (* P <0,05 frente a control; prueba de - -
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Duración de la enfermedad: evaluación del exudado nasal
Tabla 8: Resumen del efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (número de días con puntuación nasal> 0
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Tabla 9: Efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (puntuaciones nasales; * significativamente más bajo que el grupo de control de acuerdo con la prueba de Kruskal-Wallis P <0,05)
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Se encontró una larga duración de la secreción nasal en los controles después de la exposición (Tabla 8, véase también la Figura 4). El grupo vacunado mostró una reducción significativa en la duración de la secreción nasal. Los controles experimentaron un mínimo de 8 días de secreción nasal frente a 11 vacunados (38%) con 1 día o menos. Dos tercios de los vacunados tuvieron una duración más corta de la secreción nasal que el mínimo de 8 días en el grupo de control. La duración fue desde la primera hasta la última observación anormal, incluso si el caballo tenía días normales durante ese período. El número de días que los animales estuvieron enfermos con signos clínicos de enfermedad respiratoria (puntuación nasal > 0) fue significativamente más corto (cambio en 7 días) en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control.
Tabla 10: Puntuaciones nasales máximas - Diferencia significativa entre las dos distribuciones de puntuaciones rueba de Kruskal-Wallis P = 00157.
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Tabla 11: Puntuaciones nasales < 15 > 15
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La vacunación también redujo la gravedad de la secreción nasal (puntuación máxima en cualquier día posterior a la exposición). Se compararon las puntuaciones nasales máximas entre los grupos (Tabla 10). La puntuación nasal mínima para los caballos en el grupo de control fue de 1,5. Por lo tanto, los resultados se dicotomizaron a puntuaciones < 1,5 y > 1,5 para la evaluación de la gravedad de la enfermedad (Tabla 11). La fracción prevenida fue del 48% con un límite de confianza inferior superior a 0. La distribución general de las puntuaciones nasales máximas se redujo significativamente con la vacunación (prueba de Kruskal-Wallis, P = 0,0157).
Evaluación ocular
Tabla 12: Puntuaciones oculares resentes o ausentes
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Dado que solo se informaron dos valores para las puntuaciones oculares (0 o 2), los resultados se dicotomizaron en presencia o ausencia dentro de un individuo. La fracción prevenida se usó luego para evaluar el efecto de la vacunación sobre la presencia de signos oculares. La vacuna redujo significativamente la gravedad de la secreción ocular resultante de la infección por ERAV. Las puntuaciones oculares medias a lo largo del tiempo también se muestran en la Figura 5.
Los datos de este estudio demuestran que la administración de dosis intramusculares del virus inactivado es capaz de inmunizar a un animal a niveles elevados de detección de anticuerpos que previenen la enfermedad ocular y reducen la gravedad y duración de la secreción nasal. La vacuna fue muy eficaz para prevenir cualquier secreción ocular después de la exposición al ERAV. La secreción nasal persistió durante un período relativamente largo después de la exposición, mientras que la secreción ocular alcanzó su punto máximo y disminuyó rápidamente. Por lo tanto, la vacuna mostró una mejora significativa en la secreción nasal durante un período prolongado (9 de 10 días consecutivos), mientras que la vacuna redujo significativamente la secreción ocular durante 1 día durante el cual los signos oculares fueron más graves. Además, la vacunación redujo significativamente la diseminación nasal del virus durante los seis días sucesivos de diseminación viral máxima, y la viremia también se redujo significativamente durante los cuatro días de viremia máxima dentro del período de exposición.
No se observaron reacciones adversas inaceptables ni en los lugares de inyección ni por manifestación de signos de enfermedad sistémica. La vacuna es segura y bien tolerada para su administración en especies susceptibles al virus A de rinitis equina, particularmente équidos. Por lo tanto, este estudio demuestra que las inyecciones intramusculares de 3 x 1 mL de las composiciones de ERAV del ejemplo redujeron significativamente la gravedad y la duración de la enfermedad respiratoria causada por la exposición virulenta a ERAV.
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra la secuenciación y los estudios analíticos llevados a cabo en una cepa del virus A de la rinitis equina como se describe en el presente documento.
Células y virus
Se cultivaron células de riñón de conejo 13 (RK-13) (100-160 pases) en mezcla de nutrientes con medio de Eagle modificado de Dulbbeco F12 HAM (DMEM F12) (Sigma-Aldrich Canada Ltd. Oakville, Ontario) con suero fetal bovino (FBS) al 2-5 % (Sigma). El crecimiento celular y la propagación viral se realizaron en una incubadora de CO2 (5%) a 37 °C. El aislado de ERAV ERAV/ON/05 se propagó en células RK-13 y las alícuotas se almacenaron a -70 °C para su posterior trabajo. Se inocularon monocapas de RK-13 al 90% de confluencia y se extrajo el ARN antes de que se observaran los efectos citopáticos (CPE).
Valoración del virus y purificación en placa
Se cultivaron células RK-13 en placas redondas de 3 cm, usando DMEM F12 con suero de ternero fetal al 2%. Las células se infectaron a una confluencia del 90% y las placas se incubaron a 37 °C durante 72 horas. Después de 24 horas, se reemplazó el medio y se añadió una capa de agarosa al 0,7%. Las placas se contaron y registraron cada 24 horas. A las 72 horas se retiró la capa de agarosa y se tiñeron las placas con cristal violeta y se contaron.
Para la purificación en placas, se infectaron células RK-13 con ERAV/ON/05, se permitió la adsorción durante 45 minutos y se eliminó el inóculo y se reemplazó con una capa de agarosa al 0,7%. Las placas se revisaron cada 12 horas y las placas se clasificaron en pequeñas, medianas y grandes. Se seleccionaron cinco placas de cada tamaño, se recogieron en 300 pL de DMEM F12 y se congelaron a -70 °C. Los virus de cada tamaño de placa se propagaron en células RK-13 y se extrajo el ARN de las placas pequeñas y grandes para la secuenciación del genoma de la UTR 5'.
Cinética de crecimiento viral
Para estudiar las características de crecimiento de esta cepa, se infectaron células RK-13 con ERAV/ON/05 y se recogieron muestras de sobrenadante en varios momentos para la valoración. Las células RK-13 se cultivaron en placas redondas individuales de 3 cm y se infectaron al 90% de confluencia. Las placas se incubaron a 37 °C y se tomaron muestras de sobrenadante cada 4 horas comenzando a las 0 horas durante un período de 28 horas. Todas las muestras se valoraron utilizando la técnica de la unidad formadora de placa (PFU) como se describió anteriormente en el presente documento.
Inmunofluorescencia
Se cultivaron células RK-13 en cámaras de cultivo de tejidos/portaobjetos de vidrio (Miles Scientific, Inc., Naperville, Illinois) y se inocularon con ERAV/ON/05. Veintiocho horas después de la infección, se retiró el medio de cultivo celular y las células se fijaron en acetona. Los portaobjetos se mantuvieron a 4 °C hasta su procesamiento. Se utilizaron sueros de caballos infectados experimentalmente como fuente de anticuerpos de ERAV.
Extracción y secuenciación de ARN
Se extrajo ARN de monocapas de células infectadas. Las células se trataron con 1 mL de TRIzol (Invitrogen) 18-20 horas después de la infección y la extracción se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los sedimentos de ARN se eluyeron en 30 pL de agua libre de ARNasa y se mantuvieron a -70 °C para su uso posterior. El ADNc de la primera hebra se sintetizó usando 1L de SuperScript (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 pL usando un conjunto de cebadores sentido y antisentido. Para la secuenciación del genoma, se utilizó el enfoque de desplazamiento de cebadores, y los cebadores se diseñaron con base en ocho secuencias de ERAV disponibles en GenBank. Las condiciones de la PCR fueron: 4 minutos a 94 °C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C y 30 segundos a 72 °C con una extensión final a 72 °C durante 10 minutos.
La secuenciación de los extremos 5' y 3' se completó con los kits 5' RACE y 3' RACE (Invitrogen) de acuerdo con lo recomendado por el fabricante. Se requirieron varias PCR anidadas para amplificar el extremo UTR 5'.
Análisis de secuencia
La identificación preliminar del virus se completó mediante la secuenciación parcial de la proteína estructural VP1 utilizando cebadores diseñados con base en otras secuencias disponibles en el GenBank.
Tabla 13: Cebadores utilizados ara am lificar al unas de las re iones de ERAV.
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continuación
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Todos los cebadores se diseñaron en Gene Runner versión 3.05 (Hastings Software Inc.). Las reacciones de secuenciación fueron establecidas y ejecutadas por la División de Servicios del Laboratorio de la Universidad de Guelph.
