ES2751403T3 - Métodos de reprogramación nuclear de células - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para potenciar la reprogramación nuclear de una célula somática de mamífero, comprendiendo el método: poner en contacto una población de células somáticas de mamífero con (a) una dosis eficaz de una composición de aluminio, en donde la composición de aluminio se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio, y (b) un cóctel de factores de reprogramación, durante un periodo de tiempo suficiente para reprogramar las células somáticas de mamífero en un tipo celular de interés deseado, en donde el tipo celular de interés deseado es una célula madre pluripotente inducida (CMPi).

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de reprogramación nuclear de células

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos de reprogramación de células madre.

Antecedentes de la invención

La transformación de células diferenciadas para inducir células madre pluripotentes (CMPi) ha revolucionado la biología de las células madre al proporcionar una fuente más tratable de células pluripotentes para la terapia regenerativa. La obtención de CMPi a partir de numerosas fuentes de células normales y enfermedad ha permitido la generación de células madre para la eventual utilización en terapia celular y medicina regenerativa.

Los estudios seminales de Yamanaka y colaboradores han revelado que la expresión ectópica de determinados factores transcripcionales podría inducir pluripotencialidad en las células somáticas. Estas células madre pluripotentes inducidas se autorrenuevan y se diferencian en una amplia diversidad de tipos celulares, convirtiéndolas en una opción atractiva para las terapias de enfermedades y de medicina regenerativa. Se han utilizado para modelar con éxito enfermedades humanas y presentan un gran potencial para la utilización en el cribado de fármacos y la terapia celular. Además, las CMPi generadas a partir de células enfermas podrían servir como herramientas útiles para estudiar mecanismos de enfermedad y potenciales terapias. Sin embargo, queda mucho por entender sobre los mecanismos subyacentes de la reprogramación de las células somáticas en CMPi y hay inquietud respecto a las potenciales aplicaciones clínicas en ausencia de un conocimiento de los mecanismos.

El conjunto original de factores (RF) para reprogramar la pluripotencialidad incluye Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4, Lin8 y Nanog. Oct3/4 y Sox2 son factores de transcripción que mantienen la pluripotencialidad en las células madre embrionarias (ME), mientras que Klf4 y c-Myc son factores de transcripción que se cree refuerzan la eficiencia de generación de CMPi. El factor de transcripción c-Myc se cree modifica la estructura de la cromatina, permitiendo que Oct3/4 y Sox2 accedan más eficientemente a genes necesarios para la reprogramación, mientras que Klf4 potencia la activación de determinados genes por parte de Oct3/4 y Sox. Nanog, al igual que Oct3/4 y Sox, es un factor de transcripción que mantiene la pluripotencialidad en células ME, mientras que Lin28 es una proteína de unión a ARNm que se cree influye sobre la traducción o estabilidad de ARNm específicos durante la diferenciación. También se ha demostrado que la expresión retrovírica de Oct3/4 y Sox, junto con la coadministración de ácido valproico, un desestabilizador de la cromatina e inhibidor de la histona desacetilasa, resulta suficiente para reprogramar los fibroblastos en CMPi.

Se ha demostrado que varias clases de vectores inducen pluripotencialidad al sobreexpresar las combinaciones génicas requeridas. Los primeros vectores se basaban en retrovirus y trasposones que se integraban en el ADN para la reprogramación nuclear. Aunque efectivos, surge inherentemente inquietud sobre su potencial tumorigenicidad, mediante mutagénesis por inserción o mediante reexpresión de factores de reprogramación oncogénicos. Aunque se han utilizado enfoques de administración génica de sitio Cre-LoxP o de trasposón PiggyBac para extraer ADN foráneo del genoma del anfitrión tras la administración génica, ninguna de estas estrategias elimina el riesgo de mutagénesis debido a que dejan una pequeña inserción de ADN foráneo residual.

Como alteARNtiva a la modificación genética, se ha demostrado que el ARNm, los plásmidos episómicos de ADN y las proteínas que penetran en las células (PPC) resultan eficaces como factores de reprogramación.

Seiga Ohmine et al. describen un método para generar células CMPi a partir de células progenitoras hematopoyéticas o a partir de células mononucleares de sangre periférica bajo condiciones de buenas prácticas de fabricación (BPF), y muestran que las células CMPi obtenidas pueden diferenciarse en las tres capas germinales (ver la fig. 1). Lui Te et al. describen un método para generar células CMPi a partir de líquido amniótico humano mediante la sobreexpresión de oct4 en estas células (véase la fig. 1). Huangfu Danwei et al. Describen un método para generar células madre pluripotentes y muestra que la adición de inhibidores de HDAC, tales como el ácido valproico potencia en gran medida la eficiencia de reprogramación (véase la fig. 1). El documento n° WO2012/11248 describe un método para potenciar la eficiencia de reprogramación de una célula mediante la expresión de factores de pluripotencialidad en la célula y la sobreexpresión de PARP-1. El documento n° WO2010/033920 describe un método para potenciar la eficiencia de reprogramación mediante la utilización de un agente que inhibe la metilación de las histonas. En el documento n° WO2012/079278 se describe un método que permite la preparación mejorada (5 a 60 veces) de células CMPi con elevada eficiencia de producción mediante la adición de sal de litio. El documento n° WO2008/008923 describe una composición que comprende un péptido un ARNip, y que puede comprender además hidróxido de aluminio. La composición, al inyectarla en ratones SCID que portan melanomas cutáneos humanos, reduce el peso y el tamaño de los tumores de melanoma en 57% en comparación con animales de control correspondientes que recibían inyecciones intravenosas de PBS (véase la Tabla 3).

Estos vectores no integrantes, aunque funcionales, con frecuencia resultan en eficiencias de reprogramación reducidas, como resultado de su mecanismo de acción específico o debido a la compleja naturaleza de su práctica. Debido a que los enfoques basados en moléculas no integrantes y/o pequeñas para la generación o trans­ diferenciación de CMPi en un tipo celular somático diferente son vectores clínicamente relevantes, se vuelve importante para incrementar la robustez, eficiencia y facilidad de utilización de dichos métodos. La presente invención resuelve estas cuestiones.

