ES2766257T3 - Métodos y composiciones para regular la homeostasis del hierro mediante la modulación de bmp-6 - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un anticuerpo neutralizante anti-BMP-6 que inhibe preferentemente a BMP-6 humana sobre BMP-2 o BMP-4, en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de la proteína hemojuvelina humana soluble (HJV) a BMP-6 y en donde el anticuerpo se une a BMP-6 con al menos 5 veces mayor afinidad que la BMP-7, para su uso en el tratamiento de la anemia por inflamación.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para regular la homeostasis del hierro mediante la modulación de bmp-6

Campo técnico de la invención

La presente descripción se refiere generalmente a la terapia, prevención y mejora de los trastornos de la homeostasis del hierro. La descripción se refiere más específicamente a los métodos de uso de BMP-6 y de los reactivos específicos a la proteína BMP-6, tales como anticuerpos para alterar los niveles séricos de hierro, la hemoglobina sérica y/o los niveles de hematocrito en seres humanos. Tales anticuerpos son útiles en composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento de la hemocromatosis y la anemia de la inflamación.

Antecedentes de la invención

El hierro es un elemento esencial requerido para el crecimiento y la supervivencia de casi todos los organismos. Los glóbulos rojos (RBC) contienen hemoglobina (Hb), una proteína roja rica en hierro que transporta oxígeno desde los pulmones a todos los músculos y órganos del cuerpo donde reacciona para proporcionar la energía que el cuerpo necesita para sus actividades normales. Cuando la cantidad de glóbulos rojos o la cantidad de hemoglobina que contienen caen por debajo de lo normal, el cuerpo recibe menos oxígeno y genera menos energía de la que necesita para funcionar correctamente. Esta condición en general se conoce como anemia. Una causa común de la anemia entre bebés y niños es una deficiencia de hierro. Hasta un 20 % de los niños en los Estados Unidos y un 80 % de los niños en los países en desarrollo se volverán anémicos en algún momento a la edad de 18 años. Martin, P. L. y otros The Anemias, Principles and Practices of Pediatrics, 1657 (2da ed., Lippincott 1994).

En mamíferos, el equilibrio del hierro se regula principalmente a nivel de absorción duodenal del hierro de la dieta. En los humanos, la hemocromatosis hereditaria (HH) es una enfermedad genética autosómica recesiva común causada por la hiperabsorción de hierro en la dieta que conduce a una sobrecarga de hierro en el plasma y múltiples órganos, incluidos en particular el páncreas, el hígado y la piel, y provoca daños en estos órganos y tejidos debido a los depósitos de hierro.

La hemocromatosis juvenil es un trastorno de sobrecarga de hierro causado por mutaciones en el gen que codifica la principal hormona reguladora del hierro hepcidina (HAMP) y hemojuvelina (HFE2). (Roetto, A., y otros. 2003. Nut. Genet.

33:21-22; Papanikolaou, G. y otros 2004. Nut. Genet. 36:77-82.) Se ha demostrado que hemojuvelina es un correceptor de la proteína morfogenética ósea (BMP) y que las señales de BMP mediadas por hemojuvelina regulan la expresión de hepcidina y el metabolismo del hierro. (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539; Babitt, J.L., y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939.) Sin embargo, se desconoce(n) el(los) regulador(es) endógeno(s) BMP de hepcidina in vivo.

Las BMP son miembros de la superfamilia del TGF-p, que está compuesta por más de 40 ligandos. (Shi, Y. y Massague, J. 2003. Cell. 113:685-700.) Estos factores de crecimiento median diversos procesos biológicos que incluyen la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y el patrón celular. Los ligandos de la superfamilia BMP/TGF-p inician una cascada de señalización intracelular uniéndose a un complejo de receptores serina treonina quinasas de tipo I y tipo II. El complejo receptor activado fosforila las proteínas Smad intracelulares, que después se translocan al núcleo para modular la expresión génica.

Recientemente, se descubrió un papel para la vía de señalización de BMP en la regulación de la principal hormona reguladora del hierro hepcidina. (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539; Babitt, J.L., H y otros J Clin Invest.

117:1933-1939; Wang, R.H., y otros 2005. Cell Metab. 2:399-409.) Secretada por el hígado, la hepcidina inhibe la absorción intestinal de hierro y la liberación de hierro por los macrófagos al disminuir la expresión en la superficie celular de la ferroportina exportadora de hierro. (Nemeth, E. y otros 2004. Science. 306:2090-2093). La hepcidina es regulada positivamente por la administración de hierro (Pigeon, C., y otros 2001. J. Biol. Chem. 276:7811-7819, Nicolas, G. y otros 2002. J. Clin. Invest. 110:1037-1044; Nemeth, E. y otros 2004. J. Clin. Invest. 113: 1271-1276.) y se inhibe por la anemia. (Nicolas, G. y otros 2002. J. Clin. Invest. 110:1037-1044) La deficiencia de hepcidina y la actividad descontrolada de la ferroportina son los mecanismos patogénicos comunes que subyacen al trastorno genético hemocromatosis hereditaria por la sobrecarga de hierro debido a mutaciones en el propio HAMP, HFE2, HFE, TFR2 (que codifica el receptor de transferrina tipo 2) y mutaciones raras de SCLAOA1 (que codifica la ferroportina). (Pietrangelo, A. 2006. Biochim Biophys Acta 1763:700-710) La hepcidina también es regulada positivamente por las citocinas inflamatorias, como IL-6, y el exceso de hepcidina está implicado en la patogénesis de la anemia de la inflamación (Pigeon, C., y otros 2001. J. Biol. Chem.

276:7811-7819, Nicolas, G. y otros 2002. J. Clin. Invest. 110:1037-1044; Nemeth, E. y otros 2004. J. Clin. Invest. 113: 1271-1276; Nemeth, E. y otros 2003. Blood. 101:246 1-2463; Weiss, G. y Goodnough, L.T. 2005. N.Engl. J. Med.

352:1011-1023; Andrews NC. 2008. Blood. 1122 19-30.)

La reducción de la señalización de BMP hepática por una inactivación condicional específica de hígado del mediador intracelular común de BMP/TGF-p Smad4 (Wang, R.H., y otros 2005. Cell Metab.2:399-409.), o por mutaciones en el HFE2 (Papanikolaou, G., y otros 2004. Nut. Genet. 36:77-82; Babitt, J.L., y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539; Huang, F.W. y otros J. Clin. Invest. 115:2187-2191; Niederkofler, V., Salie, R., Arber, S. 2005. J Clin Invest. 115:2180-6), que codifica el correceptor de BMP hemojuvelina, se asocian con una expresión inadecuadamente baja de hepcidina y una sobrecarga de hierro. Las señales de BMP aumentan positivamente la expresión de la hepcidina a nivel transcripcional in vitro. (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539; Babitt, J.L., H y otros J Clin Invest. 117:1933-1939; Wang, R.H., y otros 2005. Cell Metab.2:399-409; Truksa, J. y otros 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:10289-10293; Verga Falzacappa, M.V., y otros 2008. J Mol Med. 86:531-40.). La administración de hierro in vivo aumenta la señalización por BMP hepática (Yu, P.B. y otros 2008. Nut Chem Biol. 4:33-41). La administración de BMP in vivo aumenta la expresión de la hepcidina y reduce el hierro sérico. (Babitt, J.L., H y otros J Clin Invest. 117:1933-1939). Por el contrario, la administración de hemojuvelina soluble fusionada a la porción Fc de la Fc de inmunoglobulina humana (HJV.Fc) in vivo, que inhibe selectivamente BMP-2, BMP-4, BMP-5 y b Mp-6, pero no BMP-7 o BMP-9, inhibe la expresión de hepcidina, aumenta la expresión de ferroportina, moviliza las reservas de hierro de células reticuloendoteliales y aumenta el hierro sérico in vivo. (Babitt, J.L. y otros 2007. J Clin Invest. 117: 1933-1939.) La administración del inhibidor de BMP de molécula pequeña no selectivo Dorsomorfina también inhibe la expresión de hepcidina y aumenta el hierro sérico in vivo. (Yu, P.B. y otros 2008. Nut Chem Biol. 4:33-41).

La hemojuvelina (también conocida como RGMc) es un miembro de la familia de proteínas de moléculas guías repulsivas, incluidas RGMa y DRAGON (RGMb), que comparten una identidad de aminoácidos del 50-60 %. (Samad, T.A. y otros 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036.). Al igual que hemojuvelina, RGMa (Babitt, J.L. y otros 2005. J. Biol. Chem.280:29820-29827) y DRAGON (Samad, T.A., y otros 2005. J. Biol. Chem. 280:14122-14129) también funciona como correceptores para la vía de señalización de BMP.

Existe la necesidad de un método rentable y eficiente para regular la expresión de la hepcidina y el metabolismo del hierro.

Resumen de la invención

En un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición para su uso en un método de tratamiento, como se define en la reivindicación 1.

La presente descripción proporciona métodos novedosos para modular BMP-6 para tratar trastornos de sobrecarga de hierro debido a la deficiencia de hepcidina o anemia de la inflamación debido al exceso de hepcidina.

La descripción se refiere a moduladores de la vía de señalización de BMP que tienen un papel en el tratamiento de los trastornos de sobrecarga de hierro debido a la deficiencia de hepcidina o anemia de la inflamación debido al exceso de hepcidina.

La presente descripción se refiere a un método para regular la homeostasis del hierro en un sujeto, dicho método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de una composición farmacéutica suficiente para modular la señalización de BMP-6 a un nivel suficiente para alterar la homeostasis del hierro, los niveles de hemoglobina y/o los niveles de hematocrito en el sujeto. En algunos aspectos, la administración de la composición reduce la señalización de BMP-6. En algunos aspectos, la composición comprende un reactivo capaz de unirse a BMP-6. En algunos ejemplos, el reactivo se une a BMP-6 en los residuos TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO:3). En algunos aspectos, el reactivo es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de la proteína hemojuvelina humana soluble a BMP-6. En ciertos ejemplos específicos, la proteína hemojuvelina humana soluble es HJV.Fc o HJV.His. En otros aspectos, el anticuerpo inhibe la actividad de BMP-6 uniéndose a BMP-6 en un dominio independiente del dominio en el que la proteína hemojuvelina humana soluble se une a BMP-6. En ciertos ejemplos específicos, la proteína hemojuvelina humana soluble es HJV.Fc o HJV.His.

La presente descripción se refiere a métodos en los que la administración del compuesto reduce la inducción mediada por hemojuvelina de la expresión de hepcidina. En algunos aspectos, el reactivo se administra en una cantidad suficiente para inhibir una interacción entre hemojuvelina y BMP-6. En algunos aspectos, el reactivo inhibe preferentemente la expresión o la actividad de BMP-6 humana sobre la de BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7 o BMP-9. En algunos aspectos, el reactivo se une a BMP-6 con al menos 5 veces mayor afinidad que a BMP-7.

La descripción proporciona los métodos para la administración de las composiciones de la descripción que dan como resultado un aumento de los niveles de hierro sérico o una mayor saturación de transferrina sérica en el sujeto. La descripción también proporciona los métodos para la administración de las composiciones de la descripción que dan como resultado niveles aumentados de hemoglobina o hematocrito.

La descripción proporciona los métodos para la administración de las composiciones de la descripción que dan como resultado un aumento de la señalización de BMP-6. En algunos aspectos, la composición comprende un reactivo capaz de aumentar los niveles séricos de BMP-6. En algunos aspectos, el reactivo aumenta los niveles de expresión de BMP-6.

La descripción proporciona los métodos para tratar a un sujeto que tiene uno o más síntomas de hemocromatosis hereditaria, los síntomas seleccionados del grupo consisten en: aumento del nivel de hierro sérico, aumento de la saturación de transferrina sérica, reducción de la expresión de la hepcidina, reducción del almacenamiento de hierro en el bazo, aumento de la expresión de la ferroportina y sobrecarga de hierro en los tejidos.

