ES2827215T3

ES2827215T3 - Métodos para detectar moléculas en una muestra

Info

Publication number: ES2827215T3
Application number: ES14710370T
Authority: ES
Inventors: Banafshe Larijani; Peter Parker; Selvaraju Veeriah
Original assignee: Francis Crick Institute Ltd
Current assignee: Francis Crick Institute Ltd
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2021-05-20
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: EP2972357B1; EP2972357A1; AU2014229822A1; SI2972357T1; LT2972357T; HRP20201319T1; CY1123283T1; US10184944B2; AU2014229822B2; US20190195877A1; RS60738B1; HK1220255A1; CA2908201C; CA2908201A1; WO2014140554A1; PT2972357T; GB201304352D0; US20160069881A1; US10578620B2; GB2511761A

Abstract

Un método in vitro para detectar moléculas, que emplea: a. al menos dos anticuerpos primarios, en donde el primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula y el segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, en donde el segundo sitio es diferente del primer sitio y en donde el primer y segundo anticuerpos primarios son inmunológicamente distintos; b. al menos dos anticuerpos secundarios, en donde al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa, y en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta con un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y se une al primer anticuerpo primario; y el segundo anticuerpo secundario se conjuga o fusiona con una enzima y se une al segundo anticuerpo primario, en donde el primer anticuerpo secundario no se une al segundo anticuerpo primario y el segundo anticuerpo secundario no se une al primer anticuerpo primario; c. un conjugado que comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se forma un conjugado activado, cuyo conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular que están de 2 a 9 nm o menos de 100 kDa de la enzima; en donde el método comprende llevar a cabo las siguientes etapas en orden: d. poner en contacto una muestra con los al menos dos anticuerpos primarios; e. poner en contacto la muestra con los al menos dos anticuerpos secundarios; f. realizar una etapa de lavado; g. poner en contacto la muestra con el conjugado; y h. detectar cualquier señal de FRET generada por el aceptor de FRET, en donde se detectará una señal de FRET positiva cuando el donante de FRET esté en el primer anticuerpo secundario unido y el aceptor de FRET esté en el conjugado activado unido y el donante de FRET esté ubicado a menos de 10 nm del aceptor de FRET, y en donde no se detectará señal de FRET cuando el donante de FRET esté en el primer anticuerpo secundario unido y el aceptor de FRET esté en el conjugado activado unido y el donante de FRET esté ubicado a más de 10 nm del aceptor de FRET, o uno o ambos del primer y segundo sitios no estén presentes en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para detectar moléculas en una muestra

Descripción de la invención

La invención se refiere a métodos in vitro para detectar moléculas en una muestra, de acuerdo con las reivindicaciones, en particular, sitios y estados de proteínas en células, tales como los de cortes histológicos. La invención proporciona además la cuantificación de interacciones moleculares, tales como interacciones proteína-proteína en una muestra.

La invención se refiere a métodos de acuerdo con las reivindicaciones que usan transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o Forster (FRET) en combinación con un sistema de activación por enzimas, tal como la amplificación de la señal con tiramida (TSA) para mejorar la detección de moléculas en una muestra, tal como estados de proteínas y una asociación espacial cercana de proteínas. Más específicamente, la invención se refiere a métodos TSA-FRET de dos sitios, donde los dos sitios están en la misma proteína o en proteínas diferentes, tal como en un par de proteínas en un complejo.

Antecedentes

La detección de moléculas en muestras, tal como la determinación de interacciones moleculares, en particular las interacciones proteína-proteína, es clave en muchos campos biológicos, particularmente en la biología del cáncer. Por ejemplo, la comprensión y la medición de la diversidad molecular que sustenta la heterogeneidad del tumor se ha convertido recientemente en una preocupación importante, ya que se cree que no apreciar esto es una de las razones del fracaso terapéutico, particularmente en los tumores sólidos avanzados.

La heterogeneidad genética intratumoral está cada vez mejor documentada en los cánceres sólidos, sin embargo, todavía se entiende poco sobre la heterogeneidad molecular funcional de los tumores. La apreciación de esta heterogeneidad funcional tiene implicaciones de largo alcance para el desarrollo de la medicina personalizada y la mejora de las metodologías de biopsia de tumor para biomarcadores predictivos.

Por ejemplo, el cáncer de mama es heterogéneo tanto a nivel histológico como molecular. Una mejor comprensión de la heterogeneidad del tumor de mama a nivel molecular entre una gran cohorte de pacientes ayudará a identificar los subtipos para predecir el desenlace, la respuesta del paciente a la quimioterapia o a la terapia dirigida.

La evaluación de la heterogeneidad molecular a nivel de proteína no se ha informado ampliamente, en parte debido a la falta de tecnologías que puedan realizar esta tarea con precisión directamente en muestras histológicas. La preparación de muestras de tejido fijadas con formalina e incrustadas en parafina (FFPE) es la técnica estándar actual mediante la cual se procesan las biopsias ambulatorias y quirúrgicas. Los biomarcadores proteicos y sus modificaciones postraduccionales pueden conservarse en muestras de tumores archivadas por FFPE y, por lo tanto, se prestan a la cuantificación precisa del estado funcional y la heterogeneidad de las oncoproteínas, siempre que las herramientas y procesos analíticos sean apropiados.

La medición precisa del estado funcional de las oncoproteínas y la heterogeneidad del tumor a nivel molecular puede ayudar a identificar subtipos para predecir el desenlace, la respuesta del paciente a la quimioterapia o a la terapia dirigida.

Una oncoproteína bien caracterizada, Akt/PKB (proteína quinasa B) es un miembro de la familia AGC de proteínas serina/treonina quinasas y contiene un dominio de homología a pleckstrina (PH) N-terminal que interactúa con Ptdlns(3,4)P2 y Ptdlns(3,4,5)P3. En el cáncer, Akt desempeña un papel central en la proliferación y supervivencia celular, el metabolismo de la glucosa, la estabilidad del genoma y la neovascularización. Akt también contribuye a la invasión tumoral y la diseminación metastásica por inducción de la transición epitelio-mesénquima (EMT). La pérdida de la regulación de la señalización de Akt se considera una característica distintiva de muchos cánceres humanos. En el cáncer de mama, la activación de Akt se produce en casos de alto grado y se correlaciona con enfermedad avanzada, pronóstico desfavorable, reducción de la supervivencia del paciente y radiorresistencia del tumor. Varios mecanismos contribuyen a la activación de la vía de Akt en tumores humanos, que incluyen la afectación de PTEN, la regulación positiva de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K) y la regulación negativa de mTOR (diana de la rapamicina en mamíferos). La vía de Akt también se activa por numerosos factores de crecimiento y citocinas a través de sus receptores afines. La estimulación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) por el factor de crecimiento epidérmico (EGF) conduce a la activación de Akt de una manera dependiente de PI3k . Dado que la activación de Akt es un evento temprano en la progresión tumoral y también una característica de muchos carcinomas avanzados, puede representar una diana terapéutica útil tanto en entornos adyuvantes como metastásicos. Por lo tanto, la cuantificación precisa de su estado de activación, así como su heterogeneidad molecular en muestras de pacientes, sería muy informativa.

En la actualidad, la investigación que implica la detección (y cuantificación) de moléculas, tales como proteínas endógenas, que incluyen oncoproteínas en muestras de tejido tumoral fijadas, enfrenta varios desafíos importantes:

i) la cuantificación precisa de las modificaciones postraduccionales, tales como las fosforilaciones, y de las interacciones proteína-proteína, tales como la interacción de proteínas en un complejo;

ii) la localización simultánea de la proteína en una arquitectura tisular conservada;

La inmunohistoquímica (IHC) es el método más fácilmente disponible para evaluar la activación de proteínas intracelulares, tales como Akt. Sin embargo, debido a que se basa en la intensidad, tiene varias limitaciones, tales como la falta de una puntuación estandarizada, la subjetividad en la interpretación de las muestras etiquetadas y la ausencia de una cuantificación precisa. Además, es un ensayo "de un sitio" que limita la especificidad.

FRET permite medir las interacciones (asociación o disociación) entre dos moléculas, tales como proteínas, muy cercanas (<10 nm) etiquetadas con un par de colorantes fluorescentes. Un colorante fluorescente donante tiene longitudes de onda de excitación/emisión más cortas, que excita a un colorante fluorescente aceptor si el espectro de excitación del aceptor se superpone con el espectro de emisión del donante. Dado que la eficiencia de la transferencia de energía se reduce en el sexto orden de magnitud de la distancia entre los colorantes fluorescentes, la transferencia de energía eficiente generalmente solo se produce entre pares fluorescentes que están separados por menos de 10 nm. Por lo tanto, este enfoque puede usarse para detectar una asociación espacial cercana de moléculas al etiquetarlas con colorantes fluorescentes. Este enfoque también puede usarse para medir la formación de complejos de proteínas, así como los cambios conformacionales en las moléculas, tales como los estados conformacionales y de modificación postraduccional de proteínas individuales.

Una limitación clave del uso de FRET para la detección de moléculas con el uso de anticuerpos es la necesidad de etiquetar un par de anticuerpos con fluoróforos a grados suficientemente altos para lograr una relación señal/ruido adecuada. La obtención de una FRET eficiente depende de la disponibilidad de pares de anticuerpos etiquetados con diferentes fluoróforos (ya sea como proteínas de fusión a GFP/mRFP o mediante conjugación química con colorantes fluorescentes apropiados). Este proceso requiere una optimización cuidadosa y el etiquetado de los anticuerpos. Además, los enfoques de etiquetado actuales de los anticuerpos solo dan una relación señal/ruido suficiente para su uso habitual en líneas celulares en cultivo de tejidos - donde a menudo es necesario sobreexpresar la(s) molécula(s) diana(s). Para cortes histológicos, para que haya suficiente especificidad de unión, sería necesario proporcionar una baja relación de proteína respecto a colorante, lo que daría como resultado una señal débil que a menudo es indetectable. Por lo tanto, el uso de FRET en cortes histológicos en particular, no es habitual.

Para realizar FRET en cortes histológicos, puede usarse "FRET por coincidencia" o FRET "de dos sitios". Tal método implica etiquetar simultáneamente una proteína individual en dos sitios distintos (es decir, los dos sitios diana están en la misma proteína) con un donante de FRET y un aceptor de FRET, y detectar la FRET entre ellos. El método ha ganado popularidad recientemente debido a su alta especificidad y su relativa insensibilidad a los artefactos de intensidad. Sin embargo, las metodologías de FRET con resolución temporal se han visto limitadas por la baja sensibilidad debido al requerimiento de anticuerpos primarios etiquetados con fluorescencia. En particular, para obtener la alta especificidad de unión, es necesario usar una baja relación de proteína respecto a colorante, lo que da como resultado una señal débil. El aumento del etiquetado del anticuerpo da como resultado una reducción de la relación de la señal respecto al ruido y afecta la unión del anticuerpo a la región diana.

Por ejemplo, los ensayos de FRET que cuantifican las proteínas expresadas ectópicamente etiquetadas con pares de fluoróforos donantes y aceptores apropiados tales como GFP y RFP monomérica (mRFP) están bien establecidos. En estos experimentos basados en células, la expresión relativamente elevada de estas proteínas de fusión a GFP y mRFP proporciona una alta relación de la señal respecto al ruido. Sin embargo, cuantificar la activación de proteínas endógenas directamente en las células con el uso de un ensayo de FRET por coincidencia ha sido un desafío, en parte debido al hecho de que para obtener la alta especificidad de unión, es necesario usar una baja relación de proteína respecto a colorante, lo que da como resultado una señal débil.

Cuando los cromóforos se conjugan con anticuerpos primarios, se logran altas eficiencias promedio de FRET, pero se encuentran varias limitaciones. En primer lugar, el proceso de conjugación puede dar como resultado la presencia de múltiples moléculas de colorante en el sitio de reconocimiento del antígeno, con consecuencias adversas sobre la especificidad del anticuerpo por el antígeno. En segundo lugar, la señal obtenida de los conjugados de anticuerpo primario-cromóforo podría no amplificarse debido a limitaciones en la relación de colorante respecto a anticuerpo. Esto es particularmente problemático cuando los biomarcadores proteicos están presentes en bajas cantidades en muestras de tejido. En tercer lugar, el costo se convierte en un factor limitante debido a la gran cantidad de anticuerpos primarios requeridos para la conjugación de anticuerpos y cromóforos. Esto se ve agravado por el hecho de que los conjugados de anticuerpos primarios y cromóforos disponibles comercialmente con pares de FRET compatibles son a menudo difíciles de encontrar. Preparar conjugados de anticuerpos primarios y cromóforos para su uso en experimentos de FRET es igualmente costoso, consume mucho tiempo en la caracterización de cada pareja y existe el riesgo perenne de pérdida de función asociada con el etiquetado o la desnaturalización.

Los anticuerpos primarios no etiquetados se han usado en combinación con anticuerpos secundarios conjugados con cromóforos. Estos se prefieren menos que los conjugados de anticuerpos primarios y cromóforos porque para una FRET eficiente, es importante mantener los fluoróforos donantes y aceptores a distancias donde pueda producirse FRET, es decir, menos de 10 nm. Con el uso de anticuerpos primarios y secundarios, esto puede conducir al aumento de las distancias de los fluoróforos, lo que disminuye, por lo tanto, una señal de FRET positiva y, en consecuencia, la relación de la señal respecto al ruido. Dichas metodologías de etiquetado solo proporcionan una relación señal/ruido suficiente para su uso habitual en líneas celulares - donde con frecuencia es necesario sobreexpresar la(s) molécula(s) diana. Para cortes histológicos, para que haya suficiente especificidad de unión, sería necesario proporcionar una baja relación de proteína respecto a colorante, lo que daría como resultado una señal débil. Esto, en combinación con el aumento de las distancias de los fluoróforos que puede producirse cuando se usan anticuerpos primarios y secundarios, daría como resultado un mayor debilitamiento de la señal, lo que a menudo hace que la señal sea indetectable. Por lo tanto, el uso de FRET en cortes histológicos con anticuerpos primarios y secundarios tampoco es habitual.

Konig y otros discuten el uso en FRET de anticuerpos secundarios etiquetados. Este artículo afirma que las inmunoglobulinas completas, así como los fragmentos Fab, pueden usarse como anticuerpos secundarios con anticuerpos primarios no etiquetados. Sin embargo, tales métodos requieren una optimización cuidadosa.

Jares-Erijman y otros describen un marco fotofísico revisado para FRET y proporcionan un catálogo sistemático de técnicas de FRET adaptadas a sistemas de imágenes.

Chin y otros describen técnicas de inmunohistoquímica y FRET para evaluar las hipótesis de que MARK se expresa en neuronas que desarrollan NFT, y que MARK se asocia específicamente con su supuesto sitio de fosforilación, Ser262, en PHF-tau.

En otras áreas de la biología, tales como la inmunohistoquímica estándar y otros métodos de un sitio, los métodos de amplificación de la señal se han usado en un intento de mejorar la relación de la señal respecto al ruido. Uno de estos métodos es la amplificación de la señal con tiramida (TSA), que amplifica señales cromogénicas y fluorescentes en los métodos de inmunohistoquímica estándar. Esta metodología se basa en la capacidad de la peroxidasa de rábano picante (HRP), en presencia de bajas concentraciones de H²O², de convertir un sustrato que contiene tiramina etiquetada en un radical libre oxidado altamente reactivo (tiramida biotinilada reactiva) que puede unirse covalentemente a restos ricos en electrones (tales como residuos de tirosina) en o cerca de la HRP. Sin embargo, la dinámica de la amplificación por TSA y el radio de difusión de la especie reactiva resultante no se han caracterizado bien. Como tal, se predice que los métodos de amplificación por TSA darán como resultado un etiquetado inespecífico de proteínas que no son diana, lo que crea, por lo tanto, artefactos que se amplificarán indefinidamente para dar como resultado una señal inespecífica.

Anteriormente también se pensaba que el uso de la amplificación por TSA o métodos de amplificación similares en un método de FRET conduciría además al aumento de las distancias de los fluoróforos, lo que disminuye, por lo tanto, una señal de FRET positiva y, en consecuencia, la relación de la señal respecto al ruido.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un método mejorado para detectar moléculas, particularmente estados de proteínas en células, tal como en cortes histológicos.

Resumen de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona un método genérico de alto rendimiento que combina FRET con un sistema de activación por enzimas, tal como un sistema de amplificación de la señal con tiramida (TSA).

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método in vitro para detectar moléculas, que emplea: a. al menos dos anticuerpos primarios, en donde el primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula y el segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, en donde el segundo sitio es diferente del primer sitio y en donde el primer y segundo anticuerpos primarios son inmunológicamente distintos; b. al menos dos anticuerpos secundarios, en donde al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa, y en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta con un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y se une al primer anticuerpo primario; y el segundo anticuerpo secundario se conjuga o fusiona con una enzima y se une al segundo anticuerpo primario, en donde el primer anticuerpo secundario no se une al segundo anticuerpo primario y el segundo anticuerpo secundario no se une al primer anticuerpo primario;

c. un conjugado que comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se forma un conjugado activado, cuyo conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular que están de 2 a 9 nm o menos de 100 KDa de la enzima;

en donde el método comprende:

d. poner en contacto una muestra con los al menos dos anticuerpos primarios;

e. poner en contacto la muestra con los al menos dos anticuerpos secundarios;

f. realizar una etapa de lavado;

g. poner en contacto la muestra con el conjugado; y

h. detectar cualquier señal de FRET generada por el aceptor de FRET;

en donde se detectará una señal de FRET positiva cuando el donante de FRET esté en el primer anticuerpo secundario unido y el aceptor de FRET esté en el conjugado activado unido y el donante de FRET esté ubicado a menos de 10 nm del aceptor de FRET, y en donde no se detectará señal de FREt cuando el donante de FRET esté en el primer anticuerpo secundario unido y el aceptor de FRET esté en el conjugado activado unido y el donante de FRET esté ubicado a más de 10 nm del aceptor de FRET, o bien el primer y segundo sitios no estén presentes en la muestra. En algunas realizaciones, los al menos dos anticuerpos primarios se seleccionan del grupo que consiste en inmunoglobulinas completas, fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de las mismas o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno. En realizaciones particulares, los al menos dos anticuerpos secundarios son fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno. En realizaciones preferidas, los fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno son fragmentos Fab, fragmentos scFv o combinaciones de los mismos.

En algunos aspectos de la descripción, el donante de FRET se selecciona del grupo que consiste en ORG 488, GFp, fluoresceína, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, ATTO488 y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos de la descripción, el aceptor de FRET se selecciona del grupo que consiste en ALX 594, mRFP, tetrametilrodamina, fluoresceína, dabcilo, BODIPY FL, QSY 7, QSY 9 y combinaciones de los mismos.

En algunos aspectos, la al menos una enzima se selecciona del grupo que consiste en oxidorreductasas, hidrolasas, liasas, transferasas, isomerasas y ligasas. En ciertos aspectos, la enzima se selecciona del grupo que consiste en peroxidasas, oxidasas, fosfatasas, esterasas y glucosidasas. En aspectos particulares, la enzima se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa. En algunos aspectos, el sustrato es tiramina.

En algunas realizaciones, los anticuerpos primarios no se etiquetan.

En algunas realizaciones, el primer anticuerpo primario es un anticuerpo murino y el al menos un anticuerpo primario adicional es un anticuerpo de conejo. En realizaciones particulares, el primer anticuerpo secundario es un anticuerpo antimurino y el al menos un anticuerpo secundario adicional es un anticuerpo anticonejo.

En realizaciones preferidas, el primer anticuerpo primario se une a Akt(pan) y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a pAkt(T308) en la proteína Akt 1, Akt 2 o Akt 3.

En algunos aspectos, el método puede usarse para detectar la activación de Akt en la muestra. En ciertos aspectos, la muestra es una muestra de tumor.

En otras realizaciones preferidas, el primer anticuerpo primario se une a HER2 y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a HER3; o el primer anticuerpo primario se une a HER3 y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a HER2.

En otros aspectos, el método puede usarse para detectar la interacción HER2/HER3 en la muestra. En ciertos aspectos, la muestra es una muestra de tumor. En aspectos preferidos, la muestra es una muestra de tumor de mama. En algunos aspectos de los métodos, los al menos dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra simultáneamente o secuencialmente entre sí.

En algunos aspectos de los métodos, los al menos dos anticuerpos secundarios se ponen en contacto con la muestra simultáneamente o secuencialmente entre sí.

En algunos aspectos de los métodos, los al menos dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra simultáneamente con los al menos dos anticuerpos secundarios.

En algunos aspectos de los métodos, los al menos dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra antes que los al menos dos anticuerpos secundarios.

