ES2758882T3 - Envasado y expedición de células madre - Google Patents
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Abstract
Un producto de envasado, que comprende una composición que contiene una pluralidad de células pluripotentes y un medio independiente de CO2, y un recipiente que contiene la composición y que comprende un sustrato, comprendiendo el sustrato un polímero, en el que el recipiente está sellado.
Description
DESCRIPCIÓN
Envasado y expedición de células madre
Campo de la invención
Esta invención se refiere a procedimientos y productos para el envasado y la expedición de diversas células madre.
Antecedentes de la invención
Las células madre son tipos de células caracterizadas por la capacidad de renovarse a sí mismas a través de la división celular mitótica y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células especializadas. Por regla general, las células madre humanas son células precursoras totipotentes o pluripotentes capaces de autorrenovarse y generar una variedad de linajes de células humanas maduras. Esta capacidad sirve como base para la diferenciación y especialización celular necesaria para el desarrollo de órganos y tejidos. Datos recientes demuestran que las células madre se pueden emplear para repoblar muchos, si no todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica. En consecuencia, las células madre tienen el potencial de ser utilizadas en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades y lesiones, incluyendo traumatismos del sistema nervioso, tumores malignos, enfermedades genéticas, hemoglobinopatías e inmunodeficiencia. Se han caracterizado muchos tipos diferentes de células madre de mamíferos. Los ejemplos incluyen células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células madre adultas y otras células madre asignadas o células progenitoras conocidas. Además, la sangre de cordón umbilical es una fuente alternativa conocida de células madre mesenquimales, así como células madre hematopoyéticas y células progenitoras.
Sin embargo, las aplicaciones de estas células a menudo se ven obstaculizadas por problemas logísticos. Por ejemplo, las células madre (incluyendo células de sangre de cordón umbilical), una vez recolectadas, se criopreservan de forma rutinaria en las instalaciones de almacenamiento (como los bancos de células) y, cuando se necesitan, se transportan desde las instalaciones a los hospitales. Este proceso de criopreservación, en el que las células o los tejidos se conservan mediante enfriamiento a bajas temperaturas bajo cero, por regla general -196 °C o 77 K (el punto de ebullición del nitrógeno líquido), implica ciertos riesgos. Por ejemplo, las células conservadas pueden resultar dañadas debido a la congelación durante el acercamiento a bajas temperaturas o al calentamiento a temperatura ambiente. Estos riesgos son particularmente graves para las células madre (incluyendo células de sangre de cordón umbilical), ya que uno de los aspectos más importantes en el trasplante de células madre es la cantidad de células madre viables y sus potenciales de desarrollo en el momento del trasplante. Aparte de este problema, las células madre se expiden de forma rutinaria criopreservadas durante un período de tiempo lo más corto posible. De hecho, las expediciones nocturnas en hielo seco o en un cargador de nitrógeno líquido son el estándar de la industria y se ha de tener especial cuidado para controlar las temperaturas. Sin embargo, esta práctica no elimina los riesgos. Además, resulta extraordinariamente costosa y no es factible para el transporte de larga distancia (por ejemplo transcontinental).
La solicitud de patente CN101298606 describe el uso de una membrana de película de etileno propileno fluorado (FEP) para sellar tubos para el almacenamiento de células madre mesenquimales de cordón umbilical y placenta. Cuando las células están dentro de los tubos, las películas de FEP no entran en contacto directo con las células. Antonemas et al, Cytotherapy, 2006, 8(2): 158-165 y Tsagias et al, Transfusion, 2007, 47(8): 1550-1552, se refieren al efecto de la temperatura en la pérdida de viabilidad de células CD34 durante el almacenamiento y transporte. El recipiente en Antonemas et al Tsagias et al no comprende ningún polímero. Wagner et al, Hematotherapy, 1992, 1(2): 167-173, es un análisis sobre criopreservación y almacenamiento de células madre hematopoyéticas de sangre de cordón umbilical y placenta. La solicitud de patente internacional WO91/10726 muestra el uso de un medio independiente de CO2 para prevenir el deterioro de células causado por un tampón de bicarbonato, pero no menciona células pluripotentes.
Por lo tanto, existe una gran necesidad de procedimientos o métodos más prácticos para la expedición de células madre. La presente invención satisface esta y otras necesidades.
Compendio de la invención
Esta invención se basa, al menos en parte, en un descubrimiento inesperado consistente en que un método para envasar y expedir células madre no requiere criopreservación y no compromete significativamente la viabilidad o el potencial de desarrollo de las células madre.
Por consiguiente, un aspecto de esta invención presenta un producto de envasado que contiene una composición que contiene una pluralidad de células pluripotentes, y un medio independiente de CO2, y un recipiente que comprende un sustrato; el sustrato tiene un polímero, y el recipiente se sella. El polímero puede ser politetrafluoroetileno (PTFE), perfluoroalcoxi (PFA), etileno propileno fluorado (FEP), fluoruro de polivinilideno (PVDF), polietileno, o cloruro de polivinilo (PVC), que tiene propiedades de baja fricción o no adherencia. El polímero también puede consistir en otros polímeros adecuados para productos biológicos, como polietileno de densidad ultrabaja, polietileno de baja densidad (LDPE), polietileno lineal de baja densidad (LLDPE), polietileno de alta densidad (Hd Pe ), polipropileno orientado coaxialmente (COPP), polipropileno orientado biaxialmente (BOPP), tereftalato de polietileno (PET), resinas de poliamida tales como nailon, polímero de etileno y alcohol vinílico (EVOH), y sus versiones metalizadas.
El producto de envasado puede tener cualquier forma adecuada, que incluye, pero no se limita a, una bolsa, una jeringa o un vial para un inyector. En un ejemplo, el producto se carga previamente con células madre para usos clínicos. Las células pluripotentes pueden ser células madre, tales como células madre hematopoyéticas o células madre mesenquimales. La composición puede contener células de sangre periférica, células de sangre de cordón umbilical o células de médula ósea.
La composición puede tener una temperatura dentro del intervalo de 5-40 °C, tal como 5-37 °C, 5-30 °C, 10-30 °C o 15-25 °C. La composición contiene un medio de cultivo que consiste en un medio independiente de CO2 (CIM). En una realización preferida, el medio contiene suero, tal como suero humano, por ejemplo en un 0,5-20% (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 15 y 20%). En otra realización, la composición es una composición farmacéutica y contiene un excipiente farmacéuticamente aceptable. El producto de envasado se sella, por ejemplo para fines de expedición. La composición puede contener al menos 1 x 106 células, por ejemplo 2 x 106, 5 x 106, 10 x 106, 20 x 106, 40 x 106, 80 x 106, 100 x 106 o 200 x 106 células. Las células arriba mencionadas pueden ser CD34+, CD133+, CD34+ CD133+ u otro tipo de células madre.
En una realización, las células arriba mencionadas (por ejemplo, células de sangre periférica, células de sangre de cordón umbilical, o médula ósea) pueden ser aquellas que se han congelado y descongelado, por ejemplo, las obtenidas de un banco de sangre. En ese caso, el medio puede contener ADNasa (por ejemplo, ADNasa humana) en aproximadamente 10-100 U/ml, por ejemplo 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 U/ml. Alternativamente, las células pueden ser recién obtenidas de un donante y no haber sido congeladas y, en este caso, la ADNasa no es necesaria y la composición puede estar libre de ADNasa.
En un segundo aspecto, la invención presenta un método para fabricar el producto de envasado arriba mencionado. El método incluye las etapas consistentes en (a) proporcionar una composición que contiene células pluripotentes y un medio independiente de CO2; (b) proporcionar un recipiente que comprende un sustrato, comprendiendo el sustrato un polímero; (c) disponer la composición dentro del recipiente; y (d) sellar el recipiente.
En un tercer aspecto, la invención presenta un método para la expedición de células madre. El método incluye las etapas consistentes en proporcionar el producto de envasado arriba mencionado y entregar el producto de envasado a un destinatario, tal como un servicio de mensajería, un agente o personal de un hospital receptor. Durante la etapa de entrega, la temperatura está dentro del intervalo de 5-40 °C, tal como 5-37 °C, 5-30 °C, 10-30 °C, 12-28 °C, o 15 25 °C (es decir, temperatura ambiente o TA). Usando el método, las células se pueden entregar a lo largo de 1-8 días, por ejemplo, al menos en 24 horas o en 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 días.
Tras la entrega, las células pluripotentes pueden tener una tasa de recuperación de más de un 40% (por ejemplo 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95%). Además, tras la entrega, las células pluripotentes pueden tener una viabilidad (de acuerdo con la determinación mediante el método de Exclusión de Azul Tripano descrito en la presente memoria) de más de un 50% (por ejemplo 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95%). En una realización, tras la entrega, las células pluripotentes pueden tener más de un 0,5% de células CD34+ (por ejemplo un 0,55%, 0,6%, 0,65%, 0,7%, 0,75%, 0,8%, 0,85%, 0,9%, 0,95%, 1,0%, 1,1%, 1,15%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5.%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% o 2,0%). En otra realización, tras la entrega, las células pluripotentes pueden tener más de un 0,25% de células CD133+ (por ejemplo 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,55%, 0,6%, 0,65%, 0,7%, 0,75%, 0,8%, 0,85%, 0,9%, 0,95%, 1,0%, 1,1%, 1,15%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%; 1,8%, 1,9% o 2,0%). En otra realización más, tras la entrega, las células pluripotentes son capaces de formar más de 2 (por ejemplo 5, 10, 15, 20, 25 o 30) UFC/5 x 104 células. Los valores arriba mencionados se pueden determinar de acuerdo con los métodos descritos más abajo en los ejemplos.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen más abajo en la descripción.