La descripción proporciona los métodos para la administración de la composición que reduce el nivel de expresión de BMP-6. En algunos aspectos, la composición comprende un reactivo capaz de inhibir la expresión del gen de BMP-6, en el que el reactivo es un ADN antisentido, ARNip, ARN de interferencia, microARN (ARNmi) o ARN antisentido, y en el que la reducción en la expresión de BMP-6 es suficiente para aumentar el nivel de hierro sérico o la saturación de transferrina sérica en el sujeto.

La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a BMP-6 humana, en el que dicha BMP-6 humana consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 y la unión inhibe la actividad reguladora de hierro de BMP-6 y una composición que comprende al anticuerpo monoclonal aislado, que comprende una cantidad del anticuerpo suficiente para aumentar el nivel de hierro sérico o la saturación de transferrina sérica en un sujeto. En algunos ejemplos, el anticuerpo monoclonal aislado inhibe competitivamente la unión de la proteína hemojuvelina humana soluble a BMP-6 para reducir la unión a BMP-6 en un 25 %-100 %. En ciertos ejemplos específicos, la proteína hemojuvelina humana soluble es HJV.Fc o HJV.His. En ejemplos más específicos, el anticuerpo monoclonal aislado inhibe competitivamente la unión de anticuerpos anti-BMP-6 a BMP-6 seleccionados del grupo que consiste en el anticuerpo monoclonal de R & D Systems contra BMP-6 humana, MAB507 (clon 74219), el anticuerpo policlonal de R & D Systems para BMP-6 humana, AF507 (lote CXL04A) y el anticuerpo policlonal de Santa Cruz en un 25 % -100 %. En otros ejemplos, el anticuerpo monoclonal aislado se une a BMP-6 en un dominio distinto del dominio al que se une la HJV.Fc.

La descripción también proporciona anticuerpos anti-BMP-6 tales como anticuerpos humanos, que consisten en un anticuerpo quimerizado, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un fragmento Fv de cadena simple, un fragmento F(ab')² , un Fd, un anticuerpo de dominio (dAb), un diacuerpo, un maxicuerpo y un nanocuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo monoclonal aislado se une tanto a BMP-6 humana como a BMP-6 de roedor.

La descripción también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica al anticuerpo anti-BMP-6 y un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico unida operativamente a una secuencia de control reguladora.

La descripción también proporciona un método para usar una célula huésped que comprende al vector de la reivindicación o una molécula de ácido nucleico para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación en condiciones adecuadas de modo que el ácido nucleico se exprese para producir el anticuerpo.

La descripción también proporciona el tratamiento de un sujeto que tiene uno o más síntomas de hemocromatosis hereditaria mediante la administración de (a) una composición farmacéutica suficiente para modular la señalización de BMP-6 a un nivel suficiente para alterar la homeostasis del hierro, los niveles de hemoglobina y/o los niveles de hematocrito y (b) un estimulador de la eritropoyesis, en cantidades terapéuticamente eficaces. Los estimuladores de la eritropoyesis ilustrativos incluyen a la eritropoyetina, las variantes agonistas de la eritropoyetina y los péptidos o anticuerpos que se unen y activan al receptor de la eritropoyetina. Los estimuladores de la eritropoyesis incluyen, pero no se limitan a, la epoetina alfa, epoetina beta, epoetina delta, epoetina omega, epoetina iota, epoetina zeta y sus análogos, péptidos miméticos, anticuerpos miméticos e inhibidores de la HIF (véase la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2005/0020487) En particular, la eritropoyetina incluye, pero no se limita a, moléculas de eritropoyetina o a sus variantes o sus análogos como se describe en las siguientes patentes o solicitudes de patentes: patentes de Estados Unidos núms. 4,703,008; 5,441,868; 5,547,933; 5,618,698; 5,621,080; 5,756,349; 5,955,422 y 5,856,298; y WO 91/05867; WO 95/05465; WO 00/24893 y WO 01/81405. En ciertos ejemplos, el estimulador de la eritropoyesis se selecciona del grupo que consiste en la eritropoyetina humana y la darbepoetina alfa.

La descripción también proporciona un método para diagnosticar un trastorno relacionado con BMP-6, el método comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica de un ser humano sospechoso de tener dicho trastorno con un anticuerpo que se une específicamente a BMP-6 en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo a BMP-6 humana; y (b) cuantificar BMP-6 unida al anticuerpo, en el que la cantidad de BMP-6 en dicha muestra, como se cuantificó en (b), por encima o por debajo de un nivel normal indica la presencia de un trastorno relacionado con BMP-6.

La descripción también proporciona un método para monitorizar un tratamiento en el que se administra un antagonista de BMP-6, el método comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica, de un humano al que se le ha administrado un antagonista de BMP-6, con un anticuerpo que se une específicamente a BMP-6 en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo a BMP-6 humana; y (b) cuantificar BMP-6 unida al anticuerpo, en la que un cambio en la cantidad del nivel de BMP-6 sérica, como se cuantificó en (b), es indicativo de la eficacia del antagonista de BMP-6. En algunos aspectos, el antagonista es un anticuerpo o una molécula pequeña.

La descripción también proporciona un método para tratar a un mamífero con un nivel elevado de hierro o anemia mediante la administración de una composición farmacéutica que modula la señalización por BMP-6.

La descripción también proporciona un conjunto para tratar un trastorno asociado con la homeostasis del hierro, que comprende un artículo de fabricación que comprende una ampolleta o una jeringa precargada que comprende los anticuerpos anti-BMP-6.

La descripción también proporciona un método para seleccionar compuestos que se unen a BMP-6 humana que comprende poner en contacto un compuesto candidato con una composición que comprende a BMP-6 bioactiva, y detectar un complejo entre el compuesto candidato y BMP-6 humana en la composición, en el que la detección de un complejo indica que el compuesto candidato se une a BMP-6 humana, y además en el que el compuesto candidato inhibe una unión de BMP-6 con HJV.Fc en al menos un 25 %.

La descripción también proporciona un método para generar un anticuerpo para BMP-6 humana que comprende poner en contacto una célula productora de inmunoglobulina con un polipéptido

que comprende una secuencia de BMP-6 con SEQ ID NO: 1 o una variante del mismo, y aislar una inmunoglobulina producida por dicha célula.

La descripción también proporciona una composición para el tratamiento de un trastorno por deficiencia de hierro que comprende un anticuerpo que se une específicamente a BMP-6 y a HJV.Fc. En un ejemplo, el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de BMP-6 por la proteína conjugado de hemojuvelina humana soluble (HJV.Fc). En otro ejemplo, el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de BMP-6 por la proteína conjugado de hemojuvelina humana soluble (HJV.Fc). En otro ejemplo, el anticuerpo se une a un dominio en BMP-6 distinto del dominio al que se une HJV.Fc.

En otro ejemplo específico, el anticuerpo está en una cantidad suficiente para reducir la unión de HJV.Fc a BMP-6 en un 25 %-100 %. preferentemente, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo monoclonal de RandD Systems, el anticuerpo policlonal de RandD Systems y el anticuerpo policlonal de Santa Cruz. En otro ejemplo específico, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otros ejemplos, dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimerizado, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F(ab')² , un Fd, un anticuerpo de dominio (dAb), un diacuerpo, un maxicuerpo y un nanocuerpo. La descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo que se une específicamente a BMP-6. La descripción también proporciona un vector de expresión que comprende esta molécula de ácido nucleico unida operativamente a una secuencia de control reguladora. La descripción también proporciona una célula huésped que comprende un vector o una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo que se une específicamente a BMP-6.

La descripción también proporciona un método para usar la célula huésped divulgada para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación en condiciones adecuadas de modo que el ácido nucleico se exprese para producir el anticuerpo.

La descripción también proporciona un método para diagnosticar un trastorno relacionado con BMP-6, el método comprende: poner en contacto una muestra biológica de un humano sospechoso de tener dicho trastorno con un anticuerpo que se une específicamente a BMP-6 en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo a BMP-6 humana; y cuantificar BMP-6 unida al anticuerpo, en el que la cantidad de BMP-6 en dicha muestra, como se cuantificó en (b), por encima o por debajo de un nivel normal indica la presencia de un trastorno relacionado con BMP-6.

La descripción también proporciona un método para monitorizar un tratamiento en el que se administra un antagonista de BMP-6, el método comprende: poner en contacto una muestra biológica, de un ser humano al que se le ha administrado un antagonista de BMP-6, un anticuerpo que se une específicamente a la BMP- 6 en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo a BMP-6 humana; y cuantificar BMP-6 unida al anticuerpo, en el que un cambio en la cantidad de nivel de BMP-6 sérica, como se cuantificó en (b), es indicativo de la eficacia del antagonista de BMP-6. En un ejemplo específica, el antagonista es un anticuerpo. En otro ejemplo específico, el antagonista es una molécula pequeña.

La descripción también proporciona un anticuerpo que se une específicamente a BMP-6 humana, en el que en presencia de una concentración de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO:3) el anticuerpo compite para que no se una específicamente a BMP-6 humana.

La descripción también proporciona un anticuerpo que se une específicamente a 5 aminoácidos consecutivos de TQSQDVARVSSASDY (SeQ ID NO:3). En ejemplos específicos, el anticuerpo se une específicamente a 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos consecutivos de TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO:3).

La presente invención y otros objetos, características y ventajas de la presente invención se tornarán evidentes en la siguiente Descripción Detallada de la Invención y las Figuras acompañantes y las modalidades.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1D muestran la evidencia de que DRAGON.Fc inhibe selectivamente la inducción en la expresión de la hepcidina por la BMP.

Las Figuras 2A-2G muestran la evidencia de que la administración de DRAGON.Fc en ratones no afecta la expresión de hepcidina o el metabolismo del hierro.

Las Figuras 3A-3D muestran la evidencia de que el anticuerpo neutralizante específico para BMP-6 inhibe la expresión hepática de la hepcidina y aumenta el hierro sérico y la saturación de la transferrina sérica in vivo.

Las Figuras 4A-4h muestran evidencia de que los ratones nulos para la Bmp6 exhiben una expresión de hepcidina hepática reducida, una expresión aumentada de ferroportina en el bazo, una saturación aumentada de hierro y transferrina en suero, un mayor contenido de hierro en el hígado y un contenido reducido de hierro del bazo.

Las Figuras 5A-5C muestran evidencia de que la administración de BMP-6 en ratones aumenta la expresión del ARNm de la hepcidina y reduce el hierro sérico.

La Figura 6 es una inmunotransferencia para BMP-6.

La Figura 7 es una inmunotransferencia para HJV.

La Figura 8 es una inmunotransferencia para hBMP-6.

Descripción detallada de la invención

Sorprendentemente, los inventores han descubierto que BMP-6 es un regulador importante de la expresión de la hepcidina y el metabolismo del hierro. En comparación con hemojuvelina soluble (HJV.Fc), la proteína de fusión homóloga DRAGON.Fc es un inhibidor más potente de la activación del promotor de la hepcidina por BMP-2 y BMP-4, pero un inhibidor menos potente de BMP-6 in vitro. In vivo, DRAGON.Fc no tiene ningún efecto sobre la expresión de la hepcidina y el metabolismo del hierro, mientras que HJV.Fc o un anticuerpo neutralizante específico para BMP-6 inhiben la expresión de la hepcidina y aumentan el hierro sérico. Además, los ratones nulos para la Bmp 6 tienen un fenotipo que se asemeja a la hemocromatosis hereditaria con expresión reducida de hepcidina, una expresión aumentada de ferroportina, un aumento de la saturación de hierro y transferrina séricos, unas reservas reducidas de hierro en el bazo y una sobrecarga de hierro en los tejidos. Los inventores muestran que la administración de BMP-6 en ratones aumenta la expresión de hepcidina y reduce el hierro sérico. Tomados en conjunto, estos datos respaldan un papel clave para BMP-6 como regulador endógeno de la expresión de la hepcidina y el metabolismo del hierro in vivo.

La administración del anticuerpo neutralizante específico para BMP-6 dio como resultado un aumento de la saturación de hierro y de la transferrina séricos, lo que indica efectos sobre la expresión de hepcidina y el metabolismo del hierro. La inhibición de BMP-6 endógena por un ARNip o un anticuerpo neutralizante inhibe la inducción de la expresión de hepcidina mediada por hemojuvelina. La BMP-6 es probablemente un ligando para hemojuvelina.

