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ES2793174T3 - Anticuerpos antiteicoicos de pared y conjugados - Google Patents

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ES2793174T3
ES2793174T3 ES14732800T ES14732800T ES2793174T3 ES 2793174 T3 ES2793174 T3 ES 2793174T3 ES 14732800 T ES14732800 T ES 14732800T ES 14732800 T ES14732800 T ES 14732800T ES 2793174 T3 ES2793174 T3 ES 2793174T3
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antibiotic
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antibiotic conjugate
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Eric Brown
Martine Darwish
John Flygare
Wouter Hazenbos
Byoung-Chul Lee
Sophie Lehar
Sanjeev Mariathasan
John Morisaki
Thomas Pillow
Leanna Staben
Richard Vandlen
Klaus Koefoed
Magnus Strandh
Peter Andersen
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Genentech Inc
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Abstract

Un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico que comprende un anticuerpo monoclonal anti-ácidos teicoicos de pared (WTA), en donde el anticuerpo monoclonal anti-ácidos teicoicos de pared se une a Staphylococcus aureus y se fija covalentemente a un antibiótico de tipo rifamicina mediante un enlazador peptídico (L) escindible por endopeptidasas o cisteína proteasas de S. aureus, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico se selecciona de las fórmulas: **(Ver fórmula)** en la que R5 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y n es 0 o 1; y **(Ver fórmula)** en la que R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y n es 1 o 2; en donde R es H, alquilo C1-C12 o C(O)CH3; L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula: -Str-Pep-Y en la que Str es una unidad extensora, Pep es un péptido de dos a doce restos de aminoácidos e Y es una unidad espaciadora; Ac es el anticuerpo monoclonal anti-ácidos teicoicos de pared; y p es un número entero de 1 a 8; en donde la VL del anticuerpo monoclonal anti-WTA comprende CDR L1 que comprende la secuencia de KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO: 99), CDR L2 que comprende la secuencia de WASTRKS (SEQ ID NO: 100) y CDR L3 que comprende la secuencia de QQYFSPPYT (SEQ ID NO: 101); y la VH del anticuerpo monoclonal anti-WTA comprende CDR H1 que comprende la secuencia de SFWMH (SEQ ID NO: 102), CDR H2 que comprende la secuencia de FTNNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO: 103) y CDR H3 que comprende la secuencia de GEGGLDD (SEQ ID NO: 118) o GDGGLDD (SEQ ID NO: 104).

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos antiteicoicos de pared y conjugados
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica los derechos de prioridad respecto a la solicitud de EE.UU. n.° de serie 14/284.609, presentada el 22 de mayo de 2014, que es una solicitud no provisional presentada bajo 37 CFR §1.53 (b), reclama el derecho bajo 35 USC §119 (e) de la Solicitud Provisional de EE.UU. N.° de Serie 61/829.461 presentada el 31 de mayo de 2013,
PRESENTACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS EN EL ARCHIVO DE TEXTO ASCII
El contenido de la siguiente presentación en el archivo de texto ASCII se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad: un formulario legible por ordenador (CRF, por sus siglas en inglés) del Listado de secuencias (nombre de archivo: P4960R2WO_PCTSequenceListing.txt, fecha de registro: 30 de mayo de 2014, tamaño: 195.240 bytes).
Campo de la invención
La invención se refiere a anticuerpos anti-ácidos teicoicos de pared ("anti-WTA", por sus siglas en inglés) conjugados con antibióticos de tipo rifamicina y al uso de los conjugados anticuerpo-antibiótico resultantes en el tratamiento de enfermedades infecciosas.
Antecedentes de la invención
Las bacterias patógenas son una causa importante de enfermedad y muerte tanto en seres humanos como en animales. Entre ellas destaca Staphylococcus aureus (S. aureus; SA), que es la principal causa de infecciones bacterianas en seres humanos en todo el mundo. S. aureus puede causar varias enfermedades, desde infecciones leves de la piel hasta enfermedades potencialmente mortales tales como la neumonía, meningitis, osteomielitis, endocarditis, síndrome de shock tóxico (TSS, por sus siglas en inglés), bacteriemia y sepsis. Su incidencia varía desde infecciones de la piel, de tejidos blandos, respiratorias, de huesos, de articulaciones, endovasculares hasta de heridas. Todavía es una de las cinco causas más comunes de infecciones nosocomiales y, con frecuencia, es la causa de infecciones de heridas posquirúrgicas. Cada año, unos 500.000 pacientes en hospitales estadounidenses contraen una infección por estafilococos.
En las últimas décadas, la infección por S. aureus se está volviendo cada vez más difícil de tratar en gran medida debido a la aparición de S. aureus resistente a meticilina (MRSA, por sus siglas en inglés) que es resistente a todos los antibióticos betalactámicos conocidos (Boucher, HW et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 48, 1-12 (2009)). Las circunstancias son tan graves, que en 2005, se indicó que la infección con MRSA era la principal causa de muerte debido a un solo agente infeccioso, responsable de más de 15.000 muertes en los Estados Unidos (DeLeo, F.R. & Chambers, H.F. Reemergence of antibioticresistant Staphylococcus aureus in the genomics era. The Journal of Clinical Investigation 119:2464-2474 (2009)). La Vancomicina, linezolid y daptomicina se han convertido en los antibióticos de elección para el tratamiento de infecciones invasivas por MRSA (Boucher, H., Miller, L.G. & Razonable, R.R. Serious infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 51 Suppl 2, S183-197 (2010)). Sin embargo, también se ha informado una susceptibilidad reducida a la vancomicina y resistencia cruzada a linezolid y daptomicina en cepas clínicas de MRSA (Nannini, E., Murray, B.E. & Arias, C.A. Resistance or decreased susceptibility to glycopeptides, daptomycin, and linezolid in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Current opinion in pharmacology 10, 516-521 (2010)). A lo largo del tiempo, la dosis de vancomicina necesaria para superar la resistencia se ha elevado a niveles en los que se produce nefrotoxicidad. Por lo tanto, la mortalidad y morbilidad por infecciones invasivas por MRSA siguen siendo altas a pesar de estos antibióticos.
Aunque generalmente se cree que SA es un patógeno extracelular, las investigaciones que se remontan al menos 50 años han revelado su capacidad de infectar y sobrevivir en diferentes tipos de células hospedadoras, tanto en fagocitos profesionales como en células no fagocíticas (Gresham, H.D. et al. Survival of Staphylococcus aureus inside neutrophils contributes to infection. J Immunol 164, 3713-3722 (2000); Anwar, S., Prince, L.R., Foster, S.J., Whyte, M.K. & Sabroe, I. The rise and rise of Staphylococcus aureus: laughing in the face of granulocytes. Clinical and Experimental Immunology 157, 216-224 (2009); Fraunholz, M. & Sinha, B. Intracellular staphylococcus aureus: Live-in and let die. Frontiers in cellular and infection microbiology 2, 43 (2012); Garzoni, C. & Kelley, W.L. Return of the Trojan horse: intracellular phenotype switching and immune evasion by Staphylococcus aureus. EMBO molecular medicine 3:115-117 (2011)). Esta persistencia intracelular facultativa permite la evasión inmunitaria del hospedador, la colonización a largo plazo del hospedador, el mantenimiento de un estado infectado de forma crónica y es probablemente una causa de los fracasos clínicos de la terapia antibiótica convencional y de las recaídas posteriores. Además, la exposición de bacterias intracelulares a concentraciones de antibióticos subóptimas puede favorecer la aparición de cepas resistentes a antibióticos, haciendo así, que este problema clínico sea más grave. De acuerdo con estas observaciones, el tratamiento de pacientes con infecciones invasivas por MRSA, tales como bacteriemia o endocarditis con vancomicina o daptomicina, se asoció con tasas de fracaso superiores al 50 % (Kullar, R., Davis, S.L., Levine, D.P. & Rybak, M.J. Impact of vancomycin exposure on outcomes in patients with methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia: support for consensus guidelines suggested targets. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 52, 975-981 (2011); Fowler, V.G., Jr. et al. Daptomycin versus standard therapy for bacteremia and endocarditis caused by Staphylococcus aureus. The New England journal of medicine 355, 653-665 (2006); Yoon, Y.K., Kim, J.Y., Park, D.W., Sohn, J.W. & Kim, M.J. Predictors of persistent methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia in patients treated with vancomycin. The Journal of antimicrobial chemotherapy 65:1015-1018 (2010)). Por lo tanto, una terapia antiestafilocócica más exitosa debe incluir la eliminación de las bacterias intracelulares.
La mayoría de los agentes antibacterianos de hoy en día, químicamente, son modificaciones semisintéticas de diferentes compuestos naturales. Estos incluyen, por ejemplo, los agentes antibacterianos betalactámicos, que incluyen las penicilinas (producidas por hongos en el género Penicillium), las cefalosporinas y los carbapenémicos. Los compuestos antimicrobianos que todavía están aislados de organismos vivos incluyen los aminoglucósidos, mientras que otros agentes antibacterianos, por ejemplo, las sulfonamidas, las quinolonas y las oxazolidinonas, están producidos únicamente por síntesis química. De acuerdo con esto, muchos compuestos antibacterianos se clasifican en función del origen químico/biosintético en natural, semisintético y sintético. Otro sistema de clasificación se basa en la actividad biológica; en esta clasificación, los agentes antibacterianos se dividen en dos grandes grupos de acuerdo con su efecto biológico sobre los microorganismos: los agentes bactericidas destruyen bacterias y los agentes bacteriostáticos ralentizan o detienen el crecimiento bacteriano.
Las ansamicinas son una clase de antibióticos, incluyendo rifamicina, rifampina, rifampicina, rifabutina, rifapentina, rifalazil, ABI-1657 y análogos de los mismos, que inhiben la ARN polimerasa bacteriana y tienen una potencia excepcional contra bacterias grampositivas y gramnegativas selectivas (Rothstein, D.M., et al (2003) Expert Opin. Invest. Drugs 12(2):255-271; documentos US 7342011; US 7271165).
Se han informado inmunoterapias para prevenir y tratar infecciones por S. aureus (incluyendo MRSA). El documento US2011/0262477 se refiere a los usos de las proteínas de adhesión bacteriana Eap, Emp y AdsA como vacunas para estimular la respuesta inmunitaria contra MRSA. El documento WO2000071585 describe anticuerpos monoclonales aislados reactivos a aislados específicos de cepas de S. aureus. El documento US20110059085A1 sugiere una estrategia basada en Ac que utiliza Ac IgM específicos para uno o más antígenos capsulares de SA, aunque no se describieron anticuerpos reales.
Los ácidos teicoicos (TA, por sus siglas en inglés) son polisacáridos bacterianos que se encuentran dentro de la pared celular de las bacterias Gram positivas, incluyendo SA. Los ácidos teicoicos de pared (WTA, por sus siglas en inglés) son aquellos enlazados covalentemente a la capa de peptidoglicano (PDG) de la pared celular; mientras que los ácidos lipoteicoicos (LTA, por sus siglas en inglés) son aquellos enlazados covalentemente a los lípidos de la membrana citoplasmática. Xia et al. (2010) Intl. J. Med. Microbiol. 300:148-54. Estos glicopolímeros desempeñan papeles cruciales en la supervivencia bacteriana en condiciones desfavorables y en otros procesos celulares básicos. Las estructuras de WTA conocidas varían ampliamente entre especies bacterianas. Los TA de S aureus están compuestos por subunidades repetitivas de poliol fosfato tales como ribitol fosfato o glicerol fosfato. Dada su diversidad y variabilidad estructural, los WTA se consideran dianas atractivas para anticuerpos y como vacunas, ibid.
Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés), también conocidos como inmunoconjugados, son moléculas quimioterapéuticas dirigidas que combinan las propiedades ideales tanto de los anticuerpos como de los fármacos citotóxicos dirigiendo los potentes fármacos citotóxicos a células tumorales que expresan antígenos (Teicher, B.A. (2009) Curr. Cancer Drug Targets 9:982-1004), potenciando, de este modo, el índice terapéutico al maximizar la eficacia y minimizar la toxicidad inespecífica (Carter, PJ y Senter P.D. (2008) The Cancer J.. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107. El ADC comprende un anticuerpo dirigido fijado covalentemente a través de una unidad enlazadora a un resto de fármaco citotóxico. Los inmunoconjugados permiten el suministro dirigido de un resto de fármaco a un tumor y la acumulación intracelular en el mismo, donde la administración sistémica de fármacos no conjugados puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales, así como para las células tumorales que se busca eliminar (Polakis P. (2005) Curr. Opin. Pharmacol.
5:382-387). El desarrollo eficaz de ADC para un antígeno diana determinado depende de la optimización de parámetros tales como los niveles de expresión del antígeno diana, la accesibilidad tumoral (Kovtun, Y.V. and Goldmacher V.S. (2007) Cancer Lett. 255:232-240), la selección de anticuerpos (documento US 7964566), la estabilidad del enlazador (Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; Doronina et al (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; Alley et al (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765), el mecanismo de acción y potencia de los fármacos citotóxicos, la carga de fármacos (Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070) y el modo de conjugación enlazador-fármaco con el anticuerpo (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138; Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patentes 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Res. 19:605-614).
El concepto de ADC en la terapia contra el cáncer también se ha ampliado a la terapia antibacteriana, en este caso, la parte de fármaco es un antibiótico, dando como resultado conjugado anticuerpo-antibiótico (AAC, por sus siglas en inglés). Los documentos US 5545721 y US 6660267 describen la síntesis de un conjugado inmunoglobulinaantibiótico no específico que se une a la superficie de bacterias diana a través del antibiótico y los usos del mismo para tratar sepsis. El documento US 7569677 y patentes relacionadas sugieren anticuerpos proféticamente conjugados con antibióticos que tienen una parte de unión a antígeno específica para un antígeno bacteriano (tal como el polisacárido capsular de SA), pero carece de una región constante que reaccione con una proteína bacteriana de unión a Fc (por ejemplo, proteína A estafilocócica).
El documento WO 2004/050846 describe el uso de composiciones que comprenden anticuerpos anti-WTA para su uso como vacunas para tratar infecciones por estafilococos mediante la unión a S. aureus para bloquear la infección. El documento US 6.322.788 describe anticuerpos capaces de unirse a un antígeno bacteriano que carece de la capacidad de unirse a proteínas bacterianas de unión a Fc.
El documento WO 2006/081711 describe conjugados anticuerpo-fármaco usando péptidos de auristatina, incluyendo MeVal-Val-Dil-Dap-Norefedrina (MMAE) y MeVal-Val-Dil-Dap-Phe (MMAF).
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Cualquier ejemplo de acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones forma una realización de la invención.
La invención proporciona composiciones denominadas "conjugados anticuerpo-antibiótico" o "AAC", por sus siglas en inglés) que comprenden un anticuerpo conjugado por una unión covalente a uno o más restos antibióticos de tipo rifamicina como se establece en las reivindicaciones.
Los conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención pueden emplear un anticuerpo monoclonal anti-WTA, que comprende una cadena ligera y una cadena H, comprendiendo, la cadena L, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 y comprendiendo la cadena H, CDR H1, CDR H2 y CDR H3, en donde la CDR L1, CDR L2, y CDR L3 y CDR H1, Cd R H2 y CDR H3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las CDR de cada uno de los Ac 4461 (SEQ ID NO: 1­ 6), 4624 (SEQ ID NO: 7-12), 4399 (SEQ ID NO: 13-18) y 6267 (SEQ ID NO: 19-24) respectivamente, como se muestra en las Tablas 6A y 6B.
En un ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la VH comprende al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la región VH seleccionada de la secuencia de VH de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 de los anticuerpos 4461, 4624, 4399 y 6267, respectivamente. En un ejemplo, este anticuerpo comprende además una región variable de cadena L (VL) en donde la VL comprende al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la región VL seleccionada de la secuencia de VL de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 de los anticuerpos 4461, 4624, 4399 y 6267, respectivamente. En otro ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado comprende una región variable de cadena L (VL) en donde la VL comprende al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la región VL seleccionada de la secuencia de VL de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 de los anticuerpos 4461, 4624, 4399 y 6267, respectivamente. En cualquiera de los ejemplos anteriores, la identidad de secuencia puede ser del 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
En ejemplos más específicos, el anticuerpo comprende:
(i) VL de SEQ ID NO: 25 y VH de SEQ ID NO: 26;
(ii) VL de SEQ ID NO: 27 y VH de SEQ ID NO: 28;
(iii) VL de SEQ ID NO: 29 y VH de SEQ ID NO: 30; o
(iv) VL de SEQ ID NO: 31 y VH de SEQ ID NO: 32.
En algunos ejemplos, el anticuerpo monoclonal anti-WTA (ácido teicoico de pared) aislado comprende una cadena ligera (L) y una cadena pesada (H), en donde:
(a) la cadena L comprende CDR L1 que comprende la secuencia de KSSQSVLSRANNNYYVA (SEQ ID NO: 1), CDR L2 que comprende la secuencia de WASTREF (SEQ ID NO: 2) y CDR L3 que comprende la secuencia de QQYYTSRRT (SEQ ID NO: 3); y la cadena H comprende CDR h 1 que comprende la secuencia de DYYMH (SEQ ID NO: 4), CDR H2 que comprende la secuencia de WINPKSGGTNYAQRFQG (SEQ ID NO: 5) y CDR H3 que comprende la secuencia de DCGSGGLRDF (SEQ ID NO: 6);
(b) la cadena L comprende CDR L1 que comprende la secuencia de RSNQNLLSSSNNNYLA (SEQ ID NO: 7),
CDR L2 que comprende la secuencia de WASTRES (SEQ ID NO: 8) y CDR L3 que comprende la secuencia de QQYYANPRT (s Eq ID NO: 9); y la cadena H comprende CDR H1 que comprende la secuencia de DYYIH (SEQ
ID NO: 10), CDR H2 que comprende la secuencia de WINPNTGGTYYAQKFRD (SEQ ID NO: 11) y CDR H3 que comprende la secuencia de DCGRGGLRDI (SEQ ID NO: 12);
(c) la cadena L comprende CDR L1 que comprende la secuencia de KSNQNVLASSNDKNYLA (SEQ ID NO: 13),
CDR L2 que comprende la secuencia de WASIRES (SEQ ID NO: 14) y CDR L3 que comprende la secuencia de QQYYTNPRT (SEQ ID NO: 15); y la cadena H comprende CDR H1 que comprende la secuencia de DYYIH
(SEQ ID NO: 16), CDR H2 que comprende la secuencia de WINPNTGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 17) y CDR
H3 que comprende la secuencia de Dc GNAGLRDI (SEQ ID NO: 18); o
(d) la cadena L comprende CDR L1 que comprende la secuencia de KSSQNVLYSSNNKNYLA (SEQ ID NO: 19),
CDR L2 que comprende la secuencia de WASTRES (SEQ ID NO: 20) y CDR L3 que comprende la secuencia de QQYYTSPPYT (SeQ ID NO: 21); y la cadena H comprende CDR H1 que comprende la secuencia de SYWIG
(SEQ ID NO: 22), CDR H2 que comprende la secuencia de IIHPGDSKTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 23) y CDR H3 que comprende la secuencia de LYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGV (SEQ ID NO: 24).
En una cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo puede ser un fragmento de unión a antígeno que carece de una región Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un F(ab) o F(ab')2. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada y/o una región constante de cadena ligera, en donde la región constante de cadena pesada y/o la región constante de cadena ligera comprenden uno o más aminoácidos que están sustituidos con restos de cisteína. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada comprende la sustitución de aminoácidos A118C y/o S400C, y/o la región constante de cadena ligera comprende la sustitución de aminoácidos V205C, en donde la numeración está de acuerdo con la numeración EU.
En algunos ejemplos, la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 149 y/o la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151. En algunos ejemplos, la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
149 y la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150. En algunos ejemplos, la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148 y la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.
En un aspecto, el Ac de una cualquiera de las realizaciones anteriores se une a WTA alfa.
En otro aspecto, la invención emplea un anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado que comprende una cadena ligera y una cadena H, comprendiendo, la cadena L, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 y/o comprendiendo, la cadena H, CDR
H1, CDR H2 y CDR H3, en donde la CDR L1, CDR L2, y CDR L3 y CDR H1, CDR H2 y CDR H3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las CDR correspondientes de cada uno de los Ac mostrados en la Figura 14 (SEQ ID
NO: 33-110). En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado que comprende una cadena ligera y una cadena H, comprendiendo, la cadena L, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 y/o comprendiendo, la cadena H, CDR H1, CDR H2 y CDR H3, en donde la CDR L1, CDR L2, y CDR L3 y CDR H1, CDR H2 y CDR H3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las CDR correspondientes de cada uno de los Ac mostrados en la
Figura 15A, 15B, 16A y 16B (anticuerpos 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys y 4497.v8HCLC-Cys).
En una realización específica, estos Ac se unen a WTA beta.
En otro aspecto, la invención emplea un anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado, específicamente el anticuerpo monoclonal anti-WTA beta que comprende una región variable de cadena L (VL) en donde la VL comprend menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la región VL seleccionada de la secuencia de VL correspondiente a cada uno de los anticuerpos 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253,
4497 y 4487 respectivamente, tal como se muestra en las Figuras 17A-1 a 17A-2 en las posiciones Kabat 1-107. En ejemplos adicionales, el anticuerpo además comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la VH comprende al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la región VH seleccionada de las secuencias de VH correspondientes a cada uno de los anticuerpos
6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497 y 4487 respectivamente, tal como se muestra en las Figuras 17B-1 a 17B-2 en las posiciones Kabat 1-113. En cualquiera de las realizaciones anteriores, la identidad de secuencia puede ser del 96 %, 97%, 98%, 99 % o 100 %. En un ejemplo más específico del anticuerpo, la VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 112 y la VL comprende la SEQ ID NO: 111.
En otro aspecto, la invención emplea un anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado, específicamente el anticuerpo monoclonal anti-WTA beta que comprende una región variable de cadena L (VL) en donde la VL comprend menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la región VL seleccionada de la secuencia de VL correspondiente a cada uno de los anticuerpos como se muestra en las Figuras 15A o 16A (anticuerpos 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys y 4497.v8HCLC-Cys) en las posiciones Kabat 1-107. En ejemplos adicionales, el anticuerpo además comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la VH comprende al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo
de la región VH seleccionada de las secuencias de VH correspondientes a cada uno de los anticuerpos como se muestra en las Figuras 15B y 16B (anticuerpos 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys y 4497.v8HCLC-Cys) en las posiciones Kabat 1-113. En cualquiera de las realizaciones anteriores, la identidad de secuencia puede ser del 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En una realización adicional, este anticuerpo comprende además, una VL que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 119.
Las variantes de cadena H y L modificadas por ingeniería con Cys de anti-WTA beta pueden emparejarse en cualquiera de las siguientes combinaciones para formar Ac completos para conjugarse con productos intermedios enlazador-Abx para generar los AAC anti-WTA de la invención. En una realización, la cadena L comprende la secuencia de SEQ ID NO: 121 y la cadena H comprende la secuencia de SEQ ID NO: 124. En otra realización, el anticuerpo aislado comprende una cadena L de SEQ ID NO: 123 y una cadena H que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 124 o SEQ ID NO: 157. En una realización particular, el anticuerpo anti-WTA beta así como el AAC anti-WTA beta de la invención comprende una cadena L de SEQ ID NO: 123.
Otro ejemplo más es un anticuerpo que se une al mismo epítopo que cada uno de los Ac anti-WTA alfa de la Figura 13A y la Figura 13B. También se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que cada uno de los Ac anti-WTA beta de la Figura 14, Figuras 15A y 15B, Figuras 16A y 16B, y Figuras 17A y 17B.
En una realización adicional, los anticuerpos anti-WTA beta y anti-WTA alfa de la presente invención son fragmentos de unión a antígeno que carecen de región Fc, preferentemente F(ab')2 o F(ab). Por lo tanto, la presente invención proporciona conjugados anticuerpo-antibiótico en donde el anticuerpo de WTA es un F(ab')2 o F(ab).
En otro aspecto, la invención emplea un anticuerpo monoclonal anti-WTA que se une a WTA beta.
En algunos ejemplos, el anticuerpo monoclonal anti-WTA (ácido teicoico de pared) aislado comprende una cadena ligera (L) y una cadena pesada (H), en donde:
(a) la cadena L comprende CDR L1 que comprende la secuencia de KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO: 99), c Dr L2 que comprende la secuencia de WASTRKS (SEQ ID NO: 100) y CDR L3 que comprende la secuencia de QQYFSPPYT (SEQ ID NO: 101); y la cadena H comprende CDR H1 que comprende la secuencia de SFWMH (SEQ ID NO: 102), CDR H2 que comprende la secuencia de FTNNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO: 103), y CDR H3 que comprende la secuencia de GDGGLDD (SEQ ID NO: 104); o
(b) la cadena L comprende CDR L1 que comprende la secuencia de KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO: 99), c Dr L2 que comprende la secuencia de WASTRKS (SEQ ID NO: 100) y CDR L3 que comprende la secuencia de QQYFSPPYT (SEQ ID NO: 101); y la cadena H comprende CDR H1 que comprende la secuencia de SFWMH (SEQ ID NO: 102), CDR H2 que comprende la secuencia de FTNNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO: 103), y CDR H3 que comprende la secuencia de GEGGLDD (SEQ ID NO: 118).
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la secuencia de VH SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la secuencia de VL SEQ ID NO: 119. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado comprende una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la secuencia de VL SEQ ID NO: 119. En cualquiera de las realizaciones anteriores, la identidad de secuencia puede ser del 96 %, 97%, 98%, 99 % o 100 %. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH), en donde la VL comprende la secuencia de SEQ ID NO: 119 y la VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 156.
En algunas realizaciones descritas anteriormente, el anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno que carece de una región Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un F(ab) o F(ab')2. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada y/o una región constante de cadena ligera, en donde la región constante de cadena pesada y/o la región constante de cadena ligera comprenden uno o más aminoácidos que están sustituidos con restos de cisteína. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada comprende la sustitución de aminoácidos A118C o S400C, y/o la región constante de cadena ligera comprende la sustitución de aminoácidos V205C, en donde la numeración está de acuerdo con la numeración EU. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 149 y/o la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 149 y la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148 y la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 124 y la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO: 121. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 146, SEQ ID nO: 147, SeQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 124, y la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO: 123. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal anti-WTA aislado comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 124 y la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO: 145.
En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente, el anticuerpo no es un isotipo IgM. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente, el anticuerpo es un isotipo IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgE, IgD o IgA (por ejemplo, IgA1 o IgA2). En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente, el anticuerpo es producido por una célula hospedadora en cultivo celular. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula no humana. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es procariota o eucariota. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana o de mamífero no humano). En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula CHO.
También se describe un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento. También se describe un vector que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento. El vector de expresión puede ser un vector de expresión.
También se describe una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. La célula hospedadora puede ser una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana o de mamífero no humano). En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula CHO.
También se describe un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico; y recuperar el anticuerpo producido por la célula. El método puede comprender además purificar el anticuerpo.
Otro aspecto de la invención es un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico (AAC) que comprende un anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared (WTA) de la invención, fijado covalentemente por un enlazador peptídico a un antibiótico de tipo rifamicina como se establece en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti­ ácidos teicoicos de pared (WTA) se une a Staphylococcus aureus. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti­ ácidos teicoicos de pared se une a Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA).
En algunos ejemplos de los conjugados anticuerpo-antibiótico divulgados en el presente documento, el anticuerpo comprende: i) CDR de cadena L y cadena H de Se Q ID NO: 99-104 o ii) la VL de SEQ ID NO: 119 o SEQ ID NO: 123 emparejada con la VH de SeQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 156; o iii) la VL de SEQ ID NO: 111 emparejada con la VH de SEQ ID NO: 112.
En algunos ejemplos, El antibiótico de tipo rifamicina es un antibiótico de tipo rifalazil. En algunas realizaciones, el antibiótico de tipo rifamicina comprende una amina cuaternaria fijada al enlazador peptídico. En algunas realizaciones, el antibiótico está fijado al anticuerpo a través de un enlazador peptídico que está fijado a una cisteína modificada por ingeniería del anticuerpo anti-WTA. La cisteína modificada por ingeniería puede estar en la cadena L o H del anticuerpo modificado. En algunas realizaciones, el resto de cisteína está en la cadena L. En algunas realizaciones, el resto de cisteína está en la cadena H.
Los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención pueden comprender un enlazador peptídico que es un enlazador escindible por cisteína proteasa de S. aureus; tales enlazadores incluyen un enlazador escindible por estafopaína B o por estafopaína A. En una realización, la proteasa de S. aureus es una endopeptidasa. En otra realización, el enlazador es un enlazador escindible por proteasas del hospedador preferentemente un enlazador escindible por la proteasa catepsina B humana (por ejemplo, un enlazador de dipéptido val-cit).
Una realización a modo de ejemplo de un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico tiene la fórmula:
Ac-(L-abx)p
en donde:
Ac es el anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared;
L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
-Str-Pep-Y-donde Str es una unidad extensora; Pep es un péptido de dos a doce restos de aminoácidos e Y es una unidad espadadora;
abx es el antibiótico de tipo rifamicina; y
p es un número entero de 1 a 8.
En una realización, los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de cualquiera de los anteriores comprenden una relación antibiótico anticuerpo (AAR, por sus siglas en inglés) de 2 o 4.
En algunas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico es de la fórmula I:
Figure imgf000008_0001
en donde:
las líneas discontinuas indican un enlace opcional;
R es H, alquilo C1-C12 o C(O)CH3;
R1 es OH;
R2 es CH=N-(heterociclilo), en donde el heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente de C(O)CH3, alquilo C1-C12-, heteroarilo C1-C12, heterociclilo C2-C20, arilo C6 -C2oy carbociclilo C3-C12;
o R1 y R2 forman un heteroarilo o heterociclilo de cinco o seis miembros fusionado y formando, opcionalmente, un anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo, o carbociclilo de seis miembros espiro o fusionado, en donde el anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo, o carbociclilo de seis miembros espiro o fusionado se sustituye opcionalmente por H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C12 u OH;
L es el enlazador peptídico fijado a R2 o al heteroarilo o heterociclilo fusionado formado por R1 y R2; y
Ac es el anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared (WTA).
En algunas de estas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de fórmula I es de la fórmula: En algunas de estas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de fórmula I es de la fórmula:
Figure imgf000008_0002
en donde R5 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y n es 0 o 1.
En algunas de estas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de fórmula I es de la fórmula:
Figure imgf000009_0001
en donde R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y n es 1 o 2.
En algunas realizaciones particulares, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de fórmula I es de la fórmula:
Figure imgf000009_0002
En algunas realizaciones, se proporciona un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico (AAC) que comprende un anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared (WTA) de la invención, fijado covalentemente por un enlazador peptídico a un antibiótico de tipo rifamicina, donde el enlazador peptídico tiene la fórmula:
-Str-Pep-Y-donde Str es una unidad extensora unida covalentemente al anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared (WTA); Pep es un péptido de dos a doce restos de aminoácidos e Y es una unidad espaciadora fijada covalentemente al antibiótico de tipo rifamicina. En algunas de estas realizaciones, Str tiene la fórmula:
Figure imgf000009_0003
en donde R6 se selecciona del grupo que consiste en -alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arileno-, -alquileno-arileno C1-C10, -arileno-alquileno C1-C10, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8, -alquileno C1-C10 -heterociclo (C3-C8) -, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2O)r- y -(CH2CH2OX-CH2-; y r es un número entero que varía de 1 a 10. En una variación, R6 es-(CH2)5-. En algunas de estas realizaciones, Pep comprende de dos a doce restos de aminoácidos seleccionados independientemente de glicina, alanina, fenilalanina, lisina, arginina, valina y citrulina. En una variación, Pep se selecciona de valina-citrulina (val-cit, vc); fenilalanina-lisina (fk); GGAFAGGG (SEQ ID NO: 126); tpm-cit; GPImeLFF (SEQ ID NO: 129); valina-citrulina-fenilalanina (val-cit-phe); GGAFA (SEQ ID NO: 131); y LAFG (SEQ ID NO: 128). En algunas de estas realizaciones, Y comprende paraaminobencilo o paraaminobenciloxicarbonilo.
En algunas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico tiene la fórmula:
Figure imgf000010_0001
donde Ac, Str, Y y abx son como se definen en el presente documento, y AA1 y AA2 se seleccionan independientemente de una cadena lateral de aminoácidos. En algunas de estas realizaciones, la cadena lateral de aminoácidos se selecciona independientemente de H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3 y -CH2CH2CH2NHC(O)NH2. En algunas de estas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico tiene la fórmula:
Figure imgf000011_0002
En algunas de estas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiotico tiene la formula:
Figure imgf000011_0001
donde R7 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12. En algunas de estas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico tiene la fórmula:
Figure imgf000012_0001
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un compuesto conjugado anticuerpoantibiótico de la invención.
En un aspecto, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-antibiótico como se establece en las reivindicaciones para su uso en un método de tratamiento de una infección bacteriana en un paciente, en donde la infección bacteriana es una infección por Staphylococcus aureus. En algunas realizaciones, el paciente ha sido diagnosticado con una infección por Staphylococcus aureus. En algunas realizaciones, tratar la infección bacteriana comprende reducir la carga bacteriana.
En un aspecto, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-antibiótico como se establece en las reivindicaciones para su uso en un método de reducción del número de células bacterianas intracelulares de Staphylococcus aureus en las células hospedadoras de un paciente infectado por Staphylococcus aureus sin reducir el número de células hospedadoras. Este uso puede comprender destruir las células bacterianas persistentes (por ejemplo, estafilococo A) in vivo poniendo en contacto las bacterias persistentes con un AAC de cualquiera de las realizaciones anteriores.
En otra realización, el uso médico comprende además administrar un segundo agente terapéutico. En una realización adicional, el segundo agente terapéutico es un antibiótico que incluye un antibiótico contra Staphylococcus aureus en general o contra MRSA en particular.
En una realización, el segundo antibiótico administrado en combinación con el compuesto conjugado anticuerpoantibiótico de la invención se selecciona de las clases estructurales: (i) aminoglucósidos; (ii) betalactámicos; (iii) macrólidos/péptidos cíclicos; (iv) tetraciclinas; (v) fluoroquinolinas/fluoroquinolonas; (vi) y oxazolidinonas.
En una realización, el segundo antibiótico administrado en combinación con el compuesto conjugado anticuerpoantibiótico de la invención se selecciona de clindamicina, novobiocina, retapamulina, daptomicina, GSK-2140944, CG-400549, sitafloxacino, teicoplanina, triclosán, naftiridona, radezolida, doxorrubicina, ampicilina, vancomicina, imipenem, doripenem, gemcitabina, dalbavancina y azitromicina.
En algunas realizaciones en el presente documento, la carga bacteriana en el sujeto se ha reducido a un nivel indetectable después del tratamiento. En una realización, el hemocultivo del paciente es negativo después del tratamiento en comparación con un hemocultivo positivo antes del tratamiento. En algunas realizaciones en el presente documento, la resistencia bacteriana en el sujeto es indetectable o baja. En algunas realizaciones en el presente documento, el sujeto no responde al tratamiento con meticilina o vancomicina.
Otro aspecto de la invención es un proceso para preparar un anticuerpo o un compuesto conjugado anticuerpoantibiótico de la invención que comprende conjugar un antibiótico de tipo rifamicina con un anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared (WTA) como se establece en las reivindicaciones.
Otro aspecto de la invención es un kit para tratar una infección bacteriana que comprende una composición farmacéutica de la invención e instrucciones para su uso como se establece en las reivindicaciones.
También se describe un producto intermedio enlazador-antibiótico que tiene la Fórmula II:
Figure imgf000013_0001
en donde:
las líneas discontinuas indican un enlace opcional;
R es H, alquilo C1-C12 o C(O)CH3;
R1 es OH;
R2 es CH=N-(heterociclilo), en donde el heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente de C(O)CH3, alquilo C1-C12-, heteroarilo C1-C12, heterociclilo C2-C20, arilo C6 -C20V carbociclilo C3-C12;
o R1 y R2 forman un heteroarilo o heterociclilo de cinco o seis miembros fusionado y formando, opcionalmente, un anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo, o carbociclilo de seis miembros espiro o fusionado, en donde el anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo, o carbociclilo de seis miembros espiro o fusionado se sustituye opcionalmente por H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C12 u OH;
L es un enlazador peptídico fijado a R2 o al heteroarilo o heterociclilo fusionado formado por R1 y R2; y que tiene la fórmula:
-Str-Pep-Y-donde Str es una unidad extensora; Pep es un péptido de dos a doce restos de aminoácidos e Y es una unidad espaciadora; y
X es un grupo funcional reactivo seleccionado de maleimida, tiol, amino, bromuro, bromoacetamido, yodoacetamido, p-toluenosulfonato, yoduro, hidroxilo, carboxilo, piridil disulfuro y N-hidroxisuccinimida.
En algunos de los intermedios enlazador-antibiótico de Fórmula II, X es
Figure imgf000014_0001
El producto intermedio enlazador-antibiótico de Fórmula II puede tener la fórmula:
Figure imgf000014_0002
en donde
R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12;
n es 1 o 2 ;
R4 se selecciona de H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C12 y OH; y
Z se selecciona de NH, N(alquilo C1-C12), O y S.
El producto intermedio enlazador-antibiótico de Fórmula II puede tener la fórmula:
Figure imgf000015_0001
También se proporciona un método para destruir Staphylococcus aureus intracelular en las células hospedadoras de un paciente infectado Staphylococcus aureus sin destruir las células hospedadoras que comprende administrar un conjugado anti-WTA-antibiótico detallado en el presente documento.
Debe entenderse que una, algunas, o todas las propiedades de las diferentes realizaciones descritas en el presente documento pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para un experto en la materia.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra que la exposición a vancomicina o rifampicina destruye el MRSA gradualmente. La vancomicina se probó a 2 pg/ml (cuadrado abierto) y 20 pg/ml (cuadrado cerrado). La rifampicina se probó a 0,02 |jg/ml (triángulo abierto) y 0,2 pg/ml (triángulo cerrado).
La Figura 2 muestra que las células peritoneales infectadas fueron capaces de transferir la infección a los osteoblastos en presencia de vancomicina.
La Figura 3 muestra la pared celular de bacterias Gram positivas, tal como S. aureus con una representación en dibujo de los ácidos teicoicos de la pared (WTA), del ácido lipoteicoico (LTA) y de las vainas de Peptidoglicano (PGN) que estabilizan la membrana celular y proporcionan sitios de unión.
La Figura 4 muestra la estructura química y las modificaciones de glucosilo del Ácido Teicoico de Pared (WTA), descrito en detalle en Definiciones.
La Figura 5 muestra un posible mecanismo de activación del fármaco para conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC). El antibiótico activo (Abx) se libera después de la internalización del Aa C dentro de las células de mamíferos.
Las Figuras 6A y 6B resumen las características de los Ac de la exploración primaria de una biblioteca de Acm que muestran una unión ELISA positiva a las preparaciones de la pared celular de las cepas de S. aureus, cepa USA300 o Wood46, tal se describe en el ejemplo 21. De los Ac que se unen a WTA, 4 son específicos de WTA alfa y 13 se unen específicamente a WTA beta.
La figura 7A muestra un ensayo de macrófagos in vitro que demuestra que AAC destruye MRSA intracelular.
La Figura 7B muestra la destrucción intracelular de MRSA (cepa USA300) con 50 |jg/ml del AAC 102tio-S4497-HC-A118C-pipBOR en macrófagos, osteoblastos (MG63), células epiteliales de las vías respiratorias (A549) y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en comparación con el anticuerpo anti-WTA S4497, no marcado, sin conjugar. La línea discontinua indica el límite de detección para el ensayo.
La Figura 7C muestra la comparación de AAC realizados con los productos intermedios enlazador- antibiótico LA-51 y LA-54 (Tabla 2). MRSA se opsonizó con el anticuerpo s4497 solo o con AAC: AAC-102 o AAC-105 (Tabla 3) a diversas concentraciones que varían de 10 jg/ml a 0,003 jg/ml.
La Figura 7D muestra que AAC destruye las bacterias intracelulares sin dañar los macrófagos.
La Figura 7E muestra la recuperación de USA300 vivas del interior de macrófagos a partir de la lisis de células de macrófagos anterior. Se recuperaron pocos (10.000 veces menos) S. aureus vivos de macrófagos infectados con bacterias opsonizadas con S-4497-AAC en comparación con los controles tratados con anticuerpos no marcados.
La figura 8A muestra la eficacia in vivo de AAC 102tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR en un modelo de infección intraperitoneal en ratones A/J. Los ratones se infectaron con MRSA mediante inyección intraperitoneal y se trataron con 50 mg/kg de anticuerpo S4497 solo o con 50 mg/kg de AAC 102 (HC-A114C Kabat = HC-A118C EU) por inyección intraperitoneal. Los ratones se sacrificaron 2 días después de la infección y se evaluó la carga bacteriana total en el sobrenadante peritoneal (bacterias extracelulares), en las células peritoneales (bacterias intracelulares) o en el riñón.
La Figura 8B muestra un modelo de infección intravenosa, in vivo, en ratones A/J. Los ratones se infectaron con MRSA por inyección intravenosa y se trataron con 50 mg/Kg de anticuerpo S4497, 50 mg/Kg de AAC 102 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR o con una mezcla simple de 50 mg/Kg de anticuerpo S4497 0,5 mg/Kg de rifamicina libre. La línea discontinua gris indica el límite de detección para cada órgano.
La Figura 9A muestra la eficacia de AAC 102 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR en un modelo de infección intravenosa por titulación del AAC S4497-pipBOR.
La Figura 9B muestra que AAC 105 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR es más eficaz que AAC 102 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR, en un modelo de infección intravenosa por titulación. Los tratamientos con el anticuerpo S4497, Aa C 102 o AAC 112 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetil-pipBOR se administraron a las dosis indicadas 30 minutos después de la infección. Los ratones se sacrificaron 4 días después de la infección y se determinó el número total de bacterias supervivientes por ratón (2 riñones agrupados) mediante siembra en placas.
La Figura 9C muestra que AAC 105 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR es más eficaz que el anticuerpo S4497 o antibiótico dimetilpipBOR 7 solo en un modelo de infección intravenosa. Ratones CB17.SCID ratones infectados con 2x107 UFC de MRSA por inyección intravenosa. Un día después de la infección, los ratones se trataron con 50 mg/Kg de anticuerpo S4497, 50 mg/Kg de AAC 105 o con 0,5 mg/Kg de dimetil­ pipBOR 7, la dosis equivalente de antibiótico contenida en 50 mg/Kg de AAC). Los ratones se sacrificaron 4 días después de la infección y se determinó el número total de bacterias supervivientes por ratón (2 riñones agrupados) mediante siembra en placas.