Descripción de los dibujos
La FIGURA 1 es un diagrama de flujo que muestra las operaciones en un procedimiento ejemplar de recolección, procesamiento, expedición y prueba a la entrega de células madre.
Las FIGURAS 2A-E son un conjunto de diagramas que muestran que, cuando se expidieron células madre en tres tipos de bolsas durante un período de 3 días, tanto los tipos de bolsas como las temperaturas de expedición afectaron a la tasa de recuperación (FIGURA 2A), la viabilidad celular (FIGURA 2B), el nivel de población de células CD 34+ (FIGURA 2C), el nivel de población de células CD 133+ (FIGURA 2D) y las UFC (FIGURA 2E) en diferentes grados.
La FIGURA 3 es una tabla y un diagrama que muestran los efectos de IMDM y CIM en la viabilidad celular a TA.
La FIGURA 4 es una tabla y un diagrama que muestran los efectos de los medios IMDM y CIM en la viabilidad celular a TA y 4 °C.
Las FIGURAS 5A-E son un conjunto de diagramas que muestran que, cuando se expidieron células en bolsas TEFLON a TA o 4 °C, los medios CIM y HTS tuvieron diferentes efectos en las tasas de recuperación celular (5A), las viabilidades (5B), los niveles de células CD 34+ (5C), los niveles de células CD 123+ (5D) y las UFC (5E).
La FIGURA 6 es un conjunto de histogramas que muestran el recuento de células CD34+ en sangre periférica.
La FIGURA 7 es una fotografía de tres bolsas probadas: bolsa de polietileno HYCLONE (izquierda), bolsa de cloruro de polivinilo TERUMO (centro) y bolsa TEFLo N (derecha).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al envasado y/o la expedición de células madre o preparaciones que contienen células madre (por ejemplo, sangre de cordón umbilical) en condiciones tales como temperatura ambiente (es decir, 15-25 °C) durante un período prolongado. Las células madre y las preparaciones así envasadas y expedidas tuvieron inesperadamente viabilidades y potenciales de desarrollo satisfactorios para usos clínicos.
En la FIGURA 1 se muestra un ejemplo de un procedimiento de recolección, procesamiento, expedición y análisis de células de sangre de cordón umbilical o un componente celular aislado de sangre de cordón umbilical.
En pocas palabras, las células de sangre de cordón umbilical se pueden recolectar in situ en un hospital u obtener de un banco de sangre de cordón umbilical (tal como el que mantiene STEMCYTE Inc.). Aunque se puede utilizar cualquier procedimiento reconocido en la técnica para la recolección y el almacenamiento, en los ejemplos dados más abajo se describe un procedimiento preferido. En general se debería realizar una prueba de esterilidad para varios marcadores infecciosos. Además se deberían determinar y registrar el número total de células, el número de células CD34+ y el volumen unitario antes de congelarlas para la criopreservación. La sangre recolectada contiene glóbulos rojos (RBC), que tienden a descomponerse durante la congelación y descongelación. En ese caso, una vez lisado, el a Dn de los glóbulos rojos aumenta la viscosidad de las células de sangre de cordón umbilical recolectadas y dificulta el manejo adicional de las células de sangre de cordón umbilical para usos clínicos. Para evitarlo se puede añadir ADNasa a las células recolectadas antes de la criopreservación para descomponer el ADN. Esto puede reducir la adherencia y la aglutinación de células y, por lo tanto, permitir una mejor separación de las células en gradientes osmóticos (por ejemplo FICOLL). Se pueden utilizar varias ADNasa comercialmente disponibles. Los ejemplos incluyen PULMOZYME® comercializado por GENENTECH.
Alternativamente, la sangre de cordón umbilical se puede procesar para retirar los glóbulos rojos de modo que los glóbulos rojos se agoten sustancialmente. Si así se desea, la sangre de cordón umbilical se puede separar en varias unidades útiles (por ejemplo células mononucleares totales (TMN), glóbulos blancos, linfocitos, células CD34+, células CD133+, macrófagos y otras células) mediante gradientes osmóticos (por ejemplo FICOLL) o del modo descrito más abajo en el Ejemplo 1. Además, tal como se ha mencionado más arriba, las células de sangre de cordón umbilical que han de ser expedidas pueden ser recién obtenidas de un donante y no haber sido congeladas. En estas estrategias no se requieren ADNasa durante el envasado y/o la expedición de dichas unidades frescas. Además, el plasma se puede agotar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la solicitud de EE. UU.
20080166324.
Después, las células recolectadas se envasan y preparan para la expedición en una instalación de procesamiento, bien in situ en el hospital, bien fuera de éste, por ejemplo, en el banco de sangre arriba mencionado. Si las células se han criopreservado, se pueden descongelar del modo descrito más abajo en el Ejemplo 1. De nuevo se puede realizar una prueba de esterilidad para varios marcadores infecciosos y se deberían determinar y registrar los números totales de células, los números de células CD34+, las concentraciones y el volumen unitario. Después, las células se disponen en el recipiente arriba descrito para formar un envase para su expedición por un transportista designado.
En la invención se utilizan medios independientes de CO2 (CIM). Estos medios CIM previenen el agotamiento de potasio y dan como resultado una mejor tasa de supervivencia celular. Además, son capaces de mantener la estabilidad del pH a largo plazo sin CO2 atmosférico (0,04%). Los ejemplos de los medios CIM incluyen los comercializados por GIBCO, por ejemplo bajo el n° de cat. 8045. También es preferible el uso de suero humano.
Las células se pueden utilizar para formar una composición farmacéutica que tiene un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como ejemplo no limitativo, una solución salina tamponada normal (por ejemplo, NaCl aproximadamente 135-150 mM) se puede emplear como excipiente farmacéuticamente aceptable. Otros excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Otros excipientes adicionales adecuados para su uso en la administración de las células madre cultivadas y las sales de litio de la presente invención se describen, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Philadelphia, Pa., 18 edición (1995).
Tal como se describe en la presente memoria, el material del recipiente es importante. En general, el material puede ser un polímero de baja fricción o no adherente para las células, y que no sea tóxico para las células ni dañino para los receptores de células madre. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, politetrafluoroetileno (PTFE), perfluoroalcoxi (p fA), etileno propileno fluorado (FEP), fluoruro de polivinilideno (PVDF), polietileno, cloruro de polivinilo (PVC), polietileno de densidad ultrabaja, polietileno de baja densidad (LDPE), polietileno lineal de baja densidad (LLDPE), polietileno de alta densidad (HDPE), polipropileno orientado coaxialmente (COPP), polipropileno orientado biaxialmente (BOPP), tereftalato de polietileno (PET), resinas de poliamida como nailon, polímero de etileno y alcohol vinílico (EVOH), y sus versiones metalizadas. También se pueden utilizar otros polímeros si sus coeficientes de fricción (contra el acero pulido) son comparables o inferiores a los del polímero arriba
mencionado. Los coeficientes de fricción de los polímeros arriba mencionados son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los coeficientes de fricción pueden ser inferiores a 0,5, tal como 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1. En una realización preferida se puede utilizar un recipiente a base de PTFE, PFA, PEP o PVDF comercializado por DUPONT bajo la marca TEFLON, recipientes a base de polietileno de HYCLONE, o recipientes a base de PVC de TERUMO.
El sustrato del recipiente se puede conformar en cualquier forma adecuada para recibir y guardar células. Los ejemplos de formas incluyen, pero no se limitan a, una bolsa, un tubo, una jeringa o un vial para un inyector. En algunas realizaciones, el sustrato se conforma en una forma adecuada para cultivo o para un sitio de trasplante o implantación de células madre en diversos tejidos, tales como el SNC. Los ejemplos incluyen una cinta, una membrana, un hilo, un portaobjetos, una microperla, una micropartícula, una placa de cultivo celular, una placa de múltiples pocillos y un biorreactor, todos los cuales pueden recibir células.
Tal como se describe en la presente memoria, durante la expedición no es necesario mantener las células en el envase a una temperatura más baja, por ejemplo, criopreservadas o entregadas durante la noche. En cambio, las células se pueden expedir dentro de un intervalo de temperatura bastante más amplio, incluyendo la temperatura ambiente, durante un período de tiempo bastante prolongado (por ejemplo 3-8 días). A pesar de estas condiciones menos estrictas, es preferible que el envase sea expedido en un recipiente protegido contra la temperatura y/o sea controlado con una sonda de temperatura para proporcionar a un expedidor o destinatario la información en caso necesario. Gracias a las condiciones menos estrictas se evitan los costes asociados con la expedición de células criopreservadas. Además, dado que el tiempo de expedición puede ser de hasta 5-8 días, es factible la expedición a larga distancia, como transcontinental. Como resultado de ello, los pacientes que se encuentran lejos de una fuente de células madre particulares (por ejemplo, aquellos que tienen un tipo raro de HLA compatible) podrán beneficiarse de un trasplante de células madre.
