ES2825598T3 - Protocolo de seguimiento de difusión para fijación de tejido optimizada - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de fijación de muestra de tejido, comprendiendo dicho procedimiento: (a) sumergir una muestra de tejido no fijado en un volumen de una solución fijadora a una temperatura de 0 a 10 °C; (b) realizar el seguimiento de una tasa de difusión de la solución fijadora en la muestra de tejido: b(1) transmitiendo una señal acústica ultrasónica a través de la muestra de tejido y detectando la señal acústica ultrasónica después de que la señal ultrasónica ha pasado a través de la muestra de tejido; b(2) calculando el tiempo de vuelo (TOF) de la señal acústica ultrasónica; b(3) repitiendo (b1) y (b2) en una pluralidad de puntos de tiempo posteriores; b(4) calculando una tasa de difusión al menos en cada uno de los puntos de tiempo posteriores analizando una pendiente de una curva de los TOF calculados a partir de las señales acústicas ultrasónicas medidas en cada uno de los puntos de tiempo; b(5) determinando cuándo la tasa de difusión desciende por debajo de un umbral predeterminado, comprendiendo la determinación: repetir (b1)-(b4) y ajustar los TOF de dos o más de los puntos de tiempo a una curva exponencial simple hasta que el ajuste supere un límite de confianza predeterminado; y después de que el ajuste supera el nivel de confianza predeterminado, calcular una cantidad de tiempo necesario para alcanzar la tasa de difusión umbral predeterminada, en la que la tasa de difusión umbral predeterminada se ha cumplido cuando la cantidad de tiempo necesaria para alcanzar la tasa de difusión umbral predeterminada ha expirado; y (c) después de que la tasa de difusión desciende por debajo del umbral predeterminado, permitir que la muestra de tejido se caliente hasta una temperatura en el intervalo de 20 °C a 55 °C durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la fijación de la muestra de tejido.
Description
DESCRIPCIÓN
Protocolo de seguimiento de difusión para fijación de tejido optimizada
ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN OBJETO
Campo de la divulgación objeto
La presente divulgación objeto se refiere al análisis de muestras de tejido. Más en particular, la presente divulgación objeto se refiere al seguimiento del procesamiento de muestras de tejido.
Antecedentes de la divulgación objeto
En el análisis de muestras biológicas tales como cortes histológicos, sangre, cultivos celulares y similares, las muestras biológicas se tiñen con una o más combinaciones de tinción y biomarcadores, y el ensayo resultante se visualiza o se representa con imágenes para un análisis adicional. La observación del ensayo posibilita una variedad de procedimientos, incluyendo diagnóstico de enfermedad, evaluación de la respuesta al tratamiento y desarrollo de nuevos fármacos para combatir la enfermedad. Un ensayo incluye una o más tinciones conjugadas con un anticuerpo que se une a proteínas, fragmentos de proteínas u otros objetos de interés en la muestra, a continuación en el presente documento denominados dianas u objetos diana. Los anticuerpos u otros compuestos que unen una diana en la muestra a una tinción se denominan biomarcadores en la presente divulgación objeto. Algunos biomarcadores tienen una relación fija con una tinción (por ejemplo, la hematoxilina de contratinción de uso frecuente), mientras que para otros biomarcadores, se puede usar una elección de tinción para desarrollar y crear un nuevo ensayo.
Antes de prepararse en un ensayo para la formación de imágenes, las muestras biológicas, tales como los cortes histológicos de sujetos humanos, a menudo se colocan en un líquido que suspenderá las actividades metabólicas de las células. Este procedimiento se denomina comúnmente "fijación" y se puede lograr con varios tipos diferentes de líquidos. El fijador más común usado por los laboratorios de anatomía patológica es el formol tamponado neutro (FTN) al 10 %. Este fijador forma reticulaciones entre las moléculas de formaldehído y las moléculas celulares que contienen aminas. Además, este tipo de fijador conserva las proteínas para su almacenamiento. Cuando se usa a temperatura ambiente, el FTN se difunde en un corte histológico y reticula proteínas y ácidos nucleicos, deteniendo de este modo el metabolismo, conservando las biomoléculas y preparando el tejido para la infiltración en parafina. El formol puede estar a una temperatura levemente elevada (es decir, mayor que la temperatura ambiente) para incrementar además la tasa de reticulación, mientras que el formol a menor temperatura puede disminuir significativamente la tasa de reticulación. Por este motivo, los histólogos realizan típicamente la fijación de tejido a temperatura ambiente o mayor.
A menudo se observan varios efectos en tejidos que están subexpuestos o bien sobreexpuestos a formol. Si el formol no se ha difundido apropiadamente a través de las muestras de tejido, las regiones externas de las muestras de tejido expuestas a formol pueden estar fijadas en exceso y las regiones interiores de las muestras de tejido no expuestas a formol pueden estar insuficientemente fijadas, lo que da como resultado una morfología tisular muy deficiente. En un tejido insuficientemente fijado, la posterior exposición a etanol a menudo encoge las estructuras celulares y condensa los núcleos puesto que los tejidos no tendrán la oportunidad de formar una red reticulada apropiada. Cuando se tiñe tejido insuficientemente fijado, tal como con hematoxilina y eosina (HyE), se pueden observar muchos espacios blancos entre las células y estructuras tisulares, los núcleos pueden estar condensados y las muestras pueden aparecer de color rosa y desequilibradas con la tinción con hematoxilina. Los tejidos que se han expuesto a cantidades en exceso de formol o por demasiado tiempo típicamente no funcionan bien para posteriores procedimientos inmunohistoquímicos, presumiblemente debido a la desnaturalización y degradación de ácidos nucleicos y/o proteínas. Como resultado, las condiciones de recuperación de antígenos óptimas para estos tejidos no funcionan apropiadamente y por lo tanto las muestras de tejido parecen estar insuficientemente teñidas.
El diagnóstico médico apropiado y la seguridad del paciente a menudo requieren fijar apropiadamente las muestras de tejido antes de la tinción. En consecuencia, se han establecido pautas por oncólogos e histopatólogos para la fijación apropiada de muestras de tejido. Por ejemplo, de acuerdo con la American Society of Clinical Oncology (ASCO), la pauta actual para el tiempo de fijación en solución de formol tamponado neutro para análisis inmunohistoquímico de HER2 es de al menos 6 horas, preferentemente más, y hasta 72 horas. Sin embargo, este es un protocolo amplio e ineficaz, y el procedimiento diagnóstico habitual actual es que los laboratorios procesen tejidos con un protocolo personalizado no verificado que no está estandarizado y es deficiente. Por ejemplo, un protocolo existente incluye una fijación fría+caliente con FTN que es beneficiosa para la conservación de la histomorfología, así como proteínas con estados de activación (originalmente expresado como protocolo 2+2 debido a la inmersión sucesiva de tejidos durante 2 horas en FTN a 4 °C y 45 °C con tejidos de hasta 4 mm de espesor), en base al principio de que se difundió suficiente formaldehído en todo el tejido durante la difusión (etapa fría) antes de iniciar la reticulación (etapa caliente). Sin embargo, este protocolo se obtuvo sobre una base puramente empírica alterando los tiempos de difusión y las temperaturas y examinando la calidad de la histomorfología y la tinción inmunohistoquímica. En consecuencia, es deseable desarrollar un procedimiento o sistema para realizar el seguimiento de la difusión de fijadores a través de una muestra de tejido para determinar si el fijador ha infundido la totalidad de la muestra de tejido para minimizar o limitar el tejido insuficientemente fijado o el tejido fijado en exceso y para conservar mejor las moléculas biológicas, la morfología tisular y/o las señales de modificación
postraduccional antes de que se produzca una degradación significativa.
El documento WO 2011/109769 A1 divulga un procedimiento para fijar una muestra biológica. El procedimiento incluye suministrar energía a través de una muestra biológica mientras se fija la muestra biológica. Se evalúa un cambio en la velocidad de la energía que viaja a través de la muestra biológica para realizar el seguimiento del avance de la fijación. Un sistema para realizar el procedimiento puede incluir un transmisor que emite la energía y un receptor configurado para detectar la energía transmitida. Un dispositivo informático puede evaluar la velocidad de la energía en base a las señales del receptor.
El documento WO 2012/110646 A1 describe un procedimiento que comprende hacer que una solución fijadora de aldehído a una primera temperatura entre en contacto con una muestra de tejido durante un primer periodo de tiempo. Además, el procedimiento comprende hacer que una solución fijadora de aldehído entre en contacto con la muestra de tejido a una segunda temperatura mayor que la primera temperatura durante un segundo periodo de tiempo. El procedimiento se usa para mejorar la morfología del tejido y la tinción IHQ.
El documento EP 2 458 365 A1 describe una fijación con formol frío en dos etapas de muestras de tejido orgánico. Describe un procedimiento que comprende las etapas de a) sumergir el tejido en una solución de formol a una temperatura de entre 2 °C y 10 °C, preferentemente de 2 °C a 5 °C, durante un primer periodo de tiempo y b) sumergir el tejido en un agente deshidratante de fijación frío durante un segundo periodo de tiempo.
SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN OBJETO
La divulgación objeto resuelve los problemas identificados anteriormente presentando sistemas y procedimientos implementados por ordenador para realizar el seguimiento de la difusión de una solución fijadora en una muestra de tejido para garantizar una fijación óptima y, por lo tanto, una tinción de alta calidad para ensayos posteriores. El seguimiento se basa en cambios en la velocidad del sonido provocados por la difusión de solución fijadora en la muestra de tejido. A medida que el fijador penetra en el tejido, desplaza el líquido intersticial. Este intercambio de líquido cambia levemente la composición del volumen de tejido porque el líquido intersticial y el fijador tienen velocidades de sonido distintas. El impulso de ultrasonido de salida acumula por tanto un pequeño diferencial de tiempo de tránsito que se incrementa a medida que se produce un mayor intercambio de líquido. La tasa a la que cambia el diferencial de tiempo de tránsito se puede usar como una medición indirecta para rastrear la tasa de difusión, que, como se muestra en el presente documento, se puede usar para predecir con exactitud la calidad de fijación y una tinción posterior.
Por lo tanto, la divulgación objeto divulga sistemas y procedimientos para rastrear y cuantificar dinámicamente la difusión de fijador. El estado activo de la difusión de fijador se correlaciona a continuación con los resultados de tinción para desarrollar una métrica que determine con precisión cuándo una muestra tiene suficiente penetración de fijador para teñir bien. Esto ayuda a asegurar que las muestras se fijan adecuadamente al alargar automáticamente la cantidad de tiempo que los tejidos lentos necesitan estar expuestos al fijador, mientras se proporcionan mejoras en el flujo de trabajo para acortar la cantidad de tiempo de procesamiento de tejidos requerido para las muestras de tejido y se añade garantía de la calidad y generación de informes para los laboratorios de procesamiento de tejidos. La métrica predictiva se valida con los resultados de un gran estudio de recogida de tejidos. Se muestran resultados experimentales que confirman que esta métrica garantiza secciones transversales teñidas idealmente. Se puede programar un sistema de preparación de tejido para realizar el seguimiento de dicha difusión de cualquier muestra de tejido y determinar un tiempo óptimo para el remojo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El documento de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. Las copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujo(s) en color se proporcionarán por la Oficina bajo petición y pago de la tasa necesaria.
La FIG. 1 muestra un sistema para optimizar la fijación de tejido usando el seguimiento de difusión, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
Las FIGS. 2A y 2B muestran respectivamente representaciones de patrones de exploración por ultrasonido de una caja de biopsia y de un casete de tamaño estándar, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
Las FIGS. 3A-C muestran trazados de tiempo de vuelo (ToF) y una curva de difusión promedio generada a partir de una muestra de tejido en un casete de tamaño estándar, de acuerdo con modos de realización ejemplares de la divulgación objeto.