La Figura 10A muestra la prevalencia de anticuerpos anti-S. aureus en suero humano. Los pacientes infectados por S. aureus o los controles normales contienen altas cantidades de anticuerpo sérico específico de WTA con la misma especificidad que S4497 anti-WTA. Se examinó la unión de varias muestras de suero de tipo silvestre (WT, por sus siglas en inglés) a MRSA que expresaban el antígeno de S4497 frente a la unión a un mutante de la cepa de MRSA TarM/TarS DKO (doble nuligénica) que carece de las modificaciones de azúcares que reconoce el anticuerpo S4497.
La Figura 10B muestra que un AAC es eficaz en presencia de niveles fisiológicos de IgG humana (10 mg/ml) en un ensayo de macrófagos in vitro con la cepa USA300 de MRSA. El 105 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR es eficaz en presencia de 10 mg/ml de IgG humana. La cepa USA300 de MRSA se opsonizó con AAC solo o con AAC diluido en 10 mg/ml de IgG humana. El número total de bacterias intracelulares supervivientes se evaluó 2 días después de la infección.
La figura 10C muestra un modelo de infección in vivo que demuestra que AAC es eficaz en presencia de niveles fisiológicos de IgG humana. Los datos combinados son de 3 experimentos independientes que usan dos preparaciones por separado de AAC 105 u 112 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR. Los ratones tratados con el AAC tuvieron una reducción mayor de 4 en escala logarítmica en las cargas bacterianas (Prueba t de Student p =. 0005).
La figura 11A muestra el modelo de infección in vivo que demuestra que los AAC son más eficaces que el antibiótico vancomicina de tratamiento de referencia (SOC, por sus siglas en inglés) actual en ratones que se reconstituyen con niveles normales de IgG humana. Los ratones se trataron con anticuerpo S4497 (50 mg/Kg), vancomicina (100 mg/Kg), AAC 105 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR (50 mg/Kg) o con un Aa C preparado con un anticuerpo de control de isotipo que no reconoce MRSA, Aa C 110 tio-hu-anti gD 5B5-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR (50 mg/Kg).
La figura 11B muestra la unión relativa de anticuerpos anti-Staphylococcus aureus anticuerpos a la cepa USA300 aislada de riñones en un modelo de infección in vivo, tal como se determina por FACS. El anticuerpo S4497 reconoce una modificación de N-acetilglucosamina que está enlazada al ácido teicoico de la pared (WTA) a través de un enlace beta-anomérico en la pared celular de S. aureus. El anticuerpo S7578 se une a una modificación similar de N-acetilglucosamina que se une a WTA a través de un enlace alfa-anomérico. El anticuerpo rF1 es un anticuerpo anti-MRSA de control positivo que reconoce las modificaciones de azúcares encontradas en una familia de proteínas ancladas a la pared celular que contienen repetición de SDR. El anticuerpo gD es una IgGi humana de control negativo que no reconoce S. aureus.
La figura 11C muestra el modelo de infección in vivo que demuestra que el AAC, 129 tio-S6078-HC A1 14C-LCWT-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR es más eficaz que el anticuerpo S4497 anti-WTA no marcado, de acuerdo con el mismo régimen que la Figura 11A, en ratones que se reconstituyen con niveles normales de IgG humana. Los ratones se trataron con anticuerpo S4497 (50 mg/Kg) o con AAC 129 tio-S6078-HC A114C-LCWT-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR (50 mg/Kg).
La Figura 12 muestra un ensayo de inhibición del crecimiento que demuestra que los AAC no son tóxicos para S. aureus a menos que el enlazador se escinda por la catepsina B. A la izquierda se muestra un ensayo esquemático de liberación de catepsina (Ejemplo 20). El AAC se trata con catepsina B para liberar antibiótico libre. La cantidad total de actividad antibiótica en el AAC intacto frente al tratado con catepsina B se determina preparando diluciones en serie de la reacción resultante y determinando la dosis mínima de AAC que puede inhibir el crecimiento de S. aureus. El gráfico superior derecho muestra el ensayo de liberación de catepsina para 102 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR y el gráfico inferior derecho muestra el ensayo de liberación de catepsina para 105 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR.
La Figura 13A muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera (VL) de cuatro anticuerpos anti-WTA alfa humanos (SEQ ID NO: 25, 27, 29 y 31, respectivamente, en orden de aparición). Las secuencias CDR, CDRL1, L2 y L3 de acuerdo con la numeración de Kabat están subrayadas. La Figura 13B muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (VH) de los cuatro anticuerpos anti-WTA alfa humanos de la Figura 13A. Las secuencias CDR, CDR H1, H2 y H3 según la numeración de Kabat están subrayadas (SEQ ID NO: 26, 28, 30 y 32, respectivamente, en orden de aparición).
La Figura 14 muestra las secuencias CDR de las cadenas L y H de 13 anticuerpos anti-WTA beta humanos (SEQ ID NO: 33-110).
Las Figuras 15A-1 y 15A-2 muestran una alineación de la cadena L de longitud completa (cadena ligera) del Ac 6078 anti-WTA beta (sin modificar) y sus variantes, v2, v3, v4 (SEQ ID NO: 113, 113, 115, 113, 115, 113, 115 y 115, respectivamente, en orden de aparición). Las secuencias CDR, CDRL1, L2 y L3 de acuerdo con la numeración de Kabat están subrayadas. Los recuadros muestran los restos de contacto y los restos de las CDR de acuerdo con Kabat y Chothia. Las variantes de la cadena L que contienen una Cys modificada por ingeniería se indican mediante la C en el cuadro negro al final de la región constante (en el resto EU n.° 205 en este caso). La designación variante, por ejemplo, v2LC-Cys significa la variante 2 que contiene una Cys modificada por ingeniería en la cadena L. HCLC-Cys significa que cada una de las cadenas H y L contiene una Cys modificada por ingeniería. Las variantes 2, 3 y 4 tienen cambios en el inicio de la cadena H como se muestra en las Figuras 15B.
Las Figuras 15B-1, 15B-2, 15B-3, 15B-4 muestran una alineación de la cadena H de longitud completa (cadena pesada) del Ac 6078 anti-WTA beta (sin modificar) y sus variantes, v2, v3, v4 (SEQ ID NO: 114, 139-144 y 143, respectivamente, en orden de aparición) que tienen cambios en el inicio de la cadena H. Las variantes de la cadena H que contienen una Cys modificada por ingeniería se indican mediante la C en el cuadro negro al final de la región constante (en el resto EU n.° 118 en este caso).
Las Figuras 16A-1 y 16A-2 muestran una alineación de la cadena L de longitud completa del Ac 4497 anti-WTA beta (sin modificar) y las cadenas L modificadas por ingeniería con Cys (SEQ ID NO: 121, 123, 145 y 145, respectivamente, en orden de aparición). Las secuencias CDR, CDRL1, L2 y L3 de acuerdo con la numeración de Kabat están subrayadas. Los recuadros muestran los restos de contacto y los restos de las CDR de acuerdo con Kabat y Chothia. Las variantes de la cadena L que contienen una Cys modificada por ingeniería se indican mediante la C en el cuadro punteado al final de la región constante (en el resto EU n.° 205 en este caso).
Las Figuras 16B-1, 16B-2, 16B-3 muestran una alineación de la cadena H de longitud completa del Ac anti-WTA beta 4497 (sin modificar) y su variante v8 con D alterada a E en la posición 96 de CDR H3, con o sin la Cys modificada por ingeniería (SEQ ID NO: 146-147, 157 y 147, respectivamente, en orden de aparición). Las variantes de la cadena H que contienen una Cys modificada por ingeniería se indican mediante la C en el cuadro negro al final de la región constante (en el resto EU n.° 118 en este caso).
Las Figuras 17A-1, 17A-2, 17A-3 muestran una alineación de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de longitud total de los trece anticuerpos anti-WTA beta humanos (SEQ ID NO: 113, 158-167, 121 y 168, respectivamente, en orden de aparición). La región variable (VL) abarca las posiciones de aminoácidos de Kabat 1 a 107. Las secuencias CDR, CDRL1, L2 y L3 de acuerdo con la numeración de Kabat están subrayadas. Las Figuras 17B-1 a 17B-6 muestran una alineación de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa de los trece anticuerpos anti-WTA beta humanos de las Figuras 17A-1, 17A-2, 17A-3 (SEQ ID NO: 114, 169- 176, 133-134, 138 y 127, respectivamente, en orden de aparición). La región variable (VH) abarca las posiciones de aminoácidos de Kabat 1-113. Las secuencias CDR, CDR H1, H2 y H3 de acuerdo con la numeración de Kabat están subrayadas. La posición Eu 118 de la cadena H marcada con un asterisco se puede cambiar a Cys para la conjugación de fármacos. Los restos resaltados en negro se pueden reemplazar con otros restos que no afectan la unión del antígeno para evitar la desamidación, isomerización del ácido aspártico, oxidación o glicosilación ligada a N.
La Figura 18A muestra la unión de mutantes de Ac 4497 a la pared celular de S. aureus según se analiza mediante ELISA.
La Figura 18B muestra una comparación de Ac 4497 y sus mutantes (SEQ ID NO: 177, 177, 177-178, 178-179, 179-180, 180 y 180, respectivamente, en orden de aparición) en las posiciones destacadas de aminoácidos y su fuerza de unión a antígeno relativa según se prueba por ELISA.
La Figura 19 muestra los resultados del análisis FACS de Ac 6078 de tipo silvestre (WT) y mutantes que se unen a la cepa deficiente de proteína A de USA300 (USA300-SPA), tal se describe en el ejemplo 23. Los mutantes mostraron una unión intacta a S. aureus.
La Figura 20 muestra que el tratamiento previo con 50 mg/kg de anticuerpos libres no es eficaz en un modelo de infección intravenosa. Los ratones Balb/c recibieron una dosis única de vehículo control (PBS) o 50 mg/kg de anticuerpos por inyección intravenosa 30 minutos antes de la infección con 2x107 UFC de USA300. Los grupos de tratamiento incluyeron un anticuerpo de control de isotipo que no se une a S. aureus (gD), un anticuerpo dirigido contra la modificación beta del ácido teicoico de la pared (4497) o un anticuerpo dirigido contra la modificación alfa del ácido teicoico de la pared (7578). Los ratones control recibieron tratamientos dos veces al día con 110 mg/kg de vancomicina mediante inyección intraperitoneal (Vanco).
La Figura 21 y la Figura 22 muestran que los AAC dirigidos contra la modificación beta del ácido teicoico de la pared o contra la modificación alfa del ácido teicoico de la pared son eficaces en un modelo de infección intravenosa que usa ratones reconstituidos con niveles normales de IgG humana. Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero y se infectaron con 2x107 UFC de USA300 por inyección intravenosa. El tratamiento se inició 1 día después de la infección con control de solo tampón (PBS), 60 mg/Kg de AAC de WTA-beta (AAC 136) o 60 mg/Kg de AAC de WTA-alfa (AAC 155).
La Figura 23A y la Figura 23B muestran la síntesis del producto intermedio enlazador-antibiótico 51 a partir de 2-nitrobenceno-1,3-diol 1.
La Figura 24 muestra la síntesis del producto intermedio enlazador-antibiótico, MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 54 a partir de benzoxazina rifamicina 4 protegida con TBS.
La Figura 25A y la Figura 25B muestran la síntesis de dimetil pipBOR 7 a partir de (5-fluoro-2-nitro-1,3-fenilen)bis(oxi)bis(metilen)dibenceno 9.
La Figura 26 muestra la estructura de un sustrato peptídico de FRET para la validación de la escisión, mal-K(TAMRA)GGAFAGGGK(fluoresceína) (SEQ ID NO: 125) que contiene los restos más abundantes en PI, P2 y P3 a partir de la exploración REPLi de la actividad proteasa. Se conservaron los restos de Gly flanqueantes de la estructura REPLi del péptido de FRET. Un grupo de maleimida reactivo con tiol en el extremo N permitió la conjugación de los anticuerpos con cisteínas reactivas. Tras la escisión del péptido de FRET, se pierde el efecto desactivador y se observa un aumento en la fluorescencia.
La Figura 27 muestra la estructura de tioFAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126), un compuesto instrumental utilizado para identificar fracciones activas que contienen la proteasa de interés. Mal-GGAFAGGGDNA31 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126) se conjugó con THIOFAB 4497. Los THIOFAB contienen una cisteína reactiva. La proteasa de S. aureus escindió el enlazador C-terminal a Ala, liberando Gly-Gly-Gly-(pipBOR).
La Figura 28 y la Figura 29 muestran Aa C Mal-K(tamra)GGAFAGGGK(fluoresceína) (SEQ ID NO: 125) que se escinden en Wood46 (Figura 28) y USA300 (Figura 29) cuando se conjugan con un anticuerpo que se une a S. aureus (tio-S4497) y no cuando se conjugan con un anticuerpo que no se une a S. aureus (tio-trastuzumab). Intensidad de fluorescencia medida a lo largo del tiempo de tioMAB 4497 mal-K(tamra)GGAFAGGGK (fluoresceína) (SEQ ID NO: 125) incubado con cultivos en fase logarítmica de MRSA Wood46 y USA300. Los conjugados tioMAB 4497 péptido de FRET preparados a partir de malK(TAMRA)GGAFAGGGK(fluoresceína) (SEQ ID NO: 125) de la Figura 26 muestran un aumento en la fluorescencia en ambas cepas, indicando que el enlazador experimental se escinde por una proteasa de S. aureus y que la proteasa está presente en la cepa clínicamente relevante de MRSA, USA300 (Figura 29). La densidad celular afecta la tasa de escisión, produciéndose la escisión antes en cultivos de mayor densidad celular (108 células/ml). El conjugado de control de isotipo (tio-trastuzumab) no mostró un aumento de la fluorescencia en ninguna condición.
La Figura 30 muestra dos enlazadores optimizados para la escisión por estafopaína B en AAC. Enlazadores optimizados para escisión por estafopaína B, incluyendo las preferencias de restos para P4 y P1 '. Los enlazadores se diseñaron usando datos de la exploración REPLi. QSY7 se añadió al extremo C de cada enlazador para actuar como un sustituto de antibiótico.
La Figura 31 muestra los resultados del ensayo de macrófagos, demostrando que el AAC escindible por estafopaína es capaz de destruir bacterias intracelulares. La cepa USA300 de S. aureus se incubó con diferentes dosis (100 |jg/ml, 10 jg/ml, 1 jg/ml o 0,1 ug/ml) de anticuerpo S4497 solo, AAC-192 tio-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) o AAC-193 tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) para permitir la unión de los AAC a la bacteria (Figura 31). Después de 1 hora de incubación, las bacterias opsonizadas se proporcionaron a macrófagos murinos y se incubaron a 37 °C durante 2 horas para permitir la fagocitosis. Después de completar la fagocitosis, la mezcla de infección se reemplazó con medio de crecimiento normal complementado con 50 ug/ml de gentamicina para destruir cualquier bacteria extracelular restante y se determinó el número total de bacterias intracelulares supervivientes 2 días después sembrando en placa diluciones en serie de los lisados de macrófagos sobre placas de Agar de Soja Tríptico. El AAC escindible por estafopaína fue capaz de destruir las USA300 intracelular con una potencia similar en comparación con el AAC escindible por catepsina B. La línea discontinua gris indica el límite de detección para el ensayo (10 UFC/pocillo).
La Figura 32 muestra los resultados del ensayo de macrófagos, demostrando que el AAC escindible por estafopaína es capaz de destruir bacterias intracelulares. Los AAC dirigen la destrucción por antibiótico de S. aureus a través de la unión del anticuerpo específica de antígeno. Se eligió la cepa Wood46 de S. aureus para este experimento porque no expresa la proteína A, una molécula que se une a la región Fc de los anticuerpos IgG. La cepa Wood46 de S. aureus se incubó con 10 |jg/ml o 0,5 |jg/ml de anticuerpo S4497, AAC de control de isotipo que contiene un enlazador escindible por catepsina B, AAC-101 tio-trastuzumab HC A118C-MCvc-PAB-(dimetil-pipBOR), AAC-192 tio-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR), AAC de control de isotipo que contiene un enlazador escindible por estafopaína, tio-trastuzumab HC A118C-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128), o AAC-193 tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) durante 1 hora para permitir la unión de los AAC a las bacterias. Para limitar la unión no específica de los AAC, las bacterias opsonizadas se centrifugaron, se lavaron una vez y se resuspendieron en tampón antes de que se proporcionaran a los macrófagos murinos. Después de completar la fagocitosis, la mezcla de infección se reemplazó con medio de crecimiento normal complementado con 50 jg/ml de gentamicina para destruir cualquier bacteria extracelular restante y se determinó el número total de bacterias intracelulares supervivientes 2 días después sembrando en placa diluciones en serie de los lisados de macrófagos sobre placas de Agar de Soja Tríptico. El 4497-AAC que contiene un enlazador escindible por estafopaína fue capaz de destruir todas las bacterias intracelulares detectables, mientras que el AAC de control de isotipo no mostró actividad.
Las Figuras 33 y 34 muestran que AAC escindible por estafopaína está activo in vivo en un modelo murino de infección intravenosa. Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero. Los ratones fueron tratados con anticuerpo 4497(50 mg/kg), AAC-215 con enlazador escindible por estafopaína (50 mg/kg) o un control de isotipo, AAC anti-gD que contiene un enlazador escindible por estafopaína (50 mg/kg). Los ratones recibieron una dosis única de AAC-215 el día 1 después de la infección por inyección intravenosa. El número total de bacterias supervivientes en 2 riñones (Figura 33) o en el corazón (Figura 34) se determinó mediante siembra en placas.
Las Figuras 35 y 36 muestran los resultados del Ensayo de macrófagos in vitro para AAC tio-S6078. En la figura 35, el AAC tio-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) fue eficaz para destruir bacterias intracelulares a dosis iguales o superiores a 0,5 jg/ml con una carga antibiótica de 2,0 (AAC-173) o 3,9 (AAC-171) de antibióticos dimetilpipBOR ( LA-54) por anticuerpo tio-S6078. En la figura 36, tio-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR) fue eficaz para destruir bacterias intracelulares a dosis iguales o superiores a 0,5 jg/ml con una carga antibiótica de antibióticos piperazBOR (LA-65) de 1,8 (AAC-174) o 3,9 (AAC-172) por anticuerpo tio-S6078.
Las Figuras 37 y 38 muestran resultados de la eficacia in vivo de AAC tio-S6078 en un modelo murino de infección intravenosa. Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero. Los ratones fueron infectados con USA300 y tratados con vehículo control (PBS), AAC tio-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) con una carga antibiótica de 2,0 (AAC-173) o 3,9 (AAC-171) de antibióticos dimetilpipBOR (LA-54) por anticuerpo tio-S6078 (Figura 37) y tio -S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR) con una carga antibiótica de 1,8 (AAC-174) o 3,9 (a Ac-172) de antibióticos piperazBOR (LA-65) por anticuerpo tio-S6078 (Figura 38). Los ratones recibieron una dosis única de AAC el día 1 después de la infección mediante inyección intravenosa y se sacrificaron el día 4 después de la infección. El número total de bacterias supervivientes en 2 riñones se determinó mediante siembra en placas. El tratamiento con AAC que contenían una carga antibiótica más baja redujo las cargas bacterianas en aproximadamente 1.000 veces y el tratamiento con AAC que contenían una carga antibiótica más alta redujo las cargas bacterianas en más de 10.000 veces.
Descripción detallada de las realizaciones de la invención
A continuación, se hará referencia con detalle a determinadas realizaciones de la invención, ejemplos de las cuales se ilustran en las estructuras y fórmulas adjuntas. Aunque la invención se describirá junto con las realizaciones enumeradas, incluyendo métodos, materiales y ejemplos, dicha descripción no es limitante y la invención está destinada a abarcar todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, si son generalmente conocidos o incorporados en el presente documento. En el caso de que uno o más de la bibliografía, patentes y materiales similares incorporados difieran o contradigan la presente solicitud, incluyendo, pero sin limitación los términos definidos, el uso de los términos, las técnicas descritas o similares, la presente solicitud será la determinante. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Un experto en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podrían utilizarse en la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos.
I. TÉCNICAS GENERALES
Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en el presente documento generalmente se comprenden bien y se emplean comúnmente usando metodología convencional por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a Edición (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
La nomenclatura usada en esta solicitud se basa en la nomenclatura sistemática de la IUPAC, a menos que se indique lo contrario. A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención y son coherentes con: Singleton et al (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2.a Ed., J. Wiley & Sons, Nueva York, NY; y Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, Nueva York.
II. DEFINICIONES
Cuando se indica el número de sustituyentes, la expresión "uno o más" se refiere al intervalo desde un sustituyente hasta el mayor número de sustitución posible, es decir, reemplazo de un hidrógeno hasta el reemplazo de todos los hidrógenos por los sustituyentes. El término "sustituyente" indica un átomo o un grupo de átomos que reemplaza un átomo de hidrógeno en la molécula precursora. El término "sustituido" indica que un grupo específico lleva uno o más sustituyentes. Cuando cualquier grupo pueda portar múltiples sustituyentes y se proporcione varios posibles sustituyentes, los sustituyentes se seleccionan de manera independiente y no necesitan ser los mismos. La expresión "sin sustituir " significa que el grupo especificado no lleva sustituyentes. La expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo especificado no está sustituido o está sustituido por uno o más sustituyentes, elegido independientemente del grupo de posibles sustituyentes. Cuando se indica el número de sustituyentes, la expresión "uno o más" significa desde un sustituyente hasta el mayor número de sustitución posible, es decir, reemplazo de un hidrógeno hasta el reemplazo de todos los hidrógenos por los sustituyentes.
La expresión "ácido teicoico de pared" (WTA) significa glicopolímeros aniónicos que están fijados covalentemente al peptidoglicano a través de enlace fosfodiéster al hidroxilo C6 de los azúcares del ácido N-acetil-murámico. Si bien la estructura química precisa puede variar entre organismos, en una realización, el WTA es un ácido teicoico de ribitol con unidades repetitivas de enlaces 1,5-fosfodiéster de D-ribitol y D-alanil éster en la posición 2 y sustituyentes de glicosilo en la posición 4. Los grupos glicosilo pueden ser N-acetilglucosaminil a (alfa) o p (beta) como están presentes en S. Aureus. Los hidroxilos en las repeticiones de alditol/alcohol de azúcar fosfato se sustituyen con ésteres catiónicos de D-alanina y monosacáridos, tales como N-acetilglucosamina. En un aspecto, los sustituyentes hidroxilo incluyen D-alanilo y alfa (a) o beta (p) GlcNHAc. En un aspecto específico, WTA comprende un compuesto de la fórmula:
Figure imgf000020_0001
donde las líneas onduladas indican unidades de repetición de enlace o los sitios de fijación de polialditol-P o el peptidoglicano, donde X es D-alanilo o -H; e Y es a (alfa)-GlcNHAc o p (beta)-GlcNHAc.
Figure imgf000020_0002
En S. aureus, el WTA se une covalentemente al 6-OH del ácido N-acetil-murámico (MurNAc) a través de un disacárido compuesto por N-acetilglucosamina (GlcNAc)-1-P y N-acetilmanosamina (ManNAc), que está seguido por dos o tres unidades de glicerol-fosfato. El polímero WTA real se compone entonces de 11-40 unidades de repetición de ribitol-fosfato (Rbo-P). La síntesis gradual de WTA se inicia primero por la enzima llamada TagO y las cepas de S. aureus que carecen del gen TagO (por eliminación artificial del gen) no producen ningún WTA. Las unidades de repetición pueden adaptarse adicionalmente con D-alanina (D-Ala) en C2-OH y/o con N-acetilglucosamina (GlcNAc) en la posición C4-OH a través de enlaces glucosídicos a-(alfa) o p-(beta). Dependiendo de la cepa de S. aureus o de la fase de crecimiento de la bacteria, los enlaces glucosídicos podrían ser a -, p -, o una mezcla de los dos anómeros.
El término "antibiótico" (abx o Abx) incluye cualquier molécula que inhibe específicamente el crecimiento de o destruye los microorganismos, tales como bacterias, pero no es letal para el hospedador a la concentración e intervalo de dosificación administrados. En un aspecto específico, un antibiótico no es tóxico para el hospedador a la concentración e intervalos de dosificación administrados. Los antibióticos eficaces contra las bacterias pueden clasificarse ampliamente como bactericidas (es decir, destruye directamente) o bacteriostáticos (es decir, evita la división). Los antibióticos antibactericidas se pueden subclasificar adicionalmente como de espectro reducido o de amplio espectro. Un antibiótico de amplio espectro es eficaz contra una amplia gama de bacterias, incluidas las bacterias tanto Gram positivas como Gram-negativas, a diferencia de un antibiótico de espectro reducido, que es eficaz contra una gama más pequeña o familias específicas de bacterias. Ejemplos de antibióticos incluyen: (i) aminoglucósidos, por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromicina, (ii) ansamicinas, por ejemplo, geldanamicina, herbimicina, (iii) carbacefémicos, por ejemplo, loracarbef, (iv), carbapenémicos, por ejemplo, ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina, meropenem, (v) cefalosporinas (primera generación), por ejemplo, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefalexina, (vi) cefalosporinas (segunda generación), por ejemplo, ceflaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozilo, cefuroxima, (vi) cefalosporinas (tercera generación), por ejemplo, cefixima, cefdinir, cefditoreno, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, (vii) cefalosporinas (cuarta generación), por ejemplo, cefepima, (viii), cefalosporinas (quinta generación), por ejemplo, ceftobiprol, (ix) glucopéptidos, por ejemplo, teicoplanina, vancomicina, (x) macrólidos, por ejemplo, axitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina, (xi) monobactamas, por ejemplo, axtreonam, (xii) penicilinas, por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, axlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina, peperacilina, ticarcilina, (xiii) polipéptidos antibióticos, por ejemplo, bacitracina, colistina, polimixina B, (xiv) quinolonas, por ejemplo, ciprofloxacino, enoxacino, gatifloxacino, levofloxacino, lomefloxacina, moxifloxacino, norfloxacino, orfloxacina, trovafloxacino, (xv) sulfonamidas, por ejemplo, mafenida, prontosil, sulfacetamida, sulfametizol, sulfanilamida, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim, trimetoprimsulfametoxazol (TMP-SMX), (xvi) tetraciclinas, por ejemplo, desmeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina y (xvii) otros tales como arspenamina, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, ácido fusídico, furazolidona, isoniazid, linezolida, metronidazol, mupirocina, nitrofurantoína, platensimicina, pirazinamida, quinupristina/dalfopristina, rifampina/rifampicina o tinidazol.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo de WTA" se refiere a cualquier anticuerpo que se una a WTA, ya sea WTA alfa o WTA beta. Las expresiones "anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared alfa " o "anticuerpo anti-WTA alfa" o "anticuerpo anti-aWTA" o "anticuerpo anti-WTA aGlcNac" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo que se une específicamente a ácidos teicoicos de pared (WTA) alfa. De manera análoga, las expresiones "anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared beta " o "anticuerpo anti-WTA beta " o "anticuerpo antipWTA" o "anticuerpo anti-WTA pGlcNac" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo que se une específicamente a ácidos teicoicos de pared (WTA) beta. Las expresiones "anticuerpo antiestafilococo" y "un anticuerpo que se une a estafilococo" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a un antígeno en Staphylococcus aureus ("estafilococo" o "S. aureus") con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico actuando de forma selectiva contra estafilococo. En una realización, el alcance de la unión de un anticuerpo antiestafilococo a una proteína no relacionada, proteína no de estafilococos menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a MRSA como se mide, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a estafilococo tiene una constante de disociación (Kd) de <1 j M, < 100 nM, < 10 nM, < 5 Nm,, < 4 nM, < 3 nM, < 2 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menor, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10' 13 M). En determinadas realizaciones, un anticuerpo antiestafilococo se une a un epítopo de estafilococo que se conserva entre estafilococos de diferentes especies.
La expresión "Staphylococcus aureus resistente a meticilina" (MRSA), conocido de manera alternativa como Staphylococcus aureus resistente a múltiples fármacos o Staphylococcus aureus resistente a oxacilina (ORSA, por sus siglas en inglés), se refiere a cualquier cepa de Staphylococcus aureus que es resistente a antibióticos betalactámicos, que incluyen las penicilinas (por ejemplo, meticilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, etc.) y las cefalosporinas. "Staphylococcus aureus sensible a meticilina"(MSS por sus siglas en inglés) se refiere a cualquier cepa de Staphylococcus aureus que es sensible a los antibióticos betalactámicos.
La expresión "concentración inhibidora mínima" ("MIC, por sus siglas en inglés") se refiere a la concentración más baja de un agente antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo después de la incubación durante la noche. Se conocen ensayos para determinar la MIC. Un método es como se describe en el Ejemplo 18 a continuación.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, (Miller et al (2003) J. of Immunology 170:4854-4861). Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos o derivados de otras especies. Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmunitario que es capaz de reconocer y unirse a un antígeno específico (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a ed., Garland Publishing, Nueva York). Un antígeno diana tiene generalmente numerosos sitios de unión, también denominados epítopos, reconocidos por las CDR en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Por lo tanto, un antígeno puede ser reconocido y estar unido por más de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una parte inmunitariamente activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión a antígeno que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno de una diana de interés o parte de la misma, incluyendo dichas dianas, pero sin limitación, célula o células cancerosas que producen anticuerpos autoinmunitarios asociados con una enfermedad autoinmunitaria, una célula infectada o un microorganismo tal como una bacteria. La inmunoglobulina (Ig) divulgada en el presente documento puede ser de cualquier isotipo excepto IgM (por ejemplo, IgG, IgE, IgD e IgA) y subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Las inmunoglobulinas pueden derivar de cualquier especie. En un aspecto, la Ig es de origen humano, murino o de conejo. En una realización específica, la Ig es de origen humano.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi , IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente.
"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con diversas estructuras. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras indénticas y dos cadenas pesadas indénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Del extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CHI, CH2 y CH3). De manera análoga, del extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada dominio variable ligero o dominio variable de cadena ligera, seguido de un dominio variable constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (k) y lambda (A), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto", y "anticuerpo completo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
Un "fragmento de unión a antígeno" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, salvo por posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, variación natural en la glucosilación), estando presentes dichas variantes generalmente en cantidades menores. Una de estas posibles variantes para los anticuerpos IgG1 es la escisión de la lisina (K) C-terminal de la región constante de cadena pesada. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen generalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden producirse mediante diversas técnicas, incluyendo pero, sin limitación, el método de hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulinas humanas, siendo descritos tales métodos y otros métodos a modo de ejemplo para hacer anticuerpos monoclonales en el presente documento. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin estar contaminados por otros anticuerpos.
La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o que deriva de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpo humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpo humanas. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenda restos de unión a antígeno no humanos.
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende restos de aminoácidos de HVR no humanas y restos de aminoácidos de FR humanas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano y la totalidad o sustancialmente todas las FR corresponden a aquellas de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen generalmente estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (FR, por sus siglas en inglés) y tres regiones hipervariables (HVR, por sus siglas en inglés). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para explorar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
La expresión "región hipervariable", "HVR", o "HV" cuando se usa en el presente documento se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en su secuencia ("regiones determinantes de complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles definidos estructuralmente y/o contienen los restos que entran en contacto con el antígeno ("contactos de antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en la VH (HI, H2, H3) y tres en la VL (LI, L2, L3). En anticuerpos naturales, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis CDR, y se cree que H3 en particular desempeña un papel único en conferir una especificidad delicada a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos de camélidos de origen natural que consisten en una cadena pesada únicamente son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera (Hamers-Casterman et al., (1993) Nature 363:446-448; Sheriff et al., (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736).
Están en uso varias delimitaciones de HVR y se abarcan en el presente documento. Las Regiones Determinantes de la Complementariedad de Kabat (CDR) se basan en la variabilidad de secuencia y son las más utilizadas habitualmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md . (1991)). Chothia se refiere, en cambio, a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). Para contactos de antígeno, consúltese MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996). Las HVR de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los restos de cada una de estas HVR se indican a continuación.
Bucle Kabat AbM Chothia Contacto
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración Kabat)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (LI), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 u 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (HI), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en la VH. A menos que se indique lo contrario, los restos de HVR, los restos de CDR y otros restos en el dominio variable (por ejemplo, restos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.
La expresión "numeración de restos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos como en Kabat" y variaciones de los mismos, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de o inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácido (resto 52a de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón".
"Marco" o "FR" se refiere a restos de dominio variable distintos de restos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Un "marco aceptor humano", para los fines del presente documento, es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano, como se define a continuación. Un marco aceptor humano "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco consenso humano pueden comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas realizaciones, el marco humano aceptor de VL es idéntico en secuencia a la secuencia marco de inmunoglobulina humana o a la secuencia marco conservada de consenso humana VL.
Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los restos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias marco VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de las secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es a partir de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, NIH Publicación 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En una realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En una realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.
"Afinidad " se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede estar representada en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más de las regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo precursor que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
El término "epítopo" se refiere al sitio particular en una molécula de antígeno al que se une un anticuerpo.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento, se proporciona un ensayo de competencia a modo de ejemplo.
Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.
La expresión "funciones efectoras" se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (c Dc , por sus siglas en inglés); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; y activación de linfocitos B.
La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde la Ig secretada unida a receptores Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan de manera específica a una célula diana portadora del antígeno y posteriormente destruyan a la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son necesarios para destruir la célula diana por este mecanismo. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos Nk , expresan solo FcY(gamma)RIII, mientras que los monocitos expresan FcY(gamma)RI, FcY(gamma)RII y Fcy(gamma)RllI. La expresión Fc en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como se describe en los documentos US 5.500.362 o US 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Como alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).
"Fagocitosis" se refiere a un proceso por el cual un patógeno es engullido o internalizado por una célula hospedadora (por ejemplo, macrófago o neutrófilo). Los fagocitos median la fagocitosis por tres vías: (i) receptores directos de la superficie celular (por ejemplo, lectinas, integrinas y receptores eliminadores) (ii) complemento potenciado- usando receptores del complemento (incluyendo CRI, receptor para C3b, CR3 y CR4) para unir e ingerir patógenos opsonizados del complemento y (iii) anticuerpos potenciados, utilizando receptores Fc (incluidos FcygammaRI, FcYgammaRIIA y FcygammaRIIIA) para unir partículas opsonizadas de anticuerpos que después se internalizan y se fusionan con los lisosomas para convertirse en fagolisososomas. En la presente invención, se cree que la vía (iii) desempeña un papel importante en la administración de agentes terapéuticos AAC anti-MRSA a leucocitos infectados, por ejemplo, neutrófilos y macrófagos (Phagocytosis of Microbes: complexity in Action by D. Underhill and A Ozinsky. (2002) Annual Review of Immunology, Vol 20:825).
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
La expresión "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La expresión incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada de lgG humana habitualmente se define que se extiende desde un resto de aminoácido en la posición Cys226 o desde Pro230, al extremo carboxilo de la misma. La lisina C-terminal (resto 447 según el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los restos de K447 eliminados, poblaciones sin restos de K447 eliminador y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin resto K447. La expresión "receptor Fc" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto. Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994). Se conocen métodos para medir la unión a FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.). La unión a FcRn in vivo y la semivida en suero de polipéptidos de unión a alta afinidad de FcRn humano puede analizarse, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran los polipéptidos que tienen una región Fc variante. El documento WO 2004/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos que mejoran o disminuyen la unión a los FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
El hidrato de carbono fijado a la región Fc puede alterarse. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden generalmente un oligosacárido biantenario, ramificado que está fijado generalmente mediante un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32. El oligosacárido puede incluir diversos hidratos de carbono, por ejemplo, manosa, N-acetil glucosamina (GIcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a un GIcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en una IgG para preparar IgG con determinadas propiedades mejoradas adicionalmente. Por ejemplo, se proporcionan modificaciones de anticuerpos que tienen una estructura de hidrato de carbono que carece de fucosa fijada (directa o indirectamente) a una región Fc. Dichas modificaciones pueden haber mejorado la función de ADCC. Véase, por ejemplo, el documento US 2003/0157108 (Presta, L.); el documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Ejemplos de publicaciones relacionadas con modificaciones de anticuerpos "defucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: el documento US 2003/0157108; el documento WO 2000/61739; el documento WO 2001/29246; el documento US 2003/0115614; el documento US 2002/0164328; el documento US 2004/0093621; el documento US 2004/0132140; el documento US 2004/0110704; el documento US 2004/0110282; el documento US 2004/0109865; el documento WO 2003/085119; el documento WO 2003/084570; el documento WO 2005/035586; el documento WO 2005/035778; el documento WO2005/053742; el documento WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células Lee 13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11) y estirpes celulares desactivadas, tales como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO desactivadas (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).
Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina por, por ejemplo, medios electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa). Para revisar los métodos de evaluación de la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico incluido en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente a su ubicación cromosómica natural.
"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-WTA beta" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, incluyendo dichas moléculas de ácido nucleico en un solo vector o vectores separados, y dichas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones de una célula hospedadora.
Como se usa en el presente documento, la expresión "se une específicamente a" o es "específico para" se refiere a interacciones medibles y reproducibles, tales como la unión entre un diana y un anticuerpo, que es determinante de la presencia del diana en presencia de una población heterogénea de moléculas que incluyen moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un diana (que puede ser un epítopo) es un anticuerpo que se une a este diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otras dianas. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo a un diana no relacionada con WTA-beta es menor que aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a la diana como se mide, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une específicamente a WTA beta tiene una constante de disociación (Kd) de <1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. En determinadas realizaciones, un anticuerpo se une específicamente a un epítopo que se conserva de diferentes especies. En otra realización, se puede incluir la unión específica, pero no requiere unión exclusiva.
"Afinidad de unión" se refiere generalmente a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, la "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede estar representada en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos durante más tiempo. Se conoce diversos métodos de medición de la afinidad de unión en la técnica, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención. A continuación se describen realizaciones específicas ilustrativas y a modo de ejemplo para medir la afinidad de unión.
En una realización, la "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe mediante el siguiente ensayo. La afinidad de unión a la solución de Fab por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, capturando después el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microtitulación (DYNEX Technologies, Inc.) se recubren durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato sódico 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con albúmina de suero bovino al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezclan antígeno [125I] 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Después, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. A partir de entonces, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). La solución se retira después y la placa se lava ocho veces con tensioactivo TWEEN-20™ al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos o igual al 20 % de la unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra realización, la Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, nJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizados en ~ 10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, se activan los chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 jg/ml (~0,2 j M) antes de la inyección a un caudal de 5 jl/min para alcanzar aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de la proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones en serie de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo TWEEN 20™ al 0,05 % (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión Langmuir simple uno a uno (Programa informático de evaluación BIACORE® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensorgramas de asociación y disociación. La constante de disociación en el equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la constante de asociación supera 106 M-1 s-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, la constante de asociación puede determinarse utilizando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Una "constante de asociación", "tasa de asociación", "velocidad de asociación", o "kon"de acuerdo con esta invención también se puede determinar como se describe anteriormente usando un sistema BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).
Las expresiones "célula hospedadora", "línea celular hospedadora", y "cultivo de células hospedadoras" se usan indistintamente y se refiere a células en las cuales se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células hospedadoras incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula primaria transformada y la progenie derivada de esta independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula precursora, pero puede contener mutaciones. Se incluye en el presente documento la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica explorada o seleccionada en la célula transformada originalmente.
El término "vector", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. El término incluye el vector en forma de una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en donde se ha introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión".
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" respecto de la secuencia de un polipéptido de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin tener en cuenta ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, b La ST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros necesarios para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. A efectos del presente documento, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue programado por Genentech, Inc., y el código fuente, junto con la documentación para usuarios, se han depositado en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, donde está registrada con el n.° de Registro de Derechos de Autor de los Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., Sur de San Francisco, California o puede compilarse a partir de su código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A para, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que puede, como alternativa, citarse como una secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un % determinado de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o frente a una secuencia de aminoácidos B) se calcula del modo siguiente: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de A respecto de B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto de A. A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe.
La expresión "antibiótico de tipo rifamicina" significa la clase o grupo de antibióticos que tienen la estructura de, o estructura similar a, rifamicina.
La expresión "antibiótico de tipo rifalazil" significa la clase o grupo de antibióticos que tienen la estructura de, o estructura similar a, rifalazil.
Cuando se indica el número de sustituyentes, la expresión "uno o más" se refiere al intervalo desde un sustituyente hasta el mayor número de sustitución posible, es decir, reemplazo de un hidrógeno hasta el reemplazo de todos los hidrógenos por los sustituyentes. El término "sustituyente" indica un átomo o un grupo de átomos que reemplaza un átomo de hidrógeno en la molécula precursora. El término "sustituido" indica que un grupo específico lleva uno o más sustituyentes. Cuando cualquier grupo pueda portar múltiples sustituyentes y se proporcione varios posibles sustituyentes, los sustituyentes se seleccionan de manera independiente y no necesitan ser los mismos. La expresión "no sustituido" significa que el grupo especificado no lleva sustituyentes. La expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo especificado no está sustituido o está sustituido por uno o más sustituyentes, elegido independientemente del grupo de posibles sustituyentes. Cuando se indica el número de sustituyentes, la expresión "uno o más" significa desde un sustituyente hasta el mayor número de sustitución posible, es decir, reemplazo de un hidrógeno hasta el reemplazo de todos los hidrógenos por los sustituyentes.
El término "alquilo" como se usa en el presente documento se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente de cadena lineal o ramificada saturado de uno a doce átomos de carbono (C1-C12), en donde el radical alquilo puede estar opcionalmente sustituido independientemente con uno o más sustituyentes descritos a continuación. En otra realización, un radical alquilo es de uno a ocho átomos de carbono (C1-C8), o de uno a seis átomos de carbono (C1-Ca). Ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero sin limitación, metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1 -propilo (n-Pr, npropilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, f-butilo, -C(CH3)3), 1 -pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1 -butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-heptilo, 1-octilo y similares.
El término "alquileno", como se usa en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarbonado divalente de cadena lineal o ramificada saturado de uno a doce átomos de carbono (C1-C12), en donde el radical alquileno puede estar opcionalmente sustituido independientemente con uno o más sustituyentes descritos a continuación. En otra realización, un radical alquileno tiene de uno a ocho átomos de carbono (C1-C8), o de uno a seis átomos de carbono (C1-Ca). Ejemplos de grupos alquileno incluyen, pero sin limitación, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), propileno (-CH2CH2CH2-) y similares.
El término "alquenilo" se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente de cadena lineal o ramificada de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2 carbonocarbono, en donde el radical alquenilo puede estar opcionalmente sustituido independientemente con uno o más de los sustituyentes descritos en el presente documento e incluye radicales que tienen orientaciones "cis" y "trans" o, como alternativa, orientaciones "E" y "Z". Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, etilenilo o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2) y similares.