Compendio de la invención

Un aspecto de la invención se refiere a un método de reprogramación nuclear de una célula somática de mamífero, comprendiendo el método: poner en contacto una población de células somáticas de mamífero con (a) una dosis eficaz de moléculas de patrón molecular asociado al daño (DAMP, por sus siglas en inglés), en el que DAMP es una composición de aluminio seleccionada del grupo que consiste en hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio, y (b) un cóctel de factores de reprogramación, durante un periodo de tiempo suficiente para reprogramar las células somáticas de mamífero en tipo celular de interés deseado, en el que el tipo celular deseado es una célula madre pluripotente inducida (CMPi).

En una realización de dicho aspecto de la invención, el DAMP es una composición de aluminio. En otra realización, la composición de aluminio y cóctel de factores de reprogramación no integrantes se proporcionan simultáneamente. En otra realización, la composición de aluminio y el cóctel de factores de reprogramación no integrantes se proporcionan secuencialmente. En una realización todavía adicional, la composición de aluminio se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio. En todavía otra realización, la composición de aluminio es hidróxido de aluminio. En todavía otra realización, el hidróxido de aluminio está presente a una concentración de aproximadamente o por lo menos 40 a 80 microgramos/ml. En todavía una realización adicional, la dosis eficaz del hidróxido de aluminio es de por lo menos o aproximadamente 30 a 60 microgramos/ml. En todavía otra realización, la composición de aluminio es fosfato de aluminio. En todavía otra realización, la composición de aluminio es sulfato de aluminio.

En una realización adicional, las células somáticas humanas son células humanas. En una realización todavía adicional, el cóctel de factores de reprogramación comprende la utilización de Oct4, Sox2, Lin28 y Nanog, y las células se reprograman para que sean pluripotentes. En todavía otra realización, el cóctel de factores de reprogramación comprende la utilización de Oct4, Sox2, c-Myc y klf4, y las células se reprograman para que sean pluripotentes. En todavía otra realización, el tipo de célula somática es una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés), células mononucleares de sangre del cordón, o fibroblastos. En una realización todavía adicional, los factores de reprogramación se proporcionan como proteínas que penetran en las células. En una realización adicional, los factores de reprogramación se proporcionan como ácidos nucleicos codificantes de proteínas de reprogramación. En todavía otra realización, el tipo celular de interés deseado es una célula madre pluripotente inducida (CMPi).

Otro aspecto de la descripción implica un método de reprogramación nuclear en el que la eficiencia de reprogramación nuclear es mayor que si el método se llevase a cabo sin la composición de aluminio. En una realización de este aspecto de la descripción, la eficiencia de reprogramación nuclear es aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces mayor que la expresión de por lo menos un marcador de pluripotencialidad clave. Tal como se describe en la presente memoria, la eficiencia de reprogramación nuclear es aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces mayor que la cantidad de tipo celular de interés deseado que se produce.

Otro aspecto de la descripción se refiere a una población de células madre pluripotentes inducidas producidas mediante cualquiera de los métodos de la descripción. En una realización, las células madre pluripotentes inducidas son células humanas.

Otro aspecto de la descripción se refiere a un kit para la puesta en práctica de los métodos de la invención. Tal como se describe en la presente memoria, el kit comprende factores de reprogramación y una composición de aluminio. Tal como se describe en la presente memoria, el kit además comprende células somáticas. Un aspecto todavía adicional de la descripción se refiere a una composición terapéutica que comprende una composición DAMP, tal como una composición de aluminio, y uno o más factores de reprogramación y/o ácidos nucleicos codificantes de los mismos y/o moléculas pequeñas, para la administración in vivo, para la modulación terapéutica del fenotipo celular y/o tisular. Otro aspecto de la descripción se refiere a métodos de tratamiento de un paciente que lo necesita mediante la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones terapéuticas de la descripción.

Breve descripción de las figuras

Puede alcanzarse una comprensión más completa de la presente invención haciendo referencia a los dibujos adjuntos, al considerarlos junto con la descripción detallada a continuación. Las realizaciones ilustradas en los dibujos pretenden únicamente ejemplificar la invención y no deben interpretarse como limitativos de la invención a las realizaciones ilustradas.

La figura 1 muestra una imagen del procedimiento de obtención de CMPi utilizando métodos descritos en la presente memoria.

Las figuras 2, 3, 4 y 5 ilustran resultados experimentales de utilización de concentraciones variables de hidróxido de aluminio para obtener CMPi procedentes de diversos donantes bajo condiciones hipóxicas y normóxicas utilizando los métodos descritos en la presente memoria.

Descripción detallada de la invención

En la presente memoria se describen métodos para potenciar la reprogramación nuclear de células somáticas para convertirlas en células madre pluripotentes inducidas. En particular, los métodos descritos en la presente memoria implican la utilización de moléculas de patrón molecular asociado al daño (DAMP). En determinadas realizaciones, las DAMP son composiciones de aluminio, tales como hidróxido de aluminio. Se ha encontrado inesperada y sorprendentemente que tales DAMP potencian la eficiencia de reprogramación nuclear de los factores de reprogramación habitualmente utilizados para inducir células somáticas para que se conviertan en células madre pluripotentes inducidas. Por consiguiente, esta descripción describe métodos de reprogramación nuclear, así como células obtenidas de tales métodos, junto con métodos terapéuticos para utilizar tales células en el tratamiento de enfermedades susceptibles de tratamiento mediante terapia de células madre, así como kits para dichos usos.

Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales y reactivos particulares indicados, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria se proporciona a fin de describir realizaciones particulares exclusivamente, y que no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas.

La utilización de las palabras “un” o “una” utilizadas junto con la expresión “que comprende” en las reivindicaciones y/o en la memoria puede significar “uno”, aunque también es consistente con el significado de “uno o más”, “por lo menos uno” y “uno o más de uno”.

En toda la presente solicitud, el término “aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la variación de error inherente del dispositivo, utilizando el método para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio. Típicamente, el término pretende comprender una variabilidad aproximadamente igual o inferior a 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%, según la situación.

La utilización del término “o” en las reivindicaciones se utiliza para referirse a “y/o” a menos que se indique explícitamente que hace referencia a alteARNtivas exclusivamente o que las alteARNtivas sean mutuamente excluyentes, aunque la descripción proporciona una definición que se refiere alteARNtivas exclusivamente e “y/o”.