La FIG.4 muestra una calidad de la morfología del tejido para muestras de tejido fijadas en diferentes intervalos de tiempo, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
La FIG. 5 muestra un gráfico de las constantes de disminución para muestras de tejido remojadas durante 3 y 5 horas, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
Las FIGS.6A y 6B muestran curvas de difusión y curvas características de funcionamiento del receptor para una pluralidad de muestras, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
Las FIGS.7A y 7B muestran una pendiente normalizada en amplitud de las curvas de difusión y las curvas características de funcionamiento del receptor para una pluralidad de muestras, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
Las FIGS.8A-E muestran curvas de difusión y tiempos de finalización previstos en base a diferentes valores de pendiente umbral, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
La FIG. 9 muestra las constantes de disminución promedio para una pluralidad de muestras de tejido representadas en orden alfabético, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
La FIG. 10 muestra las constantes de disminución promedio de cada muestra de tejido promediadas sobre el tipo de órgano y clasificadas de la constante de disminución más baja a la más alta, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
La FIG. 11 muestra los tiempos de finalización previstos para diferentes tipos de tejido usando una pendiente umbral de -7,4 %/h, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
Las FIGS. 12A y 12B muestran respectivamente las funciones de densidad de probabilidad para los tiempos de finalización previstos para una pluralidad de tipos de tejido y una función de distribución acumulada para todos los tiempos de finalización, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
La FIG. 13 muestra un procedimiento para optimizar la fijación de tejido, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN OBJETO
I. Sistemas y procedimientos
La divulgación objeto resuelve los problemas identificados anteriormente presentando sistemas y procedimientos implementados por ordenador para predecir una cantidad mínima de tiempo en que una muestra de tejido se difunde con un fijador frío para garantizar una fijación óptima y, por lo tanto, una tinción de alta calidad para ensayos posteriores. La predicción se posibilita realizando el seguimiento de la penetración del fijador en varias muestras de tejido y correlacionando la tasa de difusión con la calidad de una tinción del ensayo posterior para determinar el tiempo mínimo de difusión que da como resultado una muestra de tejido fijada de forma óptima. El seguimiento se basa en cambios en la velocidad del sonido provocados por la difusión de fijador en la muestra de tejido. A medida que penetra fijador en el tejido, desplaza el líquido intersticial. Este intercambio de líquido cambia levemente la composición del volumen de tejido porque el líquido intersticial y el fijador tienen velocidades de sonido distintas. Un impulso de ultrasonido que pasa a través de la muestra de tejido acumula por tanto un pequeño diferencial de tiempo de vuelo (TOF) que se incrementa a medida que se produce más intercambio de líquido. Por lo tanto, la divulgación objeto divulga sistemas y procedimientos para rastrear y cuantificar dinámicamente la difusión de fijador rastreando el TOF y correlacionando el TOF con una tasa de difusión. Al correlacionar tasas de difusión particulares correlacionadas con los resultados de la tinción, se puede desarrollar una métrica para determinar con precisión cuándo una muestra tiene suficiente penetración de fijador para teñir bien. Esta métrica predictiva se valida con los resultados de un gran estudio de recogida de tejidos. Se muestran resultados experimentales que confirman que esta métrica garantiza secciones transversales teñidas idealmente.
IA. Analizador de señales
En un modo de realización, se proporciona un sistema para calcular métricas de difusión en base al TOF, comprendiendo dicho sistema un analizador de señales que contiene un procesador y una memoria acoplada al procesador, la memoria para almacenar instrucciones ejecutables por ordenador que, cuando se ejecutan por el procesador, provocan que el procesador realice operaciones que incluyen el cálculo de una tasa de difusión en base a cálculos del t Of .
El término "procesador' engloba todas las clases de aparatos, dispositivos y máquinas para procesar datos, incluyendo a modo de ejemplo un microprocesador programable, un ordenador, un sistema en un chip, o múltiples, o combinaciones de los anteriores. El aparato puede incluir circuitos lógicos de propósito especial, por ejemplo, una FPGA (matriz de compuertas programables in situ) o un ASIC (circuito integrado específico de la aplicación). El aparato también puede incluir, además del equipo informático, código que crea un entorno de ejecución para el programa informático en cuestión, por ejemplo, código que constituye el microprograma del procesador, una pila de protocolos, un sistema de gestión de bases de datos, un sistema operativo, un entorno en tiempo de ejecución multiplataforma, una máquina virtual o una combinación de uno o más de ellos. El aparato y el entorno de ejecución pueden realizar diversas infraestructuras de modelos informáticos diferentes, tales como servicios web, infraestructuras informáticas distribuidas y de informática en malla.
Un programa informático (también conocido como programa, aplicación de programa informático, secuencia de comandos o código) puede estar escrito de cualquier forma de lenguaje de programación, incluyendo lenguajes compilados o interpretados, lenguajes declarativos o procedimentales, y se puede emplear de cualquier forma, incluyendo como un programa independiente o como un módulo, componente, subrutina, objeto u otra unidad adecuada para su uso en un entorno informático. Un programa informático puede corresponder, pero no necesariamente, a un archivo en un sistema de archivos. Un programa se puede almacenar en una parte de un archivo que albergue otros programas o datos (por ejemplo, una o más secuencia de comandos almacenadas en un documento de lenguaje de marcado), en un único archivo dedicado al programa en cuestión o en múltiples archivos coordinados (por ejemplo, archivos que almacenan uno o más módulos, subprogramas o partes de código). Se puede implementar un programa informático para ejecutarse en un ordenador o en múltiples ordenadores que se localicen en un sitio o se distribuyan a través de múltiples sitios y se interconecten por una red de comunicación.
Los procedimientos y flujos lógicos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden realizar por uno o más procesadores programables que ejecutan uno o más programas informáticos para realizar acciones operando sobre datos de entrada y generando una salida. Los procedimientos y flujos lógicos también se pueden realizar por, y el aparato también se puede implementar como, circuitos lógicos de propósito especial, por ejemplo, una FPGA (matriz de compuertas programables in situ) o un ASIC (circuito integrado específico de la aplicación).
Los procesadores adecuados para la ejecución de un programa informático incluyen, a modo de ejemplo, microprocesadores de propósito tanto general como especial, y uno cualquiera o más procesadores de cualquier clase de ordenador digital. En general, un procesador recibirá instrucciones y datos de una memoria de solo lectura o una memoria de acceso aleatorio o ambas. Los elementos esenciales de un ordenador son un procesador para realizar acciones de acuerdo con instrucciones y uno o más dispositivos de memoria para almacenar instrucciones y datos. En general, un ordenador también incluirá, o se acoplará de forma funcional para recibir datos o transferir datos a, o ambos, uno o más dispositivos de almacenamiento masivo para almacenar datos, por ejemplo, discos magnéticos, magnetoópticos o discos ópticos. Sin embargo, un ordenador no necesariamente tiene dichos dispositivos. Además, un ordenador se puede incluir en otro dispositivo, por ejemplo, un teléfono móvil, un asistente digital personal (PDA), un reproductor de audio o vídeo móvil, una consola de juegos, un receptor de sistema de posicionamiento global (GPS) o un dispositivo de almacenamiento portátil (por ejemplo, una unidad flash de bus en serie universal (USB)), por nombrar solo algunos. Los dispositivos adecuados para almacenar instrucciones y datos de programa informático incluyen todas las formas de memoria no volátil, medios y dispositivos de memoria, incluyendo, a modo de ejemplo, dispositivos de memoria de semiconductores, por ejemplo, EPROM, EEPROM y dispositivos de memoria flash; discos magnéticos, por ejemplo, discos duros internos o discos extraíbles; discos magnetoópticos; y discos CD-ROM y DVD-ROM. El procesador y la memoria se pueden complementar por, o incorporar en, circuitos lógicos de propósito especial.
Para proporcionar una interacción con un usuario, los modos de realización de la materia objeto descrita en la presente memoria descriptiva se pueden implementar en un ordenador que tenga un dispositivo de visualización, por ejemplo, una LCD (pantalla de cristal líquido), pantalla LED (diodo emisor de luz) o pantalla OLED (diodo orgánico emisor de luz), para mostrar información al usuario, y un teclado y un dispositivo apuntador, por ejemplo, un ratón o una bola de seguimiento, mediante los que el usuario pueda proporcionar una entrada al ordenador. En algunas implementaciones, se puede usar una pantalla táctil para mostrar información y recibir una entrada de un usuario. También se pueden usar otras clases de dispositivos para proporcionar una interacción con un usuario; por ejemplo, la retroalimentación proporcionada al usuario puede estar en cualquier forma de retroalimentación sensorial, por ejemplo, retroalimentación visual, retroalimentación auditiva o retroalimentación táctil; y la entrada del usuario se puede recibir en cualquier forma, incluyendo entrada acústica, de voz o táctil. Además, un ordenador puede interactuar con un usuario enviando documentos a y recibiendo documentos de un dispositivo que se usa por el usuario; por ejemplo, enviando páginas web a un navegador web en un dispositivo cliente de usuario en respuesta a solicitudes recibidas del navegador web.
Los modos de realización de la materia objeto descrita en la presente memoria descriptiva se pueden implementar en un sistema informático que incluye un componente de soporte, por ejemplo, como un servidor de datos, o que incluye un componente de soporte lógico personalizado, por ejemplo, un servidor de aplicaciones, o que incluye un componente frontal, por ejemplo, un ordenador cliente que tiene una interfaz de usuario gráfica o un navegador web a través del que un usuario puede interactuar con una implementación de la materia objeto descrita en la presente memoria descriptiva, o cualquier combinación de uno o más de dichos componentes de soporte, de soporte lógico personalizado o frontales. Los componentes del sistema se pueden interconectar por cualquier forma o medio de comunicación de datos digitales, por ejemplo, una red de comunicación. Los ejemplos de redes de comunicación incluyen una red de área local ("LAN") y una red de área amplia ("WAN"), una interred (por ejemplo, internet) y redes de pares (por ejemplo, redes de pares ad hoc).
El sistema informático puede incluir cualquier número de clientes y servidores. En general, un cliente y servidor, en general, son remotos entre sí y típicamente interactúan a través de una red de comunicación. La relación del cliente y servidor surge en virtud de programas informáticos que se ejecutan en los ordenadores respectivos y que tienen una relación cliente-servidor entre sí. En algunos modos de realización, un servidor transmite datos (por ejemplo, una página HTML) a un dispositivo cliente (por ejemplo, para propósitos de mostrar datos a y recibir una entrada de usuario de un usuario que interactúa con el dispositivo cliente). Los datos generados en el dispositivo cliente (por ejemplo, un resultado de la interacción del usuario) se pueden recibir del dispositivo cliente en el servidor.
IB. Cálculo de la tasa de difusión
Las operaciones realizadas por el procesador del analizador de señales comprenden el cálculo de una tasa de difusión. Para calcular la tasa de difusión, se ajusta un trazado de TOF (analizado con más detalle a continuación) a una curva exponencial simple para derivar una amplitud de disminución de TOF (A) y una constante de disminución (t). En algunos modos de realización, la curva exponencial simple tiene la forma de acuerdo con la ecuación I:
TOF(t,r) = C(r) Ae-,lT(n ( I ) .
en la que C es un desplazamiento constante, A es la amplitud de la disminución (es decir, la diferencia del valor de TOF entre la muestra de tejido no difundida y completamente difundida), t es la constante de disminución, t es el tiempo de difusión y r es la dependencia espacial (que se indica explícitamente). De acuerdo con modos de realización, el desplazamiento constante C representa la diferencia de TOF entre la muestra de tejido y una solución a granel (por ejemplo, un líquido de tejido o un tampón de muestra). La constante C se puede establecer en cero para visualización (véanse, por ejemplo, los valores iniciales de TOF "cero" en las figuras 3B y C). Cuando los cálculos de TOF se realizan en una pluralidad de localizaciones espaciales, puede ser deseable calcular un trazado de TOF promediado espacialmente (es decir, una curva simple que representa el TOF en una pluralidad de localizaciones espaciales dentro de la muestra) y obtener una amplitud de TOF promedio (Aprom) y una constante de disminución promedio (Tprom) ajustando el trazado de TOF promediado espacialmente a una curva exponencial simple. En algunos modos de realización, el trazado de TOF promediado espacialmente se ajusta a una curva exponencial simple de la forma de acuerdo con la ecuación II:
en la que TOFprom es el trazado de TOF promediado espacialmente, N es el número de localizaciones espaciales en las que se adquirió un trazado de TOF, Cprom es el desplazamiento constante promedio, Aprom es la amplitud promedio de la disminución (es decir, la diferencia de valor de TOF promedio entre la muestra de tejido no difundida y completamente difundida), y Tprom es la constante de disminución promedio. Por tanto, "promedio" en este contexto significa "promedio espacial" que se ha derivado de los valores de datos obtenidos para un punto de tiempo compartido particular en diferentes puntos de la muestra. La tasa de difusión en el tiempo t se calcula como una derivada de la curva exponencial simple en el tiempo t. En un modo de realización, la tasa de difusión para un trazado de TOF no promediado espacialmente se calcula de acuerdo con la ecuación I IIa:
d T O F ( t ) - A l jT
(I l la ) ,
d t { t - t 0)
t
en la que A es la amplitud de la disminución (es decir, la diferencia de valor de TOF entre la muestra de tejido no difundida y completamente difundida), T es la constante de disminución y to es el tiempo de difusión. En otro modo de realización, la tasa de difusión para un trazado de TOF promediado espacialmente se calcula de acuerdo con la ecuación IIIb:
en la que Aprom es la amplitud promedio de la disminución (es decir, el promedio espacial de la diferencia de TOF entre la muestra de tejido no difundida y completamente difundida), Tprom es la constante de disminución promedio, y to es el tiempo de difusión. En algunos modos de realización, la tasa de difusión se calcula como una tasa de difusión normalizada en amplitud dividiendo la derivada de la curva por la amplitud de la muestra (A o Aprom) en el tiempo to. En un modo de realización, la tasa de difusión normalizada en amplitud se calcula para un trazado de TOF no promediado espacialmente de acuerdo con la ecuación IVa:
en la que T es la constante de disminución, to es el tiempo de difusión y los corchetes indican las unidades para la tasa de difusión, en las que tiempo son las unidades de tiempo de acuerdo con T. En otro modo de realización, la tasa de difusión normalizada en amplitud se calcula para un trazado de TOF promediado espacialmente de acuerdo con la ecuación IVb:
íh (t = ta) = 100
en la que Tprom es la constante de disminución promedio, to es el tiempo de difusión, y los corchetes indican las unidades para la tasa de difusión, en las que tiempo son las unidades de tiempo de acuerdo con Tprom.