Además, se encontró que la adición de BMP-6 exógena aumenta la expresión de hepcidina y causa una reducción dependiente de la dosis en la saturación del hierro y la transferrina séricos.

La secuencia de aminoácidos de la pro-BMP-6 se muestra en la Tabla 1 a continuación:

La BMP-6 está formada por los aminoácidos 297-428 de la secuencia de la pro-BMP-6 que se muestra en la Tabla 1. La BMP-6 se muestra en la Tabla 2 a continuación.

A menos que se defina de cualquier otra forma, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente invención tendrán el significado que se entienden comúnmente por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos que de cualquier otra manera sea requerido por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y técnicas de, cultivo de tejidos y células, biología molecular, y la química e hibridiación de proteínas y oligo- o polinucleótidos descritas en la presente descripción son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Se usan las técnicas estándar para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y cultivo y transofrmación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como comúnmente se realizan en la técnica o como se describen en la presente descripción. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica, muchos de los cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da Edition, 1989); Maniatis y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Las nomenclaturas usadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente descripción son aquellas bien conocidas y usados comúnmente en la técnica. Se usan las técnicas estándar para la síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y suministro, y tratamiento de los pacientes.

Las siguientes definiciones son útiles para comprender la presente invención:

El término “anticuerpo” (Ac) como se usa en la presente descripción incluye a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad de unión al antígeno deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa indistintamente con "anticuerpo" en la presente descripción.

Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son los materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purifica: (1) a más del 95 % en peso del anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más preferentemente, a más del 99 % en peso; (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria; o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras mediante el uso de azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Habitualmente, sin embargo, un anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

La unidad de anticuerpo de cuatro cadenas básico es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Un anticuerpo IgM consta de 5 de la unidad heterotetramérica básica junto con un polipéptido adicional llamado cadena J y, por lo tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar conjuntos polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas a lo largo con la cadena J. En el caso de las IgGs, la unidad de 4 cadenas es generalmente de unos 150,000 daltons. Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L tiene, además, puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena H tiene en el extremo N, un dominio variable (V^h) seguido de tres dominios constantes (C^h) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios C^h para los isotipos p y e. Cada cadena L tiene en el extremo N, un dominio variable (V^l) seguido de un dominio constante (C^l) en su otro extremo. El V^l se alinea con el V^h y el C^l se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (C^h1). Se cree que residuos de aminioácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. El acoplamiento de una V^h y V^l juntos forman un único sitio de unión a antígeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8va edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71, y Capítulo 6.

La cadena L de cualquier especie vertebrada puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamado kappa (k) y lambda (A), basado en las secuencias de aminoácido de sus dominios constantes (C^l). En dependencia de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (C^h), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o ¡sotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas alfa (C£), delta (6), epsilon (:?.), gamma (y) and mu (p), respectivamente. Las clases y y a se dividen a su vez en subclases sobre la base de diferencias relativamente pequeñas en la secuencia y función de la C^h, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios V difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la unión del antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en el intervalo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" que son cada una generalmente de 9-12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de cada una de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cuatro FR, adoptando en gran medida una configuración de hoja p, conectados por tres regiones hipervariables, que forman lazos de conexión, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por los FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no se involucran directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan varias funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC).

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente descripción se refiere a los residuos de aminioácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos desde una “región determinante de la complementariedad” o “CDR” (por ejemplo, cerca de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la V^l, y cerca de aproximadamente los 1-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la V^h; dominio variable de la cadena pesada; Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un “bucle hipervariable” (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en la V^l, y los 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en la V^h; dominio variable de la cadena pesada; chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente descripción se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminación con otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridoma descrita por primera vez por Kohler y otros, Nature, 256: 495 (1975), o pueden hacerse usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, eucariotas de animales o plantas (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,816,567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos para fagos mediante el uso de las técnicas descritas, por ejemplo, en Clacksony otros, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en la presente descripción incluyen anticuerpos “quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada ( La patente de EE. UU. núm. 4,816,567; y Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 81:6851-6855 (1984)). La presente descripción proporciona secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de anticuerpos humanos, para uso de acuerdo con la invención. Por consiguiente, los anticuerpos quiméricos de interés principal en la presente descripción incluyen anticuerpos que tienen una o más secuencias de unión a antígeno humano (por ejemplo, los CDR) y que contiene una o más secuencias derivadas de un anticuerpo no humano, por ejemplo, una secuencia de región FR o C. Además, los anticuerpos quiméricos de interés principal en la presente descripción incluyen aquellos que comprenden una secuencia de unión a antígeno de dominio variable humano de una clase o subclase de anticuerpo y otra

secuencia, por ejemplo la secuencia de la región FR o C, derivada de otra clase o subclase de anticuerpos. Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente descripción también incluyen aquellos que contienen secuencias de unión a antígeno de dominio variable relacionadas con las descritas en la presente descripción o derivadas de una especie diferente, como un primate no humano (por ejemplo, Mono del viejo mundo, mono, etc.). Los anticuerpos quiméricos también incluyen anticuerpos primatizados y humanizados.

Además, los anticuerpos quiméricos pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. Para detalles adicionales, véase Jones y otros, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Generalmente se considera, un "anticuerpo humanizado" como un anticuerpo humano que tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se refieren frecuentemente como residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización se realiza tradicionalmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones y otros, Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann y otros, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de región hipervariable de importación por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos núm.

4,816,567) en el que se ha sustituido sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana.

Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que contiene solo secuencias presentes en un anticuerpo producido naturalmente por un humano. Sin embargo, como se usa en la presente descripción, los anticuerpos humanos pueden comprender residuos o modificaciones que no se encuentran en un anticuerpo humano natural, incluidas aquellas modificaciones y secuencias variantes descritas en la presente descripción. Estos se hacen típicamente para refinar o mejorar aún más el rendimiento del anticuerpo.

Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión a antígeno así como también un CL y al menos los dominios constantes de la cadena pesada, C^h 1, C^h 2 y C^h 3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de la secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')² y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véase la patente de Estados Unidos núm. 5,641,870; Zapata y otros, Protein Eng. 8(10): 1057-1062); moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La frase "fragmento funcional o análogo" de un anticuerpo es un compuesto que tiene actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento funcional o análogo de un anticuerpo anti-IgE es uno que puede unirse a una inmunoglobulina IgE de tal manera que se evite o reduzca sustancialmente la capacidad de tal molécula de tener la capacidad de unirse al receptor de alta afinidad FC E RI.

La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El "fragmento Fab" consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (V^h) y el primer dominio constante de una cadena pesada (C^h 1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión al antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un fragmento F(ab')² que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por enlaces disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y todavía es capaz de entrecruzar el antígeno. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por tener unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxilo del dominio C^h1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente descripción en la cual el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')² se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagras entre ellos. Se conocen, además, otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

El fragmento "Fc" comprende las porciones carboxi-terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan por las secuencias en la región Fc, región que también es la parte reconocida por los receptores Fc (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células.

Un "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno completo y de unión a antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de la región variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (tres bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen con los residuos de aminoácidos para la unión a antígeno y confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

El "Fv de cadena única" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpos V^h y V^l conectados en una cadena polipeptídica única. Preferentemente, el polipéptido scFv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios V^h y V^l que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, más arriba.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente de 5-10 residuos) entre los dominios V^h y V^l, de manera que se logra un acoplamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, lo que resulta en un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "entrecruzados" en los que los dominios V^h y V^l de los dos anticuerpos se presentan en cadenas polipeptídicas diferentes. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, la EP 404,097; WO 93/11161; y en Hollinger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Según se usa en la presente descripción, un anticuerpo que se "internaliza" es uno que es absorbido por (es decir, entra) la célula al unirse a un antígeno en una célula de mamífero (es decir, un polipéptido o receptor de superficie celular). El anticuerpo internalizante incluirá, por supuesto, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos humanos o quiméricos y conjugados de anticuerpos. Para ciertas aplicaciones terapéuticas, se contempla la internalización in vivo. El número de moléculas de anticuerpos internalizadas será suficiente o adecuado para matar una célula o inhibir su crecimiento, especialmente una célula infectada. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o del conjugado de anticuerpos, en algunos casos, la absorción de una sola molécula de anticuerpo en la célula es suficiente para matar la célula diana a la que se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son altamente potentes para matar de modo que la internalización de una molécula de la toxina conjugada con el anticuerpo es suficiente para matar la célula infectada.

Según se usa en la presente descripción, se dice que un anticuerpo es "inmunoespecífico", "específico para" o "se une específicamente" a un antígeno si reacciona a un nivel detectable con el antígeno, preferentemente con una constante de afinidad, Ka, mayor que o igual a aproximadamente 104 M-1, o mayor que o igual a aproximadamente 105 M-1, mayor que o igual a aproximadamente 106 M-1, mayor que o igual a aproximadamente 107 M-1, o mayor o igual que 108 M-1. La afinidad de un anticuerpo por su antígeno análogo también se expresa comúnmente como una constante de disociación K^d, y en ciertas modalidades, el anticuerpo anti-BMP-6 se une específicamente a BMP-6 si se une con una K^d menor que o igual a 10'4 M, menor que o igual a aproximadamente 10'5 M, menor que o igual a aproximadamente 10'6 M, menor que o igual a 10'7 M, o menor que o igual a 10'8 M. Las afinidades de los anticuerpos se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard y otros (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)).

Las propiedades de unión de un anticuerpo a antígenos, células o tejidos del mismo generalmente se determinan y se evalúan utilizando métodos de inmunodetección que incluyen, por ejemplo, ensayos basados en inmunofluorescencia, tales como inmunohistoquímica (IHC) y/o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado es uno que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el anticuerpo de la técnica con una característica biológica de un anticuerpo designado se unirá al mismo epítopo que el unido por el anticuerpo designado y/o tendrá una función efectora común como el anticuerpo designado.

El término anticuerpo "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye un anticuerpo que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente la actividad biológica de un epítopo, polipéptido o célula que se une específicamente. Los métodos para identificar anticuerpos antagonistas pueden comprender poner en contacto un polipéptido o célula específicamente unida por un anticuerpo antagonista candidato con el anticuerpo antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido o la célula.

Las “funciones efectoras” del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de secuencia de aminoácidos variante) de un anticuerpo, y varía con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de las funciones efectoras de los anticuerpos incluyen: La unión a C1q y la citotoxicidad dependiente del complemento; la unión al receptor Fc; la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B); y la activación de células B.

El “receptor Fc” o “FcR” describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En ciertas modalidades, el FcR es un FcR humano de secuencia nativa. Además, el FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, que incluyen las variantes alélicas y las formas por corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen al FcyRIIA (un “receptor de activación”) y al FcyRIIB (un “receptor de inhibición”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplásmicos de estos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico. (véase review M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel y otros, Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas y otros, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, que incluyen aquellos que están por identificarse en el futuro, se abarcan por el término “FcR” en la presente descripción. El término incluye, además, el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y otros, J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim y otros, J. Immunol. 24:249 (1994)).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos el FcyRIII y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen PBMC, células NK, monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las PBMC y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse a partir de una fuente nativa, por ejemplo, a partir de sangre.

Un "mamífero" con el propósito de tratar una infección, se refiere a cualquier mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. preferentemente, el mamífero es humano.

“Tratar” o "tratamiento" o "alivio" se refieren tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir o frenar (disminuir) el trastorno o condición patológica específico. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen aquellos que ya están con el trastorno así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que el trastorno se debe prevenir. Un sujeto o mamífero es "tratado" con éxito para una infección si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo de acuerdo con los métodos de la presente descripción, el paciente muestra una reducción observable y/o medible en o la ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el número de células infectadas o ausencia de las células infectadas; reducción en el porcentaje de células totales que están infectadas; y/o alivio hasta cierto punto, uno o más de los síntomas asociados con la infección específica; reducción de la morbilidad y mortalidad, y mejora en los problemas de calidad de vida. Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora de la enfermedad se pueden medir fácilmente mediante procedimientos de rutina familiares para un médico.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. Veáse la definición anterior de "tratar".