El término "alquenileno" se refiere a un radical hidrocarbonado divalente de cadena lineal o ramificada de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2 carbono-carbono, donde el radical alquenileno puede estar opcionalmente sustituido independientemente con uno o más de los sustituyentes descritos en el presente documento e incluye radicales que tienen orientaciones "cis" y "trans" o, como alternativa, orientaciones "E" y "Z". Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, etilenileno o vinileno (-CH=CH-), alilo (-CH2CH=CH-) y similares.
El término "alquinilo" se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente lineal o ramificado de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp carbono-carbono, en donde el radical alquinilo puede estar opcionalmente sustituido independientemente con uno o más sustituyentes descritos en el presente documento. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, etinilo (-CECH), propinilo (propargilo, -CH2CECH), y similares.
El término "alquinileno" se refiere a un radical hidrocarbonado divalente lineal o ramificado de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp carbono-carbono, en donde el radical alquinileno puede estar opcionalmente sustituido independientemente con uno o más sustituyentes descritos en el presente documento. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, etinileno (-CEC-), propinileno (propargileno, -CH2CEC-), y similares.
Los términos "carbociclo", "carbociclilo", "anillo carbocíclico" y "cicloalquilo" se refieren a un anillo monovalente no aromático, saturado o parcialmente insaturado que tiene de 3 a 12 átomos de carbono (C3-C12) como un anillo monocíclico o de 7 a 12 átomos de carbono como un anillo bicíclico. Los carbociclos bicíclicos que tienen de 7 a 12 átomos se pueden disponer, por ejemplo, como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] y los carbociclos bicíclicos que tienen 9 o 10 átomos en el anillo se pueden disponer como un sistema biciclo [5,6] o [6,6], o como sistemas puente tal como biciclo [2.2.1] heptano, biciclo [2.2.2] octano y biciclo [3.2.2] nonano. También se incluyen restos espiro dentro del alcance de esta definición. Ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, ciclohexadienilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo, ciclododecilo y similares. Los grupos carbociclilo están opcionalmente sustituidos independientemente con uno o más sustituyentes descritos en el presente documento.
"Arilo" significa un radical hidrocarbonado aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C20) obtenido por la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático precursor. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras a modo de ejemplo como "Ar". Arilo incluye radicales bicíclicos que comprenden un anillo aromático fusionado a un anillo saturado, parcialmente insaturado o a un anillo carbocíclico aromático. Los grupos arilo típicos incluyen, pero sin limitación, radicales derivados de benceno (por ejemplo, fenilo), bencenos sustituidos, naftaleno, antraceno, bifenilo, indenilo, indanilo, 1 ,2-dihidronaftaleno, 1,2,3,4-tetrahidronaftilo y similares. Los grupos arilo están opcionalmente sustituidos independientemente con uno o más sustituyentes descritos en el presente documento.
"Arileno" significa un radical hidrocarbonado aromático divalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C20) obtenido por la eliminación de dos átomos de hidrógeno de dos átomos de carbono de un sistema de anillo aromático precursor. Algunos grupos arileno se representan en las estructuras a modo de ejemplo como "Ar". Arileno incluye radicales bicíclicos que comprenden un anillo aromático fusionado a un anillo saturado, parcialmente insaturado o a un anillo carbocíclico aromático. Los grupos arileno típicos incluyen, pero sin limitación, radicales derivados de benceno (fenileno), bencenos sustituidos, naftaleno, antraceno, bifenileno, indenileno, indanileno, 1 ,2-dihidronaftaleno, 1,2,3,4-tetrahidronaftilo y similares. Los grupos arileno están opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes descritos en el presente documento.
Los términos "heterociclo", "heterociclilo" y "anillo heterocíclico" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un radical carbocíclico saturado o parcialmente insaturado (es decir, que tiene uno o más enlaces dobles y/o triples dentro del anillo) de 3 a aproximadamente 20 átomos en el anillo en el que al menos un átomo en el anillo es un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre, siendo el resto de los átomos en el anillo C, donde uno o más átomos en el anillo están opcionalmente sustituidos independientemente con uno o más sustituyentes descritos a continuación. Un heterociclo puede ser un monociclo que tenga de 3 a 7 miembros en el anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S) o un biciclo que tenga de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 6 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6]. Se describen heterociclos en Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), en particular los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; The Chemistry of Heterociclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta la actualidad), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; and J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "Heterociclilo" también incluye radicales donde los radicales heterociclo están fusionados con un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo carbocíclico o heterocíclico aromático. Ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen, pero sin limitación, morfolin-4-ilo, piperidin-1-ilo, piperazinilo, piperazina-4-il-2-ona, piperazina-4-il-3-ona, pirrolidin-1-ilo, tiomorfolin-4-ilo, S-dioxotiomorfolin-4-ilo, azocan-1-ilo, azetidin-1-ilo, octahidropirido[1,2-a] pirazin-2-ilo, [1,4] diazepan-1-ilo, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo[3.1.0]hexanilo, 3-azabiciclo[4.1.0]heptanilo, azabiciclo[2.2.2]hexanilo, 3H-indolil quinolizinilo y N-piridilureas. También se incluyen restos espiro dentro del alcance de esta definición. Ejemplos de un grupo heterocíclico en donde 2 átomos de carbono en el anillo están sustituidos con restos oxo (=O) son pirimidindionilo y 1,1-dioxotiomorfolinilo. Los grupos heterociclo del presente documento están opcionalmente sustituidos independientemente con uno o más sustituyentes descritos en el presente documento.
El término "heteroarilo" se refiere a un radical aromático monovalente de anillos de 5, 6 o 7 miembros, e incluye sistemas de anillos fusionados (al menos uno de los cuales es aromático) de 5-20 átomos, que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre. Ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo (que incluye, por ejemplo, 2-hidroxipiridinilo), imidazolilo, imidazopiridinilo, pirimidinilo (incluyendo, por ejemplo, 4-hidroxipirimidinilo), pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxadiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, indolilo, benzoimidazolilo, benzofuranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo y furopiridinilo. Los grupos heteroarilo están opcionalmente sustituidos independientemente con uno o más sustituyentes descritos en el presente documento. Los grupos heterociclo o heteroarilo pueden estar unidos a carbono (enlazado a carbono) o a nitrógeno (enlazado a nitrógeno) cuando sea posible. A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5, o 6 de una piridina, posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5, o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4, o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3, o 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una isoquinolina.
A modo de ejemplo y no de limitación, heterociclos o heteroarilos unidos a nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posición 2 de un isoindol o isoindolina, posición 4 de una morfolina y posición 9 de un carbazol o p-carbolina.
Un "metabolito" es un producto producido a través del metabolismo, en el cuerpo, de un compuesto específico o una sal del mismo. Los metabolitos de un compuesto pueden identificarse usando técnicas habituales conocidas en la técnica y se determinan sus actividades usando ensayos como los descritos en el presente documento. Dichos productos pueden ser el resultado, por ejemplo, de la oxidación, reducción, hidrólisis, amidación, desamidación, esterificación, desesterificación, escisión enzimática y similares, del compuesto administrado. Por consiguiente, la invención incluye metabolitos de compuestos de la invención, incluyendo los compuestos producidos mediante un proceso que comprende poner en contacto un compuesto de Fórmula I de la presente invención, con un mamífero durante un periodo de tiempo suficiente para producir un producto metabólico del mismo.
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que sea eficaz la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.
Una formulación "estable" es aquella en donde la proteína en la misma conserva de forma esencial su estabilidad e integridad física y química tras el almacenamiento. Están disponibles en la técnica, diferentes técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. Para la exploración rápida, la formulación puede mantenerse a 40 °C durante 2 semanas a 1 mes, momento en el que se mide la estabilidad. Cuando la formulación debe almacenarse a 2-8 °C, generalmente la formulación debe ser estable a 30 °C o 40 °C durante al menos 1 mes y/o estable a 2-8 °C durante al menos 2 años. Cuando la formulación se almacene a 30 °C, generalmente la formulación debe ser estable durante al menos 2 años a 30 °C y/o estable a 40 °C durante al menos 6 meses. Por ejemplo, el grado de agregación durante el almacenamiento puede usarse como un indicador de la estabilidad de la proteína. Por lo tanto, una formulación "estable" puede ser aquella en donde menos del 10 % y preferentemente menos del 5 % de la proteína están presentes como un agregado en la formulación. En otras realizaciones, se puede determinar cualquier aumento en la formación de agregados durante el almacenamiento de la formulación.
Una formulación "isotónica" es aquella que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. El término "hipotónica" describe una formulación con una presión osmótica inferior a la de la sangre humana. De manera correspondiente, el término "hipertónica" se utiliza para describir una formulación con una presión osmótica superior a la de la sangre humana. La isotonicidad se puede medir usando un osmómetro de presión de vapor o de congelación en hielo, por ejemplo. Las formulaciones de la presente invención son hipertónicas como resultado de la adición de sal y/o tampón.
Los "vehículos" tal como se usan en el presente documento incluyen vehículos, excipientes, o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa a pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN®, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante. Un "ácido farmacéuticamente aceptable" incluye ácidos inorgánicos y orgánicos que no son tóxicos a la concentración y la forma en que se formulan. Por ejemplo, ácidos inorgánicos adecuados incluyen clorhídrico, perclórico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, sulfónico, sulfínico, sulfanílico, fosfórico, carbónico, etc. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen alquilos de cadena lineal y ramificada, aromáticos, cíclicos, cicloalifáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, saturados, insaturados, mono, di y tricarboxílicos, incluyendo, por ejemplo, fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoroacético, fenilacético, trimetilacético, t-butil acético, antranílico, propanoico, 2-hidroxipropanoico, 2-oxopropanoico, propanodioico, ciclopentanopropiónico, ciclopentano propiónico, 3-fenilpropiónico, butanoico, butandioico, benzoico, 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, 2-acetoxibenzoico, ascórbico, cinámico, laurilsulfúrico, esteárico, mucónico, mandélico, succínico, embónico, fumárico, málico, maleico, hidroximaleico, malónico, láctico, cítrico, tartárico, glicólico, glucónico, glucónico, pirúvico, glioxálico, oxálico, mesílico, succínico, salicílico, ftálico, palmoico, palmeico, tiociánico, metanosulfónico, etanosulfónico, 1 ,2-etanodisulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, bencenosulfónico, 4-clorobencenosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, ptoluenosulfónico, canforsulfónico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, glucoheptónico, 4,4'-metilenbis-3-(ácido hidroxi-2-eno-1-carboxílico), hidroxinaftoico.
Las "bases farmacéuticamente aceptables" incluyen bases inorgánicas y orgánicas que no son tóxicas a la concentración y de la forma en que se formulan. Por ejemplo, bases adecuadas incluyen aquellas formadas a partir de metales que forman bases inorgánicas tales como litio, sodio, potasio, magnesio, calcio, amonio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio, N-metilglucamina, morfolina, piperidina y bases orgánicas no tóxicas que incluyen, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, [por ejemplo, N(R ')4+ (donde R' es independientemente H o alquilo C1-4, por ejemplo, amonio, Tris)], por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Son bases orgánicas no tóxicas particularmente preferidas isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina y cafeína.
Los ácidos y bases farmacéuticamente aceptables adicionales que se pueden usar con la presente invención incluyen aquellos derivados de los aminoácidos, por ejemplo, histidina, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y asparagina.
Los tampones y sales "farmacéuticamente aceptables" incluyen aquellos derivados de las sales de adición tanto de ácido como de base de los ácidos y bases indicados anteriormente. Los tampones y/o sales específicos incluyen histidina, succinato y acetato.
Un "azúcar farmacéuticamente aceptable" es una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés, previene o reduce significativamente la inestabilidad química y/o física de la proteína durante el almacenamiento. Cuando la formulación se pretende liofilizar y después reconstituir, los "azúcares farmacéuticamente aceptables" también pueden conocerse como un "lioprotector". Azúcares a modo de ejemplo y sus correspondientes alcoholes de azúcar incluyen: un aminoácido tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaína; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes de azúcar trihídricos o de peso molecular superior, por ejemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; PLURONICS®; y combinaciones de los mismos. Lioprotectores adicionales a modo de ejemplo incluyen glicerina y gelatina, y los azúcares melibiosa, melecitosa, rafinosa, manotriosa y estaquiosa. Ejemplos de azúcares reductores incluyen glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, isomaltulosa y lactulosa. Ejemplos de azúcares no reductores incluyen glucósidos no reductores de compuestos polihidroxilados seleccionados de alcoholes de azúcar y otros polialcoholes de cadena lineal. Los alcoholes de azúcar preferidos son los monoglucósidos, especialmente aquellos compuestos obtenidos por reducción de disacáridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo lateral glicosídico puede ser glucosídico o galactosídico. Ejemplos adicionales de alcoholes de azúcar son glucitol, maltitol, lactitol e isomaltulosa. Los azúcares farmacéuticamente aceptables preferidos son los azúcares no reductores trehalosa o sacarosa. Los azúcares farmacéuticamente aceptables se añaden a la formulación en una "cantidad protectora" (por ejemplo, previo a la liofilización), lo que significa que la proteína esencialmente conserva su estabilidad e integridad física y química durante el almacenamiento (por ejemplo, después de la reconstitución y el almacenamiento).
El "diluyente" de interés en el presente documento es aquel que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para la administración a un ser humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida, tal como una formulación reconstituida después de la liofilización. Diluyentes a modo de ejemplo incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI por sus siglas en inglés), solución a pH tamponado (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer y solución de dextrosa. En una realización alternativa, los diluyentes pueden incluir soluciones acuosas de sales y/o tampones.
Un "conservante" es un compuesto que se puede añadir a las formulaciones en el presente documento para reducir la actividad bacteriana. La adición de un conservante puede, por ejemplo, facilitar la producción de una formulación de usos múltiples (dosis múltiples). Ejemplos de posibles conservantes incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio) en los que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservante más preferido en el presente documento es el alcohol bencílico.
Un "individuo" o "sujeto" o "paciente" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tal como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica diseñada para alterar el curso natural del individuo, tejido o célula a tratar durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero sin limitación, disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad, mejorar o paliar la patología y remisión o pronóstico mejorado, todo medible por un experto en la materia, como un médico. En una realización, el tratamiento puede significar alivio de los síntomas, disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, disminución de la velocidad de progresión de la enfermedad infecciosa, mejora o paliación de la patología y remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para frenar la progresión de una enfermedad infecciosa.
Tal como se usa en el presente documento, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.
El término "fagosoma" se refiere a un depósito endocítico cerrado por una membrana internalizada de una célula fagocítica. Puede ser iniciado por fagocitosis directa, potenciada por anticuerpos o complemento. El término "fagolisosoma" se refiere a un depósito celular internalizado que se ha fusionado con uno o más lisosomas.
Las bacterias se dividen tradicionalmente en dos grupos principales, Gram positivas (Gm ) y Gram negativas (Gm-), basándose en su retención de la tinción de Gram. Las bacterias Gram positivas están limitadas por una membrana lipídica de una sola unidad y, generalmente, contienen una capa gruesa (20-80 nm) de peptidoglicano responsable de retener la tinción de Gram. Las bacterias Gram positivas son aquellas que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram. Por el contrario, las bacterias Gram negativas no pueden retener la tinción de cristal violeta, en su lugar, captan la contratinción (safranina o fucsina) y que aparece de color rojo o rosa. Las paredes celulares Gram positivas generalmente carecen de la membrana externa que se encuentra en las bacterias Gram negativas.
El término "bacteriemia" se refiere a la presencia de bacterias en el torrente sanguíneo que se detecta con mayor frecuencia a través de un cultivo de sangre. Las bacterias pueden ingresar al torrente sanguíneo como una complicación grave de las infecciones (como neumonía o meningitis), durante la cirugía (especialmente cuando implica membranas mucosas como el tracto gastrointestinal), o debido a catéteres y otros cuerpos extraños que ingresan a las arterias o venas. La bacteriemia puede tener varias consecuencias. La respuesta inmunitaria a la bacteria puede causar sepsis y shock séptico, que tiene una tasa de mortalidad relativamente alta. Las bacterias también pueden usar la sangre para propagarse a otras partes del cuerpo, causando infecciones lejos del sitio original de infección. Los ejemplos incluyen endocarditis u osteomielitis.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es la concentración mínima necesaria para lograr una mejora medible de un trastorno particular. Una cantidad terapéuticamente eficaz, en el presente documento, puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, edad, sexo y peso del paciente y de la capacidad del anticuerpo para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es aquella en la que los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para reducir la bacteriemia en una infección in vivo. En un aspecto, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es al menos la cantidad eficaz para reducir la carga bacteriana o las unidades formadoras de colonias (UFC) aisladas de una muestra de paciente, tal como sangre, en al menos uno en escala logarítmica con respecto a antes de la administración del fármaco. En un aspecto más específico, la reducción es de al menos 2 en escala logarítmica. En otro aspecto, la reducción es de 3, 4, 5 en escala logarítmica. En otro aspecto más, la reducción es inferior a niveles detectables. En otra realización, una cantidad terapéuticamente eficaz es la cantidad de un AAC en una o más dosis administradas durante el curso del período de tratamiento, que logra un hemocultivo negativo (es decir, no permite el crecimiento de la bacteria que es la diana del AAC) en comparación con el hemocultivo positivo antes o al comienzo del tratamiento del paciente infectado.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Generalmente, pero no necesariamente, debido a que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de, en la etapa temprana de la enfermedad, o incluso antes de la exposición a condiciones en las que el riesgo de infección es elevado, la cantidad profilácticamente eficaz puede ser menor que la cantidad terapéuticamente eficaz. En una realización, una cantidad profilácticamente eficaz es al menos una cantidad eficaz para reducir, prevenir la aparición de o la propagación de la infección de una célula a otra.
La administración "crónica" se refiere a la administración de uno o más medicamentos en un modo continuo en oposición a un modo de corta duración, a fin de mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un período prolongado de tiempo. La administración "intermitente" es un tratamiento que no se realiza de manera consecutiva sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.
El término "prospecto" se usa para referirse a instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia combinada, las contraindicaciones y/o las advertencias en referencia al uso de dichos productos terapéuticos.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superposición al compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que pueden superponerse sobre sus compañeros de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero se diferencian con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen propiedades físicas diferentes, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse mediante procedimientos analíticos de alta resolución, tales como electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a estereoisómeros de un compuesto que no son imágenes especulares superponibles entre sí.
Las convenciones y definiciones estereoquímicas usadas en el presente documento siguen generalmente a S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos de los compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S, se usan para indicar la configuración absoluta de la molécula en torno a su centro o centros quirales. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el sentido de rotación del plano de luz polarizada por el compuesto, significando (-) o 1 que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos salvo por que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico puede denominarse también enantiómero y una mezcla de dichos isómeros se denomina con frecuencia una mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o racemato, que puede aparecer cuando no ha habido estereoselección ni estereoespecificidad en un proceso o reacción química. Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovista de actividad óptica.
La expresión "grupo protector" se refiere a un sustituyente que se emplea habitualmente para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras que reaccionan otros grupos funcionales en el compuesto. Por ejemplo, un "grupo protector de amino" es un sustituyente fijado a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen, pero sin limitación, acetilo, trifluoroacetilo, tbutoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Para una descripción general de grupos protectores y su uso, véanse T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991, o una edición posterior.
El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere al intervalo de error habitual para el valor correspondiente, fácilmente conocido por los expertos en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a dicho valor o parámetro en sí.
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una/o", y "el/la", incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, en referencia a un "anticuerpo" es una referencia a de uno a muchos anticuerpos, tales como cantidades molares, e incluye equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia y así sucesivamente.
III. COMPOSICIONES Y MÉTODOS
CONJUGADOS ANTICUERPO-ANTIBIÓTICO (AAC)
Los compuestos AAC de la invención incluyen aquellos con actividad antibacteriana, eficaz contra varios patógenos Gram positivos, Gram negativos, humanos y veterinarios, incluyendo los estafilococos. En una realización a modo de ejemplo, los compuestos AAC incluyen un anticuerpo modificado por ingeniería con cisteína conjugado, es decir, fijado covalentemente por un enlazador, a un resto antibiótico de tipo rifamicina. La actividad biológica del resto antibiótico de tipo rifamicina se modula por conjugación con un anticuerpo. Los conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC) de la invención suministran de manera selectiva una dosis eficaz de un agente antibacteriano a un sitio de infección de modo que se puede lograr mayor selectividad, es decir, una dosis eficaz más baja, mientras se aumenta el índice terapéutico ("ventana terapéutica").
La invención proporciona una nueva terapia antibacteriana que tiene como finalidad evitar la fuga de antibióticos al actuar de forma selectiva en poblaciones de bacterias que evaden la terapia antibiótica convencional. La novedosa terapia antibacteriana se logra con un Conjugado Anticuerpo Antibiótico (AAC) en el que un anticuerpo específico para los componentes de la pared celular en S. aureus (incluyendo MRSA) está químicamente enlazado a un antibiótico potente (un derivado de rifamicina). El antibiótico se combina con el anticuerpo a través de un enlazador peptídico escindible por proteasas diseñado para ser escindido por catepsina B, una proteasa lisosómica que se encuentra en la mayoría de los tipos de células de mamíferos (Dubowchik et al (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869). El AAC actúa como un profármaco en el sentido de que el antibiótico está inactivo (debido al gran tamaño del anticuerpo) hasta que el enlazador se escinde. Debido a que las células hospedadoras captan una proporción significativa de S. aureus encontrado en una infección, principalmente neutrófilos y macrófagos, en algún momento durante el curso de la infección en el hospedador, y a que el tiempo pasado dentro de las células hospedadoras proporciona una oportunidad significativa para que la bacteria evada la actividad antibiótica. los AAC de la invención están diseñados para unirse a S. aureus y liberar el antibiótico dentro del fagolisosoma después de que las células hospedadoras capten las bacterias. Por este mecanismo, los AAC pueden concentrar el antibiótico activo específicamente en un lugar donde S. aureus está escasamente tratado con antibióticos convencionales. Si bien la invención no está limitada o definida por un mecanismo de acción particular, los AAC mejoran la actividad antibiótica a través de tres posibles mecanismos: (1) El AAC suministra antibióticos dentro de las células de mamíferos que captan las bacterias, aumentando así la potencia de los antibióticos que se difunden de forma escasa en los fagolisosomas donde están secuestradas las bacterias. (2) los AAC opsonizan las bacterias, aumentando así la captación de bacterias libres por las células fagocíticas, y liberan el antibiótico localmente para destruir las bacterias mientras están secuestradas en el fagolisosoma. (3) los AAC mejoran la semivida de los antibióticos in vivo (farmacocinética mejorada) al enlazar el antibiótico a un anticuerpo. La farmacocinética mejorada de AAC permite el suministro de antibióticos suficiente en regiones donde está concentrado S. aureusmientras limita la dosis total de antibiótico que se necesita administrar por vía sistémica. Esta propiedad debería permitir la terapia a largo plazo con AAC para actuar de forma selectiva contra la infección persistente con efectos secundarios mínimos de los antibióticos.
La presente solicitud describe la generación de nuevos agentes terapéuticos de anticuerpos anti-WTA conjugados y su uso en el tratamiento de infecciones con bacterias Gram positivas (Gm+) incluyendo infecciones por S. aureus. Estos anticuerpos son capaces de actuar de forma selectiva en poblaciones de bacterias Gm+ que evaden la terapia antibiótica convencional.
Un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la invención comprende un anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared beta (WTA beta) fijado covalentemente por un enlazador peptídico a un antibiótico de tipo rifamicina.
En un ejemplo, el conjugado anticuerpo-antibiótico tiene la fórmula:
Ac-(L-abx)p
en donde:
Ac es el anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared;
L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
-Str-Pep-Y-donde Str es una unidad extensora; Pep es un péptido de dos a doce restos de aminoácidos e Y es una unidad espaciadora;
abx es el antibiótico de tipo rifamicina; y
p es un número entero de 1 a 8.
El número de restos antibióticos que pueden conjugarse mediante un resto reactivo del enlazador a una molécula de anticuerpo puede estar limitado por el número de restos de cisteína libres, que se introducen por los métodos descritos en el presente documento. Los AAC a modo de ejemplo de Fórmula I, por lo tanto, comprenden anticuerpos que tienen 1, 2 , 3 o 4 aminoácidos de cisteína modificados por ingeniería (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138).
ANTICUERPOS ANTITEICOICOS DE PARED (WTA)
En el presente documento se divulgan determinados Ac anti-WTA y anticuerpos anti-WTA conjugados que se unen a WTA expresados en varias bacterias Gm+, incluyendo Staphylococcus aureus. Los anticuerpos anti-WTA pueden seleccionarse y producirse mediante los métodos enseñados en el documento US 8283294; Meijer PJ et al (2006) J Mol Biol. 358(3):764-72; Lantto J, et al (2011) J Virol. 85(4):1820-33, y en el Ejemplo 21 a continuación. La invención proporciona composiciones de estos Ac anti-WTA.
La pared celular de las bacterias Gram positivas comprende una capa gruesa de vainas de peptidoglicano (PGN) múltiple que no solo estabilizan la membrana celular sino que también proporcionan muchos sitios a los que se podrían fijar otras moléculas (Figura 3). Una clase importante de estas glicoproteínas de la superficie celular son los ácidos teicoicos ("TA, por sus siglas en inglés"), que son moléculas ricas en fosfato que se encuentran en muchas proteínas de unión a glicanos (GPB, por sus siglas en inglés). Los TA entran en dos tipos: (1) Los ácidos lipoteicoicos ("LTA"), que están anclados a la membrana plasmática y se extienden desde la superficie celular hasta la capa de peptidoglicano; y (2) los TA de pared (WTA), que están fijados covalentemente al peptidoglicano y se extienden a través y más allá de la pared celular (Figura 3). El WTA puede representar hasta el 60 % de la masa total de la pared celular en GPB. Como resultado, presenta un antígeno de superficie celular altamente expresado. Las estructuras químicas de los WTA varían entre los organismos. En S. aureus, WTA está covalentemente enlazado al 6-OH del ácido N-acetil-murámico (MurNAc) a través de un disacárido compuesto de N-acetilglucosamina (GlcNAc)-1-P y N-acetil-manosamina (ManNAc), que está seguido por aproximadamente dos o tres unidades de glicerol fosfato (Figura 4). El polímero WTA real se compone entonces de aproximadamente 11-40 unidades de repetición de ribitol fosfato (Rbo-P). La síntesis gradual de WTA se inicia primero por la enzima llamada TagO y las cepas de S. aureus que carecen del gen TagO (por eliminación del gen) no producen ningún WTA. Las unidades de repetición pueden adaptarse adicionalmente con D-alanina (D-Ala) en C2-OH y/o con N-acetilglucosamina (GlcNAc) en la posición C4-OH a través de enlaces glucosídicos a-(alfa) o p-(beta). Dependiendo de la cepa de S. aureus o de la fase de crecimiento de la bacteria, los enlaces glucosídicos podrían ser a -, p -, o una mezcla de los dos anómeros. Estas modificaciones de los azúcares con GlcNAc se adaptan mediante dos glicosiltransferasas (Gtfs) específicas derivadas de S. aureus: Gtf TarM media enlaces a-glicosídicos, mientras que Gtf TarS media enlaces p-(beta) glicosídicos.
Dada la evidencia significativa de que las reservas intracelulares de MRSA están protegidas de los antibióticos, las nuevas composiciones terapéuticas de la invención se desarrollaron para prevenir este método de evasión de antibióticos mediante el uso de un anticuerpo específico de S. aureus para unir un antibiótico a la bacteria, de modo que cuando la célula hospedadora engulle o internaliza la bacteria in vivo, lleva el antibiótico al interior de la célula hospedadora.
En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-WTA que son anti-WTAa o anti-WTAp. En otro aspecto, la invención proporciona Ac anti-Staphylococcus aureus. Los Ac a modo de ejemplo se clonaron a partir de linfocitos B de pacientes infectados con S. aureus (como se enseña en el Ejemplo 21). En una realización, los Ac anti-WTA y anti-Staphylococcus aureus son anticuerpos monoclonales humanos. La invención abarca Ac quiméricos y Ac humanizados que comprenden las CDR de los Ac de WTA actuales.
Para uso terapéutico, los Ac de WTA de la invención para la conjugación con antibióticos para generar AAC, pueden ser de cualquier isotipo excepto IgM. En una realización, los Ac de WTA son del isotipo IgG humano. En realizaciones más específicas, los Ac de WTA son IgG1 humana.
Las Figuras 6A y 6B enumeran los Ac que son anti-WTAa o anti-WTA p. A lo largo de la memoria descriptiva y las figuras, los Ac designados por un número de 4 dígitos (por ejemplo, 4497) también pueden denominarse con una "S" anterior, por ejemplo, S4497; ambos nombres se refieren al mismo anticuerpo que es la secuencia no modificada de tipo silvestre (WT) del anticuerpo. Las variantes del anticuerpo se indican mediante una "v" después del número de anticuerpo, por ejemplo, 4497.v8. A menos que se especifique (por ejemplo, por un número de variante), las secuencias de aminoácidos que se muestran son las secuencias originales, no modificadas/no alteradas. Estos Ac pueden alterarse en uno o más restos, por ejemplo para mejorar la pK, estabilidad, expresión, capacidad de fabricación (por ejemplo, como se describe en los Ejemplos a continuación), mientras se mantiene sustancialmente aproximadamente la misma o mejor afinidad de unión al antígeno en comparación con el anticuerpo de tipo silvestre, no modificado. La invención abarca las variantes de los presentes anticuerpos de WTA que tienen sustituciones conservativas de aminoácidos. A continuación, a menos que se especifique de otra manera, la numeración de CDR está de acuerdo con Kabat y la numeración de dominio Constante está de acuerdo con la numeración EU.
La Figura 13A y la Figura 13B proporcionan la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones Variables de cadena Ligera (VL) y la región Variable de cadena Pesada (VH), respectivamente de cuatro anticuerpos humanos anti-WTA alfa. Las secuencias CDR, CDR L1, L2, L3 y CDR H1, H2, H3 de acuerdo con la numeración de Kabat, están subrayadas.
T l A: n i DR n Li r l ni-WTA .
Figure imgf000036_0001
T l B: n i DR n P l ni-WTA .
Figure imgf000036_0002
Las secuencias de cada par de VL y VH son las siguientes:
Región Variable de la Cadena Ligera de 4461
DIQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSRANNNYYVAWYQHKPGQPPKLLIYWASTREFGVPDRFSGSGSG T DFTLTINSLQAEDVAVYYCQQYYTSRRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 25)
Región Variable de Cadena Pesada de 4461
QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPKSGGTNYAQRFQGRVTMT GDTSISAAYMDLASLTSDDTAVYYCVKDCGSGGLRDFWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 26)
Región Variable de la Cadena Ligera de 4624
DIQMTQSPDSLSVSLGERATINCRSNQNLLSSSNNNYLAWYQQKPGQPLKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGT
DF TLTISSLQAEDVAVYYCQQYYANPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 27)
Región Variable de Cadena Pesada de 4624
QVQLQQSRVEVKRPGTSVKVSCKTSGYTFSDYYIHWVRLAPGQGLELMGWINPNTGGTYYAQKFRDRVTMTRD T SIATAYLEMSSLTSDDTAVYYCAKDCGRGGLRDIWGPGTMVTVSS (SEQ ID NO: 28)
Región Variable de la Cadena Ligera de 4399
EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSNQNVLASSNDKNYLAWFQHKPGQPLKLUYWASIRESGVPDRFSGSGSGTD F TLTISSLRAEDVAVYYCQQYYTNPRTFGQGTKVEFN (SEQ ID NO: 29)
Región Variable de Cadena Pesada de 4399
EVQLVQSGAEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRLAPGQGLELMGWINPNTGGTNYAQKFQGRVTMTRD TSIATAYMELSSLTSDDTAVYYCAKDCGNAGLRDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 30)
Región Variable de la Cadena Ligera de 6267
DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLUYWASTRESGVPDRFSGSGSGT D FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTSPPYTFGQGTKLEIE (SEQ ID NO: 31)
Región Variable de la Cadena Pesada de 6267
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIHPGDSKTRYSPSFQGQVTISADK SISTAYLQWNSLKASDTAMYYCARLYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 32).
Se proporcionan ejemplos de un anticuerpo monoclonal aislado que se une al ácido teicoico de pared (WTA) que comprende una cadena ligera y una cadena H, comprendiendo, la cadena L, CDR L1, L2, L3 y comprendiendo la cadena H, CDR H1, H2, H3 en donde la CDR L1, L2, L3 y H1, H2, H3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las CDR de cada uno de los Ac 4461 (SEQ ID NO: 1-6), 4624 (SEQ ID NO: 7-12), 4399 (SEQ ID NO: 13-18) y 6267 (SEQ ID NO: 19-24) respectivamente, como se muestra en la Tabla 6A y 6B.
En otros ejemplos, el Ac monoclonal aislado que se une a WTA comprende una región variable de cadena H (VH) y una región variable de cadena L (VL), en donde la VH comprende al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de la secuencia de la región VH de cada uno de los anticuerpos 4461, 4624, 4399 y 6267, respectivamente. En otro aspecto específico más, la identidad de secuencia es del 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
También se describen Ac anti-WTA beta que comprenden las secuencias CDR de la cadena L y H como se muestra en la Figura 14. En una realización, los Ac monoclonales anti-WTA beta aislados comprenden la CDR L1, L2, L3 y H1, H2, H3 seleccionadas del grupo que consiste en las CDR de cada uno de los 13 Ac en la Figura 14. En otra realización, la invención proporciona unos Ac anti-WTA beta aislados que comprenden al menos un 95 % de identidad de secuencia a lo largo de los dominios de la región V de cada uno de los 13 anticuerpos. En otro aspecto específico más, la identidad de secuencia es del 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
De los 13 Ac anti-WTA beta, 6078 y 4497 se modificaron para crear variantes i) que tienen una Cys modificada por ingeniería en una o ambas cadenas L y H para la conjugación a los productos intermedios enlazador-antibiótico; y ii) en donde el primer resto, en la cadena H, Q se altera a E (v2) o los dos primeros restos QM se cambian a EI o EV (v3 y v4).
Las Figuras 15A-1 y 15A-2 proporcionan la secuencia de aminoácidos de la cadena L de longitud completa del Ac anti-WTA beta 6078 (sin modificar) y sus variantes, v2, v3, v4. Las variantes de la cadena L que contienen una Cys modificada por ingeniería se indican mediante la C en el cuadro negro al final de la región constante (en el resto EU n.° 205 en este caso). La designación variante, por ejemplo, v2LC-Cys significa la variante 2 que contiene una Cys modificada por ingeniería en la cadena L. HCLC-Cys significa que las cadenas H y L del anticuerpo contienen un Cys diseñado. Las Figuras 15B-1 a 15B-4 muestran una alineación de la cadena H de longitud completa del Ac anti-WTA beta 6078 (sin modificar) y sus variantes, v2, v3, v4 que tienen cambios en el primer o los 2 primeros restos de la cadena H. Las variantes de la cadena H que contienen una Cys modificada por ingeniería se indican mediante la C en el cuadro negro al final de la región constante (en el resto EU n.° 118).
Región Variable de Cadena Ligera (VL) de 6078
DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPDDFGIYYCQQYKSYSFNFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 111)
Región Variable de Cadena Pesada (VH) de 6078
XX1QLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLT
GDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 112)
en donde X es Q o E; y X1 es M, I o V.
Cadena ligera de 6078
DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPDDFGIYYCQQYKSYSFNFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 113) Cadena Ligera modificada por ingeniería con Cisteína de 6078 DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPDDFGIYYCQQYKSYSFNFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 115) Cadena Pesada de Longitud Completa de 6078 WT (de tipo silvestre)
QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLT
GDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPG (SEQ ID NO: 114)
Cadena Pesada de Longitud Completa de variantes de 6078 (v2, v3 o v4) EXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTG DTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPG (SEQ ID NO: 116) en donde X puede ser M, I o V.
Cadena Pesada modificada por ingeniería con Cys de variantes de 6078 (v2, v3 o v4) EXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTG DTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PG (SEQ ID NO: 117)
en donde X es M, I o V.
También se describe un anticuerpo anti-WTA beta aislado que comprende una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada comprende una VH que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 112. En una realización adicional, este anticuerpo comprende además, una VL que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 111. En un ejemplo, el anticuerpo anti-WTA beta comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la cadena L comprende una VL de SEQ ID NO: 111 y la cadena H comprende una VH de SEQ ID NO: 112. En un ejemplo aún más específico, el anticuerpo anti-WTA beta aislado comprende una cadena L de SEQ ID NO: 113 y una cadena H de SEQ ID NO: 114.
Las variantes de cadena H y L de anti-WTA beta modificadas por ingeniería con Cys de 6078 pueden emparejarse en cualquiera de las siguientes combinaciones para formar Ac completos para conjugarse con productos intermedios enlazador-Abx para generar los AAC anti-WTA de la invención. La cadena L no modificada (SEQ ID NO: 113) se puede emparejar con una variante de cadena H modificada por ingeniería con Cys de SEQ ID NO: 117; la variante puede ser una en donde X es M, I o V. La cadena L modificada por ingeniería con Cys de SEQ ID NO: 115 se puede emparejar con: la cadena H de SEQ ID NO: 114; una variante de cadena H de SEQ ID NO: 116; o una variante de cadena H modificada por ingeniería con Cys de SEQ ID NO: 117 (en esta versión, tanto las cadenas H como L están modificadas por ingeniería con Cys). En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-WTA beta y el AAC anti-WTA beta de la invención comprenden una cadena L de SEQ iD NO: 115 y cadena H de SEQ ID NO: 116.
Las Figuras 16A-1 y 16A-2 proporcionan la cadena L de longitud completa de del Ac anti-WTA beta 4497 (sin modificar) y sus variantes v8. Las variantes de la cadena H que contienen una Cys modificada por ingeniería se indican mediante la C en el cuadro negro al final de la región constante (en el resto EU n.° 205). Las Figuras 16B-1, 16B-2, 16B-3 muestran una alineación de la cadena H de longitud completa del Ac anti-WTA beta 4497 (sin modificar) y su variante v8 con D alterada a E en la posición 96 de CDR H3, con o sin la Cys modificada por ingeniería. Las variantes de la cadena H que contienen una Cys modificada por ingeniería se indican mediante la C en el cuadro negro al final de la región constante (en el resto EU n.° 118 en este caso). La CDR H3 no modificada es GDGGLDD (SEQ ID NO: 104); CDR H3 de 4497v8 es GEGGLDD (SEQ ID NO: 118).
Región Variable de la Cadena Ligera de 4497 DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQRPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGT DF TLTITSLQAEDVAIYYCQQYFSPPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 119)
Región Variable de Cadena Pesada de 4497 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDN A KNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGDGGLDDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 120)
Región variable de Cadena Pesada de 4497.v8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDN AKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGEGGLDDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 156)
Cadena ligera de 4497 DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQRPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGT
DFTLTITSLQAEDVAIYYCQQYFSPPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 121)
Cadena Pesada de 4497.v8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDN AKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGEGGLDDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO: 122)
Cadena Ligera de 4497-Cys DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQRPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGT
DFTLTITSLQAEDVAIYYCQQYFSPPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 123)
Cadena Pesada de 4497.v8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDN AKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGEGGLDDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO: 157; la misma que SEQ ID NO: 122).
Cadena Pesada de 4497.v8-Cys EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDN AKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGEGGLDDWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSV LTVLFIQDWLGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 124)
Otro anticuerpo anti-WTA beta aislado proporcionado por la invención comprende una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada comprende una VH que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 120. En una realización adicional, este anticuerpo comprende además, una VL que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 119. En una realización específica, el anticuerpo anti-WTA beta comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la cadena L comprende una VL de SEQ ID NO: 119 y la cadena H comprende una Vh de SEQ ID NO: 120. En un ejemplo aún más específico, el anticuerpo anti-WTA beta aislado comprende una cadena L de SEQ ID NO: 121 y una cadena H de SEQ ID NO: 122.
Las variantes de cadena H y L de anti-WTA beta modificadas por ingeniería con Cys de 4497 pueden emparejarse en cualquiera de las siguientes combinaciones para formar Ac completos para conjugarse con productos intermedios enlazador-Abx para generar los AAC anti-WTA de la invención. La cadena L no modificada (SEQ ID NO: 121) se puede emparejar con una variante de cadena H modificadas por ingeniería con Cys de SEQ ID NO: 124. La cadena L modificada por ingeniería con Cys de SEQ ID NO: 123 se puede emparejar con: la variante de la cadena H de SEQ ID NO: 157; o una variante de cadena H modificada por ingeniería con Cys de SEQ ID NO: 124 (en esta versión, tanto las cadenas H como L están modificadas por ingeniería con Cys). En una realización particular, el anticuerpo anti-WTA beta y el AAC anti-WTA beta de la invención comprenden una cadena L de SEQ ID NO: 123.
Otro ejemplo más es un anticuerpo que se une al mismo epítopo que cada uno de los Ac anti-WTA alfa de la Figura 13A y la Figura 13B. También se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que cada uno de los Ac anti-WTA beta de la Figura 14, Figuras 15 A y 15 B, y Figuras 16 A y 16 B.
La unión de los anticuerpos anti-WTA a WTA está influenciada por la orientación anomérica de las modificaciones de los azúcares con GlcNAc en WTA. Los WTA se modifican mediante modificaciones de azúcares con N-acetilglucosamina (GlcNAc) en la posición C4-OH mediante enlaces glucosídicos a o p, por glicosiltransferasa TarM o glicosiltransferasa TarS, respectivamente. Por consiguiente, preparaciones de la pared celular a partir de cepas mutantes de glicosiltransferasa que carecen de TarM (ATarM), TarS (ATarS), o tanto TarM como TarS (ATarM/ATarS) se sometieron a análisis de inmunotransferencia con anticuerpos contra WTA. El anticuerpo WTA (S7574) específico para modificaciones de a-GlcNAc en WTA no se une a la preparación de la pared celular a partir de la cepa ATarM. Por el contrario, un anticuerpo WTA (S4462) específico para modificaciones de p-GlcNAc en WTA no se une a la preparación de la pared celular de la cepa ATarS. Como cabía esperar, estos dos anticuerpos no se unen a las preparaciones de la pared celular de una cepa de eliminación que carece de ambas glicosiltransferasas (ATarM/ATarS) y tampoco la cepa que carece de cualquier WTA (ATagO). De acuerdo con dicho análisis, los anticuerpos se han caracterizado como Acm anti-a-GlcNAc WTA, o como Acm anti-p-GlcNAc WTA como se enumeran en la Tabla en las Figuras 6A y 6B.