Al recibir las células de un servicio de mensajería, las células se pueden procesar del modo descrito más abajo en los ejemplos y analizar en cuanto a su idoneidad para el trasplante. Con este fin, para determinar si las células son adecuadas para el trasplante se pueden utilizar los siguientes cuatro criterios.
Recuento de células
Debe haber suficientes células viables para trasplante y análisis. Preferentemente se prefiere al menos el doble del número de células necesarias para el trasplante (por ejemplo, en la médula espinal) para que haya suficientes células sobrantes para analizar las células. Por ejemplo, tal como se describe más abajo en el Ejemplo 2, para los Grupos A, B y C se necesitaron 16, 32 y 64 pl de suspensiones celulares (100.000 células/pl) para el trasplante. En otras palabras, se utilizaron 1,6, 3,2 y 6,4 millones de células. Duplicar esta cantidad requeriría un mínimo de 3,2, 6,4 y 12,8 millones de células mononucleares, respectivamente. Si la expedición contiene menos células, la expedición no debería ser adecuada para el trasplante.
Viabilidad
Se ha de evitar que la preparación contenga demasiadas células muertas. Para este fin, como criterio de viabilidad se puede utilizar un recuento manual mediante el uso de la Exclusión Azul Tripano (TBE). Expresada como un porcentaje, la TBE de la suspensión celular representa las células no teñidas de azul divididas por el número total de células teñidas y no teñidas. Para las células designadas para trasplante, la TBE debe ser de al menos un 70%. En general, procedimientos de lavado tales como los descritos más abajo en los ejemplos eliminan las células muertas y las suspensiones celulares tienen por regla general una TBE mayor de un 90% justo antes del trasplante.
Contaminación
Cualquier evidencia o riesgo de contaminación debería ser notificado. Esto incluye, por ejemplo, la presencia de cualquier fuga de fluidos en las bolsas de expedición, turbidez anormal en las suspensiones celulares, bacterias u hongos visibles bajo el microscopio, o informe de contaminación previa. Tal como se describe en la presente memoria, se debería tener cuidado para excluir las unidades de sangre de cordón umbilical que sean positivas para el antígeno básico de la hepatitis B materna, así como todos los demás agentes infecciosos que normalmente excluirían una unidad de sangre de cordón umbilical del registro bajo el Programa Nacional de Donantes de Médula (NMDP).
Células mononucleares
La preparación final debería tener un 95% o más de células mononucleares. Si el recuento de viabilidad de las células revela más de un 5% de otras células, tales como glóbulos rojos o neutrófilos, las células no se utilizarán para el trasplante. Se ha de tener en cuenta que puede haber algunos glóbulos rojos nucleados inmaduros en la sangre de cordón umbilical.
En una realización preferida, el envase debería rechazarse si se cumple lo siguiente: (i) el perfil de temperatura muestra una temperatura fuera del intervalo permisible designado de 12 °C a 28 °C y (ii) el tiempo total transcurrido desde la descongelación inicial (de la unidad de sangre de cordón umbilical para el procesamiento) no excede los 5 días.
En los procedimientos arriba descritos, se pueden añadir antibióticos a una preparación celular. Por ejemplo, al comienzo del procesamiento de las células se puede añadir gentamicina para reducir el riesgo de contaminación durante el procesamiento y la expedición. La gentamicina puede suprimir el crecimiento bacteriano aunque múltiples pruebas de carga de medios anteriores hayan dictado que no se estaba introduciendo contaminación. En el hospital receptor, las células se lavan y se suspenden de nuevo dos veces, diluyendo sensiblemente el antibiótico que puede estar presente en la suspensión celular. Se ha comprobado que, durante un período de seis meses, los cultivos de las soluciones de lavado no produjeron ningún cultivo positivo en más de 15 unidades de sangre de cordón umbilical procesada. Del mismo modo, ninguno de los cultivos de UFC de 2 semanas mostró crecimiento bacteriano.
En los procedimientos arriba descritos, las células madre de sangre de cordón umbilical se pueden tratar adicionalmente para expandir el grupo de células madre, es decir, la expansión in vitro, utilizando métodos tales como los descritos en las solicitudes de EE. UU. 20100189696, 20100323920, 20080227197 y 20080166324. La expresión "expansión in vitro" se refiere al cultivo de células madre en el laboratorio. Dichas células se pueden extraer de un mamífero y se pueden generar cantidades adicionales de células mediante cultivo en el entorno apropiado, por ejemplo en medios que contienen una sal de litio. Si es posible se establecen líneas celulares estables para permitir la propagación continua de las células.
Para poner en práctica esta invención se pueden utilizar diversas células madre. Los ejemplos de células madre incluyen células de sangre de cordón umbilical, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células madre de médula ósea, células madre de sangre periférica, sangre placentaria y otras células madre que se pueden diferenciar en células funcionales, por ejemplo células neuronales o gliales. La expresión "célula madre" se refiere a cualquier célula que sea capaz de diferenciarse en varios tipos de células finales, diferenciadas y especializadas. Las células madre proceden de todas las capas germinales (es decir, ectodermo, mesodermo y endodermo). Las fuentes típicas de células madre incluyen embriones, médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical, sangre placentaria, tejido muscular y tejido adiposo.
En la presente invención, las células madre son pluripotentes. Las células pluripotentes son por regla general células capaces de diferenciarse en varios tipos de células diferenciadas finales diferentes. Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden dar lugar a células del sistema nervioso, piel, hígado, riñón, sangre, músculo, hueso, etc. Los ejemplos de células madre pluripotentes incluyen, pero no se limitan a, células madre de sangre de cordón umbilical, células madre neurales, células madre hematopoyéticas, células madre derivadas de tejido adiposo, células madre mesenquimales, células madre derivadas de la placenta, células madre derivadas de dientes exfoliados y células madre del folículo piloso. En cambio, las células madre multipotentes o adultas suelen dar lugar a tipos limitados de células. La expresión célula madre, tal como se utiliza en la presente memoria, incluye células progenitoras a no ser que se indique lo contrario. Las células madre unipotentes pueden producir solo un tipo de célula, pero tienen la propiedad de autorrenovación que las distingue de las células no madre. Estas células madre pueden tener su origen en diversos sistemas de tejidos u órganos, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, nervio, músculo, piel, intestino, hueso, riñón, hígado, páncreas, timo y similares. De acuerdo con la presente invención, la célula madre se puede derivar de un tejido u órgano adulto o neonatal.
Las células descritas en esta invención pueden ser sustancialmente puras. La expresión "sustancialmente puro", cuando se usa con referencia a células madre o células derivadas de éstas (por ejemplo, células diferenciadas), significa que las células especificadas constituyen una parte sustancial o la mayoría de las células en la preparación (es decir, más de un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%). Por ejemplo, una población de células sustancialmente purificada constituye al menos aproximadamente un 70% de las células de una preparación, por regla general aproximadamente un 80% de las células de una preparación, y en particular al menos aproximadamente un 90% de las células de una preparación (por ejemplo 95%, 97%, 99% o 100%).
En una realización preferida se utilizan células de sangre de cordón umbilical. Estas células se pueden obtener como se describe más abajo en la sección de ejemplos o mediante métodos conocidos en la técnica y después analizar mediante técnicas estándar. Para confirmar el potencial de diferenciación de las células, se las puede inducir a formar, por ejemplo, varias unidades formadoras de colonias, mediante métodos conocidos en la técnica. Las células así confirmadas se pueden propagar más en un medio de cultivo no diferenciador durante más de 10, 20, 50 o 100 duplicaciones de población sin indicaciones de diferenciación espontánea, senescencia, cambios morfológicos, aumento de la tasa de crecimiento o cambios en la capacidad de diferenciarse en neuronas. Las células se pueden guardar mediante métodos estándar antes de su uso.
Los términos "proliferación" y "expansión", tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria con referencia a células, se refieren a un aumento de la cantidad de células del mismo tipo por división. El término "diferenciación" se refiere a un proceso de desarrollo mediante el cual las células se especializan para una función particular, por ejemplo, en el que las células adquieren una o más características morfológicas y/o funciones diferentes de las del tipo de célula inicial. El término "diferenciación" incluye tanto la asignación de linaje como los procesos de diferenciación terminal. La diferenciación se puede evaluar, por ejemplo, controlando la presencia o ausencia de marcadores de linaje, usando inmunohistoquímica u otros procedimientos conocidos por un trabajador experto en la técnica. Las células de progenie diferenciadas derivadas de células progenitoras pueden estar relacionadas, pero no necesariamente, con la misma capa germinal o tejido que el tejido de procedencia de las células madre. Por ejemplo, las células progenitoras neurales y las células progenitoras musculares se pueden diferenciar en linajes de células
hematopoyéticas. Las expresiones "asignación de linaje" y "especificación", tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, se refieren al proceso que experimenta una célula madre en el que la célula madre da lugar a una célula progenitora asignada a la formación de una gama limitada particular de tipos de células diferenciadas. Las células progenitoras asignadas a menudo son capaces de autorrenovación o de división celular. La expresión "diferenciación terminal" se refiere a la diferenciación final de una célula en una célula madura, completamente diferenciada. Por ejemplo, las células progenitoras hematopoyéticas y las células progenitoras musculares se pueden diferenciar en linajes de células neurales o gliales, cuya diferenciación terminal conduce a neuronas o células gliales maduras. Por lo general, la diferenciación terminal se asocia con la retirada del ciclo celular y el cese de la proliferación.
