ES2827279T3 - Terapéutico - Google Patents

Abstract

Un vehículo de administración para introducir un polinucleótido en un microorganismo resistente a antibióticos, donde el vehículo de administración se selecciona del grupo que consiste en un plásmido (tal como un plásmido conjugativo u otro replicón plasmídico), un vector nucleotídico, ADN bicatenario lineal, un bacteriófago no virulento y un bacteriófago lisogénico, y comprende un polinucleótido recombinante para la inactivación de ADN que porta al menos un gen de resistencia a antibióticos que codifica una enzima que confiere resistencia a antibióticos a un microorganismo, donde el polinucleótido recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico de matriz de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR) que tiene o transcribe múltiples moléculas de ARN guía, donde cada molécula de ARN guía: (i) se transcribe a partir de su propia secuencia promotora; (ii) media la unión de un polipéptido (Cas) de unión a ADN asociado a CRISPR o su equivalente funcional o su versión modificada del mismo al al menos un gen o genes de resistencia a antibióticos; y (iii) tiene una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia de ADN diana del al menos un gen de resistencia a antibióticos para que el al menos un gen de resistencia a antibióticos sea dirigido e inactivado en presencia de un polipéptido (Cas) de unión a ADN, o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo, asociado a CRISPR, y donde: el polipéptido Cas de unión a ADN o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo es un polipéptido Cas de unión a ADN modificado que crea una eliminación y vuelve a sellar la secuencia de ADN diana para inactivar el al menos un gen de resistencia a antibióticos para evitar la destrucción del microorganismo inducida por la rotura de la doble cadena (DSB), de tal modo que el microorganismo se sensibilice a un antibiótico, o el polipéptido Cas de unión a ADN o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo crea una DSB en la secuencia de ADN diana para inactivar el al menos un gen de resistencia a antibióticos, y el vehículo de administración comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico que previene la destrucción directa del microorganismo debido a la generación de la DSB en el al menos un gen de resistencia a antibióticos, de tal modo que el microorganismo se sensibilice a un antibiótico.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapéutico

La invención se refiere a polinucleótidos recombinantes, composiciones y métodos para interferir con genes de resistencia a antibióticos y/o replicones que portan dichos genes, en microorganismos con el fin de desactivar la resistencia a antibióticos en los microorganismos.

Los antibióticos, originalmente aislados de microorganismos tales como Streptomyces, son una forma poderosa de tratar enfermedades infecciosas. Sin embargo, muy rápidamente, las bacterias adquirieron resistencia antimicrobiana (RAM) a los antibióticos en respuesta a la presión de selección. Una ruta común a la RAM ha sido la adquisición de genes de resistencia desarrollados en los microorganismos productores de antibióticos originales, mediante transmisión horizontal en vectores plasmídicos. En algunos casos, dichos plásmidos han adquirido múltiples genes de resistencia a antibióticos portados por elementos e integrones transponibles. También se han producido mutaciones codificadas por el hospedador que modifican la proteína bacteriana diana o evitan la entrada del antibiótico.

La resistencia a antibióticos por microorganismos tales como los patógenos bacterianos es una de nuestras amenazas para la salud más graves. Las infecciones por bacterias resistentes, por ejemplo, ya no son infrecuentes, y algunos patógenos incluso se han vuelto resistentes a múltiples tipos o clases de antibióticos. La pérdida de antibióticos eficaces socava la capacidad para combatir enfermedades infecciosas y manejar las complicaciones infecciosas comunes en pacientes vulnerables, por ejemplo, los que reciben quimioterapia para el cáncer, diálisis para insuficiencia renal y cirugía, especialmente el trasplante de órganos, para lo cual la capacidad de tratar infecciones secundarias es fundamental.

Cuando las opciones de tratamiento de primera y segunda línea están limitadas por la resistencia a antibióticos o no están disponibles, los profesionales sanitarios se ven obligados a utilizar antibióticos alternativos que pueden ser más tóxicos para el paciente, más caros y menos eficaces. Incluso cuando existen tratamientos alternativos, los pacientes con infecciones resistentes suelen tener más probabilidades de morir, mientras que los supervivientes pueden tener estancias hospitalarias significativamente más largas, recuperación retrasada y discapacidad a largo plazo.

La RAM pone en riesgo muchos logros de la medicina moderna. Sin antibióticos eficaces para el cuidado y la prevención de infecciones, el éxito de tratamientos tales como el trasplante de órganos, la quimioterapia del cáncer y la cirugía mayor se vería comprometido.

El crecimiento del comercio mundial y los viajes permite que los microorganismos resistentes a antibióticos se propaguen rápidamente a través de los seres humanos, otros animales y comida.

Los mecanismos de resistencia se dividen en cuatro clases:

(1) enzimas que degradan antibióticos, incluyendo betalactamasas que rompen el anillo betalactámico de la familia de antibióticos de las penicilinas;

(2) las enzimas que modifican antibióticos incluyendo aminoglucósido fosfotransferasas que fosforilan antibióticos aminoglucósidos tales como kanamicina; cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) que acetila cloranfenicol;

(3) bombas de expulsión que exportan activamente antibióticos del citoplasma fuera de la célula, tal como la bomba de expulsión de tetraciclina que se expresa en presencia de tetraciclina, más otras bombas, que confieren resistencia a múltiples fármacos, que sean capaces de exportar una variedad de antibióticos; y

(4) mutaciones que cambian la diana proteica del antibiótico de manera que ya no sea inactivada por él; por ejemplo, los betalactámicos son bactericidas porque inhiben las proteínas de unión a penicilina (PBP, por sus siglas en inglés) que son necesarias para la biosíntesis de peptidoglucanos y la integridad de la pared celular bacteriana, y los mutantes de PBP con unión reducida a betalactámicos no se inhibirán.

Actualmente se están utilizando o desarrollando varios enfoques para abordar el problema de la resistencia a antibióticos, incluyendo los siguientes.

En primer lugar, se han desarrollado nuevos antibióticos, como derivados de fármacos existentes. Se han desarrollado menos fármacos antibióticos nuevos y muchos son más tóxicos, por lo que se utilizan como último recurso. Los microorganismos han adquirido resistencia a nuevos antibióticos de ambos tipos.

En segundo lugar, se ha intentado la inhibición directa de las enzimas de resistencia. Los ejemplos incluyen ácido clavulánico, un inhibidor de la betalactamasa que se usa en combinación con amoxicilina, un antibiótico betalactámico (también llamado Augmentina). Otros inhibidores de antibióticos betalactámicos incluyen los carbapenémicos. Pero incluso aquí ha aparecido resistencia. Blueberry Therapeutics y Avacta están desarrollando afímeros peptídicos para atacar los mecanismos de resistencia. El desarrollo de nuevos inhibidores de las enzimas de resistencia a antibióticos requiere un largo proceso de desarrollo de fármacos. El Dr. Eric Brown de la Universidad McMaster, Canadá, adoptó un enfoque alternativo, que está evaluando medicamentos conocidos (ya aprobados para su uso) con dianas no relacionadas, para la actividad críptica en la inactivación de mecanismos de resistencia a anticuerpos.

En tercer lugar, se han utilizado bactericidas no antibióticos. Por ejemplo, la infección por bacteriófagos se desarrolló en la década de 1920 y, aunque se interrumpió en gran medida con el descubrimiento de los antibióticos, se ha conservado en determinados países. Los enfoques actuales utilizan bacteriófagos líticos virulentos que destruyen bacterias, incluyendo bacterias resistentes a antibióticos, pero esto abre el camino para la selección de variantes bacterianas que son resistentes a la infección por bacteriófagos. Para obviar esto, se utilizan preparaciones que contienen una mezcla de diferentes cepas de bacteriófagos. Otra desventaja del uso de dicho bacteriófago lítico en pacientes que padecen sepsis es que la lisis y la muerte celular por bacteriófago lítico pueden liberar endotoxinas de la célula a la sangre y pueden provocar un choque de endotoxinas.

Se requieren composiciones y métodos adicionales para combatir microorganismos resistentes a antibióticos.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un vehículo de administración para introducir un polinucleótido en un microorganismo resistente a antibióticos, donde el vehículo de administración se selecciona del grupo que consiste en un plásmido (tal como un plásmido conjugativo u otro replicón plasmídico), un vector nucleotídico, ADN bicatenario lineal, un bacteriófago no virulento y un bacteriófago lisogénico, y comprende un polinucleótido recombinante para la inactivación de ADN que porta al menos un gen de resistencia a antibióticos que codifica una enzima que confiere resistencia a antibióticos a un microorganismo, donde el polinucleótido recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico de matriz de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR, por sus siglas en inglés) que tiene o transcribe múltiples moléculas de ARN guía, donde cada molécula de ARN guía:

(i) se transcribe a partir de su propia secuencia promotora;

(ii) media la unión de un polipéptido (Cas) de unión a ADN asociado a CRISPR o su equivalente funcional o su versión modificada del mismo al al menos un gen o genes de resistencia a antibióticos; y

(iii) tiene una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia de ADN diana del al menos un gen de resistencia a antibióticos para que el al menos un gen de resistencia a antibióticos sea dirigido e inactivado en presencia de un polipéptido (Cas) de unión a ADN asociado a CRISPR o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo,

y donde:

el polipéptido Cas de unión a ADN o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo es un polipéptido Cas de unión a ADN modificado que crea una eliminación y vuelve a sellar la secuencia de ADN diana para inactivar el al menos un gen de resistencia a antibióticos para evitar la destrucción del microorganismo inducida por la rotura de la doble cadena (DSB, por sus siglas en inglés), de tal modo que el microorganismo se sensibilice a un antibiótico, o

el polipéptido Cas de unión a ADN o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo crea una DSB en la secuencia de ADN diana para inactivar el al menos un gen de resistencia a antibióticos, y el vehículo de administración comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico que previene la destrucción directa del microorganismo debido a la generación de la DSB en el al menos un gen de resistencia a antibióticos, de tal modo que el microorganismo se sensibilice a un antibiótico.

El vehículo de administración de la invención puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o su versión modificada.

El polipéptido Cas de unión a ADN puede ser Cas9 o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo. El vehículo de administración de la invención puede comprender una molécula de ARN guía adicional que se dirige a un gen implicado en la patogenicidad u otros aspectos del metabolismo microbiano, por ejemplo, un gen implicado en el metabolismo bacteriano para la producción de biopelículas.

El polipéptido Cas de unión a ADN modificado puede comprender un dominio catalítico de recombinasa para volver a sellar la secuencia de ADN diana.

El producto génico que previene la destrucción directa del microorganismo puede ser una proteína codificada por un replicón sujeto a degradación debido a la DSB causada por el polipéptido Cas de unión a ADN, o una antitoxina que neutraliza el efecto de una toxina o función destructora portada por un replicón en el que se encuentra la secuencia de ADN diana.

La secuencia de ácido nucleico de la matriz CRISPR puede tener o transcribir una o más moléculas de ARN guía, comprendiendo cada una una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia diana de uno o más genes betalactamasa, por ejemplo, uno o más o todos los genes seleccionados del grupo que consiste en: NDM, VIM, IMP, KPC, OXA, TEM, SHV, CTX, 0KP, LEN, GES, MIR, ACT, ACC, CMY, LAT y FOX.

Otro aspecto de la invención es una composición que comprende el vehículo de administración como se define en el presente documento.

La composición puede ser una composición farmacéutica, un microorganismo no patógeno tal como una bacteria comensal, por ejemplo, en una formulación probiótica, o un suplemento alimenticio. La composición puede formularse para administración tópica, enteral o parenteral.

Un aspecto adicional de la invención es una composición como se define en el presente documento para usar como medicamento.

También se proporciona de acuerdo con la invención una composición como se define en el presente documento para usar en el tratamiento o prevención de una infección causada por un microorganismo resistente a antibióticos que comprende uno o más genes de resistencia a antibióticos dirigidos por las moléculas de ARN guía del polinucleótido recombinante.

Se proporciona además, de acuerdo con la invención, un método para inactivar la resistencia a antibióticos en un microorganismo resistente a antibióticos, comprendiendo el método introducir en el microorganismo el vehículo de administración como se define en el presente documento.

Otro aspecto de la invención proporciona una célula hospedadora que comprende el polinucleótido recombinante como se define en el presente documento. La célula hospedadora puede ser una bacteria comensal.

La presente solicitud divulga un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico de matriz de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR) que tiene o transcribe una molécula de ARN guía con una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia diana de un gen de resistencia a antibióticos en un microorganismo para que el gen de resistencia a antibióticos sea inactivado en presencia de un polipéptido (Cas) de unión a ADN asociado a CRISPR o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo, sensibilizando así el microorganismo al antibiótico.

También se divulga un vehículo de administración para introducir un polinucleótido en un microorganismo, tal como un microorganismo resistente a antibióticos, en el que el vehículo de administración comprende un polinucleótido recombinante para la inactivación de ADN que porta un gen que codifica una enzima de resistencia a antibióticos que confiere resistencia a antibióticos al microorganismo, y en el que el polinucleótido recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico de matriz de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR) que tiene o transcribe una molécula de ARN guía con una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia de ADN diana del gen de resistencia a antibióticos para que el gen de resistencia a antibióticos sea dirigido e inactivado en presencia de un polipéptido (Cas) de unión a ADN asociado a CRISPR o un equivalente o una versión modificada del mismo, sensibilizando así el microorganismo al antibiótico, donde el vehículo de administración es un bacteriófago lisogénico o no virulento.

Un objetivo general de la presente invención es la inactivación de ADN que porta un gen que codifica una enzima de resistencia a antibióticos usando un sistema CRISPR/Cas. Una ventaja de la invención es que se pueden usar uno o más antibióticos existentes para tratar enfermedades infecciosas, a medida que los microorganismos se vuelven a sensibilizar a los antibióticos o se les impide adquirir resistencia a los antibióticos.

La secuencia diana de un gen de resistencia a antibióticos puede ser una secuencia que flanquea al propio gen que, si se altera, inactiva el gen de resistencia a antibióticos. Por ejemplo, si el gen de resistencia a antibióticos se ubica en un plásmido, la invención puede abarcar una secuencia diana en el plásmido.

En contraste con los enfoques de la técnica anterior de inactivación de enzimas de resistencia a antibióticos, la presente invención no requerirá el desarrollo de nuevos fármacos y la aprobación reguladora concomitante requerida para cada nuevo fármaco. En cambio, la invención proporciona una herramienta que se puede aplicar para dirigir e inactivar genes de resistencia a antibióticos relevantes directamente en lugar de los productos génicos. Por ejemplo, se puede dirigir un gen que codifica una enzima de resistencia a antibióticos, o un gen que codifica una proteína que regula la captación y exportación de un antibiótico mediante la alteración de la permeabilidad de la membrana y la expresión de la bomba de expulsión, respectivamente.

El sistema CRISPR/Cas es una ruta de defensa del genoma mediada por ARN que forma parte de un sistema inmunitario natural de bacterias y arqueas contra los invasores de ácidos nucleicos, análoga a la ruta del ARNi eucariota (véase, por ejemplo, Grissa et al., 2007, BMC Informatics 8: 172; Horvath y Barrangou, 2010, Science, 327: 167-170; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl Acad. Sci. USA 109: E2579; Marraffini y Sontheimer, 2008, Science, 322: 1843-1845; Garneau et. al., 2010, Nature 468: 67). Los sistemas CRISPR naturales contienen una combinación de genes Cas así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión de ácidos nucleicos mediada por CRISPR. Hasta el momento se han identificado tres tipos (I-III) de sistemas CRISPR en una amplia gama de hospedadores bacterianos y arqueales. Cada locus CRISPR está compuesto por una serie de repeticiones directas de ADN cortas separadas por secuencias espaciadoras no repetitivas. Las secuencias espadadoras, en la naturaleza, normalmente se originan a partir de elementos genéticos extraños tales como bacteriófagos y plásmidos. Como se utiliza en el presente documento, la serie de repeticiones más secuencias espadadoras no repetitivas se conoce como matriz CRISPR. La matriz CRISPR se transcribe e hibrida con ARNcrtra complementario repetido seguido de escisión dentro de las repeticiones directas y se procesa en ARNcrtra:ARNcr dual maduro corto que contiene secuencias espaciadoras individuales, que dirigen las nucleasas Cas a un sitio diana (también conocido como "protoespaciador"). Por ejemplo, el sistema CRISPR/Cas9 de Tipo II, un ejemplo bien estudiado, lleva a cabo una rotura de doble cadena ("DSB") de ADN dirigida en cuatro pasos. En primer lugar, dos ARN, la matriz pre-ARNcr y ARNcrtra, se transcriben a partir del locus CRISPR. En segundo lugar, el ARNcrtra hibrida con las regiones repetidas del pre-ARNcr y media en el procesamiento de pre-ARNcr en ARNcr maduros (también denominados en el presente documento "moléculas de ARN guía ARNg" que contienen secuencias espaciadoras individuales o monoméricas. En tercer lugar, el complejo ARNcr:ARNcrtra maduro dirige la proteína Cas9 en forma de ribonucleoproteína al ADN diana a través del emparejamiento de bases entre el espaciador en el ARNcr y el sitio diana en el ADN diana. Por último, Cas9 media la escisión del ADN diana y crea una DSB.

En la presente invención, como se elabora en el presente documento, las construcciones CRISPR modificadas se utilizan para dirigir genes de resistencia a antibióticos. El polinucleótido recombinante de la invención que usa dicha construcción también se denomina en el presente documento "construcción asesina" que se usa para lograr la inactivación de dichos genes.

El enfoque principal del uso de la tecnología CRISPR hasta la fecha ha sido su uso como herramienta de edición de ADN para genética inversa, principalmente en eucariotas. Sin embargo, el documento WO2007/025097 describe el uso de la tecnología CRISPR para modular la resistencia en una célula contra un ácido nucleico diana invasor o un producto de transcripción del mismo, especialmente contra bacteriófagos invasores. Se han sugerido, por ejemplo, en el documento WO2010/075424, métodos para disminuir la expresión génica procariota usando tecnología CRISPR para dirigir ARNm transcrito por los genes. El documento WO2012/164565 describe un sistema CRISPR de Lactoccocus y el uso del sistema para modular la resistencia de una célula contra un ácido nucleico diana invasor o un producto de transcripción del mismo. La presente invención, por el contrario, se refiere, entre otras cosas, a la inactivación en un microorganismo resistente a antibióticos de genes implicados en conferir resistencia a antibióticos. De acuerdo con la invención, la molécula de ARN guía media la unión del polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o su versión modificada al gen de resistencia a antibióticos. Esto refleja el sistema natural descrito anteriormente.

El polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o su versión modificada también puede ser capaz de unirse a ARN u otras moléculas de ácido nucleico. En otras palabras, el requisito de que el polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o su versión modificada sea capaz de unirse a ADN no excluye que el polipéptido o su equivalente funcional o su versión modificada sea capaz de unirse a ARN u otras moléculas de ácido nucleico. El polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o su versión modificada puede denominarse polipéptido Cas de unión de ácido nucleico o su equivalente funcional o su versión modificada.

Para determinadas solicitudes, el microorganismo puede tener un polipéptido Cas de unión a ADN, o equivalente funcional o versión modificada, endógeno natural, o genomanipulado introducido. Esto significa que no se requiere que el polinucleótido recombinante de la invención codifique el polipéptido Cas de unión a ADN o equivalente funcional o versión modificada. Como alternativa, el polinucleótido recombinante de la invención puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o versión modificada. En otro aspecto, el polinucleótido recombinante de la invención no codifica el polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o versión modificada, pero puede usarse junto con un polinucleótido separado que sí lo hace. Pueden usarse otros medios para introducir el polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o su versión modificada en el microorganismo.

Un polipéptido Cas de unión a ADN ejemplar de acuerdo con la invención es Cas9 o un equivalente funcional del mismo o una versión modificada del mismo.

En el polinucleótido recombinante de acuerdo con varios aspectos de la invención, la secuencia de ácido nucleico de la matriz CRISPR tiene o transcribe múltiples moléculas de ARN guía, comprendiendo cada una una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia diana del gen de resistencia a antibióticos o uno o más genes de resistencia a antibióticos adicionales. La o cada molécula de ARN guía se transcribe a partir de su propia secuencia promotora.

Tener múltiples moléculas de ARN guía permite que diferentes genes de resistencia a antibióticos (u otros tipos de genes) en un microorganismo sean dirigidos e inactivados simultáneamente.

El polinucleótido recombinante de acuerdo con varios aspectos de la invención puede diseñarse adicionalmente para incluir una molécula de ARN guía (tal como una molécula de ARN guía adicional) dirigida a un gen implicado en la patogenicidad u otros aspectos del metabolismo microbiano. Por ejemplo, determinados patógenos forman biopelículas que dificultan el acceso de los antibióticos a ellos. Se pueden dirigir uno o más genes implicados en el metabolismo bacteriano para la producción de biopelículas.

La secuencia espadadora distal de un promotor se transcribe normalmente de forma menos eficaz. De manera ideal, múltiples moléculas de ARN guía a diferentes dianas deberían estar representadas más o menos por igual. Por tanto, se utiliza un promotor que transcribe cada molécula de ARN guía (en lugar de depender de una larga transcripción de la molécula de ARN guía policistrónica [o precursor de ARNcr]).

Por ejemplo, hay muchos genes de resistencia que codifican betalactamasas (genes bla) que dan resistencia a una amplia gama de diferentes antibióticos betalactámicos. Se pueden utilizar construcciones de ADN que expresan múltiples moléculas de ARN guía, que se transcriben individualmente a partir de sus propios promotores, para dirigirse a varios genes bla diferentes.

Por tanto, en aspectos de la invención, la secuencia de ácido nucleico de la matriz CRISPR puede tener o transcribir una o más moléculas de ARN guía, comprendiendo cada una una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia diana de uno o más genes betalactamasa.

Por ejemplo, la una o más moléculas de ARN guía pueden dirigirse a uno o más o todos los genes seleccionados del grupo que consiste en: NDM, VIM, IMP, KPC, OXA, TEM, SHV, CTX, OKP, LEN, GES, MIR, ACT, ACC, CMY, LAT y FOX.

En particular, la una o más moléculas de ARN guía pueden comprender una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a las secuencias diana de la familia betalactámica de genes de resistencia a antibióticos, incluyendo uno o más o todos los siguientes: una primera secuencia espaciadora suficientemente complementaria a las secuencias diana para NDM-1, -2, -10; un segundo espaciador suficientemente complementario a las secuencias diana para VIM-1, -2, -4, -12, -19, -26, -27, -33, 34; un tercer espaciador suficientemente complementario a las secuencias diana para IMP-32, -38, -48; un cuarto espaciador suficientemente complementario a las secuencias diana para KPC-1, -2, -3, -4, -6, -7, -8, -11, -12, -14, -15, -16, -17; un quinto espaciador suficientemente complementario a las secuencias diana para OXA-48; un sexto espaciador suficientemente complementario a las secuencias diana para TEM-1, -1B, -3, -139, -162, -183, -192, -197, -198, -209, un séptimo espaciador suficientemente complementario a las secuencias diana para SHV y sus variantes; y un octavo espaciador suficientemente complementario a las secuencias diana para CTX y sus variantes.

El gen de resistencia a antibióticos que se va a inactivar puede estar ubicado en un cromosoma o en una molécula de ADN de replicación extracromosómica conocida como replicón y que incluye plásmidos y bacteriófagos.

El sistema CRISPR/Cas utilizado de acuerdo con un aspecto de la invención genera una DSB en la secuencia diana. Cuando la secuencia diana se ubica en un cromosoma o un replicón, tal como un cromosoma o plásmido bacteriano, entonces, una DSB puede conducir a la degradación y, por lo tanto, a la pérdida del cromosoma o replicón que padece dicha DSB. Si la secuencia diana se ubica en un cromosoma bacteriano, entonces la célula puede morir directamente como consecuencia de la DSB. Adicionalmente, algunos plásmidos (incluyendo plásmidos naturales) tienen funciones de destrucción que solo se vuelven tóxicas si la célula pierde el plásmido, que es un mecanismo natural para asegurar la herencia fiel de plásmidos en células en división. Si un plásmido que porta la secuencia diana del gen de resistencia a antibióticos también porta dicha función de destrucción, y el plásmido se pierde como resultado de la DSB generada, la célula puede morir (véase Sengupta y Austin, 2011, Infect. Immun. 79: 2502-2509). En el caso de que la muerte celular causada por dicha DSB aumente la presión de selección para la resistencia contra el polinucleótido recombinante de acuerdo con varios aspectos de la presente invención, esto puede ser mitigado mediante, por ejemplo, el empleo de un polipéptido Cas de unión a ADN modificado que sella el sitio diana después de generar una eliminación para inactivar la secuencia diana del gen de resistencia a antibióticos, en lugar de generar una DSB.

Por tanto, el polipéptido Cas de unión a ADN de acuerdo con varios aspectos de la invención puede, en determinados aspectos, estar sustituido por un polipéptido Cas de unión a ADN modificado que comprende un dominio catalítico de recombinasa, donde el polipéptido Cas de unión a ADN modificado no genera DSB sino que crea una eliminación y vuelve a sellar un sitio en la secuencia diana.

El polipéptido Cas de unión a ADN modificado puede ser, por ejemplo, una proteína Cas9 modificada que comprende un dominio catalítico de recombinasa.

El polinucleótido recombinante de acuerdo con diversos aspectos de la invención puede comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica un gen que confiere una ventaja selectiva al microorganismo, por ejemplo, aumentando de ese modo la eficacia de administración del sistema CRISPR/Cas al microorganismo diana. Por ejemplo, el gen puede conferir una ventaja de crecimiento sobre hermanos no infectados, o se pueden usar genes que codifican una bacteriocina - estas son toxinas proteicas producidas por bacterias para destruir o inhibir el crecimiento de otras bacterias - y el polipéptido de inmunidad correspondiente.

La ventaja selectiva del microorganismo puede incluir o ser una que evite o disminuya el efecto de la pérdida de un replicón debido a una DSB causado por el polipéptido Cas de unión a ADN. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica un gen que confiere una ventaja selectiva al microorganismo puede codificar una antitoxina que neutraliza el efecto de una toxina o función destructora portada por un replicón en el que se ubica la secuencia diana. Asimismo, la secuencia de nucleótidos que codifica un gen que confiere una ventaja selectiva al microorganismo puede codificar una o más proteínas que están codificadas por un replicón sujeto a degradación debido a una DSB causada por el polipéptido Cas de unión a ADN.

En un aspecto de la invención, se proporciona un vehículo de administración para introducir un polinucleótido en un microorganismo, en el que el vehículo de administración comprende el polinucleótido recombinante como se define en el presente documento.

El vehículo de administración de acuerdo con varios aspectos de la invención puede ser un bacteriófago lisogénico o no virulento. Como alternativa, el vehículo de administración puede ser un plásmido tal como un plásmido conjugativo u otro replicón plamídico, un vector nucleotídico, o ADN bicatenario (ADNbc) lineal.