Los aminoácidos de cisteína se pueden modificar por ingeniería en sitios reactivos en un anticuerpo y que no formen enlaces disulfuro intracadena o intermoleculares (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; documento US 7521541; documento US 7723485; documento WO2009/052249, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52). Los tioles de las cisteínas modificadas por ingeniería pueden reaccionar con reactivos enlazadores o los productos intermedios enlazador-antibiótico de la presente invención que tienen grupos reactivos con tiol, electrófilos tales como maleimida o alfa-haloamidas para formar AAC con anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína (tioMAb) y los restos antibióticos (abx). La ubicación del resto antibiótico puede así diseñarse, controlarse y conocerse. La carga antibiótica se puede controlar ya que los grupos tiol de las cisteínas modificadas por ingeniería reaccionan generalmente con reactivos enlazadores reactivos con tiol o productos intermedios enlazador-antibiótico con alto rendimiento. Modificar por ingeniería un anticuerpo anti-WTA para introducir un aminoácido cisteína por sustitución en un solo sitio en la cadena pesada o ligera proporciona dos nuevas cisteínas en el anticuerpo tetrámero simétrico. Se puede lograr una carga antibiótica cercana a 2 y una homogeneidad cercana del producto de conjugación AAC.
En determinadas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos anti-WTA modificados por ingeniería con cisteína, por ejemplo, "tioMAb", donde uno o más restos de la molécula se sustituyen por restos de cisteína. En realizaciones particulares, los restos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Mediante la sustitución de esos restos con cisteína, los grupos tiol reactivos se colocan, así, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden utilizar para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos antibióticos o restos enlazadorantibiótico, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinadas realizaciones, pueden sustituirse uno cualquiera o más de los siguientes restos por cisteína, incluyendo V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se muestran mutantes a modo de ejemplo, no limitantes, de cadena pesada A118C (SEQ ID NO: 149) y de cadena ligera V205C (SEQ ID NO: 151) modificados por ingeniería con cisteína de un anticuerpo anti-WTA. Los anticuerpos anti-WTA modificadas por ingeniería con cisteína pueden generarse como se describe (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; documento US 7521541; documento US-2011/0301334.
En otro ejemplo, la invención se refiere a un anticuerpo anti-WTA aislado que comprende una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de región constante de cadena pesada de tipo silvestre o una mutante modificada por ingeniería con cisteína (TioMab) y la cadena ligera comprende una secuencia de región constante de cadena ligera de tipo silvestre o una mutante modificada por ingeniería con cisteína (TioMab). En un aspecto, la cadena pesada tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con:
Región constante de cadena pesada (IgG1), tipo silvestre (SEQ ID NO: 148)
A ST K G P S V F P L A P S SK S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N SG A L T S G V H T F
P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y IC N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T
H T C P P C P A P E L L G G P SV F L F P P K P K D T L M IS R T P E V T C V W D V S H E D P E V K F N
W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R W S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K
A L P A P IE K T ISK A K G Q P R E P Q V Y T L P P SR E E M T K N Q V SL T C L V K G F Y P SD IA V E
W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A
L H N H Y T Q K SL SL SP G K
(SEQ ID NO: 148)
Región constante de cadena pesada (IgG1), A118C "TioMab"
CSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC'LVKDYFPEPVTVSW NSG ALTSGVHTF
PAVLQSSGLYSLSSVV TV PSSSLG TQ TY IC N V NH K PSN TK VD K K VEPK SC D K T
H TCPPC PAPELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISR TPEV TC W \rD VSH EDPEVK FN
W Y V D G V E V H N A K T K PR EEQ Y N STY R W SV LT V LH Q D W L N G K EY K C K V SN K
ALP APIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEM TKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVE
W ESN G Q PENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSK LTVDK SRW Q Q G NVFSCSVM H EA
LHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 149)
y la cadena ligera tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con:
Región constante de cadena ligera (kappa), tipo silvestre
R T V A A P S V F IF P P S D E Q L K S G T A S W C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S
Q E SV T E Q D SK D ST Y SL SST L T L SK A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L SSP V T K SF N R
GEC
(SEQ ID NO: 150)
Región constante de cadena ligera (kappa), V205C "TioMab"
R T V A A P S V F IF P P S D E Q L K S G T A S W C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S
Q E SV T E Q D SK D S T Y S L SS T L T L SK A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P C T K SF N R G
EC
(SEQ ID NO: 151)
Los AAC de la invención incluyen anticuerpos anti-WTA modificados por ingeniería con cisteína en los que uno o más aminoácidos de un anticuerpo anti-WTA de tipo silvestre o precursor están reemplazados con un aminoácido cisteína. Cualquier forma de anticuerpo puede modificarse por ingeniería de esta manera, es decir, mutarse. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo Fab precursor puede modificarse por ingeniería para formar un Fab modificado por ingeniería con cisteína, denominado, en el presente documento, "TioFab". De manera análoga, un anticuerpo monoclonal precursor puede modificarse por ingeniería para formar un "TioMab". Cabe señalar que una mutación puntual produce un solo resto de cisteína modificado por ingeniería en un TioFab, mientras que una mutación puntual produce dos restos de cisteína diseñados en un tioMab, debido a la naturaleza dimérica del anticuerpo IgG. Los mutantes con restos de cisteína (Cys) reemplazados ("modificados por ingeniería") se evalúan para determinar la reactividad de los grupos tiol de cisteínas modificadas por ingeniería recién introducidas.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden producirse usando células hospedadoras en cultivo. Las células hospedadoras pueden transformarse con vectores (vectores de expresión o clonación) que comprenden uno o más ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento. Las células pueden cultivarse en condiciones adecuadas para producir los anticuerpos y los anticuerpos producidos por la célula pueden purificarse adicionalmente. Las células adecuadas para producir anticuerpos pueden incluir células procariotas, de levadura o eucariotas superiores (por ejemplo, de mamíferos). En algunas realizaciones, se usa una célula de mamífero (una célula de mamífero humano o no humano). En algunas realizaciones, se utiliza una célula de ovario de hámster chino (CHO).
Las células de mamífero se pueden cultivar y la propagación de células de mamífero en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento habitual. Ejemplos de líneas celulares de mamíferos hospedadoras pueden incluir, sin limitación, línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1, ATCC Cc L 70); células de riñón de mono verde africano (Ve RO-76, ATCC Cr L-1587); células de carcinoma de cuello de útero humanas (HELA, ATCC, CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC Cc L 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MCR 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas celulares de mamíferos hospedadoras útiles incluyen líneas celulares de mieloma tales como NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares de mamífero hospedadoras adecuadas para la producción de anticuerpos, véanse, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), páginas. 255-268.
También se pueden utilizar cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunias, tomate, lenteja de agua (Leninaceae), alfalfa (M. truncatula) y tabaco como hospedadoras.
Las células procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (p.ejB. licheniformis 41p divulgado en DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedador de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son hospedadores de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el más utilizado habitualmente entre los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Sin embargo, varios géneros, especies y cepas diferentes están comúnmente disponibles y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; hospedadores de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (Documento EP 402.226); Pichia pastoris (Documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (Documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedadores de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.
RESTOS ANTIBIÓTICOS DE TIPO RIFAMICINA
El resto antibiótico (abx) de los conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC) de la invención es un antibiótico de tipo rifamicina o un grupo que tiene un efecto citotóxico o citostático. Las rifamicinas son un grupo de antibióticos que la bacteria obtiene de forma natural, Nocardia mediterranei, Amycolatopsis mediterranei o artificial. Son una subclase de la familia Ansamicina más grande que inhibe la ARN polimerasa bacteriana (Fujii et al (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:1489-1492; Feklistov, et al (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105(39): 14820-5) y tienen potencia contra bacterias gram positivas y gram negativas selectivas. Las rifamicinas son particularmente eficaces contra las micobacterias y, por lo tanto, se usan para tratar la tuberculosis, lepra e infecciones por el complejo de mycobacterium avium (MAC, por sus siglas en inglés). El grupo de tipo rifamicina incluye los fármacos "clásicos" de rifamicina, así como los derivados de la rifamicina, rifampicina (rifampicina, N.° de Reg. CA 13292-46-1), rifabutina (N.° de Reg. CA 72559-06-9; documento US 2011/0178001), rifapentina y rifalazil (N.° de Reg. CA 129791-92-0, Rothstein et al (2003) Expert Opin. Investig. Drugs 12(2):255-271; Fujii et al (1994) Antimicrob. Agents Chemother.
38:1118-1122. Muchos antibióticos de tipo rifamicina comparten la propiedad perjudicial del desarrollo de resistencia (Wichelhaus et al (2001) J. Antimicrob. Chemother. 47:153-156). Las rifamicinas se aislaron por primera vez en 1957 de un cultivo de fermentación de Streptomyces mediterranei. Se descubrieron alrededor de siete rifamicinas, denominadas Rifamicina A, B, C, D, E, S y sV (documento US 3150046). La rifamicina B fue la primera introducida comercialmente y fue útil en el tratamiento de la tuberculosis resistente a fármacos en la década de 1960. Las rifamicinas se han utilizado para el tratamiento de muchas enfermedades, siendo la más importante la tuberculosis relacionada con el VIH. Debido a la gran cantidad de análogos y derivados disponibles, las rifamicinas se han utilizado ampliamente en la eliminación de bacterias patógenas que se han vuelto resistentes a los antibióticos utilizados habitualmente. Por ejemplo, la rifampicina es conocida por su potente efecto y su capacidad para prevenir la resistencia a fármacos. Destruye rápidamente cepas de bacilos de división rápida, así como células "persistentes", que permanecen biológicamente inactivos durante largos períodos de tiempo que les permiten evadir la actividad antibiótica. Además, la rifabutina y la rifapentina se han utilizado contra la tuberculosis adquirida en pacientes con VIH.
Los restos antibióticos (abx) de los conjugados anticuerpo-antibiótico de Fórmula I son restos de tipo rifamicina que tienen la estructura:
Figure imgf000043_0001
en donde:
las líneas discontinuas indican un enlace opcional;
R es H, alquilo C1-C12 o C(O)CH3;
R1 es OH;
R2 es CH=N-(heterociclilo), en donde el heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente de C(O)CH3, alquilo C1-C12-, heteroarilo C1-C12, heterociclilo C2-C20, arilo C6 -C20V carbociclilo C3-C12;
o R1 y R2 forman un heteroarilo o heterociclilo de cinco o seis miembros fusionado y formando, opcionalmente, un anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo, o carbociclilo de seis miembros espiro o fusionado, en donde el anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo, o carbociclilo de seis miembros espiro o fusionado se sustituye opcionalmente por H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C12 u OH; y
donde el enlazador peptídico L está fijado covalentemente a R2.
Un ejemplo de un resto de tipo rifamicina es:
Figure imgf000043_0002
en donde R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; R4 se selecciona de H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C12 y OH;
y Z se selecciona de NH, N(alquilo C1-C12), O y S; y donde el enlazador peptídico L está fijado covalentemente al átomo de nitrógeno de N (R3)2.
Un ejemplo de un resto de tipo rifampicina es:
Figure imgf000044_0001
en donde
R5 se selecciona de H y alquilo C1-C12; y donde el péptido enlazador L está fijado covalentemente al átomo de nitrógeno de NR5
Un ejemplo de un resto de tipo rifabutina es:
Figure imgf000044_0002
en donde R5 se selecciona de H y alquilo C1-C12; y donde el péptido enlazador L está fijado covalentemente al átomo de nitrógeno de NR5.
Una realización de un resto de tipo benzoxazina rifamicina es:
Figure imgf000044_0003
en donde R5 se selecciona de H y alquilo C1-C12; y donde el péptido enlazador L está fijado covalentemente al átomo de nitrógeno de NR5.
Una realización de un resto de tipo benzoxazina rifamicina, denominado en el presente documento pipBOR, es:
Figure imgf000045_0001
en donde R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y donde el enlazador peptídico L está fijado covalentemente al átomo de nitrógeno de N (R3)2.
Una realización de un resto de tipo benzoxazina rifamicina, denominado en el presente documento dimetil pipBOR, es:
Figure imgf000045_0002
donde el péptido enlazador L está fijado covalentemente al átomo de nitrógeno de N (CH3)2.
El derivado semisintético rifamicina S, o la forma reducida de sal de sodio rifamicina SV, se puede convertir a antibióticos de tipo Rifalazil en varias etapas, donde R es H o Ac, R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; R4 se selecciona de H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C12 y OH; y Z se selecciona de NH, N(alquilo C1-C12), O y S, como se ejemplifica en las Figuras 9-11. Se pueden preparar benzoxazina (Z = O), benztiazina (Z = S), benzdiazina (Z = NH, N(alquilo C1-C12)) rifamicinas (documento US 7271165). Los análogos de benzoxazina rifamicina (BOR), benzotiazinarifamicina (BTR) y benzdiazinarifamicina (BDR) que contienen sustituyentes se numeran de acuerdo con el esquema de numeración proporcionado en la fórmula A en la columna 28 en el documento US 7271165. Por "25-O-desacetil" rifamicina se entiende un análogo de rifamicina en el que se ha eliminado el grupo acetilo en la posición 25. Los análogos en los que esta posición se derivatiza adicionalmente se denominan "25-O-desacetil-25-(sustituyente)rifamicina", en el que la nomenclatura para el grupo derivatizador reemplaza "sustituyente" en el nombre completo del compuesto.
Los restos antibióticos de tipo rifamicina se pueden sintetizar por métodos análogos a los descritos en el documento US 4610919; documento US 4983602; documento US 5786349; documento US5981522; documento US 4859661; documento US 7271165; el documento US 2011/0178001; Seligson, et al., (2001) AntiCancer Drugs 12:305-13; Chem. Pharm. Bull., (1993) 41:148). Los restos antibióticos de tipo rifamicina pueden explorarse para detectar actividad antimicrobiana midiendo su concentración inhibidora mínima (MIC), utilizando ensayos in vitro con MIC patrón (Tomioka et al., (1993) Antimicrob. Agents Chemother. 37:67).
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ENLAZADORES PEPTIDICOS
Un "enlazador peptídico" (L) es un resto bifuncional o multifuncional que se fija covalentemente a uno o más restos antibióticos (abx) y a una unidad de anticuerpo (Ab) para formar conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC) de Fórmula I. Los enlazadores peptídicos en los AAC son sustratos para la escisión por proteasas intracelulares, incluyendo condiciones lisosómicas. Las proteasas incluyen diferentes catepsinas y caspasas. La escisión del enlazador peptídico de un AAC dentro de una célula puede liberar el antibiótico de tipo rifamicina con efectos antibacterianos. La cantidad de antibiótico activo liberado de la escisión de AAC se puede medir mediante el ensayo de liberación de Caspasa del Ejemplo 20.
Los conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC) pueden prepararse convenientemente usando un reactivo enlazador o producto intermedio enlazador-antibiótico que tiene una funcionalidad reactiva para unirse al antibiótico (abx) y al anticuerpo (Ab). En una realización a modo de ejemplo, un tiol de la cisteína de un anticuerpo (Ac) modificado por ingeniería con cisteína puede formar un enlace con un grupo funcional de un reactivo enlazador, con un resto antibiótico o con un producto intermedio antibiótico-enlazador.
El resto enlazador peptídico de un AAC, en un aspecto, un reactivo enlazador o un producto intermedio enlazadorantibiótico tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que es reactivo a una cisteína nucleófila presente en un anticuerpo. El tiol de la cisteína del anticuerpo es reactivo con un grupo electrófilo en un reactivo enlazador o enlazador-antibiótico, formando un enlace covalente. Los grupos electrófilos útiles incluyen, pero sin limitación, grupos maleimida y haloacetamida.
Los anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína reaccionan con reactivos enlazadores o productos intermedios enlazador-antibiótico, con los grupos funcionales electrófilos tales como maleimida o a-halocarbonilo, de acuerdo con el procedimiento de conjugación de la página 766 de Klussman et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773 y de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 19.
En otra realización, el grupo reactivo de un reactivo enlazador o producto intermedio enlazador-antibiótico contiene un grupo funcional tiol reactivo que puede formar un enlace con un tiol de la cisteína libre de un anticuerpo. Ejemplos de grupos funcionales de reacción con tiol incluyen, pero sin limitación, maleimida, a-haloacetilo, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros ácidos, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos.
En otra realización, un reactivo enlazador o producto intermedio antibiótico-enlazador tiene un grupo funcional reactivo que tiene un grupo nucleófilo que es reactivo a un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos de un anticuerpo útiles incluyen, pero sin limitación, disulfuro de piridilo, grupos carbonilo de aldehídos y cetonas. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un reactivo enlazador o producto intermedio antibiótico-enlazador puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente a una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un reactivo enlazador o intermedio antibiótico-enlazador incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, tiol, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y arilhidrazida. El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la fijación a un reactivo enlazador o producto intermedio antibiótico-enlazador.
Un enlazador peptídico puede comprender uno o más componentes enlazadores. Los componentes enlazadores a modo de ejemplo incluyen una unidad peptídica, 6-maleimidocaproílo ("MC"), maleimidopropanoílo ("MP"), valinacitrulina ("val-cit" o "vc"), alanina-fenilalanina ("ala-phe") y p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), N-succinimidil 4-(2 piridiltio)pentanoato ("SPP") y 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("MCC"). Se conocen diferentes componentes enlazadores en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación.
En otra realización, el enlazador puede estar sustituido con grupos que modulan la solubilidad o la reactividad. Por ejemplo, un sustituyente cargado tal como sulfonato (-SO3") o amonio, puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo enlazador con el resto anticuerpo o antibiótico, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ac-L (producto intermedio anticuerpo-enlazador) con abx, o abx-L (producto intermedio antibiótico-enlazador) con Ac, dependiendo de la vía de síntesis empleada para preparar los AAC.
Los AAC de la invención contemplan expresamente, pero sin limitación, aquellos preparados con reactivos enlazadores: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB, SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) y reactivos de bismaleimida tales como DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEG)2 y BM(PEG)3. Los reactivos de bismaleimida permiten la fijación del grupo tiol de un anticuerpo modificado por ingeniería con cisteína a un resto antibiótico, marcador o producto intermedio enlazador que contiene tiol, de forma secuencial o convergente. Otros grupos funcionales además de maleimida, que son reactivos con un grupo tiol de un anticuerpo modificado por ingeniería con cisteína, con un resto antibiótico o con un producto intermedio enlazador-antibiótico incluyen yodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato.
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También se pueden obtener reactivos enlazadores útiles a través de otras fuentes comerciales, tales como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), o sintetizarse de acuerdo con los procedimientos descritos en Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; documentos US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
En otra realización, el resto enlazador peptídico de un AAC comprende un enlazador de tipo dendrítico para la fijación covalente de más de un resto antibiótico a través de un resto enlazador multifuncional ramificado a un anticuerpo (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la relación molar de antibiótico a anticuerpo, es decir la carga, que está relacionada con la potencia de los AAC. Por lo tanto, cuando un anticuerpo modificado por ingeniería con cisteína lleva únicamente un grupo tiol de la cisteína reactivo, se pueden fijar gran cantidad de restos antibióticos mediante un enlazador dendrítico.
En determinadas realizaciones de AAC de Fórmula I, el péptido enlazador tiene la fórmula:
-Str-Pep-Y-donde Str es una unidad extensora unida covalentemente al anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared (WTA); Pep es un péptido de dos a doce restos de aminoácidos e Y es una unidad espaciadora fijada covalentemente al antibiótico de tipo rifamicina. Realizaciones a modo de ejemplo de tales enlazadores se describen en el documento US 7498298.
En una realización, una unidad extensora "Str" tiene la fórmula:
Figure imgf000047_0002
en donde R6 se selecciona del grupo que consiste en -alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C-i-Ca), -arileno-, -alquileno-arileno C1-C10, -arileno-alquileno C1-C10, -alquileno C-i-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-Cs)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-Cs)-alquileno C1-C10, -(CH2CH2O),- y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un número entero que varía de 1 a 10.
Las unidades extensoras a modo de ejemplo se muestran a continuación (en donde la línea ondulada indica sitios de fijación covalente a un anticuerpo):
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Una unidad peptídica "Pep" comprende dos o más restos de aminoácidos que se producen de forma natural, incluidos los veinte aminoácidos principales, así como los aminoácidos minoritarios tales como citrulina, que son bien conocidos en el campo de la bioquímica. Los aminoácidos se distinguen por su cadena lateral. La unidad peptídica comprende así dos o más cadenas laterales de aminoácidos, incluyendo, pero sin limitación, -CH3 (alanina), -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2 (arginina), -CH2C(O)NH2 (asparagina), -CH2CO2H (ácido aspártico), -CH2CH2CH2NHC(O)NH2 (citrulina), -CH2SH (cisteína), -CH2CH2CO2H (ácido glutámico), -CH2CH2C(O)NH (glutamina), -H (glicina), -CH2(imidazolil) (histidina), -CH(CH3)CH2CH3 (isoleucina), -CH2CH(CH3)CH3 (leucina), -CH2CH2CH2CH2NH2 (lisina), -CH2CH2SCH3 (metionina), -^ (C aH s) (fenilalanina), -CH2CH2CH2- (prolina), -CH2OH (serina), -CH(OH)CH (treonina), -CH2(indol) (triptófano), -CH2(p-CaH4OH) (tirosina), -CHCH(CH3)CH3 (valina). Véanse las páginas 1076-1077, "Organic Chemistry" 5a Ed. John McMurry, Brooks/Cole pub. (2000). Los restos de aminoácidos de la unidad peptídica incluyen todos los estereoisómeros y pueden estar en las configuraciones D o L. En una realización, Pep comprende de dos a doce restos de aminoácidos seleccionados independientemente de glicina, alanina, fenilalanina, lisina, arginina, valina y citrulina. En una de dichas realizaciones, la unidad de aminoácidos permite la escisión del enlazador por una proteasa, facilitando así la liberación del antibiótico del AAC tras la exposición a proteasas intracelulares, tales como enzimas lisosómicas (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol.
21:778-784). Las unidades de aminoácidos a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido, un pentapéptido y un hexapéptido. Los dipéptidos a modo de ejemplo incluyen: valinacitrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe); fenilalanina-lisina (fk o fen-lis); o N-metil-valina-citrulina (Meval-cit). Los tripéptidos a modo de ejemplo incluyen: glicina-valina-citrulina (glic-val-cit), valina-citrulina-fenilalanina (val-cit-phe) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Los enlazadores peptídicos adicionales incluyen GGAFAGGG (SEQ ID NO: 126); tpm-cit; GPImeLFF (SEQ ID NO: 129); y LAFG (SEQ ID NO: 128). Los enlazadores peptídicos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (E.
Schroder y K. Lubke (1965) "The Peptides", volumen 1, páginas 76-136, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las unidades de aminoácidos se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para la escisión enzimática mediante enzimas concretas, por ejemplo, una proteasa asociada a tumores, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.
En una realización, la unidad espaciadora Y comprende paraaminobencilo o paraaminobenciloxicarbonilo. Una unidad espaciadora "no autoinmolativa" es aquella en donde parte o la totalidad de la unidad espaciadora permanece unida al resto antibiótico tras la escisión enzimática (por ejemplo, proteolítica) del AAC. Ejemplos de unidades espaciadoras no autoinmolativas incluyen, pero sin limitación, una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora de glicina-glicina. También se contemplan otras combinaciones de espaciadores peptídicos susceptibles de escisión enzimática específica de secuencia. Por ejemplo, la escisión enzimática de un a Ac que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina por una proteasa asociada a células tumorales daría como resultado la liberación de un resto glicina-glicina-antibiótico del resto del AAC. En una de dichas realizaciones, el resto glicina-glicina-antibiótico se somete después a una etapa de hidrólisis separada en la célula tumoral, escindiendo así la unidad espaciadora de glicina-glicina del resto antibiótico.
Una unidad espaciadora permite la liberación del resto antibiótico sin una etapa de hidrólisis separada. Una unidad espaciadora puede ser "autoinmolativa" o "no autoinmolativa". En determinadas realizaciones, una unidad espaciadora de un enlazador comprende una unidad p-aminobencilo (PAB). En una de dichas realizaciones, se fija un alcohol p-aminobencílico a una unidad de aminoácidos a través de un enlace amida, un carbamato, metilcarbamato o carbonato entre el grupo p-aminobencilo y el resto antibiótico (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). En una realización, la unidad espaciadora es p-aminobenciloxicarbonilo (PAB). En una realización, el antibiótico forma una amina cuaternaria, tal como el grupo dimetilaminopiperidilo, cuando se fija a la unidad espaciadora PAB del enlazador peptídico. Ejemplos de tales aminas cuaternarias son los productos intermedios enlazador-antibiótico (LA) 54, 61, 66, 67, 73, 74, 76, 78, 79, 83, 84 de la Tabla 2. El grupo amina cuaternaria puede modular la escisión del resto antibiótico para optimizar los efectos antibacterianos del AAC. En otra realización, el antibiótico está enlazado a la unidad espaciadora PABC del enlazador peptídico, formando un grupo funcional carbamato en el AAC. Tal grupo funcional carbamato también puede optimizar los efectos antibacterianos del AAC. Ejemplos de productos intermedios enlazador-antibiótico (LA) con PABC carbamato son 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 64, 65, 72, 75, 80, 81, 87 de la Tabla 2. Otros productos intermedios enlazadorantibiótico (LA) emplean grupos amida (59, 69, 70, 71, 77, 82, 85) o fenólicos (60, 68, 86).
Otros ejemplos de espaciadores autoinmolativos incluyen, pero sin limitación, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB, tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (documento US 7375078; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto- o paraaminobencilacetales. Pueden usarse espaciadores que experimentan ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituido y no sustituido (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillo biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867). La eliminación de fármacos que contienen aminas que están sustituidas por glicina (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447) también es un ejemplo de espaciadores autoinmolativos útiles en AAC.
PRODUCTOS INTERMEDIOS ENLAZADOR-ANTIBIÓTICO ÚTILES PARA AAC
Los productos intermedios enlazador-antibiótico (LA) de Fórmula II y la Tabla 2 se prepararon acoplando un resto antibiótico de tipo rifamicina con un reactivo enlazador peptídico, tal como se ejemplifica en las Figuras 23-25 y en los Ejemplos 1-17. Los reactivos enlazadores se prepararon por los métodos descritos en los documentos WO 2012/113847; US 7659241; US 7498298; US 20090111756; Estados Unidos 2009/0018086; US 6214345; Dubowchik et al (2002) Bioconjugate Chem. 13(4):855-869, incluyendo:
4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6
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6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(hidroximetil) fenilairiino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)hexanamida 8
Figure imgf000050_0001
N-((S)-1-((S)-1-(4-(dorometil)fenilamino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il) -6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9
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T l 2 Pr in rm i nl z r-ni i i LA
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(continuación)
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(continuación)
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REALIZACIONES DE CONJUGADOS ANTICUERPO-ANTIBIÓTICO
El anticuerpo S4497 se enlazó a derivados de rifamicina denominados, en la Tabla 3, pipBOR y a otros a través de un enlazador peptídico escindible por proteasas. El enlazador está diseñado para ser escindido por proteasas lisosómicas, incluidas las catepsinas B, D y otras, que reconocen las unidades peptídicas, incluyendo el dipéptido Valina-Citrulina (val-cit, vc) (Dubowchik et al (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869). La generación del producto intermedio enlazador-antibiótico que consiste en el antibiótico y el enlazador MC-vc-PAB y otros, se describe en detalle en los Ejemplos 1-17. El enlazador está diseñado de tal manera que la escisión del enlace amida en el resto PAB separa el anticuerpo del antibiótico en un estado activo.
El AAC denominado S4497-dimetil-pipBOR es idéntico al AAC S4497-pipBOR, excepto por el grupo amino dimetilado en el antibiótico y el grupo oxicarbonilo en el enlazador.
La Figura 5 muestra un posible mecanismo de activación del fármaco para conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC). El antibiótico activo (Ab) solo se libera después de la internalización del AAC dentro de las células de mamíferos. La porción Fab del anticuerpo en AAC se une a S. aureus, mientras que la porción Fc del AAC potencia la captación de la bacteria mediante la unión mediada por el receptor Fc a las células fagocíticas, incluidos los neutrófilos y los macrófagos. Después de la internalización en el fagolisosoma, el enlazador Val-Cit se escinde por proteasas lisosómicas que liberan el antibiótico activo dentro del fagolisosoma.
Una realización de los compuestos de conjugado anticuerpo-antibiótico (AAC) de la invención incluye los siguientes:
Figure imgf000071_0001
donde AA1 y AA2 se seleccionan independientemente de una cadena lateral de aminoácidos, incluyendo H, -CH3, -CH2(CaH5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3 y -CH2CH2CH2NHC(O)NH2; e incluyendo las fórmulas:.
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
en donde:
las líneas discontinuas indican un enlace opcional;
R es H, alquilo C1-C12 o C(O)CH3;
R1 es OH;
R2 es CH=N-(heterociclilo), en donde el heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente de C(O)CH3, alquilo C1-C12-, heteroarilo C1-C12, heterociclilo C2-C20, arilo C6 -C20V carbociclilo C3-C12;
o R1 y R2 forman un heteroarilo o heterociclilo de cinco o seis miembros fusionado y formando, opcionalmente, un anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo, o carbociclilo de seis miembros espiro o fusionado, en donde el anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo, o carbociclilo de seis miembros espiro o fusionado se sustituye opcionalmente por H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C12 u OH;
L es el enlazador peptídico fijado a R2 o al heteroarilo o heterociclilo fusionado formado por R1 y R2; y
Ac es el anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared (WTA).
Un ejemplo de los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención incluye el siguiente:
Figure imgf000074_0001
en donde R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; n es 1 o 2; R4 se selecciona de H, F, Cl, Br, I, alquilo C1-C12 y OH; y Z se selecciona de NH, N(alquilo C1-C12), O y S.
Un ejemplo de los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención incluye el siguiente resto antibiótico de tipo rifampicina:
Figure imgf000074_0002
en donde R5 se selecciona de H y alquilo C1-C12; y n es 0 o 1.
Un ejemplo de los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención incluye el siguiente resto antibiótico de tipo rifabutina:
Figure imgf000074_0003
en donde R5 se selecciona de H y alquilo C1-C12; y n es 0 o 1.
Una realización de los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención incluye el siguiente resto antibiótico de tipo rifalazil:
Figure imgf000075_0001
en donde R5 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y n es 0 o 1.
Una realización de los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención incluye el siguiente resto antibiótico de tipo pipBOR:
Figure imgf000075_0002
en donde R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y n es 1 o 2.
Una realización de los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención incluye el siguiente:
Figure imgf000075_0003
Otras realizaciones de los compuestos conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención incluyen los siguientes: Ċ
Figure imgf000076_0001
5 y
Figure imgf000076_0002
CARGA ANTIBIÓTICA DE AAC
La carga antibiótica está representada por p, el número promedio de restos antibióticos (abx) por anticuerpo en una molécula de Fórmula I. La carga antibiótica puede variar de 1 a 20 restos antibióticos (D) por anticuerpo. El AAC de Fórmula I incluye colecciones o un conjunto de anticuerpos conjugados con una gama de restos antibióticos, de 1 a 20. El número promedio de restos antibióticos por anticuerpo en preparaciones de AAC a partir de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de AAC en función de p. En algunos casos, la separación, purificación, y caracterización de AAC homogéneos donde p es un determinado valor a partir de AAC con otras cargas antibióticas se puede conseguir por medios tales como HPLC en fase inversa o electroforesis. Para algunos conjugados anticuerpo-antibiótico, p puede estar limitado por el número de sitios de fijación en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión está en un tiol de cisteína, como en las realizaciones a modo de ejemplo anteriores, un anticuerpo puede tener solo uno o algunos grupos tiol de la cisteína, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales se puede unir un enlazador. En determinadas realizaciones, una mayor carga antibiótica, p. ej. p> 5, puede causar la agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de determinados conjugados anticuerpo-antibiótico. En determinadas realizaciones, la carga antibiótica para un AAC de la invención varía de 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; de aproximadamente 2 a aproximadamente 4; o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5; aproximadamente 4; o aproximadamente 2.
En determinadas realizaciones, se conjugan menos que el máximo teórico de restos antibióticos con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, restos lisina que no reaccionan con el producto intermedio antibiótico-enlazador o con el reactivo enlazador, tal como se analiza a continuación. En general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de la cisteínas libres y reactivos que pueden estar enlazados a un resto antibiótico; de hecho, la mayoría de los restos tiol de las cisteínas en los anticuerpos existen como puentes disulfuro. En determinadas realizaciones, un anticuerpo puede reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), en condiciones reductoras parciales o totales, para generar grupos tiol de cisteínas reactivos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleófilos reactivos tales como lisina o cisteína.
La carga (relación antibiótico/anticuerpo, "AAR") de un AAC puede controlarse de diferentes maneras, por ejemplo, (i) limitando el exceso molar del producto intermedio antibiótico-enlazador o del reactivo enlazador con respecto al anticuerpo, (ii) limitando el tiempo o la temperatura de la reacción de conjugación y (iii) limitando o reduciendo parcialmente las condiciones reductoras para la modificación del tiol de la cisteína.
Se deberá entender que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un producto intermedio antibióticoenlazador o con un reactivo enlazador seguido por el reactivo del resto antibiótico, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos AAC con una distribución de uno o más restos antibióticos unidos a un anticuerpo. El número promedio de antibióticos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpos ELISA doble, que es específico para el anticuerpo y específico para el antibiótico. Las moléculas AAC individuales pueden identificarse en la mezcla mediante espectroscopía de masas y separarse mediante HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba (véase, por ejemplo, McDonagh et al (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Resumen N.° 624, American Association for Cancer Research, Reunión Anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibodydrug conjugates," Resumen N.°627, American Association for Cancer Research, Reunión Anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004). En determinadas realizaciones, se puede aislar un AAC homogéneo con un único valor de carga de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía. Los anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína de la invención permiten preparaciones más homogéneas ya que el sitio reactivo en el anticuerpo se limita principalmente al tiol de la cisteína modificada por ingeniería. En una realización, el número promedio de restos antibióticos por anticuerpo está en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, el intervalo se selecciona y controla de aproximadamente 1 a 4.
MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE CONJUGADOS ANTICUERPO-ANTIBIÓTICO
Un AAC de Fórmula I puede prepararse por varias vías empleando reacciones, condiciones y reactivos de química orgánica conocidos por los expertos en la materia, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente para formar Ac-L a través de un enlace covalente, seguida de la reacción con un resto antibiótico (abx); y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un resto antibiótico con un reactivo enlazador bivalente, para formar L-abx, a través de un enlace covalente, seguida de la reacción con un grupo nucleófilo de un anticuerpo. En el documento US 7498298 se describen métodos a modo de ejemplo para preparar un AAC de Fórmula I a través de la última vía.
Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, pero sin limitación: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo cisteína y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcar en los que el anticuerpo está glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos enlazadores y reactivos enlazadores incluyendo: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, esteres de HOBt, haloformiatos y haluros ácidos; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida. Determinados anticuerpos tienen disulfuros intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para su conjugación con reactivos enlazadores mediante tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol) o tricarboniletilfosfina (TCEP), de modo que el anticuerpo se reduce total o parcialmente. Por tanto, cada puente de cisteína formará, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en los anticuerpos mediante la modificación de restos de lisina, por ejemplo, haciendo reaccionar restos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden introducirse en un anticuerpo introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más restos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos variantes que comprenden uno o más restos de aminoácido de cisteína no nativos).
Los conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención también pueden producirse por reacción entre un grupo electrófilo en un anticuerpo, tal como un grupo carbonilo aldehído o cetona, con un grupo nucleófilo en un reactivo enlazador o antibiótico. Los grupos nucleófilos útiles en un reactivo enlazador incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y arilhidrazida. En una realización, un anticuerpo se modifica para introducir restos electrófilos que son capaces de reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo enlazador o antibiótico. En otra realización, los azúcares de los anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos enlazadores o restos antibióticos. Los grupos de bases de Schiff, iminas, resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, mediante reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una realización, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con bien galactosa oxidasa o metaperyodato de sodio puede producir grupos carbonilo (aldehído y cetona) en el anticuerpo que pueden reaccionar con grupos apropiados en el antibiótico (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra realización, los anticuerpos que contienen restos de serina o treonina N-terminal pueden reaccionar con metaperyodato de sodio, dando como resultado la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; documento US 5362852). Dicho aldehído se puede hacer reaccionar con un resto antibiótico o nucleófilo enlazador.
Los grupos nucleófilos en un resto antibiótico incluyen, pero sin limitación: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, esteres de HOBt, haloformiatos y haluros ácidos; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida.
Los conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC) en la Tabla 3 se prepararon mediante la conjugación de los anticuerpos anti-WTA descritos y los productos intermedios enlazador-antibiótico de la Tabla 2 y de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 24. Los AAC se probados para determinar la eficacia mediante ensayo de macrófagos in vitro (Ejemplo 18) modelo de riñón de ratón in vivo (Ejemplo 19).
T l n ni r - ni i i AA
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ANÁLISIS IN VITRO QUE DEMUESTRA QUE LOS AAC DESTRUYEN MRSA INTRACELULAR
Los experimentos in vitro confirman que el AAC libera antibiótico activo solo después de que el enlazador entre el anticuerpo y el antibiótico sea escindido por una enzima apropiada tal como catepsina B. MRSA se cultivó durante la noche en medios de crecimiento bacteriano normales y hasta 10 pg/ml de AAC. La incubación de MRSA con los AAC S4497-pipBOR o S4497-dimetil-pipBOR no dio como resultado la inhibición del crecimiento bacteriano a menos que los AAC se trataran previamente con catepsina B para liberar el antibiótico activo. Un ensayo in vitro que utiliza macrófagos peritoneales murinos confirmó que AAC libera antibiótico activo y destruye MRSA dentro de las células fagocíticas (Ejemplo 18). Un AAC que comprende el anticuerpo rF1, que se une a una familia de proteínas asociadas a la pared celular se conjugó con un derivado de rifamicina. Se trató S. aureus (cepa Newman) con varias dosis de rF1-AAC o con dosis equivalentes de cualquier anticuerpo solo, rifampicina sola o una mezcla de anticuerpo y rifampicina libre para permitir la unión del anticuerpo a las bacterias (opsonización) y después de 1 hora de incubación se proporcionaron las bacterias opsonizadas a los macrófagos (Figura 7A).
La figura 7A muestra un ensayo de macrófagos in vitro que demuestra que AAC destruye MRSA intracelular. Se incubó S. aureus (Newman) con el anticuerpo rF1 solo, rifampicina libre sola, una mezcla simple del anticuerpo rF1 más rifampicina libre combinados en la misma proporción de anticuerpo a antibiótico encontrada en el AAC o en el rF1-AAC durante 1 hora y se añadió a los macrófagos murinos. Los macrófagos se incubaron a 37 °C durante 2 horas para permitir la fagocitosis. Después de completar la fagocitosis, la mezcla de infección se reemplazó con medio de crecimiento normal complementado con 50 pg/ml de gentamicina para inhibir el crecimiento de bacterias extracelulares y se determinó el número total de bacterias intracelulares supervivientes 2 días después de la infección mediante siembra en placa.
Los macrófagos se infectaron durante 2 horas y la infección se eliminó y se reemplazó con medios que contenían gentamicina para destruir cualquier bacteria extracelular restante que no se hubiera captado por los macrófagos. Después de 2 días, los macrófagos se lisaron y se determinó el número total de bacterias intracelulares supervivientes sembrando en placas sobre placas de agar. El análisis reveló que el tratamiento con el AAC dio como resultado una reducción de más de 100 veces en el número de bacterias intracelulares en comparación con el tratamiento con una mezcla simple del anticuerpo rF 1 más rifampicina libre combinados en la misma proporción de anticuerpo a antibiótico que se encuentra en el AAC (Figura 7A).
MRSA es capaz de invadir varios tipos de células no fagocíticas, incluidos los osteoblastos y diferentes tipos de células epiteliales y endoteliales (Garzoni y Kelly, (2008) Trends in Microbiology). MRSA puede infectar una línea celular de osteoblastos (MG63), una línea celular epitelial de las vías respiratorias (A549) y cultivos primarios de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). La Figura 7B muestra la destrucción intracelular de MRSA (cepa USA300) con 50 pg/ml de AAC 102 S4497-pipBOR en macrófagos, osteoblastos (MG63), células epiteliales de las vías respiratorias (A549) y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) donde el anticuerpo S4497 no conjugado, no marcado no lo hace. Estos tipos de células probablemente expresen niveles totales más bajos de catepsina B que las células fagocíticas profesionales tales como los macrófagos, sin embargo, MRSA tratado con 50 pg/ml se destruyó eficazmente después de la internalización la totalidad de estas tres líneas celulares. La línea discontinua indica el límite de detección para el ensayo.
El análisis in vitro se realizó para comparar la actividad de AAC preparado con variaciones en el enlazador que une el anticuerpo al antibiótico. El AAC S4497-dimetil-pipBOR es más potente que el AAC S4497-pipBOR en el ensayo de destrucción intracelular en macrófagos. El AAC S4497-pipBOR y el AAC S4497-dimetil-pipBOR se valoraron para determinar la dosis mínima eficaz en el ensayo de destrucción intracelular en macrófagos de los presente inventores (Figura 7C). Puede ser necesario el tratamiento con al menos 2 pg/ml de AAC para lograr el aclaramiento óptimo de las bacterias intracelulares.
La Figura 7C muestra la comparación de AAC preparado con pipBOR 51 frente a dimetil-pipBOR (diMe-pipBOR) 54. MRSA se opsonizó con el anticuerpo S4497 solo o con Aa C: 102 S4497-pipBOR o 105 S4497-dimetil-pipBOR a varias concentraciones que varían de 10 pg/ml a 0,003 pg/ml. Estos datos revelaron que para ambos AAC, la destrucción óptima se produjo cuando se probaron AAC a más de 2 pg/ml, con una pérdida de actividad dependiente de la dosis que se hizo evidente a 0,4 pg/ml. El nivel general de destrucción fue significativamente superior con el AAC 105 S4497 dimetil-pipBOR. El tratamiento con dosis más altas de AAC 105 S4497-dimetil-pipBoR eliminó las bacterias intracelulares por debajo del límite de detección y se observó una destrucción de más de 300 veces usando una dosis subóptima de 0,4 pg/ml de AAC.