Tal como se utiliza en la presente memoria y en la reivindicación o reivindicaciones, los términos “comprendiendo” (y cualquier forma de comprendiendo, tal como “comprende”), “presentando” (y cualquier forma de presentando, tal como “presenta”), “incluyendo” (y cualquier forma de incluyendo, tal como “incluye”) o “conteniendo” (y cualquier forma de conteniendo, tal como “contiene”) son inclusivas y de significado abierto y no excluyen elementos o etapas del método no indicadas adicionales. Esta contemplado que pueda implementarse cualquier realización comentada en la presente memoria con respecto a cualquier método o composición de la invención, y viceversa. Además, pueden utilizarse composiciones de la invención para conseguir métodos de la invención.

Se hace referencia a “totipotencia” en la presente memoria como la capacidad de una célula individual de dividirse y/o diferenciarse para producir todas las células diferenciadas en un organismo, incluyendo tejidos extraembrionarios. Entre las células totipotentes se incluyen esporas y cigotos. En algunos organismos, las células pueden desdiferenciarse y recuperar la totipotencia.

Se hace referencia a “pluripotencialidad” en la presente memoria como al potencial de diferenciarse en cualquier de las tres capas germinales: endodermo (revestimiento interior del estómago, tracto gastrointestinal, pulmones), mesodermo (músculo, hueso, sangre, urogenital) o ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso).

Las “células madre pluripotentes” incluyen las células madre pluripotentes naturales y las células madre pluripotentes inducidas. Pueden producir cualquier tipo celular fetal o adulto. Sin embargo, solas generalmente no pueden desarrollarse en un organismo fetal o adulto debido a que no poseen el potencial de contribuir a tejido extraembrionario, tal como la placenta.

Las “células madre pluripotentes inducidas” o (“CMPi”) son similares a las células madre pluripotentes naturales, tales como las células madre (CM) embrionarias, en muchos aspectos, tales como la expresión de determinados genes y/o proteínas de la célula madre, los patrones de metilación de la cromatina, el tiempo de duplicación, la formación de cuerpos embrioides, la formación de teratoma, la formación de quimeras viables y la potencia y diferenciabilidad. Las células pluripotentes inducidas pueden derivarse de, por ejemplo, células adultas de estómago, hígado, piel y sangre. Las CMPi pueden derivarse mediante transfección de determinados genes asociados a célula madre en células no pluripotentes, tales como fibroblastos adultos. En determinadas realizaciones, la transfección puede conseguirse mediante vectores víricos, tales como retrovirus, por ejemplo, y vectores no víricos o episómicos. Entre los genes transfectados pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos, transgenes de los factores transcripcionales maestros Oct-3/4 (Pou5fl), Klf4, c-myc, Sox2, Oct-4, Nanong y Lin28. Las subpoblaciones de células transfectadas pueden empezar a ser morfológica y bioquímicamente similares a células madre pluripotentes, y pueden aislarse mediante selección morfológica, tiempo de duplicación o mediante un gen informador y selección con antibiótico.

Entre los “marcadores de pluripotencialidad clave” conocidos por el experto ordinario en la materia se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la expresión génica y/o proteica de fosfatasa alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT y zfp42.

Se hace referencia a la “multipotencialidad” en la presente memoria como células progenitoras multipotentes que presentan el potencial de producir múltiples tipos celulares, aunque un número de linajes más limitado que una célula madre pluripotente. Por ejemplo, una célula madre multipotente es una célula hematopoyética que puede desarrollarse en varios tipos de células sanguíneas, pero no puede desarrollarse en células cerebrales o en otros tipos de células.

La expresión “factores de reprogramación”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a uno o a un cóctel de polipéptidos biológicamente activos (o ácidos nucleicos, p.ej., ADN o ARN, codificantes de los mismos) o moléculas pequeñas que actúan sobre una célula alteARNdo la transcripción y que, con la expresión, reprograman una célula somática en un tipo celular diferente, o a multipotencialidad o a pluripotencialidad. En algunas realizaciones, los factores de reprogramación pueden ser no integrantes, es decir, proporcionados a la célula somática receptora en una forma que no resulta en la integración de ADN exógeno en el genoma de la célula receptora.

En algunas realizaciones, el factor de reprogramación es un factor de transcripción, incluyendo, aunque sin limitación, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc y Nanog. También resulta de interés como factor de reprogramación Lin28, que es una proteína de unión a ARNm que se cree que influye sobre la traducción o estabilidad de los ARNm específicos durante la diferenciación.

Entre los factores de reprogramación de interés se incluyen además factores útiles en la trans-diferenciación, en la que una célula somática se reprograma en una célula somática diferente. Para el propósito de la trans-diferenciación de una célula somática en otro tipo celular somático sustancialmente diferente, encuentra utilidad un conjunto diferente de factores de reprogramación. Por ejemplo, para trans-diferenciar un fibroblasto en un cardiomiocito, podrían utilizarse los péptidos que penetran en las células Gata4, Mef2c y Tbx5 (Leda et al., Cell, volumen 142, n° 3, 375-386, 6 de agosto, 2010).

Los factores de reprogramación pueden proporcionarse en forma de composiciones de polipéptidos aislados, es decir, en una forma libre de células, que son biológicamente activos o en forma de ácidos nucleicos (p.ej., ADN o ARN) codificantes de los mismos. La actividad biológica puede determinarse mediante ensayos de unión a ADN específicos, o mediante la determinación de la eficacia del factor en la alteración de la transcripción celular. Una composición de la invención puede proporcionar uno o más factores de reprogramación biológicamente activos. La composición puede comprender por lo menos aproximadamente 50 pg/ml de factor de reprogramación soluble, por lo menos aproximadamente 100 pg/ml, por lo menos aproximadamente 150 pg/ml, por lo menos aproximadamente 200 pg/ml, por lo menos aproximadamente 250 pg/ml, por lo menos aproximadamente 300 pg/ml o más.