La administración "crónica" se refiere a la administración del (de los) agente(s) en un modo continuo en oposición a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un período prolongado de tiempo. La administración "intermitente" es un tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concomitante) y consecutiva en cualquier orden. En un ejemplo, se usa una terapia combinada que usa una composición farmacéutica suficiente para modular la señalización por BMP-6 a un nivel suficiente para alterar la homeostasis del hierro, los niveles de hemoglobina y/o los niveles de hematocrito y un estimulador de la eritropoyesis. Esta combinación es útil para tratar a un sujeto que tiene uno o más síntomas de hemocromatosis hereditaria. En varios ejemplos, los estimuladores de la eritropoyesis pueden usarse para mejorar el tratamiento de un paciente con anemia.

En particular, los pacientes que son hiporeactivos a, que incluye los no reactivos a, la terapia con un estimulador de la eritropoyesis, tales como la eritropoyetina o sus análogos (Epoetina alfa, Epoetina beta, darbepoetina alfa), entre otros, se beneficiarán del tratamiento conjunto con un antagonista de la actividad de la hepcidina o un inhibidor de la expresión de hepcidina.

Según se usa en la presente descripción, "estimulador de la eritropoyesis" significa un compuesto químico que directa o indirectamente provoca la activación del receptor de eritropoyetina, por ejemplo, al unirse y provocar la dimerización del receptor o al estimular la expresión de eritropoyetina endógena. Los estimuladores de la eritropoyesis incluyen la eritropoyetina y sus variantes, análogos o derivados de los mismos que se unen y activan al receptor de eritropoyetina; anticuerpos que se unen al receptor de eritropoyetina y activan al receptor; o péptidos que se unen y activan al receptor de eritropoyetina; o compuestos químicos orgánicos pequeños, opcionalmente de menos de aproximadamente 1000 Daltons en peso molecular, que se unen y activan al receptor de eritropoyetina. Los estimuladores de la eritropoyesis incluyen, pero no se limitan a, la epoetina alfa, epoetina beta, epoetina delta, epoetina omega, epoetina iota, epoetina zeta y sus análogos, eritropoyetina pegilada, eritropoyetina carbamilada, péptidos miméticos (que incluye los anticuerpos EMP 1/hematida), anticuerpos miméticos e inhibidores de la HIF (véase la publicación de patente de Estados Unidos núm.

2005/0020487). Los estimuladores de la eritropoyesis ejemplares incluyen la eritropoyetina, darbepoetina, las variantes agonistas de la eritropoyetina y péptidos o anticuerpos que se unen y activan al receptor de eritropoyetina (e incluyen compuestos reportados en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núms. 2003/0215444 y 2006/0040858) así como las moléculas de eritropoyetina o sus variantes o análogos, como se describe en las siguientes patentes o solicitudes de patentes: patentes de Estados Unidos núms. 4,703,008; 5,441,868; 5,547,933; 5,618,698; 5,621,080; 5,756,349; 5,767,078; 5,773,569; 5,955,422; 5,830,851; 5,856,298; 5,986,047; 6,030,086; 6,310,078; 6,391,633; 6,583,272; 6,586,398; 6,900,292; 6,750,369; 7,030,226; 7,084,245; 7,217,689; num. de publicación PCT WO 91/05867; WO 95/05465; WO 99/66054; WO 00/24893; WO 01/81405; WO 00/61637; WO 01/36489; WO 02/014356; WO 02/19963; WO 02/20034; WO 02/49673; WO 02/085940; WO 03/029291; WO 2003/055526; WO 2003/084477 WO 2003/094858 WO 2004/002417 WO 2004/002424 WO 2004/009627 WO 2004/024761 WO 2004/033651 WO 2004/035603 WO 2004/043382 WO 2004/101600 WO 2004/101606 WO 2004/101611 WO 2004/106373 WO 2004/018667 WO 2005/001025 WO 2005/001136 WO 2005/021579 WO 2005/025606 WO 2005/032460 WO 2005/051327 WO 2005/063808 WO 2005/063809 WO 2005/070451 WO 2005/081687 WO 2005/084711 WO 2005/103076 WO 2005/100403; WO 2005/092369; WO 2006/50959; WO 2006/02646; WO 2006/29094; y núm. de publicación de patente de Estados Unidos US 2002/0155998; US 2003/0077753; US 2003/0082749; US 2003/0143202; US 2004/0009902; US 2004/0071694; US 2004/0091961; US 2004/0143857; US 2004/0157293; US 2004/0175379; US 2004/0175824 US 2004/0229318 US 2004/0248815 US 2004/0266690 US 2005/0019914 US 2005/0026834 US 2005/0096461 US 2005/0107297 US 2005/0107591 US 2005/0124045 US 2005/0124564 US 2005/0137329 US 2005/0142642 US 2005/0143292 US 2005/0153879 US 2005/0158822 US 2005/0158832 US 2005/0170457 US 2005/0181359 US 2005/0181482 US 2005/0192211 US 2005/0202538 US 2005/0227289 US 2005/0244409 US 2006/0088906 US 2006/0111279.

Las secuencias ejemplares, la fabricación, purificación y uso de la eritropoyetina humana recombinante se describen en una serie de publicaciones de patentes, que incluyen pero no se limitan a Lin y otros patente de Estados Unidos núm.

4,703,008 y Lai y otros patente de Estados Unidos núm. 4,667,016. La darbepoetina es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilada que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de la rHuEPO que proporciona dos cadenas de carbohidratos adicionales. Más específicamente, la darbepoetina alfa contiene dos cadenas de carbohidratos unidas a N adicionales en los residuos de aminoácidos 30 y 88. Las secuencias ejemplares, la fabricación, purificación y uso de la darbepoetina y otros análogos de eritropoyetina se describen en varias publicaciones de patentes, que incluyen Strickland y otros, 91/05867, Elliott y otros, WO 95/05465, Egrie y otros, WO 00/24893 y Egrie y otros WO 01/81405. Los derivados de polipéptidos naturales o análogos incluyen aquellos que han sido modificados químicamente, por ejemplo, para unir polímeros solubles en agua (por ejemplo, pegilada), radionúclidos u otras fracciones diagnósticas o dirigidas o terapéuticas.

El término "actividad eritropoyética" significa actividad para estimular la eritropoyesis como se demuestra en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo de ratón policitémico exhipóxico. Véase, por ejemplo, Cotes and Bangham, Nature 191:1065 (1961)

Los "portadores" según se usan en la presente descripción incluyen portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero que está expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con pH tamponado. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen al ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS™.

"Marca" según se usa en la presente descripción, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo con el fin de generar un anticuerpo "marcado". La marca se puede detectar por sí misma (por ejemplo, los marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, que puede catalizar la modificación química de un compuesto o una composición de sustrato que se detecta.

El término "epítopo etiquetado" según se usa en la presente descripción se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual se puede formar un anticuerpo, pero es lo suficientemente corto como para que no interfiera con la actividad del polipéptido al que se fusiona. El polipéptido etiqueta también es preferentemente bastante único, de modo que el anticuerpo no reacciona sustancialmente de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos).

Una "molécula pequeña" se define en la presente descripción para tener un peso molecular inferior a aproximadamente 500 Daltons.

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a ARN, ADN, PNA o polímeros mixtos de cadena sencilla o doble. Los polinucleótidos pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y de plásmidos, y segmentos genéticos más pequeños diseñados que expresan, o pueden adaptarse para expresar polipéptidos.

Un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico que está sustancialmente separado de otras secuencias de ADN del genoma, así como de proteínas o complejos como los ribosomas y las polimerasas, que naturalmente acompañan a una secuencia nativa. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que se ha eliminado de su entorno natural e incluye aislados de ADN recombinantes o clonados y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Un ácido nucleico sustancialmente puro incluye formas aisladas del ácido nucleico. Por supuesto, esto se refiere al ácido nucleico como se aisló originalmente y no excluye genes o secuencias que después se agregaron al ácido nucleico aislado por la mano del hombre.

El término "polipéptido" se usa en su significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no están limitados a una longitud específica del producto. Los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido, y tales términos pueden usarse indistintamente en la presente descripción a menos que se indique específicamente lo contrario. Este término tampoco se refiere o excluye modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto naturales como no naturales. Un polipéptido puede ser una proteína completa, o una subsecuencia de la misma. Los polipéptidos particulares de interés en el contexto de esta descripción son subsecuencias de aminoácidos que comprenden los CDR y que son capaces de unir un antígeno o una célula infectada con Influenza A.

Un “polipéptido aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. En modalidades preferidas, el polipéptido aislado se purificará (1) a más del 95 % en peso del polipéptido según se determina por el método de Lowry, y lo más preferentemente, más del 99 % en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras mediante el uso de azul de Coomassie o tinción de plata. Un polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido no estará presente. Generalmente, sin embargo, un polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Un polinucleótido de "secuencia nativa" es uno que tiene la misma secuencia de nucleótidos que un polinucleótido derivado de la naturaleza. Un polipéptido de "secuencia nativa" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) derivado de la naturaleza (por ejemplo, de cualquier especie). Tales polinucleótidos y polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos.

Una "variante" polinucleotídica, según se usa el término en la presente descripción, es un polinucleótido que típicamente difiere de un polinucleótido específicamente divulgado en la presente descripción en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Tales variantes pueden ser de origen natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias de polinucleótidos de la descripción y evaluando una o más actividades biológicas del polipéptido codificado según se describe en la presente descripción y/o usando cualquiera de una serie de técnicas bien conocidas en la materia.

Una "variante" de polipéptido, según se usa el término en la presente descripción, es un polipéptido que típicamente difiere de un polipéptido específicamente descrito en la presente descripción en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Tales variantes pueden ser de origen natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias de polipéptidos anteriores de la descripción y evaluando una o más actividades biológicas del polipéptido según se describe en la presente descripción y/o usando cualquiera de una serie de técnicas bien conocidas en la materia.

Las modificaciones pueden hacerse en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente descripción y aún obtener una molécula funcional que codifica una variante o derivado de polipéptido con características deseables. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear una variante o porción equivalente, o incluso mejorada, de un polipéptido de la descripción, un experto en la técnica modificará típicamente uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de su capacidad para unirse a otros polipéptidos (por ejemplo, antígenos) o células. Dado que la capacidad de unión y la naturaleza de una proteína es lo que define la actividad biológica funcional de esa proteína, pueden hacerse ciertas sustituciones de la secuencia de aminoácidos en una secuencia proteica y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN, y no obstante obtener una proteína con propiedades similares. Por lo tanto se contempla que pueden hacerse varios cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones divulgadas o en las secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

En muchos casos, una variante de polipéptido contendrá una o más sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos podría esperar que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no se modifiquen sustancialmente.

En la técnica se conoce que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen una puntuación o índice hidropático similar y aún dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún se obtiene una proteína con función biológica equivalente. En la modalidad de tales modificaciones, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, aquellos que están dentro de ±1 se prefieren particularmente y aquellos dentro de ±0.5 se prefieren aun más particularmente. Además, en la técnica se entiende que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse eficazmente en base a la hidrofilicidad. U. S. Patent 4,554,101, proporciona que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, determinada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.

Como se explicó anteriormente, por lo tanto, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas para los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse además sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar modificaciones conservadoras incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener además, o alternativamente, modificaciones no conservadoras. En una modalidad preferida, las variantes de polipéptido difieren de una secuencia nativa por sustitución, eliminación o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes pueden modificarse además (o alternativamente), por ejemplo, por la eliminación o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido.

Los polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia de la proteína. El polipéptido también puede conjugarse a un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His) o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse a una región Fc de inmunoglobulina.

La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse usando el programa Megalign en el conjunto de Lasergene de programas de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando los parámetros predeterminados. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345­ 358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad., Set USA 80:726-730.

Alternativamente, el alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. MoL Biol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda de los métodos de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de programa Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) o por inspección.

Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y otros (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul y otros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. BlAs T y BLAST 2.0 pueden usarse, por ejemplo con los parámetros descritos en la presente descripción, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos y polipéptidos de la descripción. El programa para realizar el análisis de BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología.