El vehículo de administración puede ser un bacteriófago no virulento, tal como el bacteriófago M13, un bacteriófago filamentoso que infecta células de Escherichia coli, que se replica y se secreta de la célula hospedadora bacteriana sin destruir al hospedador bacteriano, que sigue creciendo y dividiéndose más lentamente. Otro bacteriófago filamentoso adecuado es NgoPhi6 aislado de Neisseria gonorrhoeae que es capaz de infectar una variedad de bacterias gramnegativas sin destruir al hospedador.

Como alternativa, se pueden usar bacteriófagos lisogénicos que no siempre destruyen las células hospedadoras después de la infección, sino que infectan y se vuelven profagos durmientes.

Por tanto, esta invención puede utilizar un sistema novedoso para inactivar genes de resistencia a antibióticos en bacterias utilizando principalmente bacteriófagos que no destruyen bacterias, y/o plásmidos conjugativos y/o transformación directa del ADN, como mecanismos de administración del polinucleótido recombinante de la invención.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición que comprende el vehículo de administración como se define en el presente documento.

La composición puede ser una composición farmacéutica, un microorganismo no patógeno tal como una bacteria comensal, por ejemplo, en una formulación probiótica, o un suplemento alimenticio.

Como se utiliza en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los agentes activos (como el polinucleótido recombinante o el vehículo de administración como se describe en el presente documento) con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración del agente activo a un organismo.

La composición puede formularse para administración tópica, enteral o parenteral.

Las composiciones de la presente invención pueden, si se desea, presentarse en un paquete, dispositivo dispensador o kit, cada uno de las cuales puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el agente o agentes activos. El paquete, dispositivo dispensador o kit puede ir acompañado de instrucciones de administración.

También se proporciona de acuerdo con la invención la composición tal como se define en el presente documento para usar como medicamento.

En otro aspecto, se proporciona de acuerdo con la invención una composición como se define en el presente documento para usar en el tratamiento o prevención de una infección causada por un microorganismo resistente a antibióticos que comprende un gen de resistencia a antibiótico dirigido por la molécula de ARN guía del polinucleótido recombinante.

También se divulga un método para tratar o prevenir una infección en un sujeto causada por un microorganismo resistente a antibióticos que comprende un gen de resistencia a antibióticos, en el que el método comprende la etapa de introducir en el microorganismo una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición como se define en el presente documento, donde la molécula de ARN guía se dirige al gen de resistencia a antibióticos, inactivando así el gen de resistencia a antibióticos y sensibilizando el microorganismo al antibiótico.

La composición se puede administrar por vía tópica u oral. Alternativamente, la composición puede administrarse mediante administración intravenosa, parenteral, oftálmica o pulmonar.

Las composiciones de la presente invención para administración tópica pueden estar en una forma adecuada para uso tópico tal como, por ejemplo, un aerosol, crema, pomada, loción o polvo para espolvoreo.

Las composiciones proporcionadas en el presente documento se pueden formular para la administración mediante inhalación. Por ejemplo, las composiciones pueden estar en forma de un aerosol, una bruma o un polvo. Por tanto, las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar en forma de una presentación de aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado tal como, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. Cuando se utiliza un aerosol presurizado, se puede determinar una unidad de dosificación proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida.

En el método divulgado, el sujeto puede ser una planta, un pez, un pájaro, un reptil o un mamífero (tal como un ser humano).

De acuerdo con el método divulgado, el vehículo de administración puede transferirse del microorganismo directamente a otro microorganismo (tal como un microorganismo resistente a antibióticos) mediante conjugación de plásmidos o infección por bacteriófagos.

El método divulgado puede comprender además una etapa de administración simultánea o posterior al sujeto de un antibiótico al que se ha sensibilizado un microorganismo.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para inactivar la resistencia a antibióticos en un microorganismo, comprendiendo el método introducir en el microorganismo el vehículo de administración como se define en el presente documento.

También se proporciona de acuerdo con la invención una célula hospedadora que comprende el polinucleótido recombinante definido en el presente documento. La célula hospedadora puede, por ejemplo, ser una bacteria comensal.

Los microorganismos a los que se dirigen diversos aspectos de la invención pueden estar en una superficie corporal, localizados (por ejemplo, contenidos dentro de un órgano, en el lugar de una herida quirúrgica u otra herida, dentro de un absceso), o pueden ser sistémicos. Se incluye el tratamiento de infecciones bacterianas que son susceptibles de terapia mediante aplicación tópica, por ejemplo, usando un bacteriófago de la invención.

La presente divulgación también abarca el recubrimiento de superficies distintas de las del cuerpo con el polinucleótido recombinante, vehículo de administración o composición de la presente invención, por ejemplo, apósitos para heridas o superficies de dispositivos médicos.

Otros aspectos, características y realizaciones no limitantes de la presente invención se describirán ahora a continuación con referencia a los siguientes dibujos:

Figura 1. Inmunización bacteriana mediada por CRISPR/Cas9 contra genes resistentes a antibióticos en un plásmido: I, locus CRISPR/Cas, donde los recuadros indican diferentes secuencias espaciadoras dirigidas a diferentes genes de resistencia a antibióticos; II, ARNg-Cas9 donde los recuadros indican diferentes ARNg que se dirigen a cada gen de resistencia a antibióticos; III, plásmido que alberga el gen de resistencia a antibióticos;

IV, reconocimiento de dianas y posicionamiento de Cas9; V, plásmido escindido, VI: bacteriófago. ApR = resistente a ampicilina, CmR = resistente a cloranfenicol, KmR = resistente a kanamicina. ApS = sensible a ampicilina, CmS = sensible a cloranfenicol, KmS = sensible a kanamicina. Bla= betalactamasa, CAT = cloranfenicol acetiltransferasa, APH = aminoglucósido fosfotransferasa. 1. Inyección - CRISPR/Cas9 se inyecta en la célula bacteriana junto con el ADN del bacteriófago mediante una infección por bacteriófagos específicos de bacterias. 2. Lisogenización - El ADN del bacteriófago se lisogeniza y se integra en el cromosoma del hospedador bacteriano (Cr. B). 3. Biogénesis de ARNcr y ensamblaje de Cas9 - El pre-ARNcr se transcribe e hibrida con ARNcrtra y se procesa para producir ARNcr:ARNcrtra maduro (una molécula guía de RNA, o "ARNg"), que se ensambla con Cas9. 4. Reconocimiento - Estos complejos ARNg-Cas9 reconocen el ADN diana en el plásmido. 5. Escisión- Los complejos ARNg-Cas9 escinden el ADN en los sitios reconocidos por los ARNcr. 6. Inactivación - Esto conduce a la inactivación de la producción de enzimas resistentes a antibióticos; 7.

Sensibilización - Así, la célula bacteriana se vuelve sensible a varios antibióticos.

Figura 2. Prevención de bacterias no patógenas y patógenos asintomáticos de un encuentro futuro con genes de resistencia a antibióticos: I, locus CRISPR/Cas, ejemplificado aquí como presente en el cromosoma bacteriano (Cr. B) y donde los recuadros indican diferentes secuencias espaciadoras dirigidas a diferentes genes de resistencia a antibióticos; II, ARNg-Cas9, donde los recuadros indican diferentes ARNg que se dirigen a cada gen de resistencia a antibióticos; III, relaxasa -una enzima que produce una muesca específica de cadena, específica de secuencia en ADN de doble cadena para iniciar la transferencia conjugada del ADN plasmídico; IV, bacteriófago, V, plásmido; VI, ADN bicatenario; VII, ADN monocatenario. Se muestran tres rutas de entrada para encontrar futuros genes de resistencia a antibióticos. 1. Transformación- Entrada de ADN desnudo que porta el gen de resistencia a antibióticos en la célula bacteriana, 2. Transducción mediada por bacteriófagos El bacteriófago que lleva el gen de resistencia a antibióticos infecta una célula bacteriana. 3 Conjugación El plásmido que porta el gen de resistencia a antibióticos se transfiere de forma conjugada desde una célula bacteriana donante a una célula bacteriana receptora. Cuando estos genes de resistencia a antibióticos se introducen en la célula "inmunizada"; está prearmada con un locus CRISPR/Cas que codifica un ARNg-Cas9 que encuentra la secuencia diana específica en el gen de resistencia a antibióticos y la escinde para alterar el gen.

Figura 3. Re-sensibilización de patógenos sintomáticos a antibióticos: I, locus CRISPR/Cas en el cromosoma bacteriano (Cr. B.), donde los recuadros indican diferentes secuencias espaciadoras dirigidas a cada gen de resistencia a antibióticos; II, ARNg-Cas9, donde los recuadros indican diferentes ARNg que se dirigen a cada gen de resistencia a antibióticos; III, antibióticos; IV, la síntesis de proteínas se altera mediante la escisión del gen correspondiente; V, plásmido. Esta figura muestra un patógeno asintomático que se vuelve sintomático debido a una infección oportunista. El patógeno contiene ADN plasmídico que proporciona varios agentes de resistencia a antibióticos, tales como 1. Bombas de expulsión- capaces de bombear antibióticos fuera de la célula bacteriana, 2 Enzimas de degradación de antibióticos y 3. Enzimas de modificación de antibióticos.

Cada agente resistente a antibióticos se altera (X) mediante escisión específica de sitio mediada por ARNg-Cas9 de los genes correspondientes.

Figura 4. Tres posibles rutas de administración CRISPR/Cas: I, locus CRISPR/Cas donde los recuadros indican diferentes secuencias espaciadoras dirigidas a cada gen de resistencia a antibióticos; II, relaxasa -una enzima que produce una muesca específica de cadena, específica de secuencia en ADN de doble cadena para iniciar la transferencia conjugada del ADN plasmídico; III, bacteriófago; IV, plásmido; V, ADN bicatenario; VI, ADN monocatenario. Esta figura muestra tres posibles rutas de administración de la construcción de expresión CRISPR/Cas9. 1. Transformación- Entrada de ADN desnudo que porta CRISPR/Cas9 en la célula bacteriana a través de un receptor de ADN en la superficie celular, seguido de integración (4) en el cromosoma bacteriano (Cr. B.), 2. Transducción mediada por bacteriófagos- El bacteriófago que lleva CRISPR/Cas9 infecta una célula bacteriana, seguido de circularización (5) y luego la integración mediada por bacteriófagos (4) en el cromosoma bacteriano (Cr. B.). 3 Conjugación El plásmido que porta CRISPR/Cas9 se transfiere de forma conjugada de una célula bacteriana donante a una célula bacteriana receptora, seguido de circularización (5) y replicación del plásmido. En todos los casos, los recuadros en el locus CRISPR/Cas9 indican diferentes secuencias espaciadoras dirigidas a cada gen de resistencia a antibióticos.

Figura 5. Estructura del modelo de transmisión bidireccional resistente a antibióticos (véase también Am J Epidemiol. 2013;178(4):508-520) y el efecto de la terapia de inactivación de genes de resistencia a antibióticos: A, La resistencia a antibióticos es dominante; B, La sensibilidad a antibióticos es dominante; S, susceptible, SA, Sensible a antibióticos; RA, Resistente a antibióticos; T, Transmisión; R, Restablecimiento, C, Conversión, ACC, Administración de CRISPR/Cas9. Los genes de resistencia a antibióticos en un estado de resistencia a antibióticos y el encuentro de genes de resistencia a antibióticos en un estado sensible se alteran, por ejemplo, por la escisión de Cas9 mediada por ARNg. La terapia de inactivación de genes de resistencia a antibióticos convierte el modelo bidireccional (A) en un modelo de conversión casi unidireccional (B) al aumentar la tasa de conversión de antibiótico resistente a sensible y disminuir la tasa de conversión de antibiótico sensible a resistente. El área de cada cuadrado representa la densidad de población de cada estado. El ancho de las flechas es proporcional a la magnitud de cada parámetro (transmisión, restablecimiento y conversión), es decir, se supone que la transmisión de bacterias resistentes a antibióticos es mayor que la de las bacterias sensibles a antibióticos en esta figura. El restablecimiento de la infección de patógenos sensibles a antibióticos es mayor que el de los patógenos resistentes a antibióticos. En presencia de antibióticos, los patógenos sensibles a antibióticos se convierten en patógenos resistentes a antibióticos mucho más que la conversión inversa de patógenos resistentes a sensibles debido a la presión de selección. El objetivo del tratamiento es revertir estos parámetros de conversión para llevar a la población de patógenos resistentes a antibióticos a un estado sensible mediante la introducción de CRISPR/Cas9 en las bacterias.

Figura 6. Estructura del modelo de transmisión resistente a antibióticos de superinfección y el efecto de la terapia de inactivación de genes de resistencia a antibióticos: El modelo de transmisión de resistencia a antibióticos bidireccional representado en la Figura 5 puede describirse adicional o alternativamente mediante el siguiente modelo de transmisión de resistencia a antibióticos de superinfección (véase también Am J Epidemiol.

2013;178(4):508-520, como en la Figura 5). Cuando los genes de resistencia a antibióticos se alteran, por ejemplo, mediante la escisión de Cas9 mediada por ARNg, esto permite que la población pase del estado resistente a antibióticos al estado sensible a antibióticos a través del estado de superinfección. La alteración de genes de resistencia a antibióticos aumenta la tasa de conversión del estado resistente al antibiótico al estado sensible. Esta figura ofrece una comparación de la densidad de población relativa antes (Figura 6A) y después (Figura 6B) de aplicar el sistema CRISPR-Cas. La población está compuesta por S, Susceptible; Iw, sensible; Iz, resistente; y Iwz, estado de superinfección. El área de cada círculo es proporcional a la densidad de población relativa en cada estado. En esta simulación, se supone que la densidad inicial en cada estado es idéntica (0,25 cada uno, representado por un círculo de líneas finas). Los círculos de líneas gruesas representan la densidad de población en el estado de equilibrio. El sistema CRISPR-Cas está contribuyendo claramente a un aumento de la población en el estado susceptible, por lo tanto, la tasa de restablecimiento en el estado de equilibrio (es decir, S se está expandiendo en B) y a reducir la población en el estado resistente (es decir, Iz se está reduciendo en B). El ancho de las flechas es proporcional a la magnitud de cada parámetro (infección, restablecimiento y conversión de estado), es decir, se supone que la infección de bacterias resistentes a antibióticos es menor que la de las bacterias sensibles a antibióticos en esta figura. El restablecimiento de la infección de los patógenos sensibles a antibióticos es mayor que el de la infección de los patógenos resistentes a antibióticos, porque los antibióticos son eficaces en las cepas sensibles. En presencia de antibióticos, los patógenos sensibles a antibióticos se convierten en patógenos resistentes a antibióticos mucho más que la conversión inversa debido a la presión de selección de los antibióticos. El objetivo del tratamiento es revertir estos parámetros de conversión y llevar a la población de patógenos resistentes a antibióticos a un estado sensible.

Figura 7. Estructura del locus CRISPR: Esta figura muestra el locus CRISPR que contiene seis espaciadores que se dirigen a seis regiones diferentes. Cada ARNcr se transcribe monocistrónicamente a partir de los mismos promotores denominados P para controlar el nivel de transcripción idéntico para cada diana. Cada transcripción de ARNcr comienza con una secuencia líder L y termina con una secuencia terminadora T. Las transcripciones de cada pre-ARNcr se muestran como flechas y los recuadros que contienen diferentes secuencias espaciadoras se indican mediante un sombreado único.

Figura 8. Mapeo de una secuencia corta bacteriana fuera de la diana en la secuencia génica bla. La figura muestra la alineación local de secuencias cortas bacterianas (SEQ ID NO: 3-5, 8-14, 17-23 y 26-33) mapeadas en el gen betalactamasa. La secuencia de betalactamasa (SEQ ID NO: 1-2, 6-7, 15-16 y 24-25) se muestra en gris en la parte superior de cada panel, la secuencia PAM (motivo adyacente al protoespaciador) se muestra en negro. La región de emparejamiento de bases con ARNcr está subrayada, la secuencia semilla fuera de la diana en el genoma bacteriano está en cursiva. La secuencia semilla fuera de la diana, incluida la secuencia PAM, se indica mediante dos líneas verticales. Dos números en la secuencia del gen de la betalactamasa son las dos posiciones de base esperadas donde el enlace fosfodiéster es escindido por Cas9 (véase Ejemplo 1 a continuación).

Figura 9. Estructura secundaria de ARNcr prevista. Con referencia a la Figura 8 y al Ejemplo 1, se muestran las estructuras secundarias previstas de las secuencias de ARNcr usando mFold. Las secuencias de CR05, CR30, CR70 y CR90 que se muestran en la Figura 9 corresponden a las SEQ ID NO: 34-37, respectivamente.

Figura 10. Posiciones de escisión esperadas en el gen betalactamasa de pBR322 (SEQ ID NO: 38). Dos secuencias protoespaciadoras, que son pares de bases con secuencias espaciadoras de ARNcr, están subrayados (cadena protoespaciadora). Dos secuencias antiprotoespaciadora, que se desplazan cuando las secuencias protoespaciadoras se emparejan con las secuencias espaciadoras de ARNcr, están en negrita y cursiva (cadena antiprotoespaciadora). Las secuencias PAM asociadas se indican con letras minúsculas encuadradas (en la cadena protoespaciadora) o en letras mayúsculas encuadradas (en la cadena antiprotoespaciadora). Las posiciones de escisión esperadas se indican mediante asteriscos. La secuencia líder está subrayada de la 1a a la 69a base y resaltada en gris.

Figura 11. Fotografía de productos de ADN separados electroforéticamente en un gel de agarosa al 0,8 % que muestra amplicones de PCR generados en el Ejemplo 2 de cada una de las tres regiones más el vector pACYC184 digerido con EcoRV. Los carriles marcados son los siguientes: 1*-NEB (N3232S) Marcadores moleculares de 1 kb, 2 pg/carril; 2 - Fragmento 1, región ARNcrtra-Cas9: 4758 pb; 3* - NEB (N3232S) marcadores moleculares de 1 kb, 0,75 pg/carril; 4 - pACYC184 sin cortar; 5 - corte pACYC184 EcoRV: 4245 pb; 6 - corte pACYC184 EcoRV: 4245 pb; 7* - n Eb (N3232S) marcadores moleculares de 1 kb, 0,12 pg/carril; 8 - Fragmento 2, líder y primera región de repetición directa: 276 pb; 9* - NEB (N3232S) marcadores moleculares de 1 kb, 0,2 pg/carril; y 10 - Fragmento 3, Segunda región de repetición directa: 452 pb. Nota: * La masa de cada amplicón de PCR se estima mediante la comparación de la intensidad de la franja de marcador apropiada utilizando el programa informático NIH ImageJ 1.48v (http://imagej.nih.gov/ij/).

Figura 12. Mapa del plásmido de pNB100 construido en el Ejemplo 2. El mapa del plásmido fue dibujado por el visor SnapGene ver. 2.4.3 versión gratuita (http://www.snapgene.com). Dos repeticiones directas (RD) se muestran como cajas rectangulares blancas estrechas adyacentes al extremo 3' de la secuencia líder.

Figura 13. Las fotografías muestran los resultados de la "actividad de simbióticos Nemesis" (ASN) de acuerdo con una realización de la invención mediante apareamiento de células bacterianas (véase el Ejemplo 2). La placa de la izquierda muestra JA200 pNT3 x DH5a pNB100 en Ap100Cm35, mientras que la placa de la derecha muestra JA200 pNT3 x DH5a pNB102 en Ap100Cm35, ambos colocados en placas a 5 x 107 células/ml.

Figura 14. Las fotografías muestran los resultados de la ASN de acuerdo con otra realización de la invención mediante transformación de plásmidos (véase el Ejemplo 2). Izquierda: placa LB Cm35. Las colonias 1-40 son Dh5a pBR322 transformadas con pNB102; Las colonias 45-60 son DH5a pBR322 transformadas con pNB100. Todas las colonias muestran resistencia a Cm llevada a cabo en los plásmidos pNB100 y pNB102; Derecha: placa LB Ap100. Hay que tener en cuenta que las colonias 1-40 han perdido ApR después de la transformación con pNB102 que lleva la región espadadora dirigida contra el gen betalactamasa portado por el plásmido pBR322 en la cepa NBEc001, demostrando así la actividad de simbióticos Nemesis. pNB100 que carece de esta región espaciadora pero que porta el gen Cas9 no puede inactivar el gen betalactamasa.

Figura 15. Muestra un fagémido de Ngophi6. ORF11 y ORF7 de Ngophi6 se eliminan del genoma de Ngophi6. Las secuencias de codificación están representadas por las flechas que indican la polaridad de traducción de cada ORF. La nomenclatura génica correspondiente de cada ORF del bacteriófago Ngophi6 a M13 son ORF1 (gll), ORF2 (gV), ORF4 (gVIII), ORFV (gVIII), ORF8 (gVI), ORF9 (gl). Las nomenclaturas génicas de M13 están entre paréntesis. La segunda T del supuesto sitio de integración izquierdo L = CTTATAT se cambia a A para dar L'= CATATAT para evitar la integración. MCS = sitio de clonación múltiple. La ubicación de Ngophi6 y M13mp18 está indicada mediante dos grandes flechas abiertas.

Figura 16. Muestra un conjunto de secuencias espaciadoras (SEQ ID NO: 39-60) que codifican 20 moléculas de ARN guía dirigidas contra 117 genes bla diferentes identificados en la base de datos NCBI ARDB para Klebsiella pneumoniae (véase el Ejemplo 5). Se identificaron secuencias espaciadoras candidatas para alterar todos los genes betalactamasa de Klebsiella pneumoniae que se encuentran en la base de datos ARDB. Las secuencias génicas de betalactamasa se recopilan de la base de datos ARDB con la palabra clave Klebsiella pneumoniae. Se eliminaron las secuencias redundantes y se utilizaron secuencias únicas para la alineación de secuencias múltiples utilizando el programa web Clustal Omega. Se eligió una secuencia canónica de cada grupo y se recogieron las secuencias espaciadoras de 20 nt previstas mediante el buscador de ARNg CRISPR/Cas9 del programa web Jack Lin. La secuencia espaciadora se elige para maximizar la proporción de la secuencia protoespaciadora encontrada en las secuencias que pertenecen a la misma rama. Por tanto, cada una de las secuencias espaciadoras de ejemplo que se muestran en la 4a columna tiene la capacidad de alterar los genes de la tercera columna. Los genes betalactamasa utilizados en este análisis son: SHV-a = 1, 2, 2a, 5, 5a, 11, 12, 14, 26, 27, 28, 31, 33, 38, 43, 44, 48, 55, 56, 60, 61, 62, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,85, 89, 92, 98, 99, 101, 103, 106, 107, 108, 109, CTXM-b = 1, 3, 10, 12, 15, 22, 32, 54, 60, 62, 68, CTXM-c = 13, 14, 16, 18, 19, 24, 26, CTXM-d = 2, 35, 59, CTXM-e = 26, 63, TEM-f = 1, 1b, 3, ESBL, 139, KPC-g = 1, 2, 3, 4, OKP-h = A11, A12, A16, A17, B13, B-SB613, 6, LEN-i = 2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, GES-j = 1, 3, 4, 5, VIM-a = 1, 2, 4, 12, 19, IMP-b = 4, 8, CMY-a = 2, 4, 25, 31, 36, LAT-b = 1, 2, CMY-c = 1, 8b, 10, 19, FOX-d = 1, 5, 7, OXA-a = 1, 30, 47, OXA-2, OXA-9, OXA-b = 10, 17. Los antibióticos betalactámicos se clasifican en cuatro clases, penámicos, cefémicos, carbapenémicos y monobactámicos. Se incluye un nombre de antibiótico como ejemplo en cada clase. La betalactamasa, que puede abrir el anillo de betalactámico está indicado por R. Por ejemplo, el carbapenema se inactiva mediante KPC. Si se desea volver a sensibilizar las bacterias al carbapenema, la secuencia espaciadora 5'-TTGTTGCTGAAGGAGTTGGG debe emplearse en una matriz espaciadora para inactivar genes KPC. Hay que tener en cuenta que la secuencia espaciadora para CMY-a también se puede emplear para la escisión de LAT-b. El ejemplo de secuencias espaciadoras se muestra desde la dirección 5' a 3'.

Figura 17. Muestra un conjunto de secuencias espaciadoras (SEQ ID NO: 61-77) que codifican 17 moléculas de ARN guía dirigidas contra 154 genes bla diferentes identificados en la base de datos CARD para Klebsiella pneumoniae (véase el Ejemplo 5). Se identificaron secuencias espaciadoras candidatas para alterar todos los genes betalactamasa de Klebsiella pneumoniae que se encuentran en la base de datos CARD. Esta tabla se creó con el mismo método explicado en la leyenda de la Figura 16. El ejemplo de secuencias espaciadoras se muestra desde la dirección 5' a 3'.

Figura 18. Mapa de un polipéptido Cas de unión a ADN modificado, Cas9R. Una fusión genética entre Cas9 y resolvasa Tn3. La resolvasa y Cas9 se indican mediante flechas. La dirección de la punta de la flecha representa la polaridad de la transcripción. Los nombres de dominio funcionales de Cas9 se muestran en los cuadros debajo de la flecha abierta de Cas9. Este Cas9 es el mutante dCas9 deficiente en actividad endonucleasa, con sustituciones de aminoácidos D10A en el dominio RuvCl, H840A en el dominio HNH (como lo describe Tsai et al. [2014, Nature Biotechnology 32: 569-576]). Una resolvasa Tn3 mutante (como la describe Proudfoot et al. [2011 PLoS ONE 6(4): e19537]) se fusiona al extremo N de este dCas9 mediante un enlazador polipeptídico de 12 mer. Las posiciones de algunos de estos restos de aminoácidos sustituidos que reducen la especificidad del sitio de recombinación se indican mediante barras verticales cortas en el dominio N terminal, restos 1-148, de la resolvasa. La lista completa de estas sustituciones es: R2A, E56K, G101S, D102Y, M103I, Q105L, V107F, E132A, L135R. En las regiones Cas9 de la fusión: los dominios RuvCI, II, III, HNH y PI (interacción PAM) son dominios nucleasa, REC1a y REC1b son dominios de reconocimiento de ARN de repetición y antirrepetición, respectivamente. El dominio REC2 no tiene ningún contacto con el heterodúplex protoespaciador-ARNg. Cuatro secuencias espaciadoras CRISPR S1, S2, S3 y S4 se ordenan bajo la expresión de una secuencia líder CRISPR y se requieren para provocar el evento de recombinación mediado por Cas9R por la resolvasa Tn3 mutante que conduce a la eliminación y refijación de la secuencia diana. Tn3R = Resolvasa Tn3, R = repetición directa, L = Secuencia líder.