Un polipéptido Klf4 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de Klf4 humana, es decir, el factor 4 similar a Kruppel, la secuencia del cual se encuentra en GenBank n° de acceso NP_004226 (SEC ID n° 1) y NM_004235 (SEC ID n° 2). Los polipéptidos Klf4, p.ej. los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank n° de acceso NM_004235 (SEC ID n° 2) y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran utilidad como factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido c-Myc es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de c-Myc humana, es decir, el homólogo del oncogén vírico de la mielocitomatosis, la secuencia del cual puede encontrarse en GenBank n° de acceso NP_002458 (SEC ID n° 3) y NM_002467 (SEC ID n° 4). Los polipéptidos c-Myc, p.ej., los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank n° de acceso NM_002467 (SEC ID n° 4) y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran utilidad como factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido Nanog es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de Nanog humano, es decir, la caja homeo de Nanog, la secuencia del cual puede encontrarse en GenBank n° de acceso NP_079141 (SEC ID n° 5) y Nm_024865 (SEC ID n° 6). Los polipéptidos Nanog, p.ej., los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank n° de acceso NM_024865 (SEC ID n° 6) y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran utilidad como factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido Lin-28 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de Lin-28 humano, es decir, homólogo de Lin-28 de C. elegans, la secuencia del cual puede encontrarse en GenBank n° de acceso NP_078950 (SEC ID n° 7) y NM_024674 (SEC ID n° 8). Los polipéptidos Lin-28, p.ej. los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% o 100% idéntico a la secuencia proporcionada en GenBank n° de acceso NM_024674 (SEC ID n° 8) y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran utilidad como un factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido Oct3/4 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de Oct3/4 humano, también conocido como caja homeo 1 de clase 5 POU de Homo sapiens (POU5F1), la secuencia del cual puede encontrarse en GenBank n° de acceso NP_002692 (SEC ID n° 9) y NM_002701 (SEC iD n° 10). Los polipéptidos Oct3/4, p.ej., los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank n° de acceso NM_002701 (SEC ID n° 10) y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran utilidad como un factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido Sox2 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de Sox2 humano, es decir, la proteína de la caja 2 de la región Y determinante del sexo, la secuencia del cual puede encontrarse en GenBank n° de acceso NP_003097 (SEC ID n° 11) y NM_003106 (SEC ID n° 12). Los polipéptidos Sox2, p.ej. los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99% o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank n° de acceso NM_003106 (SEC ID n° 12) y los ácidos nucleicos que lso codifican encuentran utilidad como un factor de reprogramación en la presente invención.

Moléculas pequeñas, incluyendo, aunque sin limitación, ácido valproico, ácido hidroxámico, tricostatina A, suberoilanilida de ácido hidroxámico, BIX-01294 y BayK8644 se han descrito como útiles en la reprogramación de células (véase Shi et al. (2008), Cell Stem Cell 6; 3(5):568-574, y Huangfu et al. (2008), Nature Biotechnology 26:795-797).

Las “moléculas de patrón molecular asociado al daño” (DAMP) también conocidas como moléculas de patrón molecular asociado al daño, tal como se utilizan en la presente memoria son moléculas que pueden iniciar y perpetuar respuestas inmunológicas en una respuesta inflamatoria no infecciosa. En contraste, las moléculas de patrón molecular asociadas a patógenos (PAMP) inician y perpetúan la respuesta inflamatoria a patógenos infecciosos. Las DAMP pueden ser proteínas nucleares o citosólicas. Al liberarse fuera de la célula o exponerse sobre la superficie de la célula tras la lesión de un tejido, pueden desplazarse de un medio reductor a uno oxidante, lo que puede resultar en su desnaturalización. Tras la necrosis, el ADN tumoral se libera al exterior del núcleo y al exterior de la célula, pudiéndose convertir en una DAMP. Entre los ejemplos de DAMP pueden incluirse, aunque sin limitación, moléculas de HMGB1, ADN, ARN, S100, metabolitos purinas, ácido úrico, nanopartículas, asbesto, composiciones de aluminio tales como sales de aluminio, beta-amiloide, sílice, cristales de colesterol, hemozoína, dehidrato de pirofosfato de calcio y similares. En determinadas realizaciones, la presencia de DAMP puede potenciar la eficiencia de la reprogramación como resultado de la exposición a los factores de reprogramación.

La expresión “composiciones de aluminio” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a moléculas que contiene aluminio elemental, sales de aluminio, iones de aluminio y/o aluminio unido covalente o iónicamente a otro elemento. En algunas realizaciones, la expresión se refiere a sales de aluminio, hidróxidos de aluminio, sulfato de aluminio y fosfatos de aluminio.

“Aluminio” es un elemento químico en el grupo del boro con símbolo Al y número atómico 13. Es un metal blanco plateado, blando y dúctil. El aluminio es el tercer elemento más abundante (después del oxígeno y el silicio) y el metal más abundante en la corteza de la Tierra. La mayoría de compuestos, incluyendo todos los minerales que contienen Al y todos los compuestos de aluminio comercialmente significativos, presentan aluminio el estado de oxidación 3+. El número de coordinación de tales compuestos varía, aunque generalmente Al3+ es hexacoordinado o tetracoordinado. Prácticamente todos los compuestos de aluminio (III) son incoloros. El aluminio forma un óxido estable, conocido por el nombre de mineral corindón. El zafiro y el rubí son corindón impuro contaminado con cantidades traza de otros metales. Los dos óxidos-hidróxidos, AlO(OH), son boehmita y diáspora. Existen tres trihidróxidos: bayerita, gibbsita y nordstrandita, que difieren en su estructura cristalina (polimorfos). La mayoría se producen a partir de menas mediante una diversidad de procedimientos húmedos utilizando ácidos y bases. El calentamiento de los hidróxidos conduce a la formación de corindón.

El “hidróxido de aluminio” tal como se utiliza en la presente memoria es Al(OH)3, ATH, en ocasiones denominado erróneamente hidrato de alúmina, y se encuentra en la naturaleza como el mineral gibbsita (también conocido como hidrargilita) y sus tres polimorfos más raros: bayerita, doyleita y nordstrandita. El hidróxido de aluminio recién precipitado forma geles, que es la base para la aplicación de sales de aluminio como floculantes en la purificación de agua. Este gel cristaliza con el tiempo. Los geles de hidróxido de aluminio pueden deshidratarse (p.ej., utilizando solventes no acuosos miscibles en agua como el etanol), formando unos polvos amorfos de hidróxido de aluminio, que son fácilmente solubles en ácidos. Los polvos de hidróxido de aluminio que se calientan a una temperatura elevada bajo condiciones cuidadosamente controladas se conocen como alúmina activada y se utilizan como desecante, un adsorbente, en la purificación de gases, como un soporte de catalizador de Claus, en la purificación de agua y como adsorbente para la catálisis durante la fabricación de polietileno mediante el procedimiento de Sclairtech. La gibbsita presenta una estructura típica de hidróxido de metal, con enlaces de hidrógeno. Está constituido de capas dobles de grupos hidroxilo con iones de aluminio ocupando dos tercios de los orificios octaédricos entre las dos capas.