La expresión "célula progenitora", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una célula que está asignada a un linaje celular particular y que da lugar a células de este linaje mediante una serie de divisiones celulares. Los ejemplos de células progenitoras incluyen células precursoras para el linaje neuronal, hepático, nefrogénico, adipogénico, osteoblástico, osteoclástico, alveolar, cardíaco, intestinal o endotelial.
El término "cultivo" se refiere al mantenimiento de células madre en condiciones en las que pueden proliferar y evitar la senescencia. Por ejemplo, en la presente invención, las células madre se cultivan en medios que contienen una sal de litio y opcionalmente uno o más factores de crecimiento, es decir, un cóctel de factores de crecimiento.
La expresión "sangre de cordón umbilical" se refiere a una fuente de células madre pluripotentes y multipotentes obtenidas de la sangre de los cordones umbilicales que quedan después del nacimiento. Los ejemplos de células madre que se encuentran en la sangre de cordón umbilical incluyen, pero no se limitan a, células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas y células progenitoras. Las células madre mesenquimales y las células progenitoras se pueden diferenciar por regla general en células nerviosas, células estromales de médula, condrocitos, osteoblastos, adipocitos, miocitos, tenocitos y células de ligamentos. Por regla general, las células madre hematopoyéticas pueden dar lugar a células de los linajes linfoides, mieloides y eritroides. A continuación se proporciona una descripción detallada de métodos para recolectar y procesar la sangre de cordón umbilical.
La expresión "unidad de sangre de cordón umbilical" se refiere a un volumen de sangre de cordón umbilical que se recolecta de un solo donante. Por regla general, en los métodos de la presente invención se utiliza una unidad de sangre de cordón umbilical simple, pero también se pueden utilizar unidades de sangre de cordón umbilical múltiple, por ejemplo, unidades de sangre de cordón umbilical doble, para aumentar el número de células madre.
Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "el plasma está sustancialmente agotado" y "plasma agotado" se refieren a unidades de sangre de cordón umbilical procesadas en las que se ha retirado un volumen de plasma mayor de aproximadamente un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. Por ejemplo, el plasma se puede agotar sustancialmente centrifugando la sangre de cordón umbilical y separando la fracción celular de la fracción plasmática. Por regla general, el volumen de plasma restante después del agotamiento sustancial es de aproximadamente un 0% a aproximadamente un 30% en volumen, preferiblemente de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 30% en volumen.
Las expresiones "glóbulos rojos no agotados" y "los glóbulos rojos no están agotados", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a unidades de sangre de cordón umbilical procesadas en las que ha retirado un volumen de glóbulos rojos menor de un 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%. Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "los glóbulos rojos están sustancialmente agotados" y "glóbulos rojos agotados" se refieren a unidades de sangre de cordón umbilical procesadas en las que ha retirado un volumen de glóbulos rojos mayor de aproximadamente un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%.
"Células nucleadas" se refiere a células que tienen un núcleo, es decir, un orgánulo que comprende ADN cromosómico. Las células nucleadas incluyen, por ejemplo, glóbulos blancos y células madre. Las "células no nucleadas" incluyen, por ejemplo, glóbulos rojos adultos.
Ejemplo 1
Este ejemplo describe un procedimiento ejemplar para la descongelación controlada de unidades de sangre de cordón umbilical congeladas (UCBU) STEMCYTE en una sola bolsa y el envasado.
I. Preparación de lavado de Hsa/Gentran
Los siguientes artículos se dispusieron en un Armario de Seguridad Biológica (BSC): 4 toallitas con alcohol, 1 juego de bolsas de descongelación (Unidad de Paquete de Transferencia), 1 bolsa de Gentran 40, 1 filtro de jeringa, 1 (2) x 50 ml HAS, 1 aguja, 1 juego de transferencia de plasma y 1 tijera. Dentro del armario de Seguridad Biológica, el puerto de inyección exterior de la bolsa n° 1 del juego de bolsas de descongelación se pinchó con un extremo de un juego de transferencia de plasma. Si la unidad era menor o igual a 100 ml de volumen criopreservado, se utilizó un juego de transferencia de 300 ml; si la unidad era mayor de 100 ml, se utilizó un juego de transferencia de 600 ml. Después se retiró la tapa y se limpió el diafragma de goma de un vial de 50 ml de HSA con una toallita con alcohol isopropílico (IPA) al 70%. El diafragma de HSA se pinchó con la segunda punta del juego de transferencia de plasma arriba mencionado. Una aguja hipodérmica, con filtro de jeringa conectado, se insertó en el diafragma de HSA al lado de la punta de plasma, para ventilar el vial. El vial de h Sa se levantó por encima de la bolsa n° 1 para permitir que todo el
contenido del vial (50 ml) fluyera dentro de la bolsa de transferencia. Para UCBU con volúmenes > 100 ml, se debían drenar 2 viales (100 ml) en una bolsa de transferencia de 600 ml. El tubo entre el vial de HSA y la bolsa n° 1 se selló con calor cerca del puerto de inyección de la bolsa n° 1 antes de desechar el vial de HSA y el tubo en exceso. El puerto de inyección restante de la bolsa n° 1 se pinchó con un nuevo juego de transferencia de plasma antes de cerrar la abrazadera de rodillo sobre el tubo del juego de transferencia. El puerto de inyección de la bolsa de Gentran 40 se pinchó con el otro extremo del juego de transferencia de plasma.
Después, la bolsa n° 1 se colocó en la balanza electrónica y se taró a cero. El tubo de transferencia se abrió para permitir que 190 g de Gentran 40 entraran en la bolsa n° 1 para una UCBU con un volumen criopreservado de no más de 100 ml. Cuando el volumen de UCBU fue superior a 100 ml, se transfirieron 380 g de Gentran 40 al interior de la bolsa n° 1. El tubo de transferencia de plasma se selló con calor cerca de la bolsa n° 1 y el tubo se desechó. El volumen final en la bolsa n° 1 debía ser de aproximadamente 240 ml (o 480 ml) con concentraciones finales de un 5% para HAS y un 8% para Gentran. Después se registraron la fecha, la hora y las iniciales del operador de la preparación de lavado en la etiqueta de la bolsa n° 1. El juego de bolsas de descongelación se dispuso en un refrigerador a 2 °C - 8 °C durante aproximadamente 30 minutos antes de descongelar la UCBU. La solución de lavado se debía utilizar en un plazo de 1 día desde la preparación.
Se descongeló una bolsa de UCBC congeladas de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación en la sección II:
II. Descongelación/lavado de UCBU congeladas
II.1 Colocar los siguientes elementos en un BSC antes del procedimiento: 6 (12) x tubos de centrífuga de 50 ml; compresas frías grandes y pequeñas enfriadas bruscamente; 5 (10) x ampollas de 2,5 ml de ADNasa; 1.000 ml de tampón de lavado de ADNasa; 100 ml de MgCh 250 mM; toallitas que no sueltan partículas; agua WFI; 4 (8) x aguja de calibre 25; pipetas de 25 ml; acoplador de sitio de muestreo; 2 x jeringa de 10 ml; 2 x jeringa de 1 ml; toallitas IPA; una balanza electrónica; pinzas hemostáticas; y un sellador de tubos.
2. Calcular volúmenes de ADNasa y solución de MgCh 250 mM requeridos de acuerdo con las siguientes fórmulas y colocar las soluciones así preparadas en jeringas de tamaño apropiado con filtros de disco de 0,2 pm y agujas para inyección.
Volumen de ADNasa requerido para el lavado de HSA/GENTRAN = volumen de lavado de HSA/Gentran 25;
volumen de ADNasa requerido para inyección en bolsa de UCBU = volumen de bolsa de UCBU 25;
volumen de MgCh 250 mM requerido para el lavado de HSA/GENTRAN = volumen de HSA/Gentran 100;
volumen de MgCh 250 mM requerido para inyección en bolsa de UCBU = volumen de bolsa de UCBU 100.
11.3 Enfriar previamente de forma brusca la centrífuga refrigerada a 2 °C - 8 °C.
Ajustes de la centrífuga:
Ajustar la velocidad de la centrífuga a 1.860 g (3.080 rpm en rotor de aluminio SORVALL HS-4 con soporte de 4 plazas).
Poner el freno en una posición media (ajustar la desaceleración a 7 para HERAEUS SUPERFUGE).
11.4 A partir de la documentación adjunta registrar el volumen criopreservado.
11.5 Calcular 1,5 volúmenes de la Unidad de Sangre de Cordón Umbilical (UCBU). Volumen de 1,5 UCBU = Volumen de UCBU (Etapa 4 más arriba) x 1,5.
11.6 Verificar que las soluciones de lavado de HSA/Gentran y de lavado de ADNasa se hayan refrigerado al menos 30 minutos y no más de 1 día.
11.7 Obtener una bolsa de plástico de aproximadamente 20,32 cm x 25,40 cm (8" x 10"). Colocar en posición vertical dentro de un cubo con hielo o compresas de hielo congeladas. Llenar con agua hasta aproximadamente 15,24-20,32 cm (6-8 pulgadas).