Figura 19. Esquema que muestra el posicionamiento específico del sitio de resolvasa mediante Cas9 dirigido por ARNg. La flecha abierta en la etapa I es el gen de resistencia a antibióticos diana en el plásmido para inactivación. Cada sitio de recombinación A (A1, A2) y B (B1, B2) son reconocidos por ARNg de forma independiente y las resolvasas ubicadas correctamente se dimerizan en estrecha proximidad (etapa II). Los dímeros en cada sitio de recombinación A1 A2 y B1 B2 se tetramerizan para formar una sinapsis (etapa III). El complejo sináptico (III) se agranda, los ARNg se presentan como flechas punteadas designadas S1, S2, S3 y S4. Los óvalos grandes representan dCas9, los óvalos longitudinales son resolvasas conectadas a través de péptidos enlazadores. Los óvalos longitudinales blancos y grises son dominios catalíticos de resolvasa que se dimerizan en el sitio de recombinación B y A, respectivamente. Las flechas verticales indican la posición de escisión en los sitios de recombinación mediante resolvasa. Las flechas paralelas horizontales delgadas representan el ADN que contiene el sitio de recombinación A1 A2 y las flechas paralelas horizontales gruesas representan el ADN que contiene los sitios de recombinación B1 B2. La punta de flecha muestra el extremo 3' de la secuencia de ADN. Las flechas cortas de bloque negro son ubicaciones de cada una de las secuencias PAM.

Figura 20. Esquema que muestra el semisitio de intercambio del sitio de recombinación A1 A2 y B1 B2 seguido de la resolución de la cadena y el sellado del punto de rotura. El semisitio de recombinación A1 y B1 se intercambian, se ligan y se resuelven. La región del gen del antibiótico diana se resuelve como un ADN circular, mientras que el resto del replicón cromosómico o plasmídico se vuelve a circularizar (etapa IV). Las flechas cortas de bloque negras son ubicaciones de cada secuencia PAM después de la resolución.

Figura 21. Muestra un conjunto de secuencias espaciadoras (SEQ ID NO: 78-85) que codifican 8 moléculas de ARN guía dirigidas contra los genes de clase A, SHV-a, CTX-M-b, TEM-c, KPC-d; los genes de clase B VIM-e, IMP-f, NDM-g y el gen de clase D, OXA-48 donde SHV-a = 1, 1a, 2, 2a, 5, 5a, 11, 12, 14, 18, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 28, 31, 32, 33, 38, 43, 44, 48, 52, 55, 56, 60, 61, 62, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 89, 92, 98, 99, 100, 101, 103, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 121, 136, 134, 137, 140, 143, 144, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 168, 172, 173, 178, 179; CTXM-b = 1, 3, 10, 12, 15, 19, 22, 32, 52, 54, 59, 60, 62, 68, 71, 80, 81, 99, 141, 147; TEM-c = 1, 1B, 3, 139, 162, 183, 192, 197, 198, 209; KPC-d = 1,2, 3, 4, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16, 17; VIM-e = 1,2, 4, 19, 26, 27, 33, 34; IMP-f = 4, 8, 32, 38; y NDM-g = 1, 9, 10 (véase el Ejemplo 7).

Figura 22. Muestra una tabla con las secuencias (SEQ ID NO: 86-98) de los oligonucleótidos utilizados en la construcción de los plásmidos pNB200, 202, 203, 104A, 104B y 108 (véase el Ejemplo 7).

Figura 23. Mapa del plásmido de pNB104A construido en el Ejemplo 7. El mapa del plásmido fue dibujado por el visor SnapGene ver. 2.4.3 versión gratuita (http://www.snapgene.com). El concatémero espaciador tetrámero (Figura 29A) se digirió con BsaI, cuyo sitio de restricción se ubica en A1 y A2, y se ligó a sitios de clonación espaciadores de BsaI en pNB202 para dar pNB203. Se muestra el promotor único y la región espaciadora (6221-7001) en pNB104A. P = Promotor, L = Líder, R = repetición directa, S = espaciador, T = Cola. Los espaciadores concatenados (dirigidos contra NDM, IMP, VIM y ^k P^c ) se ubican cadena abajo del promotor único.

Figura 24. Mapa del plásmido de pNB104B construido en el Ejemplo 7. El mapa del plásmido fue dibujado por el visor SnapGene ver. 2.4.3 versión gratuita (http://www.snapgene.com). Se muestran las regiones de promotor único (6221-6987) en pNB104B. P = Promotor, L = Líder, R = repetición directa, S = espaciador, T = Cola. Los espaciadores concatenados (dirigidos contra OXA-48, SHV, TEM y CTX-M) se ubican bajo expresión del promotor único.

Figura 25. Mapa del plásmido de pNB108 construido en el Ejemplo 7. El mapa del plásmido fue dibujado por el visor SnapGene ver. 2.4.3 versión gratuita (http://www.snapgene.com). El concatémero espaciador octámero (Figura 29B) se digirió con BsaI, cuyo sitio de restricción se ubica en A1 y A2, y se ligó a sitios de clonación espaciadores de BsaI en pNB100 para dar pNB108. Se muestra el promotor único y la región espaciadora (6221­ 7225) en pNB108. P = Promotor, L = Líder, R = repetición directa, S = espaciador, T = Cola. Los espaciadores concatenados (dirigidos contra NDM, IMP, VIM, KPC, OXA-48, SHV, TEM y CTX-M) se ubicaron debajo del promotor único.

Figura 26. Mapa del plásmido de pNB200 construido en el Ejemplo 7. El mapa del plásmido fue dibujado por el visor SnapGene ver. 2.4.3 versión gratuita (http://www.snapgene.com). El casete de doble promotor se sintetizó mediante PCR a partir del molde pNB100 con el par de cebadores NB018 y NB019, el amplicón se dirigió con BbvI y se ligó al sitio BsaI de pNB100 para dar pNB200, el pequeño fragmento BsaI de pNB100, de la posición 5776-5741 (véase la Figura 12) se reemplaza en el proceso. Se muestra el promotor dual y la región de clonación de dos espaciadores (6221-7382) en pNB200. P = Promotor, L = Líder, R = repetición directa, S = espaciador, T = Cola. Las enzimas de restricción BsaI y SapI se utilizan para clonar secuencias espaciadoras cadena arriba y cadena abajo, respectivamente.

Figura 27. Mapa del plásmido de pNB202 construido en el Ejemplo 7. El mapa del plásmido fue dibujado por el visor SnapGene ver. 2.4.3 versión gratuita (http://www.snapgene.com). El concatémero espaciador tetrámero (Figura 29A) se digirió con SapI, cuyo sitio de restricción se ubica en B1 y B2, y se ligó a sitios de clonación espaciadores SapI en pNB200 para dar pNB202. Se muestra el promotor dual y las regiones espaciadoras (6221-7329) en pNB202. P = Promotor, L = Líder, R = repetición directa, S = espaciador, T = Cola. Los espaciadores concatenados (dirigidos contra OXA-48, SHV, TEM y CTX-M) se ubican cadena abajo del segundo promotor.

Figura 28. Mapa del plásmido de pNB203 construido en el Ejemplo 7. El mapa del plásmido fue dibujado por el visor SnapGene ver. 2.4.3 versión gratuita (http://www.snapgene.com). El concatémero espaciador tetra a b c d que se muestra en la Figura 29A fue digerido con BsaI, cuyo sitio de restricción se ubica en A1 y A2, y se ligó a sitios de clonación espaciadores de BsaI en pNB202 para dar pNB203. Se muestra el promotor dual y las regiones espaciadoras (6221-7501) en pNB203. P = Promotor, L = Líder, R = repetición directa, S = espaciador, T = Cola. Los espaciadores concatenados (dirigidos contra NDM, IMP, VIM y KPC) se ubican cadena abajo del primer promotor. Los espaciadores concatenados (dirigidos contra OXA-48, SHV, TEM y CTX-M) se ubican cadena abajo del segundo promotor.

Figura 29A. Concatenación de espaciador tetrámero en el Ejemplo 7. Los números que asocian los oligonucleótidos corresponden a los números de cebadores que se enumeran en la Figura 22. Los oligonucleótidos se hibridan por pares entre 26 y 27, 28 y 34, 35 y 31, 32 y 36 a través de una región espaciadora única (I) a, c, e y g, respectivamente y se extienden en tubos individuales (II). El dímero concatémero de 26 y 27 concatena el espaciador a y b. El dímero concatémero de 28 y 34 concatena el espaciador b, c y d. El dímero concatémero de 35 y 31 concatena el espaciador e y f. El dímero concatémero de 32 y 36 concatena el espaciador f, g y h (II). Los dímeros concatenados a b y b c d, e f y f g h se hibridan adicionalmente a través de la región espaciadora b y f, respectivamente y se extienden para concatenar cuatro espaciadores a, b, c y d o e, f, g y h (III).

El concatémero espaciador tetrámero e f g h se digirió con SapI, cuyo sitio de restricción se ubica en B1 y B2, y se ligó a sitios de clonación espaciadores SapI en pNB200 para dar pNB202. El concatémero espaciador tetra a b c d se digirió con BsaI, cuyo sitio de restricción se ubica en A1 y A2, y se ligó a sitios de clonación espaciadores de BsaI en pNB202 para dar pNB203. a = espaciador de 20 mer para NDM, b = espaciador de 20 mer para IMP, c = espaciador de 20 mer para VIM, d = espaciador de 20 mer para KPC, e = espaciador de 20 mer para OXA-48, f = espaciador de 20 mer para SHV, g = espaciador de 20 mer para TEM, h = espaciador de 20 mer para CTX-M.

Figura 29B. Concatenación de espaciador octámero en el Ejemplo 7. Los concatémeros espaciadores tetrámeros a b c d y e f g h se amplificaron con el par de cebadores NB026 y NB029, NB030 y NB033, respectivamente (V), y se hibridaron los concatémeros tetra a través de la región del espaciador d seguido de extensión para producir el espaciador octámero a b c d e f g h. Este octámero se digirió con BsaI y se ligó a BsaI, cuyo sitio de restricción se ubica en A1 y A2, y se ligó a sitios de clonación de espaciador BsaI en pNB100 para dar pNB108. a = espaciador de 20 mer para NDM, b = espaciador de 20 mer para IMP, c = espaciador de 20 mer para VIM, d = espaciador de 20 mer para KPC, e = espaciador de 20 mer para OXA-48, f = espaciador de 20 mer para SHV, g = espaciador de 20 mer para TEM, h = espaciador de 20 mer para CTX-M.

Figura 30. Fotografías que muestran los resultados de la "actividad de simbióticos Nemesis" (ASN) de acuerdo con una realización de la invención mediante apareamiento de células bacterianas (véase el Ejemplo 7). La Figura 30A, placa superior izquierda muestra JA200 pNT3 x DH5a pNB100 en Ap100Cm35, mientras que la placa superior derecha muestra JA200 pNT3 x DH5a pNB102 en Ap100Cm35. La figura 30B muestra NCTC13440 x DH5a pNB100, la placa superior izquierda y NCTC13353 x DH5a pNB100, la placa superior derecha; y NCTC13440 x DH5a pNB104A la placa inferior izquierda y NCTC13353 x DH5a pNB104B, la placa inferior derecha todo en Ap100Cm35. La figura 30C muestra JA200 pNT3 x DH5a pNB100 (5-), NCTC13440 x DH5a pNB100 (2-) y NCTC13353 x DH5a pNB100 (4-), placa superior izquierda; y JA200 pNT3 x DH5a pNB108 (5/8), NCTC13440 x DH5a pNB108 (2/8) y NCTC13353 x DH5a pNB108 (4/8), placa superior derecha y JA200 pNT3 x DH5a pNB100 (5+), placa inferior, todo en Ap1 00Cm35.

Como se utiliza en el presente documento, el término "antibiótico" se refiere a un antibiótico clásico que es producido por un microorganismo que es antagonista del crecimiento de otros microorganismos y también abarca más generalmente un agente antimicrobiano que es capaz de destruir o inhibir el crecimiento de un microorganismo, incluyendo versiones sintetizadas químicamente y variantes de antibióticos de origen natural.

La expresión "suficientemente complementario" significa que la identidad de secuencia de la secuencia espaciadora y la secuencia diana es tal que la molécula de ARN guía que comprende la secuencia espaciadora es capaz de hibridarse, preferiblemente de forma específica y selectiva, con la secuencia diana, permitiendo de ese modo la inactivación del gen de resistencia a antibióticos que comprende la secuencia diana mediante el sistema CRISPR/Cas descrito en el presente documento. Por ejemplo, la secuencia espaciadora puede tener al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia en toda su longitud con la secuencia diana.

La expresión "equivalente funcional" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que es capaz de la misma actividad que un polipéptido Cas de unión a ADN (o, como se utiliza en el presente documento, un polipéptido Cas de unión a ácidos nucleicos). El "equivalente funcional" puede tener la misma propiedad biológica cualitativa que el polipéptido Cas de unión a ADN. Los "equivalentes funcionales" incluyen, pero sin limitación, fragmentos o derivados de un polipéptido Cas de unión a ADN nativo y sus fragmentos, siempre que los equivalentes tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Aunque la identidad estructural no es necesaria para la actividad biológica común, en un aspecto, el equivalente funcional puede tener al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia en toda su longitud con un polipéptido Cas de unión a ADN, por ejemplo, Cas9 (Ferretti et al, 2001, PNAS, 98 N.° 8: 4658-4663, Gene ID: 901176, Cas9 GI: 15675041; SEQ ID NO: 99).

La expresión "polipéptido Cas de unión a ADN" abarca un polipéptido Cas de longitud completa, un fragmento enzimáticamente activo de un polipéptido Cas y derivados enzimáticamente activos de un polipéptido Cas o fragmento del mismo. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, pero sin limitación, mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de una proteína Cas o un fragmento de la misma.

La expresión polipéptido Cas de unión a ADN "modificado" abarca polipéptidos Cas de unión a ADN como se definieron anteriormente excepto que la función catalítica de DSB del polipéptido se reemplaza mediante una función de sellado de ADN debido, por ejemplo, a la presencia de un dominio catalítico de recombinasa. En el presente documento se describen características adicionales de dichos polipéptidos Cas de unión a ADN modificados.

La identidad de secuencia entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos se puede determinar mediante la comparación de una alineación de las secuencias. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. La puntuación de una alineación con un porcentaje de identidad es una función del número de aminoácidos o bases idénticos en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Cuando se comparan secuencias, las alineaciones óptimas pueden requerir la introducción de huecos en una o más de las secuencias para tener en cuenta posibles inserciones y deleciones en las secuencias. Los métodos de comparación de secuencias pueden emplear penalizaciones de hueco de modo que, para el mismo número de moléculas idénticas en secuencias que se están comparando, una alineación de secuencias con la mínima cantidad posible de huecos, que refleje mayor relación entre las dos secuencias comparadas, conseguirá una mayor puntuación que una con muchos huecos. El cálculo del porcentaje máximo de identidad implica la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco.

Los programas informáticos adecuados para realizar comparaciones de secuencia están ampliamente disponibles en el sector comercial y público. Los ejemplos incluyen MatGat (Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4: 29; programa disponible en http://bitincka.com/ledion/matgat), Gap (Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443­ 453), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; programa disponible en http://www.ebi.ac.uk/fasta), Clustal W 2.0 y X 2.0 (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948; programa disponible en http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2) y algoritmos de alineación por pares EMBOSS (Needleman y Wunsch, 1970, supra; Kruskal, 1983, en: Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, Sankoff & Kruskal (eds), pág. 1-44, Addison Wesley; programas disponibles en http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align). Todos los programas pueden ejecutarse usando parámetros por defecto. Por ejemplo, pueden emprenderse comparaciones de secuencia usando el método de "needle" de los algoritmos de alineación por pares EMBOSS, que determina una alineación óptima (incluyendo huecos) de dos secuencias cuando se consideran sobre su longitud completa y proporciona una puntuación de porcentaje de identidad. Los parámetros por defecto para comparaciones de secuencias de aminoácidos (opción "molécula proteínica") puede ser penalización por extensión de hueco: 0,5, penalización por abertura de hueco: 10,0, Matriz: Blosum 62. Los parámetros por defecto para comparaciones de secuencias de nucleótidos (opción "molécula ADN") puede ser penalización por extensión de hueco: 0,5, penalización por abertura de hueco: 10,0, Matriz: DNAfull.

En un aspecto de la invención, una comparación de secuencias puede realizarse sobre la longitud completa de la secuencia de referencia.

Como se utiliza en el presente documento, el término "gen" se refiere a una secuencia de ADN a partir de la cual se codifica un polipéptido o se transcribe un ARN funcional no codificante.

La expresión "gen de resistencia a antibióticos" abarca un gen, o la porción codificante del mismo, que codifica un producto o transcribe un ARN funcional que confiere resistencia a antibióticos. Por ejemplo, el gen de resistencia a antibióticos puede ser un gen o la porción codificante del mismo que contribuye a cualquiera de los cuatro mecanismos de resistencia descritos anteriormente. El gen de resistencia a antibióticos puede, por ejemplo, codificar (1) una enzima que degrada un antibiótico, (2) una enzima que modifica un antibiótico, (3) una bomba, tal como una bomba de expulsión, o (4) una diana mutada que suprime el efecto del antibiótico.

El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótido de cualquier longitud, por ejemplo, ARN (tal como ARNm) o ADN. El término también incluye, particularmente para marcadores de oligonucleótidos, los tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la materia, metilación, "caperuzas", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas, tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces inalterados, por ejemplo, fosfatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc. y con enlaces cargados.

El término "polipéptido" como se usa en el presente documento se refiere a un polímero de aminoácidos. El término no se refiere a una longitud específica del polímero, por lo que los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. El término "polipéptido" puede incluir modificaciones posteriores a la expresión, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos dentro de la definición de "polipéptido" están, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la materia tanto de origen natural como de origen no natural.

El término "microorganismo" abarca procariotas tales como bacterias y arqueas (por ejemplo, las que pertenecen a Euryarchaeota y Crenarchaeota). Las bacterias incluyen bacterias grampositivas y gramnegativas. Algunas especies de hongos patógenos clínicamente significativas se incluye en la definición de microorganismos, por ejemplo, miembros del género Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis y Stachybotrys.

Varios aspectos de la invención se muestran en las figuras y se describen a continuación.

En la presente invención, una ventaja de usar un bacteriófago o un plásmido conjugativo que comprende el polinucleótido recombinante de la invención es que cada uno sirve como un "caballo de Troya" que, después de la infección del bacteriófago, o después de la conjugación del plásmido, da como resultado la inserción de la "construcción asesina" en la bacteria diana u otro microorganismo.

La construcción asesina, una vez insertada en el microorganismo diana, también proporciona una inmunización de las células contra la futura llegada de un plásmido que alberga genes de resistencia a antibióticos (véase la Figura 2), además, por supuesto, para alterar dichos genes ya presentes (véanse las Figuras 1 y 3).

Las construcciones asesinas comienzan entonces el proceso de degradación de los genes de resistencia a antibióticos. Si una DSB creada por la proteína Cas de unión a ADN de la invención destruye un replicón que porta dicho gen resistente a antibióticos, entonces un microorganismo que alberga el gen de resistencia a antibióticos puede ser destruido directamente por una construcción asesina. Si el microorganismo sobrevive a la DSB, el gen de resistencia se inactivará y, a continuación, se podrá tratar a un paciente con el antibiótico o antibióticos a los que ahora se ha sensibilizado el microorganismo.

De manera importante, no debe haber o debe reducirse la presión de selección directa que actúe contra este evento hasta que los pacientes sean tratados posteriormente con antibióticos. Por lo tanto, debería haber poca o ninguna selección directa para la resistencia a bacteriófagos (o plásmidos) en las bacterias patógenas u otros microorganismos y, por lo tanto, no se establece o hay menos establecimiento de una "carrera de armamentos evolutivos" - a veces una característica limitante significativa del uso conocido de bacteriófagos directamente como agentes bactericidas.

En el caso de que la destrucción de un microorganismo inducida por DSB aumente la presión de selección para la resistencia a un bacteriófago o agente de liberación de plásmido conjugativo, el problema podría mitigarse mediante, por ejemplo, la utilización de un polipéptido Cas de ADN modificado como se define en el presente documento. Esta presente invención proporciona posibles agentes para la administración de suplementos dietéticos orales, tópicos y probióticos, así como una herramienta epidemiológica para inactivar silenciosamente genes de resistencia a antibióticos en bacterias patógenas u otros microorganismos (véase la Figura 3). Pacientes programados para cirugía u otro tratamiento en el hospital, bien pueden tratarse con bacteriófagos recombinantes que porten construcciones asesinas CRISPR/Cas9 (u otras) dirigidas contra genes de resistencia a antibióticos de forma profiláctica antes de la admisión hospitalaria. De esta manera, los patógenos presentes en su microbioma se pueden destruir o eliminar directamente de los genes de resistencia a antibióticos en previsión de cualquier infección posoperatoria que pueda ocurrir y que requiera tratamiento con antibióticos.

Por tanto, esta presente invención proporciona una herramienta epidemiológica para inactivar silenciosamente genes de resistencia a antibióticos en bacterias patógenas.

Para efectuar la ejemplificación de la invención, se puede construir un conjunto de asesinos CRISPR/Cas9 dirigidos contra antibióticos seleccionados. Las variables son el bacteriófago (también denominado en el presente documento simplemente como sinónimo "fago"), o el plásmido conjugativo, o ADN, agente de administración: se puede desarrollar una variedad de bacteriófagos y agentes plasmídicos que sean específicos para una variedad de patógenos bacterianos importantes.

El grado en el que un solo bacteriófago generalizado o agente de administración de plásmidos necesita ser modificado para dirigirse a diferentes patógenos bacterianos depende de los detalles de la especificidad de las interacciones de las proteínas del bacteriófago implicadas en el ciclo de vida del bacteriófago o de la biología del plásmido y la diana bacteriana patógena.

Pueden desarrollarse tanto bacteriófagos lisogénicos que infectan a los hospedadores y se vuelven inactivos como profagos, como bacteriófagos no virulentos que se replican pero no destruyen al hospedador. Con respecto a la especificidad lisogénica del bacteriófago, solo se requiere el ciclo de vida lisogénico del bacteriófago y, por tanto, la especificidad implicada en (i) la entrada del bacteriófago en la célula bacteriana y (ii) su posterior integración en un sitio de unión en el cromosoma diana. Es posible que la integración no sea necesaria y se puede reemplazar utilizando el bacteriófago para administrar un plásmido que luego se puede extraer, por ejemplo, mediante recombinación cre-lox y replicar independientemente en la célula. Se pueden utilizar bacteriófagos M13 no virulentos y derivados del mismo.

Se puede retener un ciclo lítico funcional en el bacteriófago lisogénico de modo que los niveles bajos de entrada en el ciclo lítico en las bacterias lisogenizadas generarán nuevos bacteriófagos que pueden infectar posteriormente otras bacterias (ya sean bacterias patógenas o bacterias no patógenas, para proporcionar inmunidad). Desde el punto de vista de la propagación epidemiológica del bacteriófago en la población patógena, esto puede no ser necesario y una sola infección inicial puede ser suficiente. Esto se puede probar experimentalmente. Se identifican condiciones óptimas para una infección eficaz y la multiplicidad apropiada de infección.

Los experimentos se pueden realizar en un sistema modelo (véase la Figura 1). Por ejemplo, E. coli que porta resistencia a múltiples fármacos, por ejemplo, a ampicilina, cloranfenicol y kanamicina o dirigida contra antibióticos de uso común contra los cuales la resistencia está generalizada.

También se pueden realizar experimentos con un patógeno diana, por ejemplo, Klebsiella pneumoniae carbapenemasa ("KPC"). La KPC es responsable de infecciones y muertes en los hospitales del Reino Unido.

Administración mediante bacteriófago: El sistema de administración de bacteriófagos (véase, por ejemplo, la Figura 2, ruta 2) puede ser adecuado para el tratamiento de heridas y quemaduras infectadas por bacterias resistentes a antibióticos.

Se puede usar la administración de la construcción asesina dirigida contra estos antibióticos mediante dos bacteriófagos lisogénicos distintos de E. coli: el bacteriófago lambda y el bacteriófago Mu. El bacteriófago lambda tiene un sitio de integración específico en el cromosoma hospedador conocido como sitio de unión lambda. El bacteriófago Mu es capaz de integrarse aleatoriamente en el genoma hospedador y tiene la ventaja de que no se requieren sitios de unión específicos en las bacterias.

El bacteriófago también se puede usar para administrar un replicón plasmídico que contiene el polinucleótido recombinante de la invención que se escinde mediante recombinación cre-lox después de la infección como se discutió anteriormente o mediante el uso del bacteriófago P1 que se replica como un episoma. La especificidad implicada en una infección exitosa es el reconocimiento de una proteína de membrana en la superficie de la célula bacteriana. En el caso de lambda, esta es la proteína maltosa permeasa que transporta el azúcar maltosa a la célula bacteriana. En el caso del bacteriófago Mu, el receptor es LPS.

El bacteriófago M13 específico masculino que infecta células de E. coli que llevan el plásmido del factor F también puede usarse para administrar construcciones CRISPR/Cas9 (u otras construcciones asesinas de la invención) dirigidas contra uno o más genes de resistencia a antibióticos. M13 es un bacteriófago bien estudiado, que se replica, pero no destruye al hospedador bacteriano.

Se evalúa la eliminación exitosa de la resistencia a antibióticos diana tras la liogenización por bacteriófago recombinante o la infección por recombinantes M13 que llevan la construcción asesina dirigida contra estos genes de resistencia a antibióticos.

Se pueden realizar estudios sobre otras Enterobacteriaceae estrechamente relacionadas que portan resistencia a los mismos antibióticos. Estas pueden incluir Salmonella typhimurium, y Shigella flexneri además de Klebsiella pneumoniae discutida anteriormente.

Para hacer esto, se construyen bacteriófagos modificados con diferentes genes que codifican la proteína de la fibra de la cola del bacteriófago para permitirle interactuar con un receptor diferente presente en la superficie bacteriana. Se pueden utilizar bacteriófagos lisogénicos o bacteriófagos específicos masculino, como M13, que son hospedadores naturales de estas bacterias.

También se puede aprovechar el fenómeno de variación de fase por el cual los bacteriófagos son capaces de cambiar su especificidad de hospedador mediante la inversión, a baja frecuencia, de un segmento de ADN para controlar la expresión génica y expresar proteínas alternativas de la fibra de la cola. Y de esa manera, desarrollar sistemas de administración de bacteriófagos que sean versátiles. Por ejemplo, el bacteriófago Mu porta un segmento G invertible (regulado por una recombinasa específica de sitio codificada por Mu, Gin) dando lugar a dos tipos de bacteriófagos G(+) capaz de infectar K12 de E. coli y G(-) capaz de infectar Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens y Erwinia carotovora.