IC. Cálculo de TOF
En algunos modos de realización, el trazado de TOF se calcula previamente y se carga directamente en el analizador de señales. En otros modos de realización, las operaciones realizadas por el procesador del analizador de señales pueden incluir además convertir un conjunto de datos acústicos obtenidos transmitiendo una señal ultrasónica a través de una muestra de tejido en una pluralidad de puntos de tiempo en un trazado de TOF. Como se usa en el presente documento, la frase "trazado de TOF" se refiere a un conjunto de datos que comprende una pluralidad de mediciones de TOF tomadas en puntos de tiempo distintos.
El TOF típicamente no se registra directamente, sino que en cambio se estima comparando la fase de las ondas acústicas transmitidas y recibidas. En la práctica, un barrido de frecuencia experimental se transmite por un transmisor a través del medio y se detecta por un receptor. La fase de las ondas transmitidas y recibidas se compara y se transforma en una desviación de fase temporal. A continuación, se ejecuta una simulación para modelar las desviaciones de fase temporales candidatas en una variedad de TOF candidatos, y se genera un error entre las desviaciones de fase temporales candidatas y experimentales y se representa como una función de error. El TOF que da como resultado el mínimo de la función de error se selecciona como el TOF "observado". Por tanto, en un modo de realización, el TOF se calcula registrando una desviación de fase transmitida entre una señal de ultrasonido transmitida y recibida y ajustando la desviación de fase registrada a una pluralidad de desviaciones de fase simuladas en diferentes TOF candidatos.
De acuerdo con algunos modos de realización, la señal de TOF se determina con una alta exactitud de acuerdo con uno de los enfoques divulgados en la solicitud de patente internacional titulada ACCURATELY CALCULATING ACOUSTIC TIME-OF-FLIGHT [CALCULO EXACTO DEL TIEMPO DE VUELO ACÚSTICO] presentada el 17 de diciembre de 2015. El TOF también se puede determinar como se divulga en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos n.° 62/093.173, presentada el 17 de diciembre de 2014.
En algunos casos, el trazado de TOF se puede registrar en un único punto de la muestra de tejido (por ejemplo, en o cerca del centro geométrico de la muestra de tejido). En otros casos, se puede capturar un trazado de TOF en una pluralidad de posiciones dentro de la muestra de tejido.
Como ejemplo de cálculo de TOF, se ha desarrollado un algoritmo de posprocesamiento que puede detectar de forma consistente los valores de TOF de subnanosegundos en muestras de tejido sumergidas en una solución fijadora. Un transductor de transmisión programado con un generador de forma de onda programable transmite una señal sinusoidal de 3,7 MHz durante 600 ps. Esa cadena de impulsos se detecta por un transductor de recepción después de atravesar el líquido y el tejido, y las sinusoides de US recibidas y transmitidas se comparan a continuación electrónicamente con un comparador de fase digital. La salida del comparador de fase se consulta con un convertidor de analógico a digital y se registra el promedio. El proceso se repite en múltiples frecuencias acústicas (v). Dada la frecuencia central (4,0 MHz) y el ancho de banda fraccional (~60 %) de los transductores, un barrido típico varía de 3,7-4,3 MHz con el comparador de fase consultado cada 600 Hz. La tensión del comparador de fase se convierte en una desviación de fase temporal, denominada fase determinada experimentalmente (qexp). Seguidamente, se usa una simulación de fuerza bruta para calcular cómo se vería el barrido de frecuencia de fase observado para diferentes valores de TOF. Los valores de fase temporal candidatos, como función de la frecuencia sinusoide de entrada, se calculan de acuerdo con la Ecuación V:
donde TOFcand es un valor de TOF candidato en nanosegundos, T es el periodo de la sinusoide de entrada en nanosegundos, rnd representa el redondeo a la función entera más cercana y |...| es el símbolo de valor absoluto. Para un TOF candidato dado y un valor de frecuencia (es decir, periodo), el término de la derecha representa el tiempo que tarda en producirse el número más cercano de ciclos. Este valor se resta de TOFcand para calcular la fase temporal, hacia o hasta, el siguiente ciclo completo. Por tanto, los valores de fase se computan para múltiples valores de TOF candidatos que inicialmente varían de 10-30 ps con una separación de 200 ps. El error entre los barridos de frecuencia experimental y candidata se calcula en un sentido de mínimos cuadrados para valores de TOF candidatos individuales por la ecuación VI:
donde N es el número total de frecuencias en el barrido. La función de error normalizado, como función del TOF candidato, se asemeja a un interferograma óptico. Por ejemplo, cada rasgo característico tiene un ancho de un periodo acústico (T=1/4 MHz=250 ns). La función de error máximo indica que el barrido de frecuencia de fase candidata tiene la misma longitud de onda pero está desfasado con el barrido de frecuencia de fase experimental. Por el contrario, cuando se minimiza el error, los dos están completamente armonizados y, por tanto, el TOF reconstruido se registra como el mínimo global de la función de error de acuerdo con la ecuación VII:
TOF,eco,, = ar8 mm{Error). (VII)
TOFWnd
Esta técnica de comparación digital de ondas acústicas da como resultado una alta precisión debido a la nitidez del canal central, y da como resultado barridos de frecuencia de fase experimental y candidata excepcionalmente bien emparejados.
Además, se puede usar un trazado de TOF registrado solo a través de la solución fijadora (es decir, que no encuentra la muestra de tejido) para compensar las fluctuaciones en el TOF registrado como resultado de fluctuaciones ambientales (tales como cambios de temperatura). Un trazado de TOF que se ha ajustado de esta manera se denomina trazado de TOF compensado por referencia. Por tanto, en otro modo de realización, el trazado de TOF que se ajusta a la curva exponencial simple es un trazado de TOF compensado por referencia.
ID. Sistema de seguimiento acústico
El sistema también puede comprender un sistema de seguimiento acústico adaptado para generar el conjunto de datos acústicos transmitiendo una señal acústica de modo que la señal acústica encuentre la muestra de tejido sumergida en la solución fijadora, y a continuación detecte la señal acústica después de que la señal acústica haya encontrado la muestra de tejido. Por tanto, en otro modo de realización, se proporciona un sistema que comprende un analizador de señales como se divulga en el presente documento y un sistema de seguimiento acústico que se analiza con más detalle a continuación. Adicionalmente o de forma alternativa, se puede proporcionar un sistema que comprende un analizador de señales como se divulga en el presente documento y un medio legible por ordenador no transitorio que comprende un conjunto de datos acústicos obtenidos de un sistema de seguimiento acústico como se divulga en el presente documento. En un modo de realización, los datos acústicos se generan por un barrido de frecuencia transmitido y recibido por el sistema de seguimiento acústico. Como se usa en el presente documento, el término "barrido de frecuencia" se referirá a una serie de ondas acústicas transmitidas a intervalos de frecuencias fijos a través de un medio, de modo que un primer conjunto de ondas acústicas se emite a través del medio a una frecuencia fija durante una primera duración de tiempo fija, y los conjuntos posteriores de ondas acústicas se emiten a intervalos de frecuencia fijos para duraciones posteriores, preferentemente iguales.
En un modo de realización, se proporciona un sistema de seguimiento acústico para recoger el conjunto de datos acústicos, comprendiendo dicho sistema de seguimiento acústico un transmisor y un receptor, en el que dicho transmisor y receptor se disponen de modo que las señales acústicas generadas por el transmisor se reciban por el receptor y se transformen en una señal legible por ordenador. En un modo de realización, el sistema comprende un transmisor ultrasónico y un receptor ultrasónico. Como se usa en el presente documento, un "transmisor" es un dispositivo que puede convertir una señal eléctrica en energía acústica, y un "transmisor ultrasónico" es un dispositivo que puede convertir una señal eléctrica en energía acústica ultrasónica. Como se usa en el presente documento, un "receptor" es un dispositivo que puede convertir una onda acústica en una señal eléctrica, y un "receptor ultrasónico" es un dispositivo que puede convertir energía acústica ultrasónica en una señal eléctrica".
Determinados materiales útiles para generar energía acústica a partir de señales eléctricas también son útiles para generar señales eléctricas a partir de energía acústica. Por tanto, no es necesariamente necesario que el transmisor y el receptor sean componentes separados, aunque pueden serlo. El transmisor y el receptor se disponen de modo que el receptor detecte ondas acústicas generadas por el transmisor después de que las ondas transmitidas hayan encontrado un material de interés. En algunos modos de realización, el receptor se dispone para detectar ondas acústicas que se han reflejado por el material de interés. En otros modos de realización, el receptor se dispone para detectar ondas acústicas que se han transmitido a través del material de interés. En algunos modos de realización, se proporcionan al menos dos conjuntos de transmisores y receptores, al menos uno de los conjuntos situado para transmitir una señal acústica a través de la solución fijadora y la muestra de tejido, y al menos un segundo situados para transmitir una señal acústica a través de la solución fijadora, pero no a través de la muestra de tejido. En este modo de realización, el primer conjunto se usa para medir los cambios de TOF en la muestra de tejido, y el segundo conjunto se usa para detectar cambios en el TOF a través de la solución fijadora (por ejemplo, cambios resultantes de fluctuaciones ambientales, tales como la temperatura).
En un modo de realización, el transmisor comprende un generador de forma de onda conectado de forma funcional a un transductor, el generador de forma de onda para generar una señal eléctrica que se comunica al transductor, el transductor para convertir la señal eléctrica en una señal acústica. En determinados modos de realización, el generador de forma de onda es programable, de modo que un usuario puede modificar determinados parámetros del barrido de frecuencia, incluyendo por ejemplo: frecuencia de inicio y/o finalización, el tamaño de escalón entre frecuencias del barrido de frecuencia, el número de escalones de frecuencia, y/o la duración durante la que se transmite cada frecuencia. En otros
modos de realización, el generador de forma de onda se preprograma para generar uno o más patrones de barrido de frecuencia predeterminados. En otros modos de realización, el generador de forma de onda se puede adaptar para transmitir tanto barridos de frecuencia preprogramados como barridos de frecuencia personalizados. El transmisor también puede contener un elemento de enfoque, que permite que la energía acústica generada por el transductor se enfoque y dirija de forma predecible a un área específica.
En funcionamiento, el transmisor transmite un barrido de frecuencia a través del medio, que, a continuación, se detecta por el receptor y se transforma en el conjunto de datos acústicos que se van a almacenar en un medio de almacenamiento no transitorio legible por ordenador y/o transmitir al analizador de señales para su análisis. Cuando el conjunto de datos acústicos incluye datos representativos de una diferencia de fase entre las ondas acústicas transmitidas y las ondas acústicas recibidas, el sistema de seguimiento acústico también puede incluir un comparador de fase, que genera una señal eléctrica que corresponde a la diferencia de fase entre las ondas acústicas transmitidas y recibidas. Por tanto, en determinados modos de realización, el sistema de seguimiento acústico comprende un comparador de fase conectado de forma comunicativa a un transmisor y receptor. Cuando la salida del comparador de fase es una señal analógica, el sistema de seguimiento acústico también puede incluir un convertidor de analógico a digital para convertir la salida analógica del comparador de fase en una señal digital. A continuación, la señal digital se puede registrar, por ejemplo, en un medio no transitorio legible por ordenador, o se puede comunicar directamente al analizador de señales para su análisis.