Todas las secuencias se ensamblaron y editaron con EditSeq y SeqMan DNASTAR Lasergene 8 (DNASTAR Inc., Madison, WI, EE. UU.). Los resultados de la secuenciación se introdujeron en el software BLAST [Centro Nacional de Información Biotecnológica, Bethesda, MD (NCBI)] y se compararon con entradas similares en GenBank. ClustalW2 [Instituto Europeo de Bioinformática, Dublín, Irlanda (EBI)] se utilizó para la alineación de secuencias múltiples y la construcción preliminar del árbol filogenético. El árbol filogenético final se creó en MEGA 4.0 utilizando el método de máxima verosimilitud compuesta y la confiabilidad se evaluó mediante bootstrapping con 1000 repeticiones. El análisis de las secuencias de nucleótidos se representó en SimPlot Versión 3.5.1 (Baltimore, MD, EE.u U.). Para investigar la posibilidad de recombinación viral entre los aislados de ERAV, se completó un análisis Bootscan en SimPlot (Versión 3.5.1) comparando las secuencias genómicas de todos los ERAV reportados disponibles en GenBank. Los sitios de escisión de poliproteínas se predijeron basándose en las secuencias informadas en GenBank con números de acceso: DQ272578 y NC003982.
Resultados
Caracterización inicial
La proteína viral (VP1) del virus se amplificó, se secuenció parcialmente y se comparó con las secuencias disponibles en GenBank (números de acceso: NC003982, DQ272577, DQ272128, DQ272127, DQ268580, DQ272578, L43052). Los resultados de esta comparación inicial demostraron una identidad máxima del 95% con el virus A de la rinitis equina VP1.
Valoración del virus
El aislado de ERAV se propagó inicialmente en cultivo celular y se valoró mediante el método de unidad de formación de placa. El título del virus de reserva obtenido fue de 5x107 p Fu en la valoración inicial. Los experimentos posteriores no mostraron cambios drásticos en el título viral después de 3 años de congelación inicial. Para los experimentos con animales se empleó el virus de reserva con el título inicial.
Cinética de crecimiento
Todas las muestras de sobrenadante se valoraron utilizando la técnica de PFU y los resultados se introdujeron en una hoja de cálculo para construir una curva de crecimiento. Como se observa en otros picornavirus, el aislado de Ontario mostró un mayor título a las 4 horas después de la infección, alcanzando una meseta a las 12 horas después de la infección.
Inmunofluorescencia
Las células RK-13 infectadas se visualizaron bajo el microscopio de inmunofluorescencia. Se detectaron señales de fluorescencia verde brillante en el citoplasma de células infectadas con ERAV en comparación con señales negativas en células infectadas en forma simulada.
Purificación en placa
La secuenciación de un fragmento de 426 nucleótidos en la UTR 5' en las placas pequeñas y grandes no mostró diferencias entre los tamaños de las placas a nivel de nucleótidos. Sin embargo, las características morfológicas fueron evidentemente diferentes en los cultivos de células RK-13.
Secuenciación completa del genoma
La secuenciación del genoma del aislado de ERAV dio como resultado 7839 nucleótidos de longitud con un contenido de GC del 47%, incluida la cola de poli(A). Se identificaron cuatro repeticiones idénticas (CTGTAGCGTCAGTAAAACGC, SEQ ID NO: 13) separadas por 18, 21 y 18 nucleótidos en la UTR 5'. La UTR 5' de ERAV estaba compuesta por 940 nucleótidos con un contenido de GC del 54%. Una sola poliproteína con 6747 nucleótidos (2248 aminoácidos) compone el genoma viral con un contenido de GC del 46,8%. La síntesis de inicio de proteína se detectó en el nucleótido 940 con el codón de inicio AUG y la terminación en el nucleótido 7686 con el codón de terminación UAA. De gran interés, se identificó una segunda secuencia de AUG después del codón de inicio. También se identificó una secuencia AUGAUG posterior de 58 nucleótidos secuencia abajo del codón de inicio de la poliproteína. El análisis con Blastx (NCBI) de la poliproteína en este aislado mostró una identidad de nucleótidos del 96% con respecto a otros ERAV informados, sin embargo, cuando la secuencia del genoma de longitud completa del aislado de Ontario se alineó y se comparó con otros utilizando ClustalW2 (EBI) y Blastx (NCBI), solo se observó una identidad máxima del 80%. La composición de aminoácidos mostró una organización y longitud de proteínas idénticas (estructural y no estructural) a lo largo de todo el genoma. Estas comparaciones se realizaron con las secuencias del genoma reportadas de PERV-1 y PERV (números de acceso DQ272578 y NC003982).
La UTR 3' estaba compuesta por 110 nucleótidos con un contenido de GC del 24,3% y una cola de poli-A. Las alineaciones de la UTR 5' de todos los ERAV disponibles demostraron un porcentaje de identidad más bajo, que oscila entre el 73% y el 81 %. De manera similar, la UTR 3' se analizó por el mismo método y el porcentaje de identidad osciló entre el 75% y el 81%. Curiosamente, se identificaron varias inserciones (1 nucleótido, 2 nucleótidos y 13 nucleótidos) y dos pequeñas eliminaciones (2 nucleótidos y 3 nucleótidos) en la UTR 5' (Figura 4). No se observaron otros cambios importantes en todo el genoma.
Análisis SimPlot del genoma
El análisis SimPlot mostró una similitud (porcentaje) comparable entre todos los aislados de ERAV en comparación con ERAV/ON/05. Sin embargo, las mayores disparidades se identificaron en el nucleótido 1500 (59% de similitud) y el nucleótido 4700 (65% de similitud). Sin embargo, este análisis mostró que la similitud a lo largo del genoma estaba entre el 70% y el 82%. Para investigar más a fondo la principal divergencia en los genomas, se realizó una exploración (Bootscan) para identificar posibles sitios de recombinación. Estos análisis demostraron que el aislado de Ontario no había predicho sitios de recombinación con otros aislados de ERAV. Sin embargo, cuando el aislado de Ontario se eliminó del análisis, es posible que se haya producido una posible recombinación entre otros aislados de ERAV en el pase.
Discusión
El ERAV no se busca ni se recupera de forma rutinaria de casos clínicos durante los brotes respiratorios equinos. Por lo tanto, el aislamiento de ERAV de casos clínicos ha sido incidental y, en la mayoría de los casos, un desafío. Por estas razones, la tasa de recuperación y secuenciación de estos virus puede ser pequeña.
Durante años anteriores, los virus de la rinitis equina se clasificaron dentro de la familia Picornaviridae, pero no se asignaron claramente a un género específico. En 1996, Li y colaboradores (Li F, Browning GF, Studdert MJ y Crabb BS. Equine rhinovirus 1 is more closely related to foot-and-mouth disease virus than to other picornaviruses. Proc Natl Acad Sci USA. 19966; 93: 990-995) demostraron que el ERAV estaba estrechamente relacionado con el virus de la fiebre aftosa (FMDV) de acuerdo con las características filogenéticas y la secuenciación de nucleótidos. De acuerdo con sus hallazgos y otros (Wutz G, Auer H, Nowotny N, Grosse B, Skern T y Kuechler E. Equine rhinovirus serotypes 1 and 2: relationship to each other and to aphthoviruses and cardioviruses. J Gen Virol 1996, 77: 1719-1730), se ha encontrado que el aislado de ERAV está estrechamente relacionado con los aislados L43052, DQ272578 y NC003982.
El aislado de ERAV/ON/05 dio como resultado 7839 nucleótidos que incluyen la UTR 5', la poliproteína, UTR 3' y la cola poli-A. En comparación con los aislados de ERAV informados anteriormente, ERAV/ON/05 es una de las secuencias de ERAV más completas informadas hasta la fecha. La mayoría de las otras secuencias carecen de información de la UTR 5' o son secuencias parciales de proteínas virales individuales. Los datos de la UTR 5' revelaron la presencia de 3 repeticiones que se han informado previamente en otros ERAV y que se encuentran comúnmente en el FMDV. Se ha sugerido que estas repeticiones pueden ser necesarias en la formación de las estructuras secundarias que se encuentran en la UTR 5', el sitio de entrada del ribosoma interno (IRES). El análisis de identidad mostró que la poliproteína del aislado de ERAV/ON/05 tiene una secuencia de nucleótidos altamente conservada. Como virus de ARN, el ERAV es propenso a mutaciones constantes debido a la falta de corrección de pruebas por parte de la polimerasa. Esto puede indicar que a pesar de que este virus de ARN ha estado en evolución natural y replicación constante, no se han introducido cambios genómicos significativos desde que se informó su primera secuencia genómica. Es evidente que las proteínas estructurales y no estructurales, que están codificadas dentro de la poliproteína, representan las regiones más conservadas del genoma.