11.8 Colocar el recipiente de hielo en el lugar del procedimiento de descongelación.
Retirar el juego de bolsas de descongelación del refrigerador al BSC. Insertar un acoplador del sitio de muestreo en uno de los 2 puertos e inyectar el reactivo de ADNasa y el MgCh necesarios para el lavado de HSA/Gentran. Mezclar y disponer entre compresas frías.
Obtener la UCBU congelada del almacenamiento. Verificar que la etiqueta de identificación de UCBU en el casete coincida con la documentación requerida y registrar la identificación de UCBU.
Abrir cuidadosamente el casete congelado y verificar que el número de identificación de UCBU en la bolsa de UCBU coincida con la identificación en el casete y la documentación requerida.
Introducir la bolsa de UCBU del casete en una bolsa estéril de 20,32 cm x 25,40 cm (8" x 10"). Disponer la bolsa que contiene UCBU en el baño de hielo. NO sumergir los puertos. Utilizar un temporizador y cronometrar durante 5 minutos.
Después de 5 minutos, verificar la UCBU para ver si está descongelada. Si no lo está, continuar con las revisiones periódicas hasta que esté "medio derretida". Retirar la bolsa de congelación de UCBU descongelada del baño de hielo, secar con toallitas sin pelusa.
NOTA: Comenzar a seguir las etapas para lavado inmediatamente.
Colocar la UCBU entre compresas frías dentro del BSC, con los puertos expuestos. Agitar suavemente la UCBU durante 10 segundos para mezclar.
Retirar el tapón de 1 de los 2 puertos en la bolsa e UCBU. Pinchar el puerto con un acoplador de sitio de muestreo.
Inmediatamente después de pinchar el puerto de UCBU, inyectar reactivo de ADNasa y MgCh para inyección en la bolsa de UCBU (véase más arriba la etapa 2). Mezclar suavemente.
Pinchar el puerto restante con una punta unida al juego de bolsas de descongelación.
NOTA: Verificar para asegurarse de que todas las abrazaderas de rodillo en los tubos del juego de descongelación estén cerradas antes de pinchar las UCBU.
Colocar una compresa fría sobre una báscula. Colocar la bolsa de UCBU sobre la compresa fría. Colocar otra compresa fría encima de la bolsa de UCBU y tarar la báscula.
NOTA: Las UCBU y todos los materiales se han de mantener a 2 °C - 8 °C.
Poner una pinza hemostática en el tubo de la bolsa n° 1. Abrir la abrazadera de rodillo en el tubo a la bolsa de UCBU. Quitar la pinza hemostática de la bolsa n° 1 para transferir solución de lavado 1,5 veces el volumen de UCBU (véase más arriba la etapa 5). Registrar el volumen añadido.
Al finalizar la transferencia de lavado, poner una abrazadera en el tubo.
NOTA: Esta etapa de dilución inicial se ha de completar lo más rápido posible después de la descongelación.
Mezclar a fondo la solución de lavado y la sangre de cordón umbilical en la bolsa de UCBU girando la bolsa manualmente durante aproximadamente 10 segundos, manteniendo la UCBU entre compresas frías.
Retirar el clip de aluminio, o abrir la abrazadera de rodillo si está provista, en el tubo cerca de la bolsa n° 2 y permitir que la mezcla de lavado/sangre fluya al interior de la bolsa n° 2. Retirar la mayor cantidad posible de la mezcla de la bolsa de UCBU. Mantener la bolsa n° 2 entre las compresas frías durante esta etapa.
Cerrar el tubo cerca de la bolsa n° 2 una vez completada la transferencia.
Colocar la bolsa de UCBU de nuevo entre las compresas frías que descansan sobre la plataforma de la báscula y tarar la báscula a cero.
Quitar la pinza hemostática cerca de la bolsa n° 1 y permitir que una solución de lavado adicional igual al volumen criopreservado de UCBU fluya al interior de la bolsa de UCBU. Una vez completo este proceso, volver a poner la pinza en el tubo cerca de la bolsa n° 1. Registrar el volumen añadido.
Cerrar la abrazadera de rodillo junto a la bolsa de UCBU que ha sido lavada.
Mezclar a fondo la mezcla de lavado/sangre en la bolsa de UCBU. Retirar la mayor cantidad posible de sangre de cordón umbilical de las áreas de puerto/cola de la bolsa de UCBU.
11.29 Quitar la abrazadera del tubo junto a la bolsa n° 2 y permitir que la mezcla de lavado/sangre fluya al interior de la bolsa n° 2. Enrollar la bolsa de UCBU para asegurarse de que se extraiga la mayor cantidad posible de sangre de la bolsa de UCBU.
NOTA: En este punto, la UCBU descongelada se ha diluido con una solución de lavado igual a 2,5 veces el volumen de la UCBU criopreservada (1,5Xinicial 1,0X adicional).
11.30 Poner una abrazadera en el tubo al lado de la bolsa n° 2 y cerrar la abrazadera de rodillo al lado de la bolsa de UCBU.
11.31 Sellar el tubo con calor inmediatamente, por debajo de la conexión en "Y" que conduce a las dos puntas, pero por encima de la abrazadera al lado de la bolsa n° 2. Una vez sellado, se puede quitar el tubo sobrante.
11.32 Pinchar de forma aséptica un puerto de la bolsa n° 2 con un nuevo juego de transferencia de plasma y transferir el contenido de la bolsa n° 2 a tubos de 50 ml mantenidos en hielo.
11.33 Equilibrar la cubeta de centrífuga que contiene los tubos de 50 ml.
11.34 Centrifugar los tubos de 50 ml a aproximadamente 1.860 g (3.080 rpm en rotor de aluminio Sorvall HS-4 con soporte de 4 plazas) durante 15 minutos a una temperatura de 0 °C a 8 °C. El freno de la centrífuga debería estar ajustado en un ajuste medio.
11.35 Al finalizar la centrifugación, retirar con cuidado los tubos de 50 ml centrifugados. No alterar el sedimento.
11.36 En el armario de seguridad, abrir los tubos centrifugados y aspirar la mayor parte del lavado dejando aproximadamente 5 ml en el fondo del tubo, sin alterar el sedimento.
11.37 Añadir 5 ml de tampón de lavado y mezclar suavemente utilizando una pipeta de 10 ml.
11.38 Llenar el tubo de 50 ml con tampón de lavado hasta la marca de 50 ml.
11.39 Centrifugar los tubos de 50 ml a aproximadamente 1.860 g (3.080 rpm en rotor de aluminio Sorvall HS-4 con soporte de 4 plazas) durante 10 minutos a una temperatura de 0 °C a 8 °C. El freno de la centrífuga debería estar ajustado en un ajuste medio.
11.40 Al finalizar la centrifugación, retirar con cuidado los tubos de 50 ml.
11.41 En el armario de seguridad, abrir los tubos centrifugados y aspirar la mayor parte del lavado, dejando aproximadamente 5 ml en el fondo del tubo, sin alterar el sedimento.
11.42 Suspender de nuevo el sedimento celular en cada tubo golpeando los tubos contra la superficie del BSC.
Después, las UCBC descongeladas se sometieron bien a un procedimiento de lisado sanguíneo tal como se describe más abajo en la sección III, bien a un aislamiento de células mononucleares (MNC) tal como se describe más abajo en la sección IV.
III. Procedimiento de lisado de glóbulos rojos
111.1 Colocar los siguientes elementos en el BSC
6 (12) x tubos de centrífuga de 50 ml
160 ml de agua USP (temperatura ambiente)
160 ml 2x solución salina
111.2 Añadir 22,5 ml de agua USP a temperatura ambiente a cada tubo de 50 ml. Iniciar un temporizador de 30 segundos al final de la adición de agua. Mezclar con pipeta.
111.3 Inmediatamente después de 30 segundos, añadir 22,5 ml de solución de NaCl al 1,8% (2X) al tubo de 50 ml y mezclar suavemente mediante inversión. Completar las etapas III.2 y III.3 individualmente con cada tubo.
111.4 Dividir cada tubo en 2 tubos y llenar cada uno con tampón de lavado hasta 50 ml.
111.5 Centrifugar los tubos de 50 ml a aproximadamente 830 g (2.050 rpm en rotor de aluminio Sorvall HS-4 con soporte de 4 plazas) durante 10 minutos a una temperatura de 0 °C a 8 °C. El freno de la centrífuga debería estar ajustado en un ajuste medio.
111.6 Al finalizar la centrifugación, retirar con cuidado de la cubeta los tubos de 50 ml centrifugados. 111.7 En el armario de seguridad, abrir los tubos centrifugados y aspirar la mayor parte del lavado dejando aproximadamente 1 ml en el fondo del tubo sin alterar el sedimento.
IN.8 Añadir 5 ml de tampón de lavado y suspender de nuevo el sedimento celular suavemente utilizando una pipeta de 10 ml.
IM.9 Lavar los tubos con 10 ml adicionales de tampón de lavado de ADNasa y agrupar las células en un tubo.
III.10 Llevar el volumen de células agrupadas a 30 ml con tampón de lavado de ADNasa.
NOTA: Comenzar el calentamiento de la centrífuga ajustando la temperatura a 25 °C y la velocidad a 7.000 rpm. Pulsar inicio (por regla general tarda ~ 30').