Otro ejemplo es el bacteriófago filamentoso NgoPhi6 de Neisseria gonorrhoeae, o formas modificadas del mismo. El bacteriófago natural (tipo silvestre) tiene una amplia gama de hospedadores para bacterias gramnegativas (proteobacterias alfa, beta y gamma) - véase Piekarowicz et al. (2014 J. Virol. 88: 1002 - 1010). El bacteriófago natural no es lítico sino lisogénico y tiene un sitio de integración en el genoma del hospedador. En un aspecto de la invención, se elimina la capacidad del bacteriófago para integrarse en el cromosoma hospedador y el bacteriófago se genomanipula para que se replique de forma independiente. La sustitución del sitio de integración izquierdo L, CTTATAT con L', CATATAT eliminará el evento de integración. Para replicar el genoma del bacteriófago extracromosómicamente, el ori de M13 y el gen II de M13 pueden usarse para imitar la replicación del bacteriófago M13. La modificación se puede mantener al mínimo para mantener la capacidad de producción de la progenie de las bacterias infectadas. Aunque se desconoce el tamaño máximo del empaquetamiento, se demuestra experimentalmente que un ADN de bacteriófago de alrededor de 12 kb es empaquetable y la progenie del bacteriófago producida a partir de las bacterias infectadas con este bacteriófago es infectable. La longitud del bacteriófago es de alrededor de 4 micrómetros, que es 4,4 veces más largo que la partícula del bacteriófago M13, e indica la mayor capacidad de empaquetamiento del ADN más largo que el M13, es decir, suponiendo que el tamaño de empaquetamiento del ADN es proporcional al tamaño de la longitud de la partícula del bacteriófago, la capacidad de empaquetamiento de ADN del bacteriófago NgoPhi6 será de 4 micrómetros/0,9 micrómetros x 6407 nt = 28475 nt, lo suficientemente grande para empaquetar el genoma del bacteriófago junto con un polinucleótido recombinante de la invención, incluyendo, por ejemplo, una construcción CRISPR-Cas9 si es necesario. La estructura ejemplificada del vector bacteriófago (fagémido) cumple con los requisitos - véase la Figura 15.

Administración mediante plásmidos conjugativos: Puede evaluarse la administración de las construcciones asesinas dirigidas contra estos antibióticos mediante plásmidos conjugativos seleccionados de una amplia gama de hospedadores (véase la Figura 4, ruta 3). En el presente documento, los plásmidos pueden administrarse mediante un hospedador benigno no patógeno. La aplicación aquí puede ser para el tracto Gl y probiótico y puede usarse de manera profiláctica. En este aspecto, los posibles efectos letales de las DSB causadas por la proteína Cas de unión a ADN no son motivo de preocupación, ya que el plásmido no se transferirá al receptor.

De manera similar, se puede evaluar la demostración de la eliminación exitosa de la resistencia a los tres antibióticos diana después de la transferencia conjugada de plásmidos que portan la carga asesina.

Administración mediante transformación de ADN lineal: También se puede realizar la administración de la construcción asesina dirigida contra estos antibióticos mediante transformación de ADN bicatenario lineal (véase la Figura 4, ruta 1). En el presente documento, el ADN se administra a través del receptor de ADN en la superficie de las bacterias desde el entorno bacteriano circundante.

Ejemplos

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

El objetivo del Ejemplo 1 es demostrar un estudio de viabilidad para la resurrección de la eficacia antibiótica mediante la introducción de una construcción CRISPR/Cas9 en cepas bacterianas no patógenas de Escherichia coli. Una construcción CRlSPR/Cas9 se elabora directamente a partir de ADN genómico aislado de la cepa SF370 de Streptococcus pyogenes, que se obtiene de: http://www,straininfo.net/strains/1178GG/browser;jsessionid=A07A638D6D2472EA2FEDBD3 A1928F347.straininfo2. Aquí, la región de codificación de Cas9 más las regiones reguladoras adyacentes y el ADN que codifica el ARNcrtra se extrae mediante PCR, utilizando cebadores de ADN específicos de secuencia y clonados en un vector de clonación de plásmidos adecuado. Una repetición unitaria de la matriz CRISPR que comprende las repeticiones directas que flanquean una secuencia espaciadora se extrae de manera similar mediante PCR y se modifica para reemplazar la secuencia espaciadora por un sitio de clonación para permitir la posterior introducción de secuencias espaciadoras diseñadas para dirigirse a regiones de ADN de elección, tales como genes de resistencia a antibióticos. Es útil tener una selección positiva para los transformantes bacterianos que portan los recombinantes deseados en los que dicha secuencia espaciadora se ha clonado con éxito en el sitio de clonación. El Apéndice 3 da un ejemplo de dicha selección positiva.

Alternativamente, una construcción de direccionamiento de genes CRISPR/Cas9 equivalente, aunque carece de una selección positiva para recombinantes, se obtiene a partir de un plásmido pCas9 tal como, por ejemplo, disponible en Addgene: http://www.addgene.org/42876/. Este plásmido porta el gen Cas9 más una secuencia de a Dn que codifica la matriz de ARNcrtra y CRISPR con un sitio de clonación único con el fin de introducir la secuencia espaciadora deseada para dirigirse a una secuencia de ADN dada para la escisión por la endonucleasa Cas9. Para propósitos de ejemplificación, el uso de este plásmido pCas9 existente se describe a continuación.

El Ejemplo 1 muestra que las bacterias portadoras de un gen betalactamasa (bla) que confiere resistencia al antibiótico betalactámico, ampicilina, se vuelven sensibles a la ampicilina después de la introducción de una construcción CRISPR/Cas9 modificada dirigida contra el gen bla: la construcción CRISPR/Cas9/anti-bla.

Materiales y Métodos

A. Cepas bacterianas, plásmidos y bacteriófago

1. Cepas bacterianas:

DH5a es (F- endAI glnV44 thi-1 recAI relAI gyrA96 deoR nupG 080 dlacZAM15 A(lacZYA-argF)U169, hsdR17(n<' mK+),A-).

JM109 es (endAI glnV44 thi-1 relAI gyrA96 recAI mcrB+ A(lac-proAB) e14- [F' traD36 proAB+ laclq lacZAM15]hsdR17(rK"mK+)).

2. Plásmidos:

pUC18 (Orí pMB1); pCas9 (vector basado en pACYC184 con Orí p15A, locus CRISPR más gen Cas9, CMR); pCRISPR (Orí pMB1, CRISPR, KnR).

3. Bacteriófago: M13mp18

En el ejemplo 1A, en una cepa DH5a de E. colí y que porta pBR322 un plásmido de copia media o alternativamente un plásmido de copia baja, se administra la construcción CRISPR/Cas9/anti-bla, mediante transformación de ADN desnudo en el plásmido pCas9, denominado pCas9::anti-bla. El plásmido pBR322 ya presente, o el plásmido de copia baja, expresa la betalactamasa procedente del transposón bacteriano Tn3; pBR322 también tiene resistencia a la tetraciclina. Como pCas9::anti-bla porta resistencia al cloranfenicol, la selección de células que mantienen pCas9::anti-bla se logra mediante la adición de cloranfenicol al medio de crecimiento. En un experimento de control negativo separado, las células DH5a con pBR332, o un plásmido de copia baja se transforman con pCas9 (que es un plásmido en todos los aspectos como pCas9::anti-bla pero que carece de antibla que es la secuencia espaciadora dirigida contra el gen bla: se predice que pCas9, al carecer de anti-bla, no podría atacar e inactivar el gen bla. De nuevo, pCas9 se mantiene mediante la presencia de cloranfenicol.

La actividad betalactamasa se puede detectar mediante nitrocefina, que es un derivado cromogénico de la cefalosporina, cuando el anillo betalactámico se hidroliza, la absorción ultravioleta de la nitrocefina inalterada se desplaza a unos 500 nm, que permite la detección visual de la presencia de betalactamasa.

Sea No el número total de bacterias resistentes a cloranfenicol y Nr el número de bacterias resistentes a betalactamasa. El crecimiento de Nr se manifiestan como colonias rojas en presencia de nitrocefina. Sea Nw el número de bacterias sensibles a betalactamasa. El crecimiento de colonias Nw se manifiestan como colonias blancas en presencia de nitrocefina. Por tanto, la eficacia de la inactivación mediada por CRISPR/Cas9/anti-bla del gen bla se calcula midiendo la fracción de colonias blancas, es decir, Nw/NO = (N0-Nr)/N0.

Alternativamente, se observa que la actividad de la betalactamasa cuestiona directamente a las bacterias en la placa LB que contiene ampicilina. El total de bacterias resistentes a cloranfenicol es No, bacterias resistentes a ampicilina es Na, luego la inactivación mediada por CRISPR/Cas9/anti-bla de la eficacia del gen bla se puede definir mediante la medición de la fracción de la colonia sensible a ampicilina, 1-Na/NO.

En el Ejemplo 1B, se utiliza un sistema de administración del bacteriófago M13 para introducir la construcción CRISPR/Cas9/anti-bla en la cepa de E. colí, JM109, que expresa el gen betalactamasa de un plásmido residente. El bacteriófago recombinante M13::CRISPR/Cas9/anti-bla se prepara como sigue: la construcción CRISPR/Cas9/anti-bla se aísla de pCas9::anti-bla mediante la digestión de esta construcción con Salí y Xbal. El tamaño del fragmento digerido es de 5796 pb. El fragmento se clona en el sitio Salí (GTCGAC) y Xbal (TCTAGA) de M13mp18 RF I. El tamaño completo del M13mp18 que contiene la construcción CRISPR/Cas9/anti-bla es 13035 pb. Este ADN del bacteriófago recombinante M13 se transforma en JM109 de E. colí, una cepa bacteriana que porta el plásmido F' y el bacteriófago M13 recombinante extruido de la bacteria se purifica y se usa para introducir la construcción CRISPR/Cas9 en JM109 de E. colí que alberga pBR322. Como control negativo, se prepara un bacteriófago recombinante equivalente M13::CRISPR/Cas9 que carece de la región anti-bla a partir de pCas9 mediante la enzima de restricción Salí y Xbal y el amplicón se clona en el sitio Salí y Xbal de M13mp18 RF I.

Cuando M13 infecta las células bacterianas, no las destruye, pero el ADN del bacteriófago se replica dentro de la célula y expresa genes del bacteriófago. Por tanto, la infección del bacteriófago M13 con un bacteriófago recombinante M13::CRISPR/Cas9/anti-bla debería dar como resultado la inactivación del gen bla, en contraste, en un control negativo, a la infección por un bacteriófago recombinante M13::CRISPR/Cas9 que carece de la región anti-bla. Debido a que la infección por bacteriófago M13 ralentiza la tasa de crecimiento celular, cuando las células infectadas crecen en un césped de células producen placas turbias de células infectadas de crecimiento lento. Si se añade nitrocefina al medio de crecimiento, la eficacia de la inactivación mediada por CRISPR/Cas9/anti-bla de la eficacia del gen bla se calcula mediante la medición de la fracción de colonias blancas a colonias rojas rojas, cuando las placas se recogen y se cultivan como colonias para eliminar el césped bacteriano. Las placas también se pueden recoger y colocar en placas LB con/sin ampicilina para puntuar la proporción que resultará de colonias sensibles a ampicilina a resistentes a ampicilina.

B. Selección de secuencia espadadora a partir de la secuencia diana

Se puede utilizar la herramienta de diseño de dianas de ARN guía (véase; https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp) de BlueHeron para seleccionar la secuencia espaciadora de la diana. Este programa simplemente devuelve la secuencia espaciadora de 20 nt con la secuencia PAM (motivo adyacente protoespaciador) apropiada en el extremo 3' y el contenido de GC. No considera la estabilidad de la estructura secundaria ni la especificidad de la secuencia. La predicción de la estructura secundaria y la búsqueda de especificidad se realizan manualmente.

Se elige la secuencia espaciadora real a partir de las secuencias candidatas obtenidas en el programa anterior, que debe cumplir los dos criterios siguientes: 1) baja tendencia a formar una estructura secundaria estable de ARNcr, 2) sin ADN diana en el ADN genómico del hospedador. Puede resultar muy difícil encontrar una secuencia única que satisfaga el criterio número 2. Teniendo en cuenta los datos de la diana no coincidentes de la Figura 3 E en Jinek et al Science 337, 816 (2012), el criterio n.° 2 se relaja para permitir una secuencia coincidente hasta la posición del 12° nucleótido en la secuencia diana (la primera posición de nucleótido se cuenta desde justo al lado de la secuencia PAM). En otras palabras, cuando la primera secuencia protoespaciadora de 12 mer de la secuencia diana coincide completamente con la secuencia de 12 mer de la secuencia espaciadora de ARNcr en el extremo 3', pero el resto de la secuencia no coincide, se supone que el ADNbc diana no se escinde. La comprobación de la especificidad de la secuencia protoespaciadora a lo largo de la secuencia genómica de K12 de E. coli se realiza mediante BLAST. La secuencia bla se busca frente a la secuencia sujeto de Escherichia coli cp. subcp. MG1655 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/556503834?report=genbank&log$=nuclalign&blast_r ank = 1 & RID = JUYB76FX014), y cada una de las secuencias cromosómicas coincidentes se mapea frente a la secuencia bla para contar la secuencia semilla de la secuencia canónica PAM (NGG). Las estructuras secundarias pueden predecirse mediante mFold. (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form) para elegir la secuencia cuya G sea lo más grande posible, preferentemente para ser positivo para la estructura espaciadora secundaria de ARNcr. La siguiente es la forma de seleccionar las secuencias espaciadoras apropiadas de la secuencia bla.

Toda la secuencia diana del gen bla se obtuvo utilizando la herramienta de diseño de dianas de ARN guía (https://wwws.blueheronbio.com/extemal/tools/ARNgSrc.jsp) de BlueHeron. Se devuelven 98 secuencias candidatas diana. Se mapean secuencias similares cortas cromosómicas bacterianas fuera de la diana contra el gen bla seguido del recuento de la secuencia semilla de la secuencia canónica PAM. Se eligen las secuencias cuyo número de secuencias semilla sea menor que ocho y cuya energía libre de Gibbs sea relativamente grande. El sumario de la propiedad de las secuencias diana seleccionadas se muestra en la Tabla 1. Esta tabla también muestra la longitud de nucleótidos de la secuencia semilla de las secuencias fuera de la diana en pCas9 y pBR322.

Secuencia del casete de oligonucleótidos para secuencia espadadora

Las siguientes cuatro secuencias espaciadoras son casetes de generación de ARNcr que se dirigen a la betalactamasa en pBR322 en E. coli como cepa hospedadora, que cumplen los dos criterios anteriores. El ARNcr CR05 escinde el enlace fosfodiéster entre la base C 762 y la base C 763, CR30 escinde el enlace fosfodiéster entre la base G 198 y la base A 199, CR70 escinde los enlaces fosfodiéster entre la base T 575 y la base A 576 y CR90 escinde los enlaces fosfodiéster entre la base T 221 y la base A 222 en el gen betalactamasa.

Adaptadores para dianas únicas en el gen betalactamasa.

CR05

5'-AAACTAGATAACTACGATACGGGAg SEQ ID NO: 115 atctattgatgctatgccctcAAAA-5' SEQ ID NO: 116 CR30

5’-AAACACTTTAAAAGTGCTCATCATg SEQ ID NO: 117 tgaaattttcacgagtagtacAAAA-5' SEQ ID NO: 118 DraI CR70

5’-AAACACGTTGCGCAAACTATTAACg SEQ ID NO: 119 tgcaacgcgtttgataattgcAAAA-5’ SEQ ID NO: 120 AclI CR90

5’-AAACACTTTTAAAGTTCTGCTATGg SEQ ID NO: 121 tgaaaatttcaagacgataccAAAA-5’ SEQ ID NO: 122 DraI Adaptador para dianas duales en el gen betalactamasa. La secuencia de repetición directa interna está en cursiva y subrayada. CR30+CR90 SEQ ID NO: 123

5 ’ -AAACACTTTAAAAGTGCTCATCATGrrrrAGAGCrArGCrGrrrrGAfl.rGGrCCCAflAfl.Ca.CTTTTAAAGTTCTGCTATGq

t g a a a t t t t c a c g a g t a g t a c a a a a t c t c g a t a c g a c a a a a c t t a c c a g g g t t t t g t g a a a a t t t c a a g a c g a t a c c A A A A D ra I CR30 D ra I CR90

SEQ ID NO: 124

El extremo 5' de cada oligonucleótido está fosforilado y listo para la clonación en sitios SsaI.

Los sitios de las endonucleasas de restricción del cortador de seis bases están subrayados, que son útiles para seleccionar los recombinantes. También se puede emplear uno de los oligonucleótidos de casete como cebador para seleccionar los recombinantes mediante PCR junto con otro cebador único para el vector plasmídico.

Apéndice 1

Secuencia del plásmido pCas9 (SEQ ID NO: 125)

Gen Cas 9, locus de expresión CRISPR y ARNcrtra (todos de S. pyogenes)

GAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGG

TCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGT

TCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGA

AAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGAT

CAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAG

TGATCTTCCGTCACAGGTATTTATTCGGCGCAAAGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAACTTACTGATTTAGTGTATGATGGT

GTTTTTGAGGTGCTCCAGTGGCTTCTGTTTCTATCAGCTGTCCCTCCTGTTCAGCTACTGACGGGGTGGTGCGTAACGGC

AAAAGCACCGCCGGACATCAGCGCTAGCGGAGTGTATACTGGCTTACTATGTTGGCACTGATGAGGGTGTCAGTGAAGTG

CTTCATGTGGCAGGAGAAAAAAGGCTGCACCGGTGCGTCAGCAGAATATGTGATACAGGATATATTCCGCTTCCTCGCTC

ACTGACTCGCTACGCTCGGTCGTTCGACTGCGGCGAGCGGAAATGGCTTACGAACGGGGCGGAGATTTCCTGGAAGATGC

CAGGAAGATACTTAACAGGGAAGTGAGAGGGCCGCGGCAAAGCCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACAAGCATCA

CGAAATCTGACGCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGCGGCTCCC

TCGTGCGCTCTCCTGTTCCTGCCTTTCGGTTTACCGGTGTCATTCCGCTGTTATGGCCGCGTTTGTCTCATTCCACGCCT

GACACTCAGTTCCGGGTAGGCAGTTCGCTCCAAGCTGGACTGTATGCACGAACCCCCCGTTCAGTCCGACCGCTGCGCCT

TATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGAAAGACATGCAAAAGCACCACTGGCAGCAGCCACTGGTAATTGATTT

AGAGGAGTTAGTCTTGAAGTCATGCGCCGGTTAAGGCTAAACTGAAAGGACAAGTTTTGGTGACTGCGCTCCTCCAAGCC

AGTTACCTCGGTTCAAAGAGTTGGTAGCTCAGAGAACCTTCGAAAAACCGCCCTGCAAGGCGGTTTTTTCGTTTTCAGAG

CAAGAGA TTACGCGCAGACCAAAACGA TCTCAAGAAGA TCA TCTTA TTAA TCAGA TAAAA TA TTTCTAGATTTCAGTGCA

ATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATC

GATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCT

CATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGG

A TT AC GAAAT C AT C C T G T G GAG C T T AG T AG G T T T AG C AAGAT G G C AG C G C C T AAAT G T AGAAT GAT AAAAG GAT T AAGAG

ATTAATTTCCCTAAAAATGATAAAACAAGCGTTTTGAAAGCGCTTGTTTTTTTGGTTTGCAGTCAGAGTAGAATAGAAGT

A T C a a a a a a a g c a c c g a c t c g g t g c c a c t t t t t c a a g t t g a t a a c g g a c t a g c c t t a t t t t a a c t t g c t a t g c t g t t t t g a a t g g 11 c cAAC AAGAT T A T T T T A TAA C TTTTA TAA CAAA TAA T CAA GGA GAAA T T CAAA GAAA TTTA TCA GC C A T AAAA

CAATAC T TAATAC TATAGAAT GATAACAAAATAAAC TAC T T T T TAAAAGAAT T T T G T G T TATAAT C TAT T TAT T A T TAAG

T AT T G G G T AAT AT t T T T T GAAGAGAT AT T T T GAAAAAGAAAAAT T AAAG C AT A T T AAAC T AAT T T C GGAG G T C A T TAAAA C TAT TAT T GAAAT C A T C AAAC T C AT TAT G GAT T T AAT T T AAAC T T T T TAT T T T AG GAG G C AAAA

CATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAA GTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGT ACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAA TGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACC GT TAAG CAAT TAAAAGAAGAT TAT T T CAAAAAAATAGAAT GT T T T GATAG T GT T GAAAT T T C AG GAGT T GAAGATAGAT T TAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAG ATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCT CACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGAT TAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTA T GCAGC T GAT C CAT GAT GATAG T T T GACAT T TAAAGAAGACAT T CAAAAAGCACAAGT GT CT GGACAAGGC GATAGT T TA CATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATT GGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCC AGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCT GT '1' GAAAA'l’AC TC AAT T GCAAAAT GAAAAGCT CTAT C T C 'l'A'i' TATC T C CAAAAT G GAAGAGACAT GI'AT GT G GACCAAGA ATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACA ATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAA AACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGG TTTGAGTGAACT TGATAAAGCT GGTTTTATCAAACGCCAATTGGT TGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAA TTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCT AAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGC GTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCrATGGTGATTATA AAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCT AATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGG GGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATA TTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATT GCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGC TAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCT T T GAAAAAAAT C C GAT T GAC T T T T T AGAAGC TAAAG GAT AT AAG GAAGT TAAAAAAGAC T T AAT C A I T AAAC TAC C T AAA TATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAAeGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGC TCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAAC AAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTrTCTAAGCGTGTT ATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGA AAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTA AACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATT GATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA

-10 promotor (beq id NO; 127)

•k-Je-kieit-k'jc'k-k'kit AGrAI'ATTTTAGATGAAGATTATTTCTTAATAACTAAAAATATGGTATAATACTCTr AATAAATGCÁGT

Secuencia líder (seq id NO: 128) AArACAGGGGC?T?7CAAGACTGAAG?Cl7AGC?GAGACAAA?AG?GCGAT?ACGAAAT7Tr:T I ,AGACAAAAArAGrCTAC

Repetición directa Espaciador Repetición saggttttagagctatgctgttttgaatggtcccaaaactgagaccagtctcggaagctcaaaggtctcgttttagagct Bsa I Bsa I directa Espaciador Repetición directa atgctgttttgaatggtcccaaaacttcagcacactgagacttgttgagttccatgttttagagctatgctgttttgaat g g a c t c c a t t c a a c a t t g c c g a t g a t a a c t t g a g a a a g a g g g t t a a t a c c a g c a g t c g g a t a c c t t c c t a t t c t t t c t g t TAAAGCGTTTTCATGTTATAATAGGCAAAAGAAGAGTAGTGTGATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCG TGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGC CCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTA CGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGA TGGGG AAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTG TTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCT AA TGCAGGAGTCGCA TAAGGGAGAGCGTCGACCGA TGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGC GGGGCATGACTA TCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTA TCA TGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGG GTCA TTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGA TGA TCGGCCTGTCGCTTGCGGTA TTCGGAA TCTTGCACGC CCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCG ACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGC GGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCT CGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCATTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGA

ACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCC

ACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGG

AGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCAT

CTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTT

GCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGA

GCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCCCCTACGTGCTGCTGAAGTTG

CCCGCAACAGAGAGTGGAACCAACCGGTGATACCACGATACTATGACTGAGAGTCAACGCCATGAGCGGCCTCATTTCTT

ATTCTGAGTTACAACAGTCCGCACCGCTGTCCGGTAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTT

ATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCAC

CATACCCACGCCGAAACAAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAA

CACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTAACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTA

TTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAAT

AAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTC

GAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAA

AAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACA

GACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGG

GGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAAC

ATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAA

CTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGT

GAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACG

El complemento inverso de ARNcrtra está en minúsculas, la secuencia de codificación de Cas9 (SEQ ID NO: 126) está encuadrada y la secuencia de repetición directa en CRISPR está en negrita. Las secuencias promotoras se predijeron mediante un algoritmo de red neuronal (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html). Los dos sitios únicos, SalI (GTCGAC) y XbaI (TCTAGA) resaltados en negrita y cursiva en negro se utilizan para aislar la construcción CRISPR/Cas9 para la clonación en M13mp18. La secuencia de la cadena principal pACYC184 está en cursiva.

La información del Apéndice 1 anterior se presenta alternativamente como sigue.

Secuencia del plásmido pCas9 (SEQ ID NO: 125)

Gen Cas 9, locus de expresión CRISPR y ARNcrtra (todos de S. pyogenes)

GAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGG

TCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGT

TCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGA

AAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGAT

CAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAG

TGATCTTCCGTCACAGGTATTTATTCGGCGCAAAGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAACTTACTGATTTAGTGTATGATGGT

GTTTTTGAGGTGCTCCAGTGGCTTCTGTTTCTATCAGCTGTCCCTCCTGTTCAGCTACTGACGGGGTGGTGCGTAACGGC

AAAAGCACCGCCGGACATCAGCGCTAGCGGAGTGTATACTGGCTTACTATGTTGGCACTGATGAGGGTGTCAGTGAAGTG

CTTCATGTGGCAGGAGAAAAAAGGCTGCACCGGTGCGTCAGCAGAATATGTGATACAGGATATATTCCGCTTCCTCGCTC

ACTGACTCGCTACGCTCGGTCGTTCGACTGCGGCGAGCGGAAATGGCTTACGAACGGGGCGGAGATTTCCTGGAAGATGC

CAGGAAGATACTTAACAGGGAAGTGAGAGGGCCGCGGCAAAGCCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACAAGCATCA

CGAAATCTGACGCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGCGGCTCCC

TCGTGCGCTCTCCTGTTCCTGCCTTTCGGTTTACCGGTGTCATTCCGCTGTTATGGCCGCGTTTGTCTCATTCCACGCCT

GACACTCAGTTCCGGGTAGGCAGTTCGCTCCAAGCTGGACTGTATGCACGAACCCCCCGTTCAGTCCGACCGCTGCGCCT

TATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGAAAGACATGCAAAAGCACCACTGGCAGCAGCCACTGGTAATTGATTT

AGAGGAGTTAGTCTTGAAGTCATGCGCCGGTTAAGGCTAAACTGAAAGGACAAGTTTTGGTGACTGCGCTCCTCCAAGCC

AGTTACCTCGGTTCAAAGAGTTGGTAGCTCAGAGAACCTTCGAAAAACCGCCCTGCAAGGCGGTTTTTTCGTTTTCAGAG

CAAGAGATTACGCGCAGACCAAAACGATCTCAAGAAGATCATCTTATTAATCAGATAAAATATTTCTAGATTTCAGTGCA

ATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATC

GATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCT

CATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGG

A3TACGAAATCATCCTGTGGAGCTTAGTAGGTTTAGCAAGATGGCAGCGCCTAAATGTAGAATGATAAAAGGATTAAGAG

ATTAATTTCCCTAAAAATGATAAAACAAGCGTTTTGAAAGCGCTTGTTTTTTTGGTTTGCAGTCAGAGTAGAATAGAAGT

ATCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATGCTGTTTTG

A A T G G T T C C A A C A A G A 'T 'T A tttta ta a cT ttta ta a ca a a ta a tca a g g a g a a a ttca a a g a a a ttta tC A G C C A 'T A A A A

CAATACTTAATACTATAGAATGATAACAAAATAAACTACTTTTTAAAAGAATTTTGTGTTATAATCTATTTATTATTAAG

T A T tg g g ta a ta t t t t t tg a a g a g a ta t t t tg a a a a a g a a a a a T ta a a g c a ta T T A A A C T A A T T T C G G A G G T C A T T A A A A

CTATTATTGAAATCATCAAACTCATTATGGATTTAATTTAAACTTTTTATTTTAGGAGGCAAAAATGGATAAGAAATACT CAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTC AAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGC GGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTT TTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAG CATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCG AAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTG GTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTAC AATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATC AAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCAT TGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGAT G AT GAT T T AGAT AAT T T AT T G G C G CAAAT T G G AGAT C AAT AT G CT GAT TTGTTTTTGG CAG C T AAG AAT T T AT C AGAT G C TATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACG ATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTT GATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAAT TTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTG ACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTT TTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAA TAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTG CTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGT TTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATT TCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAG AAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGT ACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATAT TGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATA AGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGAT AAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGA TGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAA ATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGG CGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGA GCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAAT TGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGT TTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCG TTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAAC TTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGAT AAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCAT GAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACT TCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTC GTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCG TAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCT TCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATT GTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGA AGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACT GGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGG AAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGAT TGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGT TAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATAT GTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGT GGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCA ATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACAT AGAGA CAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTA TTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTAC AAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAG GAGGTGACTGAAGTATattttagatgaagattatttcttaataactaaaaatatggTataatactcTTAATAAATGCAGT AATACAGGGGCTTTTCAAGACTGAAGTCTAGCTGAGACAAATAGTGCGATTACGAAATTTTTTAGACAAAAATAGTCTAC GAGGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACTGAGaCCAGTCTCGGAAGCTCAAAGGrcrCGTTTTAGAGCT ATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACTTCAGCACACTGAGACTTGTTGAGTTCCATGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAAT GGACTCCATTCAACATTGCCGATGATAACTTGAGAAAGAGGGTTAATACCAGCAGTCGGATACCTTCCTATTCTTTCTGT TAAAGCGTTTTCATGTTATAATAGGCAAAAGAAGAGTAGTGTGATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCG TGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGC CCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTA CGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGG AAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTG TTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCT AATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGC GGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGG GTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGC CCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCG ACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGC GGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCT CGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCATTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGA ACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCC ACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTC.GCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGG AGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCAT CTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTT GCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGA GCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCCCCTACGTGCTGCTGAAGTTG CCCGCAACAGAGAGTGGAACCAACCGGTGATACCACGATACTATGACTGAGAGTCAACGCCATGAGCGGCCTCATTTCTT ATTCTGAGTTACAACAGTCCGCACCGCTGTCCGGTAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTT ATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCAC CATACCCACGCCGAAACAAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAA CACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTAACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTA TTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAAT AAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTC GAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAA

AAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACA

GACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGG

GGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAAC

ATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAA

CTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGT

GAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACG

La secuencia de la cadena principal del vector pACYC184 está en cursiva, las posiciones de las secuencias se enumeran a partir de G del sitio EcoRI subrayado. El complemento inverso de ARNcrtra está en cursiva y negrita ubicado desde 1844 hasta 1929, los codones de iniciación y terminación de Cas9 se indican con tres letras en negrita, comenzando en el nucleótido N.° 2225 y terminando en el 6331 seguido de la secuencia líder 6389-6483 indicada por letras en negrita en cursiva, las secuencias de repetición directa primer, segunda y tercera están subrayadas, entre la primera y la segunda repetición directa en las que se encuentra la región de clonación espaciadora.