Curiosamente, la tasa de replicación viral en cultivo celular fue rápida y eficiente. Se detectó un ciclo de replicación viral completo en menos de 4 horas, alcanzando una meseta en 12 horas. Estas características son típicas de los picornavirus y pueden reflejar la actividad viral in vivo. Estas características podrían explicar la gravedad y la velocidad de los signos clínicos en algunas infecciones virales respiratorias equinas. Como se ha observado en otros virus, tales como el poliovirus y el FMDV, la presencia de pequeñas eliminaciones y/o inserciones en la UTR 5' se ha asociado con diferencias en el tamaño de la placa en el cultivo celular y sobresale la virulencia in vivo. Se encontró que el aislado de ERAV/ON/05 genera diferentes tamaños de placa al infectar células RK-13. Para investigar y correlacionar la presencia de estas inserciones y eliminaciones en la UTR 5' en el aislado de ERAV/ON/05, se secuenció esta región del virus purificado en placa de diferentes tamaños de placa, y no se encontraron discrepancias a nivel de nucleótidos. Este hallazgo puede indicar que la diferencia de tamaño de placa puede deberse a una característica de crecimiento y replicación de las células RK-13 y tal vez no esté asociada con la presencia o ausencia de las secuencias que se encontraron en esta región.
Ejemplo 4
Este ejemplo muestra los resultados de un estudio diseñado para desarrollar un modelo de infección por ERAV fiable para investigar las características clínicas de ERAV/ON/05.
Materiales y métodos
En la primera fase se infectó un potro pony con ERAV/ON/05 para ajustar la dosis infecciosa y las técnicas de recolección de muestras. Se diseñó un segundo estudio piloto para comparar animales infectados y de control y dominar las técnicas de muestreo. El principal estudio de infección se realizó en dos fases debido al manejo de los animales y las limitaciones de tiempo para el muestreo. Un año después de la primera infección, se seleccionaron cuatro ponis previamente infectados para un estudio de reinfección en función de su título de ERAV. Se seleccionaron animales con un título intermedio y alto de ERAV para volver a exponerlos al aislado de Ontario.
Animales experimentales
Se seleccionaron un total de 12 yeguas pony preñadas y sus potros se mantuvieron para la infección experimental por ERAV. Todas las yeguas y potros se mantuvieron en un grupo separado lejos del establo principal y se realizaron mediciones de bioseguridad para prevenir infecciones respiratorias virales. Se tomaron regularmente muestras de sangre de todos los potros y se verificaron periódicamente los títulos de ERAV. Los potros se mantuvieron hasta que cumplieron los 12 meses de edad. Estos animales no fueron vacunados contra ningún virus respiratorio durante este período y se mantuvieron las prácticas generales para asegurar condiciones de vida saludables. Todos los animales se desparasitaron de acuerdo con el protocolo de gestión de la manada. La socialización y manipulación de los animales se realizó con regularidad. Los ponis fueron entrenados para la prueba de función pulmonar (PFT). Una vez acondicionados los animales para los experimentos, fueron transportados en grupos a la unidad de aislamiento y aclimatados durante al menos una semana antes de la infección viral.
Unidad de aislamiento
Todos los ensayos de infección se realizaron en la unidad de aislamiento de animales en el Departamento de Patología de la Universidad de Guelph. Esta unidad de aislamiento contiene compartimentos individuales que están equipados con temperatura, humedad, flujo de aire e iluminación controlados. El acceso a los puestos estaba restringido a los investigadores y al personal sanitario.
Criterios de selección
Todos los potros se manipularon con frecuencia y se comprobó periódicamente el estado de salud. En función del estado de salud y los parámetros serológicos, se eligieron los animales que se incluirían en estos experimentos. En ese momento, todos los ponis seguían siendo seronegativos al virus A de la rinitis equina (ERAV), al virus B de la rinitis equina (ERBV), al herpesvirus equino 1 y 4 (EHV1/4) y al virus de la influenza equina 2 (AE2). Aunque los títulos de anticuerpos AE2 se detectaron al nacer, se observó una disminución constante durante los primeros 5 meses y no fue detectable mediante la prueba de hemólisis radial única (SRH) a los seis meses de edad. Para el ensayo de infección experimental con ERAV, se seleccionó un poni para su uso. Posteriormente, se seleccionaron otros dos ponis para un segundo estudio piloto, y se seleccionó un grupo de 8 ponis (cuatro infectados y cuatro controles) para el estudio principal de infección. Después de un año desde la primera prueba de infección, se eligieron 4 ponis con títulos intermedios y altos de ERAV para una prueba de reinfección.
Inóculo
El aislado de ERAV (ERAV/ON/05) recuperado de un caballo durante un brote respiratorio viral equino en Ontario 2005 se propagó en células de riñón de conejo 13 (RK-13) y las alícuotas se almacenaron a -70 °C para la caracterización viral y experimentos de infección viral animal.
Brevemente, para la preparación del inóculo, el aislado se propagó en células RK-13. Se infectaron placas redondas de 30 mL que contenían monocapas confluentes al 90% con 500 pL de ERAV/ON/05 y se incubaron en presencia de CO2 (5%) a 37 °C durante 24-36 horas. Todas las placas se sacaron de la incubadora y se congelaron/descongelaron cuatro veces para provocar la ruptura celular y la liberación viral de las células intactas. Los sobrenadantes de todas las placas se agruparon en un matraz y se centrifugaron a 6000 rpm durante 15 minutos para aclarar y descartar los residuos celulares. El sobrenadante clarificado se dividió en alícuotas en viales de 10 mL para ser utilizado como inóculo en los experimentos de infección viral animal. Además, se separaron pequeñas alícuotas de 1 mL y se conservaron para la valoración viral. El virus se valoró utilizando el método de unidad formadora de placa (PFU).
Modelo animal
Se eligieron ponis como modelo animal debido a la naturaleza del agente experimental (ERAV), el tamaño del animal, la disponibilidad y la manipulación.
Protocolo de infección
Se seleccionaron, entrenaron y utilizaron ponis entre 8 y 12 meses de edad en los experimentos de infección. Debido a la gran cantidad de muestras a tomar, estos experimentos se dividieron en cinco secciones (dos estudios piloto, dos experimentos principales de infección y un experimento de reinfección). Durante los estudios piloto, se optimizaron el equipo, el manejo de los animales, la dosis de inóculo, la vía de administración y la recolección de muestras. El estudio de reinfección se realizó un año después del ensayo de infección inicial. Los ponis del grupo reinfectado fueron expuestos a la misma cepa viral en la misma dosis que se usó durante la primera infección. De este grupo solo se recogieron exámenes clínicos, muestras de sangre para la evaluación de títulos y frotis nasofaríngeos para el aislamiento del virus.
Mascarilla facial y nebulización
Para la infección viral, se equipó un AeroMaskMR equino de tamaño pequeño con un sello de goma en el extremo de la fosa nasal. El tamaño se ajustó en función de la cabeza del pony y las ventanas de respiración no se modificaron. La máscara estaba equipada con un conector de inhalador y una válvula "T" unidireccional para la nebulización del virus. Se utilizaron copas nebulizadoras convencionales de 6 mL para administrar el inóculo. La nebulización se realizó usando un compresor PM14 (Precision Medical Inc. Northampton, PA) con un flujo de gas de 9 LPM (litros por minuto). Este caudal y las copas de suministro permiten un suministro constante de partículas respirables de más o menos 5 micrones. Cada poni se nebulizó durante 45 minutos (tomando un descanso de 5 minutos cada 15 minutos) con 15 mL (volumen total) de inóculo o placebo. Se recogió un hisopo nasofaríngeo por poni después de la infección para asegurar la viabilidad del inóculo cuando se administraba. Los ponis que fueron reinfectados un año más tarde fueron expuestos al virus por el mismo protocolo.
Exámen clinico
Todos los ponis fueron evaluados clínicamente de forma regular desde el nacimiento. Antes de los estudios piloto y de infección, todos los ponis se evaluaron diariamente y durante los experimentos de prueba dos veces al día durante los primeros 10 días y una vez al día desde el día 11 hasta el día 21 después de la infección. El examen clínico incluyó: temperatura corporal (temp) (grados Celsius), frecuencia cardíaca (hr), frecuencia respiratoria (rr), relleno capilar (ref), motilidad gastrointestinal (gi), ruidos pulmonares (Is), secreción nasal (nd), secreción ocular (od) [presencia o ausencia y características], ganglios linfáticos (In) [tamaño y características], deambulación y estado físico general. El examen físico se realizó aproximadamente a la misma hora en cada pony todos los días, comenzando con los animales de control y pasando al grupo infectado. Se emplearon aproximadamente 10 minutos en cada examen de los animales cada vez y todos los datos individuales se registraron en un formulario de control diario.