IE. Sistema de seguimiento de difusión activo
En algunos modos de realización, el sistema se adapta para un seguimiento activo de la difusión de una solución fijadora en la muestra de tejido. En un modo de realización de este tipo, se puede proporcionar un sistema que comprende: (a) un sistema de seguimiento acústico como se analiza en el presente documento y/o un medio no transitorio legible por ordenador que comprende un conjunto de datos acústicos generados por dicho sistema de seguimiento acústico; (b) un analizador de señales como se analiza en el presente documento adaptado para obtener el conjunto de datos acústicos del sistema de seguimiento acústico y/o el medio de almacenamiento no transitorio legible por ordenador; y (c) un aparato para contener un volumen de una solución fijadora en la que se puede sumergir la muestra de tejido.
En los modos de realización en los que se recoge un trazado de TOF de una pluralidad de posiciones dentro de la muestra de tejido, se puede proporcionar un aparato para traducir la muestra de tejido en relación con el transmisor y el receptor o traducir el transmisor y el receptor en relación con la muestra de tejido, de modo que los focos comunes del transmisor y el receptor se muevan a diferentes posiciones en la muestra de tejido. Adicionalmente o de forma alternativa, el sistema de seguimiento acústico se puede equipar con una pluralidad de transmisores y receptores, teniendo cada uno de la pluralidad focos comunes diferentes, de modo que cada conjunto capture un trazado de TOF en una localización diferente dentro de la muestra de tejido.
En algunos modos de realización, el sistema comprende además una fuente de solución fijadora. En determinados modos de realización, el fijador es un fijador de reticulación a base de aldehído, tal como soluciones a base de glutaraldehído y/o formol. Los ejemplos de aldehídos que se usan con frecuencia para la fijación por inmersión incluyen:
• formaldehído (concentración de trabajo estándar de formol al 5-10 % para la mayoría de los tejidos, aunque se han usado concentraciones tan altas como formol al 20 % para determinados tejidos);
• glioxal (concentración de trabajo estándar de 17 a 86 mM);
• glutaraldehído (concentración de trabajo estándar de 200 mM).
Los aldehídos se usan a menudo en combinación entre sí. Las combinaciones de aldehído estándar incluyen formol al 10 %+ glutaraldehído al 1 % (p/v). Se han usado aldehídos atípicos en determinadas aplicaciones de fijación especializadas, que incluyen: fumaraldehído, hidroxiadipaldehído al 12,5 % (pH 7,5), crotonaldehído al 10 % (pH 7,4), aldehído pirúvico al 5 % (pH 5,5), acetaldehído al 10 % (pH 7,5), acroleína al 10 % (pH 7,6) y metacroleína al 5 % (pH 7,6). Otros ejemplos específicos de soluciones fijadoras a base de aldehído usadas para inmunohistoquímica se exponen en la tabla 1:
Tabla 1
En determinados modos de realización, la solución fijadora se selecciona de la tabla 1. En algunos modos de realización, la concentración de aldehído usada es mayor que las concentraciones estándar mencionadas anteriormente. Por ejemplo, se puede usar una solución fijadora a base de aldehído de alta concentración que tenga una concentración de aldehído que sea al menos 1,25 veces mayor que la concentración estándar usada para fijar un tejido seleccionado para inmunohistoquímica con una composición sustancialmente similar. En algunos ejemplos, la solución fijadora a base de aldehído de alta concentración se selecciona de: más de un 20 % de formol, aproximadamente un 25 % de formol o más, aproximadamente un 27,5 % de formol o más, aproximadamente un 30 % de formol o más, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 50 % de formol, de aproximadamente un 27,5 % a aproximadamente un 50 % de formol, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 50 % de formol, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 40 % de formol, de aproximadamente un 27,5 % a aproximadamente un 40 % de formol y de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 40 % de formol. Como se usa en este contexto, el término "aproximadamente" englobará concentraciones que no den como resultado una diferencia estadísticamente significativa en la difusión a 4 °C como se midió por Bauer et al., Dynamic Subnanosecond Time-of-Flight Detection for Ultra-precise Diffusion Monitoring and Optimization of Biomarker Preservation, Actas de SPIE, vol. 9040, 90400B-1 (20 de marzo de 2014).
En algunos modos de realización, es deseable mantener la solución fijadora a una temperatura específica o dentro de un intervalo de temperaturas específico durante al menos una parte del procedimiento de difusión (tal como durante un procedimiento de fijación a dos temperaturas como se analiza con más detalle a continuación). En un caso de este tipo, el aparato para contener el volumen de fijador se puede adaptar para mantener la solución fijadora a la temperatura específica o dentro del intervalo de temperatura específico. Por tanto, por ejemplo, el aparato se puede aislar para reducir sustancialmente la transferencia de calor entre la solución fijadora y el entorno circundante. Adicionalmente o de forma alternativa, el aparato se puede configurar con un dispositivo de calentamiento o refrigeración diseñado para mantener la solución fijadora en la que se sumerge la muestra de tejido a la temperatura específica o dentro del intervalo de temperatura específico.
En algunos modos de realización, puede ser deseable garantizar que el tejido haya alcanzado un nivel umbral de penetración del fijador. En un modo de realización de este tipo, el analizador de señales se puede programar además para incluir una función de umbral, que analiza si se ha alcanzado un valor de tasa de difusión umbral para garantizar una calidad mínima de un análisis final particular. En un modo de realización, los valores umbrales para el análisis final particular se determinan determinando empíricamente los tiempos de difusión para un tipo de muestra de tejido particular requerido para lograr la calidad mínima del procedimiento final particular, y correlacionando esos tiempos determinados empíricamente con la tasa de difusión como se calcula anteriormente. En algunos modos de realización, el sistema continuamente realiza un seguimiento de difusión hasta que se alcanza la tasa de difusión umbral. En un modo de realización alternativo, el seguimiento de difusión puede continuar hasta que los datos de TOF se ajusten a una curva exponencial simple con un grado de confianza que supere un umbral predeterminado. Una vez que se alcanza el nivel de confianza, se extrapola un tiempo para alcanzar la tasa de difusión umbral de la curva exponencial simple (en adelante denominado, "tiempo hasta la finalización"), lo que posibilita que el seguimiento activo de la tasa de difusión se reemplace por un temporizador. En un modo de realización en el que se mide un trazado de TOF en una única localización, el tiempo hasta la finalización se puede calcular de acuerdo con la ecuación VI IIa:
en la que tterminado es el tiempo hasta la finalización, y el símbolo |...| indica el valor absoluto. En un modo de realización en el que se usa un trazado de TOF promediado espacialmente, el tiempo hasta la finalización se puede calcular de acuerdo con la ecuación VIIIb:
en la que tterminado es el tiempo hasta la finalización, y el símbolo |...| indica el valor absoluto. En modos de realización que incluyen una función de umbral, el sistema puede incluir además un dispositivo de notificación que indica cuándo se
alcanza o se prevé que se alcance la tasa de difusión umbral. Adicionalmente o de forma alternativa, el sistema puede incluir dispositivos automatizados para procesar adicionalmente la muestra de tejido, que se activan después de que se alcanza o se prevé que se alcance la tasa de difusión umbral. En un ejemplo específico que puede ser útil en un protocolo de fijación a dos temperaturas, el sistema se puede adaptar para cambiar la temperatura de la solución fijadora en la que se sumerge la muestra de tejido después de que se ha alcanzado el umbral de difusión, por ejemplo (pero no limitado a): activando un mecanismo robótico que transfiere físicamente la muestra de tejido de un volumen de fijador frío a un volumen de fijador caliente; activando un mecanismo de descarga para eliminar la solución fijadora fría del aparato y un mecanismo de llenado que inyecta solución fijadora caliente en el aparato para contener el volumen de solución fijadora; activando un mecanismo de calentamiento que incrementa la temperatura del fijador a una temperatura específica o dentro de un intervalo de temperatura específico y/o mantiene la temperatura del fijador a la temperatura específica o dentro del intervalo de temperatura específico; desactivando un mecanismo de refrigeración y permitiendo que la temperatura de la solución fijadora aumente pasivamente.
IF. Fijación a dos temperaturas
En un modo de realización, los sistemas y procedimientos de seguimiento de difusión anteriores se usan para ejecutar un procedimiento de fijación por inmersión a dos temperaturas en una muestra de tejido. Como se usa en el presente documento, un "procedimiento de fijación a dos temperaturas" es un procedimiento de fijación en el que el tejido se sumerge en primer lugar en una solución fijadora fría durante un primer periodo de tiempo, seguido de calentamiento del tejido durante el segundo periodo de tiempo. La etapa fría permite que la solución fijadora se difunda por todo el tejido sin provocar sustancialmente reticulación. A continuación, una vez que el tejido se ha difundido adecuadamente por todo el tejido, la etapa de calentamiento da lugar a la reticulación por el fijador. La combinación de una difusión en frío seguida de una etapa de calentamiento da lugar a una muestra de tejido que se fija más completamente que usando los procedimientos estándar. Por tanto, en un modo de realización, una muestra de tejido se fija: (1) sumergiendo una muestra de tejido no fijada en una solución fijadora fría y realizando seguimiento de la difusión del fijador en la muestra de tejido realizando seguimiento del TOF en la muestra de tejido usando los sistemas y procedimientos como se divulga en el presente documento (etapa de difusión); y (2) permitiendo que la temperatura de la muestra de tejido aumente después de que se ha medido un TOF umbral (etapa de fijación). En modos de realización ejemplares, la etapa de difusión se realiza en una solución fijadora que está por debajo de 20 °C, por debajo de 15 °C, por debajo de 12 °C, por debajo de 10 °C, en el intervalo de 0 °C a 10 °C, en el intervalo de 0 °C a 12 °C, en el intervalo de 0 °C a 15 °C, en el intervalo de 2 °C a 10 °C, en el intervalo de 2 °C a 12 °C, en el intervalo de 2 °C a 15 °C, en el intervalo de 5 °C a 10 °C, en el intervalo de 5 °C a 12 °C, en el intervalo de 5 °C a 15 °C. En modos de realización ejemplares, se permite que la temperatura de la solución fijadora que rodea la muestra de tejido aumente dentro del intervalo de 20 °C a 55 °C durante la etapa de fijación.
Los procedimientos de fijación a dos temperaturas son especialmente útiles para los procedimientos de detección de determinados biomarcadores lábiles en muestras de tejido, que incluyen, por ejemplo, proteínas fosforiladas, ADN y moléculas de ARN (tales como miARN y ARNm). Véase el documento PCT/EP2012/052800 (incorporado en el presente documento por referencia). Por tanto, en determinados modos de realización, las muestras de tejido fijadas obtenidas usando estos procedimientos se pueden analizar para detectar la presencia de dichos marcadores lábiles. Por tanto, en un modo de realización, se proporciona un procedimiento de detección de un marcador lábil es una muestra, comprendiendo dicho procedimiento fijar el tejido de acuerdo con una fijación a dos temperaturas como se divulga en el presente documento y poner en contacto la muestra de tejido fijada con una entidad de unión a analito que se puede unir específicamente al marcador lábil, en el que se realiza seguimiento de la difusión del fijador frío de acuerdo con un procedimiento como se divulga en el presente documento. Los ejemplos de entidades de unión a analito incluyen: anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo anticuerpos monocatenarios), que se unen a antígenos diana; receptores de linfocitos T (incluyendo receptores monocatenarios), que se unen a complejos MHC:antígeno; multímeros MHC:péptido (que se unen a receptores de linfocitos T específicos); aptámeros, que se unen a dianas de ácido nucleico o péptido específicas; dedos de cinc, que se unen a ácidos nucleicos, péptidos y otras moléculas específicas; complejos de receptores (que incluyen receptores monocatenarios y receptores quiméricos), que se unen a ligandos de receptor; ligandos de receptor, que se unen a complejos de receptor; y sondas de ácido nucleico, que hibridan con ácidos nucleicos específicos. Por ejemplo, se proporciona un procedimiento inmunohistoquímico de detección de una proteína fosforilada en una muestra de tejido, comprendiendo el procedimiento poner en contacto el tejido fijado obtenido de acuerdo con el procedimiento de fijación a dos temperaturas anterior con un anticuerpo específico para la proteína fosforilada y detectar la unión del anticuerpo a la proteína fosforilada. En otros modos de realización, se proporciona un procedimiento de hibridación in situ de detección de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto el tejido fijado obtenido de acuerdo con el procedimiento de fijación a dos temperaturas anterior con una sonda de ácido nucleico específica para el ácido nucleico de interés y detectar la unión de la sonda al ácido nucleico de interés.