IV. Aislamiento de MNC de sangre de cordón umbilical humano
IV.1 Colocar los siguientes elementos en el BSC: 6 x tubos de centrífuga de 50 ml; 90 ml de LSM; 10 x pipetas de 25 ml; 2 x pipetas de 10 ml; 1 tubo cónico (225 ml).
IV.2 Diluir las células de sangre de cordón umbilical con tampón de lavado de ADNasa 1:5 en un tubo cónico estéril de 225 ml. Mezclar suavemente la sangre diluida mediante agitación con movimientos circulares.
IV.3 Colocar seis (6) tubos de centrífuga de 50 ml en el BSC.
IV.4 Utilizando una pipeta estéril de 25 ml, dispensar 30 ml de sangre diluida en cada tubo de 50 ml. IV.5 Llenar una pipeta estéril de 10 ml con 13 ml de LSM. Deslizar lentamente la pipeta hacia abajo por el costado del tubo hasta el fondo. Sostener el tubo en ángulo mientras se pipetea suavemente el LSM por debajo del nivel de la sangre. Retirar lentamente la pipeta contra la pared del tubo para evitar la mezcla de capas.
NOTA: No expulsar todo el LSM de la pipeta - las burbujas de aire alterarán la capa de LSM IV.6 Cerrar los tubos y transferir con cuidado a la centrífuga.
IV.7 Poner los tubos en el rotor de cubeta oscilante a aproximadamente 467 g (1.540 rpm en rotor de aluminio Sorvall HS-4 con soporte de 4 plazas, o 1.600 rpm para rotor S4 180) durante 32 minutos a una temperatura de 24 °C, con freno desactivado (ajustar la desaceleración a 2 para Heraeus Superfuge). Verificar que la centrífuga haya alcanzado la velocidad especificada.
IV.8 Colocar seis (6) tubos de 50 ml estériles en gradilla en el BSC.
11.9 Después de la centrifugación, retirar los tubos de la centrífuga con cuidado para evitar que se mezclen las capas y colocar en gradilla con tubos nuevos.
11.10 Configurar la(s) centrífuga(s) para enfriamiento: ajustar la temperatura a 10 °C y el temporizador a 10 minutos. Poner en marcha la centrífuga pulsando la tecla de inicio.
11.11 Abrir los tubos centrifugados en el BSC. Aspirar el sobrenadante, dejando expuesta la capa mononuclear. Recolectar únicamente la capa mononuclear (capa leucocitaria) utilizando una pipeta de 10 ml estéril. Transferir a un nuevo tubo y llenar cada tubo con tampón de lavado de ADNasa hasta 45 ml.
IV.12 Colocar los tubos en el (los) rotor(es) de la cubeta oscilante y ajustar la centrífuga a aproximadamente 467 g (1.540 rpm en rotor de aluminio SORVALL HS-4 con soporte de 4 plazas) durante 10 minutos a una temperatura de 10 °C, con el freno en ajuste medio (ajustar la desaceleración a 7 para HERAEUS SUPERFUGE).
IV.13 Después de la centrifugación, en el armario de seguridad, abrir los tubos y aspirar la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente 1 ml, sin alterar el sedimento.
IV.14 Etiquetar un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml: “MNC agrupadas”, “V90195”, “Etapa IV.14”, el número de lote de esta Dirección de Fabricación, la fecha actual y las iniciales del operador.
IV.15 Suspender de nuevo los sedimentos celulares con 5 ml de tampón de lavado de ADNasa suavemente, utilizando una pipeta estéril de 10 ml. Agrupar las células en un solo tubo de centrífuga. IV.16 Después de agrupar las células, lavar los 6 tubos con un volumen de 4 ml de tampón de lavado de ADNasa para asegurar que se recojan todas las células mononucleares (MNC).
IV.17 Transferir el lavado al tubo etiquetado "MNC agrupadas" y añadir tampón de lavado de ADNasa hasta 50 ml.
IV.18 Colocar el tubo en el rotor de cubeta oscilante con el tubo de compensación, ajustar la centrífuga a aproximadamente 467 g (1.540 rpm en rotor de aluminio SORVALl HS-4 con soporte de 4 plazas) durante 10 minutos a una temperatura de 10 °C, con el freno activado.
IV.19 Después de la centrifugación, en el armario de seguridad, abrir los tubos y aspirar la mayor parte del lavado, dejando aproximadamente 1 ml en el tubo, sin alterar el sedimento celular.
IV.20 Suspender de nuevo el sedimento con 5 ml de tampón de lavado, utilizando una pipeta estéril de 10 ml.
IV.21 Llevar el volumen del tubo de MNC agrupadas a 20 ml, mezclar bien.
11.22 Transferir una muestra de volumen adecuado de las MNC bien mezcladas a un tubo, para viabilidad y recuento de células MNC. Registrar la cantidad de la muestra.
IV.23 Determinar la densidad celular y el % de viabilidad.
IV.24 Calcular el número total de células de acuerdo con la siguiente fórmula:
Densidad de células viables de IV.23 x (20 - cantidad muestreada de IV.22).
IV.25 Si el número total de células viables es menor de 20 millones, contactar con un coordinador clínico.
Los lotes rechazados se retienen en espera del resultado de la investigación.
Las células preparadas de acuerdo con los procedimientos arriba descritos se transfirieron después a varias bolsas de transporte de acuerdo con los procedimientos descritos más abajo en la sección V. Se utilizaron los siguientes tres tipos de bolsas de muestras con accesorios de cierre Luer: bolsas de muestras HYCLONE PE (THERMO SCIENTIFIC), bolsas TEFLON® (DU PONT) y bolsas de transferencia TERUFKEX® (TERUMO, PVC).
Las bolsas de muestras HYCLONE PE (por ejemplo HYCLONE 60 ml a 20 L 2-D Labtainer con dos puertos finales, como SH3b6500 y SH3b6500) se construyeron con película CX3-9, una película de fundición 0,23 mm (9 milipulgadas), tres capas, en la que la capa de película exterior consistía en un elastómero de poliéster coextruido con una capa de contacto de polietileno de densidad ultrabaja. Las bolsas de transferencia TERUFKEX® (por ejemplo 1BB*T015CB70, 1BB*T030CB71, 1BB*T060CB71, 1BB*T080BB71, 1BB*T100BB71 y 1BB*T200BB71) estaban basadas en PVC. Las bolsas TEFLON® estaban basadas en PFA (por ejemplo, bolsas PFA de 0,05 mm (2,0 milipulgadas) o bolsas TEFLON® de 0,13 mm (5,0 milipulgadas)).
V. Transferencia de células a bolsas de transporte
V.1 Colocar los siguientes elementos en el BSC: 2 x tubos de centrífuga de 50 ml; 100 ml de medio de transporte (V90199: CIM más 10% HS, GlutaMAX 2 mM, galactosa y 100 U/ml de gentamicina); y 2 x pipetas de 5 ml; bolsas de transporte estériles.
V.2 Calcular el volumen de medio de transporte requerido: Volumen de medio de transporte requerido (ml) = Número total de células de la Etapa IV.24 x 10-6.
V.3 Colocar el tubo de MNC etiquetado en el rotor de la cubeta oscilante con el tubo de compensación, ajustar la centrífuga a aproximadamente 467 g (1.040 rpm en rotor de aluminio Sorvall HS-4 con soporte de 4 plazas) durante 10 minutos a una temperatura de 10 °C y freno en ajuste medio (ajustar la desaceleración a 7 para Heraeus Superfuge).
V.4 Después de la centrifugación, en el armario de seguridad, abrir los tubos y aspirar el sobrenadante al contenedor de residuos.
V.5 Suspender de nuevo el sedimento con 5 ml de medio de transporte utilizando una pipeta estéril de 10 ml.
V.6 Añadir medio para ajustar la concentración celular a 1 x 106/ml.
V.7 Calcular el volumen de gentamicina requerido.
Volumen de gentamicina requerido (ml) = Volumen total de células de la Etapa V.2. 500.
V.8 Retirar 3 ml de células para retenciones y transferir a un tubo cónico de 15 ml.
V.9 Añadir gentamicina (volumen calculado en V.7) a la suspensión celular y mezclar suavemente.
V.10 Transferir la suspensión celular a una bolsa de transporte.
V.11 Etiquetar la bolsa como "MNC PREPARADAS A PARTIR DE UCBU CONGELADA", un número de identificación, "V90195", "Etapa V.11", el número de lote de esta Dirección de Fabricación, el recuento total de células, la fecha actual y las iniciales del operador.
V.12 Envasar las células de acuerdo con SOP400.014 para el transporte. Incluir con la unidad de células un Certificado con especificaciones del producto: número de unidad, número de lote, recuento de células, información de viabilidad y esterilidad. Adjuntar copia de COA a este documento.
V.13 Se utilizan 0,5 ml de retención celular para inocular un tubo de caldo de TSB y 0,5 ml para inocular un tubo de caldo de tioglicolato.
V.14 Se ha de guardar 1,0 ml de muestra a 2-8 °C como una muestra de retención durante un período de una semana. Etiquetar el tubo con “2-8 °C Muestra de Retención de MNC PREPARADAS A PARTIR DE UCBU CONGELADA”, un número de identificación, “Etapa V.14”, el número de lote, el recuento total de células, la fecha y las iniciales del operador.