Prueba de función pulmonar (PFT)
La PFT se llevó a cabo como se describió previamente por Hare y colaboradores (Hare JE, Viel L. Pulmonary eosinophilia associated with increased airway responsiveness in young racing horses. J Vet Intern Med 1998; 12 (3): 163-70). La prueba se realizó en todos los ponis de control e infectados antes de la infección (día 0) y los días 1, 7, 14 y 21 después de la infección. Brevemente, el día de la prueba, los ponis dejaron de comer por la mañana y fueron sedados levemente como se describió anteriormente en el presente documento para los procedimientos de endoscopia. Se fabricó una mascarilla de goma para adaptarse perfectamente al hocico de los ponis. Se colocó una neumotacografía No. 4 (Gould Electronics, Biltholven, Países Bajos) en la mascarilla y se conectó a un conjunto de transductores que convierten las señales de flujo y presión en circuitos respiratorios que se registran en un ordenador (Pulmonary Mechanics Analyzer, Buxco Electronics Inc, Sharon, CT, EE. UU.). El flujo se midió a nivel de neumotacografía y la presión pleural se evaluó mediante un balón esofágico (10 cm de largo) que se colocó en la parte media del tórax a través de un tubo esofágico. Se introdujo un volumen total de 3 mL de aire en el globo. La diferencia de presión entre la presión pleural y la presión atmosférica (medida a nivel de la fosa nasal) se consideró como la presión transpulmonar (APpl).
Prueba de broncoprovocación
El desafío de broncoprovocación se llevó a cabo como parte de la prueba PFT. Para determinar la hiperreactividad de las vías respiratorias después de la infección por ERAV/ON/05, los animales de control e infectados se expusieron a dosis crecientes de histamina (duplicando la dosis) mediante nebulización con un compresor de PM14 con un flujo de gas de 9 LPM (Precision Medical Inc. Northampton, PA). Los parámetros fisiológicos pulmonares se evaluaron inicialmente mediante la administración de solución salina fisiológica al 0,9% (línea base), seguida de dosis aumentadas de histamina. Después de cada administración (2 minutos) se registraron los datos durante 3 minutos y luego se analizó la fisiología respiratoria. Las dosis de histamina se iniciaron con 0,5 mg/mL y se aumentaron gradualmente hasta un máximo de 32 mg/mL. El cumplimiento dinámico (Cdin.) y APp1 se utilizaron como parámetros para interrumpir la nebulización con histamina. Cuando se redujo Cdin. en dos tercios o se duplicó APp1 durante la administración de histamina, se suspendió la nebulización. Posteriormente se graficó y calculó la dosis de activación con histamina. Todos los ponis fueron sedados levemente y restringidos físicamente durante estos procedimientos.
Técnicas de muestreo
Recolección de sangre
Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular derecha o izquierda. Se recolectaron aproximadamente 10 mL de sangre en un tubo con tapa roja (suero) de cada poni de acuerdo con el programa de recolección de muestras. Además, también se recolectaron de 3 a 5 mL de sangre para CBC (hemograma completo) y perfil. Todas las muestras se recolectaron en las horas de la mañana y se procesaron en el mismo día.
Las muestras de sangre para la separación del suero se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos y luego se centrifugaron a 3000 rpm en una centrífuga de mesa. El suero se separó dentro de las 6 horas posteriores al tiempo de recolección y las alícuotas se marcaron y congelaron a -70 °C para su posterior análisis (anticuerpos para ERAV, ERBV, AE2 y EHV1/4). Las muestras de sangre para CBC y perfil se procesaron el mismo día.
Frotis nasofaríngeo
Se recogieron hisopos nasofaríngeos para el aislamiento del virus en los días previos al ensayo de infección y en los días 0 , 1 , 3, 5, 7, 10, 1 2 , 14, 17 y 2 1. Cada pony se inmovilizó con una contracción del hocico y se pasó un hisopo de 30 cm de largo (Kalayjian Industries, Inc. Signal Hill, California) por la fosa nasal derecha o izquierda hasta que alcanzó la faringe. El hisopado se realizó girando el hisopo durante aproximadamente 5 a 10 segundos. El hisopo se retiró con cuidado y las puntas se cortaron en un vial que contenía 3 mL de medio de transporte de virus (VTM). Los viales que contienen los hisopos se agitaron y se mantuvieron en hielo hasta su procesamiento. Para liberar las partículas virales y las células unidas a los hisopos, los viales se agitaron con vórtice durante aproximadamente 2 0 segundos y el medio se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y se congeló a -70 °C para su posterior análisis.
Muestreo de orina y heces
Se intentó el aislamiento del virus en muestras de orina y heces antes y después de la infección con ERAV/ON/05. La orina se recogió por la mañana después del examen clínico y/o la limpieza del establo sosteniendo una taza de recolección mientras los animales orinaban. Cuando la muestra no se pudo recolectar a mano, se colocó al animal con una bolsa plástica de recolección alrededor de los genitales. Esta bolsa se retiró después de que el animal orinó y se guardó una alícuota de 10 mL para el aislamiento del virus. Las muestras fecales se recolectaron a mano de estiércol fresco en el piso del establo. Se recogieron aproximadamente 5 mL de estiércol en una taza de recolección y se agregaron 10 mL de solución salina estéril para disolver la muestra. Las muestras de orina y heces se mantuvieron en hielo hasta su procesamiento.
Endoscopia superior e inferior
Se realizaron broncoscopia y BAL como se describió previamente (Hare et al., 1998). Se introdujo un endoscopio de fibra óptica flexible estéril, de 140 cm de longitud con un diámetro exterior de 0,8 mm (Olympus, Corp., Tokio, Japón) a través de la fosa nasal derecha o izquierda hacia la cavidad nasal hasta el nivel de la laringe. En este punto se evaluó la conformación de las vías respiratorias superiores. Después, se introdujo el broncoscopio a la tráquea y se registró la presencia o ausencia de inflamación y/o moco y sus características. Los datos se registraron en la hoja de evaluación diaria y todas las endoscopias se grabaron en video para su posterior análisis.
Biopsias por cepillo faríngeo y traqueal
Para evaluar la replicación viral en las vías respiratorias superiores e inferiores, se tomó una biopsia con cepillo de la faringe, la tráquea media y la carina de los animales infectados y de control los días 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14 y 21. Durante el examen endoscópico, se hizo avanzar un cepillo de citología de 200 cm protegido (funda protectora) (Hobbs Medical Inc. Connecticut) a través del canal de biopsia en la ubicación predeterminada de la muestra y se recogió una muestra. Los cepillos se replegaron en la funda protectora y se retiraron del broncoscopio. Para retirar el tejido muestreado del cepillo, se colocó en 600 pL de VTM y se agitó con vórtice durante 10 a 20 segundos. Todas las muestras se mantuvieron en hielo y se transportaron al laboratorio para su posterior análisis (aislamiento del virus).
Lavado broncoalveolar (BAL)
Brevemente, todos los ponis fueron sedados levemente con Romifidina (0,04 mg/kg, IV) y se introdujo un broncoscopio estéril con un diámetro externo de 0,8 mm (Olympus, Corp., Tokio, Japón) a través de la fosa nasal derecha o izquierda hacia la tráquea hasta el nivel de la carina. A medida que avanzaba el broncoscopio, se administró una solución de lidocaína calentada al 0,2% para reducir la tos y la angustia. Una vez que se redujo el reflejo de la tos, se avanzó el broncoscopio y se encajó en un bronquio terminal proximal. Se administró un total de 250 mL de solución salina estéril calentada a través del canal de biopsia dividida en dos alícuotas. El líquido BAL se recuperó mediante succión manual con una jeringa de 60 cc a través del canal de biopsia y se colocó en hielo. El líquido se filtró y se prepararon alícuotas para el aislamiento del virus, el recuento de células y los portaobjetos de citospina.
Cultivo de muestras clínicas
Las muestras recolectadas se transportaron en hielo y se congelaron a -70 °C para su posterior inoculación en cultivos celulares.
Se cultivaron células RK-13 (100-160 pases) en mezcla de nutrientes de medio de Eagle modificado de Dulbbeco F12 HAM (DMEM F12) (Sigma-Aldrich Canada Ltd. Oakville, Ontario) con suero de ternero fetal al 2-5% (Sigma). El crecimiento y aislamiento celular se realizaron en una incubadora de CO2 (5%) a 37 °C. Se cultivaron monocapas de células RK-13 en placas de 6 pozos hasta una confluencia del 90% y se infectaron con las muestras clínicas recogidas del ensayo de infección. En resumen, se eliminó el 90% del medio de cultivo de cada uno de los pozos y se añadieron a la monocapa 200 pL de la muestra a ensayar. Las placas se colocaron en la plataforma basculante durante una hora y se agregaron 3 mL de medio una vez transcurrido el tiempo. Las placas se incubaron y revisaron cada 24 horas para determinar los efectos citopatogénicos (CPE). Si se detectó CPE, el sobrenadante se retiró del pozo y se congeló para un análisis posterior. Los resultados de la prueba de aislamiento del virus se registraron en una hoja de cálculo. Las placas se comprobaron durante un máximo de 7 días y, si no se desarrollaba CPE, se intentó un segundo pase usando 200 pL de sobrenadante del primer pase. Después de un segundo pase, si no se detectó CPE, la muestra se clasificó como negativa. El sobrenadante de las muestras positivas y negativas se guardó para confirmarlo mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Análisis estadístico
Los resultados del aislamiento del virus y todas las puntuaciones clínicas (Tabla 7) se introdujeron en una hoja de cálculo.