II. Ejemplos
Se usaron procedimientos experimentales para determinar las métricas predictivas divulgadas en el presente documento. Estos procedimientos se realizaron usando tejido de amígdalas humano recién obtenido y sin fijar sobre hielo húmedo en bolsas de riesgo biológico. Se obtuvieron muestras de tejidos de amígdalas de tamaños precisos usando sacabocados de tejido de 4 o bien 6 mm de diámetro (tales como Miltex n.° 33-36). Para la fijación fría caliente, se colocaron cilindros de amígdalas de 6 mm en FTN al 10 % (formaldehído acuoso saturado de Fisher Scientific, Houston, TX, tamponado a
pH 6,8-7,2 con tampón fosfato 100 mM) previamente enfriado hasta 4 °C durante 3 o bien 5 horas. A continuación, se retiraron las muestras y se colocaron en formol tampón neutro (FTN) a 45 °C durante 1 hora adicional para iniciar la reticulación. Después de la fijación, las muestras se procesaron más a fondo en un procesador de tejidos comercial ajustado a un ciclo durante la noche y se incluyeron en parafina. Se seccionaron a lo largo 6 cilindros de amígdalas de cada serie y se incluyeron con el lado de corte hacia abajo en el molde. Esta disposición multibloque permite teñir cada uno de los 6 cilindros simultáneamente. Las muestras se tiñeron manualmente desparafinando en primer lugar las muestras con xileno y a continuación con etanoles de grado analítico y en agua desionizada. Se aplicó hematoxilina sumergiendo una rejilla de portaobjetos en hematoxilina Gill II (Leica Microsystems) durante 3 minutos, seguido de lavados exhaustivos en agua desionizada. A continuación, los portaobjetos se sumergieron en agua corriente original de Scott (Leica Microsystems) durante 1 minuto y se lavaron exhaustivamente en agua desionizada. Para hacer la transición a eosina, se sumergieron rejillas de portaobjetos en primer lugar en etanol al 70 % y a continuación en eosina Y (Leica Microsystems) durante 2 minutos. Los portaobjetos se lavaron exhaustivamente, al menos 4X en etanol al 100 %, se equilibraron en xileno y se cubrieron con cubreobjetos.
En la FIG. 1 se muestra un sistema de procesamiento de tejido 100 ejemplar para optimizar la fijación de tejido usando un seguimiento de difusión, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. El sistema 100 comprende un dispositivo de seguimiento acústico 102 acoplado de forma comunicativa a una memoria 110 para almacenar una pluralidad de módulos de procesamiento o instrucciones lógicas que se ejecutan por un procesador 105 acoplado a un ordenador 101. El dispositivo de seguimiento acústico 102 puede detectar ondas acústicas que han viajado a través de una muestra de tejido y puede incluir uno o más transmisores y uno o más receptores. La muestra de tejido se puede sumergir en un fijador líquido mientras los transmisores y receptores se comunican para detectar el tiempo de vuelo (ToF) de las ondas acústicas. Los módulos de procesamiento dentro de la memoria 110 pueden incluir instrucciones lógicas no transitorias legibles por ordenador para posibilitar que el procesador 105 realice operaciones, incluyendo un módulo de seguimiento de difusión 111 para realizar el seguimiento de la difusión de un fijador a través de una muestra de tejido y evaluar la velocidad de una onda acústica que viaja a través de la muestra de tejido en base al tiempo de vuelo, un módulo de fijación 112 para ejecutar protocolos de fijación en base a las mediciones, un módulo de correlación de calidad 113 para realizar la correlación de calidad para propósitos de formación, y una base de datos 114 para almacenar tiempos de difusión óptimos y otros resultados en una base de datos, junto con otras operaciones que potencialmente dan como resultado una salida de resultados cuantitativos o gráficos a un ordenador de operaciones de usuario 101. En consecuencia, aunque no se muestra en la FIG. 1, el ordenador 101 también puede incluir dispositivos de entrada y salida de usuario tales como un teclado, ratón, lápiz óptico y una pantalla/pantalla táctil.
Se desarrolló un sistema como se ilustra en la fig. 1 adaptando un dispositivo de seguimiento acústico 102 en un procesador de tejido de inmersión comercial tal como el Lynx II de Electron Microscopy Sciences (RTM). Se ajustó un cabezal mecánico diseñado con el programa informático Solidworks® alrededor y se selló con un recipiente de reactivo estándar. Se proporcionó un sistema de vacío externo para desgasificar el reactivo a granel, así como el contenido del casete, incluyendo el tejido. Se puede utilizar un portacasetes diseñado para su uso con un casete histológico de tamaño estándar tal como CellSafe 5 de CellPath (RTM) o bien una caja de biopsia tal como CellSafe Biopsy Capsules de CellPath (RTM) para muestras de tejido más pequeñas para contener de forma segura el tejido y evitar que la muestra se deslice durante el experimento. El portacasetes se sujetó a un brazo de traslación vertical que deslizaba el portacasetes en una dirección. El cabezal mecánico se diseñó con dos soportes de metal a cada lado del casete de tejido, alojando un soporte 5 transductores de transmisión y alojando el otro soporte 5 transductores de recepción que están alineados espacialmente con sus respectivos transductores de transmisión. El soporte de recepción también aloja un par de transductores orientados ortogonalmente al eje de propagación de los otros transductores. Después de cada adquisición, los sensores ortogonales calculan un valor de TOF de referencia para detectar variaciones espacio-temporales en el líquido que tienen un efecto profundo en la velocidad del sonido. Adicionalmente, al final de cada adquisición 2d , se puede levantar el casete y adquirir una segunda adquisición de referencia. Estos valores de TOF de referencia se pueden usar para compensar las fluctuaciones inducidas por el medio ambiente en el formol.
Los sensores acústicos en este dispositivo de seguimiento acústico ejemplar 102 incluyen pares de transductores enfocados de 4 MHz tales como el TA0040104-10 de CNIRHurricane Tech (Shenzhen) Co., Ltd. (RTM) que están alineados espacialmente, con una muestra de tejido que se coloca en sus focos comunes. Un transductor, denominado transmisor, puede enviar un impulso acústico que atraviesa el líquido de acoplamiento (es decir, formol) y el tejido y se detecta por el transductor de recepción. Inicialmente, el transductor de transmisión se puede programar con un generador de forma de onda tal como el AD5930 de Analog Devices (RTM) para transmitir una onda sinusoidal durante varios cientos de microsegundos. A continuación, esa cadena de impulsos se puede detectar por el transductor de recepción después de atravesar el líquido y el tejido. El módulo de seguimiento de difusión 111 se puede ejecutar para comparar la sinusoide de ultrasonido recibida y la sinusoide transmitida usando, por ejemplo, un comparador de fase digital tal como el AD8302 de Analog Devices. La salida del comparador de fase proporciona una lectura válida durante la región de superposición temporal entre los impulsos transmitidos y recibidos. Se permite que la salida del comparador de fase se estabilice antes de que se consulte la salida con un convertidor analógico a digital integrado en el microcontrolador, tal como el ATmega2560 de Atmel (RTM). A continuación, se puede repetir el procedimiento en múltiples frecuencias acústicas en el ancho de banda del transductor para desarrollar la relación de fase entre las sinusoides de entrada y salida en un intervalo de frecuencia. Este barrido acústico de frecuencia-fase se usa directamente para calcular el TOF usando un algoritmo de posprocesamiento análogo a la interferometría acústica y que puede detectar tiempos de tránsito con una exactitud de subnanosegundos.
La velocidad del sonido en un líquido depende en gran medida de la temperatura (por ejemplo, Atagua « 2,3 ns/°C*mm a 4 °C) que puede afectar en gran medida los tiempos de tránsito acústico, especialmente porque el TOF es una señal integrada a lo largo de la longitud de recorrido de los transductores. En el transcurso de un experimento, se observan típicamente variaciones relativamente grandes en el TOF total debido en gran parte a los efectos de las fluctuaciones térmicas por todo el líquido. Para compensar estas fluctuaciones ambientales, el TOF también se puede calcular solo a través de formol y esta adquisición, denominado canal de referencia, y usarse para compensar los gradientes térmicos espacio-temporales en el líquido. Sin embargo, el esquema de compensación de referencia funciona mejor con transitorios térmicos relativamente lentos y de baja amplitud en el líquido, por lo que la temperatura del reactivo se puede controlar con precisión usando un esquema desarrollado de modulación de ancho de impulso (PWM) en el equipo de refrigeración. El control de temperatura pW m usa un algoritmo basado en proporcional-integral-derivada (PID) que regula la temperatura del reactivo firmemente alrededor del punto establecido haciendo leves ajustes a la temperatura en incrementos de ~400 ps. Se encontró que el algoritmo PWM controlaba la temperatura del líquido con una desviación estándar de ~0,05 °C alrededor de la temperatura establecida. Este control de temperatura preciso usado junto con la compensación de referencia prácticamente elimina todos los artefactos ambientales de la señal calculada. Los trazados de TOF sin filtrar tienen un valor de ruido típico de menos de 1,0 nanosegundo.
Por lo tanto, el seguimiento de difusión incluye el rastreo y la cuantificación dinámicos de la difusión de formol hasta que el tejido está en un equilibrio osmótico completo y no tiene lugar más difusión. Como se describe en el presente documento, la tasa de difusión varía con el tipo de órgano, las constantes tisulares, la heterogeneidad espacial, la temperatura, la ubicación en el casete, etc. Estos factores en general se controlan en base a la descripción del sistema de seguimiento de difusión descrito en la publicación de patente de EE. UU. 2013/0224791. En general, la difusión de formol está altamente correlacionada con una tendencia exponencial simple, donde el transitorio temporal de la tendencia se puede caracterizar completamente por una constante de disminución como se describe además en el presente documento. Una vez que se alcanza la constante de disminución, hay suficiente formaldehído en el interior del tejido para garantizar una tinción de calidad. Usando las mediciones para cada muestra de tejido, la difusión se rastrea en cada posición, y la región con la constante de disminución más larga se correlaciona con un resultado óptimo o un resultado de tinción existente. Para propósitos de formación o para comparar con los resultados de tinción existentes o conocidos, se puede invocar el módulo de correlación de calidad 113. En base a los resultados, un módulo de fijación 112 puede ejecutar un protocolo de fijación como se describe en el presente documento, o cualquier protocolo en base a un conjunto de reglas que garantice una fijación óptima de la muestra de tejido.
Las FIGS. 2A y 2B muestran respectivamente representaciones de patrones de exploración por ultrasonido de una caja de biopsia y de un casete de tamaño estándar, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. Como se describe en el presente documento, las mediciones de los sensores acústicos en un dispositivo de seguimiento acústico se pueden usar para rastrear el cambio y la tasa de cambio de un ToF de las señales acústicas a través de la muestra de tejido. Esto incluye realizar el seguimiento de la muestra de tejido en diferentes posiciones a lo largo del tiempo para determinar la difusión a lo largo del tiempo o una tasa de difusión. Para la formación de imágenes de todo el tejido en el casete, el portacasetes se puede elevar secuencialmente “ 1 mm verticalmente y adquirir los valores de TOF en cada nueva posición, como se representa en las FIGS. 2A y 2B. El procedimiento se puede repetir para cubrir la totalidad de la abertura abierta del casete. En referencia a la FIG. 2A, cuando se forman imágenes de tejido en la caja de biopsia 220, las señales se calculan a partir de los 5 pares de transductores, lo que da como resultado el patrón de exploración representado en la FIG. 2A. De forma alternativa, cuando se forman imágenes de tejido en el casete de tamaño estándar 221 representado en la FIG. 2B, el 2.° y 4.° pares de transductores se pueden apagar y se pueden adquirir los valores de TOF entre el 1.°, 3.° y 5.° pares de transductores localizados en los centros respectivos de las tres subdivisiones intermedias del casete de tamaño estándar 221. A continuación, se pueden colocar dos cilindros de tejido en cada columna, uno en la parte superior y otro en la parte inferior, como se muestra en la FIG. 3A. Esta configuración posibilita obtener trazos de TOF de 6 muestras (2 filas X 3 columnas) simultáneamente y reducir significativamente la variación de serie en serie e incrementar el rendimiento. En este modo de realización ejemplar, el ancho a media altura del haz de ultrasonidos es de 2,2 mm.