En ciertos aspectos del método, se realiza una etapa de lavado después de poner en contacto con la muestra los al menos dos anticuerpos primarios y antes de poner en contacto con la muestra los al menos dos anticuerpos secundarios.

En algunas realizaciones, el primer anticuerpo secundario se etiqueta directamente con un donante de FRET.

En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de tejido.

En algunas realizaciones, la molécula es una proteína.

En algunas realizaciones, el primer sitio y el segundo sitio están en la misma molécula. En otras realizaciones, el primer sitio y el segundo sitio están en moléculas diferentes.

En algunos aspectos, los métodos comprenden además la etapa de cuantificar la interacción entre el primer sitio y el segundo sitio.

La invención también se refiere a kits para detectar moléculas. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un kit para detectar moléculas, el kit comprende:

i. al menos dos anticuerpos primarios, en donde el primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula y el segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, en donde el segundo sitio es diferente del primer sitio y en donde el primer y segundo anticuerpos primarios son inmunológicamente distintos; j. al menos dos anticuerpos secundarios, en donde al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa, y en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta con un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y se une al primer anticuerpo primario; y el segundo anticuerpo secundario se conjuga o fusiona con una enzima y se une al segundo anticuerpo primario, en donde el primer anticuerpo secundario no se une al segundo anticuerpo primario y el segundo anticuerpo secundario no se une al primer anticuerpo primario;

k. un conjugado que comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde el conjugado se configura de tal manera que cuando el sustrato reacciona con la enzima el conjugado forma un conjugado activado que puede unirse a restos ricos en electrones en una superficie molecular que están de 2 a 9 nm o menos de 100 KDa de la enzima.

En algunas realizaciones de los kits, los al menos dos anticuerpos primarios se seleccionan del grupo que consiste en inmunoglobulinas completas, fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de las mismas o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones de los kits, al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno. En realizaciones particulares de los kits, los al menos dos anticuerpos secundarios son fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno. En realizaciones preferidas, los fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno son fragmentos Fab, fragmentos scFv o combinaciones de los mismos.

En algunos aspectos de la descripción de los kits, el donante de FRET se selecciona del grupo que consiste en ORG 488, GFp, fluoresceína, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, ATTO488 y combinaciones de los mismos.

En algunos aspectos de la descripción de los kits, el aceptor de FRET se selecciona del grupo que consiste en ALX 594, mRFP, tetrametilrodamina, fluoresceína, dabcilo, BODIPY FL, QSY 7, QSY 9 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones de los kits, la al menos una enzima se selecciona del grupo que consiste en oxidorreductasas, hidrolasas, liasas, transferasas, isomerasas y ligasas. En ciertas realizaciones de los kits, la enzima se selecciona del grupo que consiste en peroxidasas, oxidasas, fosfatasas, esterasas y glucosidasas. En realizaciones particulares de los kits, la enzima se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa.

En algunas realizaciones de los kits, el sustrato es tiramina.

En algunas realizaciones de los kits, los anticuerpos primarios no se etiquetan.

En algunas realizaciones de los kits, el primer anticuerpo primario es un anticuerpo murino y el al menos un anticuerpo primario adicional es un anticuerpo de conejo.

En algunas realizaciones de los kits, el primer anticuerpo secundario es un anticuerpo antimurino y el al menos un anticuerpo secundario adicional es un anticuerpo anticonejo. En realizaciones preferidas de los kits, el primer anticuerpo primario se une a Akt(pan) y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a pAkt(T308) en la proteína Akt 1, Akt 2 o Akt 3. En otras realizaciones preferidas de los kits, el primer anticuerpo primario se une a HER2 y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a HER3; o el primer anticuerpo primario se une a HER3 y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a HER2.

En algunas realizaciones de los kits, el primer anticuerpo secundario se etiqueta directamente con un donante de FRET.

Los kits de la invención también pueden usarse en los métodos de la invención mencionados anteriormente. La presente invención también abarca métodos para detectar moléculas con el uso de los kits de la invención de acuerdo con las reivindicaciones.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente el experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En la presente descripción se describen métodos y materiales para su uso en la presente invención. También pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras, y de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

Ahora se describirán en más detalle las realizaciones no limitantes de la presente invención a modo de referencia a las figuras, en las que:

La FIGURA 1 muestra una realización específica de la presente invención donde se usa un método FRET TSA de dos sitios para detectar las dianas Akt(pan) y pAkt(T308) cuando están en asociación espacial cercana (menos de 10 nm). El método usa un sistema de amplificación etiquetado con TSA con fragmentos Fab como anticuerpos secundarios. Los conjugados de fragmento Fab antirratón-ORG488 se usaron como donantes y los conjugados de fragmento Fab anticonejo-HRP asociados con TSA-ALX594 se usaron como cromóforos aceptores.

La FIGURA 2 muestra un esquema de la configuración del experimento de FD-FLIM.

La FIGURA 3 muestra la cuantificación de la expresión endógena de Akt(pT308) activada en células SKBR3 fijadas con el uso de un ensayo TSA-FRET.

En la FIGURA 3(a), las células SKBR3 se trataron previamente con LY294002 (50 j M) durante 30 min antes de la estimulación con EGF (100 ng/ml) durante 6 min como se indica. Los paneles muestran las imágenes de intensidad y mapa del tiempo de vida del donante panAkt solo (con conjugados Fab-ORG488) o en presencia del aceptor pT308 (con conjugados Fab-HRP asociados con TSA-ALX495). La cuantificación de las eficiencias de FRET se muestra como un gráfico de caja y bigotes para el donante panAkt solo (gráfico superior: eficiencia de FRET cero) y para el donante en presencia del aceptor panAkt+pT308 (más de 16 % de eficiencia de FRET para la estimulación con EGF). El aumento en la eficiencia promedio de FRET con EGF fue claramente perceptible en la membrana plasmática como se observa en el mapa de tiempo de vida (azul: tiempo de vida largo; rojo: tiempo de vida corto). Las cuantificaciones muestran las medias ±SEM de al menos 20 células diferentes (***, p<0,0001, ns, no significativo).

La FIGURA 3(b) muestra el mismo experimento que en la FIGURA 3(a) pero sin señal del aceptor amplificada por TSA (con el uso de conjugados Fab-ALX495 como aceptor). El gráfico de caja y bigotes representa la media ±SEM de la eficiencia de FRET de pT308. Los datos muestran que el rango dinámico de los datos de eficiencia de FRET se reduce fuertemente en ausencia de amplificación por TSA de la intensidad del aceptor. La eficacia máxima de FRET tras la estimulación con EGF fue de solo 7 % (***, p<0,0001, ns, no significativo).

La FIGURA 4 muestra la cuantificación de la expresión endógena de Akt (pT308) activada en tumor de mama humano FFPE fijado con el uso del ensayo TSA-FRET.

La FIGURA 4(a) muestra imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de tumores de mama humanos FFPE de tres pacientes diferentes etiquetados con donante solo (panAkt);

La FIGURA 4(b) muestra el donante en presencia del aceptor (panAkt+pT308) como se indica. Los gráficos de caja y bigotes presentan la eficiencia promedio de FRET del donante solo (panAkt) y en presencia del aceptor (panAkt+pT308) de al menos 10 áreas diferentes de los mismos cortes histológicos. El aumento de la eficiencia de FRET representa el estado de fosforilación de Akt endógena y muestra la variabilidad de un paciente a otro. La eficiencia promedio de FRET varía de 3 % a 6 % (***, p<0,0001) en estos 3 pacientes y puede detectarse con gran precisión con el uso de la amplificación de la señal por TSA-FRET.

La FIGURA 4(c) muestra como un control de fosfatasa alcalina intestinal (CIP) de ternera se usó para comprobar que la eficiencia de FRET medida con el sistema TSA-FRET se debía realmente a los niveles de fosforilación de Akt. El gráfico de caja y bigotes muestra una reducción altamente significativa (***, p<0,0001) de la eficiencia de FRET de la señal de panAkt+pT308 en la condición de tratamiento con CIP, lo que confirma la especificidad del sistema TSA-FRET.

La FIGURA 5 muestra el análisis de TMA de mama humano para la cuantificación de alto rendimiento de Akt (pT308) activada y la heterogeneidad molecular con el uso de TSA-FRET.

La FIGURA 5(a) muestra la tinción con H&E de micromatrices de tumor de mama (TMA). Las TMA se prepararon a partir de biopsias de tumor de mama obtenidas de 10 pacientes. Para cada paciente, se seleccionaron 4 muestras de punción (círculos 1 a 4) de regiones diferentes en cada biopsia. En total, se aplicaron 40 muestras de punción de tumor (4 x 10 pacientes) en cada TMA de mama. La imagen inferior muestra una vista ampliada de una muestra de punción que puede dividirse en 4 regiones de interés (ROI) para su posterior análisis. Los paneles de la derecha muestran 3 aumentos diferentes de la misma región de la muestra de punción.

La FIGURA 5(b) muestra imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de las TMA teñidas solo con anticuerpo primario contra panAkt, seguido del etiquetado de amplificación de la señal por TSA (donante solo). La FIGURA 5(c) muestra imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de las TMA correspondientes (duplicado de la TMA usada para el etiquetado del donante solo (b)) teñido con anticuerpos primarios contra panAkt+pT308, seguido del etiquetado de amplificación de la señal por TSA (donante aceptor). Con el uso del algoritmo FLIM automatizado desarrollado internamente, las TMA se mapearon para cada posición de muestra de punción de tumor en el portaobjetos de TMA de donante (panAkt) y en el portaobjetos de TMA correspondiente de donante más aceptor (panAkt+pT308).

FIGURA 5(d) - el gráfico muestra la variabilidad de la eficiencia de FRET dentro de las 4 muestras de punción de la misma muestra de paciente. Para cada muestra de punción, se calculó la eficiencia de FRET en 4 r O i diferentes. Cada barra presenta el valor máximo de eficiencia de FRET de las 4 ROI.

FIGURA 5(e) - los datos presentan la media 6SEM de la eficiencia promedio de FRET de las 4 muestras de punción del mismo paciente.

La FIGURA 6 muestra el análisis de TMA de colon humano para la cuantificación de alto rendimiento de Akt (pT308) activada y la heterogeneidad molecular con el uso de TSA-FRET.

La FIGURA 6(a) muestra la tinción con H&E de las micromatrices de tumor de mama. Las TMA se prepararon a partir de biopsias de tumor de colon obtenidas de 7 pacientes. Para cada paciente, se seleccionaron 4 muestras de punción (círculos 1 a 4) de regiones diferentes en cada biopsia. En total, se aplicaron 28 muestras de punción de tumor (4 x 7 pacientes) en cada TMA de colon. La imagen inferior muestra una vista ampliada de una muestra de punción que puede dividirse en 4 regiones de interés (ROI) para su posterior análisis. Los paneles de la derecha muestran 3 aumentos diferentes de la misma región de la muestra de punción.

La FIGURA 6(b) muestra imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de las TMA teñidas solo con anticuerpo primario contra panAkt, seguido del etiquetado de amplificación de la señal por TSA (donante solo). La FIGURA 6(c) muestra imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de las TMA correspondientes (duplicado de las muestras de punción usado para el etiquetado del donante solo etiquetado con anticuerpos primarios contra panAkt+pT308, seguido del etiquetado de amplificación de la señal por TSA (donante aceptor). Con el uso de un algoritmo FLIM automatizado especialmente diseñado, las TMA se mapearon para cada posición de muestra de punción de tumor en el portaobjetos de TMA de donante (panAkt) y en el portaobjetos de TMA correspondiente de donante más aceptor (panAkt+pT308).

FIGURA 6(d) - el gráfico muestra la variabilidad de la eficiencia de FRET dentro de las 4 muestras de punción de la misma muestra de paciente. Para cada muestra de punción, se calculó la eficiencia de FRET en 4 ROl diferentes. Cada barra presenta el valor máximo de eficiencia de FRET de las 4 ROI (sectores).

FIGURA 6(e) - los datos presentan la media ±SEM de la eficiencia promedio de FRET de las 4 muestras de punción del mismo paciente.

La FIGURA 7 muestra el análisis de TMA de mama humano para la cuantificación de alto rendimiento de Akt activada con el uso de TSA-FRET de dos sitios.

La FIGURA 7(a) muestra la tinción con H&E de micromatrices de tumor de mama. Esta TMA de mama contiene muchas muestras de tejido representativas pequeñas de 120 pacientes diferentes ensambladas en un solo portaobjetos histológico. La imagen inferior muestra una vista ampliada de una muestra de punción que puede dividirse en 4 regiones de interés (ROl) para su posterior análisis. Los paneles de la derecha muestran tres aumentos diferentes de la misma región de la muestra de punción. La FIGURA 7(b) muestra imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de las TMA teñidas con anticuerpos primarios contra panAkt solo o contra panAkt+pT308 (en una TMA duplicada), seguido del etiquetado de amplificación de la señal por TSA (donante solo o donante aceptor). Con el uso de un algoritmo FLIM automatizado especialmente diseñado, las TMA se mapearon para cada posición de muestra de punción de tumor en el portaobjetos de TMA de donante (panAkt) y en el portaobjetos de TMA correspondiente de donante más aceptor (panAkt+pT308). Los tres gráficos presentan la variabilidad de la eficiencia de FRET dentro de las 4 ROI de la misma muestra de punción de paciente y en diferentes muestras de punción de pacientes.

FIGURA 7(c) - el gráfico muestra el valor máximo de eficiencia de FRET de las 4 ROI/paciente.

La FIGURA 8 muestra la evaluación de la interacción de PKB y PDK1 en xenoinjertos de mama humanos triple negativos, con el uso del anticuerpo contra PDK1 (aa350-436) de policlonal de conejo LS-Bio (especificidad comprobada en FFPE) y monoclonal de ratón contra panAkt (SKB1) de Millipore, especificidad comprobada en FFPE). Ambos anticuerpos primarios anteriores se incubaron en los tejidos durante 16 h a 4 °C. Para TSA-FRET, la PDK1 se etiquetó con Fab contra conejo-T-ALX594 como aceptor y panAkt se etiquetó con Fab contra ratón-ORG488 como donante.

La FIGURA 9(a) muestra TSA-FRET con el uso de Fab IgG (ratón y conejo) teñido simultáneamente para la cuantificación de pAkt (pT308) en tejidos FFPE de mama humanos. Los anticuerpos primarios contra panAkt y pT308 se añadieron simultáneamente al tejido FFPE de tumor de mama humano. Al día siguiente, se añadieron secuencialmente los anticuerpos secundarios Fab-IgG (ratón y conejo) seguido de amplificación por TSA.

La FIGURA 9(b) muestra TSA-FRET con el uso de Fab IgG (ratón y conejo) teñido secuencialmente para la cuantificación de pAkt (pT308) en tejidos FFPE de mama humanos. Los anticuerpos primarios contra panAkt y pT308 se añadieron secuencialmente al tejido FFPE de tumor de mama humano. Al día siguiente, se añadieron secuencialmente los anticuerpos secundarios Fab-IgG (ratón y conejo) seguido de amplificación por TSA.

La FIGURA 10 muestra imágenes confocales de Fab-IgG con TSA-FRET. Análisis de imágenes confocales de panAkt y pT308. La FIGURA 11 muestra la cuantificación de pAkt (pT308) endógena en tejido humano de mama normal y tumoral FFPE fijado con el uso de FRET amplificada. Esta figura proporciona imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de los tejidos de mama humanos FFPE de dos tejidos normales diferentes (normal 1, normal 2) y un tejido tumoral etiquetado con donante solo (panAkt) o donante/aceptor (panAkt+pT308). Las eficiencias de FRET se muestran como gráficos de caja y bigotes que representan la media ±SEM de al menos 10 regiones diferentes del mismo corte histológico (****, p<0,0001).

Las FIGURAS 12(a) a (c) muestran la cuantificación de alto rendimiento de la activación de Akt en TMA de mama humano con el uso de FRET amplificada/FLIM.

La FIGURA 12(a) muestra la tinción de TMA de mama preparadas a partir de biopsias de tumor de mama obtenidas de 230 pacientes. Cada muestra de punción es una muestra de tejido representativa de un solo paciente. La imagen inferior muestra una vista ampliada de una muestra de punción dividida en 4 sectores para su posterior análisis. Los paneles de la derecha muestran 3 aumentos diferentes del sector 4. La FIGURA 12(b) muestra imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de las TMA teñidas con donante solo (panAkt) y donante+aceptor (panAkt+pT308), seguido de amplificación por TSA. Las TMA se mapearon y las imágenes se adquirieron automáticamente con el uso de la plataforma FRET/FLIM. Los tres gráficos presentan la eficiencia de FRET de cada sector de la misma muestra de punción de paciente, para 3 pacientes representativos.

FIGURA 12(c) - los pacientes se ordenaron por eficiencia de FRET descendente. Para cada paciente se representó gráficamente la eficiencia de FRET (puntos negros, eje Y izquierdo) y la relación de intensidades (puntos grises, eje Y derecho). La línea de regresión para la relación de intensidades (línea gris, R2 = 0,3414) se muestra para la comparación con la eficiencia de FRET.

Las FIGURAS 13(a) y (b) muestran curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de todos los pacientes con carcinoma de mama (ER-/ER+) que comparan la activación de Akt alta y baja.

La FIGURA 13(a) muestra gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestran la ausencia de enfermedad (gráfico izquierdo) y la supervivencia general de los pacientes (gráfico derecho) con activación de Akt alta (tercil superior, rojo) o activación de Akt baja (terciles inferiores, azul) según se determinó por FRET amplificada. Se muestran los resultados de las pruebas del orden logarítmico.

La FIGURA 13(b) muestra los resultados correspondientes cuando la activación de Akt se evalúa por la relación de intensidades (calculada como pT308 dividida por la intensidad de panAkt).

Las FIGURAS 13(c) y (d) muestran curvas de supervivencia de Kaplan-Meier que comparan la activación de Akt alta y baja para pacientes con carcinoma de mama ER+.

La FIGURA 13(c) muestra gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestran la ausencia de enfermedad (gráfico izquierdo) y la supervivencia general de los pacientes (gráfico derecho) con activación de Akt alta (tercil superior, rojo) o activación de Akt baja (terciles inferiores, azul) según se determinó por FRET amplificada. Se muestran los resultados de las pruebas del orden logarítmico.

La FIGURA 13(d) muestra los resultados correspondientes cuando la activación de Akt se evalúa por la relación de intensidades (calculada como

pT308 dividida por la intensidad de panAkt).

Las FIGURAS 13(e) a (h) muestran la distribución de la activación de Akt revelada por FRET amplificada de todos los pacientes con carcinoma de mama (ER-/ER+).

La FIGURA 13(e) muestra la eficiencia media de FRET de los pacientes agrupados por estado de ER (***, p<0,0001). La FIGURA 13(f) muestra la media de la relación de intensidades de los pacientes agrupados por estado de ER (ns, no significativo).

La FIGURA 13(g) muestra la distribución de la población de pacientes según los cuartiles de FRET, agrupados por estado de ER (negro, cuartil de FRET alto; gris claro, cuartil de FRET bajo).

FIGURA 13(h) - Las eficiencias de FRET se muestran como gráficos de caja y bigotes que representan la distribución por edades de los pacientes de acuerdo con los terciles de FRET (ns, no significativo).

La FIGURA 14(a) muestra los resultados del análisis de transferencia Western con el uso de Cellsig, Dako y LSBio. La interacción HER2/HER3 se midió con el uso de un ensayo de amplificación de la señal con tiramida (TSA) basado en fragmentos Fab.

La FIGURA 14(b) muestra los resultados de microscopía confocal donde se midió la colocalización de HER2 y HER3 endógenos en células SKBR3 no estimuladas.

Las FIGURAS 14(c) y (d) muestran la detección de la dimerización de HER2-HER3 endógenos en células SKBR3. Las células SKBR3 no estimuladas se fijaron y se tiñeron con anticuerpos contra HER2 y HER3.

La FIGURA 14(e) muestra los resultados de imágenes confocales de la determinación de la colocalización de HER2 y HER3 endógenos en células SKBR3 estimuladas con NRG1 en comparación con células SKBR3 no estimuladas. Las FIGURAS 14(f) y (g) muestran los resultados de eficiencia de FRET (E^f) de la determinación de la colocalización de HER2 y HER3 endógenos en células SKBR3 estimuladas con NRG1 en comparación con células SKBR3 no estimuladas, para D solo y DA con el uso del análisis FRET-FLIM.

Las FIGURAS 14(h) e (i) muestran la medición de la dimerización de HER2-HER3 en portaobjetos de control de HER2 con el uso de los métodos de FRET amplificada de la presente invención. Las figuras muestran la eficiencia de FRET (E^f) con el uso del análisis FRET-FLIM.