“Homología” se refiere al porcentaje de residuos en la variante de la secuencia del polipéptido o el polinucleótido que son idénticos a la secuencia no variante después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso de ser necesario, para lograr el por ciento máximo de homología. En modalidades particulares, las variantes de polinucleótidos y polipéptidos tienen al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de polinucleótidos o polipéptidos con una polinucleótido o polipéptido descrito en la presente descripción.

"Vector" incluye vectores de expresión y lanzadera. Típicamente, la construcción del plásmido también incluirá un origen de replicación (por ejemplo, el origen de replicación ColE1) y un marcador seleccionable (por ejemplo, la resistencia a ampicilina o a la tetraciclina), para la replicación y selección, respectivamente, de los plásmidos en bacterias. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene las secuencias de control o elementos reguladores necesarios para la expresión de los anticuerpos, incluido el fragmento de anticuerpo para uso de la invención, en células bacterianas o eucariotas. Los vectores adecuados se divulgan a continuación.

La presente descripción incluye anticuerpos humanos para BMP-6 que comprenden un polipéptido de la presente descripción, incluidos aquellos polipéptidos codificados por una secuencia de polinucleótidos correspondiente a Bmp6, y fragmentos y variantes de los mismos. Los anticuerpos para uso según la presente invención se unen a la proteína BMP-6. En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona anticuerpos para BMP-6 que se unen a epítopos dentro de BMP-6 que solo están presentes en la conformación nativa, es decir, como se expresa en las células.

Como entenderá el experto en la técnica, la descripción general de los anticuerpos en la presente descripción y los métodos de preparación y uso de los mismos también se aplican a los constituyentes polipéptido anticuerpos individuales y fragmentos de anticuerpos.

Los anticuerpos para uso según la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales. Sin embargo, en modalidades preferidas, son monoclonales. En modalidades particulares, los anticuerpos para uso de acuerdo con la presente invención son anticuerpos completamente humanos. Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidos en la técnica y se describen en general, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm.

6,824,780. Típicamente, los anticuerpos para uso de acuerdo con la presente invención se producen de manera recombinante, usando vectores y métodos disponibles en la técnica, como se describe más adelante. Los anticuerpos humanos también pueden ser generados in vitro por células B activadas (véase las patentes de Estados Unidos núms.

5,567,610 y 5,229,275).

Los anticuerpos humanos también pueden producirse en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de la inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región que une la cadena pesada del anticuerpo (J^h) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal resultan en la inhibición completa de la producción del anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz génica de la inmunoglobulina de línea germinal humana a tales ratones mutantes de línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos después del reto con el antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 90:2551 (1993); Jakobovits y otros, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y otros, Year in Immunol., 7:33 (1993); patente de Estados Unidos núms. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todos de GenPharm); patente de Estados Unidos núms. 5,545,807; y WO 97 /17852. Tales animales pueden modificarse genéticamente para producir anticuerpos humanos que comprenden un polipéptido para su uso de acuerdo con la presente invención.

En ciertas modalidades, los anticuerpos para uso de acuerdo con la presente invención son anticuerpos quiméricos que comprenden secuencias derivadas de fuentes tanto humanas como no humanas. En modalidades particulares, estos anticuerpos quiméricos son humanizados o PRIMATIZADOS™. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

En el contexto de la presente invención, los anticuerpos quiméricos también incluyen anticuerpos completamente humanos en los que la región hipervariable humana o una o más CDR se retienen, pero una o más regiones de secuencia se han reemplazado por secuencias correspondientes de un animal no humano.

La elección de secuencias no humanas, tanto ligeras como pesadas, para usar en la fabricación de anticuerpos quiméricos es importante para reducir la antigenicidad y las respuestas de anticuerpos humanos anti-no humanos cuando el anticuerpo está destinado para uso terapéutico humano. Es importante además que los anticuerpos quiméricos retengan una alta afinidad de unión por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos quiméricos se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos quiméricos conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales humanas y no humanas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para aquellas personas con conocimiento en la técnica. Los programas de computación que ilustran y muestran las probables estructuras de conformación tridimensional de las secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidato están disponibles. La inspección de estas pantallas permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de la inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unir su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir del receptor y e importar las secuencias para que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad por el antígeno o los antígenos objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable están directa y más sustancialmente involucrados en influenciar la unión al antígeno.

Como se señaló anteriormente, los anticuerpos (o inmunoglobulinas) se pueden dividir en cinco clases diferentes, en función de las diferencias en las secuencias de aminoácidos en la región constante de las cadenas pesadas. Todas las inmunoglobulinas dentro de una clase dada tienen regiones constantes de cadena pesada muy similares. Estas diferencias pueden detectarse mediante estudios de secuencia o más comúnmente por medios serológicos (es decir por el uso de anticuerpos dirigidos a estas diferencias). Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, para uso en la presente invención pueden ser de cualquier clase y, por lo tanto, pueden tener una cadena pesada y, H, a, 6 o £. Una cadena y puede ser y1, y2, y3 o y4; y una cadena a puede ser a l o a2.

En una modalidad preferida, un anticuerpo para uso de acuerdo con la presente invención, o fragmento del mismo, es una IgG. La IgG se considera la inmunoglobulina más versátil, porque es capaz de llevar a cabo todas las funciones de las moléculas de inmunoglobulina. La IgG es la principal Ig en suero, y la única clase de Ig que cruza la placenta. La IgG también corrige el complemento, aunque la subclase IgG4 no. Los macrófagos, los monocitos, los PMN y algunos linfocitos tienen receptores Fc para la región Fc de la IgG. No todas las subclases se unen igualmente bien; Las IgG2 e IgG4 no se unen a los receptores Fc. Una consecuencia de la unión a los receptores Fc en los PMN, monocitos y macrófagos es que la célula ahora puede internalizar mejor el antígeno. La IgG es una opsonina que mejora la fagocitosis. La unión de la IgG a los receptores Fc en otros tipos de células da como resultado la activación de otras funciones. Los anticuerpos para uso según la presente invención pueden ser de cualquier subclase de IgG.

En otra modalidad preferida, un anticuerpo, o fragmento del mismo, para uso de acuerdo con la presente invención es una IgE. La IgE es la Ig sérica menos común, ya que se une muy fuertemente a los receptores Fc en los basófilos y los mastocitos incluso antes de interactuar con el antígeno. Como consecuencia de su unión a basófilos y mastocitos, la IgE está implicada en reacciones alérgicas. La unión del alergeno a la IgE en las células da como resultado la liberación de varios mediadores farmacológicos que provocan síntomas alérgicos. La IgE también juega un papel en las enfermedades parasitarias por helmintos. Los eosinófilos tienen receptores Fc para la IgE y la unión de los eosinófilos a los helmintos recubiertos con IgE da como resultado la muerte del parásito. La IgE no repara el complemento.

En diversas modalidades, los anticuerpos para uso de acuerdo con la presente invención y sus fragmentos comprenden una cadena ligera variable que es k o A. La cadena A puede ser cualquiera de los subtipos, incluidos, por ejemplo, la A1, A2, A3 y A4.

Como se indicó anteriormente, la presente descripción proporciona además fragmentos de anticuerpos que comprenden un polipéptido para su uso según la presente invención. En ciertas circunstancias, existen ventajas de usar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos. Por ejemplo, el tamaño más pequeño de los fragmentos permite un aclaramiento rápido y puede conducir a un mejor acceso a ciertos tejidos, como los tumores sólidos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen: los fragmentos Fab, Fab', F(ab')² y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Varias técnicas son conocidas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y otros, Journal of Biochemical and Biofysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan y otros, Science, 229:81 (1985))). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv, y ScFv se pueden todos expresar y secretar a partir de células de E. coli, permitiendo de este modo la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar los fragmentos F (ab')² (Carter y otros, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')² pueden aislarse directamente del cultivo de células huésped recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')² con un tiempo de vida medio incrementado in vivo que comprende residuos de epítopo de unión al receptor de rescate se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el profesional con experiencia.

En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Véase el documento WO 93/16185; patente de Estados Unidos núms. 5,571,894; y 5,587,458. Las Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes. Por lo tanto, son adecuadas para reducir la unión inespecífica durante su uso in vivo. Las proteínas de fusión de sFv se pueden construir para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxi de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, más arriba. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos núm.

5,641,870 por ejemplo Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Los anticuerpos para su uso según la presente invención incluyen además anticuerpos de cadena sencilla.

Se contemplan modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en la secuencia de un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones, de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se puede preparar para lograr el anticuerpo final, proporcionando que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo, como cambiar el número o la posición de los sitios de glucosilación. Cualquiera de las variaciones y modificaciones descritas anteriormente para los polipéptidos de la presente descripción puede incluirse en anticuerpos para uso de acuerdo con la presente invención.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones de un anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis

se llama "mutagénesis de exploración de alanina" según lo descrito por Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085 (1989)

También se proporcionan métodos para identificar anticuerpos o agentes de unión específicos que se unen a BMP-6 y/o que bloquean HJV.Fc soluble o anticuerpos ejemplares descritos en la presente descripción, y/o que inhiben la actividad de BMP-6. Tales métodos pueden utilizar la composición de BMP-6 humana altamente purificada y bioactiva (ya sea sintetizada químicamente o producida en bacterias o células no mamíferas) proporcionado en la presente descripción.

Los anticuerpos o agentes de unión específicos pueden seleccionarse por afinidad de unión por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse ensayos de cambio de gel, inmunotransferencias, ensayo de competición radiomarcado, cofraccionamiento por cromatografía, coprecipitación, reticulación, ELISA y similares, que se describen en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY.

Para detectar inicialmente anticuerpos o agentes de unión específicos que se unan al epítopo deseado en el antígeno objetivo, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado de rutina como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). También se pueden usar ensayos de unión competitiva de rutina, en los que el anticuerpo desconocido se caracteriza por su capacidad para inhibir la unión del objetivo a un anticuerpo específico del objetivo de la descripción. Se pueden usar el antígeno intacto, fragmentos del mismo tales como el dominio extracelular o epítopos lineales. El mapeo de epítopos se describe en Champe y otros, J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995).

En una variación de un ensayo de unión in vitro, la descripción proporciona un método que comprende (a) poner en contacto a BMP-6 inmovilizada con un anticuerpo candidato o agente de unión específico y (b) detectar la unión del anticuerpo candidato o agente de unión específico a BMP-6. En un ejemplo alternativo, el anticuerpo candidato o agente de unión específico se inmoviliza y se detecta la unión de BMP-6. La inmovilización se lleva a cabo utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica, incluida la unión covalente a un soporte, una perla o una resina cromatográfica, así como la interacción no covalente de alta afinidad, como la unión de anticuerpos o el uso de la unión de estreptavidina/biotina en la que el compuesto inmovilizado incluye una fracción de biotina. La detección de la unión se puede lograr (i) usando un marcador radiactivo en el compuesto que no está inmovilizado, (ii) usando un marcador fluorescente en el compuesto no inmovilizado, (iii) usando un anticuerpo inmunoespecífico para el compuesto no inmovilizado, (iv) usar un marcador en el compuesto no inmovilizado que excita un soporte fluorescente al que está unido el compuesto inmovilizado, así como otras técnicas bien conocidas y practicadas rutinariamente en la técnica.

En algunos ejemplos, los anticuerpos o agentes de unión específicos que inhiben o neutralizan la actividad de BMP-6 humana pueden identificarse poniendo en contacto BMP-6 con el anticuerpo (o agente de unión específico), comparando la actividad de BMP-6 en presencia y ausencia del anticuerpo de prueba (o agente de unión específico), y determinar si la presencia del anticuerpo (o agente de unión específica) disminuye la actividad de BMP-6. Se puede evaluar la actividad biológica de un anticuerpo particular, o un agente de unión específico, o una combinación de anticuerpos o agentes de unión específicos in vivo usando un modelo animal adecuado, que incluye cualquiera de los descritos en la presente descripción.