Tabla 14. Sistema de puntuación para infección experimental con ERAV/ON/05.
Signos clínicos Grado Puntuación
Tos Ninguna 0
Intermitente 1
Tos Frecuente 2
Membranas mucosas Rosadas 0
Pálidas 1
Auscultación gastrointestinal Normal 0
Anormal 1
Heces/Orina Normal 0
Anormal 1
Sonidos pulmonares Normal 0
Ligeramente incrementado 1 Incrementadamente marcado en el pecho 2
Crepitaciones y sibilancias 3
Secreción nasal Ninguna 0
Serosa moderada/severa 1 Mucupurulenta 2
Secreción ocular Ninguna 0
Serosa 1
Purulenta 2
Adenitis No palpable 0
Palpable (<1 cm) 1
Engrandecida (> 1 cm) 2
Anorexia Ninguna 0
Leve a moderada 1
Severa 2
Temperamento Brillante, alerta y receptivo 0
Embotado (cabeza gacha, desinteresado) 1
(continuación)
Signos clínicos Grado Puntuación Tiempo de perfusión Normal (2 s) 0
3 - 4 s 1
5 s 2
Los resultados del aislamiento del virus se clasificaron como positivos o negativos y los resultados se compararon entre los grupos. Para determinar si había una diferencia estadística entre las ubicaciones en el aislamiento del virus (en el grupo infectado), se utilizó una regresión logística condicional exacta en cada día y sitio. Se utilizó la misma prueba para determinar si había una diferencia estadística entre los grupos en función del día de aislamiento. Se resumieron las puntuaciones clínicas y se analizaron los totales y compararon entre los grupos.
Se empleó un modelo mixto lineal generalizado para analizar todos los parámetros clínicos. Los factores incluidos en el modelo fueron: poni, tratamiento y tiempo, así como sus interacciones. Dado que los animales se midieron a lo largo del tiempo, se utilizó el criterio de información AKAIKE (AIC) para determinar una estructura de error para la autoregresión. Los supuestos del ANOVA se evaluaron mediante análisis de residuos exhaustivos. Se realizaron una prueba de Shapro-Wilk, una prueba de Kolmogorov-Smirnov, una prueba de Cramer-von Mises y una prueba de Anderson-Darling para evaluar la normalidad general. Los residuos se graficaron contra los valores predichos y las variables explicativas (poni, tratamiento y tiempo) para buscar patrones que sugirieran valores atípicos, varianza desigual u otros problemas. Si los análisis residuales sugerían una necesidad de transformación de datos o los datos se presentaban como un porcentaje, los análisis se realizaban en una escala logit o log. Si la prueba f general fue significativa, se aplicó una prueba de Dunnetts que se remonta a la línea de base dentro de un tratamiento o una prueba de Tukey entre tratamientos y sitios en cada momento.
La respuesta serológica se definió como un aumento de cuatro veces en los niveles de anticuerpos desde la línea base (día 0) a cualquiera de los puntos de tiempo en la recolección de muestras (días 7, 14 o 21). El análisis estadístico se llevó a cabo en SAS 9.1.3 (sAs institute Inc., 2004, Cary, NC). La significancia estadística se estableció en P <0,05.
Resultados
Este estudio se diseñó para reproducir de forma coherente la enfermedad clínica por ERAV en ponis y para estudiar sus características in vivo. Los estudios piloto demostraron que el ERAV/ON/05 nebulizado podía causar enfermedad respiratoria clínica en ponis sanos (de 10 a 12 meses de edad). Se indujo una inmunosupresión leve en todos los ponis excepto en los animales reinfectados para imitar las condiciones naturales bajo eventos estresantes (por ejemplo, movimiento para ventas, reubicación de campo, programas de vacunación, etc.). Los resultados del estudio principal de infecciones confirmaron los resultados observados durante los estudios piloto. Los ponis del grupo infectado (n = 4) desarrollaron una enfermedad clínica respiratoria que consistió en aumento de la temperatura corporal, linfadenopatía, aumento de los ruidos pulmonares, aumento del moco traqueal y aumento de la secreción nasal (Figuras 7-8). Ninguno de estos signos clínicos fue significativamente extremo como para requerir cuidado animal adicional o tratamiento de apoyo. Ni la frecuencia respiratoria ni la frecuencia cardíaca fueron significativamente diferentes entre los grupos. Ninguno de los signos clínicos desarrollados por el grupo infectado se observó en los animales de control (n = 4), que permanecieron sanos durante la duración de estos ensayos. El agente etiológico (ERAV) solo se recuperó de los ponis en el grupo infectado durante un máximo de siete días (Tabla 8 ). Los ponis del grupo reinfectado (n = 4) no desarrollaron signos respiratorios clínicos y se mantuvieron sanos durante los experimentos. El análisis estadístico de los datos recopilados durante estos ensayos demostró una diferencia significativa entre los animales infectados y los de control.
Tabla 15. Resumen de la diseminación del virus A de la rinitis equina (ERAV). Resultados del aislamiento del virus de muestras recolectadas durante la infección ex erimental con ERAV/ON/05.
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En ninguno de los grupos se registró depresión ni pérdida de apetito. Además, la hidratación, la micción, la defecación y los movimientos gastrointestinales se mantuvieron sin cambios en todos los grupos durante las pruebas de infección. No hubo diferencia entre los animales reinfectados y los de control en las puntuaciones clínicas y en la prueba de aislamiento del virus, ya que no se observó ninguna enfermedad clínica en los animales reinfectados y el virus no pudo recuperarse de este grupo.
Hallazgos clínicos
Se consideró que todos los ponis estaban sanos antes de estos experimentos. La exposición a ERAV/ON/05 indujo enfermedad respiratoria clínica en animales infectados en comparación con los animales de control y los reinfectados. Los principales signos clínicos detectables por examen físico fueron pirexia, secreción nasal y linfadenopatía. El examen endoscópico también reveló la presencia de grandes volúmenes de moco e hiperemia en la tráquea media y las vías respiratorias inferiores de los animales infectados.
Temperatura rectal
No se encontraron diferencias significativas en la temperatura rectal diaria entre los grupos antes de la exposición viral o placebo. Se identificó un efecto significativo del tratamiento cuando los animales infectados se compararon con los controles y se volvieron a infectar (p = 0,002). Cuando se comparó la temperatura corporal de los tres grupos en diferentes momentos, el grupo infectado fue significativamente diferente en comparación con los controles y los animales reinfectados (p = 0,028). Se detectó un aumento de la temperatura corporal 24 horas después de la infección solo en los animales infectados y fue significativamente diferente del día 2,5 al día 6 en comparación con los animales de control en los mismos puntos de tiempo (p = <0,005). El aumento de la temperatura corporal se registró el día 4 con una temperatura corporal media de 38,45 °C (EE = 0,15) (p = 0,001) y persistió durante dos días consecutivos más (Figura 8 ). No se encontraron diferencias estadísticas cuando se compararon las temperaturas corporales de los grupos de control y reinfectados en diferentes momentos. Los animales en los grupos de control y reinfectados no tuvieron un cambio significativo en su temperatura corporal al comparar la línea de base con puntos individuales en el tiempo dentro de los grupos (días 1, 7, 14 y 21).
Ganglios linfáticos
Los ganglios linfáticos submandibulares y retrofaríngeos se examinaron diariamente y se clasificaron como no palpables, palpables y agrandados. La palpabilidad o agrandamiento de los ganglios linfáticos solo se registró en los animales infectados y reinfectados. En todos los ponis infectados, el área submandibular se volvió sensible a la palpación el segundo día y en la mayoría de los casos persistió hasta dos semanas. El tamaño de los ganglios linfáticos submandibulares en los animales infectados varió de 3 a 5 cm de longitud por 2 a 3 cm de grosor, y el análisis de las puntuaciones totales demostró una diferencia estadística entre los grupos (p = <0,0001) (Figura 7). Curiosamente, los ganglios linfáticos retrofaríngeos no eran palpables de forma constante en todos los animales infectados, pero se registró un cambio significativo de tamaño en un poni. Esta linfadenopatía no pareció interferir con el consumo de alimentos o agua y la sensibilidad a la palpación se hizo menos pronunciada a medida que avanzaban los días. Los ganglios linfáticos submandibulares fueron palpables en tres animales de los animales reinfectados con un tamaño promedio de menos de un cm de longitud y 0,5 cm de grosor aproximadamente. Los animales de control no tuvieron cambios detectables en los ganglios linfáticos a la palpación durante los experimentos de infección.