La FIGURA 15(a) muestra los resultados de imágenes confocales de la detección de la colocalización de HER2-HER3 endógenos en tejido de mama humano (TMA BRC961 se obtuvo de US Biomax).

Las FIGURAS 15(b) a (d) muestran gráficos de los resultados de eficiencia de FRET de la detección de la colocalización de HER2-HER3 endógenos en tejido de mama humano (TMA BRC961 se obtuvo de US Biomax). Descripción detallada de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona un método genérico de alto rendimiento de acuerdo con las reivindicaciones que combina los atributos espacio-temporales y cuantitativos de la FRET con resolución temporal detectada por FLIM de dominio de frecuencia múltiple (mFD-FLIM) con la sensibilidad de un sistema de activación por enzimas, tal como un sistema de amplificación de la señal con tiramida (TSA), que actúa para amplificar la señal.

En un aspecto, se proporciona un método para detectar moléculas, que emplea:

a. al menos dos anticuerpos primarios, en donde el primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula y el segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, en donde el segundo sitio es diferente del primer sitio y en donde el primer y segundo anticuerpos primarios son inmunológicamente distintos; b. al menos dos anticuerpos secundarios, en donde al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa, y en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta con un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y se une al primer anticuerpo primario; y el segundo anticuerpo secundario se conjuga con una enzima y se une al segundo anticuerpo primario, en donde el primer anticuerpo secundario no se une al segundo anticuerpo primario y el segundo anticuerpo secundario no se une al primer anticuerpo primario; c. un conjugado que comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se forma un conjugado activado, cuyo conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular que están de 2 a 9 nm o menos de 100 KDa de la enzima;

en donde el método comprende:

d. poner en contacto una muestra con los al menos dos anticuerpos primarios;

e. poner en contacto la muestra con los al menos dos anticuerpos secundarios;

f. realizar una etapa de lavado;

g. poner en contacto la muestra con el conjugado; y

h. detectar cualquier señal de FRET generada por el aceptor de FRET;

en donde se detectará una señal de FRET positiva cuando el donante de FRET esté en el primer anticuerpo secundario unido y el aceptor de FRET esté en el conjugado activado unido y el donante de FREt esté ubicado a menos de 10 nm del aceptor de FRET, y en donde no se detectará señal de FREt cuando el donante de FRET esté en el primer anticuerpo secundario unido y el aceptor de FRET esté en el conjugado activado unido y el donante de FRET esté ubicado a más de 10 nm del aceptor de FRET, o bien el primer y segundo sitios no estén presentes en la muestra. En algunos aspectos, los métodos de la invención pueden usarse para detectar la activación de una oncoproteína (PKB/Akt), en tumores de mama y colon. En ciertos aspectos, la resolución resultante evidencia la heterogeneidad molecular en los tumores.

En algunos aspectos, los métodos de la invención pueden usarse para detectar interacciones proteína-proteína, tales como las interacciones HER2/HER3. La muestra usada para detectar las interacciones proteína-proteína puede ser una muestra de células o una muestra de tejido. La muestra de tejido puede ser una muestra de tejido de mama. En una realización preferida, los métodos de la invención se usan para detectar las interacciones HER2/HER3 en una muestra de tejido de mama, tal como una muestra de tumor de mama. En ciertos aspectos, los métodos de la invención pueden usarse para determinar si existe o no un estado patológico en la muestra de tejido, tal como la presencia de un tumor.

En algunos aspectos, los métodos de la invención pueden usarse para informar sobre marcadores de pronóstico, predictivos y de diagnóstico.

Los métodos de la invención pueden automatizarse. En una realización, los métodos automatizados utilizan mFD-FLIM. En realizaciones preferidas, los métodos automatizados pueden usarse con TSA-FRET de dos sitios. En algunas realizaciones, los métodos automatizados pueden usarse para detectar la activación de una oncoproteína, por ejemplo, en tumores de mama y colon. En una realización, puede usarse mFD-FLIM automatizado en combinación con TSA-FRET de dos sitios para detectar la activación de una oncoproteína (PKB/Akt) en tumores de mama y colon con una resolución que evidencia la heterogeneidad molecular en los tumores.

i. al menos dos anticuerpos primarios, en donde el primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula y el segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, en donde el segundo sitio es diferente del primer sitio y en donde el primer y segundo anticuerpos primarios son inmunológicamente distintos; j. al menos dos anticuerpos secundarios, en donde al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa, y en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta con un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y se une al primer anticuerpo primario; y el segundo anticuerpo secundario se conjuga con una enzima y se une al segundo anticuerpo primario, en donde el primer anticuerpo secundario no se une al segundo anticuerpo primario y el segundo anticuerpo secundario no se une al primer anticuerpo primario; k. un conjugado que comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde el conjugado se configura de tal manera que cuando el sustrato reacciona con la enzima, el conjugado forma un conjugado activado que puede unirse a restos ricos en electrones en una superficie molecular que están de 2 a 9 nm o menos de 100 KDa de la enzima.

Los métodos de la invención tienen la ventaja de proporcionar una metodología de alto rendimiento genérica y robusta de bajo costo con una relación señal/ruido mejorada.

Los nuevos métodos de la invención pueden usarse, en particular, para abordar los desafíos de la investigación proteómica fundamental y aplicable en patologías humanas que incluyen el cáncer.

Definiciones:

"Sistema de activación por enzimas" se refiere a un sistema enzimático donde al menos una enzima se acopla, de cualquier manera conocida por un experto en la técnica, a un miembro de un par de unión específica. Por ejemplo, la enzima puede conjugarse o fusionarse al par de unión específica. En la presente invención, el par de unión específica puede ubicarse en un anticuerpo. En ciertas realizaciones, el par de unión específica se ubica en un anticuerpo seleccionado del primer anticuerpo primario, el segundo anticuerpo primario, el primer anticuerpo secundario y el segundo anticuerpo secundario y combinaciones de los mismos.

La enzima, ya sea sola o junto con una segunda enzima, reacciona con un conjugado que comprende un sustrato etiquetado de forma detectable, para formar un conjugado activado. El conjugado activado se une a un receptor (por ejemplo, restos ricos en electrones) en una superficie molecular adyacente a la enzima (2 a 9 nm o menos de 100 KDa de la enzima). La unión puede ser mediante unión covalente. El conjugado activado puede depositarse donde quiera que se encuentren receptores (por ejemplo, restos ricos en electrones) para el conjugado activado. Los receptores (por ejemplo, restos ricos en electrones) en la superficie molecular no son reactivos con el sistema de activación por enzimas. Por lo tanto, el sustrato etiquetado de forma detectable se une a los receptores (por ejemplo, restos ricos en electrones) solo cuando el sustrato etiquetado de forma detectable se ha activado por la enzima para formar un conjugado activado. En ausencia de la enzima, el sustrato etiquetado de forma detectable no forma un conjugado activado.

El sustrato etiquetado de forma detectable del conjugado puede comprender uno o más componentes. En una realización, el sustrato etiquetado de forma detectable comprende un componente que contiene el sitio de unión para el receptor (por ejemplo, restos ricos en electrones) y una etiqueta detectable. En otra realización, el sustrato comprende dos componentes; un componente puede contener el sitio de unión para el receptor (por ejemplo, restos ricos en electrones) y se encuentra etiquetado de forma detectable. El otro componente puede contener un constituyente que previene o interfiere con la unión a los receptores (por ejemplo, restos ricos en electrones) hasta el momento en que la enzima active el conjugado.

El término "etiquetado de forma detectable" significa que el sustrato está acoplado directamente a una etiqueta detectable o indirectamente a una etiqueta detectable.

El sustrato puede etiquetarse de forma detectable con el uso de métodos bien conocidos por un experto en la técnica. En el caso del etiquetado indirecto, el sustrato puede acoplarse a un primer miembro no etiquetado de un par de unión específica. Después de la activación y unión al receptor (por ejemplo, restos ricos en electrones) por el conjugado activado, el primer miembro del par de unión específica puede reaccionar con el segundo miembro del par de unión específica, que está acoplado a una etiqueta detectable. Alternativamente, el primer miembro del par de unión específica puede reaccionar previamente con el segundo miembro del par de unión específica, que está acoplado a un indicador, antes de la activación y unión del receptor (por ejemplo, restos ricos en electrones) por el conjugado activado.

En la presente invención, la etiqueta detectable comprende un aceptor de FRET o un donante de FRET. En realizaciones preferidas, la etiqueta detectable comprende un aceptor de FRET. En algunos aspectos de la presente invención, el sustrato comprende tiramida. En algunas realizaciones, el sustrato etiquetado de forma detectable comprende tiramida etiquetada con un donante de FRET. En realizaciones preferidas, el sustrato etiquetado de forma detectable comprende tiramida etiquetada con un aceptor de FRET.

La enzima puede seleccionarse de oxidorreductasas, hidrolasas, liasa, transferasas, isomerasas, ligasas y combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, la enzima se selecciona de peroxidasas, oxidasas, fosfatasas, esterasas, glucosidasas y combinaciones de las mismas. En realizaciones preferidas, la enzima se selecciona de peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y combinaciones de las mismas.

El término "conjugado activado" se refiere a un conjugado que comprende un sustrato etiquetado de forma detectable que es específico para el sistema de activación por enzimas y que se ha activado por la enzima del sistema. Después de la activación, el conjugado activado puede unirse a los receptores (por ejemplo, restos ricos en electrones) en una superficie molecular adyacente a la enzima. Una muestra se somete a condiciones de reacción suficientes para hacer que la enzima catalice la activación del sustrato para formar el conjugado activado.

El experto en la técnica conoce bien las condiciones de reacción suficientes para hacer que la enzima catalice la activación del sustrato. En el caso de la amplificación de la señal con tiramida (TSA), la enzima empleada es la hidrógeno peroxidasa y el sustrato etiquetado de forma detectable es la tiramida etiquetada de forma detectable. Las condiciones de reacción requieren la presencia de peróxido de hidrógeno para que la hidrógeno peroxidasa catalice la activación de la tiramida etiquetada de forma detectable para formar un conjugado activado que contiene radicales de tiramida etiquetados de forma detectable. En realizaciones preferidas, la etiqueta detectable es un aceptor de FRET o un donante de FRET. En aspectos particularmente preferidos de la descripción, la etiqueta detectable es ALX594 u ORG488. En otros aspectos preferidos de la descripción, la etiqueta detectable es ALX594 o ATTO488.

En realizaciones preferidas, el sustrato etiquetado de forma detectable comprende tiramida etiquetada con un aceptor de FRET y la enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante) activa la tiramida para formar un conjugado activado que comprende radicales de tiramida altamente reactivos de corta duración acoplados al aceptor de FRET, cuyos radicales pueden acoplarse covalentemente a restos ricos en electrones en una superficie molecular adyacente a la enzima. En realizaciones preferidas, los residuos ricos en electrones son residuos de tirosina. La superficie molecular puede ser una secuencia de proteína o ácido nucleico.

El término "amplificación" se refiere a la amplificación de una señal indicadora proporcionada por la etiqueta detectable del sustrato etiquetado de forma detectable debido a la unión de conjugados que comprenden el sustrato etiquetado de forma detectable que se ha activado por el sistema de activación por enzimas a restos ricos en electrones en una superficie molecular adyacente a la enzima. En la presente invención, la señal indicadora puede comprender fluorescencia. En algunas realizaciones, la señal indicadora comprende fluorescencia emitida por un aceptor de FRET o un donante de FRET. En realizaciones preferidas, la señal indicadora comprende fluorescencia emitida por un aceptor de FRET.

El sistema de activación por enzimas de la presente invención puede aplicarse al primer anticuerpo primario, el segundo anticuerpo primario, el primer anticuerpo secundario, el segundo anticuerpo secundario o una combinación de los mismos, siempre que el sistema se aplique al menos a uno del primer anticuerpo secundario y el segundo anticuerpo secundario.

"Adyacente a" en el contexto del sistema de activación por enzimas se refiere a receptores ubicados muy cercanos a la enzima. Por ejemplo, la distancia entre la enzima y los receptores puede ser de aproximadamente 2 a 9 nm o menos de 100 kDa (preferiblemente, de 2 a 9 nm, de 2 a 7 nm, de 2 a 6 nm, de 2 a 5 nm, de 2 a 4 nm o 2 a 3 nm o menos de 90 kDa, menos de 80 kDa, menos de 70 kDa, menos de 60 kDa, menos de 50 kDa, menos de 40 kDa, menos de 30 kDa, menos de 20 kDa o menos de 10 kDa).

Una realización específica de un sistema de activación por enzimas individual es un sistema de amplificación de la señal con tiramida (TSA). El sistema utiliza la actividad catalítica de la peroxidasa de rábano picante, que activa la tiramida acoplada al indicador para formar un conjugado activado que comprende radicales de tiramida altamente reactivos de corta duración, cuyos radicales pueden acoplarse covalentemente a residuos de tirosina en una superficie molecular adyacente a la peroxidasa de rábano picante. La superficie molecular puede ser un residuo de proteína o ácido nucleico.

La "transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (o Forster) (FRET)" es un proceso fotofísico en el que la energía se transfiere de un fluoróforo de FRET (donante) excitado a un fluoróforo de FRET (aceptor) adyacente mediante una interacción dipolo-dipolo no radioactiva. La eficiencia de la transferencia de energía varía inversamente con la sexta potencia de la distancia, que separa los fluoróforos donantes y aceptores, por tanto, la distancia en la cual puede producirse FRET está limitada a 9 nm. Por lo tanto, FRET es una "regla química" usada para medir la cercanía molecular.

La figura a continuación muestra los principios de FRET:

Distancia de más de 10 nm = = Distancia de menos de 10 nm = 528 nm

Distancia de más de 10 nm = Distancia de menos de 10 nm =

FRET permite medir las interacciones (asociación o disociación) entre dos proteínas muy cercanas (<10 nm) etiquetadas con un par de colorantes fluorescentes.

"Donante de FRET' se refiere a un sustrato cromogénico o fluorogénico que tiene longitudes de onda de excitación/emisión más cortas que un aceptor de FRET. En la figura anterior, el donante de FRET es la proteína fluorescente cian (CFP).

"Aceptor de FRET" se refiere a un sustrato cromogénico o fluorogénico que tiene longitudes de onda de excitación/emisión más largas que un donante de FRET. En la figura anterior, el aceptor de FRET es la proteína fluorescente amarilla (YFP).

El cromóforo donante (donante de FRET) excita la molécula aceptora (aceptor de FRET) cuando el espectro de emisión del donante y el espectro de excitación del aceptor se superponen. Las moléculas donante de FRET y aceptora de FRET deben estar muy cerca (menos de 10 nm). Cuando la distancia entre el donante y el aceptor es de menos de 10 nm, se produce la excitación del aceptor, lo que proporciona una señal indicadora fluorescente medible. Además de detectar la señal indicadora, es posible cuantificar la señal indicadora. Este enfoque puede usarse para determinar la distancia entre los cromóforos donantes y aceptores. Este enfoque también puede usarse para medir interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-lípido, interacciones proteína-ADN y cambios conformacionales de las proteínas, tales como los estados conformacionales y de modificación postraduccional de proteínas individuales.

La eficiencia de FRET (£)(£) es el rendimiento cuántico de la transición de transferencia de energía, es decir, la fracción del evento de transferencia de energía que se produce por el evento de excitación del donante de FRET:

'E .T

kf-*-kFT+ £ k¡

'■E.T

kf+líFT*- 5! K

donde kETkET es la velocidad de transferencia de energía, kfkf la velocidad de desintegración radioactiva y kiki son las constantes de velocidad de cualquier otra vía de desexcitación.

La eficiencia de FRET depende de muchos parámetros físicos, que incluyen la distancia entre el donante y el aceptor, la superposición espectral del espectro de emisión del donante de FRET y el espectro de absorción del aceptor de FRET y la orientación relativa del momento dipolar de emisión del donante de FRET y el momento dipolar de absorción del aceptor de FRET.

EE depende de la distancia de separación entre el donante de FRET y el aceptor de FRET rr con una ley de 6ta potencia inversa debido al mecanismo de acoplamiento dipolo-dipolo:

1

E = --------------- ;

i- (.r/Ra)b

siendo R⁰R⁰la distancia de Forster de este par de donante de FRET y aceptor de FRET. Esta es la distancia a la cual la eficiencia de transferencia de energía es aproximadamente 50 %.

La distancia de Forster depende de la integral de superposición del espectro de emisión del donante de FRET con el espectro de absorción del aceptor de FRET y su orientación molecular mutua como se expresa en la siguiente ecuación:

^{* nB=-}12Bfr5f!4A^

6 9q c(in lOinrJ

D Í 2 B í r Sf i X

donde QoQo es el rendimiento cuántico de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor de FRET, k2 es el factor de orientación del dipolo, nn es el índice de refracción del medio, N^aN^a es el número de Avogadro y JJ es la integral de superposición espectral calculada como

donde fofo es el espectro de emisión del donante de FRET normalizado, y e^ ê es el coeficiente de extinción molar del aceptor de FRET. A menudo se asume que k2 =2/3. Este valor se obtiene cuando tanto el donante como el aceptor rotan libremente y pueden considerarse orientados isotópicamente durante el tiempo de vida del estado excitado. Si cualquiera del donante o el aceptor está fijo o no puede rotar libremente, entonces k2 =2/3 no será una suposición válida. Sin embargo, en la mayoría de los casos, incluso una reorientación moderada de los donantes y aceptores da como resultado un promedio de orientación suficiente para que k2 = 2/3 no de como resultado un gran error en la distancia de transferencia de energía estimada debido a la dependencia de la sexta potencia de Ro en k2 Incluso cuando k2 es bastante diferente de 2/3, el error puede asociarse con un cambio en Ro y, por lo tanto, las determinaciones de los cambios en la distancia relativa para un sistema particular siguen siendo válidas.

La eficiencia de FRET se relaciona con el rendimiento cuántico y el tiempo de vida de fluorescencia de la molécula donante de la siguiente manera:

E = 1 — T^¡TD

f _t — _- 1 _-L —T tB ' J / T t D

dónde 7¿T¿ y 7DTD son los tiempos de vida de fluorescencia del donante en presencia y ausencia de un aceptor, respectivamente, o como

E = 1 - F¿fFa

rc — - i -L — p r if

dónde FBFB y FBFB son las intensidades de fluorescencia del donante con y sin un aceptor, respectivamente.

Los donantes incluyen ORG 488, GFp, fluoresceína, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL y ATTO488.

Los aceptores incluyen ALX 594, mRFP, fluoresceína, tetrametilrodamina, dabcilo, BODIPY FL y los colorantes QSY 7 y QSY 9.

Se describen combinaciones de los pares de donantes y aceptores anteriores.

Otros pares de donantes - aceptores ilustrativos incluyen proteína fluorescente cian (CFP) - proteína fluorescente amarilla (YFP), YFP-CFP, ORG488-ALX594 y ATTO488-ALX594.

El donante y el aceptor pueden ser de dos tipos diferentes (hetero-FRET) o del mismo tipo (homo-FRET). En el caso de homo-FRET, las diferencias espectrales no se usan para detectar y medir FRET. En cambio, se pueden detectar y medir las diferencias en la anisotropía entre la luz que excita al donante y al aceptor y la luz que se emite. Los métodos ilustrativos para detectar homoFRET incluyen imágenes de anisotropía de FREt . El nivel de anisotropía cuantificada (la diferencia de polarización entre los haces de excitación y emisión) proporciona una indicación de cuántos eventos de FRET se han producido.

La Tabla 1 a continuación proporciona pares de donantes y aceptores de FRET ilustrativos con sus valores Rq típicos:

Hay varias formas de medir la eficiencia de FRET mediante el monitoreo de los cambios en la fluorescencia emitida por el donante o el aceptor. Estos métodos son muy conocidos para un experto en la técnica, tales como emisión sensibilizada, FRET por fotoblanqueo y mediciones del tiempo de vida, y se abarcan en la presente invención.

Los usos ilustrativos de FRET incluyen, determinación de la estructura y conformación de proteínas, determinación de la distribución y ensamblaje de complejos de proteínas, determinación de interacciones receptor/ligando, inmunoensayos, ensayos enzimáticos, detección de interacciones de moléculas individuales, determinación de la estructura y conformación de ácidos nucleicos, ensayos de PCR en tiempo real y detección de SNP, detección de la hibridación de ácidos nucleicos, ensayos de extensión de cebadores para detectar mutaciones, secuenciación automática de ADN, determinación de la distribución y transporte de lípidos, ensayos de fusión de membranas, detección del potencial de membrana, indicadores de AMP cíclico y calcio, y detección y cuantificación de la activación de Akt en tumores, tales como los tumores de mama. "FRET por coincidencia" o FRET "de dos sitios", describe el método para etiquetar simultáneamente una proteína individual en dos sitios distintos con un par de donante y aceptor, y detectar la FRET entre ellos.