En modalidades particulares, un anticuerpo para el uso de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo antagonista, que bloquea o inhibe parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido o célula a la que se une específica o preferentemente. En otros ejemplos, un anticuerpo de la presente descripción es un anticuerpo inhibidor del crecimiento, que bloquea o inhibe parcial o totalmente el crecimiento de una célula infectada a la que se une. En otro ejemplo, un anticuerpo de la presente descripción induce apoptosis. En aun otro ejemplo, un anticuerpo de la presente descripción induce o promueve la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o la citotoxicidad dependiente del complemento.

La hemojuvelina (también conocida como RGMc) es un miembro de la familia de proteínas de moléculas guías repulsivas, incluidas RGMa y DRAGON (RGMb), que comparten una identidad de aminoácidos del 50-60 %. (Samad, T.A., y otros 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036). Al igual que hemojuvelina, RGMa (Babitt, J.L. y otros 2005. J. Biol. Chem.280:29820-29827) y DRAGON(Samad, T.A., y otros 2005. J. Biol. Chem. 280:14122-14129) también funciona como correceptores para la vía de señalización de BMP.

Otros inhibidores de la BMP pueden funcionar como terapia potencial para la anemia debido al exceso de hepcidina. Si DRAGON soluble purificada fusionada a la porción Fc de la inmunoglobulina humana Fc (DRAGON.Fc) inhibió la inducción por la BMP de la expresión de hepcidina de una manera similar a HJV.Fc (Babitt, J.L. y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939) fue probado. Las células Hep3B se transfectaron con un indicador de luciferasa de luciérnaga para el promotor de hepcidina y un vector de luciferasa Renilla de control. Las células se estimularon con varios ligandos de la BMP, ya sea solos o en combinación con concentraciones crecientes de DRAGON.Fc. Como se muestra en la Figura 1A, DRAGON.Fc inhibió significativamente la inducción del promotor de hepcidina en respuesta a las BMP-2 y BMP-4, pero fue menos eficaz en la inhibición de las BMP-5, BMP-6 y BMP-7 y no inhibió la Bm P-9. En comparación con HJV.Fc, DRAGON.Fc fue significativamente más potente contra BMP-2 (Figura 1B) y BMP-4 (Figura 1C), pero fue menos potente contra BMP-6 (Figura ID). La DRAGON.Fc también inhibió la expresión del ARNm de la hepcidina endógena en células HepG2 derivadas de hepatoma, donde la expresión basal de la hepcidina depende en parte de los ligandos endógenos BMP-2, BMP-4 y BMP-6 (datos no mostrados; Babitt, J.L. y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939).

Se evaluó si la administración de DRAGON.Fc en ratones afectó la expresión de hepcidina y el metabolismo del hierro. La DRAGON.Fc no tuvo ningún efecto sobre la expresión hepática de hepcidina medida por RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Figura 2A), la expresión de ferroportina esplénica según su medición por inmunotransferencia (Figura 2B), el hierro sérico (Figura 2C), la saturación de transferencia de suero (Figura 2D), el contenido de hierro en el hígado (Figura 2E) o el contenido de hierro en el bazo (Figura 2F) en comparación con los ratones control tratados con simulación. Una dosis equivalente de HJV.Fc redujo la expresión hepática de hepcidina (Figura 2A), aumentó la expresión de ferroportina esplénica (Figura 2B), aumentó el hierro sérico (Figura 2C) y la saturación de transferrina (Figura 2D), aumentó el contenido de hierro en el hígado (Figura 2E) y redujo contenido de hierro en el bazo (Figura 2F) en comparación con los ratones control tratados con simulación. Para confirmar que había suficiente DRAGON.Fc activa en el suero de los ratones inyectados con la proteína DRAGON.Fc para inhibir BMP-2, probamos la capacidad del suero de estos ratones para inhibir la inducción por BMP-2 de la actividad promotora de hepcidina medida por el ensayo de la luciferasa. El suero de los ratones control tratados con simulación inhibió la inducción por BMP-2 de la actividad promotora de hepcidina en aproximadamente un 30 % (Figura 2G, compare las barras 3 a 2), probablemente debido a la presencia de inhibidores de la BMP secretada conocidos como Noggin (23). El suero de los ratones tratados con DRAGON.Fc fue significativamente más potente en comparación con el suero de los ratones control tratados con simulación, inhibiendo la inducción por BMP-2 de la actividad del promotor de hepcidina en más del 70 % (Figura 2G, barra 4).

Dado que DRAGON.Fc no tuvo ningún efecto sobre la expresión de hepcidina y el metabolismo del hierro in vivo a pesar de su mayor potencia in vitro como inhibidor de las BMP-2 y BMP-4 en comparación con HJV.Fc, mientras que DRAGON.Fc era menos potente para inhibir BMP-6 en comparación con HJV.Fc, BMP-6 puede ser un importante regulador endógeno de la expresión de hepcidina y el metabolismo del hierro. Se analizó si la administración de un anticuerpo neutralizante específico para BMP-6 afectó la expresión de hepcidina y el metabolismo del hierro en ratones. Como se muestra en la Figura 3A, el anticuerpo neutralizante para BMP-6 inhibió selectivamente la activación de BMP-6 del indicador de luciferasa para el promotor de hepcidina en células Hep3B, pero no tuvo un efecto significativo sobre las BMP-2, BMP-4, BMP-5 o BMP-9. El anticuerpo para BMP-6 exhibió cierta actividad inhibitoria contra la BMP-7 a concentraciones más altas, pero significativamente menos en comparación con BMP-6 (Figura 3A). Como se muestra en la Figura 3B, los ratones tratados con el anticuerpo para BMP-6 durante tres días redujeron significativamente la expresión hepática de hepcidina en aproximadamente un 50 % en comparación con los ratones control tratados con simulación, medidos por RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Además, los ratones tratados con el anticuerpo para BMP-6 habían aumentado significativamente la saturación de hierro y transferrina en suero en comparación con los controles tratados con simulación (Figura 3C y D).

La importancia de BMP-6 endógena en la regulación de la expresión de hepcidina y el metabolismo del hierro se confirmó mediante pruebas en ratones nulos para la Bmp6 de 8 semanas de edad, que fueron previamente generados por Solloway y otros (Solloway M.J., y otros 1998. Dev Genet. 22:321-39). Estos ratones nulos para la Bmp6 se describió que tuvieron algunos retrasos leves en la formación ósea durante el desarrollo, pero no se compararon otros defectos evidentes con los ratones de control de tipo salvaje, los ratones nulos para la Bmp6 exhibieron una reducción de la expresión hepática de hepcidina en aproximadamente 10 veces según lo medido por RTPCR cuantitativa en tiempo real (Figura 4A), y aumentaron la expresión de ferroportina esplénica en 2.3 veces según lo medido por inmunotransferencia (Figura 4B y C). Adicionalmente, los ratones nulos para la Bmp6 habían aumentado significativamente el hierro sérico con una saturación de transferrina sérica cercana al 100 % (Figs. 4D y E). El contenido de hierro en el hígado aumentó más de 20 veces (Figura 4F y H), mientras que el contenido de hierro en el bazo se redujo en 4 veces (Figura 4G) en los ratones nulos para la Bmp6 en comparación con los controles de tipo salvaje. El grado de sobrecarga de hierro en el hígado de los ratones nulos para la Bmp6 de 8 semanas de edad parecen comparables a los reportados en los ratones Hfe2-I a una edad similar. (Huang, F.W., y otros J. Clin. Invest. 115:2187-2191; Niederkofler, V., Salie, R., Arber, S. 2005. J Clin Invest.

115:2180-6). Así, los ratones nulos para la Bmp6 tienen un fenotipo que se asemeja a la hemocromatosis juvenil debido a la pérdida del correceptor de la BMP hemojuvelina.

A continuación, se probó la capacidad de BMP-6 exógena para regular la expresión de hepcidina y el metabolismo del hierro in vivo. Se inyectó a los ratones una dosis única del ligando de BMP-6 exógena a 250 y 1000 pg/kg de IP. La administración de b MP-6 aumentó significativamente la expresión hepática de hepcidina, medida por RT-PCR cuantitativa en tiempo real. La administración de BMP-6 también causó una reducción dependiente de la dosis en el hierro sérico (Figura 5B) y la saturación de transferrina en suero (Figura 5C).

Estos resultados demuestran que la administración exógena de BMP-6 in vivo regula positivamente la expresión de hepcidina y reduce el hierro sérico, mientras que la eliminación del gen para la Bmp6 o la inhibición selectiva de BMP-6 endógena utilizando un anticuerpo para BMP-6 inhibe la expresión de hepcidina, aumenta el hierro sérico y finalmente produce un fenotipo parecido a la hemocromatosis hereditaria debido a mutaciones en el correceptor de la BMP Hfe2. Estos datos apoyan la importancia de BMP-6 como un importante regulador endógeno de la expresión de hepcidina.

Se ha demostrado que numerosos ligandos de la BMP regulan la hepcidina in vitro, incluidos las BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 y BMP-9 ( Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539; Babitt, J.L., y otros 2007. J Clin Invest.

117:1933-1939; Wang, R.H., y otros 2005. Cell Metab.2:399-409; Truksa, J., y otros 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

103:10289-10293). El ARN mensajero para todos estos ligandos, excepto la b MP-7, se expresa de manera endógena en el hígado humano (Xia Y, y otros 2008. Blood. 1115 195-204). Aunque previamente se ha demostrado que hemojuvelina se une directamente a los ligandos BMP-2 y BMP-4 (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38: 531-539 ), una versión soluble de hemojuvelina, HJV.Fc, inhibe la activación por BMP-6 de la actividad de hepcidina incluso más potente que su capacidad para inhibir la actividad de las BMP-2 y BMP-4 (Babitt, J.L. y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939). Además, la inhibición de BMP-6 endógena por un ARNip o un anticuerpo neutralizante inhibe la inducción de la expresión de hepcidina mediada por hemojuvelina (Xia Y, y otros 2008. Blood. 1115 195-204). Estos datos sugieren que b MP-6 es un ligando para hemojuvelina.

El apoyo adicional para un papel para BMP-6 en el metabolismo del hierro proviene de un estudio reciente que informa que los transcriptos Bmp se aumentaron en respuesta a una dieta enriquecida con hierro y se redujeron en respuesta a una dieta pobre en hierro (Kautz, L. y otros 2008. Blood. 112:1503-9). Los transcriptos de Bmp2 se regularon positivamente ligeramente bajo una sobrecarga de hierro extrema en ese estudio y Bmp4 no fue alterada (Id) Aunque hemojuvelina se une tanto a BMP-2 como a BMP-4, la incapacidad de DRAGON.Fc, que inhibe selectivamente las b Mp-2 y b Mp-4, para inhibir la expresión de hepcidina y modular el equilibrio de hierro sistémico en nuestro estudio sugiere que los ligandos de las BMP-2 y BMP-4 pueden ser menos importantes en este contexto. Las pruebas realizadas por los inventores tampoco encontraron ningún cambio en los niveles de los transcriptos Bmp2 y Bmp4 en el hígado de los ratones nulos para la Bmp6 a pesar de una sobrecarga de hierro significativa (datos no mostrados). Sin embargo, los datos no descartan definitivamente cualquier papel posible para otros ligandos de la BMP, incluidos BMP-2 y BMP-4, en el metabolismo del hierro.

Los datos sugieren claramente que los inhibidores selectivos de BMP-6 pueden ser agentes efectivos para tratar la anemia por inflamación debido al exceso de hepcidina. La falta de cualquier otro fenotipo notable en los ratones nulos para la Bmp6 sugieren que un inhibidor más selectivo puede tolerarse mejor con menos efectos fuera del objetivo. Además, los agonistas similares a BMP-6 pueden ser una estrategia de tratamiento alternativa para controlar los trastornos de sobrecarga de hierro en pacientes resistentes a las terapias actuales. Aunque todavía no se han descrito pacientes humanos con mutaciones en BMP-6, los datos también sugieren que las mutaciones en BMP-6 o las variantes del gen BMP-6 pueden funcionar como otra causa de hemocromatosis hereditaria o un modificador de la penetrancia de la enfermedad.