El hidróxido de aluminio puede fabricarse comercialmente mediante el procedimiento de Bayer, que implica disolver bauxita en hidróxido sódico a temperaturas de hasta 270°C. Los sólidos remanentes, que forman un lodo rojo, se separan y el óxido de aluminio se precipitada de la solución remanente. El óxido de aluminio que se produce puede convertirse en hidróxido de aluminio mediante la reacción con agua.

El “fosfato de aluminio” (AlPO4) es un compuesto químico cuya forma anhidra se encuentra en la naturaleza como el mineral berlinita. También se conocen muchas formas sintéticas de fosfato de aluminio anhidro. Presentan estructuras de marco similares a las zeolitas y algunas se utilizan como catalizadores o tamices moleculares. Se conoce una forma hidratada, AlPO4'1,5H2O. El gel de fosfato de aluminio también se encuentra comercialmente disponible. Existe un gran número de tamices moleculares de fosfato de aluminio, genéricamente conocidos como “ALPO”. Comparten la misma composición química del AlPO4 y las estructuras de marco con cavidades microporosas y las estructuras están constituidas de tetraedros alteARNntes de AO4 y PO4. El mineral de APO4 cristalino sin cavidades, más denso, de la berlinita comparte los mismos tetraedros alteARNntes de AO4 y PO4. Las estructuras de marco de aluminofosfato difieren entre sí en la orientación de los tetraedros de AO4 y los tetraedros de PO4, formando cavidades de diferente tamaño y, en este aspecto, son similares a las zeolitas aluminosilicato, que difieren en que presentan marcos eléctricamente cargados. Una preparación típica de un aluminofosfato implica la reacción hidrotérmica de ácido fosfórico y aluminio en forma de hidróxido, una sal de aluminio tal como la sal o alcóxido de nitrato de aluminio bajo pH controlado en presencia de aminas orgánicas. Estas moléculas orgánicas actúan como moldes (ahora denominados agentes directores de estructura, al dirigir el crecimiento del marco poroso).

“Sulfato de aluminio” es un compuesto químico con la fórmula Ah(SO4)3. Es soluble en agua y se utiliza principalmente como agente floculante en la purificación de agua potable. El sulfato de aluminio en ocasiones se considera un tipo alumbre. Los alumbres son una clase de compuestos relacionados tipificados por AB(SO4)2-12H2O. La forma anhidra se observa naturalmente como el mineral raro milosevichita, observado en, p.ej., medios volcánicos y al incinerar pilas de residuos de minería del carbón. El sulfato de aluminio raramente, si alguna vez, se encuentra en forma de la sal anhidra. Forma varios hidratos diferentes, de los cuales el hexadecahidrato Ah(SO4)3'16H2O y el octadecahidrato Ah(SO4)3-18H2O son los más comunes. El heptadecahidrato, la fórmula del cual se escribe como [Al(H2O)a]2(SO4)3-5H2O se encuentra naturalmente en forma del mineral alunógeno.

La dosis de un DAMP (p.ej., una composición de aluminio) que resulta eficaz en los métodos de la invención es una dosis que incrementa la eficiencia de reprogramación de una célula o población celular, respecto al mismo método llevado a cabo en ausencia el DAMP. El término “reprogramación” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la reprogramación nuclear de una célula somática en una célula pluripotente (p.ej., un fibroblasto en una célula pluripotente inducida) o la reprogramación nuclear de una célula somática en una célula somática sustancialmente diferente (p.ej., un fibroblasto en una célula endotelial) in vitro o in vivo. El último procedimiento también se conoce como trans-diferenciación.

En determinadas realizaciones, las células que se reprograman se exponen a una concentración de DAMP, tal como una composición de aluminio, que presenta una concentración de aproximadamente, o por lo menos, o exactamente 1, 10, 102 o 103 veces 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 nanogramos, microgramos, miligramos o gramos por ml de medio de cultivo celular. En otra realización, las células se exponen a dicha concentración durante aproximadamente o por lo menos o exactamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 minutos, horas o días antes, después o durante la exposición de las células somáticas en factores de reprogramación.

La expresión “eficiencia de reprogramación” puede utilizarse para referirse a la capacidad de las células de producir colonias de células CMPi al ponerlas en contacto con factores de reprogramación. Las células somáticas que demuestran una eficiencia incrementada de reprogramación en pluripotencialidad demuestran una capacidad potenciada de producir las CMPi al ponerse en contacto con factores de reprogramación respecto a un control. La expresión “eficiencia de reprogramación” puede referirse también a la capacidad de las células somáticas de reprogramarse en un tipo celular somático sustancialmente diferente, un procedimiento conocido como trans­ diferenciación. La eficiencia de reprogramación con los métodos de la invención varía con la combinación particular de células somáticas, el método de introducción de factores de reprogramación y el método de cultivo después de la inducción de la reprogramación.

En determinadas realizaciones, la presencia de un DAMP resulta en aproximadamente o por lo menos o exactamente 1, 10, 102 o 103 veces 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 porcentaje de incremento de: 1) el nivel de expresión de uno o más marcadores de pluripotencialidad clave, o 2) el número de CMPi formadas, cada uno en comparación con el mismo método de reprogramación pero sin el DAMP (es decir, un control).

Métodos de inducción de pluripotencialidad in vitro

Se pone en contacto una población inicial de células somáticas con factores de reprogramación, tal como se ha definido anteriormente, en una combinación y cantidad suficientes para reprogramar la célula en pluripotencialidad antes, concurrentemente o después de la activación de la célula somática con una dosis eficaz de un DAMP. En una realización de la invención, la composición de aluminio s hidróxido de aluminio. Los factores de reprogramación pueden proporcionarse a las células somáticas individualmente o en forma de una única composición, es decir, una composición premezclada, de factores de reprogramación. En otra realización, la población inicial de células somáticas es de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células mononucleares de sangre del cordón o fibroblastos.

En algunas realizaciones, la población inicial de células se pone en contacto con una dosis eficaz de un DAMP durante un periodo de tiempo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 18 días, p.ej., de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 días, y puede ser de aproximadamente 2 a 3 días.