Esta región de clonación espaciadora contiene dos sitios Ssal invertidos indicados por letras en negrita y cursiva 5'-GAGACC-3' y 5-GGTCTC-3' para crear cuatro bases en 5' que sobresalen de los sitios de clonación espaciadores 5-GTTT-3' y 5'-TTTT-3', respectivamente. Las secuencias promotoras se predijeron como se indicó anteriormente, indicadas por minúsculas para el promotor directo para Cas9 y la secuencia líder y minúsculas en cursiva para el promotor inverso para ARNcrtra, el supuesto sitio de inicio de la transcripción se indica con mayúsculas en negrita. Los dos sitios únicos, SalI (GTCGAC) y Xbal (TCTAGA) resaltados en negrita y cursiva en negro se utilizan para aislar la construcción CRISPR/Cas9 para la clonación en M13mp18.

Apéndice 2

Modificación del sitio de clonación del espaciador en pCas9

Este sistema aprovecha el hecho de que la expresión de un minigén produce un determinado oligopéptido que agota la reserva de ARNt en la célula hospedadora, cuando se induce para la expresión, que conduce a la alteración de la síntesis de proteínas (Tenson T, Vega-Herrera J, Kloss P, Guarneros G, Mankin AS. J. Bacteriol. 1999; 181:1617-1622). Aplicando este concepto a la clonación de la secuencia espaciadora: cuando se inserta la secuencia espaciadora, se altera el minigén y no se produce la expresión del oligopéptido, por lo tanto, el ARNt no se agota, por tanto, solo las bacterias que albergan un plásmido con inserto pueden sobrevivir en condiciones de expresión inducida; mientras que las bacterias que albergan el plásmido sin el inserto no pueden crecer. La siguiente (SEQ ID NO: 129) es la estructura de la secuencia. Para construir esta estructura, las bacterias deben expresar el represor lacI constitutivamente para desactivar la transcripción del minigén. La selección recombinante debe realizarse en presencia de IPTG para inducir la transcripción.

AA^ACrr-3,--¿\r::¿GGCAGrSaGCGCflACgCaArrAar:AT^Ar-r,rA~crCA'"r-r:Tl:GACaAT'rAAICaTCSGCTCG"ATaATG Bsal 031ac -35 Ptac -10

oPiar: s.n. m r Terminación de Trp

Los sitios de reconocimiento SsaI están subrayados. Los operadores lac 3 y 1 están en negrita y cursiva. El promotor de Tac está en negrita, Las regiones -35 y -1o en la secuencia promotora están subrayadas, la secuencia Shine-Dalgarno está encuadrada, el primer dipéptido está en negrita M y R seguido de tres codones de terminación consecutivos TAA en cursiva. Se emplea la secuencia señal de terminación de triptófano, indicado por letras en cursiva.

Apéndice 3

Sitio de escisión esperado en la secuencia diana utilizando la secuencia espaciadora CR90

Primer evento de procesamiento

El ARNcrtra se hibrida con la región de repetición directa de pre-ARNcr indicada por letras mayúsculas usando la secuencia subrayada. La RNasa III bacteriana escinde la región de ARN bicatenario en la posición indicada "I", primer evento de procesamiento.

ARNcrtra 3 ' -im nuuuucguggcu

g

(SEQ ID NO: 130) aaaagu ggcaccga

a

guucaacuauugccuga

5 ' -ggaaccanuca|aaacagcanagcaaguuaaaauaaggc

CAAACCCUGGUAA | GUUCUGTCGUAUCG AGAUTJUUG- 5 '

pre-ARNcr a

(SEQ ID NO: 131) cuuuuaaaquucuqcuauqGUUUUAGAGCUAUGCTGOUUTJG | AAUGGTJCCCAAAAC-3' uaaaauuqaacqau acqacaaa Iacu u accaaq q - 5 ' acggugaaaaaguucaacuauugccugaucggaa

g

ccga■^^cgg^^gc'v^■U1luuuu-3, ARNcrtra (SEQ ID NO: 130)

Estructura después del 1er evento de procesamiento

(SEQ ID NO: 132)

5 ' - q q aaccauuca

CAAACCCtJGGUAA

pre-ARNcr a

cuuuuaaaguucuqcuauqGUUUUAGA GCUA'JGCTGUtJUUG uaaaauuqaacqau acqacaaa

agccacggu gaaaaagu u caacu a im gcc iigau cggaa

g

ucggu gcu u u u u u u -3 ' ARNcrtra

El primer evento de procesamiento también se puede representar de la siguiente manera: Los ARNcrtra indicados por letras minúsculas se hibridan con la región de repetición directa del pre-ARNcr indicada por letras mayúsculas en negrita. La RNasa III bacteriana escinde la región de ARN bicatenario en la posición indicada con flechas, que es el primer evento de procesamiento. El enlace fosfodiéster entre 22a y 23a base en la primera y segunda repetición directa se escinde. La secuencia espaciadora en cursiva CR90 está encuadrada.

3'" " uuuum m cafa gaga ú

:::: :: *J

aaaagisggcaecqa

nT¡ñBn&ormnrt,r\m\- t £

Estructura después del 1" evento de procesamiento

Segundo evento de procesamiento

El 2° punto de escisión (*) está a unos 20 nt del extremo 3' de la secuencia espadadora. "Hay que tener en cuenta que el 2° evento de procesamiento se produce a una distancia específica de la 1a escisión dentro de las repeticiones. Teniendo en cuenta que las secuencias espaciadoras no son idénticas entre sí, por tanto, es probable que el 2° evento de procesamiento dentro de los espaciadores dependa de la distancia en lugar de depender de la secuencia "(véase la leyenda de la Figura 2 complementaria en Nature. 31 de marzo de 2011;471 (7340):602-607). Aunque el artículo mencionado anteriormente no especifica particularmente la enzima y/o el mecanismo implicado en este 2° evento de procesamiento, lo más probable es que Cas9 esté implicada en esta 2a escisión. Considerando esta posición de escisión dentro de la secuencia espaciadora, toda la secuencia espaciadora no contribuye al reconocimiento de la diana, en cambio, solo se utiliza una secuencia espaciadora de 20 nt para la hibridación.

(SEQ ID NO: 132)

5 ' -g g a a c c a u u c a

*CAAACCCUGGUAA-5 ’ pre-ARNcr (SEQ ID NO: 134)

a

cu u u u aaaqu u cu qcaau qGUllUgRGA GCUAUGCTGtKJUUG- 3 ^'

u aaaau u q a a c q a u a c q a c a a a - 5 ' agccacggugaaaaaguucaacuauugccugaucggaa

g

u c g g q g c u u u u iiu u -3 ’ ARXcrtra (SEQ ID NO: 133)

El segundo evento de procesamiento también se puede representar de la siguiente manera: El 2° punto de escisión está indicado por flechas alrededor de 20 nt desde el extremo 3' de la secuencia espaciadora en la figura anterior. La nota anterior citada de Nature, y el presente comentario, se aplica.

La secuencia espaciadora en cursiva CR90 está en el cuadro.

Escisión de ADN diana

Se muestra la parte de la secuencia de ADN de betalactamasa diana que contiene CR90. El ARNcr se híbrida con su secuencia complementaria de la región diana, los puntos de escisión con Cas9 se indican con un punto "." y la secuencia PAM tgg se indica en el cuadro.

(SEQ ID NO: 136)

a c t t t t a a a g t t c t g c t . a t g cadena antiprotoespaciadora

5 ' . . . c c a a g t c a [ tg g jc g c g g ta . . . 3 f (SEQ ID NO: 137)

3 ' . . . g g t t c a g t a c c g c g c c a t . . . 5 ' (SEQ ID NO: 138)

t g a a a a t t t c a a g a e g a . t a c cadena protoespaciadora

(SEQ ID NO: 139) 5 ' -a e a u u a a a a q u u c u g e u a u g q UUUUAGA GCUAUGCTGUUUUG- 3 ' A R N c r

u a a a a w ig a a c g a u a c g a a a a a - 5 '

a g c c a c g g u g a a a a a g u u c a a c u a u u g c c u g a u c g g a a

g

u c g g u g c u u u u u u u -3 ' A R X c rtra

A continuación se muestra una descripción alternativa de la escisión del ADN diana. En el presente documento, la parte de la secuencia de ADN de betalactamasa diana que contiene la secuencia protoespaciadora CR90 se muestra en letras negras en minúsculas. El ARNcr se hibrida con su secuencia complementaria de la cadena protoespaciadora, los puntos de escisión con Cas9 se indican mediante flechas de puntos y la secuencia PAM tgg está subrayada.

Ejemplo 2

Los siguientes experimentos describen algunos experimentos de viabilidad realizados para demostrar que el sistema CRISPR-Cas9 se puede utilizar para inactivar la resistencia a antibióticos en bacterias. Describen la construcción de un casete de ADN de aplicación general, descrita en los Ejemplos para administrar el sistema CRISPR-Cas9 más un derivado que porta una secuencia espaciadora dirigida contra un gen de resistencia a antibióticos para su administración mediante transformación de ADN desnudo e infección por bacteriófagos y también para demostrar la inhibición de la propagación de resistencia a antibióticos mediante conjugación de plásmidos.

Construcción de pNB100

pNB100 es un vector para expresar el sistema CRISPR-Cas9 en E. coli con el sitio de restricción único apropiado, Bsal, para clonar cualquier secuencia espadadora deseada entre dos repeticiones directas en el locus CRISPR. La cadena principal del vector procede de pACYC184 y el locus CRISPR-cas9 se inserta en el sitio Eco RV del vector. Se amplificaron tres regiones del locus CRISPR-cas9 mediante PCR a partir del ADN genómico de la cepa SF370 de Streptococcus pyogenes, adquirido de la ATCC y ensamblado mediante el ensamblaje Gibson (Gibson DG, et. al. Nature Methods 2009; 6: 343-345) junto con el vector pACYC184 en la reacción. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de Sanger. La actividad de CRISPR-Cas9 se confirmó utilizando un derivado de pNB100, pNB102, que porta una secuencia espaciadora dirigida contra los genes betalactamasa de los transposones bacterianos Tn3 y Tn1.

La secuencia amplificada de las tres regiones y la imagen del amplicón en el gel

Las siguientes secuencias son las tres regiones amplificadas mediante PCR. Las secuencias subrayadas son secuencias de cebadores específicas de plantilla, las letras en negrita son secuencias superpuestas utilizadas para el ensamblaje Gibson.

1. Fragmento 1 (SEQ ID NO: 140), ARNcrtra-cas9: longitud del amplicón = 4758 pb El cebador directo es de 854170 a 854193 y el cebador inverso es de 858867 a 858848 en el ADN genómico de SF370 de S. pyogenes.

ATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATCCAGAAGTCTTTTTCTTGCACTGTTTCCTTTTCTTTATGATAGTTTACGAAATCATCC

TGTGGAGCTTAGTAGGTTTAGCAAGATGGCAGCGCCTAAATGTAGAATGATAAAAGGATTAAGAGATTAATTTCCCTAAAAATGATAA

AACAAGCGTTTTGAAAGCGCTTGTTTTTTTGGTTTGCAGTCAGAGTAGAATAGAAGTATCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTT

TTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATGCTGTTTTGAATGGTTCCAACAAGATTATTTTATAACTTTTATAACAA

ATAATCAAGGAGAAATTCAAAGAAATTTATCAGCCATAAAACAATACTTAATACTATAGAATGATAACAAAATAAACTACTTTTTAAA

AGAATTTTGTGTTATAATCTATTTATTATTAAGTATTGGGTAATATTTTTTGAAGAGATATTTTGAAAAAGAAAAATTAAAGCATATT

AAACTAATTTCGGAGGTCATTAAAACTATTATTGAAATCATCAAACTCATTATGGATTTAATTTAAACTTTTTATTTTAGGAGGCAAA

AATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCT

AAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAG

CGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAA

TGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCT

ATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTG

ATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCC

TGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGA

GTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAA

ATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATT

ACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCT

AAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTA

AACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTT

TGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAA

AAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTC

CCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGAT

TGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCT

GAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTG

ATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAA

ATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGA

AAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGAT

TTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTT

AGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGAT

AAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAAT

CTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATT

TAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATT

AAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAA

TGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGG

AAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGAC

ATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATT

CAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAA

AAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGT

GAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCA

TGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAA

AGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTG

ATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGC

AAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGA

GATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAA

GTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAA

ATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCT

AGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCC

TTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTC

TTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATA

TGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAG

CATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTC

TTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGC

TCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCAT

CAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATT GATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGATGGCCACGTGAACTATATGATTTTCCGC

AGTATA

2. Fragmento 2 (SEQ ID NO: 141), Líder y primera repetición directa: longitud del amplicón = 276 pb El cebador directo es de 860648 a 860671 y el cebador inverso es de 860862 a 860806 en el ADN genómico de S. pyogenes.

ATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGATGGCCACGTGAACTATATGATTTTCCGCAGTATATTTTAGATGAAGATTATTTCTTAA

TAACTAAAAATATGGTATAATACTCTTAATAAATGCAGTAATACAGGGGCTTTTCAAGACTGAAGTCTAGCTGAGACAAATAGTGCGA

T TAC GAAAT T T T T TA GACAAAAATAGTCTACGAGGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACTGAGACCAGTCTCGGACG

TCCAAAGGTCTC

3. Fragmento 3 (SEQ ID NO: 144), Segunda repetición directa: longitud del amplicón = 452 pb El cebador directo es de 861221 a 861276 y el cebador inverso es de 861613 a 861594 en el ADN genómico de S. pyogenes. Secuencia decámero de 861246-861255 GGTCTCCATT (SEQ ID NO: 142), que contiene secuencia de reconocimiento SsaI en el ADN genómico, se sustituyó por GGTCCCAAAA (SEQ ID NO: 143) para destruir la secuencia de reconocimiento SsaI y convertir la 7a repetición directa truncada en la matriz CRISPR del genoma en la 2a secuencia de repetición directa canónica en este vector.

GAGACCAGTCTCGGACGTCCAAAGGTCTCGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACAACATTGCCGATGATAACTTGAG

AAAGAGGGTTAATACCAGCAGTCGGATACCTTCCTATTCTTTCTGTTAAAGCGTTTTCATGTTATAATAGGCAAAAGAAGAGTAGTGT

GATGGAACAAACATTTTTTATGATTAAGCCATATGGGGTTAAGCAAGGGGAGGTAGTTGGAGAGGTTTTACGGTGGATTGAACGCCTA

AGATTTACGTTTAAGCGATTCGAGCTAAGACAAGCTAGTTCGAAATACTTGGCTAAGCACGACGAGGCCTTGGTGATAAACCTTTTGA

TCCTAAACTTAAAGCTTACATGACAAGTGGTCCTGTTTTAATTGGGATAATTCTTGGGGACTAAGGTGGTATCGTCCATTCCGACAGC

ATCGCCAGTCAC

Las condiciones de PCR para generar los tres fragmentos fueron:

Los resultados que muestran los amplicones de PCR se proporcionan en la Figura 11.

Ensamblaje de pNB100 a partir de tres amplicones de PCR, ARNcrtra-cas9, líder y primera repetición directa, segunda repetición directa; más pACYC184 digerido con EcoRV

Se empleó un kit de ensamblaje Gibson de NEB (E5510) y se siguió el protocolo proporcionado por el fabricante para ensamblar los tres amplicones de PCR anteriores junto con pACYC184. El componente de cada fragmento en la reacción de ensamblaje se muestra en la siguiente tabla.

Se transformaron 2 pl de la reacción de ensamblaje en células competentes DH5a (adquiridas de New England Biolabs) seguido de selección en placas LB de cloranfenicol (35 pg/ml). Los recombinantes se cribaron mediante PCR utilizando los tres conjuntos de cebadores utilizados para obtener los tres fragmentos iniciales. Las plantillas de plásmido que daban tres amplicones deseados se aislaron de los clones candidatos y se sometieron a análisis de secuencia.

La secuencia de la construcción final de pNB100 (SEQ ID NO: 145)

GAATTCCGGATGAGCA TTCA TCAGGCGGGCAAGAA TGTGAA TAAAGGCCGGA TAAAACTTGTGCTTA TTTTTCTTTACGG

TCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGT TCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGA AAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGAT CAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAG TGATCTTCCGTCACAGGTATTTATTCGGCGCAAAGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAACTTACTGATTTAGTGTATGATGGT GTTTTTGAGGTGCTCCAGTGGCTTCTGTTTCTATCAGCTGTCCCTCCTGTTCAGCTACTGACGGGGTGGTGCGTAACGGC AAAAGCACCGCCGGACATCAGCGCTAGCGGAGTGTATACTGGCTTACTATGTTGGCACTGATGAGGGTGTCAGTGAAGTG CTTCATGTGGCAGGAGAAAAAAGGCTGCACCGGTGCGTCAGCAGAATATGTGATACAGGATATATTCCGCTTCCTCGCTC ACTGACTCGCTACGCTCGGTCGTTCGACTGCGGCGAGCGGAAATGGCTTACGAACGGGGCGGAGATTTCCTGGAAGATGC CAGGAAGATACTTAACAGGGAAGTGAGAGGGCCGCGGCAAAGCCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACAAGCATCA CGAAATCTGACGCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGCGGCTCCC TCGTGCGCTCTCCTGTTCCTGCCTTTCGGTTTACCGGTGTCATTCCGCTGTTATGGCCGCGTTTGTCTCATTCCACGCCT GACACTCAGTTCCGGGTAGGCAGTTCGCTCCAAGCTGGACTGTATGCACGAACCCCCCGTTCAGTCCGACCGCTGCGCCT TATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGAAAGACATGCAAAAGCACCACTGGCAGCAGCCACTGGTAATTGATTT AGAGGAGTTAGTCTTGAAGTCATGCGCCGGTTAAGGCTAAACTGAAAGGACAAGTTTTGGTGACTGCGCTCCTCCAAGCC AGTTACCTCGGTTCAAAGAGTTGGTAGCTCAGAGAACCTTCGAAAAACCGCCCTGCAAGGCGGTTTTTTCGTTTTCAGAG CAAGAGATTACGCGCAGACCAAAACGATCTCAAGAAGATCATCTTATTAATCAGATAAAATATTTCTAGATTTCAGTGCA ATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATC GATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCT CATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGG ATCCAGAAGTCTTTTTCTTGCACTGTTTCCTTTTCTTTATGATAGTTTACGAAATCATCCTGTGGAGCTTAGTAGGTTTA G C AAGAT G G C AG C G C C T AAAT G T AGAAT GAT AAAAG GAT T AAGAGAT T AAT T T C C C T AAAAAT GAT AAAAC AAG C G T T T T GAAAGCGCTTGTTTTTTTGGTTTGCAGTCAGAGTAGAATAGAAGTATCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCA AGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATGCTGTTTTGAATGGTTCCAACAAGATTATTTTATAACTTTTATA A CAAA TAA T CAA GGA GAAA T T CAAA GAAA T T T A T CAGC CA TAAAA CAAT AC T T AAT AC TAT AGAAT GAT AAC AAAAT AAA CTACTTTTTAAAAGAATTTTGTGTTATAATCTATTTATTATTAAGTATTGGGTAATATTTTTTGAAGAGATATTTTGAAA AAGAAAAAT TAAAG CATAT TAAAC TAAT T T C G GAG G T CAT TAAAAC TAT TAT T GAAAT CAT CAAAC T CAT TAT G GAT T TA ATTTAAACTTTTTATTTTAGGAGGCAAAAATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAAI'AGCGTCGGA TGGGCGGTGAt GAGTGATGAATATAAGGTTCGGTCTAAAAA:;TTCAAGGTTGTGGGAAATA::AGAGCGCGA:AGTATCAA AAAAAATCTTATAGGGGCTOTTTTATTTGAGAGTGGAGAGACAGGGGAAGGGACTCGTGTCAAAGGGACAGCTCGTAGAA GGTATACACGt CGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTC TTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGA T GAAG T T G C T TAT C A T GAGAAAT A T C C AAC TAT C TAT C A T C T G C GAAAAAAAT T G G T AGAT T C TAC T GAT AAAG C G GAT T TGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGAT AAT AG T GAT G T G GAC AAAC TAT T TAT C C AG T T G G TAC AAAC C TAC AAT CAAT TAT T T GAAGAAAAC C C TAT TAAC G C AAG TGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCG GTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGAT T T G G C AGAAGAT G C T AAAT T AC AG C T T T C AAAAGAT AC T TAC GAT GAT GAT T T AGAT AAT T TAT T G GC G C AAAT T G GAGA TCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTG AAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCT T T AG T T C GAC AAC AAC T T C C AGAAAAG T A T AAAGAAAT C T T T T T T GAT CAAT C AAAAAAC G GAT A T GC AG G T T A T A T T GA T G G G G GAG C T AG C C AAGAAGAAT T T TAT AAAT T TAT C AAAC CAAT T T T AGAAAAAAT G GAT G G TAC T GAG GAAT TAT T G G TGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGT GAG C T G C A T G C TAT T T T GAGAAGAC AAGAAGAC T T T TAT C C AT T T T T AAAAGAC AAT C G T GAGAAGAT T GAAAAAAT C T T GACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAG AAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAAC T T T GAT AAAAAT C T T C C AAAT GAAAAAG TAC TAC C AAAAC ATAG T T T G C T T TAT GAG TAT T T TAC G GT T TAT AAC GAAT T GAC AAAG G T C AAAT A T G T TAC T GAAG GAAT G C GAAAAC C AG C A T T T C T T T C AG G T GAAC AGAAGAAAG C CAT T G T T GAT T TAC T C T T C AAAAC AAAT C GAAAAG TAAC C G T T AAG CAAT T AAAAGAAGAT TAT T T CAAAAAAAT AGAAT G T T T T GAT AG T G T T GAAAT T T C AG GAG T T GAAGAT AGAT T T AAT G C T T CAT T AG G TAC C TAC CAT GAT T T G C T AAAAAT TAT T AAAGAT A A AGAT T T T T T G GAT AAT GAAGAAAAT GAAGAT A T C T T AGAG GAT A T T G T T T T AAC A T T GAC C T TAT T T GAAGAT AG G GAGA T GAT T GAG GAAAGAC T T AAAAC A TA T G C T C AC C T C T T T GAT GAT AAG G T GAT GAAAC AG C T T AAAC GTCGCCGT T A T AC T GGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAA A T C AGAT GGTTTTGC CAAT C G CAAT T T TAT G C 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ATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACT

TGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCA

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CGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCG

CAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTT

TACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCA

AGGGTAGGTTATTGAGTGCTAGTGGTTGCTAAGGTGGA^ATAGGGA^ATGGA^GAAGTTA^AATCGGTTAAAGAGTTACT

AGGGATGAGAATTA í^GAAAGAAGTTGCTTTGAAAAAAATCCGA íGa IAGTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTA

AAAAAGAGTTAATGAIAAAACTAGCTAAAAATAGTGTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCC

GGAG ¡ C AA AT AT G T GA AT T T T T TATAT T TAG C TAG T C AT TA T G AA AA

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T AAAT A T T T T GAT AC AAC AAT T GAT C G T AAAC GAT A T AC G T C T AC AAAAGAAG T T T TAGAT G C C AC T C T T A T C C A T C AAT

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C C GCAGTATAT T T TAGAT GAAGAT TAT T T C T TAATAAC TAAAAATAT GGTATAATAC T C T TAATAAATGCAGTAATACAG

GGGCTTTTCAAGACTGAAGTCTAGCTGAGACAAATAGTGCGATTACGAAATTTTTTAGACAAAAATAGTCTACGAGGTTT

TAGAGCTATGCTATTTTGAATGGTCCCAAAACTGAGACCAGTCTCGGACGrCCAAAGGrCTCGTTTTAGAGCTATGCTGT

TTTGAATGGTCCCAAAACAACATTGCCGATGATAACTTGAGAAAGAGGGTTAATACCAGCAGTCGGATACCTTCCTATTC

T T T C T G T T AAAG C G T T T T C A T G T TAT AAT AG G C AAAAGAAGAG TAG T G T GAT G GAAC ATAC A T T T T T TAT GAT T AAG C C A

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TTACATGACAAGTGGTCCTGTTTTAATTGGGATAATTCTTGGGGACTAAGGTGGTATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCA

GTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGC

TTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCT

GTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACA

TCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTG

GCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACT

GGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCT

TCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCG

GCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGG

AATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCG

GCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTT

CTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCT

TCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCATTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGG

CGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCA

TGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAAT

CAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCG

CACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGC.CACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAG

GCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACG

TCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCCCCTACGTG

CTGCTGAAGTTGCCCGCAACAGAGAGTGGAACCAACCGGTGATACCACGATACTATGACTGAGAGTCAACGCCATGAGCG

GCCTCATTTCTTATTCTGAGTTACAACAGTCCGCACCGCTGTCCGGTAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATC

GTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCAC

GGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGC

TACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTAACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCA

TATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTT

CCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTC

GAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAA

TAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATG

GAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCA

TGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCT

GAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATA

TATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGG

TGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACG

El número total de nucleótidos es 9578 pb. La secuencia de la cadena principal del vector pACYC184 está en cursiva, las posiciones de secuencia están numeradas a partir de G del sitio EcoRI (GAATTC) subrayado. El ARNcrtra se ubica en el nucleótido N.° de 1889 a 1974 indicado en negrita, los codones de iniciación y terminación de Cas9 se indican con tres letras en negrita, comenzando en el nucleótido N.° 2270 y terminando en el 6376 seguido de la secuencia líder 6462-6556 indicada por letras en negrita en cursiva, la primera y la segunda secuencia de repetición directa están subrayadas, entre las cuales se ubica la región de clonación espaciadora (30 mer). Esta región de clonación espaciadora contiene dos sitios Ssal invertidos indicados por letras en negrita y cursiva 5'-GAGACC-3' y 5'-GGTCTC-3' para crear cuatro bases en 5' que sobresalen de los sitios de clonación espaciadores 5'-GTTT-3' y 5'-TTTT-3', respectivamente, y un único sitio ^afII (5'-GACGTC-3') también indicado en negrita y cursiva para reducir la autoligación en caso de digestión incompleta con BsaI. Hay que tener en cuenta los cambios de base de transición y conversión G6573A, A6779T que se detectaron mediante secuenciación Sanger y que se muestran en negrita, respectivamente. Sin embargo, estas mutaciones puntuales no afectan la actividad CRISPR-Cas9, que se mostrará en la sección posterior. Los dos sitios únicos, SalI (GTCGAC) y XbaI (TCTAGA) resaltados en letras en negrita y cursiva se utilizan para aislar la construcción CRISPR/Cas9 para la clonación en M13mp18. En la Figura 12 se muestra un mapa plasmídico de pNB100.