Sin experimentación adicional, se cree que una persona con experiencia en la técnica pueden, usando la descripción anterior, utilizar la presente invención en toda su extensión. Los ejemplos específicos que aparecen más abajo deben considerarse meramente ilustrativos y no limitativos del resto de la descripción de modo alguno.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Preparación del ADNc

El codón de codificación del ADNc optimizado de DRAGON.Fc fue generado por GenScript Corporation (Piscataway, NJ 08854), basado en la secuencia de la proteína DRAGON humana secuencia arriba del ancla GPI predicha (UniProtKB/Swiss-Prot accession Q6NW40, aminoácidos 1-409) y la secuencia de la Fc IgG1 Fc humana (del vector Signal pIg plus (R&D Systems) y GenBank AF150959).

Ejemplo 2. Producción y purificación de DRAGON.Fc y HJV.Fc.

El ADNc que codifica DRAGON.Fc se transfectó usando 293fectina (Invitrogen) en células Freestyle 293-F (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se cultivaron en medio de expresión GIBCO Freestyle 293 (Invitrogen) agitando a 110 rpm en una incubadora humificada y con 8 % de CO² a 37 °C. Siete días después de la transfección, las células se sedimentaron por centrifugación y DRAGON.Fc se purificó de los medios mediante cromatografía de afinidad con proteína A en un solo paso usando columnas Hi-Trap rProtein A FF (Amersham Biosciences) como se describe en Babbitt, J.L. y otros 2005. J. Biol. Chem.280:29820-29827. La HJV.Fc se produjo como se describe en Babitt, J.L. y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-9. Para determinar la pureza y cuantificar la concentración de proteínas, DRAGON.Fc y HJV.Fc se sometieron a SDS-PAGE reductora seguido de tinción con azul de Coomassie Bio-safe (Bio-Rad), así como a una inmunotrasnferencia con un anticuerpo anti-HJV (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet.

38:531-539), un anticuerpo anti-DRAGON (Samad, T.A., y otros 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036) y el anticuerpo de cabra anti-Fc humano (Jackson ImmunoResearch Laboratories) como se describe. (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539; Samad, T.A., y otros 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036). La concentración de proteína también se cuantificó mediante el ensayo de la proteína albúmina de suero bovino (Pierce).

Ejemplo 3. Producción de BMP-6.

La BMP-6 humana recombinante purificada se preparó como se describió previamente. (Simic, P., y otros 2006. J Biol Chem. 281:25509-21). La BMP-6 liofilizada se disolvió en acetato de sodio 20 mM, solución de manitol al 5 %, a pH 4,0 para inyecciones en animales.

Ejemplo 4. Ensayo de luciferasa.

Los ensayos de indicador de luciferasa para el promotor de la hepcidina en células Hep3B derivadas de hepatoma se llevaron a cabo usando el sistema de ensayo de indicador de luciferasa dual (Promega) como se describió previamente (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539; Babitt, J.L., y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-9) con las siguientes modificaciones. Las células Hep3B transfectadas con el indicador de luciferasa para el promotor de la hepcidina (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539) y el vector de luciferasa Renilla de control (pRL-TK) se privaron de suero en a-MEM con L-glutamina (Invitrogen) suplementado con 1 % de FBS durante 6 horas, seguido de estimulación con 25 ng/ml de BMP-2 amablemente proporcionado por Vicki Rosen, Harvard School of Dental Medicine), BMP-4, BMP-6 o BMP-7, 50 ng/ml de BMP-5 o 5 ng/ml de BMP-9 (R&D Systems) solos o con 0,2-25 pg/ml de DRAGON.Fc, HJV.Fc o el anticuerpo anti-BMP-6 durante 16 h. Se eligieron las concentraciones relativas de ligandos de la BMP para provocar grados similares de actividad luciferasa para el promotor de la hepcidina, como se describió previamente (Babitt, J.L. y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-9).

Ejemplo 5. Animales.

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Hospital General de Massachusetts y el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zagreb. Los ratones 129S6/SvEvTac de ocho semanas de edad (Taconic) fueron alojados en las instalaciones de roedores del Hospital General de Massachusetts y alimentados con la dieta Prolab 5P75 Isopro RMH 3000 con 380 partes por millón de hierro. Los ratones nulos para Bmp6 en un fondo mixto 129Sv/C57 (Solloway MJ, y otros 1998. Dev Genet 22:321-39) amablemente proporcionados por Elizabeth J. Robertson, se alojaron en la Facultad de Medicina de la Universidad de Zagreb y se mantuvieron con una dieta GLP estándar (4RF21, Mucedola, Italia) con 180 mg/kg de hierro.

Para los experimentos con las DRAGON.Fc y HJV.Fc, los ratones 129S6/SvEvTac de 8 semanas de edad (Taconic) recibieron una inyección intraperitoneal de DRAGON.Fc a dosis de 5 o 10 mg/kg, HJV.Fc a dosis de 5 o 7 mg/kg, o un volumen igual de solución salina isotónica tres veces por semana durante tres semanas. Para los experimentos de inyección de anticuerpos BMP-6, los ratones 129S6/SvEvTac de 8 semanas de edad recibieron una inyección intraperitoneal del anticuerpo monoclonal anti-BMP-6 humano (R&D Systems) a 10 mg/kg o solución salina isotónica diariamente durante tres días. Doce horas después de la última inyección, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sangre e hígados para medir los parámetros de hierro y la expresión de hepcidina.

Para los experimentos de inyección de BMP-6, los ratones 129S6/SvEvTac de 8 semanas de edad recibieron una inyección intraperitoneal de BMP-6 a 250 o 1000 mcg/kg o un volumen igual de vehículo solo (acetato de sodio 20 mM, solución de manitol al 5 %, a pH 4,0). Seis horas después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sangre, hígados y bazo para medir los parámetros de hierro y la expresión de hepcidina.

Para los experimentos con los ratones nulos para la Bmp6, cinco ratones nuelos para la Bmp6 de 8 semanas de edad y cinco ratones control de tipo salvaje se sacrificaron y se extrajeron la sangre, hígados y bazo para medir los parámetros de hierro y la expresión de hepcidina.

Ejemplo 6. RT-PCR cuantitativa en tiempo real.

El ARN total se aisló de los hígados de ratón usando el conjunto RNeasy (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cuantificación en tiempo real de los transcriptos ARNm de Rampl relativos a RPL19 se realizó utilizando un RT-PCR cuantitativa en tiempo real de 2 pasos como se describió anteriormente. (Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet.

38:531-539; Babitt, J.L., y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-9; Xia, Y., y otros 2007. J Biol Chem. 282:18129-40). La cuantificación en tiempo real del ARNm de las Bmp2, Bmp4, y Bmp6 en los hígados de los ratones nulos para la Bmp6 versus los de tipo salvaje también se realizaron usando cebadores descritos anteriormente (Kautz, L. y otros 2008. Blood.

112:1503-9).

Ejemplo 7. Inmunotransferencia

Para los ensayos de ferroportina, se prepararon preparaciones de membrana de bazo como se describió previamente. Las concentraciones de proteínas se determinaron por el ensayo BCA (Pierce). Después de la solubilización en tampón Laemmli 1x durante 30 minutos a temperatura ambiente, se resolvieron 20 pg de proteína por muestra mediante SDS-PAGE utilizando geles BisP Tris Novex 4-12 % prefabricados (Invitrogen) y se transfirieron a membranas PDVF (método de transferencia de líquido). Las transferencias se saturaron con leche descremada al 10 % en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía Tween al 0,1 % (TBS-T) y se sondearon durante la noche a 4 °C con un anticuerpo para la ferroportina 2,5 pg/ml (diluido en TBS-T con leche descremada 5 %). Knutson, M.D., y otros 2005. Proc Natl Acad Sci USA. 102:1324-8. Después del lavado con TBS-T, las transferencias se incubaron con una IgG anti-conejo de cabra acoplada a peroxidasa diluida 1:5000 (Sigma) durante 1 hora. La detección se realizó con el método mejorado de quimioluminiscencia ECLB (Perkin Elmer). Las transferencias se desmontaron y se volvieron a sondear para la expresión de p-actina como control de aplicación como se describe en Babitt, J.L. y otros 2006. Nat. Genet. 38:531-539. La quimioluminiscencia se cuantificó utilizando el programa IPLab Spectrum versión 3.9.5 r2 (Scanalytics).

Ejemplo 8. Mediciones de hierro en suero y tejido.

El suero se colectó y analizó para determinar la concentración de hierro y la capacidad de unión al hierro insaturado como se describió previamente. La capacidad de unión total al hierro y la saturación de transferrina se calcularon como se describió previamente. Se realizaron medidas cuantitativas de hierro no hemo en tejido de hígado y bazo como se describió previamente. (VéaseBabitt, J.L. y otros 2007. J Clin Invest. 117:1933-9).

Ejemplo 9. Histología.

Los hígados de los ratones nulos para la Bmp6 y los de tipo salvaje se fijaron en paraformaldehído al 2 % seguido de etanol al 2 % e embebidos en parafina. Las secciones a las 5 pm se desparafinaron en xileno y se hidrataron hasta agua destilada. Las secciones se colocaron después en solución de tinción con volúmenes iguales de ferrocianuro de potasio al 2 % (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) y ácido clorhídrico al 2 %, durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se enjuagaron después en agua destilada, se contratiñeron en Safranina al 0,2 % (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) durante 2 minutos, y se lavaron en ácido acético al 1 %, antes de deshidratarse en alcohol al 95 %, alcohol absoluto, aclarado en xileno, y montado en DPX.

Ejemplo 10. Estadística.

Se usó una prueba t de Student de dos colas con P <0,05 para determinar la significación estadística.

Ejemplo 11. La DRAGON.Fc inhibe selectivamente la inducción por la BMP de la expresión de hepcidina.

Figura 1. Las células Hep3B se transfectaron con un indicador de luciferasa para el promotor de la hepcidina y el vector de luciferasa Renilla control (pRL-TK). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se incubaron en ausencia o en presencia de los ligandos de las BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 o BMP-9, solos o en combinación con 0,2 a 25 pg/ml de DRAGON.Fc purificada (Dra.Fc) o HJV.Fc durante 16 horas como se muestra. Los lisados celulares se analizaron para determinar la actividad de luciferasa y la actividad de luciferasa relativa se calculó como la proporción de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla para controlar la eficacia de la transfección. Los resultados se informan como la media /- sd del porcentaje de disminución en la actividad de luciferasa relativa para las células tratadas con los ligandos de BMP en combinación con DRAGON.Fc o HJV.Fc en comparación con las células tratadas con los ligandos de BMP solos, n = 2 a 4 por grupo. Se muestran valores de P exactos. (1A) Efectos de DRAGON.Fc sobre los ligandos de BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 y BMP-9. (1B-1D). Se muestran las comparaciones directas de DRAGON.Fc y HJV.Fc para inhibir las BMP-2 (1B), BMP-4 (1C) y BMP-6 (1D).

Ejemplo 12. La administración de DRAGON.Fc en ratones no afecta la expresión de hepcidina ni el metabolismo del hierro.

Figura 2. Los ratones 129S6/SvEvTac machos de ocho semanas de edad recibieron una inyección intraperitoneal de DRAGON.Fc purificada soluble (Dra.Fc) a 5 (n = 3) o 10 mg/kg (n = 4) o un volumen igual de solución salina isotónica (Con, n = 7) tres veces por semana durante tres semanas. Como control positivo, otro grupo de ratones recibió una inyección intraperitoneal de una cantidad equivalente de HJV.Fc a 5 (n = 3) o 7 mg/kg (n = 4) o un volumen igual de solución salina isotónica (Con, n = 7) tres veces por semana durante tres semanas. Los resultados para las dosis de DRAGON.Fc y HJV.Fc fueron similares y, por lo tanto, se combinaron en un grupo. (A) El ARN hepático total se aisló y analizó mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real para el ARNm de hepcidina en relación con el ARNm de RPL19 como control interno. (B) Las preparaciones de membrana de bazo se analizaron para la expresión de ferroportina (FPN) mediante inmunotransferencia. Las transferencias se eliminaron y se sondearon con anticuerpo anti-p-actina como control de aplicación. La quimioluminiscencia se cuantificó mediante el programa IPLab Spectrum para la ferroportina en relación con la expresión de p-actina. (C y D) Medición de hierro sérico (C) y saturación de transferencia (D). (E y F) cuantificación del contenido de hierro en el tejido del hígado (E) y el bazo (F). (G) Las células Hep3B se transfectaron con un indicador de luciferasa para el promotor de la hepcidina y pRL-TK como en la Figura 1. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se incubaron en ausencia o en presencia de 1 ng/ml de BMP-2, solo o en combinación con suero agrupado al 20 % de ratones control tratados con simulación (Con, n = 4) o de ratones tratados con DRAGON.Fc (Dra.Fc, n = 4) durante dieciséis horas. La actividad relativa de luciferasa se calculó como en la Figura 1. Los resultados se reportan como la media I- s.d. Se muestran los valores exactos de P.