Como se indica previamente, el TOF en el líquido es altamente dependiente de las fluctuaciones térmicas dentro de los medios a granel. Para compensar estas desviaciones, el valor de TOF de referencia se puede restar del valor de TOF obtenido a través del tejido y formol para aislar el retardo de fase del tejido. Cuando se usan los sensores de referencia ortogonales, se puede usar un factor de ajuste a escala para ajustar la leve diferencia geométrica de separación entre estos dos sensores y los pares de sensores de exploración. Los trazados de TOF compensados por referencia resultantes de la difusión activa en el tejido, de ahora en adelante simplemente denominados TOF, se determinan empíricamente para que estén altamente correlacionados con una curva exponencial simple de la forma:
TOF(t,r) = C(r) + Ae !/T(r) (I)
C es un desplazamiento constante en nanosegundos, A es la amplitud de la disminución en nanosegundos (es decir, la diferencia del valor de TOF entre la muestra de tejido no difundida y completamente difundida), t es la constante de disminución en horas y la dependencia espacial (r) se indica explícitamente. La amplitud de señal indica la magnitud de la difusión y, por tanto, es directamente proporcional a la cantidad acumulada de intercambio de líquidos. La constante de
disminución representa el tiempo para que la amplitud disminuya en un 63 % y es inversamente proporcional a la tasa de difusión de formol en el tejido (es decir, constante de disminución grande = difusión lenta). Debido a la capacidad de exploración del sistema, se pueden adquirir múltiples señales de TOF independientes de cada muestra de tejido.
Las FIGS. 3A-C muestran trazados de tiempo de vuelo (ToF) y una curva de difusión promedio generada a partir de una muestra de tejido en un casete de tamaño estándar, de acuerdo con modos de realización ejemplares de la divulgación objeto. Como se describe en el presente documento, para cada muestra de tejido, la difusión se rastrea en cada posición. La FIG. 3A muestra un casete de tamaño estándar con 6 muestras de tejido colocadas en su interior. Las muestras se pueden remojar en frío en FTN al 10 %. La FIG. 3B representa las señales adquiridas durante la formación de imágenes del tejido de amígdalas humanas de 6 mm representado en el recuadro verde en la FIG. 3 A. Cada señal proviene de una localización espacial diferente dentro del tejido (Ay=1 mm) correspondiente a las líneas de color en el recuadro verde. Cada tendencia se puede ajustar a la ec. 1 usando regresión no lineal para estudiar la variación espacial de la muestra. Los valores de la constante de amplitud y disminución se pueden analizar espacialmente para determinar tendencias y análisis adicionales. Por ejemplo, en la FIG. 3B se puede ver una gran variabilidad tanto en la tasa de disminución como en la amplitud de las señales de TOF que varían espacialmente. Sin embargo, para el estudio representado en este modo de realización ejemplar, cada señal de TOF independiente se promedió espacialmente para calcular la señal de TOF bruta de la totalidad del tejido de acuerdo con la siguiente ecuación:
N TOF
pro
(
mv
t )
y
=
YTOF
(t,
1
r)
y
=
C
prom
+ A
prom
e~,hr™
V
(II)
/
r= l
TOFprom es la diferencia de la señal de TOF promediada espacialmente entre la muestra de tejido no difundida y la muestra de tejido completamente difundida, N es el número de localizaciones espaciales en las que se adquirió una señal de TOF, Cprom es el desplazamiento constante promedio (promediado espacialmente) en nanosegundos, Aprom es la amplitud promedio de la disminución en nanosegundos (es decir, el TOF promediado espacialmente obtenido en el tiempo t=0, es decir, antes de que comenzara la difusión del reactivo en la muestra), y Tprom es la constante de disminución promedio en horas. Para los parámetros promediados, la señal se promedia espacialmente y a continuación se ajusta a la ec. 1 usando regresión no lineal para determinar estas variables.
La FIG. 3C representa nueve trazados de TOF promediados en conjunto para calcular el TOF promedio para la totalidad de la muestra. Esta señal se puede usar para calcular la constante de disminución promedio (Tprom) y la amplitud (Aprom) que están marcadas en la figura. Espacialmente, promediar las señales de TOF fue importante para caracterizar las propiedades globales del tejido y también mejoró significativamente la proporción señal/ruido del sistema. Para mitigar el ruido blanco falso en los datos de TOF compensado por referencia, se puede utilizar un filtro de Butterworth de 3.er orden. Este filtro conserva los componentes de baja frecuencia de la disminución de difusión exponencial mientras elimina el ruido de alta frecuencia. Con referencia a una disminución exponencial simple, los datos de TOF sin filtrar tienen una raíz cuadrada del error medio (RMSE) atípica de aproximadamente 1 nanosegundo, que se redujo a 200-300 picosegundos después del filtrado. Para todos los análisis estadísticos en este modo de realización, se puede usar una prueba bilateral de la t de Student para someter a prueba la significación estadística entre las distribuciones de interés y los valores de p menores de 0,1 (p<0,1) se consideraron significativos.
En general, la difusión de FTN en los cortes histológicos se controla principalmente por la concentración de formaldehído y el tiempo. Puesto que el FTN es una concentración fija de formaldehído (3,7 % p/v), se puede suponer que un tiempo de exposición mínimo al FTN frío produce una histomorfología excelente. Un experimento de evolución temporal se representa en la FIG. 4A usando cilindros de 6 mm de tejidos de amígdalas humanas sumergidos en FTN a 4 °C seguido de 1 hora en FTN a 45 °C. Después de múltiples experimentos, se determinó que un mínimo de 3 horas de FTN frío (3 horas frío 1 hora caliente) puede producir una buena histomorfología. La morfología del tejido fue levemente mejor después de 5 horas (5+1). A continuación, se examinaron múltiples cilindros usando protocolos tanto 3+1 como 5+1 como verificación.
La FIG.4 muestra una calidad de la morfología del tejido para muestras de tejido fijadas en diferentes intervalos de tiempo, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. En el lado izquierdo se representan cilindros de amígdalas humanas 425 fijados con un protocolo frío+caliente, con tiempos de remojo en frío como se indica. En el lado derecho, un resumen de múltiples experimentos de evolución temporal 427 está codificado por colores para indicar la calidad de la morfología del tejido, indicando la flecha 426 la calidad de la morfología del tejido usando rojo (tercio superior de la flecha) para indicar una mala calidad, amarillo (tercio medio de la flecha) para indicar una calidad adecuada y verde (tercio inferior de la flecha) para indicar una buena calidad.
Por lo tanto, se ha demostrado que los tiempos de difusión necesarios se determinan empíricamente a partir de los resultados de ensayos posteriores. Las propiedades de difusividad de los tejidos de amígdalas humanas además se pueden caracterizar y validar cuantitativamente. Como se describe en el presente documento, cada muestra se puede cortar en cilindros de aproximadamente 6 mm de diámetro. Los resultados de difusividad se pueden correlacionar con la cantidad requerida de agente de reticulación por toda la muestra como se detecta con el sistema de seguimiento de difusión basado en TOF descrito en el presente documento. Por ejemplo, en un experimento, se obtuvieron imágenes de un total de 38 muestras de amígdalas humanas de seis mm usando TOF en FTN al 10 % frío (7+0,5 °C). De las 38
muestras, se realizó el seguimiento de 14 durante 3 horas y las 24 muestras restantes se exploraron durante 5 horas. Para cada muestra, se midió la difusión por toda la muestra en intervalos de 1 mm. Las curvas de TOF de esas exploraciones se promediaron espacialmente, de acuerdo con la ec. 2, para producir la curva de difusión promedio de cada muestra respectiva. De acuerdo con modos de realización, la constante de difusividad de la muestra se puede determinar por medio de uno de los enfoques divulgados en la solicitud de patente internacional titulada OBTAINING TRUE DIFFUSIVITY CONSTANT [OBTENCIÓN DE UNA CONSTANTE DE DIFUSIVIDAD VERDADERA], presentada el 17 de diciembre de 2015.
La FIG. 5 muestra un gráfico de las constantes de disminución para muestras de tejido remojadas durante 3 y 5 horas, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. Las muestras exploradas durante 3 horas y 5 horas tenían constantes de disminución de difusión promedio de 2 horas y 20 minutos y 2 horas y 43 minutos, respectivamente. La diferencia de las constantes de disminución promedio de 23 minutos es relativamente pequeña (<15 %) y se encontró que era estadísticamente no significativa (p = 0,15), lo que indica que los dos conjuntos de datos provienen de la misma distribución y, por lo tanto, miden los mismos fenómenos físicos. Esto establece que el mecanismo de detección, cuando se realiza el seguimiento del tejido durante al menos tres horas, produce resultados exactos y reproducibles. En promedio para el conjunto de datos acumulados, el tiempo de disminución promedio de las 38 muestras de amígdalas fue de 2 horas y 34 minutos (2,57 horas).
Habiendo validado el sistema de seguimiento de difusión, se analizó el conjunto de datos de 38 muestras de amígdalas de seis mm para encontrar una correlación entre las propiedades de difusión de cada muestra y los tiempos de difusión en frío conocidos requeridos para producir resultados de tinción posteriores ideales determinados empíricamente en cortes anteriores. Se pueden emplear numerosas técnicas analíticas, incluyendo el análisis multivariante, algoritmos basados en agrupaciones, que caracteriza la derivada de la señal, y el análisis de componentes principales. Un análisis de base de pendiente proporciona una discriminación válida de las muestras en formol frío durante 3 horas frente a 5 horas, es decir, muestras que se tiñen adecuadamente frente a aquellas que teñirían idealmente toda la muestra. Sin embargo, la derivada de la señal de TOF calculada a partir de una regresión lineal en base a una serie de puntos de TOF puede ser ruidosa y, para mitigar significativamente el ruido y representar con mayor exactitud la tasa de difusión activa, se puede calcular la derivada de la señal de TOF en base a un ajuste a una función exponencial simple.
Formalmente, la derivada de la curva de TOF exponencial simple de cada muestra tiene la forma
TOF(t) es la señal de TOF dependiente del tiempo, to es el tiempo en el que se toma la derivada (es decir, la cantidad de tiempo en formol frío), Aprom es la amplitud de la señal de disminución de difusión promedio (es decir, la diferencia del valor de TOF promedio entre la muestra de tejido no difundida y completamente difundida), Tprom es la constante de disminución promedio, d/dt es la derivada con respecto al tiempo y los corchetes indican las unidades de la pendiente de TOF que son nanosegundos de TOF por hora de difusión. La ec. 3 se puede usar para calcular la derivada de cada muestra, con los resultados representados en las FIGS. 6A y 6B.
Las FIGS.6A y 6B muestran curvas de difusión y curvas características de funcionamiento del receptor para una pluralidad de muestras, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. La FIG. 6A muestra una pendiente de la curva de difusión de cada muestra tomada después de 3 horas (izquierda) o bien 5 horas (derecha) de difusión fría. La tasa de difusión promedio a las 3 horas y 5 horas fue de -2,96 ns/h y -1,26 ns/h, respectivamente, lo que significa que la tasa de difusión se había reducido ~135 % durante este periodo de dos horas. Esto representa una gran diferencia en las tasas de difusión promedio que se encontró que era estadísticamente significativa (p < 2e-6). La FIG. 6B muestra la curva de eficacia diagnóstica (ROC) de la tasa de difusión de muestra con un área bajo la curva (AUC) de 0,98, lo que indica una diferenciación muy alta, pero no perfecta, de los dos conjuntos de datos en base a la derivada de sus curvas de TOF. En la Fig. 6B, TPF representa una fracción positiva verdadera y FPF representa una fracción positiva falsa.