La secuencia espaciadora deseada se puede clonar en el sentido de las agujas del reloj entre los sitios Bsa. Este vector contiene el origen p15A en 1393-848 y el gen cat (resistente a cloranfenicol) en 219-9137. Las posiciones de corte de cada enzima de restricción, indicadas entre paréntesis, se refieren a la posición de los sitios de corte en 5' en la cadena superior dentro de la secuencia de reconocimiento.

Construcción de pNB102

pNB100 se digirió con Bsayo y AatII seguido de purificación utilizando perlas Agencourt AMPure. Se empleó la secuencia espaciadora CR30 de la discusión en B. Selección de secuencia espaciadora a partir de secuencia diana en la sección de Materiales y Métodos anterior. La secuencia CR30 es la siguiente:

5'-AAACACTTTAAAAGTGCTCATCATg (SEQ ID NO: 117)

tgaaattttcacgagtagtacAAAA-5' (SEQ ID NO: 118)

Este casete de ADN bicatenario se genera mediante desnaturalización a 95 °C durante 1 minuto y reasociación a -1 grado cada minuto a 30 °C en el tampón de ligasa 1 x T4 (Tris-HCI 50 mM (pH 7,5 a 25 °C), MgCl2 10 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM) más NaCl 50 mM después de la reacción de cinasa para añadir una fracción fosfato en el extremo 5' de cada oligonucleótido. El casete hibridado contiene en 5' cuatro bases que sobresalen compatibles con bases en ambos extremos para los sitios creados en pNB102 mediante la digestión con BsaI. Este casete CR30 se ligó a pNB100 mediante ADN ligasa T4 y se transformó en células Dh5a competentes (adquiridas en New England Biolabs). Los transformantes se seleccionaron en una placa LB de cloranfenicol y se cribaron mediante PCR con la secuencia inferior del casete CR30 como cebador inverso y cebador directo CF1: 5'-acgttgacgaatcttggagc, que se hibrida en la región 6209-6228 del plásmido recombinante para generar un amplicón de PCR de 409 pb. Los clones PCR positivos se secuenciaron para confirmar la secuencia espaciadora CR30 y este clon recombinante se designa como pNB102 y se usa para experimentos de alteración in vitro del gen betalactamasa. El espaciador CR30 se hibrida con la cadena de sentido del gen betalactamasa y escinde los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos 188 y 189 en la cadena de sentido y antisentido.

Construcción de M13mp18::NB102

pNB102 se digirió con sitios de restricción únicos SalI y XbaI para generar dos fragmentos de 6044 pb y 3524 pb. La longitud de los fragmentos se calculó a partir del extremo 5' de los sitios de restricción en la cadena superior dentro de los sitios de reconocimiento de restricción. Los fragmentos de 6044 pb que contenían el locus CRISPR con la secuencia espaciadora CR30 en la matriz CRISPR se separaron del fragmento de 3524 pb y se purificaron en el gel de agarosa preparatorio al 1 %. M13 mp18 se digirió con Sall-XbaI, seguido de la purificación Agencourt AMPure para eliminar el fragmento de seis bases Sall-XbaI de la reacción. Estos dos fragmentos purificados se combinaron y ligaron mediante ADN ligasa T4 y se transformaron en células competentes DH5aF'Iq (adquiridas en New England Biolabs). Las células transformadas se sembraron en placas junto con células DH5aF'Iq recién cultivadas como indicador de bacteriófagos y una solución de IPTG/X-gal como indicador de color azul-blanco con agar superior fundido en placa LB. Las placas blancas recogidas del césped se seleccionaron mediante PCR para detectar la presencia de la secuencia espaciadora CR30. Las construcciones de bacteriófagos correctas obtenidas se purificaron mediante aislamiento de placa única dos veces. La longitud total de la secuencia de la construcción final es 13288 pb. Este espaciador CR30 positivo recombinante se designa como M13mp18::NB102 y se utilizó para experimentos de inactivación de genes bla mediados por administración de bacteriófagos M13.

Administración de construcciones CRISPR-Cas9 a bacterias

Habiendo construido el plásmido CRISPR-Cas9 pNB100 y el plásmido derivado pNB102 que porta una inserción espaciadora dirigida contra los genes betalactamasa (bla) codificados por los elementos bacterianos transponibles Tn1 y Tn3, luego se buscó demostrar, utilizando tres métodos de administración, (i) conjugación de plásmidos, (ii) transformación de ADN plasmídico, (iii) infección por bacteriófagos, que las células bacterianas que llevan copias de la construcción CRISPR-Cas9 con inserción espaciadora-bla no podrían crecer en presencia del antibiótico betalactámico ampicilina.

Las construcciones que son capaces de inactivar genes diana, incluyendo genes resistentes a antibióticos, a través del sistema CRISPR-Cas, y que son un aspecto de la presente invención también se denominan en el presente documento "simbióticos Nemesis".

Ensayo de "actividad de simbióticos Nemesis" (ASN) mediante conjugación de plásmidos: un experimento de profilaxis

Se demostró en el presente documento que los simbióticos Nemesis pueden prevenir la propagación de la resistencia a antibióticos mediante la inhibición de la transferencia conjugada de plásmidos conjugativos que portan genes de resistencia a antibióticos desde una célula donante a una célula receptora que porta los simbióticos Nemesis. Para hacer esto, se apareó una célula receptora que porta los simbióticos Nemesis con una célula donante que porta un plásmido conjugativo, más un plásmido movilizable multicopia que porta el gen bla que codifica la resistencia a ampicilina. En un apareamiento exitoso, el plásmido conjugativo se transferirá a sí mismo más el plásmido movilizable que porta resistencia a ampicilina al receptor. Los exconjugantes pueden seleccionarse por su resistencia tanto al cloranfenicol presente en un plásmido no movilizable en el receptor como a la ampicilina recibida del donante. La actividad exitosa de simbióticos Nemesis reducirá la eficacia de transferencia de la resistencia a ampicilina.

La célula receptora DH5a (F- endAI glnV44 thi-1 recAI relAI gyrA96 deoR nupG 080dlacZAM15 A(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), A-) se adquirió en New England Biolabs y se transformó con los plásmidos pNB100 o pNB102 o pACYC184, donde los plásmidos codifican resistencia a cloranfenicol y tanto pNB100 como pNB102 portan CRlSPR-Cas9 pero solo pNB102 porta la secuencia espaciadora dirigida contra el gen betalactamasa. El plásmido pACYC184 es el plásmido parental no movilizable usado para la construcción de pNB100 y pNB102 como se describió anteriormente.

La cepa donante JA200 (F+ thr-1, leu-6, DE(trpE)5, recA, lacY, thi, gal, xyl, ara, mtl) que también porta el plásmido pNT3 se describe en Saka et al. DNA Research 12, 63-68 (2005). El plásmido pNT3 es un plásmido movilizable que porta el gen bla de Tn1.

Se recogió una única colonia del donante JA200 pNT3 de una placa de caldo Luria (LB) que contenía 100 pg/ml de ampicilina y se hizo crecer con agitación a 37 °C durante la noche en 1 ml de medio LB con 100 pg/ml de ampicilina. Se recogió una única colonia de cada uno de los receptores, DH5a pNB100 y DH5a pNB102 de una placa LB que contenía 35 pg/ml de cloranfenicol y se cultivó con agitación a 37 °C durante la noche en 1 ml de LB con 35 pg/ml de cloranfenicol. Para lavar las células para eliminar los antibióticos, se añadieron 50 pl de células a 1 ml de LB en tubos Eppendorf y se centrifugaron durante 60 segundos a 12500 rpm. Las células se resuspendieron en 50 pl de LB. Para configurar el apareamiento, se colocó JA200 pNT3 en una placa LB, luego se añadieron a este punto 2 pl de cada DH5a que porta pNB100 y pNB102. También se realizaron manchados separados de 2 pl del donante y los receptores (es decir, no apareados). Las placas se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Las células se retiraron, se resuspendieron en LB y se sembraron 100 pl en placas LB que contenían tanto ampicilina 100 pg/ml como cloranfenicol 35 pg/ml (LB ApCm). También se colocaron en placas LB 100 pl de diluciones 10.000 veces (10A-4) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Las colonias resultantes se contaron como se muestra en la Tabla siguiente.

Las fotografías de la Figura 13 muestran las placas de los apareamientos entre: (A) JA200 pNT3 x DH5a pNB100 (como se esperaba sin actividad de simbióticos Nemesis); y (B) JA200 pNT3 x DH5a pNB102 (que muestra actividad de simbióticos Nemesis).

La dilución 10A-4 colocada en placas LB, dio aproximadamente 500 colonias, un recuento de 5 x 10A7 células por ml en la suspensión de células apareadas y para JA200 pNT3 x DH5a pNB102 solo se pudieron cultivar 3,7 x 10A2 células/ml en las placas LB Ap1 00Cm35. Por lo tanto, asumiendo que la mitad de las células son receptoras/exconjugantes entonces: 3,7 x 10A2 células/ml dividido por 2,5 x 10A7 da una eficacia de apareamiento para el receptor que porta pNB102 de 1,2 x 5 x 10A-5

El experimento demostró una reducción significativa en los exconjugantes CmRApR en apareamientos con DH5a que portan pNB102 frente a pNB100 x JA200 pNT3.

Para medir las eficacias relativas de apareamiento con mayor precisión, después de un líquido, las células de apareamiento se sembraron en placas LB para valorar todas las células, placas LB Ap100 para valorar los donantes más los exconjugantes, placas LB Cm para valorar los receptores más los exconjugantes y LB Ap100Cm35 para valorar solo los exconjugantes.

Para el apareamiento líquido durante la noche, se mezclaron cultivos de 10 pl de JA200 pNT3 con 10 pl de receptores DH5a pNB100 o Dh5a pNB102. Se añadieron 200 pl de LB y los tubos se incubaron durante la noche a 37 °C. Las mezclas de apareamiento se diluyeron 10A-1, 10A-3, 10A-5 en LB y 50 pl de diluciones se sembraron en placas LB, LB Ap100Cm35, LB Ap100 y LB Cm35 y las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. La siguiente tabla resume los valores de células obtenidos.

El número de células en las placas LB Cm más LB Ap debe ser igual al número de células en las placas LB. Para pNB100 1,40 x 10A8 (placas Cm) más 2,64 x 10A8 (placas Ap) = 4,04 x 10A8 que concuerda muy bien con 4,14 x 10A8 en placas LB. Para pNB1021,78 x 10A8 (placas Cm) más 3,8210A8 (placas Ap) = 5,6 x 10A8 que concuerda muy bien con 5,16 x 10A8 en placas LB.

En conclusión, los datos muestran que después del apareamiento durante la noche en cultivo líquido, hay una reducción de 5000 veces en la eficacia de apareamiento por receptor comparando pNB102 con el espaciador con pNB100 que carece de espaciador.

Ensayo ASN mediante transformación de plásmido

En este experimento, se demostró que la introducción de simbióticos Nemesis en células receptoras mediante la transformación de ADN inactiva la resistencia a antibióticos en los transformantes.

Para obtener una cepa de prueba, se transformaron células competentes DH5a adquiridas en New England Biolabs con pBR322 (que porta el gen bla procedente de Tn3) y se seleccionaron en placas LB Ap100. A continuación, se prepararon células competentes de la cepa derivada DH5a pBR322 usando el protocolo CaCl2 25 (1,116) como describen Sambrook y Russell en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001) y posteriormente se transformaron con plásmidos pNB100, pNB102 y pACYC184 con selección para CmR. Después, las colonias transformantes se recogieron en placas LB Cm35 y LB Ap100. Los transformantes primarios se recogieron en réplicas en placas LB Cm35 y LB Ap100 y se incubaron durante la noche a 37 °C.

Los resultados, como se muestra en la Figura 14, muestran que todas las colonias extraídas de DH5a pBR322 transformadas por pNB100 (que carecen de la secuencia espaciadora diana del gen bla) siguen siendo resistentes a ampicilina. En contraste, todas las colonias extraídas de DH5a pBR322 transformadas por pNB102 han perdido resistencia a ampicilina, lo que demuestra la actividad de simbióticos Nemesis.

Los experimentos anteriores no dan un valor para la fracción de transformantes primarios donde la ASN ha inactivado el gen bla. Para abordar esto, se recogieron colonias individuales de los transformantes primarios en 1 ml de LB y se diluyeron 10A-3 en LB. Luego se colocaron 100 pl en placas de la siguiente manera y se puntuaron los resultados. Los resultados mostraron que después de la transformación de DH5a pBR322 con pNB102, menos de 10A-6 células retienen ApR. La actividad de simbióticos Nemesis es muy eficaz.

Ensayo de la ASN mediante infección por bacteriófago M13

En este experimento, se demostró que la introducción de simbióticos Nemesis en células receptoras mediante infección por bacteriófagos inactiva la resistencia a antibióticos en los transformantes. Se eligió el bacteriófago filamentoso específico masculino M13 como agente de administración para la construcción de simbióticos Nemesis. Se utilizó un derivado de M13 M13mp18::NB102 que porta el Cas9 CRISPR más la región espaciadora diana del gen bla de pNB102 para administrar el simbiótico Nemesis mediante la infección de una cepa F+, JA200, que porta resistencia a ampicilina en el plásmido pNT3. Se añadieron 0,2 ml de un cultivo reciente de esta cepa a 3 ml de agar superior LB (caldo Luria con agar al 0,7 %) y se vertieron en una placa LB. A continuación, se esparcieron sobre el césped 2 pl de reservas de bacteriófagos M13mp18::NB102 (10A8 ufp/ml) y como control M13mp18 y la placa se incubó 8 horas a 37 °C. Las placas se recogieron en 1,5 ml de LB y se cultivaron con agitación durante la noche a 37 °C. También se cultivó durante la noche una cepa de control DH5a que carece de resistencia a ampicilina a partir de una única colonia recogida en 1,5 ml de LB.

Se realizó un ensayo de nitrocefina para la actividad de betalactamasa:

Se centrifugó 1 ml del cultivo de células durante 60 segundos a 12.500 rpm en microcentrífuga, luego se añadieron 2 |j| de nitrocefina de reserva (10 mg/ml en DMSO) a 1 ml de sobrenadante celular y se midió la absorbencia del producto de degradación de nitrocefina a 482 nm en un espectrofotómetro en varios puntos temporales después de la adición de nitrocefina. La siguiente Tabla resume los resultados.

Los experimentos informados anteriormente proporcionan el estudio de viabilidad de que, en el organismo modelo, Escherichia coli, las construcciones de ADN que portan la región Cas9 CRISPR más una región espaciadora con secuencias dirigidas contra una región diana del gen betalactamasa pueden inactivar la resistencia a ampicilina cuando se administran mediante transformación de ADN desnudo e infección por bacteriófagos, así como prevenir la transferencia de la resistencia a ampicilina mediante conjugación de plásmidos. Es evidente que los simbióticos Nemesis de la invención se pueden aplicar a bacterias patógenas y a otros genes de resistencia a antibióticos. Ejemplo 3

El objetivo del Ejemplo 3 es ampliar el estudio de viabilidad para la resurrección de la eficacia antibiótica mediante la introducción de una construcción CRlSPR/Cas9 en una cepa bacteriana patógena de Klebsiella pneumoniae. La resistencia a una clase más nueva de antibióticos betalactámicos, los carbapenémicos ha surgido en Enterobacteriaceae mediante la adquisición de nuevos genes bla que codifican betalactamasas capaces de degradar incluso los carbapenémicos. Las cepas de Klebsiella pneumoniae con resistencia a carbapenémicos, KPC, son causas importantes de morbilidad y mortalidad entre las infecciones hospitalarias y las asociadas a cuidados a largo plazo. Es de destacar la altísima mortalidad (alrededor del 30-70 %) entre los pacientes con bacteriemia o infecciones pulmonares.

El Ejemplo 3 muestra que una Klebsiella pneumoniae que porta un gen betalactamasa (bla) que confiere resistencia al antibiótico betalactámico, ampicilina, se vuelve sensible a la ampicilina después de la introducción de una construcción CRISPR/Cas9 modificada dirigida contra el gen bla. La misma construcción CRISPR/Cas9/anti-bla usada en el Ejemplo 1 o Ejemplo 2 se usa y se administra a Klebsiella pneumoniae mediante conjugación con una cepa donante que porta un plásmido conjugativo con CRlSPR/Cas9/anti-bla. El receptor exconjugante Klebsiella pneumoniae que porta el plásmido con la construcción CRlSPR/Cas9/anti-bla se selecciona en medios apropiados con contra-selección contra la célula donante y células de Klebsiella pneumoniae que no recibieron el plásmido. Como en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2, la eficacia de la construcción CRISPR/Cas9/anti-bla se evalúa mediante la comparación de un control negativo de una cepa exconjugante de Klebsiella pneumoniae que recibió un plásmido con CRISPR/Cas9 (es decir, que carece de la región antibla). Como en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2, la actividad betalactamasa puede detectarse mediante nitrocefina para contar las colonias blancas frente a las rojas. También como en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2, alternativamente, se observa que la actividad betalactamasa cuestiona directamente a las bacterias en la placa LB con/sin ampicilina y mide la fracción de colonias sensibles a ampicilina frente a las resistentes a ampicilina.

El experimento idéntico al descrito anteriormente también se evalúa utilizando en su lugar un CRlSPR/Cas9/antiblaCb, donde la construcción CRISPR/Cas9/anti-blaCb porta una región, anti-blaCb, dirigida contra un gen bla que codifica una betalactamasa capaz de descomponer los carbapenémicos y estar presentar en esa cepa particular de Klebsiella pneumoniae.

Ejemplo 4

El Ejemplo 4 proporciona rutas de administración para las construcciones terapéuticas. Todas estas rutas se aplican a aplicaciones veterinarias y humanas que se administran por vía oral, tópica, probiótica y para usar en líquidos de irrigación quirúrgica y apósitos para heridas.

Por vía oral: La construcción asesina que contiene bacteriófagos como principio activo se puede administrar por vía oral como preparación terapéutica estabilizada: ya sea - administrada antes de la terapia con antibióticos o administrada en forma de un adyuvante que forma complejo con un antibiótico. Los plásmidos conjugativos que contienen la construcción asesina como principio activo pueden administrarse como un cultivo de bacterias comensales que portan estos plásmidos para transmitir estos plásmidos a la flora intestinal generando así protección profiláctica contra futuras infecciones con patógenos bacterianos resistentes a antibióticos.

Por vía tópica: La construcción asesina que contiene bacteriófagos como principio activo puede administrarse por vía tópica como un medicamento estabilizado (pomada, aerosol, polvo, etc.): ya sea - administrado antes de la medicación antibiótica tópica; o administrado en forma de complejo con un medicamento antibiótico. La aplicación tópica de plásmidos conjugativos que contienen la construcción asesina como principio activo puede ser mediante un cultivo estabilizado de bacterias comensales que portan estos plásmidos para transmitir los plásmidos a la flora intestinal generando así protección profiláctica contra futuras infecciones con patógenos bacterianos resistentes a antibióticos.

Por vía probiótica: La construcción asesina que contiene bacteriófagos como principio activo puede administrarse de forma probiótica como un cultivo estabilizado de bacterias comensales (por ejemplo, Lactobacillus spp) que portan estos plásmidos para transmitir los plásmidos a la flora intestinal generando así protección profiláctica contra futuras infecciones con patógenos bacterianos resistentes a antibióticos. Un ejemplo de esto puede ser la administración profiláctica probiótica de dicha preparación a pacientes en entornos con un alto riesgo de infección con patógenos bacterianos resistentes a antibióticos tales como hospitales, residencias, escuelas, centros de trasplantes, etc. Otro ejemplo puede ser la administración de dicha preparación al ganado a través de alimentos para animales, limitando así el aumento y la transmisión horizontal de bacterias resistentes a antibióticos. El uso de la presente invención en ganado representa por tanto un medio para el tratamiento profiláctico (indirecto) de bacterias resistentes a antibióticos seres en humanos.

Líquidos de irrigación quirúrgica: La construcción asesina que contiene bacteriófagos como principio activo se puede añadir a líquidos de irrigación quirúrgica y también a aerosoles para desinfectar material contaminado. Los cultivos bacterianos comensales estabilizados que contienen plásmidos conjugativos que incorporan construcciones asesinas pueden añadirse como revestimientos a toallitas quirúrgicas y apósitos para heridas.

Ejemplo 5

En este ejemplo, se diseña una construcción para incluir múltiples moléculas de ARN guía donde cada molécula de ARN guía se transcribe mediante su propio promotor.

La Figura 16 ejemplifica un conjunto de secuencias espaciadoras que se han identificado que codifican 20 moléculas de ARN guía dirigidas contra 117 genes bla diferentes identificados en la base de datos NCBI ARDB para Klebsiella pneumoniae. Se muestran el tipo de gen betalactamasa, la secuencia espaciadora y el perfil de resistencia a antibióticos en Klebsiella pneumoniae obtenido de la base de datos NCBI ARDB.

Se recopilaron secuencias de genes betalactamasa de la base de datos ARDB con la palabra clave Klebsiella pneumoniae. Se eliminaron las secuencias redundantes y se utilizaron secuencias únicas para la alineación de secuencias múltiples utilizando el programa web Clustal Omega. Se eligió una secuencia canónica de cada grupo y se recogieron las secuencias espaciadoras de 20 nt previstas mediante el buscador de ARNg CRISPR/Cas9 del programa web Jack Lin. La secuencia espaciadora se eligió para maximizar la proporción de la secuencia protoespaciadora encontrada en las secuencias que pertenecen a la misma rama. Cada una de las secuencias espaciadoras de ejemplo que se muestran en la 4a columna tiene la capacidad de alterar los genes de la tercera columna.

Los genes betalactamasa utilizados en este análisis son: SHV-a = 1,2, 2a, 5, 5a, 11, 12, 14, 26, 27, 28, 31, 33, 38, 43, 44, 48, 55, 56, 60, 61,62, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,85, 89, 92, 98, 99, 101, 103, 106, 107, 108, 109, CTXM-b = 1, 3, 10, 12, 15, 22, 32, 54, 60, 62, 68, CTXM-c = 13, 14, 16, 18, 19, 24, 26, CTXM-d = 2, 35, 59, CTXM-e = 26, 63, TEM-f = 1, 1b, 3, ESBL, 139, KPC-g = 1, 2, 3, 4, OKP-h = A11, A12, A16, A17, B13, B-SB613, 6, LEN-i = 2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, GES-j = 1, 3, 4, 5, VIM-a = 1,2, 4, 12, 19, IMP-b = 4, 8, CMY-a = 2, 4, 25, 31, 36, LAT-b = 1, 2, CMY-c = 1, 8b, 10, 19, FOX-d = 1, 5, 7, OXA-a = 1, 30, 47, OXA-2, OXA-9, OXA-b = 10, 17.

Los antibióticos betalactámicos se clasificaron en cuatro clases, penámicos, cefémicos, carbapenémicos y monobactámicos. En la Figura 16 se enumera un nombre de antibiótico como ejemplo para cada clase. La betalactamasa, que puede abrir el anillo de betalactámico está indicado por R. Por ejemplo, el carbapenema se inactiva mediante k Pc . Para volver a sensibilizar las bacterias al carbapenémico, la secuencia espaciadora 5'-TTGTTGCTGAAGGAGTTGGG (SEQ ID NO: 45) debe emplearse en la matriz espaciadora e inactivar los genes KPC. Hay que tener en cuenta que la secuencia espaciadora para CMY-a se puede emplear para la escisión de LAT-b.

Análogamente, la Figura 17 ejemplifica un conjunto de secuencias espaciadoras que codifican 17 moléculas de ARN guía dirigidas contra 154 genes bla diferentes identificados en la base de datos CARD para Klebsiella pneumoniae. Se muestran el tipo de gen betalactamasa, la secuencia espaciadora y el perfil de resistencia a antibióticos en Klebsiella pneumoniae obtenido de la base de datos IIDR CARD.