Ejemplo 13. El anticuerpo para BMP-6 neutralizante específico inhibe la expresión hepática de hepcidina y aumenta la saturación sérica de hierro y transferrina in vivo.

Figura 3. (A) Las células Hep3B se transfectaron con un indicador de luciferasa para el promotor de la hepcidina y control pRL-TK como en la Figura 1. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se incubaron en ausencia o en presencia de los ligandos de BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 o BMP-9, solos o en combinación con 0,2 a 25 pg/ml de anticuerpo neutralizante BMP-6 como se muestra (n = 2 por grupo). La actividad relativa de luciferasa se calculó como en la Figura 1. (BD) Los ratones machos 129S6/SvEvTac de ocho semanas de edad recibieron una inyección intraperitoneal de anticuerpo neutralizante para BMP-6 a 10 mg/kg (a-BMP-6, n = 4) o un volumen igual de solución salina isotónica (Control, n = 4) diariamente por tres días. (B) El ARN hepático total se aisló y analizó mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real para el ARNm de hepcidina en relación con el ARNm de RPL19 como control interno. (C y D) Medición de hierro sérico (C) y saturación de transferrina (D). Los resultados se expresan como la media ±.s.d. Se muestran los valores exactos de P.

Ejemplo 14. Los ratones con Bmp6 nulo exhiben una expresión hepática reducida de hepcidina, una expresión aumentada de ferroportina del bazo, una saturación aumentada de hierro y transferrina en suero, un mayor contenido de hierro en el hígado y un contenido reducido de hierro del bazo.

Figura 4. Los ratones con Bmp6 nulo de ocho semanas de edad (n = 5) y los ratones de control de tipo salvaje emparejados por cepa (TS, n = 5) se analizaron para (A) expresión del ARNm de hepcidina en relación con la expresión de ARNm de RPL19 por RT-PCR cuantitativa en tiempo real, (B y C) expresión de ferroportina en relación con la expresión de p-actina por inmunotransferencia (C) seguido de cuantificación usando el programa IPLab Spectrum (B), (D) hierro en suero, (E) saturación de transferrina en suero, (F) contenido de hierro en el hígado, (G) y contenido de hierro en el bazo como se describe en la Figura 2. (H) Tinción azul de Prusia Perls de hierro en el tejido e hígados de los ratones nulos para la Bmp6 y los control de tipo salvaje (TS). Aumento original x 10 Los resultados se expresan como la media ± s.d. Se muestran los valores exactos de P.

Ejemplo 15. La administración de BMP-6 en ratones aumenta la expresión de ARNm de hepcidina y reduce el hierro sérico.

Figura 5. Los ratones 129S6/SvEvTac machos de ocho semanas de edad recibieron una inyección intraperitoneal de BMP-6 a 250 pg/kg (n = 6) o 1000 pg/kg (n = 7) o un volumen igual de vehículo solo (n = 6). Seis horas después de la inyección, se extrajeron sangre e hígados. (A) Se aisló el ARN hepático total y se analizó mediante RT PCR cuantitativa en tiempo real para el ARNm de hepcidina en relación con el ARNm de RPL19 como control interno. (B y C) Medición de hierro sérico (B) y saturación de transferrina (C). Los resultados se reportaron como la media /- s.d. Se muestran los valores exactos de P.

Ejemplo 16. Preparación de Brucella abortus para inyección intraperitoneal usada en

modelos de ratones con anemia

Brucella abortus (BA) se usa para inducir una anemia inflamatoria cuando se inyecta por vía intraperitoneal (IP) en ratones. La anemia resultante generalmente se establece dentro de los 7 días, caracterizada por una caída de 2-3 g/dL en los niveles de hemoglobina. La anemia generalmente dura 28 días después de la inyección. Después de 28 días, los ratones comienzan a recuperarse y ven que los niveles de hemoglobina comienzan a aumentar. Este protocolo describe cómo 1) lavar y separar las partículas de BA del tampón fenolizado y 2) preparar BA para la administración IP de 5x108 partículas/ratón en un volumen de 200 pl para 10 ratones.

Un concentrado a 5x109 se lava y se prepara de la siguiente manera. Primero, se sacan botellas de 60 ml del refrigerador y se mezclan completamente. Después se transfieren 500 ml de BA a una botella de centrífuga de 500 ml. Después se centrifugan a 10,000 rpm durante 15 minutos utilizando una ultracentrífuga. El sobrenadante se elimina y se resuspende en 100 ml de PBS. La suspensión ahora es de 5x109 partículas/ml. Alicuotar y congelar a -80 °C, típicamente en alícuotas de 1 ml.

Las partículas a 5x108 para inyección se preparan de la siguiente manera (ejemplo para 10 ratones). La concentración inicial debe ser 2,5x109 partículas/ml ya que se inyectarán 200 pl/ratón. Diluir el concentrado 2 veces usando PBS. Por ejemplo, 10 ratones x 0,200 pl = 2 ml 20 % de excedente = 2,2 ml de 2,5x109 partículas/ml necesarios. 1,1 ml de concentrado de BA 1,1 ml de PBS.

Materiales

BA: El antígeno de prueba en anillo para la Brucella abortus (cepa 1119-3) en botellas de 60 ml se puede comprar en el Departamento de Agricultura de Estados Unidos, Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal, Laboratorios de Servicios Veterinarios Nacionales, Ames, Iowa. El antígeno de prueba de anillo de brucelosis contiene una suspensión de células de B. abortus de la cepa 1119-3 muertas y teñidas tampón fenolizado. La concentración de cada botella de 60 ml es aproximadamente de 109 partículas/ml. Antígeno almacenado a 4 °C.

Diluyente: Agente de lavado DPBS (Gibco) en vehículo y control.

Resultados

Los anticuerpos que se unen específicamente a BMP-6 se administran a ratones sujetos a la inyección intraperitoneal de Brucella abortus. Los anticuerpos que disminuyen o eliminan los síntomas de anemia inflamatoria en ratones por inyección intraperitoneal de Brucella abortus son apropiados para usarse para tratar la anemia en mamíferos.

Ejemplo 17. La unión en múltiples sitios de BMP-6 inhibe la expresión hepática de hepcidina y aumenta la saturación de hierro y transferrina en suero.

Se realizó un ensayo de precipitación para determinar si HJV y el anticuerpo para BMP-6 usado en el Ejemplo 13 anterior, se unen a BMP-6 en el mismo sitio.

Se incubó hBMP6 (1 pg) /- hHJV.His (7,1 pg para 5x o 35,5 pg para una relación molar de 25x con respecto a AcM) en 500 pl de solución salina durante la noche a 4 °C. Después se añadieron 2,5 pg de AcM (mAb507, R&D Systems) durante 1 hora, antes de precipitarse con perlas de proteína A. Después, las muestras se procesaron en gel SDS-PAGE al 4-12 %, y se transfirieron a la membrana de PVDF. El análisis de inmunotransferencia que se muestra en la Figura 6, se realizó con un anticuerpo policlonal anti-BMP6 de conejo como anticuerpo primario, y IgG-HRP anti-conejo de cabra como Ac secundario. La transferencia se desarrolló con reactivo ECL, expuesto durante 3 minutos. La banda de la proteína BMP6 está indicada por la flecha y está presente solo en muestras que contienen la BMP6 (carriles 2, 3, 4, 5, 8 y 9) pero no está presente en muestras sin BMP6 (carriles 6, 7 y 10).

Carriles:

1. Véase patrón de peso molecular preteñido con Blue Plus 2

2. Alícuota pre-IP de mezcla de hBMP6 AcM

3. IP de hBMP6 AcM

4. IP de hBMP6 AcM 5x hHJV.His

5. IP de hBMP6 AcM 25x hHJV.His

6. IP de AcM solamente

7. Blanco

8. Alícuota pre-IP de hBMP6 AcM 5x hHJV.His

9. Alícuota pre-IP de hBMP6 AcM 25x hHJV.His

10. Alícuota pre-IP de AcM

Resultados:

El AcM anti-BMP6 (R&D Systems) precipitó hBMP6, como se muestra en la Figura 6, carril 3. La adición del exceso molar de hHJV.His no inhibió la precipitación como se muestra en la Figura 6, carriles 4 y 5. En base a esto, reconocemos que hHJV.His y el anti-BMP6 pueden unirse a diferentes sitios en hBMP6. A continuación, se revisó la transferencia para detectar la presencia de hHJV.his para ver si también precipitaba.

La Figura 7 muestra la misma transferencia que se muestra en la Figura 6, después de la eliminación, y se reprobó con AcM 24C8-C10 (específico para HJV) para visualizar hHJV.His Como se muestra en la Figura 7, el AcM anti-BMP6 (R&D Systems) precipitó la proteína hHJV.His en presencia de hBMP6 (carriles 4 y 5). Por lo tanto, concluimos que hHJV.his y el anti-BMP6 se unen a sitios no superpuestos en hBMP6, un resultado no obvio.

Ejemplo 18. Péptido hBMP-6 para uso en el aumento de anticuerpos a BMP-6.

Se han fabricado anticuerpos contra el péptido TQSQDVARVSSASDY de hBMP6.

Se realizó un ensayo de análisis por inmunotransferencia para demostrar que es posible generar anticuerpos contra un dominio peptídico específico en hBMP6 madura definido como TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO:3).

Los anticuerpos policlonales de cabra anti-hBMP6 (R and D Systems AF507) detectan específicamente la albúmina de suero bovino (BSA) conjugada con el péptido de hBMP6 mediante un residuo de cisteína (BSA-C-TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO:4)) (Figura 8, carril 1).

La competencia con un exceso molar de 500x del péptido de hBMP6 no conjugado eliminó la unión del anticuerpo policlonal a BSA-C-TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO:4) (Figura 8, carril 2).

Esto indica que es posible generar anticuerpos contra un dominio peptídico específico en hBMP6 madura definida como TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO:3).

Referencias

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Se cita cada una de las siguientes referencias de patentes: solicitud PCT núm. PCT1/US08/059753, presentada el 9 de abril de 2008; solicitud de patente en los Estados Unidos núm. 11/884,509, presentada el 16 de agosto de 2007; solicitud de patente núm. 11/195,205, presentada el 2 de agosto de 2005; y solicitud de patente de Estados Unidos núm.

10/419,296, presentada el 17 de abril de 2003.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, será evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las modalidades adjuntas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un anticuerpo neutralizante anti-BMP-6 que inhibe preferentemente a BMP-6 humana sobre BMP-2 o BMP-4, en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de la proteína hemojuvelina humana soluble (HJV) a BMP-6 y en donde el anticuerpo se une a BMP-6 con al menos 5 veces mayor afinidad que la BMP-7, para su uso en el tratamiento de la anemia por inflamación.

2. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína hemojuvelina humana soluble es HJV.Fc.

3. Una composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la administración de la composición reduce la inducción de la expresión de hepcidina mediada por hemojuvelina.

4. Una composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo se administra en una cantidad suficiente para inhibir una interacción entre hemojuvelina y BMP-6.

5. Una composición para su uso como se reivindica en la reivindicación 1 en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.

6. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimerizado, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F(ab')2, un Fd, un anticuerpo de dominio (dAb), un diacuerpo, un maxicuerpo y un dominio variable único de inmunoglobulina.