La Figura 7D muestra que AAC destruye las bacterias intracelulares sin dañar los macrófagos. La cepa USA300 de S. aureus se incubó previamente con 50 pg/ml del anticuerpo S4497 anti-S. aureus (anticuerpo) o con 50 pg/ml de AAC 105tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR, durante 1 hora para permitir la unión del anticuerpo a la bacteria. Se añadieron bacterias opsonizadas a los macrófagos peritoneales murinos a múltiples infecciones de 10­ 20 bacterias por macrófago y se incubaron a 37 °C durante 2 horas para permitir la fagocitosis. Después de completar la fagocitosis, se eliminaron las bacterias libres y los macrófagos se cultivaron durante 2 días en medios de crecimiento normales complementados con 50 pg/ml de gentamicina para destruir las bacterias no internalizadas. Al final del periodo de cultivo, la supervivencia de los macrófagos se evaluó detectando la liberación de lactato deshidrogenasa citoplasmática (LDH) en el sobrenadante del cultivo. La cantidad total de LDH liberada de cada pocillo se comparó con los pocillos de control que contienen macrófagos que se lisaron mediante la adición de detergente a los pocillos. Se midió la extensión de la lisis celular de macrófagos en los pocillos tratados con detergente, macrófagos no infectados, macrófagos infectados con USA300 opsonizados previamente con anticuerpo S4497 o macrófagos infectados con USA300 opsonizados previamente con AAC 105 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR.
La Figura 7E muestra la recuperación de USA300 vivas del interior de macrófagos a partir de la lisis de células de macrófagos anterior. Los macrófagos se lisaron y las diluciones en serie del lisado celular se sembraron en placas para enumerar el número de bacterias intracelulares supervivientes.
La Figura 9 muestra un ensayo de inhibición del crecimiento que demuestra que los AAC no son tóxicos para S. aureus a menos que el enlazador se escinda por la catepsina B. A la izquierda se muestra un ensayo esquemático de liberación de catepsina (Ejemplo 20). El a Ac se trata con catepsina B para liberar antibiótico libre. La cantidad total de actividad antibiótica en el AAC intacto frente al tratado con catepsina B se determina preparando diluciones en serie de la reacción resultante y determinando la dosis mínima de AAC que puede inhibir el crecimiento de S. aureus. El gráfico superior derecho muestra el ensayo de liberación de catepsina para 102 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR y el gráfico inferior derecho muestra el ensayo de liberación de catepsina para 105 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR.
EFICACIA DE CONJUGADOS ANTICUERPO CONJUGADO IN VIVO:
Se estableció un modelo de peritonitis in vivo en ratones para probar la eficacia de AAC. En este modelo, los ratones se infectan por inyección intraperitoneal (IP) de MRSA y la carga bacteriana se monitoriza 2 días después de la infección en el líquido peritoneal y el riñón. Las bacterias recogidas del peritoneo podrían encontrarse bien como bacterias libres extracelulares flotantes o internalizadas dentro de las células peritoneales, principalmente neutrófilos y macrófagos, que se reclutan en el sitio de la infección. Aunque las bacterias extracelulares identificadas en este modelo parecían ser sensibles al tratamiento con antibióticos, se demostró que las bacterias intracelulares no respondían al tratamiento con una serie de antibióticos clínicamente relevantes, incluyendo rifampicina (Sandberg et al (2009) Antimicrobial Agents Chemother) y, por lo tanto, parecían ser una excelente diana para evaluar la eficacia de los AAC de los presentes inventores.
La figura 8A muestra la eficacia in vivo del AAC 102 S4497-pipBOR. Modelo de infección intraperitoneal en ratones A/J. Los ratones se infectaron con 5x107 UFC de MRSA por inyección intraperitoneal y se trataron con 50 mg/Kg de anticuerpo S4497 solo o con 50 mg/Kg de AAC 102 S4497-pipBOR por inyección intraperitoneal (protocolo 11-2032A). Los ratones se sacrificaron 2 días después de la infección y se evaluó la carga bacteriana total en el sobrenadante peritoneal (bacterias extracelulares), en las células peritoneales (bacterias intracelulares) o en el riñón. Los ratones A/J se infectaron con USA300 y se les administró 50 mg/Kg bien de anticuerpo S4497 o de AAC 102 S4497-pipBOR treinta minutos después de la infección. Después de 2 días, los ratones se sacrificaron y se monitorizaron las cargas bacterianas en el lavado peritoneal y el riñón. Para distinguir entre bacterias extracelulares e intracelulares, el lavado peritoneal se centrifugó suavemente para separar el sobrenadante, que contenía bacterias extracelulares, y las células peritoneales. Las células peritoneales se trataron con lisostafina para destruir cualquier bacteria extracelular contaminante y se lisaron para enumerar el número total de bacterias intracelulares en el momento de la recogida. Aunque los ratones tratados con anticuerpo solo albergaban entre 105 y 106 UFC de bacterias tanto intracelulares como extracelulares en el lavado peritoneal y entre 104 y 106 bacterias en el riñón, los ratones tratados con el AAC S4497-pipBOR AAC aclararon la infección por debajo del límite de detección. Estos datos revelaron que aunque el AAC está diseñado para liberar antibióticos activos dentro del fagolisosoma, se observó un aclaramiento excelente tanto de los grupos intracelulares como extracelulares de MRSA. Debido a que las bacterias extracelulares no se destruyen directamente por el AAC, el hecho de que estas bacterias también fueran eliminadas por el tratamiento con AAC sugiere que una fracción significativa de las bacterias extracelulares es captada por las células en algún momento durante la infección, o que el AAC puede potenciar la captación de bacterias extracelulares aumentando así la proporción relativa de bacterias que son intracelulares donde son eliminadas de manera eficaz por el AAC.
También se examinó la eficacia del AAC en un modelo de infección intravenosa. En este modelo, los neutrófilos circulantes captan S. aureus poco después de la infección, de modo que la mayoría de las bacterias que se encuentran en la sangre están asociadas con las células hospedadoras en cuestión de minutos después de la infección (Rogers, et al. (1956) J. Exp. Med. 103:713-742). Los ratones A/J se infectaron con 2x106UFC de MRSA por inyección intravenosa, y después se trataron con 50 mg/Kg de AAC por inyección intravenosa 30 minutos después de la infección. En este modelo, el sitio primario de infección es el riñón, y los ratones desarrollan grandes abscesos que son detectables dos días después de la infección y no pueden aclararse hasta 30 días en ausencia de tratamiento. El tratamiento con 50 mg/Kg del AAC 102 S4497-pipBOR aclaró la infección en todos los ratones probados (Figura 8B).
La Figura 8B muestra el modelo de infección intravenosa en ratones A/J. Los ratones se infectaron con 2x106 UFC por inyección intravenosa y se trataron con 50 mg/Kg de anticuerpo S4497, 50 mg/Kg de AAC 102 S4497-pipBOR o con una mezcla simple de 50 mg/Kg de anticuerpo S4497 0,5 mg/Kg de rifamicina libre. Los tratamientos se suministraron mediante inyección IV 30 minutos después de la infección y los riñones se recogieron 4 días después de la infección. La línea discontinua gris indica el límite de detección para cada órgano. Los grupos de control tratados con 50 mg/kg de anticuerpo S4497 solo, o con una mezcla simple de 50 mg/kg de anticuerpo S4497 más 0,5 mg/kg de rifamicina libre (la dosis equivalente de antibiótico presente en 50 mg/kg de AAC) no fueron eficaces. Se comparó la eficacia de AAC preparado con restos antibióticos pipBOR y dimetil-pipBOR in vivo en el modelo de infección intravenosa en ratones A/J. El AAC 102 S4497-pipBOR (Figura 9A) o el a Ac 105 S4497-dimetil-pipBOR (Figura 9B) se administraron a varias dosis que varían desde 50 mg/kg a 2 mg/kg 30 minutos después de la infección y se examinaron los riñones 4 días después de la infección para determinar la carga bacteriana total. La Figura 9A muestra la eficacia de AAC 102 pipBOR en un modelo de infección intravenosa por titulación del AAC 102 S4497-pipBOR. Se infectaron ratones A/J hembra de siete semanas de edad con 2x106 UFC de MRSA (cepa USA300) por inyección intravenosa en la vena de la cola. La Figura 9B muestra la eficacia de AAC 105 dimetilpipBOR en el modelo de infección intravenosa por titulación del AAC 105 S4497-dimetil-pipBOR. Se administraron tratamientos con anticuerpo S4497, AAC 102 o AAC 105 a las dosis indicadas 30 minutos después de la infección. Los ratones se sacrificaron 4 días después de la infección y se determinó el número total de bacterias supervivientes por ratón (2 riñones agrupados) mediante siembra en placas.
Ambos AAC fueron eficaces a la dosis más alta de 50 mg/Kg, sin embargo, el AAC 102 S4497-pipBOR solo fue parcialmente eficaz a dosis más bajas. El AAC 105 S4497-dimetil-pipBOR produjo un aclaramiento bacteriano completo a dosis superiores a 10 mg/kg. Experimentos posteriores indicaron que se requerían dosis superiores a 15 mg/kg para un aclaramiento bacteriano consistente. Las Figuras 9A y 9B muestran que AAC 105 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR es más eficaz que AAC 102 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR en un modelo de infección intravenosa lo que indica un efecto de la distinción estructural del carbamato (51) y el dimetilpiperidilo (54) entre 102 y 105, respectivamente.
Los ratones se trataron con el AAC 30 minutos después de la infección. Para replicar mejor las condiciones que probablemente se producen en pacientes con MRSA que buscan tratamiento, se determinó si el AAC es eficaz para aclarar una infección establecida y que la vinculación del antibiótico con un anticuerpo anti-S. aureus proporciona una ventaja definitiva sobre el tratamiento con antibiótico solo. Con este fin, se comparó la eficacia de AAC con una dosis equivalente del antibiótico dimetil-pipBOR.
La Figura 9C muestra ratones CB17.SCID infectados con 2x107 UFC de MRSA por inyección intravenosa (protocolo 12-2418). Un día después de la infección, los ratones se trataron con 50 mg/Kg de anticuerpo S4497, 50 mg/Kg de AAC 105 S4497 dimetil-pipBOR o con 0,5 mg/Kg de antibiótico 7 dimetil-pipBOR, la dosis equivalente de antibiótico contenida en 50 mg/Kg de AAC). Los ratones se sacrificaron 4 días después de la infección y se determinó el número total de bacterias supervivientes por ratón (2 riñones agrupados) mediante siembra en placas. El tratamiento con 50 mg/Kg de AAC S4497-dimetil-pipBOR fue claramente eficaz cuando se administró 1 día después de la infección, mientras que el tratamiento con la dosis equivalente de dimetil-pipBOR solo no logró aclarar la infección. EL TRATAMIENTO CON UN AAC ES EFICAZ EN PRESENCIA DE ANTICUERPOS HUMANOS Y SUPERIOR AL TRATAMIENTO CON EL TRATAMIENTO DE REFERENCIA (SOC) ACTUAL CON VANCOMICINA
El anticuerpo S4497 se clonó a partir de linfocitos B derivados de pacientes infectados por S. aureus. Esto planteó la preocupación de que el suero humano normal, o el suero presente en pacientes infectados con MRSA, puede contener anticuerpos anti-MRSA que competirían por unirse con el AAC de los presentes inventores. Para abordar esto, se probó el suero humano derivado de donantes sanos normales y un panel de pacientes con MRSA para estimar el nivel general de anticuerpos anti-MRSA que reconocen el mismo antígeno que el AAC. Se desarrolló un ensayo basado en ELISA usando preparaciones de pared celular de MRSA. Para limitar la unión no específica de antígeno a las preparaciones de la pared celular en estos ensayos, se utilizó una cepa de MRSA que es deficiente en el gen para la proteína A. La proteína A se une a la región Fc de los anticuerpos IgG. Se examinó la unión de varias muestras de suero de tipo silvestre (WT) a MRSA que expresaban el antígeno de S4497 (Figura 10A, WT) frente a la unión a un mutante de la cepa de MRSA TarM/TarS DKO (doble nuligénica) que carece de las modificaciones de azúcares que reconoce el anticuerpo S4497. La Figura 10A muestra la prevalencia de anticuerpos anti-S. aureus en suero humano. Los pacientes infectados por S. aureus o los controles normales contienen altas cantidades de anticuerpo sérico específico de WTA con la misma especificidad que S4497 anti-WTA.
Se generó una curva patrón utilizando un anticuerpo monoclonal que se une bien al mismo antígeno reconocido por S4497. Al comparar el nivel de unión en muestras de suero con la señal obtenida del anticuerpo utilizado para generar la curva patrón, se estimó el nivel de anticuerpos anti-MRSA presentes en muestras de suero derivadas de donantes sanos normales o pacientes con MRSA, o en preparaciones de IgG total aisladas de suero normal (Figura 10A). El suero humano normal contiene 10-15 mg/ml de IgG total (Manz et al. (2005) Annu Rev. Immunol. 23:367). El análisis de la reactividad anti-MRSA en las diferentes muestras de suero reveló que hasta 300 pg/ml de estos anticuerpos son potencialmente reactivos con el mismo antígeno reconocido por S4497 y, por lo tanto, es probable que compitan por la unión con el AAC.
El anticuerpo S4497 se usó para generar AAC para determinar las propiedades incluyendo la unión muy alta en MRSA (50.000 sitios de unión estimados por bacteria). Un número suficiente de AAC puede ser capaz de unirse a MRSA incluso en presencia de los anticuerpos competidores encontrados en el suero humano. Para probar esto directamente, se tituló el AAC S4497-dimetil-pipBOR en tampón complementado con 10 mg/ml de IgG humana (Figura 10B, IGIV) y se midió el nivel de destrucción intracelular en el ensayo de destrucción intracelular de macrófagos.
La figura 10B muestra un modelo de infección in vivo que demuestra que AAC es eficaz en presencia de niveles fisiológicos de IgG humana. El ensayo de macrófagos in vitro con la cepa USA300 de MRSA muestra que AAC 105 S4497-dimetil-pipBOR es eficaz en presencia de 10 mg/ml de IgG humana. La cepa USA300 de MRSA se opsonizó con AAC solo, o con AAC diluido en 10 mg/ml de IgG humana durante 1 hora a 37 °C con agitación. Las bacterias opsonizadas se añadieron directamente a los macrófagos peritoneales murinos y se incubaron durante 2 horas para permitir la fagocitosis. Después de la infección, los cultivos de macrófagos se mantuvieron en medios completos complementados con gentamicina y se evaluó el número total de bacterias intracelulares supervivientes 2 días después de la infección. Estos datos revelaron que aunque la IgG humana inhibió la destrucción por AAC a las dosis más bajas, se logró una excelente destrucción utilizando dosis superiores a 10 |jg/ml, una concentración de anticuerpos que se puede lograr fácilmente in vivo. La IgG sérica normal puede disminuir el efecto funcional de AAC 105. Debido a que la máxima actividad de destrucción intracelular de macrófagos de un AAC puede requerir una alta unión al antígeno y una interacción eficaz con los FcR (para la opsonofagocitosis), los anticuerpos séricos preexistentes pueden competir ambos por unirse a WTA y los complejos inmunitarios formados correspondientes compiten por unirse a los FcR en macrófagos.
Para confirmar que el AAC sería eficaz en presencia de anticuerpos humanos de competencia in vivo, el modelo de infección in vivo se modificó para generar ratones que expresen niveles normales de IgG humana en el suero. Se reconstituyeron ratones CB17:SCID, que carecen tanto de linfocitos T como de linfocitos B y, por lo tanto, no tienen anticuerpos en el suero (Bosna & Carroll, (1991) Ann Rev Immunol. 9:323), con 10 mg/ml de IgG humana por dosificación diaria de IgG humana altamente concentrada (IGIV). Los estudios preliminares confirmaron que estos ratones, denominados SCID:huIgG, tenían, de hecho, niveles sostenidos de al menos 10 mg/ml de IgG humana en el suero y que estos ratones eran igualmente susceptibles a la infección por MRSA en comparación con los controles no tratados. Los ratones SCID:huIgG se infectaron con MRSA y se trataron bien con el anticuerpo S4497 o con el AAC S4497-dimetil-pipBOR (50 mg/Kg) 1 día después de la infección. Cuatro días después de la infección se evaluó la carga bacteriana en los riñones (Fig. 10C).
La Figura 10C muestra los datos combinados de 3 experimentos independientes usando 2 preparaciones separadas de AAC 105 o 112 tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetil-pipBoR. Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero. Los ratones se trataron con anticuerpo S4497 (50 mg/Kg) o AAC S4497-dimetil-pipBOR (50 mg/Kg). Los ratones tratados con el AAC tuvieron una reducción mayor de 4 en escala logarítmica en las cargas bacterianas (prueba t de Student p = 0,0005). Las cargas bacterianas fueron en promedio más de 10.000 veces más bajas en los ratones tratados con el AAC S4497-dimetil-pipBOR en comparación con los ratones tratados con el control de anticuerpos S4497, indicando que el AAC fue claramente eficaz incluso en presencia de altos niveles de anticuerpos humanos anti-MRSA de competencia.
La eficacia del AAC se comparó con la del tratamiento con vancomicina, el tratamiento de referencia actual para las infecciones por MRSA. La figura 11A muestra el modelo de infección in vivo que demuestra que el AAC es más eficaz que el antibiótico vancomicina de tratamiento de referencia (SOC) actual en ratones que se reconstituyen con niveles normales de IgG humana. Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero. Los ratones se trataron con anticuerpo S4497 (50 mg/Kg), vancomicina (100 mg/Kg), AAC S4497-dimetil-pipBOR (50 mg/Kg), 112 o un AAC preparado con un anticuerpo de control de isotipo que no reconoce MRSA, AAC 110 tio-hu-anti gD 5B5-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR (50 mg/Kg). Se administró, a los ratones que recibieron AAC, una dosis única de AAC el día 1 después de la infección mediante inyección intravenosa. Se administró, a los ratones que recibieron tratamientos con vancomicina, dos veces al día inyecciones del antibiótico por inyección intraperitoneal. Todos los ratones se sacrificaron el día 4 después de la infección y se determinó el número total de bacterias supervivientes por ratón (2 riñones agrupados) mediante siembra en placas.
El tratamiento con vancomicina es eficaz para tratar la infección por MRSA en el modelo de infección intravenosa murina de los presentes inventores si el tratamiento se inicia 30 minutos después de la infección. La dosis dos veces al día con 100 mg/kg de vancomicina no logró aclarar la infección y solo fue capaz de reducir las cargas bacterianas en aproximadamente 50 veces, cuando se inició el tratamiento más de 1 día después de la infección (Figura 11A). Asombrosamente, el tratamiento con una dosis única del AAC S4497-dimetil-pipBOR 1 día después de la infección fue capaz de aclarar la infección en la mayoría de los ratones. Sorprendentemente, el tratamiento con AAC de control preparado con un anticuerpo IgG humano que no reconoce S. aureus (gD-AAC) tuvo cierta eficacia en este modelo. El anticuerpo gD no reconoce S. aureus a través de su sitio de unión a antígeno, sin embargo, el anticuerpo es capaz de unirse a la proteína A que se encuentra en S. aureus.
La figura 11C muestra el modelo de infección in vivo que demuestra que el AAC, 129 tio-S6078-HC A114C-LCWT-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR es más eficaz que el anticuerpo anti-WTA S4497 no marcado, de acuerdo con el mismo régimen que la Figura 11A, en ratones que se reconstituyen con niveles normales de IgG humana. Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero. Los ratones se trataron con anticuerpo S4497 (50 mg/Kg) o con AAC 129 tio-S6078-HC A114C-LCWT-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR (50 mg/Kg).
El análisis FACS mostró que la tinción con altas concentraciones del anticuerpo gD en bacterias aisladas de una infección in vivo produce un bajo nivel de unión a S. aureus respecto a la unión de anticuerpos anti-MRSA a MRSA aislado de riñones infectados (Figura 11B). Los ratones se infectaron con MRSA mediante inyección intravenosa y los riñones infectados se eliminaron 3 días después de la infección y se homogeneizaron. Los anticuerpos anti-MRSA o de control se marcaron con Alexa-488 y se analizaron en un intervalo de concentraciones entre 0,08 pg/ml y 50 pg/ml. El anticuerpo S4497 reconoce una modificación de N-acetilglucosamina que está enlazada al ácido teicoico de la pared (WTA) a través de un enlace beta-anomérico en la pared celular de S. aureus. El anticuerpo S7578 se une a una modificación similar de N-acetilglucosamina que se une a WTA a través de un enlace alfaanomérico. El anticuerpo rF1 es un anticuerpo anti-MRSA de control positivo que reconoce las modificaciones de azúcares encontradas en una familia de proteínas ancladas a la pared celular que contienen repetición de SDR. El anticuerpo gD es una IgGi humana de control negativo que no reconoce S. aureus. Aunque el nivel general de unión con el anticuerpo gD es significativamente menor que el obtenido con el anticuerpo S4497 (estimado que es al menos 30 veces menor por análisis FACS, Figura 11B), la eficacia limitada observada con el gD-AAC indica que incluso la unión a bajo nivel de un AAC en MRSA in vivo es suficiente para producir una eficacia que parecía equivalente a la reducción en las UFC obtenidas con vancomicina.
Los datos anteriores demuestran claramente que los AAC son capaces de destruir el MRSA intracelular y que los AAC S4497-pipBOR y S4497 dimetil-pipBOR son eficaces para limitar la infección por MRSA tanto in vitro como in vivo. Los AAC de la invención actúan destruyendo las bacterias dentro de las células de mamíferos y, de este modo, proporcionan un tratamiento terapéutico único que es más eficaz para destruir las poblaciones de bacterias que son resistentes al tratamiento con vancomicina.
La Figura 20 muestra que el tratamiento previo con 50 mg/kg de anticuerpos libres no es eficaz en un modelo de infección intravenosa. Los ratones Balb/c recibieron una dosis única de vehículo control (PBS) o 50 mg/kg de anticuerpos por inyección intravenosa 30 minutos antes de la infección con 2x107 UFC de USA300. Los grupos de tratamiento incluyeron un anticuerpo de control de isotipo que no se une a S. aureus (gD), un anticuerpo dirigido contra la modificación beta del ácido teicoico de la pared (4497) o un anticuerpo dirigido contra la modificación alfa del ácido teicoico de la pared (7578). Los ratones control recibieron tratamientos dos veces al día con 110 mg/kg de vancomicina mediante inyección intraperitoneal (Vanco). Todos los ratones se sacrificaron el día 4 después de la infección y se determinó el número total de bacterias supervivientes los riñones (2 riñones agrupados) mediante siembra en placas. Aunque el tratamiento previo con vancomicina aclaró la infección en todos los ratones probados, el tratamiento previo con anticuerpos dirigidos contra la pared celular de S. aureus no tuvo efecto sobre las cargas bacterianas.
Las Figuras 21 y 22 muestran que los AAC dirigidos contra la modificación beta del ácido teicoico de la pared o contra la modificación alfa del ácido teicoico de la pared son eficaces en un modelo de infección intravenosa que usa ratones reconstituidos con niveles normales de IgG humana. Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero e se infectaron con 2x107 UFC de USA300 por inyección intravenosa. El tratamiento se inició 1 día después de la infección con control de solo tampón (PBS), 60 mg/Kg de AAC de WTA-beta (AAC 136) o 60 mg/Kg de AAC de WTA-alfa (AAC 155). Los ratones se sacrificaron el día 4 después de la infección y se determinó el número total de bacterias supervivientes en los riñones (2 riñones agrupados, Figura 21) y el corazón (Figura 22) mediante siembra en placas. El tratamiento con el AAC de WTA-beta dio como resultado una reducción de 100.000 veces en la carga bacteriana en el riñón en comparación con los ratones tratados con el vehículo control. El tratamiento con el AAC de WTA-alfa dio como resultado una reducción promedio de 9.000 veces en la carga bacteriana en el riñón.
Hasta la fecha, sigue siendo incierto por qué los antibióticos disponibles actualmente son a con frecuencia ineficaces para destruir las reservas intracelulares de bacterias. Los antibióticos pueden fallar porque no alcancen concentraciones suficientes dentro de las células, ya sea porque no entran al compartimento fagolisosómico donde residen las reservas intracelulares de bacterias o porque pueden estar sujetos a la actividad de las bombas de eflujo que eliminan el antibiótico de las células de los mamíferos. Los antibióticos pueden dañarse por condiciones severas que se encuentran dentro del fagolisosoma, incluido un pH bajo, agentes reductores y agentes oxidantes que se liberan específicamente para destruir la bacteria fagocitada. Alternativamente, los antibióticos pueden fallar porque las bacterias regulan los mecanismos de defensa o no se dividen dentro del fagolisosoma y, por lo tanto, se vuelven transitoriamente insensibles a los antibióticos. La importancia relativa de estos mecanismos de resistencia a los antibióticos será diferente para los diferentes patógenos y para cada antibiótico. El componente antibiótico de los AAC de los presentes inventores, pipBOR y dimetil-pipBOR son de hecho más potentes que la rifampicina para destruir el MRSA intracelular cuando se prueban como antibióticos libres. La unión de estos antibióticos a un anticuerpo proporciona un aumento real dependiente de la dosis de la eficacia que es evidente in vivo (Figura 9C). En este caso, es probable que la eficacia mejorada del AAC sobre el antibiótico solo se deba a una combinación de su capacidad para opsonizar bacterias y a una farmacocinética mejorada de AAC. La mayoría de los antibióticos libres se aclaran rápidamente in vivo y requieren dosis repetidas con altas concentraciones de antibiótico para mantener concentraciones suficientes de antibiótico en suero. Por el contrario, los AAC tienen semividas largas en suero debido a la porción de anticuerpo de la molécula. Debido a que los AAC liberan el antibiótico solo después de unirse a S. aureus y ser transportados junto con la bacteria al espacio confinado del fagolisosoma, concentran pequeñas dosis de antibiótico específicamente en un nicho donde fracasan la mayoría de los antibióticos. Por lo tanto, además de actuar de forma selectiva en reservorios protegidos de bacterias intracelulares, los AAC pueden facilitar el uso de antibióticos más potentes que pueden resultar demasiado tóxicos para su uso como agente único al limitar la liberación del antibiótico donde más se necesita.
Las Figuras 35 y 36 muestran los resultados del Ensayo de macrófagos in vitro para AAC tio-S6078. Se incubó S. aureus (USA300 NRS384) con anticuerpo S6078 no conjugado a 50 ug/ml y AAC a 50 pg/ml, 5 pg/ml, 0,5 pg/ml o 0,05 pg/ml durante 1 hora para permitir la unión del anticuerpo a la bacteria. Las bacterias opsonizadas resultantes se proporcionaron a macrófagos murinos y se incubaron a 37 °C para permitir la fagocitosis. Después de 2 horas, la mezcla de infección se eliminó y se reemplazó con medio de crecimiento normal complementado con 50 pg/ml de gentamicina para destruir cualquier bacteria extracelular restante. El número total de bacterias intracelulares supervivientes se determinó 2 días después mediante la siembra en placa de diluciones en serie de los lisados de macrófagos en placas de Agar de Soja Tríptico. En la figura 35, el a Ac tio-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) fue eficaz para destruir bacterias intracelulares a dosis iguales o superiores a 0,5 pg/ml con una carga antibiótica de 2,0 (AAC-173) o 3,9 (AAC-171) de antibióticos dimetilpipBOR ( LA-54) por anticuerpo tio-S6078. En la figura 36, tio-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBoR) fue eficaz para destruir bacterias intracelulares a dosis iguales o superiores a 0,5 pg/ml con una carga antibiótica de antibióticos piperazBOR (LA-65) de 1,8 (AAC-174) o 3,9 (AAC-172) por anticuerpo tio-S6078.
Las Figuras 37 y 38 muestran resultados de la eficacia in vivo de AAC tio-S6078 en un modelo murino de infección intravenosa. Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero. Los ratones fueron infectados con USA300 y tratados con vehículo control (PBS), AAC tio-S6078.v4.HC-WT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) con una carga antibiótica de 2,0 (AAC-173) o 3,9 (AAC-171) de antibióticos dimetilpipBOR (LA-54) por anticuerpo tio-S6078 (Figura 37) y tio -S6078.v4.HC-Wt , LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR) con una carga antibiótica de 1,8 (AAC-174) o 3,9 (AAC-172) de antibióticos piperazBOR (LA-65) por anticuerpo tio-S6078 (Figura 38). Los ratones recibieron una dosis única de AAC el día 1 después de la infección mediante inyección intravenosa y se sacrificaron el día 4 después de la infección. El número total de bacterias supervivientes en 2 riñones se determinó mediante siembra en placas. El tratamiento con AAC que contenían una carga antibiótica más baja redujo las cargas bacterianas en aproximadamente 1.000 veces y el tratamiento con AAC que contenían una carga antibiótica más alta redujo las cargas bacterianas en más de 10.000 veces.
ENLACES ESCINDIBLES POR ESTAFOPAINA B PARA CONJUGADOS ANTICUERPO-ANTIBIÓTICO
En el presente documento se describe un enlazador escindible por proteasa para ser escindido por estafopaína B, una endopeptidasa secretada por S. aureus. Para diseñar un enlazador escindido de menara específica por la bacteria Staphylococcus aureus, se caracterizó el sobrenadante de cultivo de S. aureus con actividad proteasa usando una biblioteca de péptidos de FRET. A partir de esta exploración, se identificó una especificidad de sustrato única. Usando este sustrato, la enzima responsable de la actividad se purificó del sobrenadante de cultivo y se identificó como estafopaína B. Basándose en esta identificación, se generó un enlazador optimizado para estafopaína B y se enlazó a piperazino-rifamicina:
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Piperazino-rifamicina es un antibiótico potente de tipo rifalazil. El AAC resultante ha demostrado eficacia en modelos de infección por MRSA in vitro e in vivo, proporcionando un mecanismo novedoso para actuar de forma selectiva contra infecciones por MRSA. La estafopaína B es una cisteína proteasa secretada de la familia de papaína de las endopeptidasas (N.° de Reg. CAS 347841-89-8, Sigma-Aldrich número S3951, Filipek et al (2005) J. Biol. Chem. 280 (15): 14669-74) y ha evolucionado para tener una especificidad de sustrato exclusiva, prefiriendo cadenas laterales aromáticas voluminosas en la posición P2. La expresión de estafopaína B está controlada por el sistema de percepción de cuórum agr (o regulador de genes accesorio) (Janzon, L. y S. Arvidson (1990) The EMBO journal 9 (5): 1391-1399) como parte de la cascada proteolítica estafilocócica (SCP, por sus siglas en inglés). Agr modula la expresión de proteasas secretadas y otros factores de virulencia de S. aureus incluyendo aureolisina, V8 y estafopaína A (Shaw, L., E. Golonka, et al. (2004) Microbiology 150(Pt 1): 217-228). La estafopaína B se ha implicado como un potente factor de virulencia debido a su capacidad para degradar el tejido conectivo del hospedador, así como para aumentar varias proteínas del sistema inmunitario (Imamura, T., S. Tanase, et al. (2005) Journal of experimental medicine 201(10): 1669-1676; Potempa, J., A. Dubin, et al. (1988) Journal of biological chemistry 263(6): 2664-2667; Ohbayashi, T., A. Irie, et al. (2011) Microbiology 157(Pt 3): 786-792; Smagur, J., K. Guzik, et al. (2009); Biological chemistry 390(4): 361-371; Smagur, J., K. Guzik, et al. (2009); Journal of innate immunity 1(2): 98-108; Kulig, P., B. A. Zabel, et al. (2007); Journal of immunology 178(6): 3713-3720). El papel de la estafopaína B como un importante factor de virulencia la convierte en una diana atractiva para la liberación de antibióticos mediada por proteasas.
Identificación de sustratos escindidos por proteasas de Staphylococcus aureus:
Para identificar sustratos fácilmente escindidos por endopeptidasas de S. aureus, se incubó sobrenadante de un cultivo durante la noche de la cepa Wood46 de S. aureus con una biblioteca de péptidos de FRET disponible comercialmente. La cepa Wood46 tiene un locus agr constitutivamente activo, por lo tanto, la cepa Wood46 muestra una expresión de proteasa aumentada en comparación con el tipo silvestre. La biblioteca de péptidos de FRET, Biblioteca de Perfiles de Endopeptidasas Rápidas o PepSets ™ REPLi (por sus siglas en inglés) (Mimotopes, Victoria, Australia), consiste en 512 pocillos con 8 péptidos fluorogénicos desactivados internamente por pocillo en un formato de placa de 96 pocillos. Los péptidos emiten fluorescencia tras la escisión, lo que permite monitorizar la actividad proteolítica en tiempo real. Cada péptido tiene un núcleo tripeptídico variable flanqueado por una serie de restos de glicina a cada lado y dos restos de lisina adicionales en el extremo C para determinar la solubilidad. El sobrenadante del cultivo Wood46 se añadió a la biblioteca y las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Los pocillos que mostraban un aumento de fluorescencia superior a 15 veces (12 de 512 pocillos en total) se analizaron por LC-Ms (Agilent Q-TOF) para determinar los productos de escisión. Los sitios de escisión se clasificaron basándose en la frecuencia (Tabla 4). Entre los mejores resultados, se observó un patrón en la especificidad del sustrato, específicamente una preferencia por cadenas laterales hidrófobas voluminosas de Phe y Tyr en la posición P2.
Tabla 4. Preferencias de aminoácidos de las secuencias REPLi escindidas por proteasas secretadas por Wood46.
A n n i n i i n
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Abundancia en cada posición de restos de aminoácidos presentes en los péptidos de FRET de los pocillos que mostraron el mayor aumento en la fluorescencia. Los péptidos REPLi contienen la secuencia MCA-Gly-Gly-Gly-Xaa-Yaa-Zaa-Gly-Gly-DPA-Lys-Lys (SEQ ID NO: 132), donde Xaa, Yaa y Zaa varían. Los restos de glicina presentes en la tabla representan los restos de Gly que flanquean el núcleo variable. Mientras que los restos de Gly son los más abundantes en varias posiciones, dan poca información sobre la especificidad del sustrato. Al diseñar los enlazadores, se dio preferencia a los aminoácidos del núcleo variable. Los aminoácidos que no estaban en ninguno de los mejores resultados se omitieron de la tabla.
Diseño y conjugación de un sustrato de FRET escindido por una proteasa de MRSA in vitro:
Se diseñó y sintetizó un péptido usando los restos más frecuentes en los péptidos escindidos de la exploración REPLi usando información de especificidad para PI, P2 y P3. El péptido tenía la secuencia GGAFAGGG (SEQ ID NO: 126) con la escisión esperada entre GGAFA (SEQ iD NO: 131) y GGG. El péptido se sintetizó usando síntesis en fase sólida que incorpora colorantes fluorescentes, tetrametilrodamina (TAMRA) y fluoresceína como un par de FRET (Figura 26) con ácido maleimido-propiónico añadido al extremo N para permitir la conjugación con los restos de cisteína del anticuerpo. El mal-FRET-péptido resultante, maleimido-propiónico (MP)-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(fluoresceína) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 125), se conjugó con el anticuerpo tioMab modificado por ingeniería con cisteína, tio-S4497. El mal-FRET-péptido también se conjugó con el tioMab trastuzumab modificado por ingeniería con cisteína anti-Her2, un control que no se une.
El conjugado de FRET tio-S4497-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(Fluoresceína) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 125) y el conjugado de FRET de control que no se une, tio-trastuzumab-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(fluoresceína) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 125), se incubaron con cultivos en fase logarítmica de Wood46 (Figura 28) y de tipo silvestre, USA300 (Figura 29), a densidades celulares de 108 células/ml y 107 células/ml en caldo de soja tríptico (TSB, por sus siglas en inglés). La concentración final de MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys (fluoresceína) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 125) para todos los pocillos fue 2 pM. La fluorescencia se monitorizó a lo largo del tiempo a 37 °C, excitación A495nm/emisión A518nm. Se observó un aumento en la fluorescencia con el conjugado 4497-mal-FRET-péptido tanto en Wood46 como en USA300, indicando que el péptido de FRET se escinde por una proteasa de S. aureus y que la proteasa está presente en ambas cepas. La unidad enlazadora MP-K(TAMRA)GGAFAGGGK(fluoresceína) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ iD NO: 125) se escinde tanto en Wood46 como en USA300 cuando se conjuga con un anticuerpo que se une a S. aureus. La validación de la escisión de este enlazador modelo en USA300 fue crítica debido a su relevancia para la cepa clínica de MRSA a la que se dirigiría un posible conjugado terapéutico anticuerpo-antibiótico (AAC). El conjugado de FRET tio-S4497-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK (fluoresceína) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 125) muestra un aumento de fluorescencia en ambas cepas, indicando que el enlazador se escinde por una proteasa de S. aureus y que la proteasa está presente en la cepa clínicamente relevante de MRSA, USA300. La densidad celular afecta la tasa de escisión, produciéndose escisión antes en los cultivos de mayor densidad celular. El conjugado de control que no se une tio-trastuzumab-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(Fluoresceína) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 125) no mostró un aumento de fluorescencia en ninguna condición probada.
Basándose en el sustrato escindido de los ensayos basados en células, el producto intermedio enlazador-antibiótico LA-59 (Tabla 2) se preparó y se conjugó con anticuerpos para formar una cadena pesada anti-MRSA, tio-S4497 (AAC-113) y tio-S4462 (AAC-114) modificados por ingeniería con cisteína y tio-trastuzumab de cadena ligera anti-HER2 (AAC-115) de la Tabla 3. El AAC enlazado a GGAFAGGG (SEQ iD NO: 126) demostró mejores tasas de escisión que el FRET-péptido cuando se incubó con sobrenadante concentrado de un cultivo Wood46 durante la noche, indicando que el enlazador-antibiótico es un mejor sustrato para la proteasa de interés desconocida. La escisión se produjo en el sitio esperado entre alanina y glicina en los AAC enlazados a GGAFAGGG ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID No : 126) (AAC-113, AAC-114, AAC-115). Este enlazador-antibiótico (LA-59) no es un sistema de suministro optimizado para el antibiótico porque después de la escisión, se libera GGG-rifamicina en lugar de rifamicina libre. Si bien el potencial terapéutico de este enlazador-antibiótico puede ser incierto, su capacidad para ser escindido de manera eficaz por la proteasa lo convierte en un compuesto instrumental útil para identificar fracciones que contienen la proteasa activa de interés. El producto intermedio enlazador-antibiótico LA-59 se conjugó con la porción Fab del anticuerpo tio-S4497 (Scheer, J. M., W. Sandoval, et al. (2012). PloS one 7(12): e51817). Los anticuerpos Fab modificados por ingeniería con cisteína, "tioFAB", tienen una cisteína reactiva que permite la conjugación específica de sitio de un compuesto reactivo de tiol. Se hizo reaccionar tioFAB S-4497 con un exceso molar de 3 veces de LA-59 sobre tioFAB durante 1 hora en TRIS 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM a temperatura ambiente. El exceso de LA-59 se separó de AAC por diafiltración en PBS. El conjugado resultante, tioFAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126) (Figura 27), se usó como un compuesto instrumental para identificar fracciones activas, con análisis LC-MS que detectó la escisión del enlazador.
Optimización de los enlazadores para una escisión eficaz por estafopaína B:
El producto intermedio enlazador-antibiótico LA-59, MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126), tiene restos de sustrato optimizados para las posiciones PI, P2 y P3. Usando los resultados de la exploración REPLi, se diseñaron y sintetizaron dos nuevos enlazadores incorporando una preferencia de resto por P4 (Figura 30). Se sintetizaron maleimido-propiónico-Leu-Ala-Phe-Ala-Ala ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 136) y maleimido-propiónico-Leu-Ala-Phe-Gly-Ala ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 135) usando síntesis en fase sólida. Isoleucina y leucina fueron los restos más frecuentes en P4 en la exploración REPLi (sin tener en cuenta la glicina). Solo se eligió un resto, Leucina, para limitar el número de enlazadores sintetizados. Ala y Gly se alternaron en la posición P1 para examinar el efecto sobre la escisión. También se incluyó un resto en P1', Ala. Se añadió cloruro de QSY®7 (xantilio, 9-[2-[[4-[[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil]-1-piperidinil]sulfonil]fenil]-3,6-bis(metilfenilamino) -NHS éster, N.° de Reg. Ca S 304014-12-8, Life Technologies) al extremo C de ambos enlazadores para actuar como un sustituto de antibiótico (Figura 30). La incorporación de QSY®7 permitió evaluar la capacidad de escisión de estos enlazadores sin consumir antibióticos costosos y laboriosos.
Los enlazadores experimentales mal-péptido-QSY7 se conjugaron con THIOFAB S4497 para evaluar la capacidad de escisión de estos enlazadores. Las conjugaciones se realizaron como se describe anteriormente. Los conjugados resultantes THIOFAB S4497 enlazador-QSY7 se evaluaron para determinar la capacidad de escisión por estafopaína B, estafopaína A y catepsina B humana a pH 7,2 (Tabla 5). Como la estafopaína B, la estafopaína A es una cisteína proteasa secretada de S. aureus de la familia de las proteasas de papaína. Es estructuralmente similar a la estafopaína B, pero tiene una especificidad de sustrato más amplia (Filipek, R., M. Rzychon, et al. (2003). The Journal of biological chemistry 278(42): 40959-40966). La Catepsina B, una cisteína proteasa lisosómica de mamífero, también es miembro de la familia de las endopeptidasas de papaína. Se cree que escinde los enlazadores de valina-citrulina utilizados en otros enlazadores de AAC descritos en esta patente.
T l . E i i n nl z r imiz r f ín in B h m n
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La Tabla 5 muestra los datos de la escisión de los enlazadores optimizados conjugados con tioFAB por la estafopaína A, estafopaína B y catepsina B. El enlazador-antibiótico final, MP-LAFG-piperazino-rifamicina ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) se escinde eficazmente por las tres proteasas. La escisión por las estafopaínas da como resultado la liberación de rifamicina libre. La escisión por catepsina B libera Phe-Glypiperazino-rifamicina (Ejemplo 26).
Diseño y conjugación de un enlazador escindible por estafopaína B que libera antibiótico libre:
De los ensayos de escisión de los enlazadores experimentales probados, se seleccionó mal-LAFGA ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 135) para la fijación a antibiótico. Se requirió una optimización adicional de este enlazador para lograr la liberación libre de antibióticos tras la escisión proteolítica. Para conseguir esto, se reemplazó la Ala en P1' por p-aminobencilo (PAB) o p-aminobenciloxicarbonilo (PABC). Se añadió piperazinorifamicina al extremo C de este enlazador para completar los productos intermedios enlazador-antibiótico lA-88 MC-LAFG-PAB-(dimetilamino-3-pirroloBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) y LA-104, MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128). Tras la escisión después de la Gly en la posición P1, los grupos PAB y PABC están diseñados para autoinmolarse, liberando antibiótico libre. LA-88 se conjugó para formar AAC-163 tio-S4497-v8-LCV205C-MC-LAFG-PAB-(dimetilamino-3-pirroloBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) (Tabla 3). LA-104 se conjugó para formar AAC-193, AAC-215 y Aa C-222. Se realizaron ensayos de escisión de AAC 193 con estafopaína A, estafopaína B y catepsina B a pH 7,2 y pH 5. Estos valores de pH se seleccionaron para imitar el plasma (pH 7,2) o el entorno del fagolisosoma (pH 5). La estafopaína B logró una escisión del 100 % a pH 5 y 7,2. La estafopaína A mostró una escisión del 100 % a pH 5 y una escisión del 64 % a pH 7,2.