Para proporcionar evidencia más concluyente, los efectos de las señales de TOF de diferentes amplitudes se mitigaron normalizando cada señal por su amplitud. Se encontró que la discriminación óptima se logró por medio de las señales de TOF dependientes del tiempo normalizadas por su amplitud promedio de acuerdo con la ecuación:
m(t = t 0) = 100
En esta ecuación, a continuación en el presente documento denominada ec. 4, m (t = to) es la derivada de la señal de TOF en to dividida por la amplitud promedio de la muestra y los corchetes indican las unidades de la pendiente de TOF
normalizada en amplitud, que son el porcentaje de cambio de TOF por hora de difusión. Las FIGS. 7A y 7B muestran la pendiente normalizada en amplitud de las curvas de difusión y las curvas de eficacias diagnósticas para una pluralidad de muestras, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. La FIG. 7A representa la pendiente normalizada, a las 3 y 5 horas respectivamente, de cada muestra de ambos conjuntos de datos. La pendiente de la curva de difusión representa la tasa de difusión activa de formol en el tejido. Como se esperaba, las muestras que estuvieron en formol durante solo 3 horas experimentan una tasa de difusión activa mucho mayor de -11,3 %/h, mientras que después de 5 horas la tasa de difusión se ha reducido significativamente a una tasa promedio de -5,3 %/h, acercándose varias muestras al equilibrio osmótico completo como se indica por una tasa de difusión cercana a cero. Las diferentes distribuciones de las tasas de difusión normalizadas a las 3 y 5 horas fueron altamente estadísticamente significativas (p<2e-15), lo que indica una diferencia drástica y físicamente real en la tasa de difusión a las 3 frente a las 5 horas.
Para evaluar qué tan fiablemente se pueden separar los grupos, se completó un análisis ROC con los resultados representados en la FIG. 7B. En esta figura se puede ver que la tasa de difusión normalizada distingue bien los dos conjuntos de datos. Se calculó que el AUC era exactamente 1,0, lo que indica una discriminación perfecta de las muestras que se teñirán de forma satisfactoria y las muestras que se teñirán de forma impecable en base a su tasa normalizada de difusión de formol. Este resultado parece apropiado porque a medida que las muestras alcanzan el equilibrio osmótico con el formol externo, su concentración interna de formaldehído será alta, lo que dará como resultado una tasa de difusión detenida. En otras palabras, los dos grupos de muestras se pueden distinguir perfectamente en base a la pendiente de sus curvas de difusión de TOF. Por lo tanto, es lógico que la tasa de difusión de formol y la calidad de tinción estén altamente correlacionadas.
A partir de estos resultados, es evidente que la tasa de difusión de formol y la calidad de tinción están altamente correlacionadas con claras diferencias de ambas métricas entre las muestras analizadas a las 3 y 5 horas. Dada la naturaleza correlativa de estas variables, la ec. IVb se puede resolver para el tiempo requerido para alcanzar una pendiente normalizada dada, lo que da como resultado la siguiente ecuación:
tterminado es el tiempo requerido para que la derivada de la señal alcance la pendiente umbral y el símbolo |...| indica el valor absoluto. Para una constante de disminución promedio dada, que puede ser específica de la muestra, y un valor de pendiente normalizada, esta ecuación se puede usar para calcular cuánto tiempo es necesario que esté una muestra en formol frío antes de que alcance un valor de pendiente umbral dado. Para evaluar la tasa de difusión como un predictor de la calidad de tinción, se eligieron tres valores de pendiente umbral (mumbral = -7,4, -8,0, -10,4 %/h) para la evaluación, con valores de pendiente absolutos grandes que representan más intercambio de líquido por hora. Por tanto, a medida que la difusión activa de una muestra se ralentiza, la velocidad de difusión se acercará al equilibrio osmótico o a 0 %/h. Por lo tanto, es lógico que un criterio de pendiente umbral más grande predecirá que las muestras tendrán una difusión adecuada después de menos tiempo.
Esto se ilustra gráficamente en las FIGS. 8A-E en un trozo de amígdala humana de 6 mm representativa. Las FIGS. 8A-E muestran curvas de difusión y tiempos de finalización previstos en base a diferentes valores de pendiente umbral, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. La FIG. 8A muestra la pendiente normalizada de la curva de difusión de cada muestra tomada después de 3 horas (izquierda) o bien 5 horas (derecha) de difusión en frío con diferentes valores de pendiente umbral de -7,4, -8,0, -10,4 %/h indicados con líneas verdes marcadas como 3, 2 y 1 respectivamente. La FIG. 8B muestra la señal de TOF promedio de un trozo de amígdala de 6 mm con las localizaciones aproximadas de los valores de pendiente umbral indicados en el gráfico. Las FIGS. 8C, D y E muestran gráficos de los tiempos de finalización previstos para cada uno de los tres valores de pendiente evaluados marcados en cada gráfico.
Los datos resumidos de los tres valores de pendiente umbral evaluados se muestran en la tabla 2 como sigue:
TABLA 2
En base a estos resultados, es posible que todas las muestras no tengan suficiente formol para teñir de forma aceptable cuando su tasa de difusión es de -10,4 %/h. El valor de pendiente umbral intermedio de -8,0 %/h (representado en la FIG.
8D) produce una discriminación ideal entre los dos conjuntos de datos y tiempos de finalización razonables entre 3 y 5 horas. Sin embargo, para ser lo más conservador posible, se puede seleccionar el valor de pendiente umbral más bajo
de -7,4 %/h (representado en la FIG. 8E) como criterio para determinar cuándo se teñirán las muestras idealmente por todas partes. Con esta métrica conservadora de tasa de difusión, se prevé que los cilindros de amígdalas de 6 mm tarden entre 3,21 y 4,96 horas, lo que, en comparación con la tinción histológica posterior, resulta razonable y verdadero. En base a estos experimentos y análisis, una vez que la tasa de difusión normalizada en tiempo real de una muestra se ralentiza al menos a: n i umbra¡ (f) < .7,4 %/ñ (ecuación 6), la muestra debe tener suficiente formol por todas partes para garantizar una tinción histológica ideal y uniforme.
Las tinciones histológicas modernas tienen lugar en una plétora de diferentes tipos de tejidos. Por lo tanto, es útil caracterizar las propiedades de difusión de una serie de tipos de tejidos diferentes. Por lo tanto, se registraron las propiedades de varios cientos de muestras (n=241) de 34 tipos de tejidos diferentes con el sistema de seguimiento de difusión divulgado. Se registraron tendencias fiables de todos los tipos de tejidos muestreados, lo que indica que el sistema de seguimiento de difusión divulgado es compatible con una variedad de diferentes tipos de tejidos. Además, cuando se realizó el seguimiento de todas las muestras en formol al 10 % frío, tenían curvas de difusión de TOF que estaban altamente correlacionadas con una función exponencial simple divulgada en el presente documento. Por ejemplo, típicamente R2ajus era típicamente mayor que 0,99 y el RMSE promedio para todas las muestras, en referencia al ajuste, fue de sólo 0,535 ns, lo que representa una desviación promedio del ajuste de aproximadamente un 1 %.
La FIG. 9 muestra las constantes de disminución promedio para una pluralidad de muestras de tejido cortadas con un espesor de 5-7 mm y representadas en orden alfabético, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. Existe una enorme cantidad de variabilidad en la tasa de difusión de formol, incluso dentro de tipos de tejido individuales, con varios tejidos que demuestran diferencias de mínimas a máximas de múltiples horas (por ejemplo, mama, grasa, hígado, piel). Por tanto, los modos de realización de la invención aprovechan la observación de que el tejido es altamente heterogéneo. Adicionalmente, la constante de disminución promedio de cada grupo respectivo varía significativamente, lo que indica tasas de difusión radicalmente diferentes en diferentes órganos y tipos de tejidos. En consecuencia, la FIG. 10 muestra las constantes de disminución promedio de cada muestra de tejido promediadas sobre el tipo de órgano y clasificadas de la constante de disminución más baja a la más alta, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. Representados de esta manera, los tejidos que se difunden más rápidamente se presentan a la izquierda (es decir, constantes de disminución más pequeñas) y los tejidos que se difunden lentamente se presentan a la derecha (es decir, constantes de disminución más grandes). Es importante destacar que, varios de los tipos de tejido que la American Society of Clinical Oncology y el College of American Pathologists (ASCO/CAP) han reconocido como que necesitan más tiempo en formol (por ejemplo, mama, cerebro, grasa) se localizan en el extremo derecho del gráfico entre el cuarto más lento de los tejidos. Claramente, el sistema de seguimiento de difusión de TOF divulgado ha confirmado las pautas de ASCO/CAP de los tejidos de difusión lenta. Estos resultados proporcionan una caracterización exhaustiva de las diferencias clave entre las propiedades de difusividad de diferentes tipos. Clasificados de esta manera, está claro que aproximadamente un 75 % de los órganos tienen constantes de disminución promedio de menos de ~2 horas. Los tejidos con constantes de disminución más largas tienden a tener más variación en la propagación de sus tasas de disminución.
En base a la métrica de tasa de difusión normalizada en amplitud desarrollada, la ec. 5 se puede usar para calcular los tiempos de finalización previstos para todas las muestras en el estudio general de recogida de tejidos. La FIG. 11 muestra los tiempos de finalización previstos para diferentes tipos de tejido usando una pendiente umbral de -7,4 %/h, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. Los resultados se clasifican del menor al mayor tiempo de finalización calculado, en base al valor de pendiente umbral conservador de -7,4 %/h. Los puntos rojos indican el valor máximo y los bigotes verdes indican ± la desviación estándar del grupo.
Las FIGS. 12A y 12B muestran respectivamente las funciones de densidad de probabilidad para los tiempos de finalización previstos para una pluralidad de tipos de tejido y una función de distribución acumulada para todos los tiempos de finalización, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. En referencia a la FIG. 12A, el tiempo de finalización promedio fue de 3 horas y 23 minutos. La función de densidad acumulada (CDF) representada en la FIG. 12B representa la integral de la FIG. 12A. Un 36,1 % de las muestras tendrán suficiente agente reticulante después de 3 horas y un 74,7 % de las muestras tendrán tiempos de finalización de menos de 4 horas. Es importante destacar que, un 100 % de las muestras se difundirá suficientemente después de 5 horas. Por lo tanto, la FIG. 12B predice que todas las muestras remojadas en frío en formol al 10 % durante 5 horas se teñirán de forma impecable con los ensayos posteriores.
Por lo tanto, se puede afirmar que para todos los tipos de tejidos, tterminado < 5 horas para muestras de hasta 7 mm de espesor remojadas en frío en formol al 10 %. Es importante señalar que este tterminado se calcula exclusivamente a partir de muestras de 5-7 mm de espesor. Sin embargo, debido a que el tiempo de difusión aumenta con el cuadrado del espesor del tejido, las muestras más pequeñas de 5 mm se difundirán significativamente más rápido que los tejidos más grandes. Debido a que el tiempo adicional en formol frío no tiene efectos perjudiciales sobre los biomarcadores del cáncer o la morfología del tejido, el tiempo de finalización máximo presentado conservará los biomarcadores del cáncer y la morfología en todas las muestras de hasta 7 mm de espesor. Muchos factores afectarán la tasa a la que el agente de reticulación formol perfundirá el tejido, incluyendo la composición de la muestra, el espesor, la temperatura, la orientación en el casete y la manipulación preanalítica del tejido, por nombrar unos pocos. El tiempo presentado necesario en formol frío es especialmente poderoso porque se tienen en cuenta todos estos factores. Adicionalmente, el seguimiento de la
gran cantidad de muestras en el estudio y la capacidad de exploración del sistema garantizan que 5 horas en formol frío idealmente conservarán el tejido a pesar de la variabilidad de diferentes tipos de tejido (variación entre muestras), así como las contribuciones de la heterogeneidad del tejido (variación intramuestra). Además, debido a que los tejidos con la difusión más lenta (grasa, cerebro, etc.) se incluyeron en este estudio, se puede afirmar que otros tipos de tejidos a los que no se les realizó el seguimiento exclusivamente no serán el factor limitante de un protocolo de fijación potencial. Por tanto, todas las muestras de hasta 7 mm de espesor se pueden teñir apropiadamente después de 5 horas en formol frío.