"Inmunológicamente distinto" en el contexto de anticuerpos, se refiere a anticuerpos generados en especies hospederas diferentes o de diferentes isotipos de la misma especie. El primer anticuerpo primario se genera en una especie hospedera diferente a la del segundo anticuerpo primario o el primer anticuerpo primario es un primer isotipo de una especie y el segundo anticuerpo primario es un segundo isotipo de la misma especie, donde el primer y el segundo isotipos son diferentes. Las especies hospederas ilustrativas incluyen ratón, rata, conejo, cabra, camello, oveja o caballo. Por ejemplo, el primer anticuerpo primario puede generarse en ratón y el segundo anticuerpo primario puede generarse en conejo. Esto permite que el primer anticuerpo secundario sea un anticuerpo antirratón genérico (etiquetado con un donante) y que el segundo anticuerpo secundario sea un anticuerpo anticonejo genérico (conjugado con una enzima). Esto proporciona una metodología genérica de alto rendimiento. En una realización preferida, el primer anticuerpo primario es un anticuerpo de ratón anti-Akt y el segundo anticuerpo primario es un anticuerpo de conejo anti-pAkt.

"Anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente inmunoglobulinas completas, así como fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de las mismas, tales como dominios variables. Las inmunoglobulinas completas ilustrativas incluyen anticuerpos nativos y de longitud completa, anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos.

"Anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único determinante antigénico, también denominado epítopo. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante cualquier técnica o metodología conocida en la técnica, que incluye los métodos de hibridoma, los métodos de ADN recombinante y el aislamiento a partir de bibliotecas de anticuerpos en fago.

Por el contrario, los "anticuerpos policlonales" son típicamente una población heterogénea de isotipos y/o clases de inmunoglobulinas y también exhiben una variedad de especificidad de epítopo.

"Anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo monoclonal en el que una porción de o la secuencia de aminoácidos completa en una o más regiones o dominios de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, homóloga a o una variante de la secuencia correspondiente en un anticuerpo monoclonal de otra especie o que pertenece a otra clase o isotipo de inmunoglobulina, o de una secuencia consenso. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de tales anticuerpos, siempre que el anticuerpo exhiba la actividad biológica deseada de su anticuerpo parental, por ejemplo, se une al mismo epítopo.

"Fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno", se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa en la que se retiene una región variable o una capacidad funcional del anticuerpo parental, por ejemplo, unión a un epítopo específico. Los fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de la invención tienen un epítopo conservado en la región constante para el reconocimiento secundario. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')², Fd, Fv, scFv y scFv-Fc, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, anticuerpo lineal, anticuerpo de cadena sencilla y otros anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. "Fragmento Fab" se refiere al fragmento de fragmento de unión al antígeno, que es una región en un anticuerpo que se une a los antígenos. Se compone de un dominio constante y uno variable de cada una de las cadenas pesada y ligera. Estos dominios dan forma al sitio de unión al antígeno en el extremo amino terminal del fragmento. Los dos dominios variables se unen al epítopo en sus antígenos específicos. Los fragmentos Fab de la invención tienen un epítopo conservado en la región constante para el reconocimiento por anticuerpos secundarios.

Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de preparación de fragmentos Fab, por ejemplo, la enzima papaína puede usarse para escindir una inmunoglobulina completa en dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. Los fragmentos Fab pueden escindirse adicionalmente para formar fragmentos F(ab')²y Fab', con el uso de métodos conocidos por el experto. Por ejemplo, la enzima pepsina puede usarse para escindir un fragmento Fab debajo de la región de bisagra para producir un fragmento F(ab')²y un fragmento pFc'. Alternativamente, la enzima IdeS (enzima que degrada inmunoglobulinas de Streptococcus pyogenes, nombre comercial FabRICATOR) puede usarse para escindir IgG de una manera específica de secuencia a pH neutro para producir fragmentos F(ab')². Los fragmentos F(ab')²pueden dividirse en dos fragmentos Fab', por ejemplo, mediante una reducción suave.

Un fragmento de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" es una variante de Fv de cadena sencilla que comprende el dominio variable de cadena pesada (Vh) y el dominio variable de cadena ligera (Vl) de un anticuerpo, en el que los dominios están presentes en una cadena polipeptídica única y que puede reconocer y unirse al antígeno. Los fragmentos scFv de la invención tienen un epítopo conservado en la región constante para el reconocimiento por anticuerpos secundarios. El polipéptido scFv contiene opcionalmente un enlazador polipeptídico colocado entre los dominios Vh y Vl que permite que el scFv forme una estructura tridimensional deseada para la unión al antígeno. El experto conoce bien los métodos para producir scFv. Por ejemplo, cadenas Vh y Vl separadas pueden fusionarse entre sí. Los scFv tienen aproximadamente la mitad del tamaño de los fragmentos Fab, pero retienen la especificidad original del anticuerpo parental.

"Diacuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo pequeño que tiene dos sitios de unión al antígeno. Cada fragmento contiene un dominio Vh concatenado con un Vl para formar un polipéptido Vh-Vl o Vl-Vh. Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios Vh -Vl enlazados se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno.

"Anticuerpo lineal" se refiere a anticuerpos que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (Vh -Ch1 -Vh -Ch1) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de los mismos de la invención pueden etiquetarse. En realizaciones preferidas, la etiqueta es FLAG.

"Anticuerpo primario" se refiere a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno del mismo que se une a un primer sitio en una molécula, tal como una proteína, ADN o un lípido. El anticuerpo primario tiene especificidad de unión por un sitio en una molécula. El primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula, tal como una proteína. En realizaciones preferidas, el primer sitio es Akt(pan). El segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, tal como una proteína. En realizaciones preferidas, el segundo sitio es pAkt(T308). En realizaciones preferidas, los anticuerpos primarios no se etiquetan. En otras realizaciones, los anticuerpos primarios pueden etiquetarse. Por ejemplo, la etiqueta puede ser una etiqueta secuencial, tal como una etiqueta secuencial FLAG.

En realizaciones de la invención, de acuerdo con las reivindicaciones, los anticuerpos primarios pueden ser inmunoglobulinas completas o fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de las mismas. También se prevén combinaciones de lo anterior. Los fragmentos de anticuerpo preferidos son fragmentos Fab o fragmentos scFv. Por ejemplo, en los métodos de la invención, tanto el primer anticuerpo primario como el segundo anticuerpo primario pueden ser inmunoglobulinas completas. Alternativamente, tanto el primer anticuerpo primario como el segundo anticuerpo primario pueden ser un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo primario y el segundo anticuerpo primario son fragmentos Fab, fragmentos scFv o combinaciones de los mismos. Alternativamente, el primer anticuerpo primario puede ser una inmunoglobulina completa y el segundo anticuerpo primario puede ser un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno o el segundo anticuerpo primario puede ser un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno y el segundo anticuerpo primario puede ser una inmunoglobulina completa. En algunas realizaciones, los anticuerpos primarios pueden etiquetarse (por ejemplo, con una etiqueta secuencial FLAG) y los anticuerpos secundarios pueden tener una especificidad de unión por la etiqueta secuencial (por ejemplo, anti-FLAG).

"Anticuerpo secundario" se refiere a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno del mismo que se une a un anticuerpo primario, tal como el primer o segundo anticuerpo primario, o una etiqueta en un anticuerpo primario, tal como una etiqueta secuencial FLAG.

En las realizaciones de la invención, de acuerdo con las reivindicaciones, los anticuerpos secundarios pueden ser inmunoglobulinas completas o fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de las mismas. También se prevén combinaciones de lo anterior. Los fragmentos de anticuerpo preferidos son fragmentos Fab o fragmentos scFv. En realizaciones particularmente preferidas, al menos un anticuerpo secundario es un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno. En realizaciones preferidas, tanto el primer anticuerpo primario como el segundo anticuerpo primario son fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo secundario y el segundo anticuerpo secundario son fragmentos Fab, fragmentos scFv o combinaciones de los mismos. Alternativamente, el primer anticuerpo secundario puede ser un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno y el segundo anticuerpo secundario puede ser una inmunoglobulina completa o el primer anticuerpo secundario puede ser una inmunoglobulina completa y el segundo anticuerpo secundario puede ser un fragmento de anticuerpo o de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo secundario y el segundo anticuerpo secundario no son inmunoglobulinas completas. Se descubrió que la presente invención no funciona para algunos anticuerpos secundarios donde ambos eran inmunoglobulinas completas, presumiblemente debido a problemas de conformación que provocan que las distancias entre el donante de FRET y los aceptores de FRET sean mayores que las requeridas para que se produzca FRET (>10 nm). Se descubrió que este era el caso independientemente del orden de aplicación de los anticuerpos primarios y secundarios.

En algunas realizaciones, una enzima se conjuga o se fusiona con un anticuerpo secundario. En realizaciones preferidas, la enzima se conjuga o se fusiona con el segundo anticuerpo secundario. En realizaciones donde el segundo anticuerpo secundario es un fragmento scFv, el fragmento scFv puede fusionarse de manera recombinante con la enzima.

En la presente invención, el primer sitio es diferente del segundo sitio para permitir la detección de FRET entre los diferentes sitios. En realizaciones preferidas, el primer y el segundo sitio están en la misma molécula. En realizaciones particularmente preferidas, el primer y el segundo sitio están en la misma proteína. En otras realizaciones, el primer y segundo sitios están en una molécula diferente, por ejemplo, proteínas diferentes en un complejo.

Una muestra "aislada" es una muestra biológica que se ha aislado de un sujeto, por ejemplo, una muestra de tumor aislada. La muestra biológica puede incluir órganos, tejidos, células y/o fluidos.

El término "sujeto" se refiere a cualquier animal, particularmente un animal clasificado como mamífero, que incluye seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas y similares. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

"Etapa de lavado" en el contexto de la presente invención se usa en su sentido habitual en inmunohistoquímica para referirse a que la muestra se lava con una solución aceptable, tal como solución salina. Por ejemplo, la etapa de lavado puede usarse para eliminar cualquier anticuerpo no unido de una etapa precedente o para eliminar cualquier sustrato etiquetado de forma detectable que no se haya activado para formar un conjugado activado.

Métodos de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones. Los métodos de la invención son sensibles, cuantitativos y permiten la determinación de la localización de vías moleculares (alteradas) con el uso de anticuerpos convencionales. Tales métodos ayudan en la detección de marcadores farmacodinámicos y facilitan el descubrimiento/desarrollo de nuevos inhibidores de molécula pequeña.

Los métodos de la invención también pueden usarse para detectar la heterogeneidad molecular en tumores, que puede usarse como un parámetro fundamental en el pronóstico del cáncer.

Los métodos de la invención pueden usarse para determinar la localización y cuantificar la interacción de proteínas, tales como proteínas diferentes en un complejo. Los métodos de la invención también pueden usarse para determinar el estado de fosforilación de moléculas intracelulares. Los métodos de la invención pueden usarse en combinación con la detección por microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM). La FRET con resolución temporal puede proporcionar dicha información en células individuales y en tejido tumoral fijado con formalina e incrustado en parafina (FFPE).

La presente invención proporciona una nueva metodología de acuerdo con las reivindicaciones que emplea al menos dos anticuerpos primarios, al menos dos anticuerpos secundarios y un conjugado.

El primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula y el segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, en donde el segundo sitio es diferente del primer sitio y en donde el primer y segundo anticuerpos primarios son inmunológicamente distintos.

El primer anticuerpo secundario se etiqueta con un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y se une al primer anticuerpo primario; y el segundo anticuerpo secundario se conjuga con una enzima y se une al segundo anticuerpo primario, en donde al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa, y en donde el primer anticuerpo secundario no se une al segundo anticuerpo primario y el segundo anticuerpo secundario no se une al primer anticuerpo primario.

El conjugado comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se activa un conjugado, el conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular adyacente a la enzima (2 a 9 nm o menos de 100 KDa de la enzima).

Los métodos de la presente invención de acuerdo con las reivindicaciones comprenden las etapas de poner en contacto una muestra con al menos dos anticuerpos primarios, poner en contacto la muestra con al menos dos anticuerpos secundarios, realizar una etapa de lavado, poner en contacto la muestra con el conjugado y detectar cualquier señal de FRET generada por el aceptor de FRET.

Con el uso de los métodos de la invención, es posible detectar una señal de FRET si el primer sitio y el segundo sitio están espacialmente muy cercanos (menos de 10 nm), incluso si el primer sitio y el segundo sitio se expresan a niveles bajos.

De manera ventajosa, los métodos de la invención pueden usarse en cortes histológicos así como en cortes de células. De manera ventajosa, los métodos de la invención pueden usarse para detectar dos sitios muy cercanos que están en la misma superficie molecular (por ejemplo, una proteína), así como dos sitios muy cercanos que están en superficies moleculares diferentes (por ejemplo, una proteína).

En los métodos de la invención, de acuerdo con las reivindicaciones, los al menos dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra. Los al menos dos anticuerpos primarios pueden ponerse en contacto con la muestra al mismo tiempo entre sí o secuencialmente entre sí. Por lo tanto, el primer anticuerpo primario puede ponerse en contacto con la muestra primero y después el segundo anticuerpo primario puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, el segundo anticuerpo primario puede ponerse en contacto con la muestra primero y después el segundo anticuerpo primario. Cuando el primer y segundo anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra secuencialmente entre sí, puede realizarse una etapa de lavado opcional entre las etapas en la secuencia.

El primer anticuerpo primario se une a cualquier primer sitio presente en la muestra y el segundo anticuerpo primario se une a cualquier segundo sitio presente en la muestra. La etapa de lavado opcional elimina cualquier anticuerpo primario no unido.

Los al menos dos anticuerpos secundarios pueden ponerse en contacto con la muestra al mismo tiempo que los al menos dos anticuerpos primarios o los al menos dos anticuerpos primarios pueden ponerse en contacto con la muestra antes que los al menos dos anticuerpos secundarios. Los al menos dos anticuerpos secundarios pueden ponerse en contacto con la muestra al mismo tiempo entre sí o secuencialmente entre sí. Por lo tanto, el primer anticuerpo secundario puede ponerse en contacto con la muestra primero y después el segundo anticuerpo secundario puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, el segundo anticuerpo secundario puede ponerse en contacto con la muestra primero y después el primer anticuerpo secundario. Cuando el primer y segundo anticuerpos secundarios se ponen en contacto con la muestra secuencialmente entre sí, puede realizarse una etapa de lavado opcional entre las etapas en la secuencia. En realizaciones donde los al menos dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra antes que los al menos dos anticuerpos secundarios, puede realizarse una etapa de lavado opcional entre la administración de los al menos dos anticuerpos primarios y la administración de los al menos dos anticuerpos secundarios.

El primer anticuerpo secundario se une al primer anticuerpo primario y el segundo anticuerpo primario se une al segundo anticuerpo primario. La etapa de lavado opcional elimina cualquier anticuerpo secundario no unido o cualquier anticuerpo secundario que se haya unido al anticuerpo primario que no se haya unido al primer o segundo sitio (es decir, anticuerpo primario no unido).

Después del contacto de los al menos dos anticuerpos primarios y los al menos dos anticuerpos secundarios con la muestra, se realiza una etapa de lavado antes de poner en contacto el conjugado con la muestra. La etapa de lavado elimina cualquier anticuerpo (primario o secundario) que no se haya unido a su diana (por ejemplo, el primer sitio, el segundo sitio, el primer anticuerpo primario o el segundo anticuerpo primario). Se puede usar solución salina u otra solución adecuada para realizar las etapas de lavado en los métodos de la invención. Las condiciones usadas en la etapa de lavado son muy conocidas para el experto en la técnica.

Después de la etapa de lavado, el conjugado se pone en contacto con la muestra. Cuando el segundo anticuerpo primario se ha unido al segundo sitio y el segundo anticuerpo secundario se ha unido al segundo anticuerpo primario, el sustrato del conjugado reacciona con la enzima conjugada con el segundo anticuerpo secundario para formar un conjugado activado. El conjugado activado se unirá a restos ricos en electrones en una superficie molecular (por ejemplo, una superficie de proteína) adyacente a la enzima (2 a 9 nm o menos de 100 KDa de la enzima). La enzima puede activar múltiples conjugados, lo que proporciona la unión de múltiples conjugados activados a restos ricos en electrones en una superficie molecular adyacente a la enzima. Esto amplifica el número de conjugados activados que contienen aceptores de FRET que están unidos en las proximidades del segundo sitio.

Se detecta cualquier señal de FRET generada por el aceptor de FRET.

En realizaciones donde el donante de FRET en el primer anticuerpo secundario unido está lo suficientemente cerca (menos de 10 nm) de los aceptores de FRET en el conjugado activado unido, puede detectarse una señal de FRET positiva.

Cuando el donante de FRET en el primer anticuerpo secundario unido no está lo suficientemente cerca (más de 10 nm) de los aceptores de FRET en el conjugado activado unido, la señal de FRET será reducida o estará ausente.

Cuando uno o ambos del primer y segundo sitios no están presentes en la muestra, no se detectará señal de FRET. En otro aspecto de la descripción, el sistema de activación por enzimas puede aplicarse al primer anticuerpo secundario además del segundo anticuerpo secundario. Esto amplifica de manera ventajosa tanto la señal del donante de FRET como la señal del aceptor de FRET. En este aspecto, el primer anticuerpo secundario se conjuga con una enzima en lugar de un donante de FRET. El método emplea además un segundo conjugado que comprende un donante de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se forma un segundo conjugado activado, cuyo segundo conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular adyacente a la enzima. El sustrato no reacciona con la enzima conjugada con el segundo anticuerpo secundario.

Los métodos de la presente descripción se adaptan en consecuencia. Por ejemplo, el método puede comprender las etapas de poner en contacto una muestra con los al menos dos anticuerpos primarios, poner en contacto la muestra con los al menos dos anticuerpos secundarios, realizar una etapa de lavado, poner en contacto la muestra con un primer conjugado específico para la enzima conjugada con el primer anticuerpo secundario y un segundo conjugado específico para la enzima conjugada con el segundo anticuerpo secundario, y detectar cualquier señal de FRET generada por el aceptor de FRET. El primer conjugado puede aplicarse simultáneamente o secuencialmente al segundo conjugado. Por ejemplo, el primer conjugado puede ponerse en contacto con la muestra primero y después el segundo conjugado puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, el segundo conjugado puede ponerse en contacto con la muestra primero y después el primer conjugado. Cuando el primer y segundo conjugados se ponen en contacto con la muestra secuencialmente entre sí, puede realizarse una etapa de lavado opcional entre las etapas en la secuencia.

En aspectos de la presente descripción donde los donantes de FRET en el primer conjugado activado unido están lo suficientemente cerca (menos de 10 nm) de los aceptores de FRET en el segundo conjugado activado unido, puede detectarse una señal de FRET positiva.

Cuando los donantes de FRET en el primer conjugado activado unido no están lo suficientemente cerca (más de 10 nm) de los aceptores de FRET en el segundo conjugado activado unido, la señal de FRET será reducida o estará ausente.

Cuando uno o ambos del primer y segundo sitios no están presentes en la muestra, no se detectará señal de FRET. En un aspecto de la invención, los anticuerpos primarios no se etiquetan. Por ejemplo, los anticuerpos primarios no se etiquetan con un donante de FRET o un aceptor de FRET. Esto tiene la ventaja de que los métodos de la invención pueden proporcionar una metodología genérica de alto rendimiento que no depende de la producción de anticuerpos primarios con especificidades de unión individuales que estén etiquetados con un donante de FRET o un aceptor de FRET, lo que consume mucho tiempo y es costoso.

Los anticuerpos primarios pueden etiquetarse. Por ejemplo, los anticuerpos primarios pueden etiquetarse con un donante de FRET o un aceptor de FRET. Aunque se prefiere menos, este aspecto está cubierto por la presente descripción. En este aspecto, se puede prescindir de los anticuerpos secundarios. Alternativamente, un anticuerpo primario marcado puede usarse en combinación con una pareja de anticuerpo primario-anticuerpo secundario y un conjugado. Por ejemplo, un primer anticuerpo primario etiquetado con un aceptor de FRET puede usarse en combinación con un segundo anticuerpo primario que se une a un segundo anticuerpo secundario conjugado con una enzima y un conjugado. En este caso, se puede prescindir del primer anticuerpo secundario. Alternativamente, un primer anticuerpo primario que se une a un primer anticuerpo secundario etiquetado con un aceptor de FRET puede usarse en combinación con un segundo anticuerpo primario que se conjuga con una enzima y un conjugado. En este caso, se puede prescindir del segundo anticuerpo secundario. En estos aspectos de la descripción, el sistema de activación por enzimas puede aplicarse al primer anticuerpo primario además del segundo anticuerpo primario/secundario. Esto amplifica de manera ventajosa tanto la señal del donante de FRET como la señal del aceptor de FRET. En este aspecto de la descripción, el primer anticuerpo primario se conjuga con una enzima en lugar de un donante de FRET. El método emplea además un segundo conjugado que comprende un donante de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se forma un segundo conjugado activado, cuyo segundo conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular adyacente a la enzima. El sustrato no reacciona con la enzima conjugada con el segundo anticuerpo primario/secundario.