Frecuencia cardíaca y respiratoria
Las medias de la frecuencia respiratoria (RR) y la frecuencia cardíaca (HR) no fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento (P = 0,1) en ningún momento. En general, la RR y la HR estaban dentro de los parámetros fisiológicos normales y los pequeños cambios solo se asociaron con la manipulación y la recogida de muestras. La media de RR más alta entre todos los grupos se identificó el día 0 y la media más baja de todos los grupos se registró el día 2 1.
Examen endoscópico
En el examen endoscópico, los animales infectados tenían una cantidad aumentada de moco traqueal detectable el día uno que persistió hasta el día 21. Ni los animales de control ni los reinfectados tenían secreciones de moco detectables en el examen endoscópico a lo largo de estos experimentos.
Las características del moco variaron de transparente y seroso el día uno a mucoide los días 7-21. Los parches de moco se distribuyeron consistentemente desde la tráquea superior hasta la bifurcación de la carina. Se observó hiperemia traqueal localizada en todos los animales infectados y en algunos animales de control a lo largo de estos experimentos. La carina en todos los animales infectados se redujo y, en algunos casos, fue hiperémica a partir del día tres. La sensibilidad al examen endoscópico aumentó notablemente el día siete en los animales infectados y se observó broncoconstricción durante BAL. La secreción nasal varió de leve a moderada en todos los ponis infectados y no estuvo presente en los grupos de control y reinfectados. Se observó secreción nasal serosa durante el examen clínico durante aproximadamente 8 días en los animales infectados, comenzando entre las 36 y las 48 horas posteriores a la infección. Sin embargo, esta descarga no fue un reflejo del moco (características y volumen) observado durante el examen endoscópico. Se observó una secreción ocular leve de manera inconsistente en los animales infectados.
Serología
Se infectaron un total de 12 ponis (de 10 a 12 meses de edad) con ERAV/ON/05 o placebo mediante nebulización. Todos los ponis fueron serológicamente negativos para ERAV, ERBV, AE2 y EHV1/4 y estaban en condiciones saludables antes de los experimentos de infección. Después de la exposición a ERAV/On /05, todos los animales infectados (1 0 0 %) se seroconvirtieron (aumento de cuatro veces) a ERAV determinado por la prueba de neutralización del virus (VN) (Figura 9). Se observó una interacción significativa entre el tratamiento por día en los animales infectados (P = <0,0001). Se encontró una diferencia estadística entre los animales infectados y reinfectados en la línea base y el día 7 (P = <0,001). En el grupo reinfectado no se encontraron diferencias estadísticas cuando se compararon los títulos de ERAV en los días 7, 14 y 21 con los valores de línea base.
Los títulos de anticuerpos contra ERAV se elevaron significativamente en los animales infectados desde el día 7 y en la mayoría de los casos alcanzaron su punto máximo el día 14 y se mantuvieron hasta el día 21 (P = <0,001). Por el contrario, todos los animales de control permanecieron seronegativos a ERAV y no se identificaron cambios detectables mediante la prueba VN. Los animales de todos los grupos no mostraron un aumento en los niveles de anticuerpos o conversión serológica a ningún otro virus respiratorio (ERBV, AE2 y EHV1/4) durante estos experimentos (Figura 9). Los animales del grupo reinfectado (n = 4) no tuvieron una diferencia significativa en los títulos de anticuerpos contra ERAV entre la línea base y el día 21 después de la infección. Sin embargo, se detectó un pequeño cambio en los niveles de anticuerpos contra ERAV en 3 ponis y un aumento de cuatro veces en un pony del mismo grupo (Figura 9).
Aislamiento de virus
El frotis nasofaríngeo, el cepillado laríngeo, el cepillado traqueal, BAL, las muestras fecales y de orina fueron negativas para el aislamiento del virus (virus respiratorios equinos) en todos los ponis antes de la infección (Tabla 8 ). Los hisopos obtenidos de la nasofaringe de animales infectados y de control después de completar la nebulización se cultivaron en células RK-13 y se recuperó ERAV en un primer pase de todos los animales infectados únicamente. La RT-PCR que utilizó cebadores dirigidos al gen VP1 confirmó los diagnósticos positivos y negativos de ambos grupos.
Los resultados del aislamiento del virus de los ensayos de infección y reinfección se resumen en la Tabla 8. Se identificó una diferencia significativa entre los animales infectados, de control y reinfectados al comparar el aislamiento del virus entre los grupos (P = <0,05). El ERAV solo se recuperó de los animales del grupo infectado en días específicos y áreas específicas del tracto respiratorio (Tabla 8 ). No se recuperaron otros virus de las muestras recogidas durante estos experimentos. Todos los ponis del grupo de control dieron negativo en las pruebas de aislamiento del virus durante todo el estudio. Se detectó por primera vez una interacción de tratamiento por día en animales infectados el día 7 y persistió los días 14 y 21 (P = <0,05).
La ubicación para la recuperación del virus varió desde las vías respiratorias inferiores los días 1, 3 y 5 hasta las vías respiratorias medias y superiores los días 1, 3, 5 y 7. El día uno se aisló ERAV de la faringe y la carina de todos los ponis en el grupo infectado y la tráquea media y BAL de 3 ponis del mismo grupo. Todos los intentos de recuperación del virus de las heces en todos los grupos no tuvieron éxito. El aislamiento del virus de la orina y el plasma se logró solo en raras ocasiones (Tabla 8 ). La recuperación del virus se redujo gradualmente desde el día 1 hasta el día 7, cuando ERAV se recuperó de forma constante de las muestras clínicas. Esta última recuperación viral se asoció con un aumento en el título de anticuerpos contra ERAV y una disminución en la puntuación de los signos clínicos (Figuras 7 y 9).
Prueba de función pulmonar (PFT)
Se evaluó la hiperactividad de las vías respiratorias basándose en la respuesta fisiológica y clínica a la provocación con histamina. Se graficaron los datos de los animales infectados y de control y se calcularon las dosis de histamina desencadenante. Curiosamente, los ponis de ambos grupos (infectados y control) respondieron el día 0 a una dosis baja de histamina ( < 6 mg de histamina). En general, las dosis de histamina desencadenantes no superaron los 13 mg. La reacción clínica a la histamina (dependiente de la dosis) se observó como hiperventilación asociada con levantamiento abdominal y dificultad para respirar. La reacción fisiológica se detectó en la PFT por una caída del 35% en la distensibilidad dinámica pulmonar (Cdin.) o una duplicación de la presión transpulmonar (APp1) al comparar la administración de solución salina e histamina. Los ponis del grupo infectado mostraron una pequeña reducción de la dosis desencadenante de histamina desde el día 0 hasta el día 1. Sin embargo, esto no fue significativamente diferente entre los grupos. Se detectó una diferencia significativa entre los infectados y los controles el día 21 (P = 0,02).
Recuentos de células diferenciales de líquido BAL
Se llevaron a cabo recuentos celulares diferenciales en los portaobjetos de citospina preparados a partir de alícuotas de líquido BAL. No se encontraron diferencias significativas en los recuentos de células entre los caballos en los diferentes grupos de tratamiento antes del ensayo de infección. No se detectó ningún efecto del tratamiento por día en los porcentajes de macrófagos y células epiteliales a lo largo de los experimentos. Se observó un aumento significativo en el número de neutrófilos el día 7 después de la infección en el grupo infectado (P = <0,05). Estos números no fueron significativamente diferentes en los animales de control o reinfectados al comparar la línea base con los días 7, 14 y 21. Los porcentajes medios de linfocitos, eosinófilos y mastocitos disminuyeron proporcionalmente el día 7 después de la infección en los animales infectados y se detectó una diferencia estadística (P = <0,05). Las células epiteliales ciliadas se observaron comúnmente en los portaobjetos de los animales infectados y de control, sin embargo, no se detectaron diferencias significativas, excepto en uno de los animales infectados que tuvo un recuento alto el día 7. En general, se detectó una inflamación supurativa no séptica con la presencia de células epiteliales y células gigantes esporádicas en los ponis infectados. Curiosamente, no se observaron cambios importantes en el examen citológico en las muestras de los animales reinfectados.
Este estudio demuestra que ERAV/ON/05 indujo enfermedad respiratoria clínica en ponis infectados. La serología demostró que no había otros virus respiratorios presentes durante estos ensayos. La enfermedad se caracteriza por pirexia, secreción nasal, aumento de los ruidos pulmonares y aumento del tamaño de los ganglios linfáticos submandibulares. Además, se detectaron endoscópicamente grandes volúmenes de moco en las vías respiratorias inferiores que persistieron hasta el día 21. El virus se aisló de las vías respiratorias inferiores y superiores hasta el día 7 correspondiente a la aparición de anticuerpos detectables contra el virus A de la rinitis equina (ERAV). Ninguno de los animales reinfectados desarrolló enfermedad clínica y solo un pony de este grupo tuvo un aumento de cuatro veces en los títulos de anticuerpos contra ERAV. Los ponis con anticuerpos ERAV preexistentes no desarrollaron la enfermedad clínica cuando se expusieron al virus.
Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra una realización de una composición del virus B de la rinitis equina de acuerdo con la presente invención.
Materiales y métodos
Se recuperó la cepa 07-10342 del virus B de la rinitis equina (ATCC acceso No. PTA-11829) de un cultivo de células de riñón de conejo 13 (RK-13) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá. El 07-10342 inactivado se produjo siguiendo el procedimiento general descrito en el Ejemplo 1 para ERAV/ON/05.
Se prepararon las siguientes composiciones que contenían ERBV solo o en combinación con ERAV.
Tabla 16. Gru os de vacunas
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Se expusieron ocho caballos de cada uno de los grupos de vacuna 1, 2 y 3, junto con ocho caballos de control, con una dosis de exposición de 1066 TCID50. El estado de la enfermedad se basa en las puntuaciones de la secreción nasal y la conjuntivitis, como se indica en la Tabla 10. En las Tablas 17-22 se muestra el efecto de la vacunación sobre la duración, gravedad e incidencia de la enfermedad.
Tabla 17. Puntuación del estado de la enfermedad
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El grupo vacunado mostró una reducción significativa (Tabla 18) en la duración de la secreción nasal que, en algunos casos, no incluyó signos de enfermedad respiratoria leve.
Tabla 18. Número de días con enfermedad respiratoria leve, moderada o grave
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El número de días que los animales estuvieron enfermos con signos clínicos de enfermedad respiratoria (puntuación nasal > 0 ) fue significativamente menor en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control.
Tabla 19. Efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad
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La inmunización con ERBV también redujo la gravedad de la enfermedad con un porcentaje menor de vacunados que los controles que demostraron signos clínicos leves y moderados de enfermedad respiratoria a lo largo del estudio (Tabla 20).
T abl 2 R m n l r l nf rm r n l n i n r ir ri m xima
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Se encontró que la inmunización con ERBV reduce significativamente la incidencia de la enfermedad, en un 37,5%, 25% y 12,5% en los grupos vacunados 1 ,2 y 3, respectivamente (Tablas 21 y 22).
Tabla 21. Efecto de la vacunación sobre la incidencia de la enfermedad (los estados de enfermedad leve y m r m in r n r l fin l i n
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La vacunación también redujo la diseminación de virus por las fosas nasales, lo que indica una menor enfermedad clínica en los caballos vacunados, así como demostró la eficacia de la vacuna para prevenir la propagación de la enfermedad infecciosa a otros caballos potencialmente susceptibles (Tabla 22).
T l 22 In i n i i i l ir l l r l i m
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Resultados y discusión
Se descubrió que las vacunas contra ERBV inactivadas eran capaces de inmunizar a un animal a niveles elevados de detección de anticuerpos. Las vacunas redujeron la duración, la gravedad y la incidencia de la enfermedad en los animales inmunizados expuestos a ERBV. La vacunación también redujo la diseminación del virus infeccioso de los caballos enfermos. No se observaron reacciones adversas inaceptables ni en los lugares de inyección ni por manifestación de signos de enfermedad sistémica. Las vacunas son seguras y bien toleradas para su administración en especies susceptibles al virus B de la rinitis equina, particularmente équidos.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra un modelo de conejillo de indias para su uso en un ensayo de potencia de liberación.
La vacuna 5 (A/B-1) y la vacuna 6 (A/B-2) se administraron cada una a cobayas (cinco conejillo de indias por vacuna, 0,5 mL por vacunación intramuscular). Se administró una vacuna de refuerzo tres semanas después. Después de 19 días, se extrajo sangre de los conejillos de indias y se analizó la sangre mediante pruebas de neutralización del suero para ERAV y ERBV.
Tabla 23. Vacuna 5 A/B-1 dosificada con 1080 A/107-5 B con ad uvante^ HRA-5
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Tabla 24. Vacuna 6 (A/B-2) dosificada con 1080 A/1075 B, con adyuvante HRA-3 aceite de semilla de al odón
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Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra una evaluación de la exposición al virus A de la rinitis después de la vacunación con una vacuna de 2 dosis contra el virus de la rinitis A equina/rinopneumonitis/influenza y protección contra la infección respiratoria por virus A de rinitis equina después de la vacunación con la vacuna contra el virus de rinitis A/rinopneumonitis/ influenza.
Objetivo
El objetivo de este estudio de exposición a la vacuna fue demostrar la eficacia del virus A de rinitis equina ATCC (acceso No. PTA-11828) para la vacuna contra el virus A de rinitis equina/rinopneumonitis/influenza. La variable del resultado principal utilizada para evaluar la eficacia de la vacunación fue la reducción de la enfermedad respiratoria causada por el virus A de la rinitis equina.
Material y Métodos
La vacuna usada en este estudio es una vacuna contra el virus A de rinitis equina/rinopneumonitis/influenza de la presente invención.
A. Virus A de la rinitis equina
La cepa original del virus A de la rinitis equina (ErhA V) se obtuvo del Laboratorio de Sanidad Animal de la Universidad de Guelph, con el número de aislamiento 04-54188, y se recibió el 9 de septiembre de 2008 con el permiso de importación número 106930. El virus se pasó una vez sobre células E-Vero para producir una reserva maestra previa de alto título y luego se diluyó con medio de cultivo celular para producir el virus de la semilla maestra (MSV). El MSV está designado como ERhA V (04-54188), MSV, Lote 091508A-diluido, 24 de septiembre de 2008, y el USDA aprobó su uso para el Establecimiento 597 el 18 de junio de 2010.
El antígeno viral A de rinitis equina usado en las vacunas evaluadas en este estudio fue un virus MSV 5 producido en el vigésimo pase de células E-Vero aprobadas por APHIS. Después del crecimiento, los fluidos virales se filtraron, se inactivaron con formalina y se concentraron de acuerdo con el esquema de producción para el código de producto A522.20. Los fluidos virales inactivados se analizaron para detectar virus vivos residuales después de la inactivación.
Los resultados fueron satisfactorios. Se utilizaron fluidos virales inactivados para formular la vacuna a un nivel de inclusión de antígeno de 1 0 75 TCID50/mL.
1. Combo de vacuna experimental contra la rinitis, lote 122110
Se formuló el lote 122110 del combo de vacuna experimental contra la rinitis con base en títulos de inactivación previa. La vacuna final formulada contenía los siguientes ingredientes por dosis de 1 mL:
Virus A de rinitis equina 1075 TCID50/mL
EHV-1 1070 TCID50/ 1T1L
EHV-4 1065 TCID50/mL
Influenza A2/Ohio/03 1070 TCID50/mL
Influenza A2/KY/95 1070 TCID50/mL
Influenza A2/NewMarket/2/93 1070 TCID50/mL
Adyuvante (MVP Laboratories, S.O. # 25) 100 pL
Diluyente, que contiene MEM-E cantidad suficiente
Gentamicina, 30 pg/mL de volumen de diluyente
Formaldehído, 0,1% del volumen de diluyente
Anfotericina B, 2,5 pg/mL
B. Caballos experimentales
1. Descripción de los caballos experimentales
Cuarenta (40) caballos de tiro de seis a ocho meses de edad adquiridos a través de Steve Waagen, Bottineau, Dakota del Norte, recibieron un microchip al llegar a Equine Resources, LLC, Butler, Missouri y fueron asignados a IVP (Producto de Investigación Veterinaria) o Producto de Control (CP) con base en un generador de números aleatorios después de ser preseleccionado para títulos de rinitis A de < 1: 4.
Durante todo el estudio, los caballos se dividieron en cuartos en un solo gran prado con comederos, bebederos y rejillas de heno comunes. Tras la exposición, el personal de laboratorio asignó a cada animal un "código de establo" de 2 dígitos que se adjuntó a un cabestro usado durante el período posterior a la exposición y se utilizó para identificar a los caballos cuando se tomaron muestras y signos clínicos cada día. Durante cada día de observación, los caballos fueron ubicados en corrales de retención y se trabajaron al azar a través de conductos de contención individuales. La Tabla 25 resume el diseño del estudio:
Tabla 25: Diseño del estudio
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2. Programa de vacunación/exposición y muestreo
El 28 de enero de 2011 y el 18 de febrero de 2011, se administró por vía intramuscular la vacuna experimental de combo de rinitis lote 122110 en un volumen de dosis de 1 mL a cada uno de los 20 caballos (grupo vacunado, IVP). Veinte caballos (grupo de control, CP) recibieron una dosis de 1 mL de MEM-E con adyuvante (producto experimental 005) que contenía los excipientes utilizados en la vacuna del lote 122110 (adyuvante, gentamicina, anfotericina B y formaldehído) pero no antígenos. Todos los caballos fueron expuestos mediante aerosolización intranasal del virus A de rinitis equina virulento el día 46 del estudio (25 días después de la vacunación de refuerzo) el 15 de marzo de 2011. La Tabla 2 6 muestra el calendario de eventos.