V.15 Se ha de guardar 1,0 ml de muestra a -80 °C como una muestra de retención. Etiquetar el tubo con “-80 °C. Muestra de Retención de MNC PREPARADAS A PARTIR DE UCBU CONGELADAS”, un número de identificación, “Etapa V.15”, el número de lote, el recuento total de células, la fecha y las iniciales del operador.
Las células se envasaron en varios medios diferentes del modo arriba descrito y después se transportaron a varias temperaturas diferentes a un sitio diferente a lo largo de un período de 1-8 días.
Ejemplo 2
En este ejemplo se realizaron ensayos para examinar células de sangre de cordón umbilical envasadas y expedidas del modo descrito más arriba en el Ejemplo 1.
A la llegada del envase de las bolsas por transporte aéreo, el envase se guardó en su recipiente en un lugar seguro hasta su procesamiento y el controlador de temperatura se mantuvo con el envase. Antes del procesamiento, el envase se inspeccionó y documentó en cuanto a cualquier cambio en el envase. También se anotó el tiempo total transcurrido desde la descongelación inicial de la unidad original de sangre para el procesamiento.
Desembalaje
El recipiente de expedición se abrió; el envase que contenía bolsas de hUCB-MNC se sacó y se mantuvo a la temperatura designada (TA). Las bolsas se inspeccionaron en busca de daños o fugas en un armario de seguridad biológica (BSC). En el armario de seguridad biológica, las bolsas se agitaron suavemente para mezclar las células. Utilizando un par de guantes estériles y una jeringa con cierre Luer, el contenido de cada bolsa se transfirió a un tubo de centrífuga estéril de 30, 50 o 100 ml etiquetado como hUCB-MNC. Los tubos se centrifugaron a 400 x g durante 10 minutos a la temperatura designada (TA). El sobrenadante del tubo de centrífuga se aspiró utilizando la pipeta de 10 ml sin alterar el sedimento, y se guardó para la prueba de esterilidad (Muestra 1). El sedimento celular se suspendió de nuevo con 1 ml de albúmina de suero normal (NSA) al 1% en solución salina fisiológica de calidad clínica para formar una suspensión celular inicial para inyección.
Ensayo de viabilidad y recuento de células de la UCB-MNC
1. Ensayo de viabilidad
En el armario de seguridad se preparó una dilución de células 1:10 utilizando una punta de 100 pl para dispensar y mezclar 50 pl de la suspensión celular en un tubo de 12 x 75 mm que contenía 450 pl de solución salina normal complementada con NSA al 1%. Utilizando una punta de 100 pl se pipetearon 40 pl de suspensión celular diluida a 10 pl de solución de azul de tripano en un tubo EPPENDORF de 0,5 ml. Después de mezclar pipeteando varias veces, la suspensión de células teñidas con azul de tripano se cargó en un hemocitómetro de recuento Improved Neubauer para recontar el número de células muertas teñidas de azul y células vivas sin teñir en cuatro cuadrados grandes, cada uno de 1 mm x 1 mm, que incluían 16 cuadrados pequeños. Los glóbulos rojos anucleados se podían distinguir fácilmente de las células nucleadas viables no teñidas, ya que parecían espejos reflectantes bajo el microscopio al enfocar el objetivo hacia arriba y hacia abajo. Después se calculó el porcentaje de células viables dividiendo el número de células no teñidas entre el número total de células teñidas de color azulado y células no teñidas.
2. Recuento manual
En el armario de seguridad se preparó una dilución de células 1:100 transfiriendo 50 |jl de la suspensión celular inicial arriba mencionada a 450 j l de solución de ácido acético al 3% con azul de metileno en un tubo de 12 x 75 mm. La suspensión celular resultante se cargó en las dos cámaras superior e inferior de un hemocitómetro de recuento Improved Neubauer para recontar el número de células teñidas de color azulado en ocho cuadrados grandes, cada uno de 1 mm x 1 mm, tanto en la cámara superior como en la inferior. El número de células se calculó dividiendo el recuento total entre ocho y multiplicando por 100 (factor de dilución) y 10.000.
La lisis de glóbulos rojos mediante ácido acético al 3% fue instantánea, mientras que las células nucleadas permanecieron intactas durante al menos 40 minutos. Las células nucleadas se tiñeron de azul en ácido acético al 3% complementado con azul de metileno. La concentración celular se ajustó de manera óptima para producir una densidad celular de aproximadamente 50 en cada cuadrado de 1 mm x 1 mm. Los recuentos derivados de las cámaras superior (N1) e inferior (N2) eran comparables de manera que N2 debería estar dentro del intervalo de N1 ± VN-i. De lo contrario, el procedimiento de llenado y el recuento se repitieron para evitar la falta de aleatoriedad y la imprecisión causada por la imperfección técnica y la incompetencia.
3. Recuento automatizado
La suspensión celular también se recontó con el analizador hematológico Beckman Coulter ACT Diff para comprobar de nuevo la precisión del recuento manual.
Preparación celular
Después de registrar la viabilidad celular y los recuentos celulares, los tubos que contenían las células se centrifugaron a 400 x g durante 5 minutos. El sobrenadante de cada tubo se aspiró sin alterar el sedimento celular, y las células se suspendieron de nuevo y se ajustaron a una concentración de 1 x 105 células viables/jl con solución salina fisiológica de calidad clínica complementada con NSA al 1%. Los 100 j l de la suspensión celular resultante se transfirieron a dos tubos EPPENDORF de 0,25 ml estériles (uno para reserva). La suspensión celular se utilizó después para las siguientes dosis de inyección:
a. 4 j l x 4 inyecciones (16 x 105 células viables)
b. 8 j l x 4 inyecciones (32 x 105 células viables)
c. 16 j l x 4 inyecciones (64 x 105 células viables).
En pocas palabras, los tubos EPPENDORF con células se transportaron a un quirófano. En el quirófano, la suspensión celular se cargó en jeringas Hamilton y agujas de mariposa con solución salina fisiológica de calidad clínica complementada con NSA al 1%. Más específicamente, un volumen apropiado de suspensión celular se cargó en jeringas Hamilton de 50 j l o 100 j l a través de agujas de mariposa antes de administrarlo a tres grupos de individuos, A, B y C. Para el Grupo A o B se utilizó una jeringa Hamilton de 50 j l para aspirar 20 j l (5 j l x 4) para el Grupo A o 40 j l (10 j l x 4) para el Grupo B. Para el Grupo C se utilizaron jeringas Hamilton de 100 j l para aspirar 80 jl. Se realizaron cuatro inyecciones en las zonas de entrada de la raíz dorsal de la médula espinal de cada individuo.
El tubo de reserva arriba mencionado se centrifugó a 400 x g durante 5 minutos. El sobrenadante resultante se aspiró y se guardó para la prueba de esterilidad (Muestra 2). Después, las células se sometieron a análisis de linaje mediante inmunofluorescencia directa (véase más abajo) y ensayo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
Pruebas de esterilidad
Tanto la Muestra 1 como la Muestra 2 arriba mencionadas (Etapa 38) se sometieron a una prueba de esterilidad inmediatamente después del protocolo estándar del hospital o el protocolo manual apropiado.
Ensayo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
En primer lugar se recontó el número de células viables y después se cultivaron para determinar el número de UFC formadas durante un período de 2 semanas. En pocas palabras, las células se pipetearon en medio de metilcelulosa previamente mezclado (Methocult H4230; St Em CELL TECHNOLOGIES Inc.) complementado con factores de crecimiento, rhG-CSF y rhIL-3 en IMDM (Medio Dulbecco Modificado por Iscove). Las concentraciones finales ajustadas fueron metilcelulosa al 1%, suero fetal bovino al 30%, albúmina de suero bovino al 1%, 2-mercaptoetanol 10-4 M, 1-glutamina 2 mM, 10 ng/ml de rhIL-3 y 500 ng/ml de rhG-CSF. Las células se agitaron suavemente con vórtice y 1,1 ml de las suspensiones celulares (5 x 104 células) se dispusieron por duplicado en placas de cultivo estériles de 35 mm x 10 mm (FISHER SCIENTIFIC). Después de cultivar las células a 37 °C en incubadora de CO2 al 5% saturada de agua, se recontaron manualmente las colonias UFC-GM consistentes en 20 o más células con un microscopio invertido estándar. Los cultivos contaminados con bacterias u hongos, si los había, se anotaron.
Análisis de inmunofluorescencia directa de hUCB-MNC
Lo siguiente es un análisis opcional llevado a cabo cuando había suficientes células sobrantes. Dependiendo de la práctica institucional, la técnica analítica podía ser de plataforma doble o simple, con o sin lavado. Para enumerar las células CD34+ y las células CD133+ se utilizó la estrategia de compuerta ISHAGE.
Los reactivos requeridos para este análisis incluían anticuerpos monoclonales para antígenos de superficie celular humana (IgG-PE, CD45-FITC, CD34-PE y CD133-PE), 7-amino-actinomicina (7-AAD; eBioScience o equivalente), Reactivos de Lisado de Sangre Total ImmunoPrep (BECKMAN COULTER), tampón de lavado (PBS complementado con azida sódica al 0,1%), tampón de tinción (PBS complementado con azida sódica al 0,1% y NSA al 1%), solución de paraformaldehído al 1% y tubos de ensayo de poliestireno de 12 x 75 mm. A continuación se muestra el procedimiento de tinción.