Los métodos de la invención se adaptan en consecuencia. Por ejemplo, el método puede comprender las etapas de poner en contacto una muestra con los al menos dos anticuerpos primarios, opcionalmente poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo secundario, realizar una etapa de lavado, poner en contacto la muestra con un primer conjugado específico para la enzima conjugada con el primer anticuerpo primario/secundario y un segundo conjugado específico para la enzima conjugada con el segundo anticuerpo primario/secundario, y detectar cualquier señal de FRET generada por el aceptor de FRET. El primer conjugado puede aplicarse simultáneamente o secuencialmente al segundo conjugado. Por ejemplo, el primer conjugado puede ponerse en contacto con la muestra primero y después el segundo conjugado puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, el segundo conjugado puede ponerse en contacto con la muestra primero y después el primer conjugado. Cuando el primer y segundo conjugados se ponen en contacto con la muestra secuencialmente entre sí, puede realizarse una etapa de lavado opcional entre las etapas en la secuencia.

En aspectos de la descripción donde los donantes de FRET en el primer conjugado activado unido, el primer anticuerpo primario o el primer anticuerpo secundario están lo suficientemente cerca (menos de 10 nm) de los aceptores de FRET en el segundo conjugado activado unido, puede detectarse una señal de FRET positiva.

Cuando los donantes de FRET en el primer conjugado activado unido, el primer anticuerpo primario o el primer anticuerpo secundario no están lo suficientemente cerca (más de 10 nm) de los aceptores de FRET en el segundo conjugado activado unido, la señal de FRET será reducida o estará ausente.

Cuando uno o ambos del primer y segundo sitios no están presentes en la muestra, no se detectará señal de FRET. En algunas realizaciones, los métodos de la invención emplean más de dos anticuerpos primarios.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención emplean más de dos anticuerpos secundarios.

Las muestras son muestras biológicas aisladas, células aisladas y cortes histológicos. En realizaciones preferidas, las muestras son muestras de tumor de mama, que incluyen cortes histológicos de tumor de mama.

De manera ventajosa, los anticuerpos secundarios empleados en la invención pueden ser fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno, tales como fragmentos Fab o fragmentos scFv, en lugar de inmunoglobulinas completas. Los anticuerpos secundarios pueden ser una combinación de fragmentos Fab e inmunoglobulinas completas (mezclas de fragmentos Fab). Se ha descubierto que las realizaciones de la invención que emplean fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno (por ejemplo, que varían en tamaño de 50 kDa a 100 kDa) o mezclas de fragmentos Fab para los anticuerpos secundarios, son particularmente eficaces. Las ventajas particulares son la reducción de la distancia entre los cromóforos donantes de FRET y aceptores de FRET y el aumento de la eficiencia de FRET, la fácil penetración de los tejidos y la unión a sus dianas. Además, su especificidad inherente aumenta por el hecho de que carecen de la región Fc, por lo tanto, cualquier fondo resultante de la unión inespecífica a receptores de Fc endógenos se reduce significativamente. Esto es particularmente ventajoso cuando los dos sitios diana están en la misma molécula.

El uso de un sistema de activación por enzimas en combinación con los métodos de FRET de la invención mejora la eficiencia de FRET, particularmente en FRET de dos sitios. Anteriormente, se preveía que el tamaño del sistema aumentaría la distancia entre el donante de FRET y el aceptor de FRET, lo que conduciría a la pérdida de FRET. Sin embargo, los inventores descubrieron que los métodos de la invención proporcionan una relación señal/ruido mejorada, así como una metodología de alto rendimiento genérica y robusta de bajo costo.

De manera ventajosa, el sistema de activación por enzimas aumenta la detección de proteínas de baja expresión y también permite la dilución de anticuerpos primarios, lo que reduce las interacciones inespecíficas y, por lo tanto, mejora la especificidad.

Los métodos de la invención tienen la ventaja de un aumento significativo en la sensibilidad, sin un aumento en el fondo.

La Figura 1 de los dibujos muestra una realización específica y no limitante de la presente invención, donde el método se usa para cuantificar la activación de proteínas pAkt (pT308).

Las inmunoglobulinas primarias completas anti-Akt (ratón) y anti-pAkt (T308) (conejo) se ponen en contacto con una muestra y se unen a los sitios Akt(pan) y pAkt(T308) en la misma proteína Akt 1/2/3. Los fragmentos Fab secundarios antirratón-ORG488 y anticonejo-HRP se ponen en contacto con la muestra y se unen a los anticuerpos anti-Akt (ratón) y anti-pAkt (T308) (conejo), respectivamente. Después de una etapa de lavado, se aplica tiramida (TSA)-ALX594 a la muestra. La HRP cataliza la activación de múltiples copias de TSA-ALX594. Los radicales de tiramida de corta duración resultantes se acoplan covalentemente a residuos ricos en electrones adyacentes a la HRP, que deposita múltiples copias de ALX594 adyacentes al sitio diana pAkt(T308). La vida media corta de los radicales de tiramida da como resultado una pérdida mínima relacionada con la difusión de la localización de la señal de ALX594. Se genera una señal de FRET positiva entre ORG488 y ALX594 cuando los dos están muy cerca (menos de 10 nm), lo que indica que Akt(pan) y pAkt(T308) están muy cerca en la proteína Akt 1/2/3 en la muestra. La señal de FRET puede detectarse con resolución temporal mediante FLIM de dominio de frecuencia múltiple (mFD-FLIM).

En un aspecto, la descripción se refiere a un ensayo de coincidencia cuantitativo altamente sensible. En ciertas realizaciones, el TSA-FRET de dos sitios combina la amplificación de la señal con tiramida (TSA) de la inmunofluorescencia con conjugados de fragmentos Fab como anticuerpos secundarios, para maximizar la sensibilidad y especificidad.

En otro aspecto de la presente invención, los métodos pueden usarse para detectar la interacción proteína-proteína, por ejemplo, la interacción de proteínas diferentes en un complejo. En dicho método, dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con una muestra de interés. Esta puede ser un corte histológico o una muestra de células. Los anticuerpos primarios tienen especificidades de unión diferentes, donde un anticuerpo primario se une a un sitio en una proteína y el segundo anticuerpo primario se une a un sitio en una proteína diferente.

Los anticuerpos secundarios que son específicos para los anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra. Uno de los anticuerpos secundarios se etiqueta con un donante de FRET, tal como ORG-488. El otro anticuerpo secundario se conjuga o fusiona con HRP. Después de una etapa de lavado, se aplica tiramida (TSA)-ALX594 a la muestra. La HRP cataliza la activación de múltiples copias de TSA-ALX594. Los radicales de tiramida de corta duración resultantes se acoplan covalentemente a los residuos ricos en electrones adyacentes a la HRP, que deposita múltiples copias de ALX594 adyacentes al sitio diana. La vida media corta de los radicales de tiramida da como resultado una pérdida mínima relacionada con la difusión de la localización de la señal de ALX594. Se genera una señal de FRET positiva entre el donante de FRET (por ejemplo, ORG488) y ALX594 cuando los dos están muy cerca (menos de 10 nm), lo que indica que los sitios de proteínas están muy cerca de la muestra.

La señal de FRET puede detectarse con resolución temporal mediante FLIM de dominio de frecuencia múltiple (mFD-FLIM).

En una realización específica y no limitante de la presente invención, la interacción proteína-proteína detectada puede ser la interacción HER2/HER3, por ejemplo en tejido de cáncer de mama.

El monoclonal primario anti-HER2 (conejo) (se une a Tyr aa1248) y el anti-HER3 (ratón) (se une alrededor de aa1175-1275) se ponen en contacto con una muestra. Los fragmentos Fab secundarios anticonejo-ATTO488 (donante) y antirratón-HRP (aceptor) se ponen en contacto con la muestra y se unen a los anticuerpos anti-HER2 (conejo) y anti-HER3 (ratón), respectivamente. Después de una etapa de lavado, se aplica tiramida (TSA)-ALX594 a la muestra. La HRP cataliza la activación de múltiples copias de TSA-ALX594. Los radicales de tiramida de corta duración resultantes se acoplan covalentemente a los residuos ricos en electrones adyacentes a la HRP, que deposita múltiples copias de ALX594 adyacentes al sitio diana de HER3. La vida media corta de los radicales de tiramida da como resultado una pérdida mínima relacionada con la difusión de la localización de la señal de ALX594. Se genera una señal de FRET positiva entre ATTO488 y ALX594 cuando los dos están muy cerca (menos de 10 nm), lo que indica que HER2 y HER3 están muy cerca en la muestra. La señal de FRET puede detectarse con resolución temporal mediante FLIM de dominio de frecuencia múltiple (mFD-FLIM).

Se puede usar un algoritmo "de complemento" para automatizar un mFD-FLIM. Tal instrumento miniaturizado distingue automáticamente entre regiones de interés (ROI) en células y tumores, lo que permite la selección imparcial de ROI específicas.

En realizaciones de la invención, mFD-FLIM automatizado miniaturizado puede usarse en combinación con TSA-FRET de dos sitios para detectar fácilmente la activación de una oncoproteína (PKB/Akt o HER2/HER3), en tumores de mama y/o colon con una resolución que evidencia la heterogeneidad molecular dentro de los tumores. Los métodos pueden usarse para informar de manera habitual sobre biomarcadores de pronóstico, predictivos y de diagnóstico.

De manera ventajosa, los métodos de la invención combinan los atributos espacio-temporales y cuantitativos de FRET con resolución temporal detectada por FLIM de dominio de frecuencia múltiple (mFD-FLIM) con la sensibilidad del sistema de amplificación de la señal con tiramida (TSA).

Kits de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones. La presente invención también proporciona kits de acuerdo con las reivindicaciones que pueden usarse en los métodos de la invención mencionados anteriormente.

La presente invención proporciona un kit de acuerdo con las reivindicaciones para detectar moléculas, el kit comprende, al menos dos anticuerpos primarios, al menos dos anticuerpos secundarios y un conjugado.

El conjugado comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima. Cuando el sustrato reacciona con la enzima, el conjugado forma un conjugado activado que puede unirse a restos ricos en electrones en una superficie molecular que están de dos a 9 nm o menos de 100 KDa de la enzima.

En otro aspecto de la descripción, el sistema de activación por enzimas puede aplicarse al primer anticuerpo secundario además del segundo anticuerpo secundario. Esto amplifica de manera ventajosa tanto la señal del donante de FRET como la señal del aceptor de FRET. En este aspecto, el primer anticuerpo secundario se conjuga con una enzima en lugar de una molécula donante de FRET. El kit incluye además un segundo conjugado que comprende un donante de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se forma un segundo conjugado activado, cuyo segundo conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular adyacente a la enzima. El sustrato no reacciona con la enzima conjugada con el segundo anticuerpo secundario.

En un aspecto de la invención, los anticuerpos primarios no se etiquetan. Por ejemplo, los anticuerpos primarios no se etiquetan con un donante de FRET o un aceptor de FRET. Esto tiene la ventaja de que los kits de la invención pueden usarse en una metodología genérica de alto rendimiento que no depende de la producción de anticuerpos primarios con especificidades de unión individuales que estén etiquetados con moléculas donantes de FRET o aceptoras de FRET, lo que consume mucho tiempo y es costoso.

En un aspecto de la descripción, los anticuerpos primarios pueden etiquetarse. Por ejemplo, los anticuerpos primarios pueden etiquetarse con un donante de FRET o un aceptor de FRET. Aunque se prefiere menos, en este aspecto de la descripción se pueden prescindir de los anticuerpos secundarios. Alternativamente, un anticuerpo primario marcado puede usarse en combinación con una pareja de anticuerpo primario-anticuerpo secundario y un conjugado. Por ejemplo, un primer anticuerpo primario etiquetado con un aceptor de FRET puede usarse en combinación con un segundo anticuerpo primario que se une a un segundo anticuerpo secundario conjugado con una enzima y un conjugado. En este caso, se puede prescindir del primer anticuerpo secundario. Alternativamente, un primer anticuerpo primario que se une a un primer anticuerpo secundario etiquetado con un aceptor de FRET puede usarse en combinación con un segundo anticuerpo primario que se conjuga con una enzima y un conjugado. En este caso, se puede prescindir del segundo anticuerpo secundario. En estos aspectos de la descripción, el sistema de activación por enzimas puede aplicarse al primer anticuerpo primario además del segundo anticuerpo primario/secundario. Esto amplifica de manera ventajosa tanto la señal del donante de FRET como la señal del aceptor de FRET. En este aspecto, el primer anticuerpo primario se conjuga con una enzima en lugar de un donante de FRET. El kit incluye además un segundo conjugado que comprende un donante de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se forma un segundo conjugado activado, cuyo segundo conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular adyacente a la enzima. El sustrato no reacciona con la enzima conjugada con el segundo anticuerpo primario/secundario.

Ejemplos

La presente invención se describe en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

Los métodos de la invención pueden usarse para cuantificar el estado de activación de Akt en células de tumor de mama SKBR3 fijadas, así como tumores de mama y colon humanos FFPE en un formato TMA.

Los métodos de la invención también pueden usarse para detectar y/o medir interacciones proteína-proteína, tales como interacciones HER2/HER3 en células de tumor de mama SKBR3 fijadas, así como en tejido de cáncer de mama.

Los estudios previos de proteínas endógenas con el uso de FLIM han sido limitados debido a la falta de sensibilidad.

Los métodos de la presente invención permiten la identificación de la heterogeneidad molecular de la activación de Akt entre regiones de interés diferentes de la misma muestra de punción y entre varias muestras de punción del mismo paciente.

Los métodos de la presente invención también permiten la identificación de interacciones HER2/HER3 en diferentes partes de las células y entre regiones de interés diferentes de la misma muestra de punción y entre varias muestras de punción del mismo paciente.

Los resultados muestran que el ensayo TSA-FRET de dos sitios es un ensayo altamente sensible y específico para la detección de la heterogeneidad molecular que se beneficia de un rango dinámico alto y cuantificable.

Los inventores también han diseñado un nuevo ensayo de FRET por coincidencia con el uso de conjugados de anticuerpo secundario y colorante, con el objetivo de aumentar la sensibilidad.

Para los estudios de activación de Akt, se obtuvieron anticuerpos monoclonales primarios, anti-panAkt de ratón, anti-PAkt (pT308) de conejo de Cell Signaling technology, EE. UU. Los anticuerpos secundarios conjugados con IRDye, anti-IgG de ratón-IRDye de cabra y anti-IgG de conejo-IRDye 680LT de cabra se adquirieron de LI-COR Biosciences, EE. UU. El conjugado de anticuerpo de fragmentos Fab purificado por afinidad y el Fab dimérico de cabra anti-IgG de conejo-HRP se adquirieron de Bethyl Laboratories, TX, EE. UU. El anticuerpo de fragmentos Fab diméricos purificado por afinidad, el fragmento Fab de burro anti-IgG de ratón se adquirieron de Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Reino Unido. El kit de amplificación de la señal con tiramida (TSA) con tiramida Alexa Fluor@ 594 se adquirió de Invitrogen Life Technologies, EE. UU. Las líneas celulares SKBR3 y MCF7 de cáncer de mama humano se obtuvieron del banco de cultivos celulares CRUK. Se obtuvieron diez muestras de tumor de mama humano de tres pacientes diferentes del Laboratorio de Histopatología Experimental en LRI-CRUK.

La conjugación de ORG488 con el Fab dimérico específico antirratón como anticuerpo secundario se realizó con el uso de un protocolo de conjugación estándar de éster de NHS.

Ejemplo 1 - Colocalización de panAkt y pT308 endógenos con el uso de conjugados de fragmento Fab y colorante en SKBR3 fijadas

Las células SKBR3 se sembraron a 30 000 células/pocillo; con medio de cultivo DMEM a 0,4 ml/pocillo en dos portaobjetos de cámara de vidrio Millicell de 8 pocillos (portaobjetos Millicell® EZ de Millipore).

Las células se incubaron durante 24 h a 37 °C, 10 % de CO2 y 95 % de humedad relativa. Al día siguiente, las células se privaron de nutrientes durante 6 h y se cultivaron en medio DMEM sin suero o en presencia de EGF (100 ng/ml) durante 6 min o LY294002 (50 j M) durante 30 min. Antes del etiquetado de inmunofluorescencia, las células SKBR3 se prepararon en portaobjetos de cámara, se fijaron en PFA al 4 % durante 15 min, se permeabilizaron con saponina al 0,3 % durante 10 min y se bloquearon (BSA al 1 % en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.

Las células en el primer portaobjetos de cámara se inmunoetiquetaron con anti-panAkt primario de ratón (1:100). El segundo portaobjetos de cámara se inmunoetiquetó con anticuerpos anti-panAkt de ratón (1:100) y anti-pT308 de conejo (1:200) durante 16 horas a 4 °C. Ambos portaobjetos se lavaron en p Bs y se aplicaron anticuerpos secundarios específicos de especie, Fab antirratón ORG488 (20 jg/m l) y Fab anticonejo Alexa-594 (25 jg/ml), respectivamente, durante 2 h a temperatura ambiente. Las células se montaron con el reactivo protector de fluorescencia ProLong® Gold (Invitrogen, Cat#: P36930) antes de la observación bajo un microscopio confocal.

Ejemplo 2-Colocalización de panAkt y pT308 endógenos con el uso del ensayo de amplificación de la señal con tiramida (TSA) basado en fragmentos Fab en SKBR3 fijadas

Para el ensayo de TSA basado en fragmentos Fab, se prepararon células SKBR3 con diferentes condiciones en dos portaobjetos de cámara de vidrio de 8 pocillos como se describió anteriormente. Las células en el primer y segundo portaobjetos de cámara se incubaron además con fragmentos Fab específicos de especie como anticuerpos secundarios, fragmento Fab antirratón ORG488 (20 jg/m l) y conjugado Fab anticonejo-HRP (10 jg/ml), respectivamente durante 2 h a temperatura ambiente. Las células en el segundo portaobjetos de cámara se etiquetaron con el uso del sistema Alexa-594 TSA durante 15 min.

En este momento, la amplificación alcanzó una meseta y la señal no se amplificó más. El colorante Alexa-594 TSA se une covalentemente a las proteínas inmediatamente próximas a la diana, lo que es ideal para la localización subcelular de proteínas.

Las células SKBR3 teñidas se montaron con el reactivo protector de fluorescencia ProLong® Gold antes de la inspección bajo un microscopio confocal. Se adquirieron imágenes confocales con el uso de un microscopio confocal de barrido láser invertido Zeiss LSM 710.

Ejemplo 3 - Colocalización de panAkt y pT308 endógenos con el uso del ensayo de TSA basado en fragmentos Fab en tumor de mama humano FFPE fijado

Dos cortes histológicos idénticos de tumor de mama FFPE se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a recuperación de antígeno inducida por calor en tampón TRIS-EDTA (pH 9,0) durante 10 min.

Para inactivar la señal de fluorescencia de fondo, estos portaobjetos se incubaron con borohidrato de sodio fresco (1 mg/ml en PBS) durante 10 min a RT y se bloquearon con BSA al 1 %/PBS. El primer portaobjetos se incubó con anti-panAkt primario de ratón (1:100); el segundo portaobjetos se incubó con los anticuerpos primarios anti-panAkt de ratón (1:100) y anti-pT308 de conejo (1:200). Para ambos portaobjetos la incubación fue durante 16 horas a 4 °C. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron 3x con PBS. El primer portaobjetos se etiquetó con el anticuerpo secundario Fab antirratón ORG488 (20 |jg/ml). El segundo portaobjetos se etiquetó con los anticuerpos secundarios Fab antirratón ORG488 y Fab anticonejo-HRP (10 jg/ml), que después se detectaron con el uso del ensayo Alexa-594-TSA de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Para cada experimento de etiquetado inmunofluorescente se incluyó un control negativo, mediante el reemplazo del anticuerpo primario con BSA al mismo volumen que el anticuerpo primario. Todas las muestras de tejidos se montaron con el reactivo protector de fluorescencia ProLong® Gold antes de la observación bajo un microscopio confocal. Ejemplo 4 - Ensayo TSA-FRET de dos sitios

En este ejemplo, se usaron fragmentos Fab (50 kDa) como anticuerpos secundarios.