Las secuencias de genes betalactamasa se recolectaron mediante la filtración de todos los genes betalactamasa recolectados con la palabra clave Klebsiella pneumoniae y se sometieron a alineación de secuencia múltiple utilizando el programa web Clustal Omega. Se eligió una secuencia canónica de cada grupo y se recopilaron las secuencias espaciadoras de 20 nt previstas mediante el buscador de ARNg CRISPR/Cas9 del programa web Jack Lin. La secuencia espadadora se eligió para maximizar la proporción de la secuencia protoespaciadora encontrada en las secuencias que pertenecen a la misma rama. Cada una de las secuencias espadadoras de ejemplo que se muestran en la 4a fila tiene la capacidad de alterar los genes de la tercera columna.

Los genes betalactamasa utilizados en este análisis son: SHV-a = 1a, 5, 2a, 11, 18, 20, 21, 22, 23, 28, 31, 32, 52, 55, 98, 99, 100, 106, 107, 110, 111, 121, 134, 136, 137, 140, 143, 144, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 168, 172, 173, 178, 179, CTXM-b = 10, 12, 15, 52, 54, 62, 71, 80, CTXM-c = 19, 81, 99, 147, TEM-f = 1, 162, 183, 192, 197, 198, 209, KPC-g = 3, 4, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16, 17, OKP-h = 5, 6, A1, A2, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B10, B11, B12, B13, B17, B18, B19, B20, LEN-i = 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, GES-j = 1, 3, 4, VIM-a = 4, 26, 27, 28, 33, 34, IMP-b = 32, 38, NDM-c = 1,9, 10, ACT-3, CMY-a = 25, 31, 56, 87, FOX-d = 8, 9, OXA-a = 1, 30, 47, OXA-1, OXA-a = 181, 204, 247, OXA-9.

Los antibióticos betalactámicos se clasifican en cuatro clases, penámicos, cefémicos, carbapenémicos y monobactámicos. En la Figura 17, se incluye un nombre de antibiótico como ejemplo en cada clase. La betalactamasa, que puede abrir el anillo de betalactámico está indicado por R. Por ejemplo, el carbapenema se inactiva mediante KpC. Para volver a sensibilizar las bacterias al carbapenémico, la secuencia espaciadora 5'-TTGTTGCTGAAGGAGTTGGG (SEQ ID NO: 45) debe emplearse en la matriz espaciadora e inactivar los genes KPC.

Ejemplo 6

En este ejemplo, se crea un polipéptido Cas de unión a ADN modificado que elimina y vuelve a sellar en lugar de dejar una DSB.

Como se ha descrito anteriormente, las DSB causadas por el polipéptido Cas de unión a ADN tal como CRISPR-Cas9 pueden ser letales para el replicón diana y pueden dar como resultado la muerte celular en lugar de, por ejemplo, la resensibilización a los antibióticos, si un gen de resistencia a antibióticos en el replicón se dirige a la inactivación. La muerte celular inmediata en lugar de dicha resensibilización a los antibióticos para su posterior destrucción por antibióticos puede aumentar la presión de selección contra la administración de las construcciones de direccionamiento. En lugar de DSB, se puede modificar el gen Cas9 para permitir el resellado de la secuencia diana después de la inactivación del gen mediante la introducción de una eliminación o inversión.

Tsai et al. (2014) han construido una fusión entre una proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) con el dominio de nucleasa de tipo silvestre de la endonucleasa de restricción Fok1 para aumentar la especificidad de escisión en células eucariotas. Proudfoot et al. (2011) han fusionado de manera similar dominios de reconocimiento de ADN de dedos de zinc con los dominios catalíticos de recombinasas para programar la recombinación específica de sitio en secuencias de ADN designadas.

En el presente documento de añadieron dominios de recombinasa apropiados a dCas9 para catalizar una reacción de recombinación en lugar de una DSB en una posición deseada guiada por ARN mediada por CRISPR en los genes diana.

La fusión de resolvasa Cas9, llamada Cas9R en la Figura 18, se dirige a los sitios deseados determinados por el dominio Cas9:secuencias espaciadoras de ARN guía; y la resolvasa fusionada se coloca en el sitio de recombinación. Para generar una eliminación entre dos sitios de recombinación: A y B, las resolvasas deben dimerizarse en cada sitio de recombinación. Por tanto, es necesario colocar dos Cas9R en estrecha proximidad en cada sitio de recombinación A1A2 y B1B2 designado por las secuencias codificadas por los espaciadores S1-S4. Las orientaciones correctas de A1 con respecto a A2 y B1 con respecto a B2 deberán determinarse experimentalmente.

La orientación del ARNg como se muestra en la Figura 19 ya está probada en el caso de FokI fusionado con dCas9 (Tsai el al., 2014) - es decir, las secuencias PAM de cada secuencia protoespaciadora en los sitios de recombinación se colocan directamente en los límites externos del sitio de recombinación de longitud completa. Por tanto, se emplea la misma configuración de la polaridad del ARNg hibridado.

Las Figuras 19 y 20 muestran un proceso esquemático de cómo esta resolvasa de fusión Cas9R resuelve la sinapsis y se recirculariza el ADN del replicón parental.

Ejemplo 7

Los siguientes experimentos describen algunos experimentos de viabilidad realizados para demostrar que el sistema CRISPR-Cas9 se puede usar en una sola construcción para inactivar una gran cantidad de diferentes genes betalactamasa que se pueden encontrar entre patógenos microbianos, así como entre los miembros no patógenos del microbioma.

En estas ejemplificaciones, se construyen plásmidos que portan el sistema CRISPR-Cas9 más derivados que portan secuencias espadadoras, flanqueadas por repeticiones directas, dirigidas contra hasta ocho de las siguientes familias de betalactamasas de genes de resistencia: SHV, CTX-M, TEM, KPC, VIM, IMP, NDM y OXA.

Para cada una de estas ocho familias de genes betalactamasa, se diseña un solo espaciador que se dirigirá a varios miembros génicos de esa familia. Estos son: SHV-a = 1, 1a, 2, 2a, 5, 5a, 11, 12, 14, 18, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 28, 31, 32, 33, 38, 43, 44, 48, 52, 55, 56, 60, 61, 62, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 89, 92, 98, 99, 100, 101, 103, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 121, 136, 134, 137, 140, 143, 144, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 168, 172, 173, 178, 179; CTXM-b = 1, 3, 10, 12, 15, 19, 22, 32, 52, 54, 59, 60, 62, 68, 71, 80, 81, 99, 141, 147; TEM-c = 1, 1B, 3, 139, 162, 183, 192, 197, 198, 209; KPC-d = 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16, 17; VIM-e = 1, 2, 4, 19, 26, 27, 33, 34; IMP-f = 4, 8, 32, 38; y NDM-g = 1, 9, 10.

La Figura 21 muestra las ocho secuencias espaciadoras que se diseñaron para dirigirse a las ocho familias de betalactamasas de genes de resistencia: SHV, CTX-M, Te M, KPC, VIM, IMP, NDM y OXA-48. Las secuencias de cebadores utilizadas en la construcción de los plásmidos se enumeran en una tabla en la Figura 22.

En una ejemplificación, se describe en los Ejemplos un derivado plasmídico de pNB100 (Figura 12), pNB104A (Figura 23), un casete de ADN de aplicación general, que porta el sistema CRISPR-Cas9 más derivados que portan secuencias espaciadoras, flanqueadas por repeticiones directas, dirigidas contra cuatro familias de betalactamasas de genes de resistencia a antibióticos en bacterias y se expresan a partir de un promotor: NDM, IMP, VIM y KPC. En otra ejemplificación, se describe en los Ejemplos un derivado plasmídico de pNB100, pNB104B (Figura 24), un casete de ^a Dⁿ de aplicación general, que porta el sistema CRISPR-Cas9 más derivados que portan secuencias espaciadoras, flanqueadas por repeticiones directas, dirigidas contra cuatro familias de betalactamasas de genes de resistencia a antibióticos en bacterias y se expresan a partir de un promotor: OXA-48, SHV, TEM y CTX-M.

En otra ejemplificación, se describe en los Ejemplos un derivado plasmídico de pNB100, pNB108 (Figura 25), un casete de ADN de aplicación general, que porta el sistema CRISPR-Cas9 más derivados que portan secuencias espaciadoras, flanqueadas por repeticiones directas, dirigido contra ocho familias de betalactamasas de genes de resistencia a antibióticos en bacterias y se expresan a partir de un promotor: SHV, CTX-M, TEM, KPC, VIM, IMP, NDM y OXA-48.

En otra ejemplificación, se construye un derivado plasmídico de pNB100 donde las secuencias espaciadoras pueden expresarse a partir de una elección de dos promotores diferentes. Este plásmido, pNB200 (Figura 26), porta un sitio de restricción único diferente cadena abajo de cada promotor para clonar cualquier secuencia espaciadora deseada flanqueada por sus propias repeticiones directas entre dos repeticiones directas en el locus CRISPR. Se describen derivados de pNB200 que portan el sistema CRISPR-Cas9 más derivados que portan secuencias espaciadoras, flanqueadas por repeticiones directas, dirigidas contra ocho familias de betalactamasas de genes de resistencia: SHV, CTX-M, TEM, KPC, VIM, IMP, NDM y OXA-48. En pNB202 (Figura 27), el segundo promotor se usa para expresar espaciadores flanqueados por repeticiones directas para dirigirse a las cuatro familias de betalactamasas de genes de resistencia: OXA-48, S^hV, T^e M y CTX-M. Y en pNB203 (Figura 28), que procede de pNB202, se utilizan ambos promotores: el primero en expresar espaciadores flanqueados por repeticiones directas para dirigirse a cuatro familias de betalactamasas de genes de resistencia: NDM, IMP, VIM y KPC y el segundo promotor para expresar espaciadores flanqueados por repeticiones directas para dirigirse a cuatro familias de betalactamasas de genes de resistencia: OXA-48, SHV, TEM y CTX-M.

Construcción de pNB104A

El concatémero espaciador tetrámero a b c d que se muestra en la Figura 29A se digirió con BsaI, cuyo sitio de restricción se ubica en A1 y A2, y se ligó a sitios de clonación espaciadores de BsaI en pNB100. La estructura del promotor único y la región espaciadora (6221-7001) en pNB104A se muestra en la Figura 23. El concatémero de cuatro espacios contiene secuencias espaciadoras dirigidas a NDM, IMP, VIM y KPC desde el extremo proximal al distal del promotor único.

Construcción de pNB104B

El concatémero de secuencia espaciadora tetrámero e f g h que se muestra en la Figura 29A se digirió con SapI, cuyo sitio de restricción se ubica en B1 y B2, y se ligó a sitios de clonación espaciadores de SapI en pNB200. Mientras se rastreaba pNB202, se encontró esta construcción y se confirmó mediante secuenciación. Se produjo un evento de eliminación entre las repeticiones directas adyacentes a las secuencias líder y se restauró la secuencia de repetición directa para dar pNB104B. En la Figura 24 se muestran las regiones de un solo promotor (6221-6987) en pNB104B. Los espaciadores concatenados (dirigidos contra OXA-48, SHV, TEM y CTX-M) se ubicaron debajo del promotor único.

Construcción de pNB108

Las secuencias A y B de la matriz de espaciadores concatenados se amplificaron a partir del vector subclonado pCR Blunt II-TOPO_SpacerA y pCR Blunt ll-TOPO_SpacerB con el conjunto de cebadores NB026 y NB029, NB030 y NB033, respectivamente. En el extremo 3' del amplicón del espaciador A y el extremo 5' del amplicón del espaciador B hay 20 bases de secuencia solapada de la secuencia espaciadora KPC. Estos dos amplicones se purificaron en gel y se usaron para la reacción de extensión del ciclo por pares basada en PCR en ausencia del cebador. El material extendido se volvió a amplificar con el conjunto de cebadores NB037 (5'-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3'; SEQ ID NO. 150) y NB038 (5'-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3'; SEQ ID NO. 151) para generar el concatémero completo de matriz de 8 espaciadores. Este concatémero de ocho espaciadores se clonó en el vector pCR Blunt II-TOPO y se confirmó la secuencia.

La digestión con SsaI de este subclon pCR Blunt ll-TOPO elimina el concatémero completo de matriz de 8 espaciadores como un subclon del vector pCR Blunt ll-TOPO, que contiene en 5' cuatro bases que sobresalen compatibles con bases en ambos extremos para los sitios creados en pNB100 mediante la digestión con SsaI. Luego, pNB100 se digirió con SsaI seguido de purificación en gel de agarosa. El casete del concatémero de ocho espaciadores, liberado del pCR Blunt II-TOPO se ligó en pNB100 mediante ADN ligasa T4 y se transformó en células competentes DH5a (adquiridas de New England Biolabs). Los transformantes se seleccionaron en placas LB de cloranfenicol y se seleccionaron mediante PCR con el cebador inverso NB021: 5'-GGTGACTGATGGCCACGT (SEQ ID NO: 149) y un cebador directo NB020: 5'-CCAACTACCTCCCCCCTTGCTTAAC (SEQ ID NO: 148), que se aparean en la región 6368-6385 y la región 7203-7225, respectivamente, en el plásmido recombinante para generar un amplicón de PCR de 858 pb. Los clones positivos por PCR se secuenciaron para confirmar la secuencia del concatémero de ocho espaciadores y este clon recombinante se designa como pNB108 y se usa para demostrar la inactivación mediada por CRISPR/Cas9 de genes betalactamasa diana después de la administración de ADN a cepas bacterianas que portan dichos genes. En la Figura 25 se muestra un mapa plasmídico de pNB108.

Construcción de pNB200

El plásmido pNB200 contiene dos promotores idénticos para la expresión de ARNg y porta un sitio de restricción único diferente SsaI y Sapl cadena abajo de cada promotor para clonar cualquier secuencia espaciadora deseada flanqueada por sus propias repeticiones directas entre dos repeticiones directas en el locus CRISPR. La estructura deseada del locus de la matriz CRISPR en pNB200 consiste en dos conjuntos de casetes que albergan promotorlíder-repetición directa-región de clonación espaciadora-repetición directa-cola en tándem. El cebador directo NB018 hibrida en el extremo 5' de la secuencia líder con el promotor en pNB100 e introduce la primera región de clonación espaciadora, la segunda repetición directa y la secuencia de cola. El cebador inverso NB019 se hibrida en el extremo 3' de la secuencia líder en pNB100 e introduce una tercera repetición directa, segunda región de clonación espaciadora. Este amplicón se clona entre sitios BsaI en pNB100 para dar pNB200.

La secuencia amplificada (SEQ ID NO: 146) con el cebador NB018 y NB019 de pNB100 como molde

5 'CCAAAACtgagacctGCTGCGGACGTCCAAAGGTCTCGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACTTG

CCGATGATAACTTGAGAAAGAGGGTTAATACCAGCAGTCGGATACCTTCCTATTCTTTCTGTTAAAGCGTTTTCATGT

TATAATAGGCAAATTTTAGATGAAGATTATTTCTTAATAACTAAAAATATGGTATAATACTCTTAATAAATGCAGTAA

TACAGGGGCTTTTCAAGACTGAAGTCTAGCTGAGACAAATAGTGCGATTACGAAATTTTTTAGACAAAAATAGrCTAC GAGGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACtGAAGAGCGTCT CGGACcrcaqcGCTCT TCGTTTTAGA.

El cebador directo NB018 y el cebador inverso NB019 están subrayados y los sitios de hibridación iniciales, para el primer ciclo de PCR, se indican en negrita y en negrita en cursiva, respectivamente. Este amplicón se digirió con SbvI (5'-GCAGCN8/N12) para crear cuatro bases compatibles con extremos en 5' que sobresalen del pNB100 digerido con BsaI. Los sitios de reconocimiento BbvI se representan con mayúsculas y minúsculas en negrita.

Las condiciones de PCR para generar el casete de promotor-líder dual fueron:

Condiciones de ciclo

La secuencia de la matriz CRISPR modificada en pNB200 (SEQ ID NO: 147)

El número total de nucleótidos de pNB200 es 9919 pb. La secuencia en la región modificada se muestra a continuación, que reemplaza al pequeño fragmento BsaI en pNB100. La primera y la segunda secuencias promotoras están subrayadas. Las secuencias de líderes están en negrita. Las repeticiones directas están en cursiva y la región de clonación espaciadora entre las repeticiones directas se indica en cursiva y subrayada.

La primera región de clonación de la matriz espaciadora contiene dos sitios BsaI invertidos indicados por letras en negrita y cursiva subrayadas 5-GAGACC-3' y 5'-GGTCTC-3' para crear en 5' cuatro bases que sobresalen en sitios de clonación espaciadores 5'-GTTT-3' y 5'-TTTT-3' en el vector, respectivamente y uno único sitio AatII (5-GACGTC-3') también se indica mediante letras subrayadas en negrita y cursiva para reducir la autoligación en caso de digestión incompleta con BsaI.

La segunda región de clonación espaciadora contiene dos sitios Sapl invertidos indicados por letras en cursiva y negrita subrayadas 5-GAAGAGC-3' y 5'-GCTCTTC-3' para crear en 5' tres bases que sobresalen en sitios de clonación espaciadores 5'-GTT-3' y 5'-TTT-3' en el vector, respectivamente.

GGTGACTGATGGCCACGTGAACTATATGATTTTCCGCAGTATATTTTAGATGAAGATTATTTCTTAATAACTAAAAAT

A-'GG-A_AA-AC-'CG-'AATAAATGCAGTAATACAGGGGCTTTTCAAGACTGAAGTCTAGCTGAGACAAATAGTGCGAT

TACGAAATTTTTTAGACAAAAATAGTCTACGAGGTTTTAGAGCTATGCTATTTTGAATGGTCCCAAAACtGAGACCtG CTGCGGACGTCCAAAGGTCTCGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACttqccqatqataacttqaqaa agagggttaataccagcagtcggataccttcctattctttctgttaaagcgttttcatgttataataggcaaATTTTA

GATGAAGATTATTTCTTAATAACTAAAAATATGGTATAATACTCTTAATAAATGCAGTAATACAGGGGCTTTTCAAGA

CTGAAGTCTAGCTGAGACAAATAGTGCGATTACGAAATTTTTTAGACAAAAATAGTCTACGAGGTTTTAGAGCTATGC

TGTTTTGAATGGTCCCAAAACtGAAGAGCGTCTCGGACGCAGCGCTCTTCGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGT CCCAAAACaacattgccgatgataacttgagaaagagggttaataccagcagtcggataccttcctattctttctgtt aaagcgttttcatgttataataggcaaaagaagagtagtgtg

En la Figura 26 se muestra un mapa plasmídico de pNB200. Las secuencias de matriz espaciadoras deseadas se pueden clonar en el sentido de las agujas del reloj entre dos sitios BsaI y dos sitios SapI de forma independiente, para cada promotor respectivamente.

Construcción de pNB202

El plásmido pNB201 contiene los promotores duales de pNB200 del que procede, pero una secuencia de matriz espaciadora dirigida a las familias de genes betalactamasa OXA-48, SHV, TEM y CTX-M se expresa a partir del segundo promotor.

Para construir pNB202, se digirió pNB200 con BsaI seguido de purificación en gel de agarosa. La secuencia B de la matriz de espaciadores concatenados se generó mediante concatenación de oligonucleótidos por pares mediada por PCR. Esta matriz de concatémeros de cuatro espaciadores B se clonó en el vector pCR Blunt ll-TOPO, adquirido de Life Technologies, y se confirmó la secuencia. Sapl corta la secuencia B de la matriz espaciadora como un subclon del vector TOPO y produce en 5' tres bases que sobresalen compatibles con bases en ambos extremos para los sitios creados en pNB200 por digestión con Sapl. Este casete de concatémero B de cuatro espaciadores se ligó a pNB200 mediante ADN ligasa T4 y se transformó en células competentes DH5a (adquiridas en New England Biolabs). Los transformantes se seleccionaron en placas LB de cloranfenicol y se seleccionaron mediante PCR con el cebador inverso NB021: 5'-GGTGACTGATGGCCACGT (SEQ ID NO: 149) y un cebador directo NB020: 5'-CCAACTACCTCCCCCCTTGCTTAAC (SEQ ID NO: 148), que se aparean en la región 6368-6385 y la región 7307­ 7329, respectivamente, en el plásmido recombinante para generar un amplicón de PCR de 962 pb. Los clones PCR positivos se secuenciaron para confirmar la secuencia del concatémero B de cuatro espaciadores y este clon recombinante se designa como pNB202 y se usa para demostrar la inactivación mediada por CRISPR/Cas9 de genes betalactamasa diana después de la administración de ADN a cepas bacterianas que portan dichos genes. En la Figura 27 se muestra un mapa plasmídico de pNB202.

Construcción de pNB203

El plásmido pNB203 contiene los promotores duales de pNB200 pero cada promotor expresa cuatro espaciadores. El primer promotor expresa la secuencia espadadora dirigida a NDM, IMP, VIM y KPC, el segundo promotor expresa los genes betalactamasa OXA, SHV, TEM y CTX-M. El plásmido pNB202 se digirió con BsaI seguido de purificación en gel de agarosa. La secuencia de matriz de espaciadores concatenados A se cortó del vector pCR Blunt ll-TOPO que alberga el concatémero espaciador A con BsaI. BsaI corta la región espaciadora, que contiene en 5' cuatro bases que sobresalen compatibles con bases en ambos extremos para los sitios creados en pNB202 mediante la digestión con BsaI. Este casete de concatémero A de cuatro espaciadores se ligó a pNB202 mediante ADN ligasa T4 y se transformó en células competentes DH5a (adquiridas en New England Biolabs). Los transformantes se seleccionaron en una placa LB de cloranfenicol y se cribaron mediante PCR con el cebador inverso NB021: 5'-GGTGACTGATGGCCACGT y un cebador directo NB020: 5'-CCAACTACCTCCCCTTGCTTAAC, que se hibridó en la región 6368-6385 y la región 7479-7501, respectivamente, en el plásmido recombinante para generar un amplicón de PCR de 1134 pb. Los clones PCR positivos se secuenciaron para confirmar la secuencia del concatémero A y B de cuatro espaciadores y este clon recombinante se designa como pNB203 y se usa para demostrar la inactivación mediada por CRISPR/Cas9 de genes betalactamasa diana después de la administración de ADN a cepas bacterianas que portan dichos genes. En la Figura 28 se muestra un mapa plasmídico de pNB203.

Representación esquemática de la estructura de matrices espadadoras concatenadas

Se determinaron secuencias espaciadoras para maximizar la cobertura de la familia de genes betalactamasa diana. Cada unidad de oligonucleótidos contiene la repetición directa que flanquea la secuencia espaciadora apropiada en cada extremo. Las reacciones de concatenación se realizan entre oligonucleótidos por pares, es decir, los oligonucleótidos de la unidad vecina más cercana se concatenan primero para generar dos oligonucleótidos de longitud unitaria, luego se concatenan dos oligonucleótidos de longitud unitaria para generar cuatro unidades de longitud de oligonucleótido, etc.

La estructura esquemática de las estructuras espaciadoras de tetrámero y octámero se muestra en la Figura 29. S: espaciador, R: repetición directa, A y B contienen BsaI para crear sitios compatibles de unión para la clonación en pNB100 y cadena abajo del primer promotor de pNB200. C y D contienen un sitio SapI para crear la unión de un sitio compatible para la clonación cadena abajo del segundo promotor de pNB200. En este ejemplo, se empleó la secuencia espaciadora S1 dirigida a NDM, S2 dirigida a iMp , S3 dirigida a VIM, S4 dirigida a KPC, S5 dirigida a OXA, S6 dirigida a SHV, S7 dirigida a TEM y S8 dirigida a CTX-M.

Reacción de concatenación de espaciadores

Cada oligonucleótido tiene una secuencia superpuesta en el extremo 3' y 5' para hibridarse con el oligonucleótido vecino más cercano, excepto el primer y el último oligonucleótido. El primer y el último oligonucleótido tienen la secuencia superpuesta al segundo y al penúltimo oligonucleótido solo en el extremo 5'. Para concatenar cuatro espaciadores, se sintetizan cuatro oligonucleótidos. En otras palabras, el oligonucleótido n.° 1 consiste en el espaciador 1 y 2 en los extremos 5' y 3'. El oligonucleótido n.° 2 contiene el complemento inverso de los espaciadores 2 y 3 en los extremos 3' y 5'. El oligonucleótido n.° 3 contiene los espaciadores 3 y 4 en los extremos de 5' y 3'. El oligonucleótido n.° 4 contiene el complemento inverso del espaciador 4 en el extremo 3'. Por lo tanto, el oligonucleótido n.° 2 puede unir al oligonucleótido n.° 1 y al oligonucleótido n.° 3, el oligonucleótido 4 hibrida al extremo 3' del oligonucleótido n.° 3. El oligonucleótido n.° 1 y el oligonucleótido n.° 2, el oligonucleótido n.° 3 y el oligonucleótido n.° 4 se concatenan en un tubo separado usando las siguientes condiciones de reacción de PCR.

Condiciones de ciclo

En este ejemplo, NB026 y NB027, NB028 y NB034, NB035 y NB031, NB032 y NB036 están concatenados. Cada producto concatenado A1, A2, B1 y B2 se purificó en gel y se preparó la segunda reacción de concatenación usando el producto dímero A1 y A2, B1 y B2 purificados en las siguientes condiciones de PCR.

Condiciones de ciclo

Estos productos de ampliación se amplificaron mediante NB037 y NB038 con ADN polimerasa Q5. Los amplicones finales se clonaron en el vector pCR Blunt II TOPO y se confirmaron las secuencias de concatémero.

En caso de concatenación de ocho espaciadores, el concatémero espaciador A y el concatémero espaciador B en el vector pCR Blunt II TOPO se amplificaron con los pares de cebadores NB026 y NB029, ⁿ B030 y NB033, respectivamente, y los amplicones se purificaron en gel. Los espaciadores A y B purificados se utilizaron como un cebador largo en la siguiente reacción de ampliación del ciclo.

Condiciones de ciclo

Estos productos de ampliación se amplificaron mediante NB037 y NB038 con ADN polimerasa Q5. Los amplicones finales se clonaron en el vector pCR Blunt II TOPO y se confirmaron las secuencias de concatémero.

Administración de construcciones CRISPR-Cas9 a bacterias

Las construcciones que son capaces de inactivar genes diana, incluyendo genes resistentes a antibióticos, a través del sistema CRISPR-Cas, y que son un aspecto de la presente invención también se denominan en el presente documento "simbióticos Nemesis". Los derivados plasmídicos de CRISPR-Cas9, pNB104A, pNB104B, pNB202 y pNB203 portan todos inserciones espaciadoras dirigidas contra las familias seleccionadas de genes betalactamasa (bla) descritos y, por lo tanto, proporcionan ejemplos para demostrar que una única construcción plasmídica posee actividad de simbióticos Nemesis (ASN) y, por lo tanto, son capaces de inactivar genes representativos de las 8 familias diferentes de antibióticos betalactámicos. El plásmido pNB104A (véase la Figura 23) se prueba por su capacidad para inactivar genes representativos miembros de las familias NDM, IMP, VIM y KPC; pNB104B (véase la Figura 24) y pNB202 (véase la Figura 27) se prueban para determinar su capacidad para inactivar genes representativos miembros de las familias OXA, ^s H^v , TEM y CTX-M; y pNB108 (véase la Figura 25) y pNB203 (véase la Figura 28) se prueban para determinar su capacidad para inactivar genes representativos miembros de las familias SHV, CTX-M, TEM, KPC, VIM, IMP, NDM y OXA.