Los factores de reprogramación pueden añadirse a las células sujeto simultánea o secuencialmente en diferentes tiempos, y pueden añadirse en combinación con el DAMP. En algunas realizaciones, se añade un conjunto de por lo menos tres factores de reprogramación purificados, p.ej., un polipéptido Oct3/4, un polipéptido Sox2 y un polipéptido Klf4, c-myc, Nanog o lin28. En algunas realizaciones, se proporciona a las células un conjunto de cuatro factores de reprogramación purificados, p.ej., un polipéptido Oct3/4, un polipéptido Sox2, un polipéptido Klf4 y un polipéptido c-Myc, o un polipéptido Oct3/4, un polipéptido Sox2, un polipéptido lin28 y un polipéptido Nanog.

Entre los métodos para introducir los factores de reprogramación en células somáticas se incluye proporcionar una célula con factores proteínas purificados o ácidos nucleicos codificantes de las mismas. En algunas realizaciones, un factor de reprogramación comprenderá las secuencias polipeptídicas del factor de reprogramación fusionadas con un dominio polipéptido que penetra en las células. Se conocen de la técnica varios dominios que penetran en las células y pueden utilizarse en los polipéptidos no integrantes de acción en el núcleo de la presente invención, incluyendo portadores peptídicos, peptidomiméticos y no peptídicos. Por ejemplo, un péptido que penetra en las células puede derivarse a partir de la tercera hélice alfa del factor de transcripción Antennapaedia de Drosophila melanogaster, denominado penetratina, que comprende la secuencia de aminoácidos RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC ID n° 13). A título de otro ejemplo, el péptido que penetra en las células comprende la secuencia de aminoácidos de la región básica tat del VIH-1, que puede incluir, por ejemplo, los aminoácidos 49 a 57 de la proteína tat natural. Entre otros dominios que penetra en las células se incluyen los motivos poliarginina, por ejemplo, la región de aminoácidos 34 a 56 de la proteína Rev del VIH-1, nona-arginina (SEC ID n° 14), octa-arginina (SEC ID n° 15) y similares (véase, por ejemplo, Futaki et al. (2003), Curr. Protein Pept. Sci. 2003, abril; 4(2):87-96, y Wender et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 21 de nov., 97(24).13003-8, solicitudes publicadas de patente u S n° 2003/0220334, n° 2003/0083256, n° 2003/0032593 y n° 2003/0022831, para las enseñanzas de péptidos y peptoides de translocalización). La secuencia de nona-arginina (R9) (SEC ID n° 14) es una de las PTD más eficientes que se han caracterizado (Wender et al., 2000; Uemura et al., 2002).

En dichas realizaciones, las células se incuban en presencia de un factor de reprogramación purificado durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 72 horas, p.ej., 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24, horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, o cualquier otro periodo entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 72 horas. Típicamente, los factores de reprogramación se proporcionan a las células del sujeto cuatro veces, y se deja que las células incuben con los factores de reprogramación durante 48 horas, seguido de la sustitución del medio por medio fresco y se cultivan adicionalmente las células (véase, por ejemplo, Zhou et al. (2009), Cell Stem Cells 4(5); 381-384). Los factores de reprogramación pueden proporcionarse en las células del sujeto durante aproximadamente una a aproximadamente 4 semanas, p.ej., entre aproximadamente dos y aproximadamente 3 semanas.

La dosis de factores de reprogramación variará con la naturaleza de las células, los factores, las condiciones de cultivo, etc. En algunas realizaciones, la dosis será de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 pM para cada factor, más habitualmente entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 500 nM, o aproximadamente 100 a 200 nM. En algunas realizaciones, las células se exponen inicialmente a una composición de aluminio durante la exposición a los factores de reprogramación durante por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos aproximadamente 2 días, por lo menos aproximadamente 4 días, por lo menos aproximadamente 6 días o una semana, y pueden exponerse durante el procedimiento de reprogramación completo, o menos. La dosis dependerá del DAMP específico, aunque puede ser de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 1 pg/ml, de entre aproximadamente 10 ng/ml y aproximadamente 500 ng/ml. Después de cada provisión pueden realizarse dos incubaciones de 16 a 24 horas con los factores de recombinación, seguido de la sustitución del medio por medio fresco, y las células se cultivan adicionalmente.

En algunas realizaciones, se utiliza un vector que no se integra en el genoma de la célula somática. Se encuentran disponibles muchos vectores útiles para transferir genes exógenos al interior de las células de mamífero diana. Los vectores pueden mantenerse episómicamente, p.ej., en forma de plásmidos, vectores derivados de virus, tales como citomegalovirus, adenovirus, etc. Los vectores utilizados para proporcionar factores de reprogramación a las células del sujeto en forma de ácidos nucleicos típicamente comprenderán promotores adecuados para controlar la expresión, es decir, la activación transcripcional, de los ácidos nucleicos del factor de reprogramación. Lo anterior puede incluir promotores de acción ubicua, por ejemplo, el promotor beta-actina del CMV, o promotores inducibles, tales como promotores que están activos en las poblaciones celulares particulares o que responden a la presencia de fármacos tales como la tetraciclina. Activación transcripcional pretende referirse a que la transcripción se incrementa sobre los niveles basales en la célula diana en por lo menos o aproximadamente igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100 o 1000 veces.

Tras la introducción de factores de reprogramación, las células somáticas pueden mantenerse en un medio de cultivo convencional que comprende células de capa de alimentación, o pueden cultivarse en ausencia de capas de alimentación, es decir, que no presenta células somáticas diferentes de las inducidas a pluripotencialidad. Los cultivos libres de capa de alimentación pueden utilizar una superficie recubierta con proteína, p.ej., Matrigel, etc. Las células somáticas también pueden mantenerse en suspensión o unirse a microportadores.

Las CMPi inducidas para convertirse en CMP mediante los métodos de la invención pueden presentar una morfología de tipo CMEh, las cuales crecen en forma de colonias planas con grandes proporciones núcleo-citoplasma, bordes definidos y núcleos prominentes. Además, las CMPi pueden expresar uno o más marcadores de pluripotencialidad clave conocidos por el experto ordinario en la materia, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, fosfatasa alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT y zfp42. Además, las CMPi son capaces de formar teratomas. Además, son capaces de formar o contribuir a los tejidos del ectodermo, mesodermo o endodermo en un organismo vivo.