Se descubrió que el ensayo TSA-FRET de dos sitios proporciona un aumento significativo en la sensibilidad, sin un aumento en el fondo. Además, a diferencia de otros métodos de amplificación, TSA amplifica la señal después de la unión de los anticuerpos al antígeno (Figuras 3 a 7).

Ejemplo 5 - Ensayo FRET de dos sitios no amplificada para la cuantificación de pT308 en SKBR3 fijadas

Las células SKBR3 se cultivaron en dos portaobjetos de cámara de 8 pocillos /- estimulación con EGFR y LY294002 como se describió anteriormente.

Después del tratamiento, las células se fijaron en PFA, se permeabilizaron y se bloquearon (BSA al 1 % en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Para FRET de dos sitios, se usaron fragmentos Fab como anticuerpos secundarios conjugados con cromóforo donante y aceptor contra los sitios panAkt y pT308.

Las células en el primer portaobjetos de cámara se incubaron con anticuerpo primario anti-panAkt de ratón (1:100). Las células en el segundo portaobjetos de cámara se incubaron con anticuerpo primario anti-panAkt (1:100) de ratón y anticuerpo anti-pT308 de conejo (1:200) durante la noche a 4 °C. A la mañana siguiente, el primer portaobjetos de cámara se incubó además con fragmento Fab específico de especie como anticuerpo secundario conjugado con colorante, Fab antirratón-ORG488 (20 jg/m l) (como donante), durante 2 h a temperatura ambiente. El segundo portaobjetos de cámara se incubó además con Fab antirratón-ORG488 (20 jg/m l) y Fab anticonejo-ALX594 (25 jg/m l) (como aceptor) específicos de especie, durante 2 h a temperatura ambiente. Las células SKBR3 etiquetadas se montaron con reactivo protector de fluorescencia ProLong Gold.

Se preparó una solución de referencia de Rodamina B (en H2O) y se obtuvo una imagen antes de múltiples adquisiciones por mFD-FLIM de las células SKBR3. Las células etiquetadas con donante (Fab antirratón-ORG488) se excitaron con un haz de láser modulado de 473 nm y la fluorescencia de emisión se detectó a 510 a 530 nm por un intensificador de imagen CCD.

El tiempo de vida del donante de Fab-ORG488 se midió en un mínimo de 20 células. Se adquirieron imágenes de intensidad y tiempo de vida de células etiquetadas con donante del mismo campo de visión. Los datos de tiempo de vida se analizaron con el uso del algoritmo especialmente diseñado como se describió anteriormente, para calcular los valores de eficiencia de FRET, con el uso de la siguiente ecuación: E=1-(tDA/tD)*100 %; donde tD es el tiempo de vida del donante y tDA es el tiempo de vida del donante más el receptor. Se realizaron tres réplicas para cada punto de datos (Figura 3(b)).

Ejemplo 6 - TSA-FRET de dos sitios para la cuantificación de pT308 en SKBR3 fijadas

Para la adquisición de los mapas de tiempo de vida se usó el microscopio de mFD-FRET como se describió anteriormente. Las células SKBR3 se cultivaron en dos portaobjetos de cámara de 8 pocillos /- estimulación o inhibición con EGFR y LY294002 respectivamente como se describió anteriormente.

Después del tratamiento, las células se fijaron en PFA, se permeabilizaron y se bloquearon (BSA al 1 % en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se incubaron además con supresor de peroxidasa (Thermo Scientific Pierce) durante 15 min para inhibir cualquier actividad peroxidasa endógena de las células.

El ensayo FRET de dos sitios se realizó como anteriormente. La principal diferencia aquí fue que las células en el segundo portaobjetos de cámara se etiquetaron con el uso del sistema de TSA con Alexa-594 (aceptor) durante 15 min. Para cada experimento, se incluyeron células de control etiquetadas con conjugados de fragmentos Fab secundarios solamente. Las células SKBR3 etiquetadas se montaron con reactivo protector de fluorescencia ProLong Gold. Se preparó una solución de referencia de Rodamina B (en H2O) y se obtuvo una imagen antes de la adquisición por mFD-FLIM de las células SKBR3. Los experimentos de imágenes de tiempo de vida se realizaron como anteriormente. Se realizaron tres réplicas para cada punto de datos (Figura 3(a)).

Ejemplo 7 - Ensayo TSA-FRET de dos sitios para la cuantificación de pT308 en FFPE fijado en tejido de mama humano

El ensayo TSA-FRET para la cuantificación de pT308 se realizó en cortes de 4 |jm de dos muestras idénticas de tejido de cáncer de mama FFPE fijado.

Después de la desparafinación y la rehidratación, los cortes se sometieron a recuperación de antígeno por calor mediante microondas en tampón TRIS-EDTA (pH 9,0), durante 10 minutos a 800 W. Después, los cortes se incubaron en tampón de borohidrato de sodio recién preparado (1 mg/ml en PBS) durante 10 min a RT, seguido de bloqueo con BSA al 1 %/PBS. Los cortes histológicos se incubaron con supresor de peroxidasa (Thermo Scientific Pierce) durante 15 min.

Para el ensayo TSA FRET de dos sitios, el primer portaobjetos se incubó con anti-panAkt de ratón (1:100) y el segundo portaobjetos con anticuerpos primarios anti-panAkt de ratón (1:100) y anti-pT308 de conejo (1:200), durante 16 horas a 4 °C. El primer portaobjetos se inmunoetiquetó además con fragmento Fab antirratón conjugado con ORG488 (20 jg/m l) como anticuerpo secundario. El segundo portaobjetos se inmunoetiquetó con fragmento Fab antirratón conjugado con ORG488 (20 jg/m l) y fragmento Fab anticonejo conjugado con HRP (10 jg/m l) como anticuerpo secundario, que se detectó con el uso del ensayo Alexa-594-TSA.

Como control para abordar la especificidad de la señal de fosforilación, se incubó fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIP) con los cortes histológicos. La CIP (10 unidades/portaobjetos) se diluyó en tampón NEB 31X y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Además, la sustitución de los anticuerpos primarios específicos por BSA al 1 % en cortes histológicos se usó como control negativo. Estos portaobjetos de control también se prepararon como se describió anteriormente antes de montar todos los cortes histológicos con protector de fluorescencia ProLong® Gold. Los tiempos de vida del donante de ORG488 se determinaron a partir de al menos 10 ROI de los tumores, cada una se realizó por triplicado a menos que se indique de otro modo. La eficiencia de FRET se calculó como se describió anteriormente (Figura 4).

Ejemplo 8 - Ensayo TSA-FRET de dos sitios de alto rendimiento para la cuantificación de la heterogeneidad molecular de pT308 en TMA de mama y colon humanos

Las micromatrices de tumor se prepararon a partir de biopsias obtenidas de 10 pacientes con cáncer de mama y 7 con cáncer de colon. Para cada biopsia de paciente, se dispusieron cuatro muestras de punción de regiones diferentes en una matriz. La tinción con H&E del corte de TMA confirmó que los rasgos citomorfológicos eran representativos de tejido maligno, a diferencia del tejido estromal. Cada TMA de mama contenía 40 (4x10) muestras de punción de tumor, que representan 4 áreas distintas de la misma biopsia de tumor para cada paciente. Cada TMA de colon contenía 28 (4x7) muestras de punción de tumor, que representan 4 áreas distintas de la misma biopsia de tumor para cada paciente.

Dos TMA idénticas se desparafinaron y rehidrataron, se sometieron a recuperación de antígeno por calor mediante microondas en tampón TRIS-EDTA (pH 9,0), durante 10 min a 800 W de potencia.

Las TMA se incubaron además con tampón de borohidrato de sodio fresco durante 10 min, seguido de bloqueo con BSA al 1 %/PBS. Las TMA se incubaron con supresor de peroxidasa (Thermo Scientific Pierce) durante 15 min. Para el ensayo TSA-FRET de dos sitios se realizó como se indicó anteriormente. Las mediciones de tiempo de vida se realizaron con el uso de TMA etiquetadas con donante y etiquetadas con donante más aceptor, para cada muestra de punción. Se excluyeron los cálculos de eficiencia de FRET con una baja señal respecto al ruido (señal inferior a 4 veces la intensidad de fondo). La eficiencia máxima de FRET de cuatro regiones de interés de la muestra de punción se calculó como se describió anteriormente (Figuras 5 y 6).

Ejemplo 9 - Ensayo TSA-FRET de dos sitios de alto rendimiento automatizado para la cuantificación de pT308 en TMA de mama humano

TMA que contienen 120 muestras de punción de tejido de mama, procedentes de biopsias tomadas de una gran combinación de casos de pacientes con cáncer de mama ER positivo y ER negativo del banco de tumores en Guys Hospital, Londres, Reino Unido. Todas las biopsias se tomaron antes del tratamiento y se vincularon con datos histológicos y clínicos almacenados de manera integral en una base de datos. Estas eran una serie consecutiva de cánceres de mama de pacientes diagnosticados entre 1993-94.

Antes del etiquetado de inmunofluorescencia, se procesaron dos cortes de TMA idénticos como se describió anteriormente. El ensayo TSA-FRET también se realizó como anteriormente.

Las mediciones de tiempo de vida se realizaron con el uso de TMA etiquetadas con donante y etiquetadas con donante más aceptor, para cada muestra de punción. Para los cálculos de eficiencia de FRET solo se incluyeron las muestras con intensidad de donante de al menos cuatro veces mayor que la intensidad de fondo. Se calculó la mayor eficiencia de FRET de cuatro regiones de interés de cada muestra de punción, como se describió anteriormente.

El análisis estadístico se realizó con el uso del programa informático Graphpad Prism (GraphPad Prism software, CA, EE. UU.). Los resultados se muestran como valores medios ± SEM. La significación estadística entre los grupos se calculó con la prueba de Mann-Whitney (los valores se indican en los gráficos de caja y bigotes)22,31. Las diferencias se consideraban estadísticamente significativas cuando p<0,05 (Figura 7).

Ejemplo 10 - Optimización del ensayo TSA-FRET por coincidencia para la cuantificación del estado de activación de Akt endógena en células SKBR3

Antes de la optimización del ensayo TSA-FRET, la especificidad de unión de los anticuerpos anti-Akt humanos (panAkt, pT308) se evaluó por transferencia Western Li-COR de dos colores contra Akt endógena en células SKBR3 (no se muestran los datos). Las células SKBR3 se trataron con el inhibidor de PI3K, LY294009 50 pM durante 30 minutos, /- EGF (100 ng/ml) durante 6 minutos. Las células se lisaron y los lisados de proteínas totales se evaluaron por transferencia Western Li-COR. Las bandas individuales demostraron la especificidad de los anticuerpos anti-Akt (panAkt, pT308) (no se muestran los datos). La incubación de los anticuerpos contra panAkt y pT308 seguido de la adición de anticuerpos secundarios específicos de especie conjugados con colorante NIR, en una sola transferencia, no afectó la especificidad de ninguno de los anticuerpos primarios (no se muestran los datos). Con el uso de evaluaciones cualitativas y cuantitativas relativas, el Western Li-COR mostró que la fosforilación de Akt aumentó por EGF y se inhibió por LY294002 en células SKBR3 (no se muestran los datos).

Estos resultados confirmaron la especificidad de los anticuerpos anti-Akt. El ensayo de inmunofluorescencia usa fragmentos Fab como conjugados de anticuerpo secundario y colorante. Este enfoque tiene varias ventajas. Debido a su pequeño tamaño, los fragmentos Fab secundarios penetran fácilmente en los tejidos y se unen a sus dianas. Su especificidad inherente aumenta aún más por el hecho de que carecen de la región Fc, por lo tanto, se elimina cualquier fondo resultante de la unión inespecífica a receptores de Fc endógenos. El uso de fragmentos Fab secundarios también reduce la variación entre lotes inherente en los anticuerpos primarios de etiquetado con colorantes.

Además de usar fragmentos Fab, se explotó la metodología de etiquetado de TSA, que se ha usado para amplificar señales fluorescentes en protocolos de inmunofluorescencia estándar y aumenta en 100 veces el umbral de detección de proteínas muy débilmente expresadas. Para mejorar la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos contra pan-Akt y pT308, los conjugados de fragmentos Fab como anticuerpos secundarios se combinaron con el sistema TSA. Este ensayo se optimizó en células SKBR3, con y sin TSA.

Las imágenes confocales con el uso de conjugados de fragmento Fab y colorante sin TSA en células SKBR3 privadas de nutrientes o estimuladas con EGF, mostraron un aumento de la translocación de pT308 a través de la membrana plasmática (Figura 10) que se redujo significativamente en células tratadas con EGF+LY294002 (Figura 10). El ensayo se realizó además en presencia de TSA. Las células SKBR3 estimuladas con EGF mostraron una translocación de pT308 a través de la membrana plasmática bien definida en comparación con las células no estimuladas (Figura 10). Sin embargo, la señal de pT308 se suprimió en células tratadas con LY2940002 indicativas de una señal de TSA específica para pT308 (Figura 10). Cuando se comparó la señal de translocación del fragmento Fab, sin TSA con la señal de t Sa , se observó un aumento notable para esta última (Figura 10).

Estos resultados demuestran claramente una alta especificidad de los anticuerpos en ambos métodos (con y sin sistema TSA), sin un aumento en el fondo. Sin embargo, al usar el sistema de etiquetado de TSA con la misma dilución de anticuerpos primarios, las señales fluorescentes se amplificaron y la relación de la señal respecto al ruido aumentó. Dado que el ensayo de TSA basado en fragmentos Fab dio como resultado una mayor señal respecto al ruido, este ensayo se usó para investigar la expresión endógena y la colocalización de panAkt y pT308 en cortes de tumor de mama humano FFPE.

Las imágenes confocales muestran una clara colocalización de panAkt y pT308 en la membrana plasmática (Figura 10). La pT308 estaba predominantemente en la membrana plasmática, lo que indica la especificidad del etiquetado de TSA en el tejido. Los experimentos de control (Figura 10) con el uso de un ensayo de TSA basado en fragmentos Fab sin anticuerpos primarios produjeron una señal muy débil, lo que confirma, por lo tanto, la especificidad del sistema TSA basado en fragmentos Fab en los tejidos. Para establecer el tiempo óptimo requerido para que se produzca la reacción de TSA, se realizó un curso temporal en células MCF7 estimuladas. A los 5 minutos, la señal de pT308 era muy débil. De 10 a 15 minutos, la señal de pT308 aumentó antes de alcanzar la saturación de la señal a los 20 minutos. Por lo tanto, se eligió a 15 minutos como el tiempo óptimo para la amplificación por TSA (Figura 10).

Estos resultados resaltan claramente cómo el sistema TSA combinado con conjugados de fragmento Fab como anticuerpo secundario y colorante mejora la detección de pan y fosfo-Akt en células y tumores, al tiempo que mantiene una alta especificidad. Tal sistema puede explotarse habitualmente en muestras donde las proteínas diana y sus sitios de fosforilación se expresan poco.

El ensayo de TSA basado en fragmentos Fab fue sensible y específi

cortes de tumor. Por lo tanto, este ensayo se explotó para desarrollar un ensayo FRET de dos sitios más sensible y genérico. Para detectar la FRET con resolución temporal se usó FLIM de dominio de frecuencia múltiple (mFD FLIM) (Figura 2). Los diagramas esquemáticos muestran el principio del TSA-FRET por coincidencia con conjugados de fragmentos Fab como anticuerpos secundarios (Figura 1).

Se realizó TSA-FRET de dos sitios en células SKBR3. Las células se privaron de nutrientes o se estimularon con EGF con o sin inhibidor de PI3K, y se fijaron de acuerdo con el protocolo de TSA-FRET de dos sitios. La Figura 2c muestra que la eficiencia promedio de FRET de las células etiquetadas con donante solo no cambió tras la estimulación con EGF. Sin embargo, la eficiencia promedio de FRET de las células etiquetadas tanto con el donante (fragmento Fab-ORG488) como con el aceptor (TSA-ALX594) aumentó significativamente tras la estimulación con EGF (Figura 3(a)). El aumento en la eficiencia promedio de FRET (mayor que 16 %) con EGF fue claramente perceptible en la membrana plasmática como se observa en las imágenes de mapa de tiempo de vida, lo que indica un aumento significativo en pT308 en la membrana plasmática (Figura 3(a)). El mismo experimento de FRET por coincidencia pero sin la señal del aceptor amplificada por TSA (con el uso de conjugados Fab-ALX495 como aceptor) mostró que la eficiencia de FRET se redujo (Ef=7 %) (Figura 3(b)), lo que demuestra que la amplificación mejora significativamente el rango dinámico de la eficiencia de FRET.

Estos resultados demuestran que el ensayo TSA-FRET de dos sitios puede cuantificar el estado de activación de Akt endógena en células fijadas, con alta sensibilidad y especificidad.

Estos resultados también demuestran que los pequeños fragmentos Fab como anticuerpos secundarios (50 kDa) dan como resultado una cercanía viable entre pares de FRET, y que el sistema TSA amplificó la señal general, lo que de esta manera da como resultado una mayor eficiencia de FRET.

Ejemplo 11 - Cuantificación del estado de activación de Akt por ensayo TSA-FRET por coincidencia en tumores de mama humanos FFPE fijados

Después de haber optimizado con éxito el TSA-FRET de dos sitios en células SKBR3, se explotó el mismo ensayo para cuantificar la Akt activada en muestras FFPE de pacientes con cáncer.

Para estos experimentos, se usó la mFD-FLIM de alto rendimiento para adquirir, detectar y analizar automáticamente las eficiencias promedio de FRET. El TSA-FRET de dos sitios se realizó inicialmente en muestras FFPE de cáncer de mama de tres fuentes diferentes. El análisis TSA-FRET de dos sitios de la activación de Akt en tumores de mama humanos FFPE mostró que la eficiencia promedio de FRET del donante (panAkt) solo era cero (Figura 4(a)). Sin embargo, la eficiencia promedio de FRET aumentó significativamente en presencia del aceptor (pT308) (Figura 4(b) y Figura 12(a) y (b)). Por otra parte, la eficiencia promedio de FRET varió (de 2,5 a 6,0 %) entre pacientes con tumor de mama, lo que sugiere que TSA-FRET puede usarse para cuantificar la variación en el estado de activación de Akt entre pacientes.

Los experimentos de control (Figura 4(c)) con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIP) mostraron que pT308 se redujo significativamente (de Ef= 6,0 a 1,5 %) en muestras de tumor tratadas con CIP, lo que confirma, por lo tanto, la especificidad del sistema TSA-FRET de dos sitios en tejidos.

Estos resultados han validado el sistema TSA-FRET de dos sitios que usa reactivos Fab secundarios para cuantificar con precisión el estado de activación de Akt en cortes de tumor de mama humano FFPE. La eficiencia promedio de FRET aumentó en presencia de aceptor en las tres muestras (Figura 4(b) y Figura 12(a) y (b)) lo que indica cantidades significativas de pT308. Sin embargo, la eficiencia promedio de FRET varió en gran medida entre las muestras. Esto sugirió que el ensayo TSA-FRET de dos sitios podría discriminar entre diferentes niveles de activación de Akt en tejidos de una muestra pequeña de pacientes.

Ejemplo 12 - Cuantificación de alto rendimiento de la activación de Akt y su heterogeneidad molecular en el cáncer de mama humano mediante TSA-FRET de dos sitios

Para mapear y cuantificar la heterogeneidad molecular del estado de activación de Akt en tumores de mama de pacientes. Se prepararon micromatrices de tumor de biopsias de tumor de mama obtenidas de 10 pacientes combinados. Estos pacientes tenían un estado variable de e R y HER2 como se muestra en la Tabla 1 a continuación: Tabla 1

Para cada paciente, se seleccionaron cuatro muestras de punción de regiones diferentes en cada biopsia. La tinción con H&E confirmó que cada muestra de punción contenía tejido tumoral (Figura 5(a)). En total había 40 muestras de punción de tumor por TMA. Las TMA se etiquetaron con anticuerpos primarios anti-Akt (panAkt, pT308), seguidos del etiquetado de TSA (como se describió en Materiales y Métodos). Se mapeó cada posición de muestra de punción de tumor en las TMA de donante y las de donante más aceptor correspondientes. La intensidad y las imágenes de FLIM correspondientes para las muestras etiquetadas con donante y donante más aceptor se muestran para todas las muestras de punción en las Figuras 4b y 4c, respectivamente.

Se usó FLIM para mapear y adquirir las imágenes de tiempo de vida de cada posición de muestra de punción de tumor y las 4 ROI segmentadas (Figura 5(a)). La eficiencia máxima de FRET entre sectores de la misma muestra de punción se calculó con un Excel-macro.