Ensayo de actividad de simbióticos Nemesis (ASN) mediante transformación de plásmido

El ensayo de ASN descrito en el Ejemplo 2 mostró que la transformación de ADN de una cepa de E. coli, DH5a, que también porta el gen betalactamasa TEM-3 en el plásmido pBR322, con el plásmido pNB102 convierte el transformante en sensibilidad a ampicilina (ApS, por sus siglas en inglés). En el presente documento, el plásmido pNB102 codifica la resistencia a cloranfenicol y los transformantes DH5a (pBR322) que ahora portan pNB102 se seleccionaron en placas LB Cm y luego se seleccionan para ApS (véase la Figura 14). En el presente documento, el plásmido pNB102, al expresar el sistema CRISPR/Cas9 con la secuencia espaciadora que codifica el ARNg que se dirige al gen TEM-3, inactivó el gen TEM-3. En contraste, en un experimento de control negativo, cuando DH5a (pBR322) se transformó con el plásmido parental pNB100 que portaba el sistema CRISPR/Cas9 que expresaba pero carecía del ARNg dirigido al gen TEM-3, no se produjo ninguna conversión a ApS.

A modo de ejemplo, se describe un experimento equivalente donde se construyen derivados plasmídicos de pBR322 donde el t EM-3 se reemplaza por genes representativos de las otras 7 familias diferentes de antibióticos betalactámicos: SHV, CTX-M, KPC, VIM, IMP, NDM y OXA. Dichos genes se obtienen de cepas bacterianas adecuadas que portan dichos genes. Esto permite una comparación directa con los experimentos de viabilidad descritos en el Ejemplo 2 en antecedentes genéticos isogénicos.

Un conjunto de cepas de E. coli y K. pneumoniae que portan genes representativos de estas siete familias diferentes de antibióticos betalactámicos se compraron en Culture Collections, Public Health England, Porton Down, Salisbury, SP4, 0JG, Reino Unido. Estos son: NCTC13368, una cepa de K. pneumoniae portadora del gen SHV-l8; NCTC13353 una cepa de E. coli portadora del gen CTX-M-15; NCTC13438 una cepa de K. pneumoniae portadora del gen KPC-3; NCTC13440 una cepa de K. pneumoniae portadora del gen VIM-1; NCTC13476 una cepa de E. coli portadora de un gen IMP no caracterizado; NCTC13443 una cepa de K. pneumoniae portadora del gen NDM-1 y NCTC13442 una cepa de K. pneumoniae portadora del gen OXA-48. Los siete genes codifican betalactamasas que también son capaces de degradar e inactivar la clase de antibióticos penámicos (véanse las Figuras 16, 17). Todas las cepas se probaron y, como se esperaba, se ha encontrado que son resistentes al antibiótico de clase penámica, ampicilina.

Las secuencias codificantes de betalactamasa se amplifican a partir de la célula con el conjunto de cebadores directo e inverso apropiados que se muestran a continuación:

Cada cebador directo contiene una secuencia de 17 bases para restaurar el promotor betalactamasa en pBR322, y cada cebador inverso contiene un sitio SsaI (para NDM-1, OXA-48, SHV-18, KPC-3, IMP-4 y CTX-M15) o un sitio Fokl (para VIM-1) para crear 5'-ACCG cuatro bases que sobresalen en el extremo 5'. Después de amplificar cada gen betalactamasa con ADN polimerasa de alta fidelidad, tal como ADN polimerasa Q5, el amplicón se digiere con la enzima de restricción apropiada ubicada en el cebador inverso, descrito anteriormente. Los amplicones digeridos están listos para ligarse usando ligasa T4 entre los sitios Sspl y SsaI en el plásmido pBR322 (comprado en New England Biolabs), después de la eliminación del fragmento t EM-3. SspI crea un final romo y SsaI crea un extremo 5'-CGGT que sobresale. El complemento inverso de las secuencias codificantes de cada amplicón después de la digestión de restricción se muestra a continuación. El extremo en 5' que sobresale está subrayado y el extremo en 3' de la secuencia promotora está en letras minúsculas en negrita. El complemento inverso CAT de los codones de iniciación de metionina ATG de estos siete genes, también se muestra en negrita, produce una fusión precisa de la región codificante de los otros siete betalactamasas con las secuencias señal de traducción del betalactamasa TEM-3 de pBR322.

NDM-1 (SEQ ID NO: 166)

ACCGTCAGCGCAGCTTGTCGGCCATGCGGGCCGTATGAGTGATTGCGGCGCGGCTATCGGGGGCGGA

ATGGCTCATCACGATCATGCTGGCCTTGGGGAACGCCGCACCAAACGCGCGCGCTGACGCGGCGTAG

TGCTCAGTGTCGGCATCACCGAGATTGCCGAGCGACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATCAGGCAGCCAC

CAAAAGCGATGTCGGTGCCGTCGATCCCAACGGTGATATTGTCACTGGTGTGGCCGGGGCCGGGGTA

AAATACCTTGAGCGGGCCAAAGTTGGGCGCGGTTGCTGGTTCGACCCAGCCATTGGCGGCGAAAGTC

AGGCTGTGTTGCGCCGCAACCATCCCCTCTTGCGGGGCAAGCTGGTTCGACAACGCATTGGCATAAG

TCGCAATCCCCGCCGCATGCAGCGCGTCCATACCGCCCATCTTGTCCTGATGCGCGTGAGTCACCAC

CGCCAGCGCGACCGGCAGGTTGATCTCCTGCTTGATCCAGTTGAGGATCTGGGCGGTCTGGTCATCG

GTCCAGGCGGTATCGACCACCAGCACGCGGCCGCCATCCCTGACGATCAAACCGTTGGAAGCGACTG

CCCCGAAACCCGGCATGTCGAGATAGGAAGTGTGCTGCCAGACATTCGGTGCGAGCTGGCGGAAAAC

CAGATCGCCAAACCGTTGGTCGCCAGTTTCCATTTGCTGGCCAATCGTCGGGCGGATTTCACCGGGC

ATGCACCCGCTCAGCATCAATGCAGCGGCTAATGCGGTGCTCAGCTTCGCGACCGGGTGCATAATAT

TGGGCAATTCCATactcttcctttttcaat

OXA-48 (SEQ ID NO: 167)

ACCGCTAGGGAATAATTTTTTCCTGTTTGAGCACTTCTTTTGTGATGGCTTGGCGCAGCCCTAAACC

ATCCGATGTGGGCATATCCATATTCATCGCAAAAAACCACACATTATCATCAAGTTCAACCCAACCG

ACCCACCAGCCAATCTTAGGTTCGATTCTAGTCGAGTATCCAGTTTTAGCCCGAATAATATAGTCAC

CATTGGCTTCGGTCAGCATGGCTTGTTTGACAATACGCTGGCTGCGCTCCGATACGTGTAACTTATT

GTGATACAGCTTTCTTAAAAAGCTGATTTGCTCCGTGGCCGAAATTCGAATACCACCGTCGAGCCAG

AAACTGTCTACATTGCCCGAAATGTCCTCATTACCATAATCGAAAGCATGTAGCATCTTGCTCATAC

GTGCCTCGCCAATTTGGCGGGCAAATTCTTGATAAACAGGCACAACTGAATATTTCATCGCGGTGAT

TAGATTATGATCGCGATTCCAAGTGGCGATATCGCGCGTCTGTCCATCCCACTTAAAGACTTGGTGT

TCATCCTTAACCACGCCCAAATCGAGGGCGATCAAGCTATTGGGAATTTTAAAGGTAGATGCGGGTA

AAAATGCTTGGTTCGCCCGTTTAAGATTATTGGTAAATCCTTGCTGCTTATTCTCATTCCAGAGCAC

AACTACGCCCTGTGATTTATGTTCAGTAAAGTGAGCATTCCAACTTTTGTTTTCTTGCCATTCCTTT

GCTACCGCAGGCATTCCGATAATCGATGCCACCAAAAACACAGCCGATAAGGCTAATACACGCATac tcttcctttttcaat

SHV-18 (SEQ ID NO: 168)

ACCGTTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCAGCGCCGCGCCGATCCCGGCGATTTGCTGATTTCGCTCGGC

CATGCTCGCCGGCGTATCCCGCAGATAAATCACCACAATCCGCTCTGCTTTGTTATTCGGGCCAAGC

AGGGCGACAATCCCGCGCGCACCCCGTTTGGCAGCTCCGGTCTTATCGGCGATAAACCAGCCCGCCG

GCAGCACGGAGCGGATCAACGGTCCGGCGACCCGATCGTCCACCATCCACTGCAGCAGCTGCCGTTG

CGAACGGGCGCTCAGACGCTGGCTGGTCAGCAGCTTGCGCAGGGTCGCGGCCATGCTGGCCGGGGTA

GTGGTGTCGCGGGCGTCGCCGGGAAGCGCCTCATTCAGTTCCGTTTCCCAGCGGTCAAGGCGGGTGA

CGTTGTCGCCGATCTGGCGCAAAAAGGCAGTCAATCCTGCGGGGCCGCCGACGGTGGCCAGCAGCAG

ATTGGCGGCGCTGTTATCGCTCATGGTAATGGCGGCGGCACAGAGTTCGCCGACCGTCATGCCGTCG

GCAAGGTGTTTTTCGCTGACCGGCGAGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGCT

CCAGCTGTTCGTCACCGGCATCCACCCGCGCCAGCACTGCGCCGCAGAGCACTACTTTAAAGGTGCT

CATCATGGGAAAGCGTTCATCGGCGCGCCAGGCGGTCAGCGTGCGGCCGCTGGCCAGATCCATTTCT

ATCATGCCTACGCTGCCCGACAGCTGGCTTTCGCTTAGTTTAATTTGCTCAAGCGGCTGCGGGCTGG

CGTGTACCGCCAGCGGCAGGGTGGCTAACAGGGAGATAATACACAGGCGAAAATAACGCATactctt cctttttcaat

VIM-1 (SEQ ID NO: 169)

ACCGCTACTCGGCGACTGAGCGATTTTTGTGTGCTTTGACAACGTTCGCTGTGTGCTGGAGCAAGTC TAGACCGCCCGGTAGACCGTGCCCGGGAATGACGACCTCTGCTTCCGGGTAGTGTTTTTGAATCCGC TCAACGGAGGTGGGCCATTCAGCCAGATCGGCATCGGCCACGTTCCCCGCAGACGTGCTTGACAACT CATGAACGGCACAACCACCGTATAGCACGTTCGCTGACGGGACGTATACAACCAGATTGTCGGTCGA ATGCGCAGCACCAGGATAGAAGAGCTCTACTGGACCGAAGCGCACTGCGTCCCCGCTCGATGAGAGT CCTTCTAGAGAATGCGTGGGAATCTCGTTCCCCTCTGCCTCGGCTAGCCGGCGTGTCGACGGTGATG CGTACGTTGCCACCCCAGCCGCCCGAAGGACATCAACGCCGCCGACGCGGTCGTCATGAAAGTGCGT GGAGACTGCACGCGTTACGGGAAGTCCAATTTGCTTTTCAATCTCCGCGAGAAGTGCCGCTGTGTTT TTCGCACCCCACGCTGTATCAATCAAAAGCAACTCATCACCATCACGGACAATGAGACCATTGGACG GGTAGACCGCGCCATCAAACGACTGCGTTGCGATATGCGACCAAACACCATCGGCAATCTGGTAAAG TCGGACCTCTCCGACCGGAATTTCGTTGACTGTCGGATACTCACCACTCGGCTCCCCGGAATGGGCT AACGGACTTGCGACAGCCATGACAGACGCGGTCATGTAGACCAATAAACTACTAATAACTTTTAACA

Tactcttcctttttcaat

KPC-3 (SEQ ID NO: 170)

ACCGTTACTGCCCGTTGACGCCCAATCCCTCGAGCGCGAGTCTAGCCGCAGCGGCGATGACGGCCTC GCTGTACTTGTCATCCTTGTTAGGCGCCCGGGTGTAGACGGCCAACACAATAGGTGCGCGCCCAGTG GGCCAGACGACGGCATAGTCATTTGCCGTGCCATACACTCCGCAGGTTCCGGTTTTGTCTCCGACTG CCCAGTCTGCCGGCACCGCCGCGCGGATGCGGTGGTTGCCGGTCGTGTTTCCCTTTAGCCAATCAAC AAACTGCTGCCGCTGCGGCGCAGCCAGTGCAGAGCCCAGTGTCAGTTTTTGTAAGCTTTCCGTCACG GCGCGCGGCGATGAGGTATCGCGCGCATCGCCTGGGATGGCGGAGTTCAGCTCCAGCTCCCAGCGGT CCAGACGGAACGTGGTATCGCCGATAGAGCGCATGAAGGCCGTCAGCCCGGCCGGGCCGCCCAACTC CTTCAGCAACAAATTGGCGGCGGCGTTATCACTGTATTGCACGGCGGCCGCGGACAGCTCCGCCACC GTCATGCCTGTTGTCAGATATTTTTCCGAGATGGGTGACCACGGAACCAGCGCATTTTTGCCGTAAC GGATGGGTGTGTCCAGCAAGCCGGCCTGCTGCTGGCTGCGAGCCAGCACAGCGGCAGCAAGAAAGCC CTTGAATGAGCTGCACAGTGGGAAGCGCTCCTCAGCGCGGTAACTTACAGTTGCGCCTGAGCCGGTA TCCATCGCGTACACACCGATGGAGCCGCCAAAGTCCTGTTCGAGTTTAGCGAATGGTTCCGCGACGA GGTTGGTCAGCGCGGTGGCAGAAAAGCCAGCCAGCGGCCATGAGAGACAAGACAGCAGAACTAGACG GCGATACAGTGACATactcttcctttttcaat

IMP-4 (SEQ ID NO: 171)

ACCGTTAGTTGCTTAGTTTTGATGGTTTTTTACTTTCGTTTAACCCTTTAACCGCCTGCTCTAATGT AAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAGCTTCACTGTGACTTGGAACAACCAGTTTTGCCTTACCATAT TTGGATATTAATAATTTAGCGGACTTTGGCCAAGCTTCTAAATTTGCGTCACCCAAATTACCTAGAC CGTACGGTTTAATAAAACAACCACCGAATAATATTTTCCTTTCAGGCAGCCAAACTACTAGGTTATC TGGAGTGTGTCCTGGGCCTGGATAAAAAACTTCAATTTTATTTTTAACTAGCCAATAGTTAACCCCG CCAAATGAATTTTTAGCTTGAACCTTACCGTCTTTTTTAAGCAGCTCATTAGTTAATTCAGACGCAT AC GTGGGGAT GGAT TGAGAAT TAAGC CACTCTAT TCCGCCCGTGCT GT CACTAT GAAAATGAGAGGA AATACTGCCTTTTATTTTATAGCCACGTTCCACAAACCAAGTGACTAACTTTTCAGTATCTTTAGCC GTAAAT GGAGT GTCAAT TAGATAAGC TTCAGCAT CTACAAGAACAAC CAAAC CAT GTTTAGGAACAA CGCCCCACCCGTTAACTTCTTCAAACGAAGTATGAACATAAACGCCTTCATCAAGTTTTTCAATTTT TAAAT CTGGCAAAGACT CTGC TGCGGTAGCAAT GCTACAAAACAAAAATATAAAGAATACAGATAAC TTGCTCATactcttcctttttcaat

CTX-M-15 (SEQ ID NO: 172)

ACCGTTACAAACCGTCGGTGACGATTTTAGCCGCCGACGCTAATACATCGCGACGGCTTTCTGCCTT AGGTTGAGGCTGGGTGAAGTAAGTGACCAGAATCAGCGGCGCACGATCTTTTGGCCAGATCACCGCG ATATCGTTGGTGGTGCCATAGCCACCGCTGCCGGTTTTATCCCCCACAACCCAGGAAGCAGGCAGTC CAGCCTGAATGCTCGCTGCACCGGTGGTATTGCCTTTCATCCATGTCACCAGCTGCGCCCGTTGGCT GTCGCCCAATGCTTTACCCAGCGTCAGATTCCGCAGAGTTTGCGCCATTGCCCGAGGTGAAGTGGTA TCACGCGGATCGCCCGGAATGGCGGTGTTTAACGTCGGCTCGGTACGGTCGAGACGGAACGTTTCGT CTCCCAGCTGTCGGGCGAACGCGGTGACGCTAGCCGGGCCGCCAACGTGAGCAATCAGCTTATTCAT CGCCACGTTATCGCTGTACTGTAGCGCGGCCGCGCTAAGCTCAGCCAGTGACATCGTCCCATTGACG TGCTTTTCCGCAATCGGATTATAGTTAACAAGGTCAGATTTTTTGATCTCAACTCGCTGATTTAACA GATTCGGTTCGCTTTCACTTTTCTTCAGCACCGCGGCCGCGGCCATCACTTTACTGGTGCTGCACAT CGCAAAGCGCTCATCAGCACGATAAAGTATTTGCGAATTATCTGCTGTGTTAATCAATGCCACACCC AGTCTGCCTCCCGACTGCCGCTCTAATTCGGCAAGTTTTTGCTGTACGTCCGCCGTTTGCGCATACA

GCGGCACACTTCCTAACAACAGCGTGACGGTTGCCGTCGCCATCAGCGTGAACTGGCGCAGTGATTT TTTAACCATactcttcctttttcaat

Luego, las células competentes DH5a adquiridas en New England Biolabs se transforman con estos ligandos, seguido de la selección de los recombinantes deseados en placas LB de ampicilina (100 |jg/ml).

Las muestras de ADN plasmídico se aíslan de estos transformantes y se someten a un análisis de secuencia de ADN para confirmar que la secuencia correcta para cada uno de los siete genes betalactamasa diferentes está presente en cada construcción que dan los plásmidos:

Estos plásmidos derivados de pBR322 así derivados se denominan:

i. pNB010 portador del gen SHV-18;

ii. pNB011 portador del gen CTX-M-15;

iii. pNB012 portador del gen KPC-3;

iv. pNB013 portador del gen VIM-1;

v. pNB014 portador del gen IMP;

vi. pNB015 portador del gen NDM-1;

vii. pNB016 portador del gen OXA-48; además de, como se describe,

viii. pBR322 portador del gen TEM-3

Luego, 7 cepas receptoras de E. coli, DH5a, cada una con uno de estos siete genes betalactamasa en los plásmidos pNB010-0l6 se transforman posteriormente con los plásmidos pNB104A, pNB104B, pNB108 y pNB203 y se seleccionan por su resistencia a cloranfenicol para seleccionarlos para la adquisición de estos plásmidos de simbióticos Nemesis, junto con el control negativo pNB100 así como con la transformación de DH5a (pBR322) mediante pNB102 como control positivo, y luego se analizó la conversión a la sensibilidad a ampicilina como se describe en el Ejemplo 2 (véase la Figura 14).

Ensayo de "actividad de simbióticos Nemesis" (ASN) mediante conjugación de plásmidos para probar la actividad de construcciones que portan múltiples espaciadores dirigidos a familias de genes betalactamasa El ensayo de conjugación de plásmidos descrito en el Ejemplo 2 también puede usarse para probar la actividad de simbióticos Nemesis de las nuevas construcciones plasmídicas CRISPR/Cas9 que portan secuencias espaciadoras dirigidas a múltiples familias de genes betalactamasa. El ensayo implica el apareamiento de una célula donante que porta el gen betalactamasa en un plásmido conjugativo y, por tanto, resistente a ampicilina, con una célula receptora que porta el simbiótico Nemesis en un plásmido no movilizable que codifica la resistencia a cloranfenicol. Los exconjugantes se seleccionan en placas LB que contienen tanto 100 jg/ml de ampicilina como 35 jg/ml de cloranfenicol. La actividad de simbióticos Nemesis exitosa se ve en una reducción en la eficacia de la transferencia del gen de resistencia a ampicilina.

Como donantes, se usó la misma cepa usada en el Ejemplo 2. Esta cepa, JA200 (F+ thr-1, leu-6, DE(trpE)5, recA, lacY, thi, gal, xyl, ara, mtl), también porta el plásmido pNT3 como lo describe Saka et al. (DNA Research 12, 63-68, 2005). El plásmido pNT3 es un plásmido movilizable que porta el gen betalactamasa TEM-1 de Tn1. La conjugación de pNT3 y, por tanto, la transferencia de resistencia a ampicilina se efectúa mediante las funciones de transferencia del plásmido F+ corresidente.

Los otros posibles donantes son el conjunto de cepas de E. coli y K. pneumoniae que portan genes representativos de estas siete familias diferentes de antibióticos betalactámicos que se compraron en Culture Collections, Public Health England, como se ha descrito anteriormente. Estas cepas deben ser sensibles a cloranfenicol para permitir la selección de exconjugantes y se ensayó su crecimiento en placas LB de 35 jg/ml de cloranfenicol. NCTC13368, una cepa de K. pneumoniae portadora del gen SHV-18; NCTC13438 una cepa de K. pneumoniae portadora del gen KPC-3; NCTC13476 una cepa de E. coli portadora de un gen IMP no caracterizado; NCTC13443 una cepa de K. pneumoniae portadora del gen NDM-1 y NCTC13442 una cepa de K. pneumoniae portadora del gen OXA-48, se encontró que eran resistentes a cloranfenicol, pero NCTC13353, una cepa de E. coli portadora del gen CTX-M-15 y NCTC13440, una cepa de K. pneumoniae portadora del gen VIM-1, se encontró que eran sensibles a cloranfenicol y se llevaron adelante para ser probados en apareamientos con los receptores.

Como receptores, las cepas usadas en el Ejemplo 2 sirven como controles para probar las nuevas construcciones de plásmidos. Así, el control negativo es Dh5a (F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 080 dlacZAM15 A(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), A con el plásmido pNB100 que codifica el casete CRISPR/Cas9 pero sin secuencia espaciadora dirigida a ningún gen de resistencia a antibióticos; y el control positivo es DH5a con el plásmido pNB102 que codifica el casete CRISPR/Cas9 así como la secuencia espaciadora que se dirige a la familia de betalactamasa TEM. Se probarán las cepas DH5a con los plásmidos pNB104A, pNB104B y pNB108. Estos plásmidos también codifican el casete CRISPR/Cas9 además de las secuencias espaciadoras, todos dirigidos a un promotor en el siguiente orden, de proximal a distal del promotor (pNB104A): NDM-lMP-VIM-KPC; (pNB104B): OXA-48-SHV-TEM-CTX-M (pNB108): NDM-IMP-VIM-KPC-OXA-48-SHV-TEM-CTX-M.

Para configurar los apareamientos, se recogieron colonias de donantes de LB Ap100 (ampicilina 100 jg/ml) y receptores de placas L^b Cm35 (cloranfenicol 35 jg/ml) en 200 j l de LB y luego se mezclaron 100 j l de receptores

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un vehículo de administración para introducir un polinucleótido en un microorganismo resistente a antibióticos, donde el vehículo de administración se selecciona del grupo que consiste en un plásmido (tal como un plásmido conjugativo u otro replicón plasmídico), un vector nucleotídico, ADN bicatenario lineal, un bacteriófago no virulento y un bacteriófago lisogénico, y comprende un polinucleótido recombinante para la inactivación de ADN que porta al menos un gen de resistencia a antibióticos que codifica una enzima que confiere resistencia a antibióticos a un microorganismo, donde el polinucleótido recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico de matriz de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR) que tiene o transcribe múltiples moléculas de ARN guía, donde cada molécula de ARN guía:

(i) se transcribe a partir de su propia secuencia promotora;

(ii) media la unión de un polipéptido (Cas) de unión a ADN asociado a CRISPR o su equivalente funcional o su versión modificada del mismo al al menos un gen o genes de resistencia a antibióticos; y

(iii) tiene una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia de ADN diana del al menos un gen de resistencia a antibióticos para que el al menos un gen de resistencia a antibióticos sea dirigido e inactivado en presencia de un polipéptido (Cas) de unión a ADN, o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo, asociado a CRISPR, y donde:

el polipéptido Cas de unión a ADN o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo es un polipéptido Cas de unión a ADN modificado que crea una eliminación y vuelve a sellar la secuencia de ADN diana para inactivar el al menos un gen de resistencia a antibióticos para evitar la destrucción del microorganismo inducida por la rotura de la doble cadena (DSB), de tal modo que el microorganismo se sensibilice a un antibiótico, o

el polipéptido Cas de unión a ADN o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo crea una DSB en la secuencia de ADN diana para inactivar el al menos un gen de resistencia a antibióticos, y el vehículo de administración comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico que previene la destrucción directa del microorganismo debido a la generación de la DSB en el al menos un gen de resistencia a antibióticos, de tal modo que el microorganismo se sensibilice a un antibiótico.

2. El vehículo de administración de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido Cas de unión a ADN o su equivalente funcional o su versión modificada.

3. El vehículo de administración de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido Cas de unión a ADN es Cas9 o un equivalente funcional o una versión modificada del mismo.

4. El vehículo de administración de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una molécula de ARN guía adicional que se dirige a un gen implicado en la patogenicidad u otros aspectos del metabolismo microbiano, por ejemplo, un gen implicado en el metabolismo bacteriano para la producción de biopelículas.

5. El vehículo de administración de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido Cas de unión a ADN modificado comprende un dominio catalítico de recombinasa para volver a sellar la secuencia de ADN diana.

6. El vehículo de administración de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el producto génico que previene la destrucción directa del microorganismo es una proteína codificada por un replicón sujeto a degradación debido a la DSB causada por el polipéptido Cas de unión a ADN, o una antitoxina que neutraliza el efecto de una toxina o función destructora portada por un replicón en el que se ubica la secuencia de ADN diana.

7. El vehículo de administración de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de ácido nucleico de la matriz CRISPR tiene o transcribe una o más moléculas de ARN guía, comprendiendo cada una una secuencia espaciadora suficientemente complementaria a una secuencia diana de uno o más genes betalactamasa, por ejemplo, uno o más o todos los genes seleccionados del grupo que consiste en: NDM, VIM, IMP, KPC, OXA, TEM, SHV, CTX, OKP, LEN, GES, MIR, ACT, ACC, CMY, LAT y FOX.

8. Una composición que comprende el vehículo de administración de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la composición es una composición farmacéutica, un microorganismo no patógeno tal como una bacteria comensal, por ejemplo, en una formulación probiótica, o un suplemento alimenticio.

10. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, formulada para administración tópica, enteral o parenteral.

11. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para usar como un medicamento.

12. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para usar en el tratamiento o prevención de una infección causada por un microorganismo resistente a antibióticos que comprende uno o más genes de resistencia a antibióticos dirigidos por las moléculas de ARN guía del polinucleótido recombinante.

13. Un método para inactivar la resistencia a antibióticos en un microorganismo resistente a antibióticos, comprendiendo el método introducir en el microorganismo el vehículo de administración de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

14. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido recombinante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

15. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la célula hospedadora es una bacteria comensal.