Los genes pueden introducirse en las células somáticas o en las CMPi derivadas de las mismas para una diversidad de propósitos, p.ej., para sustituir genes con una mutación de pérdida de función, para proporcionar genes marcadores, etc. AlteARNtivamente, se introducen vectores que expresan ARNm antisentido ribozimas, bloqueando de esta manera la expresión e un gen no deseado. Otros métodos de terapia génica son la introducción de genes de resistencia a fármaco para permitir que las células progenitoras normales presenten una ventaja y se vean sometidas a presión selectiva, por ejemplo, el gen de resistente a múltiples fármacos (RMF), o genes antiapoptosis, tales como bcl-2. Pueden utilizarse diversas técnicas conocidas para introducir ácidos nucleicos en las células diana, p.ej., electroporación, ADN precipitado con calcio, fusión, transfección, lipofección, infección y similares, tal como se ha comentado anteriormente. El modo particular en el que se introduce el ADN no resulta crucial para la práctica de la invención.

Las CMPi producidas mediante los métodos anteriores pueden utilizarse para reconstituir o complementar células en diferenciación o diferenciadas en un receptor. Las células inducidas pueden diferenciarse en tipos celulares de diversos linajes. Entre los ejemplos de células diferenciadas se incluyen células diferenciadas de los linajes ectodérmico (p.ej., neuronas y fibroblastos), mesodérmico (p.ej., cardiomiocitos) o endodérmico (p.ej., células pancreáticas). Las células diferenciadas pueden ser una o más de: células beta pancreáticas, células madre neurales, neuronas (p.ej., neuronas dopaminérgicas), oligodendrocitos, células progenitoras de oligodendrocitos, hepatocitos, células madre hepáticas, astrocitos, miocitos, células hematopoyéticas o cardiomiocitos.

Existen numerosos métodos de diferenciación de las células inducidas en un tipo celular más especializado. Los métodos de diferenciación de células inducidas pueden similares a los utilizados para diferenciar células madre, particularmente células ES, MSC, MAPC, MIAMI, células madre hematopoyéticas (h Sc , por sus siglas en inglés). En algunos casos, la diferenciación se produce ex vivo; en algunos casos, la diferenciación se produce in vivo.

Las células inducidas, o células diferenciadas a partir de células inducidas, pueden utilizarse como una terapia para tratar enfermedades (p.ej., un defecto genético). La terapia puede dirigirse a tratar la causa de la enfermedad; o alteARNtivamente, la terapia puede ser para tratar los efectos de la enfermedad o condición. Las células inducidas pueden transferirse a, o a un sitio próximo a, un sitio lesionado en un sujeto; o las células pueden introducirse en el sujeto de una manera que permita que las células migren o se dirijan al sitio lesionado. Las células transferidas pueden sustituir ventajosamente las células dañadas o lesionadas y permitir la mejora de la condición global del sujeto. En algunos caos, las células transferidas pueden estimular la regeneración o reparación de tejidos.

Las células transferidas pueden ser células diferenciadas a partir de células inducidas. Las células transferidas también pueden ser células madre multipotentes diferenciadas a partir de células inducidas. En algunos casos, las células transferidas pueden ser células inducidas que no se han diferenciado.

El número de administraciones de tratamiento en un sujeto puede variar. La introducción de las células inducidas y/o diferenciadas en el sujeto puede ser un suceso de una vez; aunque en determinadas situaciones, dicho tratamiento puede inducir la mejora durante un periodo de tiempo limitado y requerir una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden requerirse múltiples administraciones de las células antes de que se observe un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o condición, el estado de la enfermedad y parámetros del sujeto individual que se está tratando.

Las células pueden introducirse en el sujeto mediante cualquiera de las vías siguientes: parenteral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, transdérmica, intratraqueal, intraperitoneal o en líquido espinal.

Las CMPi pueden administrarse en cualquier medio fisiológicamente aceptable. Pueden proporcionarse solas o con un sustrato o matriz adecuado, p.ej., para proporcionar soporte a su crecimiento y/o organización en el tejido en el que se trasplantan. Habitualmente, se administrarán por lo menos 1x105 células, preferentemente 1x106 o más. Las células pueden introducirse mediante inyección, catéter o similar. Las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante periodos de tiempo prolongados, siendo posible su utilización tras descongelarlas. Si se congelan, las células habitualmente se almacenan en un medio de DMSO al 10%, FCS al 50%, RPMI 1640 al 40%. Una vez descongeladas, las células pueden expandirse mediante la utilización de factores de crecimiento y/o células estromales asociadas a la proliferación y diferenciación de células progenitoras.

Pueden proporcionarse kits, en donde el kit comprende una dosis eficaz de un DAMP, tal como una composición de aluminio. En algunas realizaciones, la composición de aluminio es un hidróxido de aluminio. El kit puede comprender además uno o más factores de reprogramación, p.ej., en forma de proteínas fusionadas con un dominio que penetra en las células.

“Tratar” o “tratamiento” se refiere en la presente memoria a administración de una sustancia en un sujeto con el propósito de curar, aliviar, mitigar, remediar, evitar o paliar un trastorno, síntomas del trastorno, un estado de enfermedad secundario al trastorno o una predisposición al trastorno. Una “cantidad eficaz” es una cantidad de la sustancia que es capaz de producir un resultado médicamente deseable, tal como se indica en la presente memoria, en un sujeto tratado. El resultado médicamente deseable puede ser objetivo (es decir, medible mediante algún ensayo marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto proporciona una indicación o siente un efecto).