La sustitución de PABC por Ala en el grupo P1' cambió la ubicación en la que la catepsina B escinde el enlazador. Tras la escisión por catepsina B, se liberó Phe-Gly-PABC-(piperazinoBOR). Como tratamiento terapéutico, la posible escisión de este enlazador por catepsina B probablemente se produciría en el compartimento lisosómico de los macrófagos. En estas circunstancias, otras proteasas, incluyendo estafopaína B, pueden procesar adicionalmente FG-PABC-piperazino-rifamicina para liberar antibiótico libre.
El producto intermedio enlazador-antibiótico, LA-104 MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) se conjugó con tioMAB S4497 para evaluar la eficacia in vitro e in vivode los AAC resultantes AAC-193, AAC-215, AAC-222. También se prepararon dos conjugados de control conjugando LA-104 con tioMAB anti-Her2 y tioMAB anti-gD, ambos controles de isotipo. El conjugado tioMAB 4497 MP-LAFG-PABC-piperazino-rifamicina ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) AAC-215, enlazado a la cadena ligera tenía una relación fármaco/anticuerpo (DAR) de 1,6, al igual que el conjugado de control tioMAB anti-gD. El conjugado tioMAB anti-Her2 mal-LAFG-PABC-piperazino-rifamicina ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) tenía una DAR de 1,5.
El sobrenadante de cultivo de S. aureus se exploró usando una biblioteca de péptidos de FRET para identificar sustratos fácilmente escindidos por proteasas secretadas. Los resultados de esta exploración mostraron que la inmensa mayoría de la actividad proteasa medida puede atribuirse a una cisteína proteasa secretada de S. aureus, estafopaína B. Los enlazadores peptídicos diseñados para la escisión por estafopaína B se optimizaron y se identificó un sustrato escindido de manera eficaz que liberaba antibiótico libre. El enlazador resultante también se escinde por la proteasa de S. aureus estafopaína A y por la proteasa humana catepsina B, ambas también cisteína proteasas.
Cuando se conjuga con un anticuerpo que se une a S. aureus, el AAC resultante muestra eficacia tanto in vitro como in vivo. Las endopeptidasas endógenas de MRSA proporcionan un mecanismo para actuar de forma selectiva contra las infecciones por MRSA y liberar la carga útil de una manera específica de la enfermedad. La capacidad de este enlazador para ser escindido por proteasas secretadas de S. aureus permite actuar de forma selectiva contra MRSA presente tanto en neutrófilos humanos como extracelularmente en plasma/tejido del hospedador. Esta doble actuación de forma selectiva puede permitir la liberación de una alta concentración de antibiótico en los sitios de infección tanto intra como extracelulares.
La expresión de estafopaína A y B está regulada positivamente en los neutrófilos humanos y se cree que son factores de virulencia importantes (Burlak, C., et al. (2007) Cellular microbiology 9 (5): 1172-1190), lo que los convierte en dianas atractivas para la liberación de antibiótico mediada por proteasas. La catepsina B humana también escinde el enlazador, presentando una vía alternativa de liberación. Es probable que la eficacia observada del AAC sea el resultado de múltiples proteasas, tanto de S. aureus como del hospedador, implicadas en la liberación de antibióticos o restos antibióticos. Un enlazador estable en suero que se escinde por varias proteasas proporciona un mecanismo de liberación que puede superar las mutaciones de resistencia de la bacteria.
MÉTODOS DE TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE INFECCIONES CON CONJUGADOS ANTICUERPO-ANTIBIÓTICO
Los AAC de la invención son útiles como agentes antimicrobianos eficaces contra varias bacterias Gram positivas humanas y veterinarias, incluyendo los estafilococos, por ejemplo S. aureus, S. saprophyticus y S. simulans; Listeria, por ejemplo, Listeria monocytogenes; Enterococos, por ejemplo E. faecalis; Estreptococos, por ejemplo S. pneumoniae; Clostridium, por ejemplo C. difficile.
La bacteriemia persistente puede ser el resultado de la internalización en las células hospedadoras. Si bien no se entiende por completo, los patógenos internalizados son capaces de escapar del reconocimiento inmunitario al sobrevivir dentro de las células hospedadoras. Dichos organismos incluyen S. aureus, Salmonela (por ejemplo, S. typi, S. choreraesuis y S. enteritidis), Legionella (p.ej, L. pneumophila), Listeria (p.ej, L. monocytogenes), Brucella (p.ej, B. abortus, B. melitensis, B. suis), Chlamydia (C. pneumoniea, C. trachomati), Rickettsia spp., Shigella (e.g., S. flexneri), y mycobacteria.
Después de la entrada en el torrente sanguíneo, S. aureus puede causar infección metastásica en casi cualquier órgano. Las infecciones secundarias se producen en aproximadamente un tercio de los casos antes del inicio de la terapia (Fowler et al., (2003) Arch. Intern. Med. 163: 2066-2072), e incluso en el 10 % de los pacientes después del inicio de la terapia (Khatib et al., (2006) Scand. J. Infect. Dis., 38:7-14). Las características distintivas de las infecciones son grandes reservorios de pus, destrucción de tejidos y formación de abcesos (todos los cuales contienen grandes cantidades de neutrófilos). Si bien solo aproximadamente el 5 % de los pacientes desarrollan complicaciones si la bacteriemia se extingue en 48 horas, los niveles se elevan al 40 %, si la bacteriemia persiste más de tres días.
Mientras S. aureus generalmente se considera un patógeno extracelular que secreta toxinas, existe evidencia de que puede sobrevivir dentro de las células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos y osteoclastos (Alexander et al, (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:361-366; Garzoni et al, (2009) Trends Microbiol. 17:59-65). Los neutrófilos y los macrófagos son componentes clave de la respuesta inmunitaria innata del hospedador a la infección bacteriana. Estas células internalizan S. aureus por fagocitosis, que se puede potenciar por anticuerpos, complemento, o lectinas del hospedador tal como la proteína de unión a manosa, que pueden unirse simultáneamente a patógenos y neutrófilos, macrófagos y otros fagocitos profesionales. Como se ha mencionado previamente, S. aureus no solo sobrevive en el entorno lisosómico, si no que, en realidad, puede explotarlo como un mecanismo para desarrollar persistencia en el hospedador.
Los conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC) de la invención tienen ventajas terapéuticas significativas para el tratamiento de patógenos intracelulares, incluidos aquellos que residen en fagolisosomas. En una realización, el patógeno se internaliza en células leucocitarias y el componente intracelular es un fagolisosoma. En un AAC intacto, la región variable del anticuerpo se une a un antígeno de la superficie celular en la bacteria (opsonización). Sin estar limitado por ninguna teoría, en un mecanismo, por el componente de anticuerpo del AAC que se une a la superficie celular bacteriana, los fagocitos son atraídos por la bacteria. La porción Fc del anticuerpo se une a un receptor de Fc en el fagocito, facilitando la fagocitosis. Después de que el complejo AAC-bacteria sea fagocitado, al fusionarse con el lisosoma, el enlazador de AAC se escinde por exposición a enzimas del fagolisosoma, liberando un antibiótico activo. Debido al espacio confinado y la concentración local de Abx relativamente alta (aproximadamente 104 por bacteria), el resultado es que el fagolisosoma ya no es respalda la supervivencia del patógeno intracelular (Figura 5). Debido a que el AAC es esencialmente un profármaco inactivo, el índice terapéutico del antibiótico puede extenderse con respecto a la forma libre (no conjugada). El anticuerpo proporciona una actuación selectiva específica del patógeno, mientras que el enlazador escindible se escinde en condiciones específicas de la ubicación intracelular del patógeno. El efecto puede ser tanto directamente sobre el patógeno opsonizado como sobre otros patógenos que se localizan conjuntamente en el fagolisosoma. En un aspecto específico, el patógeno es S. aureus. La tolerancia a los antibióticos es la capacidad de un patógeno causante de enfermedad para resistir la destrucción por antibióticos y otros agentes antimicrobianos y es mecánicamente diferente de la resistencia a múltiples fármacos (Lewis K (2007). "Persister cells, dormancy and infectious disease". Nature Reviews Microbiology 5 (1): 48-56. doi:10.1038/nrmicro1557). En cambio, esta forma de tolerancia está causada por una pequeña subpoblación de células microbianas llamadas persistentes (Bigger JW (14 de octubre de 1944). "Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilization". Lancet 244 (6320): 497-500). Estas células no son resistentes a múltiples fármacos en el sentido clásico, sino que, en cambio, son células latentes que son tolerantes al tratamiento con antibióticos que pueden destruir a sus hermanos genéticamente idénticos. Esta tolerancia a los antibióticos está inducida por un estado fisiológico de división no extremadamente lento. Cuando el tratamiento antimicrobiano no puede erradicar estas células persistentes, se convierten en un reservorio de infecciones crónicas recurrentes. Los conjugados anticuerpo-antibiótico de la invención poseen una propiedad exclusiva para destruir estas células persistentes y suprimir la aparición de poblaciones bacterianas tolerantes a múltiples fármacos.
En otra realización, los AAC de la invención pueden usarse para tratar la infección independientemente del compartimento intracelular en el que sobrevive el patógeno.
En otra realización, los AAC también podrían usarse para actuar de forma selectiva contra las bacterias en forma de plancton o biopelícula (ejemplo: S. aureus, K. pneumonía, E. coli, A. baumannii, P. aeruginosa y Enterobacteriaceae) por opsonización mediada por anticuerpos, conduciendo a la internalización por fagocitos profesionales. Cuando el fagosoma se fusiona con un lisosoma, se liberarán concentraciones suficientemente altas de antibiótico libre del AAC en el ambiente ácido o proteolítico del fagolisosoma para destruir el patógeno fagocitado.
Los métodos para tratar la infección con conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC) de la invención incluyen tratar infecciones pulmonares bacterianas, tales como la neumonía o infecciones de tuberculosis por S. aureus, infecciones oculares bacterianas, tal como el tracoma y la conjuntivitis, infecciones de corazón, cerebrales o cutáneas, infecciones del tracto gastrointestinal, tales como la diarrea de los viajeros, osteomielitis, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable (SII), Enfermedad de Crohn y EII (enfermedad inflamatoria intestinal) en general, meningitis bacteriana y abscesos en cualquier órgano, tal como músculo, hígado, meninges o pulmón. Las infecciones bacterianas pueden estar en otras partes del cuerpo como el tracto urinario, el torrente sanguíneo, una herida o un sitio de inserción de catéter. Los AAC de la invención son útiles para infecciones difíciles de tratar que implican biopelículas, implantes o sitios santuarios (por ejemplo, osteomielitis e infecciones de prótesis articulares) e infecciones de alta mortalidad como neumonía y bacteremia adquirida en el hospital. Los grupos de pacientes vulnerables que pueden tratarse para prevenir la infección por Staphylococcus aureus incluyen pacientes con hemodiálisis, pacientes inmunocomprometidos, pacientes en unidades de cuidados intensivos y determinados pacientes quirúrgicos. En otro aspecto, la invención proporciona un método para destruir, tratar o prevenir una infección microbiana en un animal, preferentemente un mamífero y lo más preferentemente, un ser humano, que incluye administrar al animal un AAC o formulación farmacéutica de un AAC de la invención. La invención presenta además el tratamiento o la prevención de enfermedades asociadas con o que de manera oportunista son el resultado de tales infecciones microbianas. Dichos métodos de tratamiento o prevención pueden incluir la administración oral, tópica, intravenosa, intramuscular o subcutánea de una composición de la invención. Por ejemplo, antes de la cirugía o la inserción de un catéter IV, en cuidados de UCI, en medicina de trasplante, con o después de la quimioterapia contra el cáncer u otras actividades que conlleven un alto riesgo de infección, los AAC de la invención puede administrarse para prevenir la aparición o propagación de la infección.
La infección bacteriana puede estar causada por una bacteria con una forma activa e inactiva, y el AAC se administra en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar tanto a la forma activa como la inactiva, latente de la infección bacteriana, cuya duración es más larga de lo necesario para tratar la forma activa de la infección bacteriana.
El análisis de varias bacterias Gram+ encontró WTA beta expresada en todos los S. aureus, incluidas las cepas MRSA y MSSA, así como cepas de estafilococos no aureus tales como S. saprophyticus y S. simulans. WTA alfa (Alfa-GLcNAc ribitol WTA) está presente en la mayoría, pero no todos los S. aureus, y también están presentes en Listeria monocytogenes. WTA no está presente en bacterias Gram. Por lo tanto, un aspecto de la invención es un método para tratar a un paciente infectado con S. aureus o S. saprophyticus o S. simulans mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un AAC anti-WTA beta de la invención. Otro aspecto de la invención es un método para tratar a un paciente infectado con S. aureus o Listeria monocytogenes mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un AAC anti-WTA alfa de la invención. La invención también contempla un método para prevenir infecciones por S. aureus o S. saprophyticus o S. simulans mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un AAC anti-WTA beta de la invención en situaciones hospitalarias tales como cirugía, paciente quemado y trasplante de órganos.
El paciente que necesita tratamiento para una infección bacteriana, según lo determinado por un médico experto en la materia, puede haber sido ya diagnosticado, aunque no necesariamente, con el tipo de bacteria con la que está infectado. Debido a que un paciente con una infección bacteriana puede empeorar muy rápidamente, en cuestión de horas, al paciente ingresado en el hospital se le pueden administrar los AAC anti-WTA de la invención junto con uno o más Abx de tratamiento de referencia tal como la vancomicina. Cuando los resultados de diagnóstico estén disponibles e indiquen la presencia de, por ejemplo, S. aureus en la infección, el paciente puede continuar con el tratamiento con el AAC anti-WTA. Por lo tanto, en una realización del método de tratamiento de una infección bacteriana o específicamente una infección por S. aureus, al paciente se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un AAC anti-WTA beta. En los métodos de tratamiento o prevención de la presente invención, un AAC de la invención puede administrarse como el único agente terapéutico o en combinación con otros agentes tales como los descritos a continuación. Los AAC de la invención muestran superioridad a la vancomicina en el tratamiento de MRSA en modelos preclínicos. La comparación de AAC con SOC se puede medir, por ejemplo, mediante una tasa de reducción de la mortalidad. Se evaluaría la capacidad de respuesta del paciente al tratamiento con AAC mediante varios factores medibles. Ejemplos de signos y síntomas que los médicos podrían usar para evaluar la mejora en sus pacientes incluyen los siguientes: normalización del recuento de glóbulos blancos si está elevado en el momento del diagnóstico, normalización de la temperatura corporal si está elevada (fiebre) al momento del diagnóstico, aclaramiento de hemocultivos, mejora visual en la herida, incluido menos eritema y drenaje de pus, reducción en los requisitos de respirador, tales como requerir menos oxígeno o una tasa reducida de ventilación en un paciente que está ventilado, salir completamente del respirador si el paciente está ventilado en el momento del diagnóstico, uso de menos medicamentos para mantener una presión sanguínea estable si estos medicamentos fueran necesarios al momento del diagnóstico, normalización de anormalidades de laboratorio que sugieren fallo del órgano terminal, tal como creatinina elevada o pruebas de función hepática si eran anormales en el momento del diagnóstico, y mejoría en las imágenes radiológicas (por ejemplo, radiografía de tórax que previamente sugirió una neumonía que mostraba resolución). En un paciente en la UCI, estos factores podrían medirse al menos diariamente. La fiebre se monitoriza de cerca, al igual que el recuento de glóbulos blancos, incluidos los recuentos absolutos de neutrófilos, así como la evidencia de que se ha resuelto un "desplazamiento a la izquierda" (aparición de blastos que indican una mayor producción de neutrófilos en respuesta a una infección activa).
En el contexto de los presentes métodos de tratamiento de la invención, un paciente con una infección bacteriana se considera tratado si hay una mejora significativa medible según lo evaluado por el médico experto en la materia, en al menos dos o más de los factores anteriores en comparación con los valores, signos o síntomas antes o al inicio del tratamiento o al momento del diagnóstico. En algunas realizaciones, hay una mejora medible en 3, 4, 5, 6 o más de los factores anteriormente mencionados. En algunas realizaciones, la mejora en los factores medidos es de al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % en comparación con los valores antes del tratamiento. Generalmente, un paciente puede considerarse completamente tratado de la infección bacteriana (por ejemplo, infección por S. aureus) si las mejoras medibles del paciente incluyen lo siguiente: i) repetir cultivos de sangre o tejidos (generalmente varios) que no producen la bacteria que se identificó originalmente; ii) la fiebre está normalizada; iii) los WBC (glóbulos blancos) están normalizado; y iv) la evidencia de fallo del órgano terminal (pulmones, hígado, riñones, colapso vascular) se ha resuelto total o parcialmente debido a las comorbilidades preexistentes que tenía el paciente.
Dosificación
En cualquiera de los aspectos anteriores, en el tratamiento de un paciente infectado, la dosis de un AAC es normalmente de aproximadamente 0,001 a 1000 mg/kg/día. En una realización, el paciente con una infección bacteriana se trata a una dosis de AAC en el intervalo de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, generalmente de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 90 mg/kg, más específicamente de 10 mg/kg a 50 mg/kg. El AAC se puede administrar diariamente (por ejemplo, una dosis única de 5 a 50 mg/kg/día) o con menos frecuencia (por ejemplo, una dosis única de 5, 12,5 o 25 mg/kg/semana). Una dosis puede dividirse en 2 días, por ejemplo, 25 mg/kg en un día y 25 mg/kg al día siguiente. Al paciente se le puede administrar una dosis una vez cada 3 días (q3D), una vez por semana a cada dos semanas (qOW), por una duración de 1-8 semanas. En una realización, al paciente se le administra un AAC de la invención por vía intravenosa una vez por semana durante 2-6 semanas con tratamiento de referencia (SOC) para tratar la infección bacteriana, tal como la infección por estafilococo A. La duración del tratamiento dependería de la afección del paciente o la extensión de la infección, por ejemplo, una duración de 2 semanas para bacteriemia no complicada, o 6 semanas para bacteriemia con endocarditis.
En una realización, se administra un AAC a una dosis inicial de 2,5 a 100 mg/kg durante uno a siete días consecutivos, seguido de una dosis de mantenimiento de 0,005 a 10 mg/kg una vez cada uno a siete días durante un mes.
Vía de administración
Para tratar las infecciones bacterianas, los AAC de la invención pueden administrarse a cualquiera de las dosificaciones anteriores por vía intravenosa (iv) o subcutánea. En una realización, el AAC de WTA se administra por vía intravenosa. En una realización específica, el AAC de WTA administrado por vía i.v. es un AAC de WTA-beta, más específicamente, en donde el anticuerpo de WTA-beta es uno seleccionado del grupo de Ac con secuencias de aminoácidos como se describe en la Figura 14, Figuras 15A, Figura 15B, Figura 16A y Figura 16B. Terapia de combinación
Un AAC puede administrarse junto con uno o más agentes adicionales, por ejemplo, segundos agentes terapéuticos o profilácticos según corresponda según lo determine el médico que trata al paciente.
En una realización, el segundo antibiótico administrado en combinación con el compuesto conjugado anticuerpoantibiótico de la invención se selecciona de las clases estructurales: (i) aminoglucósidos; (ii) betalactámicos; (iii) macrólidos/péptidos cíclicos; (iv) tetraciclinas; (v) fluoroquinolinas/fluoroquinolonas; (vi) y oxazolidinonas. Véanse: Shaw, K. y Barbachyn, M. (2011) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1241:48-70; Sutcliffe, J. (2011) Ann. N.Y. Acad. Sci.
1241:122-152.
En una realización, el segundo antibiótico administrado en combinación con el compuesto conjugado anticuerpoantibiótico de la invención se selecciona de clindamicina, novobiocina, retapamulina, daptomicina, GSK-2140944, CG-400549, sitafloxacino, teicoplanina, triclosán, naftiridona, radezolida, doxorrubicina, ampicilina, vancomicina, imipenem, doripenem, gemcitabina, dalbavancina y azitromicina.
Ejemplos adicionales de estos agentes terapéuticos o profilácticos adicionales son agentes antiinflamatorios (por ejemplo, medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE); por ejemplo, detoprofeno, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, meclofenamato, ácido mefenámico, meloxicam, nabumeona, naproxeno sódico, oxaprozina, piroxicam, sulindaco, tolmetina, celecoxib, rofecoxib, aspirina, salicilato de colina, salsalato y salicilato de sodio y magnesio) y esteroides (por ejemplo, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona)), agentes antibacterianos (por ejemplo, azitromicina, claritromicina, eritromicina, gatifloxacino, levofloxacino, amoxicilina, metronidazol, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, ampicilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina, piperacilina, azlocilina, temocilina, cefalotina, cefapirina, cefradina, cefaloridina, cefazolina, cefamandol, cefuroxima, cefalexina, cefprozilo, cefaclor, loracarbef, cefoxitina, cefmatozol, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidima, cefixima, cefpodoxima, ceftibuteno, cefdinir, cefpiroma, cefepima, BAL5788, BAL9141, imipenem, ertapenem, meropenem, astreonam, clavulanato, sulbactam, tazobactam, estreptomicina, neomicina, kanamicina, paromicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, espectinomicina, sisomicina, dibecalina, isepamicina, tetraciclina, clortetraciclina, desmeclociclina, minociclina, oxitetraciclina, metaciclina, doxiciclina, telitromicina, ABT-773, lincomicina, clindamicina, vancomicina, oritavancina, dalbavancina, teicoplanina, quinupristina y dalfopristina, sulfanilamida, ácido paraaminobenzoico, sulfadiazina, sulfisoxazol, sulfametoxazol, sulfatalidina, linezolida, ácido nalidíxico, ácido oxolínico, norfloxacino, perfloxacina, enoxacino, ofloxacino, ciprofloxacino, temafloxacino, lomefloxacino, fleroxacino, grepafloxacino, esparfloxacino, trovafloxacino, clinafloxacino, moxifloxacino, gemifloxacino, sitafloxacino, daptomicina, garenoxacina, ramoplanina, faropenem, polimixina, tigeciclina, AZD2563 o trimetoprima), anticuerpos antibacterianos, incluidos anticuerpos contra el mismo o diferente antígeno del Ag dirigido de AAC, inhibidores de la agregación plaquetaria (por ejemplo, abciximab, aspirina, cilostazol, clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, ticlopidina o tirofibán), anticoagulantes (por ejemplo, dalteparina, danaparoide, enoxaparina, heparina, tinzaparina o warfarina), antipiréticos (por ejemplo, paracetamol) o agentes hipolipemiantes (por ejemplo, colestiramina, colestipol, ácido nicotínico, gemfibrozilo, probucol, ezetimiba, o estatinas tales como atorvastatina, rosuvastatina, lovastatina simvastatina, pravastatina, cerivastatina y fluvastatina). En una realización, el AAC de la invención se administra en combinación con el tratamiento de referencia (SOC) para S. aureus (incluyendo cepas resistentes a meticilina y sensibles a meticilina). El MSSA habitualmente se trata con nafcilina u oxacilina y el MRSA generalmente se trata con vancomicina o cefazolina.
Estos agentes adicionales pueden administrarse dentro de los 14 días, 7 días, 1 día, 12 horas, o 1 hora de administración de un AAC, o de manera simultánea con el mismo. Los agentes terapéuticos adicionales pueden estar presentes en las mismas o diferentes composiciones farmacéuticas que un AAC. Cuando están presente en diferentes composiciones farmacéuticas, pueden usarse diferentes vías de administración. Por ejemplo, un AAC puede administrarse por vía intravenosa o subcutánea, mientras que un segundo agente puede administrarse por vía oral.
FORMULACIONES FARMACÉUTICAS
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que contienen el AAC y métodos para tratar una infección bacteriana usando las composiciones farmacéuticas que contienen AAC. Dichas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales como excipientes (vehículos) farmacéuticamente aceptables, incluidos tampones, ácidos, bases, azúcares, diluyentes, sustancias de deslizamiento, conservantes y similares, que son bien conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los presentes métodos y composiciones se pueden usar solos o en combinación con otros métodos y/o agentes convencionales para tratar enfermedades infecciosas. En un aspecto, la invención proporciona además formulaciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo de la invención y/o al menos un conjugado anticuerpo-antibiótico (AAC) del mismo. En algunas realizaciones, una formulación farmacéutica comprende 1) un anticuerpo de la invención y/o un AAC del mismo, y 2) un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una formulación farmacéutica comprende 1) un anticuerpo de la invención y/o un AAC del mismo, y opcionalmente, 2) al menos un agente terapéutico adicional.
Las formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o AAC de la invención se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo o AAC que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales ("Remington's Pharmaceutical Sciences" 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)) en forma de soluciones acuosas o liofilizadas u otras formulaciones secas. Los vehículos, excipientes y/o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio); fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONlCS™ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones farmacéuticas que se van a usar para la administración in vivo son, generalmente, estériles, esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Los principios activos pueden inmovilizarse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo o AAC de la invención, cuyas matrices están en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (patente de EE.UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y Y-etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como las LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli-ácido D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etilvinilacetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados o AAC permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden crear estrategias racionales para la estabilización según el mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando restos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicas.
Se puede formular un anticuerpo en cualquier forma adecuada para la administración a una célula/tejido diana. Por ejemplo, los anticuerpos pueden formularse como liposomas, una pequeña vesícula compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que son útiles para suministrar un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma habitualmente están dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., (1980) Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030; documento uS 4485045; documento US 4544545; documento WO 97/38731; documento US 5013556.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Pueden conjugarse fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención con los liposomas como se describe en Martin et al., (1982) J. Biol. Chem. 257:286-288) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido dentro del liposoma (Gabizon et al., (1989) J. National Cancer Inst. 81(19):1484).
MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA DIAGNÓSTICOS Y DETECCIÓN
En determinadas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de MRSA en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en el presente documento, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. Una "muestra biológica" comprende, por ejemplo, sangre, suero, plasma, tejido, esputo, aspirado, hisopo, etc.
En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-WTA para su uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de WTA en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-WTA como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-WTA a WTA, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-WTA y WTA en la muestra biológica. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se usa un anticuerpo anti-MRSA para seleccionar sujetos elegibles para la terapia con un anticuerpo anti-MRSA, por ejemplo, donde MRSA es un biomarcador para la selección de pacientes.
En una realización a modo de ejemplo, se usa un anticuerpo anti-WTA in vivo para detectar, por ejemplo, por obtención de imágenes in vivo, una infección por MRSA positiva en un sujeto, por ejemplo, para fines de diagnóstico, pronóstico o tratamiento de estadificación de una infección, para determinar el curso apropiado de la terapia, o monitorizar la respuesta de la infección a la terapia. Un método conocido en la técnica para la detección in vivo es la tomografía por emisión de inmunopositrones (inmuno-PET), como se describe, por ejemplo, en van Dongen et al., (2007) The Oncologist 12:1379-1389 y Verel et al., (2003) J. Nucl. Med. 44:1271-1281. En dichas realizaciones, se proporciona un método para detectar una infección por estafilococos positiva en un sujeto, comprendiendo,el método, administrar un anticuerpo anti-estafiloco marcado a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por estafilococo positiva, y detectar el anticuerpo antiestafilococo marcado en el sujeto, en donde la detección del anticuerpo antiestafilococo marcado indica una infección por estafilococo positiva en el sujeto. En determinadas de estas realizaciones, el anticuerpo antiestafilococo marcado comprende un anticuerpo antiestafilococo conjugado con un emisor de positrones, tal como 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr e 124I. En una realización particular, el emisor de positrones es 89Zr.
En realizaciones adicionales, un método de diagnóstico o detección comprende poner en contacto un primer anticuerpo antiestafilococo inmovilizado en un sustrato con una muestra biológica para analizar la presencia de estafilococos, exponiendo el sustrato a un segundo anticuerpo antiestafilococo y detectando si el segundo anticuerpo antiestafilococo está unido a un complejo entre el primer anticuerpo antiestafilococo y estafilococos en la muestra biológica. Un sustrato puede ser cualquier medio de soporte, por ejemplo, vidrio, metal, cerámica, perlas poliméricas, portaobjetos, chips y otros sustratos. En determinadas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o un tejido (p.ej., material de biopsia, incluyendo tejido colorrectal canceroso o potencialmente canceroso, del endometrio, pancreático u ovárico). En determinadas realizaciones, el primer o segundo anticuerpo antiestafilococo es cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En dichas realizaciones, el segundo anticuerpo anti-WTA puede ser los anticuerpos anti-WTA S4497, S4462, S6978, S4487, o anticuerpos derivados de ellos como se describe en el presente documento.
Los trastornos a modo de ejemplo que pueden diagnosticarse o detectarse de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores incluyen infección positiva por MRSA, utilizando pruebas como la inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) o hibridación in situ (ISH, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, una infección por estafilococo positiva es una infección que expresa estafilococos de acuerdo con un ensayo de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) que detecta el ARNm de estafilococos. En algunas realizaciones, la RT-PCR es RT-PCR cuantitativa (Francois P y Schrenzel J (2008). "Rapid Diagnosis and Typing of Staphylococcus aureus". Staphylococcus: Molecular Genetics. Caister Academic Press; Mackay IM, ed. (2007)) y PCR en tiempo real ("Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization. Caister Academic Press).
En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-ácido teicoico de pared (WTA) marcados. Los marcadores incluyen, pero sin limitación, marcadores o restos que se detectan directamente (tal como marcadores fluorescentes, cromofóricos, de densidad de electrones, quimioluminiscentes y radiactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (documento US 4737456), luciferina, 2,3-dihidroftalacinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas como uricasa y xantina oxidasa, junto con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares. En otra realización, un marcador es un emisor de positrones. Los emisores de positrones incluyen, entre otros, 68G, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr e 124I. En una realización particular, un emisor de positrones es 89Zr.
Clínicamente, los síntomas de las infecciones por MRSA son similares a los del Staphylococcus aureus sensible a meticilina (MSSA) e incluyen abscesos y celulitis. Con frecuencia, los abscesos van acompañados de áreas de necrosis central. Los forúnculos (furúnculos) también son comunes, particularmente en el contexto de un brote de MRSA. Las lesiones también pueden describirse erróneamente como una picadura de araña debido al enrojecimiento general que progresa a un centro necrótico. Adicionalmente, las infecciones pueden aparecer como impétigo, foliculitis, abscesos profundos, piomiositis, osteomielitis, fascitis necrotizante, síndrome de shock tóxico estafilocócico, neumonía y sepsis. Las infecciones sistémicas graves son más habituales entre las personas con antecedentes de uso de fármacos inyectables, diabetes u otras afecciones inmunocomprometidas.
Las opciones de tratamiento convencional para las infecciones por MRSA incluyen opciones mecánicas conservadoras, tales como: (i) baños calientes y compresas, (ii) incisión y drenaje, y (iii) extracción del dispositivo extraño (por ejemplo, catéter) que causa la infección. Para infecciones más graves, especialmente aquellas que presentan celulitis, se prescriben antibióticos (Abx). Para infecciones leves a moderadas, los antibióticos incluyen trimetoprima-sulfametoxazol (TMP-SMX), clindamicina, doxiciclina, minociclina, tetraciclina, rifampina, vancomicina, linezolida. Generalmente, se produce un régimen de tratamiento durante 5-10 con reexaminación y evaluación periódica tanto durante como después del período de tratamiento.
Las opciones de tratamiento adicionales incluyen descolonización, especialmente en el entorno donde un paciente experimenta una infección recurrente o donde se encuentra en un entorno donde está en curso un brote de MRSA. La descolonización es un procedimiento en el que se elimina la flora que inhibe las narinas del paciente. Esto se realiza mediante la aplicación tópica de ungüento de mupirocina al 2 % aplicado generosamente en ambas fosas nasales durante 5-10 días y la limpieza tópica con gluconato de clorhexidina al 4 % durante 5 días.
ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN
En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución IV, etc. Los envases pueden formarse a partir de diversos materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que está sola o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar el trastorno y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que es perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en este, en donde la composición comprende un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en este, en donde la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación en esta realización de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto que indica que las composiciones pueden usarse para tratar una afección concreta. Como alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Ejemplos
Lo siguiente son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica varias realizaciones diferentes, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1 MC-vc-PAB-pipBOR 51
Se hidrogenó 2-nitrobenceno-1,3-diol 1 en hidrógeno gaseoso con catalizador de paladio/carbono en disolvente de etanol para dar 2-aminobenceno-1,3-diol 2, aislado como la sal de hidrocloruro (Figuras 23A y 23B). La monoprotección de 2 con cloruro de terc-butildimetilsililo y trietilamina en diclorometano/tetrahidrofurano dio 2-amino-3-(terc-butildimetilsililoxi)fenol 3. LA rifamicina S (ChemShuttle Inc., Fremont, CA, documento US 7342011; documento US 7271165; documento US 7547692) se hizo reaccionar con 3 por condensación oxidativa con óxido de manganeso u oxígeno gaseoso en tolueno a temperatura ambiente para dar benzoxazina rifamicina protegida con TBS 4. La reacción de 4con piperidin-4-amina y óxido de manganeso dio piperidil benzoxazina rifamicina (pipBOR) 5.
Se mezclaron piperidil benzoxazina rifamicina (pipBOR) 5 (0,02 mmol) y 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 (0,02 mmol) en DMF (0,4 ml) a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés). A esto se añadieron 2,5 equivalentes de N,N'-diisopropiletilamina. La solución se agitó de una a aproximadamente 12 horas y se monitorizó por LC/MS. Tras completarse, la solución se diluyó con DMF y se inyectó en HPLC y se purificó en condiciones ácidas para dar MC-vc-PAB-pipBOR 51. M/Z = 1498,9. Rendimiento 40 %
Ejemplo 2 MC-fk-PAB-pipBOR 52
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1, 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((S)-1-((S) -5-guanidino-1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-1-oxopentan-2-ilamino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)hexanamida 12 se convirtió en 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) hexanamido)-3-fenilpropanamido)-5-guanidinopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 13.
Figure imgf000099_0001
Se mezclaron benzoxazina rifamicina (pipBOR) 5 (0,02 mmol) y 13 (0,02 mmol) en DMF (0,4 ml) a temperatura ambiente (RT). A esto se añadieron 2,5 equivalentes de N,N'-diisopropiletilamina. La solución se agitó de una a aproximadamente 12 horas y se monitorizó por LC/MS. Tras completarse, la solución se diluyó con DMF y se inyectó en HPLC y se purificó en condiciones ácidas para dar MC-fk-PAB-pipBOR 52. M/Z = 1545,8. Rendimiento 32 % Ejemplo 3 MP-vc-PAB-pipBOR 53
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1, 6-(2-(2-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)etoxi) acetamido)-N-(( S)-1-((S)-1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)hexanamida 14 se convirtió en 4-((17S, 20S)-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-17-isopropil-8,15,18-trioxo-20-(3-ureidopropil)-3,6-dioxa-9,16,19-triazahenicosanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 15.
Figure imgf000100_0001
Se mezclaron piperidil benzoxazina rifamicina (pipBOR) 5 (0,02 mmol) y 15 (0,02 mmol) en DMF (0,4 ml) a temperatura ambiente (RT). A esto se añadieron 2,5 equivalentes de N,N'-diisopropiletilamina. La solución se agitó de una a aproximadamente 12 horas y se monitorizó por LC/MS. Tras completarse, la solución se diluyó con DMF y se inyectó en HPLC y se purificó en condiciones ácidas para dar MP-vc-PAB-pipBOR 53. M/Z = 1644,8. Rendimiento 57 %
Ejemplo 4 MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 54
La reacción de N,N-dimetilpiperidin-4-amina con benzoxazina rifamicina protegida con TBS 4 dio dimetilpiperidil benzoxazina rifamicina (dimetil pipBOR) 7 (Figura 24).
Alternativamente, se hidrogenó (5-fluoro-2-nitro-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(metileno)dibenceno 9 en hidrógeno gaseoso con catalizador de paladio/carbono en disolvente de tetrahidrofurano/metanol para eliminar los grupos bencilo para dar 2-amino-5-fluorobenceno-1,3-diol 10. Se hizo reaccionar rifamicina S o sal de sodio de Rifamicina SV disponibles comercialmente (ChemShuttle Inc., Fremont, CA) con 2-amino-5-fluorobenceno-1,3-diol 10 por condensación oxidativa en aire o cianuro férrico de potasio en acetato de etilo a 60 °C para dar fluorobenzoxazina rifamicina 11. El desplazamiento de fluoro con N,N-dimetilpiperidin-4-amina dio dimetil pipBOR 7 (Figuras 25A y 25B).
El 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(hidroximetil)fenilamino) -1-oxo-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)hexanamida 8, preparada de acuerdo con los procedimientos en el documento WO 2012113847; documento US 7659241; documento US 7498298; documento US 20090111756; documento US 20090018086; documento US 6214345; Dubowchik et al (2002) Bioconjugate Chem. 13 (4): 855-869 (1,009 g, 1,762 mmol, 1,000, 1009 mg) se incorporó en N,N-dimetilformamida (6 ml, 77 mmol, 44, 5700 mg). A esto se le añadió una solución de cloruro de tionilo (1,1 equivalentes, 1,938 mmol, 1,100, 231 mg) en diclorometano (DCM) (1 ml, 15,44 mmol, 8,765, 1325 mg) en porciones gota a gota (1/2 se añadió durante 1 hora, se agitó una hora a temperatura ambiente (RT) y después se añadió la otra mitad durante más de otra hora). La solución permaneció de color amarillo. Se añadieron otros 0,6 equivalentes de cloruro de tionilo como una solución en 0,5 ml de DCM gota a gota, cuidadosamente. La reacción permaneció de color amarillos y se agitó sellada durante la noche a RT. La reacción se monitorizó por LC/MS al 88 % de cloruro de bencilo producto 9. Se añadieron gota a gota otros 0,22 equivalentes de cloruro de tionilo como una solución en 0,3 ml de d Cm . Cuando la reacción se acercó al 92 % de cloruro de bencilo 9, la reacción se sometió a burbujeo con N2. La concentración se redujo de 0,3 M a 0,6 M. El producto N-((S)-1-((S)-1-(4-(clorometil)fenilamino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9 se almacenó en el refrigerador como una solución 0,6 M y se usó como está. M/Z 591,3, 92 % de rendimiento.
En un matraz, N-((S)-1-((S)-1-(4-(clorometil)fenilamino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9, (0,9 mmol) se enfrió a 0 °C y se añadió dimetilpiperidil benzoxazina rifamicina (dimetil pipBOR) 7 (0,75 g, 0,81 mmol, 0,46, 750 mg). La mezcla se diluyó con otros 1,5 ml de DMF para alcanzar 0,3 M. Se agitó al aire durante 30 minutos. Se añadió N, N-diisopropiletilamina (3,5 mmol, 3,5 mmol, 2,0, 460 mg) y la reacción se agitó durante la noche al aire. En el transcurso de 4 días, se añadieron 4 adiciones de 0,2 equivalentes de N, N-diisopropiletilamina base mientras la reacción se agitaba al aire, hasta que la reacción pareció dejar de progresar. La reacción se diluyó con DMF y se purificó en HPLC (20-60 % ACN/FAH2O) en varios lotes para dar MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 54.
M/Z = 1482.8 rendimiento: 32 %
Ejemplo 5 MC-vc-PAB-monometilpip, desacetilBOR 55
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se hicieron reaccionar N-metilpiperidin-4-amina y desacetil benzoxazina rifamicina protegida con TBS con óxido de manganeso para dar monometilpiperidil benzoxazina rifamicina (pipBOR) 16.
Figure imgf000101_0001
Se hicieron reaccionar 4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 y 16 para dar MC-vc-PAB-monometilpip, desacetilBOR 55 con un rendimiento del 26% (M/Z = 1456,5).
Ejemplo 6 MC-vc-PAB-monometilpipBOR 56
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se hicieron reaccionar N-metilpiperidin-4-amina y benzoxazina rifamicina protegida con TBS 4 con óxido de manganeso para dar monometilpiperidil benzoxazina rifamicina (pipBOR) 17.
Figure imgf000101_0002
Se hicieron reaccionar 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 y 17 para dar MC-vc-PAB-monometilpipBOR 56 con un 25 % de rendimiento (M/Z = 1471,0).
Ejemplo 7 MC-vc-PAB-pip, desacetilBOR 57
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se hicieron reaccionar piperidin-4-amina y desacetil benzoxazina rifamicina protegida con TBS 18 con óxido de manganeso para dar piperidil, desacetil benzoxazina rifamicina (pip desacetil BOR) 19.
Figure imgf000102_0001
Se hicieron reaccionar piperidil, desacetil benzoxazina rifamicina 19 (0,02 mmol) y 4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 (0,02 mmol) para dar MC-vc-PAB-pip, desacetilBOR 57. M/Z = 1456,6. Rendimiento 13 %
Ejemplo 8 MC-vc-PAB-rifabutina 58
Figure imgf000102_0002
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se hicieron reaccionar desisobutil rifabutina 20 (0,02 mmol) y 4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 (0,02 mmol) para dar MC-vc-PAB-rifabutina 58. M/Z = 1389,6. Rendimiento 21 %
Ejemplo 9 MC-GGAFAGGG-pipBOR ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126) 59
Figure imgf000102_0003
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se acopló péptido maleimida 21 con piperidil benzoxazina rifamicina (pipBOR) 5 en condiciones convencionales de formación de enlaces amida para dar MC-GGAFAGGG-pipBOR ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126) 59. M/Z = 1626,0. Rendimiento 13 %
Ejemplo 10 MC-vc-PAB-rif 60
Figure imgf000102_0004
En un vial pequeño, 0,05 ml de una solución 0,6 M de N-((S)-1-((S)-1-(4-(clorometil)fenilamino)-1-oxo-5 ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9, preparada por el procedimiento del Ejemplo 4 se enfrió a 0 °C y se añadió 1 equivalente de benzoxazina rifamicina 22 y la mezcla se agitó durante 5 minutos. A esta solución a 0 °C se le añadió K2CO3 (15 equivalentes) y los lados del vial se lavaron con 0,05 ml de DMF. La reacción se agitó al aire a temperatura ambiente durante 1-4 horas. Cuando la totalidad de 9 se consumió, los sólidos se filtraron y el filtrado recogido se diluyó con DMF. La purificación por HPLC dio MC-vc-PAB-rif 60 con un rendimiento del 11 % (M/Z = 1356,9).