Además, los sistemas de seguimiento dinámico divulgados en el presente documento se pueden incluir como un protocolo que ajusta terminado en base al tipo de tejido y el seguimiento de difusión en tiempo real. La FIG. 13 muestra un procedimiento para optimizar la fijación de tejido, de acuerdo con un modo de realización ejemplar de la divulgación objeto. El procedimiento comienza con la difusión de formol S1301 de muestras de tejido como se describe en el presente documento. Tras el remojo, se pone en marcha un temporizador (S1302) y se realiza el seguimiento de la difusión de la muestra de tejido (S1303). Se puede realizar el seguimiento de la difusión usando los procedimientos descritos en el presente documento, incluyendo la determinación de TOF ajustado para factores ambientales. Se realiza una determinación de si el tejido está suficientemente difundido o no (S1303). Esto se puede basar en una o más constantes de difusión umbral que se pueden seleccionar en base al tipo de tejido, la edad, etc. Por ejemplo, se puede usar el umbral de -7,4 %/h. En cualquier caso, si no se alcanza el umbral, el procedimiento simplemente espera mientras continúa la medición (S1304). Una vez que se alcanza el umbral, hay suficiente formaldehído en el interior del tejido para garantizar una tinción de calidad, y el temporizador se puede parar (S1305) y el tejido se procesa, cambiando a formol frío durante un periodo de tiempo especificado, por ejemplo, 1 hora, o bien por cualquier otro procedimiento.
Por lo tanto, la divulgación anterior desarrolla un algoritmo predictivo que puede determinar cuándo se ha difundido una muestra de tejido en concentraciones adecuadas de formol para garantizar una tinción histopatológica uniforme e ideal. Los sistemas y procedimientos divulgados proporcionan medios para predecir con exactitud cuándo una muestra de tejido tiene suficiente formol para teñir idealmente toda la muestra. Esto proporciona una garantía de que las muestras se fijan adecuadamente al alargar automáticamente la cantidad de tiempo que los tejidos lentos necesitan estar expuestos a formol, mientras se proporcionan mejoras en el flujo de trabajo para acortar la cantidad de tiempo de procesamiento de tejidos requerido para las muestras de tejido y se añade garantía de la calidad y generación de informes para los laboratorios de procesamiento de tejidos. Los procedimientos descritos en el presente documento se han validado a través del seguimiento de varios cientos de trozos de tejido como parte de un gran estudio de recogida de tejidos. Los resultados sugieren que todas las muestras producirán tinciones de alta calidad después de 5 horas de difusión pasiva en formol frío. En general, esta tecnología tiene el potencial de revolucionar los procedimientos de procesamiento de tejidos preanalítico, lo que garantiza una manipulación específica de la muestra para conservar bien los biomarcadores del cáncer y la morfología. Este método se puede volver esencial para un flujo de trabajo de medicina personalizado al eliminar la necesidad de un costoso reproceso de muestras al garantizar que cada muestra se procesa perfectamente con un protocolo de fijación rápida al que se realiza un seguimiento completo para garantizar una garantía de la calidad incomparable.
La divulgación anterior de los modos de realización ejemplares de la presente divulgación objeto se ha presentado para propósitos ilustrativos y descriptivos. No pretende ser exhaustivo ni limitar la divulgación objeto a las formas precisas divulgadas. Muchas variaciones y modificaciones de los modos de realización descritos en el presente documento serán evidentes para un experto en la técnica a la luz de la divulgación anterior. El alcance de la divulgación objeto se ha de definir solo por las reivindicaciones adjuntas a la misma y por sus equivalentes.
Además, al describir modos de realización representativos de la presente divulgación objeto, la memoria descriptiva puede haber presentado el procedimiento y/o proceso de la presente divulgación objeto como una secuencia de etapas particular. Sin embargo, en la medida en que el procedimiento o proceso no se basa en el orden de etapas particular expuesto en el presente documento, el procedimiento o proceso no se debe limitar a la secuencia de etapas particular descrita. Como apreciaría un experto en la técnica, pueden ser posibles otras secuencias de etapas. Por lo tanto, el orden particular de las etapas expuestas en la memoria descriptiva no se debe interpretar como limitaciones de las reivindicaciones.
Claims (15)
1. Un procedimiento de fijación de muestra de tejido, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) sumergir una muestra de tejido no fijado en un volumen de una solución fijadora a una temperatura de 0 a 10 °C; (b) realizar el seguimiento de una tasa de difusión de la solución fijadora en la muestra de tejido:
b(1) transmitiendo una señal acústica ultrasónica a través de la muestra de tejido y detectando la señal acústica ultrasónica después de que la señal ultrasónica ha pasado a través de la muestra de tejido;
b(2) calculando el tiempo de vuelo (TOF) de la señal acústica ultrasónica;
b(3) repitiendo (b1) y (b2) en una pluralidad de puntos de tiempo posteriores;
b(4) calculando una tasa de difusión al menos en cada uno de los puntos de tiempo posteriores analizando una pendiente de una curva de los TOF calculados a partir de las señales acústicas ultrasónicas medidas en cada uno de los puntos de tiempo;
b(5) determinando cuándo la tasa de difusión desciende por debajo de un umbral predeterminado, comprendiendo la determinación:
repetir (b1)-(b4) y ajustar los TOF de dos o más de los puntos de tiempo a una curva exponencial simple hasta que el ajuste supere un límite de confianza predeterminado; y
después de que el ajuste supera el nivel de confianza predeterminado, calcular una cantidad de tiempo necesario para alcanzar la tasa de difusión umbral predeterminada, en la que la tasa de difusión umbral predeterminada se ha cumplido cuando la cantidad de tiempo necesaria para alcanzar la tasa de difusión umbral predeterminada ha expirado; y
(c) después de que la tasa de difusión desciende por debajo del umbral predeterminado, permitir que la muestra de tejido se caliente hasta una temperatura en el intervalo de 20 °C a 55 °C durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la fijación de la muestra de tejido.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que (b4) comprende
(a) ajustar un trazado de TOF que conecte dos o más de los TOF determinados de (b1)-(b3) para puntos de tiempo respectivos a una curva exponencial simple, y
(b) calcular la tasa de difusión en cada punto de tiempo:
• calculando una derivada de la curva exponencial simple; y
• opcionalmente, normalizando la derivada dividiendo la derivada por una amplitud de la señal de TOF en el punto de tiempo.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el trazado de TOF se captura en una única localización dentro de la muestra de tejido.
4. El procedimiento de la reivindicación 2 o 3, en el que la curva exponencial simple es una curva de acuerdo con la ecuación I:
TOF(t , r) = C(r) Ae'l/T(r) (1), y
en el que la tasa de difusión se calcula de acuerdo con la ecuación IIIa:
en la que C es un desplazamiento constante, A es la amplitud de disminución, t es una constante de disminución, t es el tiempo de difusión y r es la dependencia espacial, y to es el tiempo de difusión en el punto de tiempo en el que se calcula la tasa de difusión.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas 2-4, en el que la curva exponencial simple es una curva de acuerdo con la ecuación I:
T O F ( t , r ) = C ( r ) + A ¿ 't/í(r) (1), y
en el que la tasa de difusión es una tasa de difusión normalizada en amplitud se calcula de acuerdo con la ecuación IVa:
en la que C es un desplazamiento constante, A es la amplitud de disminución, t es una constante de disminución, t es el tiempo de difusión, r es la dependencia espacial, m es la tasa de difusión normalizada en amplitud, to es el tiempo de difusión en el punto de tiempo en el que se calcula la tasa de difusión, y los corchetes indican las unidades para la tasa de difusión, en las que tiempo son las unidades de tiempo de acuerdo con t.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, 2-5, en el que el trazado de TOF es un trazado de TOF promediado espacialmente obtenido capturando las mediciones de TOF en una pluralidad de localizaciones espaciales dentro de la muestra de tejido y promediando espacialmente las mediciones de TOF.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la curva exponencial simple es una curva de acuerdo con la ecuación II:
en el que la tasa de difusión se calcula de acuerdo con la ecuación IIIb:
en la que TOFprom es el trazado de TOF promediado espacialmente, N es el número de localizaciones espaciales en las que se adquirió una señal de TOF medida, Cprom es el desplazamiento constante promedio, Aprom es la amplitud promedio de la disminución, Tprom es la constante de disminución promedio, y to es el tiempo de difusión en el punto de tiempo en el que se calcula la tasa de difusión.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la curva exponencial simple es una curva de acuerdo con la ecuación II:
en el que la tasa de difusión es una tasa de difusión normalizada en amplitud calculada para un trazado de TOF promediado espacialmente de acuerdo con la ecuación IVb:
en la que TOFprom es el trazado de TOF promediado espacialmente, N es el número de localizaciones espaciales en las que se adquirió una señal de TOF medida, Cprom es un desplazamiento constante promedio, Aprom es una amplitud de disminución promedio, Tprom es la constante de disminución promedio, es la tasa de difusión normalizada en amplitud, to es el tiempo de difusión en el punto de tiempo en el que se calcula la tasa de difusión, y los corchetes indican las unidades para la tasa de difusión, en la que tiempo son las unidades de tiempo de acuerdo con Tprom.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la tasa de difusión es una tasa de difusión normalizada en amplitud calculada de acuerdo con la ecuación IVa, y el tiempo hasta la finalización se calcula de acuerdo
con la ecuación Villa:
en la que íterminado es el tiempo hasta la finalización, y el símbolo |...| indica el valor absoluto.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la tasa de difusión es una tasa de difusión normalizada en amplitud calculada de acuerdo con la ecuación IVb, y el tiempo hasta la finalización se puede calcular de acuerdo con la ecuación VIIIb:
en la que íterminado es el tiempo hasta la finalización, y el símbolo |...| indica el valor absoluto.
11. Un procedimiento de hibridación histoquímica o in siíu de detección de un biomarcador lábil en una muestra de tejido, comprendiendo dicho procedimiento fijar el tejido de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones previas, aplicar un marcador detectable a la muestra de tejido fijado que se puede unir específicamente al biomarcador lábil, y detectar la presencia del marcador detectable.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el procedimiento es un procedimiento histoquímico y el marcador lábil es una proteína fosforilada o en el que el procedimiento es un procedimiento de hibridación in siíu y el marcador lábil es un ácido nucleico.
13. El procedimiento de cualquiera de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la solución fijadora comprende formol.
14. El procedimiento de cualquiera de una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende además identificar el tipo de tejido del que se derivó la muestra de tejido: comparando la tasa de difusión obtenida en la etapa b4 con una o tasas de difusión de referencia determinadas empíricamente, específicas del tipo de tejido y/o específicas del tipo de cáncer, con lo que la una de las tasas de difusión de referencia que es la más similar a la tasa de difusión obtenida en la etapa b4 se usa como indicador del tipo de tejido y/o el tipo de tumor del que se derivó la muestra de tejido.
15. Un sistema para realizar el seguimiento de la difusión de una solución fijadora en una muestra de tejido y para fijar la muestra de tejido, comprendiendo el sistema:
un aparato para contener un volumen de una solución fijadora en el que se sumerge una muestra de tejido no fijado a una temperatura de 0 a 10 °C;
un sistema de seguimiento acústico para realizar mediciones de TOF, estando configurado el sistema de seguimiento acústico para
b(1) transmitir una señal acústica ultrasónica a través de la muestra de tejido y detectar la señal acústica ultrasónica después de que la señal ultrasónica ha pasado a través de la muestra de tejido;
un analizador de señales configurado para:
b(2) calcular el tiempo de vuelo (TOF) de la señal acústica ultrasónica;
b(3) repetir (b1) y (b2) en una pluralidad de puntos de tiempo posteriores;
b(4) calcular una tasa de difusión al menos en cada uno de los puntos de tiempo posteriores analizando una pendiente de una curva de los TOF calculados a partir de las señales acústicas ultrasónicas medidas en cada uno de los puntos de tiempo;
b(5) determinar cuándo la tasa de difusión desciende por debajo de un umbral predeterminado, comprendiendo la determinación:
repetir (b1 )-(b4) y ajustar los TOF de dos o más de los puntos de tiempo a una curva exponencial simple hasta que el ajuste supere un límite de confianza predeterminado; y
después de que el ajuste supera el nivel de confianza predeterminado, calcular una cantidad de tiempo necesario para alcanzar la tasa de difusión umbral predeterminada, en la que la tasa de difusión umbral predeterminada se ha cumplido cuando la cantidad de tiempo necesaria para alcanzar la tasa de difusión umbral predeterminada ha
expirado;
estando configurado el aparato para permitir, después de que la tasa de difusión desciende por debajo del umbral predeterminado, que la muestra de tejido se caliente hasta una temperatura en el intervalo de 20 °C a 55 °C durante un período de tiempo suficiente para permitir la fijación de la muestra de tejido.
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