El análisis FLIM de la TMA etiquetada con donante solo mostró eficiencias promedio de FRET de cero para todas las muestras de punción (Figura 5(b)). El análisis de tiempo de vida (con el uso de 4 ROI pareadas) de la muestra con donante más aceptor mostró un aumento de las eficiencias promedio de FRET en algunas muestras de punción de tumor (por ejemplo, muestra de punción 2, 3, 30) (Figura 5(c) y (d)). La Figura 3a ilustra la eficiencia de FRET calculada para 4 ROI diferentes por muestra de punción. El valor máximo del valor de eficiencia de FRET (Ef= 23 %) de 4 ROI se muestra en la Figura 5(d).

Estos resultados demuestran la variabilidad de la eficiencia de FRET entre 4 muestras de punción de la misma muestra de paciente (Figura 5(d)). Promediar la eficiencia de FRET de las 4 muestras de punción dio como resultado una pérdida de información localizada informada sobre el estado de activación de Akt (Figura 5(e)).

Estos resultados demostraron la coexistencia de eficiencias de FRET altas y bajas en muestras de punción de la misma biopsia de paciente, lo que demuestra la heterogeneidad molecular del estado de activación de Akt en los tumores de mama. Por tanto, el análisis de las eficiencias de FRET localizadas es fundamental en los tumores de mama para evitar la pérdida de información valiosa.

Ejemplo 13 - Cuantificación por TSA-FRET de dos sitios de alto rendimiento de la activación de Akt y su heterogeneidad molecular en el cáncer de colon humano

Para evaluar más a fondo el ensayo TSA-FRET y cuantificar el estado de activación de Akt y su heterogeneidad molecular en otros tipos de tumores, se preparó una TMA de colon de 7 pacientes. De cada paciente se aplicaron 4 muestras de punción (ver la Figura 6(a)) de regiones diferentes en cada biopsia de tumor y en total hubo 28 muestras de punción en cada TMA. Se realizó la tinción con H&E para confirmar que cada muestra de punción contenía tejido tumoral (Figura 6(a)). Se siguió el mismo procedimiento para las TMA de mama descritas anteriormente.

Las Figuras 6(b) y 6(c) muestran imágenes de la intensidad y el tiempo de vida correspondientes para las muestras etiquetadas con donante y donante más aceptor, respectivamente. La eficiencia máxima de FRET de cada muestra de punción de tumor se calculó con el uso del Excel-macro. El análisis de tiempo de vida de la TMA con donante solo mostró eficiencias promedio de FRET de cero (Figura 6(c)).

El análisis de tiempo de vida de la TMA de donante más aceptor mostró un aumento de las eficiencias de FRET en las muestras de punción de tumor 3, 5 y 7 (Figura 6(c) y (d)). La Figura 6(a) ilustra la eficiencia de FRET calculada para 4 ROI diferentes por muestra de punción. El valor máximo de eficiencia de FRET (Ef= 11 %) de 4 ROI se muestra en la Figura 6(d). En los tumores de colon, la heterogeneidad parece ser menor que la de las muestras de mama, sin embargo, estos resultados demostraron la coexistencia de eficiencias de FRET altas y bajas en las muestras de punción de la misma biopsia de paciente (Figura 6(d)), lo que demuestra la heterogeneidad molecular del estado de activación de Akt dentro de los tumores de colon. También en este caso se sugiere que el análisis de las eficiencias de FRET localizadas es fundamental en los tumores de colon para evitar la pérdida de información potencialmente valiosa.

Ejemplo 14 - Cuantificación de alto rendimiento de la activación de Akt en una amplia combinación de casos de pacientes con cáncer de mama

Este estudio de casos analizó el estado de activación de Akt en una amplia combinación de casos enmascarados obtenida del banco de tumores en King's Health Partners Tumour Bank. Se preparó un total de 120 muestras de punción para el análisis. La distribución de estos tumores era tumores ductales sin tipo especial (NST), lobulares, grado 1, grado 2 y grado 3. Hubo muestras de punción ER positivas, muestras de punción ER negativas y muestras de punción de pacientes con ganglios negativos como se muestra en la Tabla 2 a continuación:

Tabla 2

La presencia de tejido tumoral (>50 %) se confirmó por tinción con H&E para cada TMA de mama (Figura 7(a)). Las TMA se fijaron y se tiñeron de acuerdo con el protocolo de TSA-FRET descrito anteriormente. Se usó FLIM para mapear y adquirir imágenes de tiempo de vida de cada posición de muestra de punción de tumor (Figura 7(a)). La TMA etiquetada con donante mostró eficiencias promedio de FRET de cero para todas las muestras. La Figura 7(b) muestra la TMA de donante más aceptor y la variabilidad de la eficiencia de FRET entre los 4 sectores de la misma muestra de punción de paciente y entre diferentes muestras de punción de pacientes, que incluyen muestras con eficiencia de FRET baja (Ef= 0,9 %) y alta (Ef= 4,5 %). Las diferencias en el estado de activación de Akt de muestras histológicamente homogéneas y heterogéneas se muestran en la Figura 6b. Una vez más, se observó la heterogeneidad en el estado de activación de Akt en estos tumores. La Figura 7(c) ilustra la eficiencia de FRET de cada muestra de punción de tumor (paciente), que varía de una eficiencia de FRET alta de 4,8 % a una eficiencia de FRET baja de 0,09 % lo que indica el alto rango dinámico del ensayo TSA-FRET de dos sitios.

Es importante destacar que los algoritmos automatizados permitieron la adquisición y el análisis rápidos de más de 120 imágenes de TSA-FRET con intervención humana mínima, lo que eliminó una gran cantidad de error humano y subjetividad del análisis de las muestras.

Con el uso de TSA-FRET de dos sitios, la activación de Akt y su heterogeneidad en cortes de tumor y células puede cuantificarse con un alto rango dinámico, de una manera objetiva de alto rendimiento.

Ejemplo 15 - Cuantificación de la interacción proteína-proteína (PKB+PDK1) endógena

La interacción de PKB y PDK1 se evaluó en xenoinjertos de mama humanos triple negativos con el uso del anticuerpo contra PDK1 (aa350-436) de policlonal de conejo LS-Bio #Is-b1733 (especificidad comprobada en FFPE) y monoclonal de ratón contra panAkt (SKB1) de Millipore, (especificidad comprobada en FFPE).

Ambos anticuerpos primarios se incubaron en los tejidos durante 16 horas a 4 °C. Para la tinción con anticuerpos secundarios, la PDK1 se etiquetó con Fab contra conejo-TSA-ALX594 como aceptor de FRET y panAkt se etiquetó con Fab contra ratón-ORG488 como donante de FRET.

Los resultados ilustran que los tiempos de vida promedio de Akt(pan) sola fue de 3,08 ns. Los tiempos de vida disminuyen significativamente (2,51 ns) en presencia del aceptor (PDK1-T-ALX594), lo que indica una fuerte unión de PKB con PDK1. La disminución en el tiempo de vida del donante por FRET fue significativa (****, P<0000,1) (Figura 11).

Los resultados demuestran que el ensayo TSA-FRET de la presente invención puede usarse para cuantificar la interacción proteína-proteína (PKB+PDK1) endógena en cortes de tumor de mama humano PPFE fijado.

Ejemplo 16 - Aplicación secuencial frente a simultánea de los anticuerpos primarios y secundarios

Los anticuerpos primarios contra panAkt y pT308 se añadieron simultáneamente al tejido FFPE de tumor de mama humano. Al día siguiente, se añadieron simultáneamente los anticuerpos secundarios Fab-IgG (ratón y conejo) seguido de amplificación por TSA. Con el uso de este método, se obtuvo una eficiencia de FRET de 10 % con activación significativa (***, P<0000,1) de pT308 (Figura 9(a)).

Los anticuerpos primarios contra panAkt y pT308 se añadieron secuencialmente al tejido FFPE de tumor de mama humano. Al día siguiente, se añadieron secuencialmente los anticuerpos secundarios Fab-IgG (ratón y conejo) seguido de amplificación por TSA. Con el uso de este método, se obtuvo una eficiencia de FRET de 11 % con activación significativa (***, P<0000,1) de pT308. Al añadir el Fab-IgG secuencialmente, los resultados mostraron que no había una diferencia significativa en la eficiencia de FRET (Figura 9(b)).

La Figura 10 muestra imágenes confocales para Fab-IgG con TSA-FRET. El análisis de imágenes confocales para panAkt y pT308 mostró una clara colocalización de panAkt y pT308. Sin embargo, no hubo diferencia en la intensidad entre el experimento simultáneo y el experimento secuencial con Fab-IgG. Los experimentos de control sin anticuerpo primario no mostraron patrón de tinción.

Otros ensayos de coincidencia que no son de FRET que cuantifican la formación de complejos de proteínas o las modificaciones postraduccionales de proteínas, tales como el ensayo de unión por cercanía (PLA) in situ, detectan moléculas a 30-40 nm entre sí. El método PLA in situ se evaluó en células SKBR3 fijadas y tumor de mama FFPE para cuantificar el estado de activación de pT308. La activación de Akt se detectó en células SKBR3 (no se muestran los datos) pero no en tejido de mama FFPE. Se prevé que la activación de Akt no se cuantificó en el tejido de mama FFPE debido al bajo rango dinámico del PLA in situ y el fondo inespecífico creado por esta metodología en muestras de tejido.

Por el contrario, los resultados mencionados anteriormente demuestran que los métodos de la invención pueden mapear y cuantificar la heterogeneidad molecular de la vía de Akt en células SKBR3 y tejido de mama FFPe . Los métodos de la invención también pueden detectar la heterogeneidad molecular de la activación de Akt en tumores de mama y tumores de colon. Los métodos de la invención pueden detectar la heterogeneidad molecular de la activación de oncoproteínas entre diferentes muestras de punción tomadas de la misma biopsia, así como entre pacientes, lo que demuestra el rango dinámico cuantitativo de eficiencias de FRET medibles por los métodos de la presente invención. Los métodos de la invención pueden aplicarse a la cuantificación del estado de activación de otros biomarcadores proteicos, así como a la evaluación de la interacción proteína-proteína en tumores.

Ejemplo 17 - Cuantificación de pAkt endógena (pT308) en tejido de mama humano normal y tumoral FFPE fijado con el uso de FRET amplificada

Los métodos descritos anteriormente se usaron para comparar la activación de Akt endógena en tejido de mama humano normal y tumoral.

La Figura 11 proporciona imágenes de intensidad y mapas de tiempo de vida de tejidos de mama humanos FFPE de dos tejidos normales diferentes (normal 1, normal 2) y un tejido tumoral etiquetado con donante solo (panAkt) o con donante/aceptor (panAkt+pT308).

Las eficiencias de FRET se muestran como gráficos de caja y bigotes que representan la media ± SEM de al menos 10 regiones diferentes del mismo corte histológico (****, p<0,0001).

El aumento observado de la eficiencia de FRET representa el estado de fosforilación de Akt endógena y muestra la activación diferencial de pT308 en pacientes con tejido normal y tumoral.

Los resultados confirman que el ensayo TSA-FRET de dos sitios de la invención es un ensayo altamente sensible y específico para la detección de la heterogeneidad molecular que se beneficia de un rango dinámico alto y cuantificable, que permite una cuantificación y comparación precisas de diferentes muestras de tejido.

Esto confirma que el ensayo TSA-FRET de dos sitios de la invención puede ayudar a determinar con precisión si existe un estado patológico en una muestra de tejido, lo que permite realizar un diagnóstico eficaz en un paciente e iniciar un curso de tratamiento, si es necesario.

Ejemplo 18 - uso del método de FRET amplificada para estratificar muestras p-Akt/ER+/ER

Los métodos de la invención pueden usarse para la estratificación de pacientes. En particular, el valor pronóstico de la expresión de pAkt en cánceres de mama humanos se evaluó mediante FRET amplificada de alto rendimiento frente a IHC basada en intensidad.

Estudios anteriores han intentado determinar el valor pronóstico de la activación de Akt en el cáncer de mama con el uso de IHC, con resultados variables (7, 33). Los inventores obtuvieron TMA que representan 164 tumores de mama humanos primarios representativos de los subtipos de cáncer de mama tratados en centros de referencia terciarios. Los métodos de FRET amplificada/FLIM de la presente invención y también la relación de intensidades de IHC se usaron para investigar si pAkt podría estar asociada con un pronóstico desfavorable para demostrar la validez de ambos métodos. Un estudio previo (33) demostró que los altos niveles de pAkt evaluados por IHC no pudieron demostrar un valor pronóstico en pacientes con cáncer de mama antes de la terapia hormonal (33). De acuerdo con estos resultados, los resultados de los inventores con el uso de la relación de intensidades de IHC en TMA de mama no mostraron una asociación entre la activación de Akt y DFS u OS (Figura 13b y Figura 13d).

Sin embargo, a diferencia de estas metodologías limitadas, los métodos de FRET amplificada por coincidencia de la presente invención muestran que en las TMA de mama primario hubo una diferencia significativa entre los grupos con pAkt alta y baja en términos de DFS y OS. Esto se aplica al grupo total de 230 pacientes (que comprende ER(+) y ER(-)) (Figura 13 a), así como para los 125 pacientes Er (+) (Figura 13c). Por lo tanto, el ensayo de FRET amplificada por coincidencia permite evaluar la activación de biomarcadores en comparación con la IHC tradicional. El tamoxifeno es uno de los fármacos más usados para tratar el cáncer de mama ER+. La pérdida de la regulación de la vía de PI3K/Akt desempeña un papel vital en la resistencia farmacológica al tamoxifeno al promover la proliferación y la supervivencia celular.

En la presente metodología, el valor pronóstico de pAkt se evaluó en el carcinoma primario de mama y los resultados se compararon con la IHC basada en intensidad (calculada como la relación de intensidades de pT308 dividida por panAkt). Se obtuvo una amplia combinación de casos de muestras de tumores que representan a 230 pacientes del banco de tumores King's Health Partners Tumour Bank en formato TMA, con datos clínicos de seguimiento de 15 años vinculados. La combinación de casos consistió en 76 % de tumores ER+ y 24 % ER(-) con una combinación de tumores de grado 1, grado 2 y grado 3, como se muestra en la Tabla 3 a continuación.

La presencia de tejido tumoral (>50 %) se confirmó por tinción con H&E de cada muestra de punción de tumor de mama (Figura 12a). Las TMA se fijaron y se tiñeron de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.

Con el uso de la plataforma FLIM automatizada, se mapearon y adquirieron imágenes de cada posición de muestra de punción de tumor. El programa informático permitió la adquisición y el análisis rápidos de 230 muestras de punción de tumor con una intervención mínima, lo que eliminó de esta manera una gran cantidad de error humano y subjetividad del análisis de las muestras.

Las diferencias en el estado de activación de Akt de muestras histológicamente homogéneas y heterogéneas pueden apreciarse en la Figura 12b (panel derecho). Se usó tejido de mama normal para evaluar la eficiencia de FRET basal como control negativo. Los valores basales de eficiencia de FRET variaron de 2,3 % a 5,7 % con una mediana de eficiencia promedio de FRET de 4 % (Figura 11). La Figura 12b (gráficos de barras) muestra la variabilidad de la eficiencia de FRET entre los 4 sectores del mismo paciente, así como entre diferentes muestras de punción de pacientes, que varían de una eficiencia de FRET baja (3,9 %) a una alta (25,1 %).

La Figura 12c ilustra la eficiencia máxima de FRET de cada muestra de punción tumoral, organizada de alta (27,8 %) a baja (0,5 %), lo que indica el alto rango dinámico del ensayo de FRET amplificada. Los inventores investigaron si había una relación entre el estado de pAkt evaluado por FRET amplificada (puntos negros) y por relación de intensidades (puntos grises). La regresión lineal mostró que no había correlación entre los dos métodos.

Abreviatura

epirrubicina, cisplatino, 5-fluorouracilo de infusión continua (ECF)

ciclofosfamida, metrotexato y 5-fluorouracilo (CMF)

fluorouracilo, epirrubicina y ciclofosfamida (FEC)

aprepitant, palonosetrón y dexametasona (APD)

Tabla 3: Características de los pacientes para muestras de TMA de mama y eficiencia media de FRET. Después, los inventores evaluaron el valor pronóstico de la activación de Akt evaluada por FRET amplificada en comparación con la relación de intensidades en 164 casos, que consisten en 125 tumores ER+ y 39 ER (-). Los pacientes se clasificaron de acuerdo con su eficiencia de FREt o relación de intensidades, y se dividieron en dos grupos para la comparación, tercil superior (pAkt alta) y dos terciles inferiores (pAkt baja). Se usaron 15 años de datos de seguimiento clínico para generar gráficos de Kaplan-Meier para DFS y OS, para comparar los dos grupos (Figura 13). Cuando se evaluó por FRET amplificada, la pAkt alta se correlacionó significativamente con una reducción de DFS (p=0,036, HR=0,634, 95 % Cl [0,385-0,694]) y OS (p=0,013, HR=0,570, 95 % Cl [0,331-0,876]) en comparación con pAkt baja (Figura 13a). Es importante destacar que, cuando se evaluó por la relación de intensidades, la pAkt alta no se asoció con una reducción de DFS (p=0,890, HR=0,699, 95 % Cl [0,616-1,521]) u OS (p=0,746, HR=1,082, 95 % [0,670-1,750]) en comparación con pAkt baja (Figura 13b).

Los inventores estudiaron el subgrupo ER+ por separado (n=125), dividiendo esta cohorte en grupos con pAkt alta y baja como antes. Como se muestra en la Figura 13c, cuando se evaluó por FRET amplificada, hubo una asociación significativa entre pAkt alta y reducción de DFS (p=0,029, HR=0,566, 95 % Cl [0,299-0,936]) y OS (p=0,033, HR=0,284, 95 % de Cl [0,284-0,946]). Por el contrario, con el uso de la relación de intensidades, pAkt alta no se asoció con DFS (p=0,800, HR=0,932, 95 % Cl [0,535-1,618]) u OS (p=0,759, HR=1,098, 95 % Cl [0,607-1,983]) (Figura 13d). Por otra parte, la edad de los pacientes (media de 60 años) no parecía correlacionarse con la DFS u OS desfavorables (no se muestran los datos). Además, se evaluaron 11 factores de importancia pronóstica potencial mediante análisis univariante, como se muestra en la Tabla 4 a continuación:

Tabla 4: Análisis univariante de los factores asociados con la importancia pronóstica.

El análisis de los datos reveló que el aumento de Ef de pAkt se asociaba con la disminución de OS (p = 0,041) pero no con la relación de intensidades (p = 0,218, Tabla 4). En los análisis univariantes, el grado por histología fue el factor pronóstico independiente más significativo para DFS y OS. Estos resultados demuestran que la eficiencia de FRET, como un indicador del estado de activación de Akt, pero no la relación de intensidades, predice una supervivencia libre de enfermedad y general más desfavorable en pacientes con carcinoma primario de mama ER+.

Estos resultados resaltan que, con el uso de los métodos de FRET amplificada de la presente invención (pero no la relación de intensidades de IHC), la activación de Akt alta en el carcinoma primario de mama predice un desenlace más desfavorable en estos pacientes.

En particular, la Figura 13 muestra que el simple uso de la relación de las intensidades no se correlaciona con los desenlaces. Como puede observarse en los Ejemplos, se produce una sinergia a partir de la utilización de los métodos de la invención, lo que proporciona un método de detección mejorado. Los resultados también permiten una mejor estratificación de los pacientes.

Los datos en la Figura 13 confirman que el aumento de la activación de Akt en pacientes con carcinoma primario de mama se asocia con un peor pronóstico, lo que indica que el aumento de la supervivencia de las células cancerosas está contribuyendo a la resistencia al tamoxifeno en este grupo de pacientes.

Dado que los inventores han demostrado que la pAkt alta se asocia con una supervivencia reducida, se cree que los pacientes con pAkt alta son candidatos adecuados para los inhibidores dirigidos de la vía de PI3K/Akt. Esto se encuentra ahora en evaluación en ensayos clínicos de Fase II en cánceres de mama avanzados (para, por ejemplo, ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01277757).