Tabla 26: Calendario de eventos:
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continuación
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3. Inoculación por exposición intranasal de los caballos
a. Virus de la exposición
El virus A de la exposición de rinitis equina lote 112108A se produjo en el cultivo de tejidos en células E-Vero. Se determinó que el título del virus de la exposición era de 1 x 1 073 TCID50/1T1L el día de la exposición.
b. Método de exposición intranasal
Se administró por vía intravenosa Sedivet® (clorhidrato de romifidina), un sedante y analgésico, a cada caballo antes de la exposición a una dosis de 50 pg/kg de peso corporal. El virus de la exposición se administró por vía intranasal como un aerosol producido por un nebulizador en una AeroMask equina (Trudell Medical International, Ontario, Canadá) mediante el siguiente método: Se colocaron cuatro mililitros de 1073 TCID50/t L de virus de la exposición en la copa nebulizadora del dispositivo AeroMask. Se instaló una manguera de presión desde un compresor de aire al puerto de entrada del nebulizador. A continuación, se insertó el tubo de salida en el AeroMask unido a la cabeza del caballo que estaba siendo expuesto y se aplicaron aproximadamente 10 psi de presión de aire al puerto de entrada durante tres minutos. Durante este tiempo se aerosolizaron aproximadamente dos mililitros de fluido de virus de la exposición directamente en las fosas nasales del caballo que se estaba exponiendo. El virus de la exposición se administró a los caballos sin diluir, lo que produjo una cantidad de exposición de 1 x 107,6 TCID50 en una dosis de 2 mL.
C. Parámetros de evaluación antes y después de la exposición
1. Evaluación del exudado nasal
Todas las observaciones del exudado nasal se realizaron antes de la recogida de frotis nasofaríngeos. El día de la exposición (D46) y durante los 21 días posteriores a la exposición, se examinaron y clasificaron los conductos nasales y el hocico de cada uno de los 40 caballos vacunados y de control utilizando la descripción de clasificación y puntuación enumerada a continuación.
Los grados de puntuación de 0 a 6 se asignaron sobre la base de la gravedad de la enfermedad indicada por cada una de las siguientes clasificaciones:
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2. Secreción ocular
La secreción ocular se evaluó diariamente en el momento de la evaluación del exudado nasal. Las puntuaciones de secreción ocular se registraron como 0 = normal;
1 = secreción ocular leve a moderada y 2 = secreción ocular grave.
3. Temperatura
Se registraron las temperaturas rectales diarias para cada uno de los 40 caballos vacunados y de control el día de la exposición y durante 21 días después de la exposición por medio de una sonda de termómetro electrónico calibrada (GSA Electronics). Las temperaturas rectales diarias se registraron en grados Fahrenheit (°F).
4. Aislamiento viral nasofaríngeo
En cada día de prueba de observación, cada pasaje nasal de cada caballo vacunado y de control se limpió profundamente por medio de una lanza quirúrgica WECK-CEL® estéril (Edward Week and Company, Inc., Research Triangle Park, NC 27709) unida a una pipeta de plástico estéril de 11 pulgadas de largo. En la recolección, cada una de las dos lanzas quirúrgicas se colocó inmediatamente en un solo tubo que contenía 4 mL de medio de transporte frío (E-199 complementado con gentamicina, L-glutamina, 2X Pen/Strep, 2X Anfotericina B).
Para el aislamiento del virus, los tubos se mezclaron, los hisopos se retiraron asépticamente y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 a 15 minutos para eliminar las partículas. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pL antes de la inoculación en células de cultivo de tejidos. Después de la filtración, se añadió 4-6% de solución estéril de sacarosa al 85% a cada muestra para congelarla a -80 °C para que todas las muestras se analicen al mismo tiempo.
El día de la prueba, se usó un mL del medio de transporte clarificado descongelado para inocular una monocapa de dos días de 2 cm2 de células E-Vero cultivadas en una placa de cultivo de tejido de 24 pozos a partir de la cual el medio de crecimiento había sido eliminado asépticamente. Después de la inoculación, se dejó que el inóculo se adsorbiera en la monocapa celular durante al menos una hora a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía una atmósfera de CO2 al 5%. Después del período de adsorción, se añadió a cada pozo 1 mL adicional de medio de realimentación (E-199 que contiene L-glutamina 2 mM, Gentamicina 2X Pen-Strep y 2X Anfotericina B). Después de la adición del medio de realimentación, las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2. Cada pozo de cultivo de tejido de prueba y control se examinó microscópicamente durante 7 días en busca de signos de efecto citopático (CPE) típicos del virus A de exposición de rinitis equina. Los pozos que dieron negativo al final del período de observación de 7 días se subcultivaron en células frescas y se observaron durante 7 días adicionales.
Métodos de evaluación estadística
Los caballos se clasificaron en una variedad de estados de enfermedad respiratoria, diariamente. La clasificación del estado de la enfermedad incluyó la combinación de las evaluaciones nasal y ocular. El algoritmo utilizado se detalla a continuación:
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La influencia de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (número de días con enfermedad al menos moderada) se evaluó usando la estimación Hodges-Lehman (exacta) (el procedimiento NPAR1WAY en SAS, SAS Institute, Cary NC).
Se evaluó la gravedad de la enfermedad comparando el estado máximo de enfermedad entre los caballos vacunados y los caballos con placebo. Se calculó la fracción mitigada y los intervalos de confianza del 95% (CI, error estándar asimétrico) (el procedimiento FREQ en SAS).
Se analizaron los títulos de neutralización del suero y temperatura rectal mediante análisis de medidas repetidas apropiado para datos continuos (temperatura y títulos de SN transformados logarítmicamente; ANOVA). Se asumió que los títulos de SN eran 0 si el título se informó como <4 y 709 si el título se informó como > 709. Los títulos de SN se transformaron logarítmicamente antes del análisis. Se compararon los resultados de la capa leucocitaria y los hisopos nasales de cada día mediante la prueba exacta de Fisher.
Resultados
Un caballo, # 39 (grupo IVP) murió el día 62 del estudio. Tras la necropsia en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Missouri, se diagnosticó esofagitis submucosa enfisematosa, necrotizante grave y crónica activa, difusa, gastritis y faringitis con colonias bacterianas de cocobacilos intralesionales y material vegetal, así como una pleuroneumonía fibrinosupurativa difusa grave del pulmón. La explicación más probable de esta muerte sugiere una ruptura mucosa previa, tal como una úlcera mucosa en el cardias del estómago que permitió la siembra de material vegetal en los tejidos conectivos asociados (informe de patología adjunto).
A. Duración
La distribución de la duración de la enfermedad (número de días con enfermedad respiratoria moderada o grave) en días se resume en la Tabla 27. La mediana del número de días en que los animales del grupo placebo se observaron con enfermedad fue 14. En el grupo vacunado, la mediana del número de días con enfermedad fue 1. La duración de la enfermedad fue significativamente menor en los animales vacunados en comparación con los controles (Tabla 28; P <0,0001).
Tabla 27: Resumen del efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (número de días con enfermedad res iratoria moderada o rave
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Tabla 28: Efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (número de días con enfermedad respiratoria moderada o rave
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Gravedad
La distribución de la gravedad de la enfermedad se resume en la Tabla 29. La gravedad de la enfermedad fue significativamente menor en los caballos vacunados en comparación con los caballos de placebo (Tabla 30; fracción mitigada = 0,7550, CI del 95% = 0,5518, 0,9582). Los resultados individuales se proporcionan en la Tabla 31.
En la Tabla 31, los valores para el caballo # 39 que murió el día 62 del estudio se informan como 0 del día 62 al 67, pero en el análisis solo se consideran los valores > 1, por lo que no afectan al resultado. La duración es de 1 día para este caballo y la puntuación máxima es de 3.
T l 2 R m n l r l nf rm r n l n i n m xim r i n n l
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Tabla 30: Efecto de la vacunación sobre la ravedad de la enfermedad
Figure imgf000047_0002
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica que comprende el virus A de la rinitis equina inactivado (ERAV), en la que el ERAV es ERAV/ON/05 depositado bajo la ATCC acceso No. PTA-11828.
2. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha composición inmunogénica comprende además una o más cepas del virus B inactivado de rinitis equina (ERBV).
3. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la composición inmunogénica comprende además una o más cepas del virus inactivado del herpes equino, en la que el virus del herpes equino es EHV-1 o EHV-4 o una combinación de los mismos.
4. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha composición inmunogénica comprende además una o más cepas inactivadas del virus de la influenza equina.
5. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o causados por ERAV en un animal o una manada de animales que comprende la etapa de administrar dicha composición inmunogénica a un animal que lo necesite.
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