1. Ajustar el recuento de células nucleadas a < 1 x 107/ml con NSA al 1%, en caso necesario, de la suspensión celular preparada en la Etapa 7 del ensayo de viabilidad.
2. Etiquetar los tubos de 12 x 75 mm, dispensar anticuerpos y células de la siguiente manera:
Anticuerpo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
CD45-FITC (pl) 20 20 20
CD34-PE (pl) - 20
CD133-PE (pl) - - 10
IgG1-PE (pl) 20 - -
7-AAD (pl) 5 5 5
Muestra de células (pl) 100 100 100
3. Agitar suavemente con vórtice y dejar reposar en la oscuridad a 4 °C durante 20 minutos o a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4. Lisar, neutralizar y fijar la tinción utilizando el Dispensador Q-Prep y los Reactivos de Lisado de Sangre Total ImmunoPrep. Dejar reposar en la oscuridad durante al menos 1 hora antes de la adquisición de señales, o
4a. añadir 500 pl de tampón de lisis de glóbulos rojos a la suspensión celular, mezclar suavemente e incubar en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lavar dos veces con 2 ml de tampón de lavado frío. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 2-8 °C. Eliminar el sobrenadante, suspender de nuevo las células en 0,5 ml de solución de paraformaldehído al 1%.
5. Adquirir no menos de 75.000 eventos CD45+ y un mínimo de 100 eventos CD34+ utilizando el protocolo ISHAGE tal como se muestra en la Figura X1.
En la FIGURA 6 se muestra un ejemplo de enumeración de CD34 utilizando un protocolo que sigue las pautas de ISHAGE. Las células se marcaron utilizando un protocolo sin lavado con CD45-FITC y CD34-PE. Antes del análisis se añadió 7-AAD. La Región A se estableció en un citograma de SS frente a CD45 para delinear los leucocitos. La región B se estableció para encerrar las células CD34 ve. La región C para incluir las células CD45 débilmente positivas se estableció en una gráfica de puntos de SS frente a CD45 con compuerta (A Y B). La región D se dibujó alrededor de los linfocitos en el gráfico de SS frente a CD45 y se utilizó para establecer una compuerta en un gráfico de SS frente a FS. La región E se trazó para incluir todos los linfocitos y esta región se copió en otro diagrama de dispersión con compuerta (A Y B Y C), (E2). La región F se trazó en una gráfica de puntos de SS frente a 7-AAD para excluir las células positivas para 7-AAD (muertas) y todas las gráficas anteriores con compuerta en esta región. Después, las células en la región E2 se registraron como las células CD34+.
1. Tipos de bolsa y temperaturas
Como se muestra en la FIGURA 2, cuando las células madre se expidieron en los tres tipos de bolsas arriba mencionados a lo largo de un período de 3 días, tanto los tipos de bolsas como las temperaturas de expedición influyeron en la tasa de recuperación (FIGURA 2A), la viabilidad celular (FIGURA 2B), el nivel de población de células CD 34+ (FIGURA 2C), el nivel de población de células CD 133+ (FIGURA 2D) y UFC (FIGURA 1E) en diferentes grados.
Por ejemplo, mientras que las tasas de recuperación y las viabilidades celulares fueron comparables entre los tres tipos de bolsas (véanse las FIGURAS 2A y B), los niveles de la población de células CD 34+ y la población de células CD 133+ fueron mayores en los casos expedidos con bolsas de muestra HYCLONE PE y Te Ru MO (PVC) (FIGURAS
2C y D). En cambio, las células expedidas con bolsas TEFLON® tenían una UFC significativamente más alta que la de las células expedidas con bolsas de muestra HYCLONE PE, que tenían una UFC significativamente mayor que la de las células expedidas con bolsas TERUMO (PVC) (FIGURA 2 E).
Con respecto a las temperaturas de expedición, las células expedidas a TA muestran tendencias de tasas de recuperación o viabilidades de células más bajas (FIGURAS 2A y B). Sin embargo, era inesperado que las células expedidas a TA tuvieran niveles más altos de población de células CD 34+ y de población de células CD 133+, independientemente del tipo de bolsa (FIGURAS 2C y D). Además, también fue inesperado que las células expedidas en las bolsas TEFLON® a TA tuvieran el nivel más alto de UFC y que, de manera similar, las células expedidas en las bolsas de muestra HYCLONE PE a TA también tuvieran un nivel alto de UFC.
Los anteriores resultados demostraron que la expedición de células madre a TA tenía inesperadamente niveles más altos de UFC o niveles más altos de población de células CD 34+ y población de células CD 133+.
2. Medios
También se examinaron los efectos de los medios de expedición. Se comprobó que las células expedidas en el medio CIM tenían una mayor viabilidad celular que las expedidas en IMDM (FIGURAS 3 y 4) después de aproximadamente 2 días. En particular, después de 5 días, las células en el medio CIM todavía tenían una viabilidad de aproximadamente un 74%.
Después, el medio CIM se comparó con un medio HYPOTHERMOSOL® (HTS) (BIOLIFE SOLUTIONS). Se comprobó que, en general, las células expedidas en el medio CIM en bolsas TEFLON a temperatura ambiente o 4 °C tenían tasas de recuperación celular, viabilidades y niveles de células CD 34+ comparables o superiores a los del medio HTS (FIGURAS 5A-C). Resultó inesperado que las células expedidas en el medio CIM a TA tuvieran los valores más altos para los niveles de células CD 34+, los niveles de células CD 133+, y UFC. También se comprobó que un 1% de NSA mejoraba las viabilidades celulares tanto en HTS como en CIM, independientemente del tipo de bolsa. Véanse más abajo las tablas 1-3.
Tabla 1
Bolsa de expedición: Teflon
Tabla 2
Tabla 3
Las células se suspenden en NSA al 1%
En resumen se comprobó que, entre las bolsas utilizadas para la prueba de los procedimientos, la bolsa TEFLON dio los mejores recuentos de UFC. Sin embargo, dado que no había ninguna fuente GMP de estas bolsas y las bolsas TEFLON requerían una manipulación abierta de los contenidos, se ha de tener especial cuidado para evitar el riesgo de contaminación. Las bolsas HYCLONE tenían mayor viabilidad, recuentos totales de nucleados y recuentos de UFC que las bolsas TERUMO. Por lo tanto, las bolsas HYCLONE se eligieron para otras expediciones y experimentos.
Se realizaron ensayos de adición para examinar las temperaturas en las células expedidas en CIM y en las bolsas TEFLON. Los datos se muestran a continuación.
manas en bolsa TEFLON, incubación a 4 °C/medio independiente de CO2
manas en bolsa TEFLON, incubación a 4 °C/medio independiente de CO2
manas en bolsa TEFLON, incubación a TA/medio independiente de CO2
manas en bolsa TEFLON, incubación a 37 °C/medio independiente de CO2 Unidad P.22
Tal como se muestra en las tablas anteriores, las células mononucleares humanas en la incubación en bolsas TEFLON a TA en un medio independiente de CO2 tenían los niveles relativos más altos para células CD34+ o células CD133+ durante el período de 8 días.
Claims (14)
1. Un producto de envasado, que comprende
una composición que contiene una pluralidad de células pluripotentes y un medio independiente de CO2 , y un recipiente que contiene la composición y que comprende un sustrato, comprendiendo el sustrato un polímero, en el que el recipiente está sellado.
2. El producto de envasado según la reivindicación 1, en el que el polímero es politetrafluoroetileno (PTFE), perfluoroalcoxi (PFA), etileno propileno fluorado (FEP), fluoruro de polivinilideno (PVDF), polietileno o cloruro de polivinilo (PVC).
3. El producto de envasado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el recipiente es una bolsa, un tubo, una jeringa o un vial para un inyector.
4. El producto de envasado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que las células pluripotentes son células madre, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, células madre embrionarias, células CD34+, o células CD133+.
5. El producto de envasado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la composición contiene células de sangre periférica, células de sangre de cordón umbilical, células de médula ósea o células de sangre placentaria.
6. El producto de envasado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la composición tiene una temperatura dentro del intervalo de 5-30 °C.
7. El producto de envasado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el medio contiene suero o suero humano.
8. Un método para fabricar el producto de envasado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que consiste en
proporcionar una composición que contiene células pluripotentes;
proporcionar un recipiente que comprende un sustrato, comprendiendo el sustrato un polímero;
colocar la composición en el recipiente; y
sellar el recipiente.
9. Un método para expedir células pluripotentes, que comprende proporcionar el producto de envasado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y entregar el producto de envasado a una temperatura dentro del intervalo de 5-40 °C a un destinatario.
10. El método según la reivindicación 9, en el que la etapa de entrega se realiza a una temperatura dentro del intervalo de 10-30 °C.
11. El método según la reivindicación 10, en el que la etapa de entrega se realiza a una temperatura dentro del intervalo de 15-25 °C.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que la etapa de entrega se lleva a cabo durante al menos 1 día.
13. El método según la reivindicación 12, en el que la etapa de entrega se lleva a cabo durante al menos 3 días.
14. El método según la reivindicación 13, en el que la etapa de entrega se lleva a cabo durante al menos 5 días.
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