La activación de Akt fue significativamente mayor en pacientes ER (-) que en ER (+) cuando se evaluó por los métodos de FRET amplificada por coincidencia de la presente invención, pero no por la relación de intensidades de IHC (Figura 13e y f). Una mayor proporción de pacientes ER (-) tenía una pAkt alta en comparación con los pacientes ER (+) (Figura 13g). Este resultado indica que en la activación de Akt intervienen vías de señalización independientes de ER. Además, entre los pacientes ER (-), más de la mitad exhibió activación de Akt alta, en comparación con un tercio de los pacientes ER (+) (Figura 13h). Esto indica que la población ER+ puede beneficiarse de la estratificación basada en un valor medido de activación de Akt. Actualmente, los tumores de mama ER (+) se tratan con terapia basada en hormonas - esto podría complementarse con la inhibición dirigida de Akt para los pacientes con actividad de Akt alta. Por el contrario, la estratificación de los pacientes ER (-) permitiría la introducción de la inhibición de Akt a un subconjunto de pacientes que, hasta ahora, no habían tenido muchas opciones terapéuticas dirigidas.

Los nuevos métodos de FRET por coincidencia de la invención, que combinan la amplificación de la señal con la flexibilidad de los anticuerpos secundarios etiquetados, proporcionan una metodología altamente sensible, específica y transferible para la cuantificación de bajos niveles de activación de proteínas endógenas en una amplia variedad de vías de señalización.

Paralelamente, la plataforma de imágenes FRET/FLIM de alto rendimiento descrita en la presente descripción puede mapear las TMA, adquirir imágenes automáticamente y procesar datos de FRET, lo que requiere una intervención mínima de un usuario no especializado.

Por otra parte, los métodos de la presente invención disminuyen significativamente el tiempo requerido para completar el análisis de múltiples muestras (por ejemplo, 230 muestras), en comparación con las técnicas estándar de IHC, que también requieren que un patólogo califique manualmente un número similar de muestras etiquetadas con técnicas estándar de IHC.

Los estudios demuestran que en el carcinoma primario de mama, la activación de Akt alta medida por los métodos de FRET amplificada de la presente invención (pero lo más importante, no por la relación de intensidades de IHC) se correlacionó con una supervivencia libre de enfermedad y general más desfavorables. Los métodos de la presente invención pudieron cuantificar la heterogeneidad de la activación de Akt en dos niveles: i) entre múltiples muestras de punción tomadas de regiones diferentes del mismo tumor (rango >2 mm) y ii) entre sectores de una muestra de punción tumoral individual (rango <1 mm). La metodología funcionó igualmente bien cuando se usó para analizar otros tipos de tejidos, tales como el carcinoma de colon.

Estos métodos de la presente invención pueden monitorear directamente Akt pT308 como una lectura de la activación de la proteína tanto en células como en tejido de mama FFPE, y pueden usarse más generalmente para monitorear modificaciones postraduccionales o interacciones proteína-proteína en cualquier vía de señalización.

La capacidad de cuantificar con precisión la activación de oncoproteínas tiene varias implicaciones importantes para la medicina aplicable, en particular: detección de fármacos en cultivo de tejidos; el descubrimiento y validación de biomarcadores de pronóstico y predictivos; estratificación de pacientes basada en la activación de oncoproteínas; y validación del modo de acción de la inhibición del fármaco, por ejemplo, durante la terapia neoadyuvante o los ensayos de ventana.

Ejemplo 19 - uso del método de FRET amplificada para la detección de la interacción proteína-proteína (HER2/HER3) Los métodos de la invención pueden usarse para detectar la interacción proteína-proteína. En este ejemplo, la interacción HER2/HER3 se midió con el uso de un ensayo de amplificación de la señal con tiramida (TSA) basado en fragmentos Fab.

La especificidad de los anticuerpos contra HER2 y HER3 en células SKBR3 que sobreexpresan HER2 se midió por transferencia Western.

Las células SKBR3 que sobreexpresan HER2 se estimularon durante 5 min con Heregulina (HRG) a 25 ng/ml. Los lisados de células completas de las células SKBR3 se sometieron a transferencia Western para HER2 y HER3, que mostró bandas específicas para ambas proteínas.

La Figura 14a muestra los resultados del análisis de transferencia Western con el uso de Cellsig, Dako y LSBio. HER2 se etiquetó con fragmentos Fab anticonejo-ATT0488 (se une a Tyr aa1248) como el donante de FRET (D). HER3 se etiquetó con fragmentos Fab antirratón TSA-ALX594 (se une alrededor de aa1175-1275) como el aceptor de FRET (A).

La colocalización de HER2 y HER3 endógenos también se midió en células SKBR3 no estimuladas con el uso de microscopía confocal. Las células SKBR3 no estimuladas (sin privación de nutrientes) se fijaron y se etiquetaron con anticuerpos para HER2 y HER3. HER2 se detectó con fragmentos Fab anticonejo-ATT0488. HER3 se detectó con antirratón TSA-ALX594 con el uso del método de amplificación de la presente invención.

La Figura 14b muestra los resultados de la microscopía confocal. Los resultados muestran que HER2 se localizó en la membrana plasmática, pero HER3 se localizó tanto en la membrana plasmática como en el citoplasma, pero no en el núcleo.

Los métodos de FRET amplificada de la presente invención se usaron además para detectar la dimerización de HER2-HER3 endógenos en células SKBR3.

Las células SKBR3 no estimuladas se fijaron y se tiñeron con anticuerpos contra HER2 y HER3 como se describió anteriormente. Nuevamente, HER2 se detectó con fragmentos Fab anticonejo-ATT0488. HER3 se detectó con antirratón TSA-ALX594 con el uso del método de amplificación de la presente invención.

Las Figuras 14c y d muestran que la eficiencia de FRET (Ef) para el donante (D) solo fue 0 y el donante-aceptor (DA) fue de 24 % con el uso del análisis FRET-FLIM. Esto indica que HER2 y HER3 están en un estado predimerizado. La Ef fue mayor en la membrana plasmática en comparación con el citoplasma, lo que indica que la dimerización tiene lugar principalmente en la membrana plasmática. Los portaobjetos de control con un anticuerpo secundario no etiquetado no mostraron etiquetado inespecífico.

Se realizaron estudios adicionales para determinar la colocalización de HER2 y HER3 endógenos en células SKBR3 estimuladas con NRG1.

Las células SKBR3 privadas de nutrientes (1 h con 0 % de suero) se estimularon con NRG1 (10 ng/ml) durante 5 minutos, se fijaron y se tiñeron con anticuerpos para HER2 y HER3 como se describió anteriormente. Estas se compararon con células SKBR3 privadas de nutrientes (1 h con 0 % de suero) que no se estimularon con NRG1. Nuevamente, HER2 se detectó con fragmentos Fab anticonejo-ATT0488. HER3 se detectó con antirratón TSA-ALX594 con el uso del método de amplificación de la presente invención.

La Figura 14e muestra los resultados de imágenes confocales de dicho análisis. Los resultados mostraron nuevamente que HER2 se localizaba en la membrana plasmática y HER3 se localizaba tanto en la membrana plasmática como en el citoplasma sin localización nuclear. La señal de HER2 parecía ser homogénea en la membrana plasmática en las células no estimuladas con NRG1, mientras que en las células estimuladas con NRG1, la señal de HER2 parecía ser puntuada/erizada. La señal de HER3 parecía ser similar tanto en células no estimuladas con NRG1 como en células estimuladas con NRG1.

Las Figuras 14f y g muestran que la eficiencia de FRET (Ef) para D solo fue 0 y DA fue aproximadamente 15 % con el uso del análisis FRET-FLIM. Esto indica que HER2-HER3 todavía están en un estado dimerizado en las células privadas de nutrientes, pero que después de la privación de nutrientes, hay un cierto agotamiento de HER2 y HER3 en la membrana plasmática. No parecía haber ningún cambio dependiente de NRG1 en Ef. Ef fue mayor en la membrana plasmática en comparación con el citoplasma, lo que indica que la dimerización se produce principalmente en la membrana plasmática.

La dimerización de HER2-HER3 en los portaobjetos de control de HER2 se midió con el uso de los métodos de FRET amplificada de la presente invención.

Nuevamente, HER2 se detectó con fragmentos Fab anticonejo-ATT0488. HER3 se detectó con antirratón TSA-ALX594 con el uso del método de amplificación de la presente invención.

Las Figuras 14h e i muestran la eficiencia de FRET (Ef) con el uso del análisis FRET-FLIM. Se usó un tiempo de exposición óptimo para obtener suficientes fotones, con un mayor tiempo de exposición en células con menor expresión de HER2. El tiempo de vida (aproximadamente 2,7 ns) de los portaobjetos etiquetados con D (ATT0488) no cambió significativamente en las diferentes muestras que expresan HER-2.

FLIM en los portaobjetos teñidos con DA mostró una Ef diferencial y tuvo alta correlación con la expresión de HER2 como se muestra en la Figura 14i, lo que indica que se produce una mayor dimerización de HER2-HER3 con el aumento de la expresión de HER2. El portaobjetos de HER2(0) no mostró etiquetado de HER2, por lo tanto, los cálculos de Ef - no fueron posibles. Esto confirmó aún más la especificidad del anticuerpo anti-HER2.

Por lo tanto, el ejemplo anterior muestra que los métodos de la presente invención pueden usarse para detectar interacciones proteína-proteína.

Ejemplo 20 - uso del método de FRET amplificada para la detección de la interacción proteína-proteína (HER2/HER3) en tejido de cáncer de mama

Los métodos de la invención pueden usarse para detectar la interacción HER2-HER3 en tejido de mama normal y tejido de cáncer de mama.

Para evaluar la dimerización de HER2-HER3 en tejido de mama normal y tejido de cáncer de mama de una manera de alto rendimiento, TMA BRC961 se obtuvo de US Biomax.

BRC961 consiste en 96 muestras de punción (un total de 48 casos), con duplicados de 36 casos de tipos comunes de carcinoma de mama y 12 casos de tejido de mama normal y otro maligno. Todas las muestras de punción tenían los resultados de IHC AR/ER/PR/Her-2.

Los métodos de FRET amplificada de la presente invención se usaron para detectar la colocalización de HER2-HER3 endógenos en tejido de mama humano (TMA BRC961 se obtuvo de US Biomax).

La Figura 15a muestra las imágenes confocales de este estudio. Las imágenes mostraron colocalización frecuente específica de la región de la expresión de HER2 y HER3 (ver, por ejemplo, la Muestra de punción 1) y la ausencia de h ER2 como se esperaba en algunas muestras de punción (ver, por ejemplo, la Muestra de punción 3). Solo unas pocas muestras de punción contenían muy pocas células epiteliales (ver, por ejemplo, la Muestra de punción 2), lo que puede deberse a la presencia de tejido adiposo significativo.

El etiquetado de HER2 coincidió con la mayoría de los resultados de inmunohistoquímica (IHC) de HER2 mencionados anteriormente. En algunas de las muestras de punción de tejido normal hubo una intensidad media de HER2 detectada por el método de la presente invención, que también fue respaldada por la puntuación de IHC HER2 +, como se muestra en la Tabla 5 a continuación:

Tab la 5

HER3 se expresó a niveles altos en la mayoría de las muestras de punción.

La Tabla 5 anterior proporciona valores de Ef para todas las muestras de punción de TMA con datos de intensidad de HER2 (DA) y HER3 (A). Las muestras de punción de TMA se clasificaron en base a Ef de mayor a menor.

La Figura 15b muestra que la Ef alta se correlacionó con la puntuación de IHC HER2+++. Las Figuras 15c y d, sin embargo, muestran que la Ef se correlacionada poco con la intensidad de HER2 y HER3.

Por lo tanto, los Ejemplos anteriores muestran que los métodos de la presente invención pueden usarse para detectar interacciones proteína-proteína tanto en células como en muestras de tejido. Estos métodos pueden ser útiles, por ejemplo, para detectar interacciones proteína-proteína en el tejido de cáncer de mama, tal como por detección y/o medición de la interacción HER2-HER3.

Estos resultados resaltan claramente cómo el sistema TSA combinado con conjugados de fragmento Fab como anticuerpo secundario y colorante mejora la detección de HER2 y HER3 en células y tumores, al tiempo que mantiene una alta especificidad.

El ensayo TSA basado en fragmentos Fab fue sensible y específico para detectar interacciones de HER2 y HER3 en células y cortes tumorales. Por lo tanto, este ensayo se explotó para desarrollar un ensayo FRET de dos sitios más sensible y genérico. Para detectar la FRET con resolución temporal se usó FLIM de dominio de frecuencia múltiple (mFD FLIM) (Figura 2). Los diagramas esquemáticos muestran el principio del TSA-FRET por coincidencia con conjugados de fragmentos Fab como anticuerpos secundarios (Figura 1).

En la presente memoria descriptiva "comprende" significa "incluye o consiste en" y "que comprende" significa "que incluye o consiste en".

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Claims

REIVINDICACIONES

i . Un método in vitro para detectar moléculas, que emplea:

a. al menos dos anticuerpos primarios, en donde el primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula y el segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, en donde el segundo sitio es diferente del primer sitio y en donde el primer y segundo anticuerpos primarios son inmunológicamente distintos;

b. al menos dos anticuerpos secundarios, en donde al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa, y en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta con un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y se une al primer anticuerpo primario; y el segundo anticuerpo secundario se conjuga o fusiona con una enzima y se une al segundo anticuerpo primario, en donde el primer anticuerpo secundario no se une al segundo anticuerpo primario y el segundo anticuerpo secundario no se une al primer anticuerpo primario;

c. un conjugado que comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde cuando el sustrato reacciona con la enzima, se forma un conjugado activado, cuyo conjugado activado se une a restos ricos en electrones en una superficie molecular que están de 2 a 9 nm o menos de 100 kDa de la enzima;

en donde el método comprende llevar a cabo las siguientes etapas en orden:

d. poner en contacto una muestra con los al menos dos anticuerpos primarios;

e. poner en contacto la muestra con los al menos dos anticuerpos secundarios;

f. realizar una etapa de lavado;

g. poner en contacto la muestra con el conjugado; y

h. detectar cualquier señal de FRET generada por el aceptor de FRET,

en donde se detectará una señal de FRET positiva cuando el donante de FRET esté en el primer anticuerpo secundario unido y el aceptor de FRET esté en el conjugado activado unido y el donante de FRET esté ubicado a menos de 10 nm del aceptor de FRET, y en donde no se detectará señal de FRET cuando el donante de FRET esté en el primer anticuerpo secundario unido y el aceptor de FRET esté en el conjugado activado unido y el donante de FRET esté ubicado a más de 10 nm del aceptor de FRET, o uno o ambos del primer y segundo sitios no estén presentes en la muestra.
2. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde los al menos dos anticuerpos primarios se seleccionan del grupo que consiste en:

inmunoglobulinas completas, fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de las mismas o combinaciones de los mismos; y/o

en donde los al menos dos anticuerpos secundarios son fragmentos de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o fragmentos de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa; y/o

en donde los fragmentos de anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno son fragmentos Fab, fragmentos scFv o combinaciones de los mismos; y/o

en donde el donante de FRET se selecciona del grupo que consiste en:

GFp, fluoresceína y combinaciones de los mismos; y/o

en donde el aceptor de FRET se selecciona del grupo que consiste en:

tetrametilrodamina, fluoresceína y combinaciones de los mismos.
3. El método in vitro de cualquier reivindicación anterior, en donde la al menos una enzima se selecciona del grupo que consiste en oxidorreductasas, hidrolasas, liasas, transferasas, isomerasas y ligasas;

preferiblemente, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en peroxidasas, oxidasas, fosfatasas, esterasas y glucosidasas;

con mayor preferencia, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa.
4. El método in vitro de cualquier reivindicación anterior en donde el sustrato es tiramina; y/o

en donde los anticuerpos primarios no se etiquetan.
5. El método in vitro de cualquier reivindicación anterior, en donde el primer anticuerpo primario es un anticuerpo murino y el al menos un anticuerpo primario adicional es un anticuerpo de conejo;

preferiblemente, en donde el primer anticuerpo secundario es un anticuerpo antimurino y el al menos un anticuerpo secundario adicional es un anticuerpo anticonejo.
6. El método in vitro de cualquier reivindicación anterior, en donde el primer anticuerpo primario se une a Akt(pan) y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a pAkt(T308) en la proteína Akt 1, Akt 2 o Akt 3; preferiblemente, en donde el método detecta la activación de Akt en la muestra;

con mayor preferencia, en donde la muestra es una muestra tumoral.
7. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el primer anticuerpo primario se une a HER2 y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a HER3; o

en donde el primer anticuerpo primario se une a HER3 y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a HER2;

preferiblemente, en donde el método detecta la dimerización de HER2/HER3 en la muestra.
8. El método in vitro de la reivindicación 7, en donde la muestra es una muestra tumoral;

preferiblemente, en donde la muestra es una muestra de tumor de mama.
9. El método in vitro de cualquier reivindicación anterior, en donde los al menos dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra simultáneamente o secuencialmente entre sí; y/o

en donde los al menos dos anticuerpos secundarios se ponen en contacto con la muestra simultáneamente o secuencialmente entre sí;

preferiblemente, en donde se realiza una etapa de lavado después de poner en contacto con la muestra los al menos dos anticuerpos primarios y antes de poner en contacto con la muestra los al menos dos anticuerpos secundarios; y/o

en donde los al menos dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra simultáneamente con los al menos dos anticuerpos secundarios; y/o

en donde los al menos dos anticuerpos primarios se ponen en contacto con la muestra antes que los al menos dos anticuerpos secundarios.
10. El método in vitro de cualquier reivindicación anterior, en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta directamente con un donante de FRET; y/o

en donde la muestra es una muestra de tejido; y/o

en donde la molécula es una proteína; y/o

en donde el primer sitio y el segundo sitio están en la misma molécula; y/o

en donde el primer sitio y el segundo sitio están en moléculas diferentes; y/o

que comprende además la etapa de cuantificar la interacción entre el primer sitio y el segundo sitio.
11. Un kit para detectar moléculas, el kit comprende:

a. al menos dos anticuerpos primarios, en donde el primer anticuerpo primario se une a un primer sitio en una molécula y el segundo anticuerpo primario se une a un segundo sitio en una molécula, en donde el segundo sitio es diferente del primer sitio y en donde el primer y segundo anticuerpos primarios son inmunológicamente distintos;

b. al menos dos anticuerpos secundarios, en donde al menos uno de los anticuerpos secundarios es un fragmento de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o un fragmento de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa, y en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta con un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y se une al primer anticuerpo primario; y el segundo anticuerpo secundario se conjuga o fusiona con una enzima y se une al segundo anticuerpo primario, en donde el primer anticuerpo secundario no se une al segundo anticuerpo primario y el segundo anticuerpo secundario no se une al primer anticuerpo primario;

c. un conjugado que comprende un aceptor de FRET y un sustrato específico para la enzima, en donde el conjugado se configura de tal manera que cuando el sustrato reacciona con la enzima, el conjugado forma un conjugado activado que puede unirse a restos ricos en electrones en una superficie molecular que están 2 a 9 nm o menos de 100 kDa de la enzima.
12. El kit de la reivindicación 11, en donde los al menos dos anticuerpos primarios se seleccionan del grupo que consiste en inmunoglobulinas completas, fragmentos de anticuerpo o de unión al antígeno de las mismas o combinaciones de los mismos; y/o

en donde, los al menos dos anticuerpos secundarios son fragmentos de anticuerpo de una inmunoglobulina completa o fragmentos de unión al antígeno de una inmunoglobulina completa; y/o

en donde los fragmentos de anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno son fragmentos Fab, fragmentos scFv o combinaciones de los mismos; y/o

en donde el donante de FRET se selecciona del grupo que consiste en GFp, fluoresceína y combinaciones de los mismos; y/o

en donde el aceptor de FRET se selecciona del grupo que consiste en tetrametilrodamina, fluoresceína y combinaciones de los mismos.
13. El kit de las reivindicaciones 11 a 12, en donde la al menos una enzima se selecciona del grupo que consiste en oxidorreductasas, hidrolasas, liasas, transferasas, isomerasas y ligasas;

preferiblemente, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en peroxidasas, oxidasas, fosfatasas, esterasas y glucosidasas;

con mayor preferencia, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa.
14. El kit de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el sustrato es tiramina; y/o

en donde los anticuerpos primarios no se etiquetan; y/o

en donde el primer anticuerpo primario es un anticuerpo murino y el al menos un anticuerpo primario adicional es un anticuerpo de conejo;

preferiblemente, en donde el primer anticuerpo secundario es un anticuerpo antimurino y el al menos un anticuerpo secundario adicional es un anticuerpo anticonejo; y/o

en donde el primer anticuerpo primario se une a Akt(pan) y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a pAkt(T308) en la proteína Akt 1, Akt 2 o Akt 3; y/o

en donde el primer anticuerpo primario se une a HER2 y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a HER3; y/o

en donde el primer anticuerpo primario se une a HER3 y el al menos un anticuerpo primario adicional se une a HER2; y/o

en donde el primer anticuerpo secundario se etiqueta directamente con un donante de FRET.
15. Un método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 para detectar moléculas con el uso del kit de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.