Ejemplo 11 MC-vc-PAB-dimetilpip, desacetilBOR 61
Figure imgf000103_0001
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 4, se hizo reaccionar N-((S)-1-((S)-1-(4-(clorometil)fenilamino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9con dimetilpiperidil, desacetil benzoxazina rifamicina (dimetil, desacetil pipBOR) 23 para dar MC-vc-PAB-dimetilpip, desacetilBOR 61. M/Z = 1440,66
Ejemplo 12 MC-vc-PAB-piperazBTR 62
Figure imgf000103_0002
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se hizo reaccionar 4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 con piperazino benztiazino rifamicina (piperazBTR) 24 dar MC-vc-PAB-piperazBTR 62. M/Z = 1483,7
Ejemplo 13 MC-vc-PAB-piperaz, desacetilBTR 63
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se hizo reaccionar 4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 con piperazino, desacetil benztiazino rifamicina (pipBTR) 25 para dar MC-vc-PAB-piperaz, desacetilBTR 63. M/Z = 1441,6
Ejemplo 14 MC-vc-PAB-piperaz, desacetilBOR 64
Figure imgf000104_0001
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se hizo reaccionar 4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 con piperazilo, desacetil benzoxazina rifamicina (desacetil pipBOR) 26 para dar MC-vc-PAB-piperaz, desacetilBOR 64. m/z = 1441,6 Ejemplo 15 MC-vc-PAB-piperazBOR 65
Figure imgf000104_0002
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se hizo reaccionar 4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 con piperazil benzoxazina rifamicina (piperazilBOR) 27 para dar MC-vc-PAB-piperazBOR 65. M/Z = 1482,7
Ejemplo 16 MC-vc-bisPAB-dimetilpipBOR 66
En un vial, se incorporó 4-((S)-2-((S)-2-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-nitrofenil carbonato 6 (1,56 g, 2,11 mmol, 100% en masa) en DMF (55 equivalentes, 116 mmol, 55,0, 8,5 g) y se agitó a TA. A esta mezcla de color amarillo turbia se añadió (4-aminofenil)metanol (PAB, 1,1 equivalentes, 2,33 mmol, 1,10, 286 mg) y 1-hidroxibenzotriazol (0,37 equivalentes, 0,782 mmol, 0,370, 106 mg) seguido de N,N'-diisopropiletilamina (1 equivalente, 2,11 mmol, 1,00, 276 mg). La reacción se agitó durante 2 horas y se monitorizó por LC/Ms . Se añadieron 1 equivalente adicional de N,N'-diisopropiletilamina (Hunigs Base) y 100 mg de (4-aminofenil)metanol. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente sellada. Se añadieron aproximadamente 0,5 l de dietil éter gota a gota para precipitar el producto. El éter se decantó, el sólido se redisolvió en DMF y se purificó directamente sobre HPLC en varios lotes para dar 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-(hidroximetil)fenilcarbamato 28 (0,435 g) con un rendimiento global aislado del 28 % (M/Z: 722,5), que tiene la estructura:
Figure imgf000105_0001
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4, se hizo reaccionar 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-(hidroximetil)fenilcarbamato 28 con cloruro de tionilo para dar 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-(clorometil)fenilcarbamato 29 con un rendimiento global aislado del 47 % (M/Z: 740,4), que tiene la estructura:
Figure imgf000105_0002
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4, se hizo reaccionar 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil 4-(clorometil)fenilcarbamato 29 con dimetilpiperidil benzoxazina rifamicina (dimetil pipBOR) 7 para dar MC-vc-bisPAB-dimetilpipBOR 66 con un rendimiento del 5 % (M/Z: 1632,1)
Ejemplo 17 MC-vc-PAB-metilpiperaz BOR 67
Figure imgf000105_0003
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4, se hizo reaccionar N-((S)-1-((S)-1-(4-(clorometil)fenilamino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-il) -6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9 con metilpiperazino benzoxazina rifamicina (metil piperazBOR) 30 para dar MC-vc-PAB-metilpiperaz BOR 67. M/Z = 1454,68
Ejemplo 18 Los MRSA intracelulares están protegidos de los antibióticos
Este ejemplo proporciona evidencia de que MRSA puede sobrevivir intracelularmente in vivo. En una infección, los MRSA intracelulares están protegidos de y pueden sobrevivir al tratamiento con antibióticos (tal como la a SOC con vancomicina), permitiendo la transferencia de infección de una célula a otra.
Determinaciones de MIC para bacterias extracelulares: La MIC para las bacterias extracelulares se determinó preparando diluciones en serie de 2 veces del antibiótico en Caldo de Soja Tríptico. Las diluciones del antibiótico se hicieron por cuadruplicado en placas de cultivo de 96 pocillos. Se tomó MRSA (cepa NRS384 de USA300) de un cultivo en crecimiento exponencial y se diluyó a 1x104 UFC/ml. Las bacterias se cultivaron en presencia de antibióticos durante 18-24 horas con agitación a 37 °C y se determinó el crecimiento bacteriano leyendo la densidad óptica (DO) a 630 nM. Se determinó que la MIC era la dosis de antibiótico que inhibía el crecimiento bacteriano en > 90 %.
Determinaciones de MIC para bacterias intracelulares: La MIC intracelular se determinó en bacterias secuestradas dentro de macrófagos peritoneales de ratón. Los macrófagos se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos a una densidad de 4x105células/ml y se infectaron con MRSA (cepa NRS384 de USA300) en una proporción de 10-20 bacterias por macrófago. Los cultivos de macrófagos se mantuvieron en medios de crecimiento complementados con 50 |jg/ml de gentamicina para inhibir el crecimiento de bacterias extracelulares y se añadieron antibióticos de prueba a los medios de crecimiento 1 día después de la infección. La supervivencia de las bacterias intracelulares se evaluó 24 horas después de la adición de los antibióticos. Los macrófagos se lisaron con Solución Salina Tamponada de Hanks complementada con albúmina de suero bovino al 0,1 % y Triton-X al 0,1 %, y las diluciones en serie del lisado se prepararon en solución Salina Tamponada con Fosfato que contenía Tween-20 al 0,05 %. El número de bacterias intracelulares supervivientes se determinó mediante siembra en placas de Agar de Soja Tríptico con sangre de oveja desfibrinada al 5 %.
Aislamiento de macrófagos peritoneales: Los macrófagos peritoneales se aislaron del peritoneo de ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Para aumentar el rendimiento de los macrófagos, los ratones se trataron previamente mediante inyección intraperitoneal con 1 ml de medio de tioglicolato (Becton Dickinson). El medio de tioglicolato se preparó a una concentración de 4 % en agua, esterilizado en autoclave y envejecido durante 20 días a 6 meses antes de su uso. Los macrófagos peritoneales se recogieron 4 días después del tratamiento con tioglicolato lavando la cavidad peritoneal con solución salina tamponada con fosfato fría. Los macrófagos se sembraron en placas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con Suero Fetal De Ternera al 10 % y HEPES 10 mM, sin antibióticos, a una densidad de 4x105 células/pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos. Los macrófagos se cultivaron durante la noche para permitir la adherencia a la placa. Este ensayo también se utilizó para evaluar la destrucción intracelular en tipos de células no fagocíticas. Las líneas celulares MG63 (CRL-1427) y A549 (CCL185) se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en medios de cultivo de tejidos RPMI 1640 complementados con Hepes 10 mM y Suero Fetal De Ternera al 10 % (RPMI-10). Las células HUVEC se obtuvieron de Lonza y se mantuvieron en medio completo de células endoteliales EGM (Lonza, Walkersville, MD).
Infección de macrófagos con MRSA opsonizado: La cepa USA300 de MRSA (NRS384) se obtuvo del repositorio de NARSA (Chantilly, Virginia). Algunos experimentos utilizaron la cepa Newman de S. aureus (ATCC25904). En todos los experimentos, las bacterias se cultivaron en Caldo De Soja Tríptico. Para evaluar la muerte intracelular con AAC, se tomó USA300 de un cultivo de crecimiento exponencial y se lavó con HB (solución salina equilibrada de Hanks complementada con HEPES 10 mM y albúmina de suero bovino al 0,1 %). El AAC o los anticuerpos se diluyeron en HB y se incubaron con la bacteria durante 1 hora para permitir la unión del anticuerpo a la bacteria (opsonización), y las bacterias opsonizadas se usaron para infectar a los macrófagos en una proporción de 10-20 bacterias por macrófago (4x106 bacterias en 250 j l de HB por pocillo. Los macrófagos se lavaron previamente con medio DMEM sin suero inmediatamente antes de la infección, y se infectaron por incubación a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada con CO2 al 5 % para permitir la fagocitosis de la bacteria. Después de 2 horas, la mezcla de infección se eliminó y se reemplazó con medio de crecimiento normal (DMEM complementado con Suero Fetal De Ternera al 10 %, HEPES 10 mM y se añadió gentamicina a 50 jg/ml para prevenir el crecimiento de bacterias extracelulares. Al final del periodo de incubación, los macrófagos se lavaron con medios sin suero y las células se lisaron en HB complementado con triton-X al 0,1 % (lisa los macrófagos sin dañar las bacterias intracelulares). En algunos experimentos, se evaluó la viabilidad de los macrófagos al final del período de cultivo mediante la detección de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) citoplásmica en el sobrenadante del cultivo utilizando un kit de detección de citotoxicidad LDH (Producto 11644793001, Roche Diagnostics Corp, Indianápolis, IN). Los sobrenadantes se recogieron y analizaron inmediatamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las diluciones en serie del lisado se realizaron en solución salina tamponada con fosfato complementada con Tween-20 al 0,05 % (para romper los agregados de bacterias) y se determinó el número total de bacterias intracelulares supervivientes por siembra en placas en Agar Tríptico de Soja con sangre de oveja desfibrinada al 5 %.
Generación de células peritoneales infectadas con MRSA. Se infectaron ratones A/J hembra de 6-8 semanas de edad (ratones JAX ™, Jackson Laboratories) con 1x108 UFC de la cepa NRS384 de USA300 por inyección peritoneal. El lavado peritoneal se cosechó 1 día después de la infección y las células peritoneales infectadas se trataron con 50jg/ml de lisostafina diluida en tampón Hepes complementado con BSA al 0,1 % (tampón HB) durante 30 minutos a 37 °C. Las células peritoneales se lavaron después 2X en tampón HB enfriado con hielo. Las células peritoneales se diluyeron a 1x106 células/ml en medio de cultivo de tejidos Rp MI 1640 complementado con Hepes 10 mM y Suero Fetal De Ternera al 10%, y 5 jg/ml de vancomicina. Se almacenó MRSA libre de la infección primaria durante la noche a 4 °C en Solución Salina Tamponada con Fosfato como control para bacterias extracelulares que no estaban sujetas a la destrucción por los neutrófilos.
Transferencia de infección de células peritoneales a osteoblastos: La línea celular de osteoblastos MG63 se obtuvo de ATCC (CRL-1427) y se mantuvo en medio de cultivo de tejidos RPMI 1640 complementado con Hepes 10 mM y Suero Fetal De Ternera al 10% (RPMI-10). Los osteoblastos se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se cultivaron para obtener una capa confluente. El día del experimento, los osteoblastos se lavaron una vez en RPMI (sin complementos). Se diluyeron MRSA o células peritoneales infectadas en RPMI-10 completo y se añadió vancomicina a 5 pg/ml inmediatamente antes de la infección. Se añadieron células peritoneales a los osteoblastos a 1x106 células peritoneales/ml. Se lisó una muestra de las células con 0,1 % de triton-x para determinar la concentración real de bacterias intracelulares vivas en el momento de la infección. El título real para todas las infecciones se determinó sembrando en placas diluciones en serie de la bacteria en Agar de Soja Tríptico con sangre de oveja desfibrinada al 5 %.
Los osteoblastos MG63 se sembraron en placas en portaobjetos de cámara de vidrio de 4 pocillos y se cultivaron en medios de cultivo de tejidos RPMI 1640 complementados con Hepes 10 mM y Suero Fetal De Ternera al 10 % (RPMI-10) hasta que formaron capas confluentes. En el día de la infección, los pocillos se lavaron con medio sin suero y se infectaron con una suspensión de células peritoneales infectadas, o con la cepa USA300 de MRSA diluida en RPMI-10 completo complementado con 5 pg/ml de vancomicina. Un día después de la infección, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en PBS con paraformaldehído al 2 %. Los pocillos se lavaron 3X en PBS y se permeabilizaron con PBS con saponina al 0,1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Inmunofluorescencia: MRSA se identificó mediante tinción con 20 pg/ml de antiestafilococo 20920 de conejo, (abcam, Cambridge, MA) seguido de anti-rodamina de conejo (Jackson ImmunoResearch, 711-026-152). Las membranas celulares de las células peritoneales se tiñeron con subunidad de biotina de la toxina beta del cólera (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguido de estreptavidina Cy5 (BD Biosciences San José, CA). La unión de la toxina del cólera a las células peritoneales se confirmó mediante tinción conjunta con el clon M1/70 de Alexa 488 anti-CD 11b (BD biosciences). Los portaobjetos se montaron con Prolong Gold con DAPI (Invitrogen, Carlsbad CA). Los portaobjetos se vieron usando un microscopio confocal Leica SPE. Las imágenes se recopilaron como una serie de pilas Z y se compilaron para generar las imágenes de proyección máximas mostradas.
La supervivencia de S. aureus dentro de las células de mamíferos proporciona un nicho viable que permite la infección persistente en presencia terapia con antibióticos. S. aureus es capaz de infectar y sobrevivir dentro de diversos tipos de células de mamíferos, incluidos los neutrófilos, macrófagos, osteoblastos y células epiteliales (Garzoni, C. y WL Kelley (2009) Trends Microbiol 17(2): 59-65). Para probar directamente si el MRSA intracelular está protegido de los antibióticos, se comparó una serie de antibióticos clínicamente aprobados por su capacidad para destruir MRSA extracelular cultivado en medios de crecimiento bacteriano convencionales, con su capacidad de destruir MRSA intracelular que está secuestrado dentro de los macrófagos murinos (Tabla 1). Los macrófagos peritoneales murinos se seleccionaron para este análisis porque estas células representan un tipo de célula primaria genéticamente normal que es un componente natural de la respuesta inmunitaria innata a S. aureus. El análisis confirmó que estas células se infectan y cultivan fácilmente in vitro. MRSA es capaz de sobrevivir intracelularmente hasta seis días después de la infección de los macrófagos (Kubica, M., K. Guzik, et al. (2008) PLoS One 3(1): e1409). Para probar el efecto intracelular de los antibióticos, los macrófagos se infectaron con MRSA y se cultivaron en presencia de gentamicina, un antibiótico que se sabe que está inactivo dentro del fagolisosoma debido a la mala captación celular del antibiótico (Vaudaux, P. y FA Waldvogel (1979) Antimicrob Agents Chemother 16(6): 743-749). Se añadieron antibióticos de prueba a los medios de cultivo (además de gentamicina) un día después de la infección en un intervalo de dosis elegidas para incluir los niveles séricos clínicamente alcanzables (mostrados como Cmax sérica en la Tabla 1). Este análisis reveló que aunque el MRSA extracelular es altamente susceptible a la inhibición del crecimiento por dosis bajas de vancomicina, daptomicina, linezolid o rifampicina en cultivo líquido, ninguno de los cuatro antibióticos logró destruir la misma cepa de MRSA intracelular que estaba secuestrada dentro de los macrófagos. De manera destacable, incluso rifampicina, que, según se informa, es uno de los mejores antibióticos para el tratamiento de infecciones intracelulares, tales como la tuberculosis, produjo una destrucción mínima de MRSA intracelular a lo largo del tiempo y en el intervalo de dosis del experimento.
T l 1 n nr i n inhi i ri mínim MI v ri ni i i
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Los datos anteriores confirmaron que las bacterias intracelulares están protegidas de los antibióticos durante el tiempo que están secuestradas dentro de las células. Sin embargo, no se cree que MRSA sea un verdadero patógeno intracelular ya que no es capaz de infectar células vecinas por transferencia directa de célula a célula, y la mayoría de las células infectadas eventualmente lisarán y liberarán las bacterias intracelulares. Por lo tanto, seguía siendo posible que el grupo intracelular, una vez liberado, inevitablemente estuviera expuesto a antibióticos extracelulares al menos de forma transitoria, incluso si las bacterias fueron captadas inmediatamente por las células vecinas. La absorción de MRSA libre por los macrófagos requiere entre 15 y 90 minutos (datos no mostrados), lo que sugiere que si las bacterias fueron capaces resistir una breve exposición al antibiótico, podrían permanecer protegidas en el nicho intracelular moviéndose secuencialmente de una célula moribunda a una nueva hospedadora. Para determinar si una breve exposición a antibióticos era suficiente para destruir MRSA, se evaluaron la vancomicina, el tratamiento de referencia actual para las infecciones por MRSA, y la rifampicina. Se tomó MRSA de un cultivo en crecimiento activo y se diluyó a 1x106 bacterias/ml en medios de crecimiento normales. Se añadieron antibióticos a dos dosis que representan entre 2x y 10x la concentración inhibitoria mínima esperada (MIC). Las muestras se eliminaron en diversos momentos entre 30 minutos y 5 horas, y el antibiótico se eliminó por centrifugación y dilución. El número total de bacterias supervivientes en el cultivo se determinó mediante la siembra placas sobre placas de agar.
La Figura 1 muestra la comparación del tiempo de destrucción por vancomicina (vanco) y rifampicina (Rifa) en la división activa de MRSA. MRSA se cultivó durante 5 horas en medio TSB en presencia de antibióticos. En los momentos indicados, se tomó una muestra del cultivo y el antibiótico se eliminó por centrifugación. El número total de bacterias supervivientes se determinó en cada punto temporal mediante siembra en placas. La vancomicina se probó a 2 pg/ml (cuadrado abierto) y 20 pg/ml (cuadrado cerrado). La rifampicina se probó a 0,02 pg/ml (triángulo abierto) y 0,2 pg/ml (triángulo cerrado). Estos datos (Figura 1) revelaron que, aunque ambos antibióticos fueron capaces de inhibir el crecimiento bacteriano de manera eficaz, y en 5 horas se observó una pérdida de 100 veces en bacterias viables, las bacterias se destruyeron gradualmente durante el período de observación de 5 horas y el 90 % de las bacterias permanecieron viables durante las primeras dos horas de tratamiento con antibióticos, lo que permitió un amplio tiempo para la posible captación por parte de las células hospedadoras.
Las reservas intracelulares de MRSA se analizaron para determinar la transferencia de infección a un nicho intracelular permisivo en presencia de vancomicina. S. aureus puede sobrevivir dentro de los osteoblastos y se han observado reservas intracelulares de S. aureus en pacientes con osteomielitis, una afección en la que se sabe que la infección crónica por S. aureus es recalcitrante al tratamiento con antibióticos (Thwaites y Gant, (2011) Nature Reviews Microbiology 9: 215-222; Ellington et al., (2006) J. Orthopedic Research 24(1): 87-93; Bosse et al., (2005) J. Bone and Joint Surgery, 87(6): 1343-1347). Se desarrolló un ensayo in vitro utilizando una línea celular de osteoblastos MG63 ya que se informó que esta línea celular es capaz de albergar S. aureus intracelular (Garzoni y Kelly, (2008) Trends in Microbiology). Este ensayo confirmó que MRSA es capaz de infectar células MG63 y que las bacterias intracelulares viables pueden recuperarse de las células MG63 infectadas hasta durante 6 días in vitro. Para generar un grupo de S. aureus intracelular, se recogieron células peritoneales de ratones que fueron infectados por inyección peritoneal de MRSA (Figura 2).
La Figura 2 muestra la transferencia de infección de células peritoneales infectadas a osteoblastos en presencia de vancomicina. Para generar un grupo de S. aureus intracelular, los ratones A/J se infectaron con MRSA y las células peritoneales infectadas se tomaron 1 día después de la infección. De manera similar, se ha informado que las células generadas albergan bacterias intracelulares viables que son capaces de transferir infecciones en un modelo de infección in vivo(Gresham et al. J Immunol 2000; 164:3713-3722). Las células peritoneales infectadas consistían en una mezcla de principalmente neutrófilos y macrófagos y aproximadamente el 10 % de las células albergaban bacterias intracelulares. Las células se trataron con lisostafina para eliminar las bacterias extracelulares y se suspendieron en medios de crecimiento complementados con 5 pg/ml de vancomicina. Una muestra de las células peritoneales utilizadas para la infección se lisó para determinar la dosis precisa de MRSA intracelular viable en el momento en que se inició la infección y también se diluyeron diferentes dosis de MRSA extracelular libre en medios con vancomicina para la comparación. Las células peritoneales (MRSA intracelular) o las bacterias libres (MRSA extracelular) se añadieron después a monocapas de osteoblastos MG63 y se cultivaron durante 4 horas (barras abiertas) o 1 día (barras cerradas). El número total de bacterias intracelulares supervivientes en cada pocillo se determinó sembrando en placas lisados celulares sobre placas de agar. Los MRSA intracelulares estaban protegidos de la vancomicina en comparación con los controles extracelulares de MRSA. Los pocillos infectados con 3x104 bacterias intracelulares produjeron 8.750 bacterias intracelulares (aproximadamente 1 tercio de la dosis de infección) 1 día después de la infección, mientras que las bacterias extracelulares se destruyeron de manera eficaz como infección con una dosis similar de MRSA libre que produjo solo 375 bacterias intracelulares 1 día después de la infección.
La microscopía de inmunofluorescencia también demostró la transferencia de infección de las células peritoneales a los osteoblastos MG63. Se recogieron células peritoneales de ratones 1 día después de la infección con MRSA y se trataron con lisostafina para destruir cualquier bacteria extracelular contaminante (infección intracelular). El MRSA libre se tomó de un cultivo en crecimiento activo y se lavó con PBS (infección extracelular). El número total de bacterias viables en las muestras de infección intracelular y extracelular se confirmó mediante siembra en placas sobre placas de agar y ambas muestras se suspendieron en medios complementados con 5 pg/ml de vancomicina inmediatamente antes de la adición a capas confluentes de osteoblastos MG63 cultivados en portaobjetos de cámara. Un día después de la infección, las células MG63 se lavaron para eliminar las bacterias extracelulares, permeabilizaron y tiñeron con un anticuerpo anti-S. aureus para identificar MRSA intracelular y toxina del cólera que se unió preferentemente a las membranas de las células peritoneales. Todos los núcleos celulares se tiñeron conjuntamente con DAPI para confirmar que la monocapa MG63 estaba intacta. Los portaobjetos se examinaron por microscopía confocal.
Los pocillos infectados con células peritoneales contenían una monocapa confluente de células MG63 y los macrófagos peritoneales eran claramente visibles en la parte superior de la capa MG63. Muchos de los macrófagos estaban claramente infectados con MRSA, que es visible como grupos de bacterias rojas en la imagen de un solo color o partículas blancas en la imagen superpuesta. Además de los macrófagos infectados, se observaron ejemplos claros de bacterias que estaban asociadas solamente con las células MG63. Estas células MG63 infectadas también eran visibles en pocillos que estaban infectados con el MRSA libre. La infección con MRSA libre requirió un inóculo mucho más alto para lograr un nivel similar de infección en las células MG63.
Los resultados anteriores establecieron que tanto el MRSA libre como el MRSA intracelular pueden sobrevivir e infectar células MG63 en presencia de vancomicina. Las bacterias de la infección intracelular fueron significativamente más capaces de sobrevivir al tratamiento con vancomicina que las bacterias libres en estas condiciones. La infección con 3x104 UFC de bacterias intracelulares produjo 8,7x103 UFC de bacterias intracelulares 1 día después de la infección. La infección con una dosis similar de bacterias libres produjo solamente 375 bacterias intracelulares 1 día después de la infección, indicando que las bacterias intracelulares fueron hasta 20 veces más capaces de sobrevivir que las bacterias libres. Todas las dosis de infección recuperaron más bacterias intracelulares (entre 1,5 y 6 veces) cuando los pocillos se recogieron 1 día frente a 4 horas después de la infección. Debido a que la vancomicina inhibe completamente el crecimiento cuando se añade al MRSA libre (Figura 1), estos datos sugieren que el MRSA debe haberse replicado en algún momento a pesar de la exposición constante a vancomicina en los medios de cultivo. Aunque MRSA no se replica significativamente dentro de los macrófagos murinos (nuestras observaciones no publicadas), hay evidencia considerable de que S. aureus es capaz de escapar del fagolisosoma y replicarse dentro del citoplasma de los tipos de células no fagocíticas (Jarry, T. M., G. Memmi, et al. (2008) Cell Microbiol 10(9): 1801-1814). En conjunto, las observaciones anteriores sugieren que incluso en exposición constante a la vancomicina, MRSA libre puede infectar células y MRSA intracelular puede transferirse de una célula a otra. Estas observaciones revelan un posible mecanismo para el mantenimiento e incluso la propagación de la infección que podría producirse en presencia de una terapia antibiótica constante.
Ejemplo 19 Modelos de infecciónin vivo.
Modelo de peritonitis. Se infectaron ratones A/J hembra de 7 semanas (Jackson Laboratories) mediante inyección peritoneal con 5x107 UFC de USA300. Los ratones se sacrificaron 2 días después de la infección y el peritoneo se lavó abundantemente con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato fría (PBS). Los riñones se homogeneizaron en 5 ml de PBS como se describe a continuación para el modelo de infección intravenosa. Los lavados peritoneales se centrifugaron durante 5 minutos a 1.000 rpm a 4 °C en una centrífuga de sobremesa. El sobrenadante se recogió como la bacteria extracelular y el sedimento celular que contenía células peritoneales se recogió como la fracción intracelular. Las células fueron tratadas con 50 pg/ml de lisostafina durante 20 minutos a 37 °C para destruir las bacterias extracelulares contaminantes. Las células peritoneales se lavaron 3X en PBS enfriado con hielo para eliminar la lisostafina antes del análisis. Para contar el número de UFC intracelulares, las células peritoneales se lisaron en HB (solución salina equilibrada de Hanks complementada con HEPES 10 mM y Albúmina De Suero Bovino al 0,1%) con Triton-X al 0,1% y se hicieron diluciones en serie del lisado en PBS con tween-20 al 0,05%.
Modelo de infección intravenosa: Se utilizaron ratones hembra de 7 semanas de edad para todos los experimentos in vivo y se llevaron a cabo infecciones por inyección intravenosa en la vena de la cola. Los ratones A/J (Jackson Lab) se infectaron con una dosis de 2x106 UFC. Los ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Hollister, CA) se infectaron con una dosis de 2x107 UFC. Para los estudios que examinan el papel de la competencia de IgG humana (modelo IVIG en SCID), se reconstituyeron ratones CB17.SCID (Charles River Laboratories, Hollister, CA) con inmunoglobulina GammaGard S/D IGIV (ASD Healthcare, Brooks KY) utilizando una pauta posológica optimizada para alcanzar niveles séricos constantes de> 10 mg/ml de IgG humana. Se administró IGIV con una dosis intravenosa inicial de 30 mg por ratón seguida de una segunda dosis de 15 mg/ratón por inyección intraperitoneal después de 6 horas, y las dosis diarias posteriores de 15 mg por ratón por inyección intraperitoneal durante 3 días consecutivos. Los ratones se infectaron 4 horas después de la primera dosis de IGIV con 2x107 UFC de MRSA diluido en solución salina tamponada con fosfato mediante inyección intravenosa. Los ratones que recibieron vancomicina se trataron con inyecciones intraperitoneales dos veces al día de 100 mg/kg de vancomicina que comenzaron entre 6 y 24 horas después de la infección durante la duración del estudio. Los agentes terapéuticos experimentales (AAC, anticuerpos anti-MRSA o antibiótico dimetil-pipBOR libre) se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato y se administraron con una inyección intravenosa única de 30 minutos a 24 horas después de la infección. Todos los ratones se sacrificaron el día 4 después de la infección, y los riñones se recogieron en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato. Las muestras de tejido se homogeneizaron usando un GentleMACS Dissociator™ (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). El número total de bacterias recuperadas por ratón (2 riñones) se determinó sembrando en placas diluciones en serie del homogeneizado de tejido en PBS, Tween al 0,05 % sobre Agar Tríptico DE Soja con sangre de oveja desfibrinada al 5 %.
Ejemplo 20 Ensayo de liberación de Catepsina/Caspasa
Para cuantificar la cantidad de antibiótico activo liberado de AAC después del tratamiento con catepsina B, los AAC se diluyeron a 200 pg/ml en tampón de catepsina (acetato de sodio 2o mM, EDTA 1 mM, L-cisteína 5 mM). Véase: página 863 de Dubowchik et al (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869. Se añadió catepsina B (de bazo bovino, SIGMA C7800) a 10 pg/ml y las muestras se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Como control, se incubaron AAC en tampón solo. La reacción se detuvo mediante la adición de 10 volúmenes de medios de crecimiento bacteriano, Caldo De Soja Tríptico a pH 7,4 (TSB). Para estimar la liberación total de antibiótico activo, se hicieron diluciones en serie de la mezcla de reacción por cuadruplicado en TSB en placas de 96 pocillos y se añadió la cepa USA300 de S. aureus a cada pocillo a una densidad final de 2x103 UFC/ml. Los cultivos se incubaron durante la noche a 3 °C con agitación y se midió el crecimiento bacteriano leyendo la absorbancia a 630 nM usando un lector de placas.
Ejemplo 21 Producción de anticuerpos anti-WTA
Generación de anticuerpos, exploración y selección
Abreviaturas: MRSA (S. aureus resistente a meticilina); MSSA (S. aureus sensible a meticilina); VISA (S. aureus resistente a productos intermedios de vancomicina); LTA (ácido lipoteicoico); TSB (caldo de soja tríptico); CWP (preparación de pared celular).
Los anticuerpos IgG humanos se clonaron a partir de linfocitos B periféricas de pacientes posteriormente a la infección por S. aureus utilizando la tecnología Symplex™ (Symphogen, Lyngby, Dinamarca) que conserva el emparejamiento afín de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, como se describe en el documento US 8.283.294: "Method for cloning cognate antibodies"; Meijer PJ et al. Journal of Molecular Biology 358:764-772 (2006); y Lantto J et al. J Virol. 85(4):1820-33 (febrero de 2011); Se usaron células plasmáticas y de memoria como fuente genética para los repertorios de IgG recombinantes de longitud completa. Los clones de anticuerpos individuales se expresaron mediante transfección de células de mamífero como se describe en Meijer PJ, et al. Methods in Molecular Biology 525: 261-277, xiv. (2009). Los sobrenadantes que contenían anticuerpos IgG1 de longitud completa se recogieron después de siete días y se usaron para explorar la unión al antígeno mediante ELISA indirecto en la exploración primaria. Se generó una biblioteca de AcM que muestran una unión ELISA positiva a las preparaciones de la pared celular de las cepas de S. aureus cepa USA300 o Wood46. Posteriormente se produjeron anticuerpos en transfecciones transitorias de 200 ml y se purificaron con cromatografía con proteína A (MabSelect SuRe, Ge Life Sciences, Piscataway, NJ) para pruebas adicionales. Para la producción de anticuerpos a mayor escala, se produjeron anticuerpos en células CHO. Los vectores que codifican VL y VH se transfectaron en células CHO y la IgG se purificó a partir de medios de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad con proteína A.
T l 7: Li ní n iliz r i l r l A
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La Figura 6 resume la exploración primaria de los anticuerpos mediante ELISA. Todos (excepto 4569) se aislaron cuando se exploraron con la mezcla de preparación de la pared celular (CWP por sus siglas en inglés) de USA300 (agotamiento de hierro:TSB en una relación de 96:4). Todos los Ac de GlcNAc beta (excepto 6259), SDR y PGN (4479) también fueron positivos para PGN y WTA en la exploración primaria. Todos los GlcNAc alfa se encontraron exclusivamente mediante exploración para la unión con la mezcla de CW de USA300. El 4569 (específico de LTA) se encontró mediante exploración en CWP de Wood46.
Selección de Acm anti-WTA de la biblioteca usando citometría de flujo ex vivo
Se consultó cada AcM dentro de esta biblioteca por tres criterios de selección: (1) intensidad relativa de unión de AcM a la superficie de MRSA, como una indicación de alta expresión del antígeno afín correspondiente que favorecería un alto suministro de antibióticos; (2) consistencia de la unión de AcM a MRSA aislado de una variedad diversa de tejidos infectados, como una indicación de la expresión estable del antígeno afín en la superficie de MRSA in vivo durante las infecciones; y (3) capacidad de unión de AcM a un panel de cepas clínicas de S. aureus, como una indicación de conservación de la expresión del antígeno de superficie afín. Con este fin, se usó citometría de flujo para probar todos estos sobrenadantes de cultivo de AcM preseleccionados en la biblioteca para determinar la reactividad con S. aureus de varios tejidos infectados y de diferentes cepas S. aureus.
Todos los AcM en la biblioteca se analizaron para determinar su capacidad para unirse a MRSA de riñones, bazos, hígados y pulmones infectados de ratones infectados con MRSA USA300; y dentro de corazones o riñones de conejos que se infectaron con USA300 COL en un modelo de endocarditis de conejo. La capacidad de un anticuerpo para reconocer S. aureus de varios tejidos infectados aumenta la probabilidad de que el anticuerpo terapéutico sea activo en una amplia variedad de infecciones clínicas diferentes con S. aureus. Las bacterias se analizaron inmediatamente después de la recogida de los órganos, es decir, sin subcultivo, para prevenir cambios fenotípicos causados por condiciones de cultivo in vitro. Los presentes inventores habían observado previamente que varios antígenos de superficie de S. aureus, aunque se expresaban durante el cultivo in vitro, perdían su expresión en tejidos infectados. Es poco probable que los anticuerpos dirigidos contra tales antígenos sean útiles para tratar infecciones. Durante el análisis de esta biblioteca de AcM en varios tejidos infectados, esta observación se confirmó para un número significativo de anticuerpos, que mostró una unión significativa a bacterias S. aureus de cultivo, pero ausencia de unión a bacterias de todos los tejidos infectados probados. Algunos anticuerpos se unen a las bacterias de algunos tejidos infectados, pero no todos. Por lo tanto, en la presente invención, los presentes inventores seleccionaron los anticuerpos que pudieron reconocer las bacterias de todas las condiciones de infección probadas. Los parámetros que se evaluaron fueron (1) intensidad de fluorescencia relativa, como medida para la abundancia de antígeno; (2) número de órganos que se tiñeron positivamente, como medida para la estabilidad de la expresión de antígeno; y (3) capacidad de unión de AcM a un panel de cepas clínicas de S. aureus como una indicación de conservación de la expresión del antígeno de superficie afín. La intensidad de fluorescencia de los anticuerpos de prueba se determinó con respecto a un anticuerpo de control de isotipo dirigido contra un antígeno no relevante, por ejemplo, AcM IgG1 anti-gD:5237 de herpes virus (referenciado a continuación). Los AcM contra WTA-beta no solo mostraron la mayor abundancia de antígeno, sino que también mostraron una unión muy consistente a MRSA de todos los tejidos infectados probados y especificados anteriormente.
Adicionalmente, se probó la capacidad de estos AcM para unirse a las siguientes cepas de S. aureus, que se cultivaron in vitro en TSB: USA300 (MRSA), USA400 (MRSA), COL (MRSA), MRSA252 (MRSA), Wood46 (MSSA), Rosenbach (MSSA), Newman (MSSA) y Mu50 (VISA). Se descubrió que los AcM anti-WTA beta pero no los AcM anti-WTA alfa son reactivos con todas estas cepas. El análisis de la unión a diferentes cepas indicó que WTA beta está más conservado que WTA alfa y, por lo tanto, es más adecuado para AAC.
Ejemplo 22 Caracterización de anticuerpos con especificidad contra los ácidos teicoicos de pared en S. aureus. i) Confirmación de la especificidad de Ac a WTA
Se generaron preparaciones de pared celular (CWP) de una cepa de S. aureus de tipo silvestre (WT) y una cepa S. aureus mutante que carece de WTA (ATagO; cepa nula para WTA) incubando 40 mg de cepas de S.aureus sedimentadas con 1 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) complementado con rafinosa al 30 %, 100 pg/ml de lisostafina (Cell Sciences, Canton, MA) y cóctel inhibidor de proteasas sin EDTA (Roche, Pleasanton, CA), durante 30 min a 37 °C. Los lisados se centrifugaron a 11.600 x g durante 5 minutos y se recogieron los sobrenadantes que contenían componentes de la pared celular. Para el análisis por inmunotransferencia, las proteínas se separaron en un gel de Tris-glicina al 4-12 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de la transferencia con anticuerpos de prueba indicados contra WTA o con anticuerpos de control contra PGN y LTA. La inmunotransferencia muestra que los anticuerpos contra WTA se unen a las preparaciones de la pared celular de S. aureus de tipo silvestre pero no a las preparaciones de la pared celular de la cepa ATagO que carece de WTA. Los anticuerpos de control contra peptidoglicano (anti-PGN) y ácido lipoteicoico (anti-LTA) se unen bien a ambas preparaciones de la pared celular. Estos datos indican la especificidad de los anticuerpos de prueba contra WTA. ii) Citometría de flujo para determinar el grado de unión de AcM a la superficie de MRSA
La expresión del antígeno de superficie en bacterias enteras de tejidos infectados se analizó mediante citometría de flujo usando el siguiente protocolo. Para la tinción de anticuerpos de bacterias de tejidos de ratones infectados, se infectaron ratones hembra C57B1/6 de 6-8 semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA) por vía intravenosa con 108 UFC de USA300 cultivada en fase logarítmica en PBS. Los órganos de los ratones se recogieron dos días después de la infección. La endocarditis infecciosa de conejo (IE, por sus siglas en inglés) se estableció como se describe anteriormente en Tattevin P. et al. Antimicrobial agents and chemotherapy 54: 610-613 (2010). Los conejos se inyectaron por vía intravenosa con 5x107 UFC de la cepa COL de MRSA cultivada en fase estacionaria y se recogieron las vegetaciones del corazón dieciocho horas más tarde. El tratamiento con 30 mg/kg de vancomicina se administró por vía intravenosa dos veces al día, 18 h después de la infección con 7x107 UFC en fase estacionaria Para lisar células de ratón o conejo, los tejidos se homogeneizaron en tubos M (Miltenyi, Auburn, CA) usando un disociador de células gentleMACS (Miltenyi), seguido de incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente en PBS que contiene Triton-X100 (Thermo) al 0,1 %, 10 pg/ml de DNAsal (Roche) y cóctel de inhibidor de proteasas Complete Mini (Roche). Las suspensiones se pasaron a través de un filtro de 40 mieras (BD) y se lavaron con HBSS sin rojo fenol complementado con BSA sin IgG al 0,1 % (Sigma) y Hepes 10 mM, pH 7,4 (tampón HB). Las suspensiones bacterianas se incubaron después con 300 pg/ml de IgG de conejo (Sigma) en tampón HB durante 1 ha temperatura ambiente (RT) para bloquear la unión inespecífica de IgG. Las bacterias se tiñeron con 2 pg/ml de anticuerpos primarios, incluyendo rF1 o AcM anti-gD:5237 de herpes virus con IgG1 de control de isotipo (Nakamura GR et al., J Virol 67: 6179-6191 (1993)) y a continuación, con anticuerpos secundarios fluorescentes anti-IgG humana (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Para permitir la diferenciación de bacterias de residuos de órganos de ratones o conejos, se realizó una doble tinción usando 20 pg/ml de AcM 702 de ratón antipeptidoglicano de S. aureus(Abcam, Cambridge, MA) y un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con fluorocromo (Jackson Immunoresearch). Las bacterias se lavaron y analizaron por FACSCalibur (BD). Durante el análisis por citometría de flujo, las bacterias se seleccionaron para la tinción positiva con AcM 702 de gráficos de fluorescencia doble.
iii) Medición de la afinidad de unión a S. aureus y densidad de antígenos en MRSA
La Tabla 8 muestra el análisis de unión en equilibrio de los anticuerpos de MRSA que se unen a la cepa Newman-ASPA, y la densidad de antígenos en la bacteria.
T l
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La Kd y la densidad de antígenos se obtuvieron usando un ensayo de unión a células con radioligando en las siguientes condiciones de ensayo: DMEM tampón de unión a suero de ratón al 2,5 %; unión de la solución durante 2 horas a temperatura ambiente (RT); y usando 400.000 bacterias/pocillo.
El Ac 6263 es similar a 6078 en que las secuencias son muy similares. Excepto por el segundo resto (R frente a G) en CDR H3, todas las otras secuencias CDR de cadena L y H son idénticas.
Ejemplo 23 Modificación por ingeniería de mutantes de anticuerpos de WTA
En síntesis, la región VH de cada uno de los Ac anti-WTA beta se clonó y se enlazó a la región constante gamma1 de la cadena H humana y la VL se enlazó a la región constante kappa para expresar los Ac como IgG1. En algunos casos, las secuencias de tipo silvestre se alteraron en determinadas posiciones para mejorar la estabilidad de los anticuerpos como se describe a continuación. Después se generaron Ac modificados por ingeniería con cisteína (TioMab).
i. Enlace de regiones variables a regiones constantes
Las regiones VH de los Ac de WTA beta identificadas a partir de la biblioteca de anticuerpos humanos anterior se enlazaron a las regiones constantes y1 humanas para preparar Ac IgG1 de longitud completa. Las cadenas L eran cadenas L kappa.
ii. Generación de variantes de estabilidad
Los Ac de WTA en la Figura 14, (véanse en particular, las figuras 15A, 15B, 16A, 16B) se modificaron por ingeniería para mejorar determinadas propiedades (tales como evitar la desamidación, la isomerización del ácido aspártico, la oxidación o la glicosilación ligada a N) y se probaron para determinar la retención de la unión al antígeno, así como la estabilidad química después de los reemplazos de aminoácidos. El ADN monocatenario de los clones que codifican las cadenas pesadas o ligeras se purificó a partir de partículas de fago M13KO7 cultivadas en células CJ236 de E. coli usando un kit QIAprep Spin M13 (Qiagen). Se usaron oligonucleótidos sintéticos 5' fosforilados con las secuencias:
5-CCCAGACTGCACCAGCTGGATCTCTGAATGTACTCCAGTTGC-3' (SEQ ID NO: 152)
5-CCAGACTGCACCAGCTGCACCTCTGAATGTACTCCAGTTGC-3' (SEQ ID NO: 153) 5'CCAGGGTTCCCTGGCCCCAWTMGTCAAGTCCASCWKCACCTCTTGCACAGTAATAGACAGC-3' (SEQ ID NO: 154);
y
5'-CCTGGCCCCAGTCGTCAAGTCCTCCTTCACCTCTTGCACAGTAATAGACAGC-3 '(SEQ ID NO: 155) (códigos IUPAC)
para mutar los clones que codifican los anticuerpos mediante mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótidos como se describe mediante mutagénesis específica de sitio siguiendo la metodología descrita en Kunkel, T.A. (1985). Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 82(2): 488-492. Se usó ADN mutagenizado para transformar células XL1-Blue de E. coli (Agilent Technologies) y se sembraron en placas sobre placas de Caldo Luria que contenían 50 pg/ml de Carbenicilina. Las colonias se recogieron individualmente y se cultivaron en medio líquido de Caldo Luria que contenía 50 pg/ml de Carbenicilina. Se secuenció el ADN Miniprep para confirmar la presencia de mutaciones.
Para el Ac 6078, el segundo aminoácido en la VH, met (met-2), es propenso a la oxidación. Por lo tanto, met-2 se mutó a Ile o Val, para evitar la oxidación del resto. Debido a que la alteración de met-2 puede afectar la afinidad de unión, se probaron los mutantes para determinar la unión a cWp de estafilococos por ELISA.
Se descubrió que los motivos "DG" o "DD" de la CDR H3 eran propensos a transformarse en ácido isoaspártico. El Ac 4497 contiene DG en las posiciones 96 y 97 de CDR H3 (véase la Figura 18B) y se alteró por estabilidad. CDR H3 es generalmente crítico para la unión al antígeno, por lo que se evaluó la unión a antígeno y la estabilidad química de varios mutantes (véase la Figura 18A). El mutante d 96E (v8) conserva la unión a antígeno, similar al AC 4497 de tipo silvestre (Figura 18A; Figura 18B) y es estable y no forma ácido isoaspártico.
ELISA de CWP de estafilococos
Para el análisis de mutantes del anticuerpo 6078, una preparación de pocillos de células USA300 ASPA de S. aureus (WT) tratada con lisostafina que consiste en IX10® microbios/ ml se diluyeron 1/100 en carbonato de sodio 0,05 pH 9,6 y se recubrieron sobre placas ELISA de 384 pocillos (Nunc; Neptune, NJ) durante una incubación durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron con PBS más Tween-20 al 0,05 % y se bloquearon durante una incubación de 2 horas con PBS más albúmina de suero bovino al 0,5 % (BSA). Esta y todas las incubaciones posteriores se realizaron a temperatura ambiente con agitación suave. Las muestras de anticuerpos se diluyeron en muestra/tampón de dilución patrón (PBS, BSA al 0,5 %, Tween 20 al 0,05 %, CHAPS al 0,25 %, EDTA 5 mM, NaCl 0,35 M, 15 ppm de Proclina, pH 7,4), se añadieron a las placas lavadas y se incubaron durante 1,5 - 2 horas. Se detectaron anticuerpos anti-S. aureus unidos a la placa durante una incubación de 1 hora con un fragmento F(ab')2 anti- IgG (Fc) humana de cabra conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA) diluido a 40 ng/ml en tampón de ensayo (PBS, BSA al 0,5 %, 15 ppm de Proclina, Tween 20 al 0,05%). Después de un lavado final, se añadió tetrametilbencidina (KPL, Gaithersburg, MD), el color se desarrolló durante 5-10 minutos y la reacción se detuvo con ácido fosfórico 1 M. Las placas se leyeron a 450 nm con una referencia de 620 nm utilizando un lector de microplacas.
iii. Generación de mutantes modificados por ingeniería con Cys (TioMab)
Los TioMab de longitud completa se produjeron mediante la introducción de una Cisteína en la cadena H (en CHI) o en la cadena L (Ck) en una posición predeterminada como se enseña anteriormente y se describe a continuación para permitir la conjugación del anticuerpo con un producto intermedio enlazador-antibiótico. Las cadenas H y L se clonan después en plásmidos separados y los plásmidos que codifican H y L se cotransfectan en células 293 donde se expresan y se ensamblan en Ac intactos. Las cadenas H y L también se pueden clonar en el mismo plásmido de expresión. Se preparan IgG1 que tienen 2 Cys modificadas por ingeniería, una en cada una de las cadenas H, o 2 Cys modificadas por ingeniería, una en cada una de las cadenas L, o se generó una combinación de cadenas 2H y 2L, cada una con Cys modificadas por ingeniería (HCLCCys) expresando la combinación deseada de cadenas mutantes cys y cadenas de tipo silvestre.
Las Figuras 15A y 15B muestran el 6078 WT y Ac mutantes con la combinación de HC Cys y LC Cys. También se probaron los mutantes de 6078 para determinar su capacidad para unirse a estafilococo A USA300 deficiente en proteína A del cultivo durante la noche. De los resultados del análisis FACS como se muestra en la Figura 19, los Ac mutantes se unieron a USA300 de manera similar que al anticuerpo 6078 WT (sin alterar); las alteraciones de los aminoácidos en los mutantes no perjudicaron la unión a estafilococo A. gD es un anticuerpo de control negativo no específico.
Ejemplo 24 Preparación de Conjugados Anticuerpo-Antibiótico anti-WTA
Los conjugados de anticuerpo anti-ácidos teicoicos de pared-antibiótico (AAC) Tabla 3 se prepararon conjugando un anticuerpo anti-WTA con un producto intermedio enlazador-antibiótico, incluidos los de la Tabla 2. Antes de la conjugación, los anticuerpos anti-WTA se redujeron parcialmente con TCEP usando métodos convencionales de acuerdo con la metodología descrita en el documento WO 2004/010957. Los anticuerpos parcialmente reducidos se conjugaron con el producto intermedio enlazador -antibiótico utilizando métodos convencionales de acuerdo con la metodología descrita, por ejemplo, en Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784 y en el documento US 2005/0238649 A1. Brevemente, los anticuerpos parcialmente reducidos se combinaron con el producto intermedio enlazador-antibiótico para permitir la conjugación del producto intermedio enlazador-antibiótico con restos de cisteína reducidos del anticuerpo. Las reacciones de conjugación se desactivaron y se purificaron los AAC. Se determinó la carga antibiótica (número promedio de restos antibióticos por anticuerpo) para cada AAC y estaba entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 para los anticuerpos anti-ácidos teicoicos de pared modificados por ingeniería con un único sitio mutante de cisteína.
Reducción/Oxidación de TioMab para Conjugación: Los anticuerpos monoclonales modificados por ingeniería con cisteína de longitud completa (ThioMabs - Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; documento US 7521541; documento US 7723485; documento WO2009/052249, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52) expresados en células CHO se redujeron con un exceso de aproximadamente 20-40 veces de TCEP (hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina) o DTT (ditiotreitol) en Tris 50 mM pH 7,5 con EDTA 2 mM durante 3 horas a 37 °C o durante la noche a temperatura ambiente (Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). El TioMab reducido se diluyó y se cargó en una columna HiTrap S en acetato de sodio 10 mM, pH 5 y se eluyó con PBS que contenía cloruro de sodio 0,3M. Alternativamente, el anticuerpo se acidificó mediante la adición de 1/20° volumen de ácido acético al 10 %, diluido con succinato 10 mM pH 5, cargado en la columna y después se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón succinato. La columna se eluyó con Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 2 mM.
El TioMab reducido eluido se trató con un exceso molar de 15 veces de DHAA (ácido deshidroascórbico) o sulfato de cobre acuoso 200 nM (CuSO4). La oxidación de los enlaces disulfuro intercadena se completó en aproximadamente tres horas o más. La oxidación del aire ambiental también fue eficaz. El anticuerpo reoxidado se dializó en succinato de sodio 20 mM pH 5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM y se almacenó congelado a -20 °C.
Conjugación de TioMab con productos intermedios enlazador-antibióticos: Los tioanticuerpos (TioMab) desbloqueados, reoxidados, se hicieron reaccionar con un exceso molar de 6-8 veces del producto intermedio enlazador-antibiótico de la Tabla 2 (de un stock de DMSO a una concentración de 20 mM) en Tris 50 mM, pH 8, hasta que la reacción se completó (16-24 horas) como se determinó por análisis LC-MS de la mezcla de reacción. Los conjugados anticuerpo-antibiótico (AAC) en bruto se aplicaron después a una columna de intercambio catiónico después de la dilución con succinato de sodio 20 mM, pH 5. La columna se lavó con al menos 10 volúmenes de columna de succinato de sodio 20 mM, pH 5, y el anticuerpo se eluyó con PBS. Los AAC se formularon en His/acetato 20 mM, pH 5, con sacarosa 240 mM usando columnas de filtración en gel. Los AAC se caracterizaron por espectroscopía Uv para determinar la concentración de proteínas, SEC analítica (cromatografía de exclusión por tamaño) para análisis de agregación y LC-MS antes y después del tratamiento con lisina C endopeptidasa.
La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó usando una columna Shodex KW802.5 en fosfato de potasio 0,2 M pH 6,2 con cloruro de potasio 0,25 mM e IPA al 15% a un caudal de 0,75 ml/min. El estado de agregación de AAC se determinó mediante la integración de la absorbancia de área máxima eluida a 280 nm.
El análisis LC-MS se realizó utilizando un instrumento Agilent QTOF 6520 ESI. Como ejemplo, un AAC generado utilizando esta química se trató con endoproteinasa Lys C (Promega) 1:500 p/p en Tris, pH 7,5, durante 30 min a 37 °C. Los fragmentos de escisión resultantes se cargaron en una columna 1000A, 8 um PLRP-S calentada a 80 °C y eluida con un gradiente de 30 % de B a 40 % de B en 5 minutos. Fase móvil A: H2O con TFA al 0,05 %. Fase móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,04 %. Caudal: 0,5 ml/min. La elución de proteínas se monitorizó mediante detección de absorbancia UV a 280 nm antes de la ionización por electropulverización y análisis de MS. Se logró, habitualmente, la resolución cromatográfica del fragmento Fc no conjugado, Fab no conjugado residual y antibiótico-Fab. Los espectros m/z obtenidos se desconvolucionaron utilizando el programa informático Mass Hunter™ (Agilent Technologies) para calcular la masa de los fragmentos de anticuerpos.
Ejemplo 25 Identificación y purificación de la estafopaína B como la proteasa responsable de la escisión
El sobrenadante de un cultivo durante la noche de Wood46 de 3 litros se concentró y se intercambió el tampón usando TFF (10 kDa) en fosfato de sodio 50 mM pH 7. La muestra se cargó en Q Sepaharose FF y las proteínas se separaron cromatográficamente usando un gradiente de NaCl 0-300 mM en fosfato de sodio 50 mM pH 7. Las fracciones activas se identificaron incubando con tioFAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126) de la Figura 27 y evaluando la escisión del enlazador en el sitio esperado mediante análisis LC-MS. Las fracciones activas se agruparon y se complementaron con sulfato de amonio a una concentración de 2M. Las proteínas se purificaron adicionalmente por cromatografía de interacción hidrófoba en Fenil Sepharose usando un gradiente de sulfato de amonio 2-0 M en TRIS 50 mM pH 7,5. De nuevo, Las fracciones activas se identificaron utilizando el compuesto instrumental. Estas fracciones se agruparon y se purificaron adicionalmente en Mono Q en acetato de sodio 50 mM pH 5,5 usando un gradiente de sal de NaCI 0-1M. Las fracciones activas de esta etapa de cromatografía se identificaron como antes, se agruparon y se aplicaron a cromatografía de exclusión por tamaño en PBS. SDS-PAGE identificó las fracciones activas y determinó que contenían una única proteína de interés.
Las fracciones activas enriquecidas de la purificación con Q Sepharose se caracterizaron para identificar la clase de proteasa responsable de la actividad. Se encontró que la proteasa estaba inhibida por N-etilmaleimida, indicando que la enzima es probablemente una cisteína proteasa. Después de revisar las cisteína proteasas secretadas conocidas de Staphylococcus aureus, se identificó estafopaína B para tener una especificidad de sustrato similar a la especificidad observada en la exploración REPLi (Kalinska, M., T. Kantyka, et al. (2012). Biochimie 94(2): 318). Se adquirió estafopaína B purificada (Sigma-Aldrich) y se incubó con tioFAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126) de la Figura 27. Se encontró que la estafopaína B escindía el enlazador en el mismo sitio que la proteasa activa purificada del sobrenadante de Wood46. La estafopaína B y la proteasa activa purificada del sobrenadante del cultivo se incubaron con Alexa Fluor® 488 C5 maleimida (Invitrogen, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.) para marcar las cisteínas del sitio activo. Las muestras se procesaron en SDS-PAGE para identificar la proteasa como estafopaína B. Los geles de SDS-PAGE de las fracciones activas de la purificación SEC se analizaron junto con la estafopaína B purificada, con y sin Alexa Fluor 488.
Las fracciones activas enriquecidas para la purificación con Q sepharose también se analizaron por espectrometría de masa proteómica. Se ejecutaron en SDS-PAGE diez microgramos de fracciones activas B11, B12 y C02 y diez microgramos de fracciones activas, 1, 2, 3 y diez microgramos de una fracción inactiva. Las bandas se quitaron y se sometieron a digestiones nocturnas por tripsina. Las muestras digeridas se analizaron por LC-MS/MS y los resultados de los espectros de masas en tándem se enviaron para la búsqueda en la base de datos utilizando el algoritmo de búsqueda Mascot. La estafopaína B fue el mejor resultado para las cisteína proteasas presentes en las fracciones activas. La Autolisina, que también es una cisteína proteasa, también aparece como un mejor resultado, con la mayor abundancia de péptidos únicos que se producen en la fracción inactiva, el control negativo, por lo tanto, la autolisina se omitió del examen. El análisis proteómico del espectro de masas de las fracciones activas de las purificaciones con Q Sepharose muestra una gran abundancia de estafopaína B. Los datos T de la reestructuración se filtraron para determinar proteínas S. aureus y se clasificaron por número de péptidos en la fracción activa 1.
La proteasa activa se purificó de sobrenadante de cultivo de Wood46 de S. aureus. Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C en 3 litros de TSB. Las células se eliminaron por centrifugación a 10.000 xg durante 10 min. El sobrenadante se recogió y se hizo pasar a través de dos filtros de 0,22 um. A continuación, se concentró y el tampón se intercambió en fosfato de sodio 50 mM pH 7 usando TFF con una membrana de 10 kD. La muestra se concentró diez veces hasta un volumen de 300 ml. La muestra se cargó en Q Sepaharose FF (GE Healthcare Biosciences AB) y las proteínas se separaron cromatográficamente usando un gradiente de NaCl 0-300 mM en fosfato de sodio 50 mM pH 7. Las fracciones activas se agruparon y se complementaron con sulfato de amonio a una concentración de 2M. Las proteínas se purificaron adicionalmente por cromatografía de interacción hidrófoba en Fenil Sepharose (GE Healthcare Biosciences AB) usando un gradiente de sulfato de amonio 2-0 M en TRIS 50 mM pH 7,5. Las fracciones se agruparon y se purificaron adicionalmente en Mono Q (GE Healthcare Biosciences AB) en acetato de sodio 50 mM pH 5,5 usando un gradiente de sal de NaCl 0-1M. Las fracciones activas de esta etapa de cromatografía se identificaron como antes, se agruparon y se aplicaron a cromatografía de exclusión por tamaño (Zenix-150, Tecnologías Sepax) en PBS.
Para identificar fracciones que contienen la proteasa activa de interés de los presentes inventores, se transfirieron 100 ul de cada fracción a una placa de 96 pocillos donde se incubó con 25 |jg de TIOFAB 4497 mal-GGAFAGGG-DNA31 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126). Se analizaron las fracciones de cada etapa de cromatografía para determinar la actividad, y se usaron 100 ul independientemente de la concentración de proteína. Las muestras se incubaron durante la noche a 37 °C y posteriormente se analizaron por LC-MS para identificar las fracciones donde se había producido la escisión por la proteasa del enlazador-antibiótico. Las fracciones activas agrupadas de la cromatografía Q Sepharose FF se midieron para tener una concentración de proteína total de 14 mg/ml. Se diluyeron 200 jg del conjunto a 2 mg/ml en PBS y se incubaron con y sin N-etilmaleimida (NEM, Sigma) a una concentración final de 0,1 mM. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadieron 25 |jg de THIOFAB 4497 mal-GGGAFAGGG-DNA31 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 126) a ambas muestras y se incubaron a 37 °C durante 2 horas. A las 2 horas, las muestras se analizaron por LC-MS para identificar si se había producido la escisión por la proteasa del enlazador-antibiótico. Se incubaron aproximadamente 50 ul de las fracciones activas de SEC con 0,1 mM Alexa Fluor 488 C5 maleimida (Invitrogen) durante 1 hora, independientemente de la concentración de proteínas para el marcado. Los ensayos de escisión con proteasas purificadas se realizaron incubando 5 jM del tioFAB conjugado con proteasa 50 nM en un volumen final de 100 jl. Los ensayos se realizaron en PBS pH 7.2, 4 mM L-Cys, EDTA 2,5 mM o citrato de sodio 100 mM pH 5, NaCl 100 mM, L-Cys 4 mM, EDTA 2,5 mM. Las muestras se incubaron durante 2 horas a 37 °C. A las 2 horas, las reacciones de escisión se desactivaron por dilución 1:1 con TFA al 1 %. Las muestras se ejecutaron posteriormente en LC-MS para determinar el porcentaje de escisión del enlazador. El porcentaje de escisión se determinó integrando los cromatogramas A280 de las especies escindidas e intactas. Los restos antibióticos o cromóforos añadidos en el extremo C de los enlazadores añaden una hidrofobicidad significativa, de modo que se resuelven en el periodo inicial tioFAB con enlazadores intactos y tioFAB con enlazadores escindidos.
Para el análisis proteómico de fracciones enriquecidas, se cargaron diez microgramos de fracciones activas enriquecidas de la purificación con Q Sepahrose® (GE Healthcare Life Sciences) en un gel Bis-Tris al 4-12 % (Life Technologies). Se quitaron carriles de gel completos y se dividieron de arriba a abajo en 11 bandas. Las bandas de gel se destiñeron con acetonitrilo al 50 %/bicarbonato de amonio 50 mM, se redujeron con ditiotreitol (concentración final 50 mM) durante 30 minutos a 50 °C, y se alquilaron con yodoacetamida (concentración final 50 mM) a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Las muestras se digirieron después a 37 °C durante la noche con 0,02 pg/pl de tripsina (Promega) en bicarbonato de amonio 50 mM. Las muestras digeridas se inyectaron en una columna capilar de diámetro interno de 100 pm (columna UPLC NanoAcquity, 100 pm x 100 mm, 1,7 pm, BEH130 C18, Waters Corp) y se separaron por cromatografía capilar de fase inversa en un sistema de UpLC NanoAcquity (Waters Corp). Las muestras se cargaron en ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua y se eluyeron con un gradiente de 2-90 % de tampón B (donde el tampón A es ácido fórmico al 0,1 %/acetonitrilo al 2 %/ agua al 98 % y el tampón B es ácido fórmico al 0,1 %/agua al 2 %/acetonitrilo al 98 %) a 1,00 pl/min con un tiempo de análisis total de 45 minutos. Los péptidos se eluyeron directamente en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher) y se ionizaron usando una fuente ADVANCE (Michrom-Bruker) con un voltaje de pulverización de 1,4 kV. Los datos del espectro de masas se obtuvieron utilizando un método que comprende una exploración MS completa (375-1600 m/z) en el Orbitrap a una resolución de 60.000 M/AM a m/z 400 seguido de disociación inducida por colisión (CID, por sus siglas en inglés) de los 8 primeros iones más abundantes detectados en la exploración MS completa en un ciclo repetido a lo largo del gradiente de LC en la trampa iónica lineal. Los resultados del espectro de masas en tándem se enviaron para la búsqueda en la base de datos utilizando el algoritmo de búsqueda Mascot® versión 2.3.02 (Matrix Sciences) contra una base de datos concatenada de diana-señuelo, Uniprot ver 2010_12, que comprende proteínas de S. aureus y contaminantes comunes de laboratorio. Se buscaron los datos con especificidad tríptica, modificaciones variables de la carbamidometilación de cisteína (+57,0215 Da) y oxidación de metionina (+15,995 Da), lo que permite 2 errores de escisión, 20 ppm de masa de iones precursores, y especificación de tolerancia de masa de iones de fragmento de 0,5 Da. Las coincidencias espectrales de péptidos se filtraron usando un algoritmo discriminante lineal (LDA, por sus siglas en inglés) a una tasa de falso descubrimiento falso (FDR, por sus siglas en inglés) del 1 %.
Ejemplo 26 Escisión por estafopaína de péptidos de FRET y AAC tioFab
Se incubaron 5 pM de tioFAB 4497 MP-LAFGA-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 135) y tioFAB 4497 MP-LAFAA-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 136) (Figura 30) con 50 nM de proteasa en PBS pH 7,2, L-Cys 4 mM, EDTA 2,5 mM durante 2 horas a 37 °C. A las 2 horas, las reacciones de escisión se desactivaron por dilución 1:1 con TFA al 1 %. Las muestras se ejecutaron posteriormente en LC-MS para determinar el porcentaje de escisión del enlazador. Todas las proteasas probadas escindieron los dos enlazadores, aunque en diferentes grados y ubicaciones (Tabla 4). La estafopaína A y la estafopaína B escinden los enlazadores en los mismos sitios: MP-La Fg ^A-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SeQ ID NO: 135) y MP-LAFA|A-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 136). La estafopaína B logra una escisión del 100 % de ambos enlazadores a la concentración probada. La catepsina B también logró una escisión del 100 % para ambos enlazadores en estas condiciones, aunque los sitios de escisión fueron mixtos. La Catepsina B escindió mal-LAFGA-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 135) exclusivamente en MP-LAFG|A-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 135), mientras escindió mal-LAFAA-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 136) en MP-LAFA|A-QsY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 136) y MP-LAFAA|-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SeQ ID NO: 136). La escisión de MP-LAFAA-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 136) por estafopaína A fue del 23 %, mientras que la escisión de m MP-LAFGA-QSY7 ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 135) fue del 38 %.
Se incubaron 5 pM de AAC-193 con 50 nM de proteasa en PBS pH 7,2, L-Cys 4 mM, EDTA 2,5 mM o citrato de sodio 100 mM pH 5, NaCl 100 mM, L-Cys 4 mM, EDTA 2,5 mM durante 2 horas a 37 °C. A las 2 horas, las reacciones de escisión se desactivaron por dilución 1:1 con TFA al 1 %. Las muestras se ejecutaron posteriormente en LC-MS para determinar el porcentaje de escisión del enlazador. El enlazador-antibiótico optimizado fue escindido eficazmente por todas las proteasas probadas. Tras la escisión por estafopaína A y estafopaína B, se liberó piperazino-rifamicina libre. La estafopaína B logró una escisión del 100 % a pH 5 y 7,2. La estafopaína A mostró una escisión del 100 % a pH 5 y una escisión del 64 % a pH 7,2.
Ejemplo 27 El conjugado anticuerpo-antibiótico, tio-S4497 LC v8-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) AAC-215, inhibe S. aureus in vitro:
Se suspendieron 1x108 bacterias Wood46 en fase estacionaria en 10 pl de tampón HB (solución salina equilibrada de Hanks complementada con Albúmina De Suero Bovino al 0,1 %) que contenía 100 pg/ml de AAC-215, tio-S4497 LC v8-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) (péptido del núcleo "divulgado como SEQ ID NO: 128) o AAC 126, tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PABC-(piperaz-BOR). Este último utiliza un enlazador escindible por catepsina B de valina-citrulina (vc) para suministrar el mismo antibiótico.
Después de 1 hora, las muestras se diluyeron 10 veces mediante la adición de 90 pl de HB o 90 pl de catepsina B (10 |jg/ml de catepsina B en acetato de sodio 20 mM, EDTA 1 mM, L-Cisteína 5 mM, pH 5) y se incubaron a 37 °C durante 3 horas adicionales. La liberación del antibiótico activo se infirió determinando si la incubación de los AAC con la bacteria era capaz de inhibir el crecimiento bacteriano posterior. Las suspensiones de bacterias/AAC se detectaron directamente sobre placas de Agar de Soja Tríptico y se visualizó el crecimiento bacteriano después de la incubación durante la noche a 37 °C. El fármaco activo se libera de AAC conjugado con el producto intermedio enlazador-antibiótico, MC-LAFG-PAB-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SeQ ID NO: 128).
Las bacterias que se incubaron sin AAC crecieron bien y no se vieron afectadas por el tratamiento con catepsina B. Las bacterias tratadas con AAC-126 que contienen el enlazador escindible por catepsina B, valina-citrulina (vc) crecieron bien después de la incubación en tampón HB solo, pero no pudieron crecer después del tratamiento con AAC-126 Catepsina B, indicando que se requirió el tratamiento enzimático para liberar antibiótico activo. Por el contrario, las bacterias incubadas con AAC-215 que contiene el enlazador escindible por estafopaína LAFG (SEQ ID NO: 128) no pudieron crecer después de la incubación con tampón HB solo, sugiriendo que la suspensión bacteriana contenía actividad enzimática que era suficiente para liberar el antibiótico activo del AAC con enlazador escindible por estafopaína.
Ejemplo 28 El conjugado anticuerpo-antibiótico, AAC -193, tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) destruye MRSA intracelular en un ensayo de macrófagos:
La cepa USA300 de S. aureus se incubó con diferentes dosis (100 jg/ml, 10jg/ml, 1 jg/ml o 0,1 jg/ml) de anticuerpo S4497 solo, tio-S4497 HC WT (v8) (SEQ ID NO: 137), AAC-192 LC V205C-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) o AAC-193 tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) para permitir la unión del AAC a la bacteria (Figura 31).
S4497 HC WT (v8) 446aa
EVQ LVE SGG GLV QPG GSL RLS CSA SGF SFN SFW MHW VRQ VPG KGL VWI SFT NNE GTT TAY ADS VRG RF1 ISR DNA KNT LYL EMN NLR GED TAV YYC ARG DGG LDD WGQ GTL VTV SSA STK
GPS VFP LAP S5K STS GGT AAL GCL VKD YFP EPV TVS WNS GAL TSG VHT FPA VLQ SSG LYS
LSS W T VPS SSL GTQ TY1 CNV NHK PSN TKV DKK VEP KSC DKT HTC PPC PAP ELL GGP SVF
LFP PKP KDT LMI SRT PEV TCV WD VSH EDP EVK FNW YVD GVE VHN AKT KPR EEQ YNS TYR W S VLT VLH QDW LNG KEY KCK VSN KAL PAP IEK TIS KAK GQP REP QVY TLP PSR EEM TKN QVS LTC LVK GFY PSD IAV EWE SNG QPE NNY KTT PPV LOS DGS FFL YSK LTV DKS RWQ QGN VFS CSV MHE ALH NHY TQK SLS LSP GK (SEQ ID NO: 137)
Después de 1 hora de incubación, las bacterias opsonizadas se proporcionaron a macrófagos murinos y se incubaron a 37 °C durante 2 horas para permitir la fagocitosis. Después de completar la fagocitosis, la mezcla de infección se reemplazó con medio de crecimiento normal complementado con 50 jg/ml de gentamicina para destruir cualquier bacteria extracelular restante y se determinó el número total de bacterias intracelulares supervivientes 2 días después sembrando en placa diluciones en serie de los lisados de macrófagos sobre placas de Agar de Soja Tríptico (Figura 31). El AAC escindible por estafopaína fue capaz de destruir las USA300 intracelular con una potencia similar en comparación con el AAC escindible por catepsina B. La línea discontinua gris indica el límite de detección para el ensayo (10 UFC/pocillo).
Ejemplo 29 Los AAC actúan de forma selectiva en la destrucción por antibióticos de S. aureus a través de la unión específica a antígeno del anticuerpo:
Se eligió la cepa Wood46 de S. aureus porque no expresa proteína A, una molécula que se une a la región Fc de los anticuerpos IgG. La cepa Wood46 de S. aureus se incubó con 10 jg/ml o 0,5 jg/ml de anticuerpo S4497, AAC de control de isotipo que contiene un enlazador escindible por catepsina B, AAC-101 tio-trastuzumab HC A118C-MC-vc-PAB-(dimetil-pipBOR), AAC-192 tio-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR), AAC de control de isotipo que contiene un enlazador escindible por estafopaína, tio-trastuzumab HC A118C-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) o AAC-193 tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-pABC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) durante 1 hora para permitir la unión de los AAC a las bacterias (Figura 32). Para limitar la unión no específica de los AAC, las bacterias opsonizadas se centrifugaron, se lavaron una vez y se resuspendieron en tampón antes de que se proporcionaran a los macrófagos murinos. Después de completar la fagocitosis, la mezcla de infección se reemplazó con medio de crecimiento normal complementado con 50 jg/ml de gentamicina para destruir cualquier bacteria extracelular restante y se determinó el número total de bacterias intracelulares supervivientes 2 días después sembrando en placa diluciones en serie de los lisados de macrófagos sobre placas de Agar de Soja Tríptico (Figura 32). El AAC que contiene un enlazador escindible por estafopaína, AAC-193, fue capaz de destruir todas las bacterias intracelulares detectables, mientras que el AAC de control de isotipo no mostró actividad. El ensayo de macrófagos demuestra que los AAC escindibles por estafopaína pueden destruir las bacterias intracelulares. El conjugado anticuerpo-antibiótico, AAC-125 tio-S4497 LC v8-MP-LAFG-PA-BC-(piperazinoBOR) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 128) es eficaz en un modelo de infección por MRSA in vivo:
Los ratones CB17.SCID se reconstituyeron con IgG humana usando una pauta posológica optimizada para producir niveles constantes de al menos 10 mg/ml de IgG humana en suero. Los ratones fueron tratados con anticuerpo 4497(50 mg/kg), AAC-215 con enlazador escindible por estafopaína (50 mg/kg) o un control de isotipo, AAC anti-gD que contiene un enlazador escindible por estafopaína (50 mg/kg). Los ratones recibieron una dosis única de AAC-215 el día 1 después de la infección por inyección intravenosa. Todos los ratones se sacrificaron el día 4 después de la infección y se determinó el número total de bacterias supervivientes en 2 riñones (Figura 33) o en corazón (Figura 34) mediante siembra en placas. El tratamiento con AAC-215 que contiene un enlazador escindible por estafopaína redujo las cargas bacterianas por debajo del límite de detección en 6 de los 8 ratones analizados, mientras que el AAC de control de isotipo mostró actividad limitada. La línea discontinua indica el límite de detección para el ensayo (333 UFC/ratón).
Ejemplo 30 Crecimiento de S. aureus y perfil de actividad de proteasas:
La cepa Wood46 de Staphylococcus aureus (ATCC10832) se cultivó durante la noche a 37 °C en caldo de soja tríptico (TSB) con agitación. Los cultivos se centrifugaron a 10.000 xg durante 10 min. El sobrenadante se recogió y se hizo pasar a través de dos filtros de 0,22 um.
Perfil de actividad de proteasas de S. aureus: Se concentraron 150 ml de sobrenadante de cultivo y se intercambió el tampón en solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando TFF (Millipore Pellicon XL Cassette Biomax 10kDa) hasta un volumen final de 38 ml con una concentración final de proteína total de 1 mg/ml. El ensayo de actividad de proteasas del sobrenadante de Wood46 se realizó utilizando la Biblioteca de Perfiles de Endopeptidasas Rápidas o REPLi (Mimotopes, Victoria, Australia). La biblioteca consta de 3375 péptidos fluorogénicos desactivados internamente en un formato de 96 pocillos dispuestos en 512 grupos. Los péptidos de la biblioteca contienen la secuencia MCA-Gly-Gly-Gly-Xaa-Yaa-Zaa-Gly-Gly-DPA-Lys-Lys (SEQ ID NO: 132) donde MCA corresponde al ácido 7-metoxicumarina-4-acético (donante fluorescente) y DPA corresponde al ácido Nb-(2,4-dinitrofenil)-L-2,3-diaminopropiónico (aceptor de fluorescencia). Los pocillos que contenían 5 nmoles de péptidos de FRET se solubilizaron en 5 ul de acetonitrilo al 50 % (Sigma). Se añadieron 50 pl (microlitros) del sobrenadante de Wood46 concentrado y 50 ul de PBS a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 °C y se tomaron medidas de fluorescencia a los 0, 30, 60, 140 y 170 minutos. Los datos de fluorescencia se obtuvieron en un Tecan Saphire2, excitación A320nm/emisión A400nm. El factor de cambio de la intensidad de fluorescencia del criterio de valoración se calculó como Ffinal/Finicial.
Los sitios de escisión del sustrato se determinaron por LC-MS realizada con un Agilent Q-TOF usando una fuente ESI. Se inyectaron 10 ul de cada pocillo y se separaron por cromatografía de fase inversa en una columna Waters Xbridge OST C182,5um (4,6 x 50 mm) usando un sistema Agilent 1260 HPLC. Las muestras se eluyeron con un gradiente de 2-90 % de tampón B (donde el tampón A es ácido trifluoroacético al 0,05 %/ agua al 99,95% y el tampón B es ácido trifluoroacético al 0,04 %/acetonitrilo al 99,96%) a 500 pl/min con un tiempo de análisis total de 20 minutos. Los péptidos se eluyeron directamente en un espectrómetro de masas Q-TOF. Los productos de escisión se asignaron basándose en la comparación de los pesos moleculares observados con las masas calculadas correspondientes a la escisión en cada sitio posible.
Ejemplo 31 Síntesis del enlazador peptídico de FRET con maleimida:
El péptido de FRET con maleimida, (MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(fluoresceína) ("péptido del núcleo" divulgado como SEQ ID NO: 125) de la Figura 26 se sintetizó mediante química en fase sólida de Fmoc convencional usando un sintetizador de péptidos PS3 (Protein Technologies, Inc.). Se usaron 0,1 mmol de resina Fmoc-Lys(Boc)-Rink amida (Novabiochem) para generar una carboxamida C-terminal. Se añadió Fmoc-Lys(Mtt)-OH (Novabiochem) en el primer resto N-terminal para permitir una determinación química adicional de la cadena lateral después de la eliminación del grupo Mtt. Un aceptor de fluorescencia, 5(6)-carboxitetrametilrrodamina o TAMRA (Novabiochem), se unió a esta amina de cadena lateral en la resina después de que el grupo Mtt se eliminara por tres lavados consecutivos de 30 minutos de TFA al 1 % en diclorometano con triisopropilsilano (TIS) al 3 %. La reacción se dejó proceder durante 20 horas. Después de esta etapa, el grupo Fmoc terminal se elimina con piperidina al 20% en DMF y se acopla con ácido maleimido-propiónico (Bachem AG) mediante HBTU. Los péptidos intermedios marcados con TAMRA se separaron de la resina con ácido trifluoroacético (TFA)/TIS/agua 95:2,5:2,5) (v/v/v) durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. La solución de escisión se filtró y se evaporó en una corriente de nitrógeno para eliminar el TFA. Los intermedios en bruto disueltos en una mezcla de agua y acetonitrilo se sometieron a purificación adicional por HPLC de fase inversa con una columna Júpiter de 5 pl C4 (5 pm, 10 mm x 250 mm) de Phenomenex. Después de la liofilización, los intermedios purificados se hicieron reaccionar con 10 equivalentes de NHS-fluoresceína (Thermo Scientific) en solución salina tamponada con fosfato 50/50 (PBS)/dimetilformamida (DMF) (v/v) durante 20 horas para marcar la amina libre en la lisina C-terminal. El péptido de FRET se purificó y liofilizó como se describe anteriormente. Todas las mezclas de reacción y productos finales se analizaron y confirmaron por LC-MS.
Síntesis en fase sólida de enlazadores: Todos los enlazadores descritos se sintetizaron usando química en fase

Claims (52)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico que comprende un anticuerpo monoclonal anti-ácidos teicoicos de pared (WTA), en donde el anticuerpo monoclonal anti-ácidos teicoicos de pared se une a Staphylococcus aureus y se fija covalentemente a un antibiótico de tipo rifamicina mediante un enlazador peptídico (L) escindible por endopeptidasas o cisteína proteasas de S. aureus, el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico se selecciona de las fórmulas:
Figure imgf000234_0001
en la que
R5 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y
n es 0 o 1; y
Figure imgf000234_0002
R3 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12; y
n es 1 o 2;
en donde R es H, alquilo C1-C12 o C(O)CH3;
L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
-Str-Pep-Y-en la que Str es una unidad extensora, Pep es un péptido de dos a doce restos de aminoácidos e Y es una unidad espaciadora;
Ac es el anticuerpo monoclonal anti-ácidos teicoicos de pared; y
p es un número entero de 1 a 8;
en donde la VL del anticuerpo monoclonal anti-WTA comprende CDR L1 que comprende la secuencia de KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO: 99), CDR L2 que comprende la secuencia de WASTRKS (SEQ ID NO: 100) y CDR L3 que comprende la secuencia de q Qy FSp Py T (SEQ ID NO: 101); y la VH del anticuerpo monoclonal anti-WTA comprende CDR H1 que comprende la secuencia de SFWMH (Se Q ID NO: 102), CDR H2 que comprende la secuencia de FTNNEGTTTAyAdSVRG (SEQ ID NO: 103) y CDR H3 que comprende la secuencia de GEGGLDD (SEQ ID NO: 118) o GDGGLDD (SEQ ID NO: 104).
2. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 119.
3. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.
4. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo comprende una VL y una VH, en donde la VL comprende la secuencia de SEQ ID NO: 119 y la VH comprende la secuencia SEQ ID NO: 156.
5. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) en donde la LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y una cadena pesada (HC) en donde la HC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146, SEQ ID No : 147, SEQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 124.
6. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) en donde la LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y una cadena pesada (HC) en donde la HC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146, SEQ ID No : 147, SEQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 124.
7. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) en donde la LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 y una cadena pesada (HC) en donde la HC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146, SEQ ID No : 147, SEQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 124.
8. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120.
9. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8, en donde el anticuerpo comprende una VL y una VH, en donde la VL comprende la secuencia de SEQ ID NO: 119 y la VH comprende la secuencia SEQ ID NO: 120.
10. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) en donde la LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y una cadena pesada (HC) en donde la HC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146.
11. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) en donde la LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y una cadena pesada (HC) en donde la HC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147.
12. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) en donde la LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 y una cadena pesada (HC) en donde la HC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157.
13. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera (LC) en donde la LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 y una cadena pesada (HC) en donde la HC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147.
14. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antibiótico de tipo rifamicina comprende una amina cuaternaria fijada al enlazador peptídico.
15. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 14, en donde el enlazador peptídico está fijado a una cisteína o una cisteína modificada por ingeniería del anticuerpo anti-WTA.
16. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, en donde el enlazador peptídico es un enlazador escindible por estafopaína B o por estafopaína A.
17. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 16, en donde el enlazador peptídico es un enlazador escindible por la proteasa catepsina B humana.
18. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 17, en donde el enlazador peptídico es un enlazador dipeptídico val-cit.
19. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde p es de 2 a 4.
20. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:
Figure imgf000236_0001
21. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Str tiene la fórmula:
Figure imgf000236_0002
en la que R6 se selecciona del grupo que consiste en alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8, -0-(alquilo C-i-Cs), -arileno-, -alquileno-arileno C1-C10, -arileno-alquileno-C1-C10, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo-C3-C8)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2OX- y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un número entero que varía de 1 a 10.
22. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 21, en donde R6 es -(CH2)5-.
23. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Pep comprende de dos a doce restos de aminoácidos seleccionados independientemente de glicina, alanina, fenilalanina, lisina, arginina, valina y citrulina.
24. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 23, en donde Pep se selecciona de valinacitrulina (val-cit, vc), fenilalanina-lisina (fk) y valina-citrulina-fenilalanina (val-cit-phe).
25. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Y comprende paraaminobencilo o paraaminobenciloxicarbonilo.
26. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000236_0003
donde AA1 y AA2 se seleccionan independientemente de una cadena lateral de aminoácidos.
27. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 26, en donde la cadena lateral de aminoácidos se selecciona independientemente de H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3 y -CH2CH2CH2NHC(O)NH2.
28. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 26, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000237_0001
29. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 26, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000237_0002
30. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 29, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000237_0003
31. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 26, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000237_0004
32. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 31, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000238_0001
33. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 26, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000238_0002
34. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 33, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000238_0003
35. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 26, en donde L es el enlazador peptídico que tiene la fórmula:
Figure imgf000238_0004
donde R7 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C12.
36. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 26 que tiene la fórmula:
Figure imgf000239_0001
37. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiotico de la reivindicación 36 que tiene la formula:
Figure imgf000239_0002
38. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 26 que tiene la fórmula:
Figure imgf000239_0003
39. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de la reivindicación 38 que tiene la fórmula:
Figure imgf000240_0001
40. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiotico de la reivindicación 1 que tiene la formula:
Figure imgf000240_0002
en donde Ac es un anticuerpo monoclonal anti-ácidos teicoicos de pared (WTA) que se une a Staphylococcus aureus, en donde la VL del anticuerpo monoclonal anti-ácidos teicoicos de pared comprende CDR L1 que comprende la secuencia de KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO: 99), CDR L2 que comprende la secuencia de WASTRKS (SEQ ID NO: 100) y CDR L3 que comprende la secuencia de QQYFSPPYT (SEQ ID NO: 101); y la VH del anticuerpo monoclonal anti-WTA comprende CDR H1 que comprende la secuencia de SFWMH (SEQ ID NO: 102), CDR H2 que comprende la secuencia de FTNNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO: 103) y CDR H3 que comprende la secuencia de GEGGLDD (SEQ ID NO: 118); y
p es un número entero de 1 a 8.
41. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo, un agente de deslizamiento, un diluyente o un excipiente farmacéuticamente aceptables.
42. Un proceso para preparar el compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, que comprende conjugar el antibiótico de tipo rifamicina con el anticuerpo monoclonal de WTA.
43. Un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 para su uso en terapia.
44. Un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 para su uso en un método para tratar una infección bacteriana en un paciente, en donde la infección bacteriana es una infección por Staphylococcus aureus.
45. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico para su uso en el método de la reivindicación 44, en donde la carga bacteriana en el paciente se reduce por el tratamiento.
46. Un compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 para su uso en un método para reducir el número de células bacterianas intracelulares de Staphylococcus aureus en las células hospedadoras de un paciente infectado por Staphylococcus aureus sin reducir el número de las células hospedadoras.
47. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico para su uso en el método de la reivindicación 46, en donde se reduce el número de células bacterianas persistentes.
48. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 47, en donde el paciente es un ser humano.
49. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 48, que comprende además administrar un segundo agente terapéutico.
50. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico para su uso en el método de la reivindicación 49, en donde el segundo agente terapéutico es un antibiótico.
51. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico para su uso en el método de la reivindicación 50, en donde el segundo agente terapéutico es un antibiótico seleccionado de la clase estructural que consiste en (i) aminoglucósidos, (ii) betalactámicos, (iii) macrólidos/péptidos cíclicos, (iv) tetraciclinas, (v) fluoroquinolinas/fluoroquinolonas y (vi) oxazolidinonas.
52. El compuesto conjugado anticuerpo-antibiótico para su uso en el método de la reivindicación 50, en donde el segundo agente terapéutico es un antibiótico seleccionado del grupo que consiste en clindamicina, novobiocina, retapamulina, daptomicina, GSK-2140944 (gepotidacina) que tiene la estructura:
Figure imgf000241_0001
sitafloxacina, teicoplanina, triclosán, naftiridona, radezolida, doxorrubicina, ampicilina, vancomicina, imipenem, doripenem, gemcitabina, dalbavancina y azitromicina.
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