“Enfermedad susceptible de tratamiento con terapia de células madre” tal como se indica en la presente memoria se refiere a cualesquiera procedimientos, condiciones, trastornos, afecciones y/o enfermedades que pueden tratarse mediante la administración de células madre, tales como CMPi. Entre dichas enfermedades se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, trasplante de médula ósea, piel, corazón y córnea, enfermedad del injerto contra el huésped, insuficiencia hepática y renal, lesión pulmonar, artritis reumatoide, tratamiento de enfermedades autoinmunológicas, tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, lupus y diabetes; prevención del rechazo de aloinjerto, trastornos neurológicos y medicina cardiovascular, así como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), linfoma de Burkitt, leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia mielomonocítica juvenil (LMMJ), linfoma de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, granulomatosis linfomatoide, síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), síndromes de insuficiencia de la médula ósea, trombocitopenia amegacariocítica, neutropenia autoimunológica (grave), anemia diseritropoyética congénita, neutropenia cíclica, anemia de Diamond-Blackfan, síndrome de Evan, anemia de Fanconi, enfermedad de Glanzmann, dermatomiositis juvenil, síndrome de Kostmann, aplasia de células rojas, síndrome de Schwachman, anemia aplásica grave, anemia sideroblástica congénita, trombocitopenia con radio ausente (síndrome TAR), disqueratosis congénita, trastornos sanguíneos, anemia de células falciformes (hemoglobina SS), enfermedad HbSC, talasemia falciforme p0, a-talasemia mayor (hidropesía fetal), p-talasemia mayor (anemia de Cooley), p-talasemia intermedia, E-p0 talasemia, E-p+ talasemia, trastornos metabólicos, adrenoleucodistrofia, enfermedad de Gaucher (infantil), leucodistrofia metacromática, enfermedad de Krabbe (leucodistrofia de células globoides), enfermedad de Gunther, síndrome de Hermansky-Pudlak, síndrome de Hurler, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilipo, síndrome de Maroteaux-Lamy, mucolipidosis tipo II, III, alfa-manosidosis, síndrome de Niemann-Pick, tipo A y B, síndrome de Sandhoff, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Batten (lipofuscinosis neuronal ceroidea hereditaria), enfermedad de Lesch-Nyhan, inmunodeficiencias, ataxia telangiectasia, enfermedad granulomatosa crónica, síndrome de DiGeorge, deficiencia de IKK gamma, poliendocrinopatía de desregulación inmunológica, mucolipidosis ligada al X, tipo II, mielocatexis, inmunodeficiencia ligada al X, inmunodeficiencia combinada grave, deficiencia de adenosina desaminasa, síndrome de Wiskott-Aldrich, agammaglobulinemia ligada al X, enfermedad linfoproliferativa ligada al X, síndrome de Omenn, displasia reticular, displasia tímica, deficiencia de adhesión de los leucocitos, otra osteopetrosis, histiocitosis de las células de Langerhans, linfohistiocitosis hemofagocítica, enfermedad renal aguda y crónica, enfermedad de Alzheimer, antienvejecimiento, artritis, asma, terapia de células madre cardiacas, infarto cerebral (ictus, parálisis cerebral (ictus), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad cardiaca congestiva, diabetes mellitus (tipo I y II), fibromialgia, deficiencias inmunológicas, enfermedad cardiaca isquémica, lupus, esclerosis múltiple, infarto de miocardio, osteoartritis, osteoporosis, enfermedad de Parkinson, enfermedad arterial periférica, artritis reumatoide, terapia de células madre en cirugía plástica, lesión cerebral traumática y enfermedades neurológicas.

El término “paciente” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un sujeto mamífero diagnosticado o con sospecha de presentar o desarrollar una enfermedad susceptible de terapia de células madre, p.ej., enfermedad cardiovascular. Pueden ser pacientes ejemplares, seres humanos, simios, perros, cerdos, vacas, gatos, caballos, cabras, ovejas, roedores y otros mamíferos que pueden beneficiarse de las terapias de células madre.

“Administrar” se refiere en la presente memoria a proporcionar las CMPi de la invención en un paciente. A título de ejemplo no limitativo, la administración de composición, p.ej., inyección, puede llevarse a cabo mediante inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.), o inyección intramuscular (i.m.). Puede utilizarse una o más de dichas vías. La administración parenteral puede ser, por ejemplo, mediante inyección de bolo o mediante perfusión gradual durante el tiempo. AlteARNtivamente, o concurrentemente, la administración puede ser por la vía oral. Adicionalmente, la administración también puede ser mediante deposición quirúrgica de un bolo o pellet de células, o la colocación de un dispositivo médico, p.ej., un stent, cargado de células. Preferiblemente, las composiciones de la invención se administran en el sitio de enfermedad, p.ej., en el sitio o en proximidad, p.ej., aproximadamente o por lo menos a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 milímetros) el sito de una lesión patológica (p.ej., estenosis/bloqueo vascular, tejido necrótico o sitio de infección gangrenosa).

“Un paciente que lo necesita” se refiere en la presente memoria a un paciente en el que se ha diagnosticado o que se sospecha que presenta, una enfermedad susceptible de terapia de células madre.

Ejemplo

La reprogramación de las células CD34+ de sangre del cordón humano o células mononucleares de sangre periférica con plásmidos episómicos e hidróxido de aluminio bajo condiciones libres de células alimentadoras.

Este procedimiento genera células madre pluripotentes inducidas humanas (CMPi) mediante reprogramación de las células CD34+ de sangre del cordón humana o PBMC, utilizando plásmidos episómicos, sistema 4D-NucleofectorTM de Lonza, medio de CMP n° 7 de Lonza y una matriz de vitronectina humana.

Entre los materiales se incluyen: células CD34+ de sangre del cordón humano (Lonza, n° de cat. 2C-101) o células mononucleares de sangre periférica humana (Lonza, n° de cat. CC-2702), medio celular sanguíneo que contiene medio basal libre de suero, IMDM al 50% (Invitrogen, n° de cat. 12440-053), F12 de Ham al 50% (Invitrogen, n° de cat.

11765054), concentración de lípidos definidos químicamente 1x (Invitrogen, n° de cat. 11905-031), insulinatransferrina-selenio-X 1x (ITS-X) (Invitrogen, n° de cat. 51500), ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma-Aldrich, n° de cat.

49752), solución de fracción V de albúmina bovina 5 mg/ml (Invitrogen, n° de cat 15260-037), GlutaMaxTM-I 2 mM (Invitrogen, n° de cat. 35050), así como factores de crecimiento específicos de la sangre del cordón, incluyendo SCF humano recombinante 100 ng/ml (Preprotech, n° de cat. AF-300-07), ligando de Flt3 humano recombinante 100 ng/ml (Preprotech, n° de cat. AF-300-19), TPO humano recombinante 20 ng/ml (Preprotech, n° de cat. 300-18) e IL-3 humana recombinante (Preprotech, n° de cat. 200-03), así como factores de crecimiento específicos de PBMC, tales como 1-tioglicerol 200 pM (Sigma, n° M6145), holo-transferrina 100 pg/ml (R&D Systems, n° 2914-HT), dexametasona 1 pM (Sigma, n° D1756), 100 ng/ml (Preprotech, n° 300-07), EPO 2 U/ml (R&D Systems, n° 287-TC-500), IL-3 10 ng/ml (PreproTech, n° 200-03) y Alro 40 ng/ml IGF-1 (Preprotec, n° 100-11). También se utilizan los plásmidos pEB-C5 y pEB-Tg de grado GMPc; alteARNtivamente, pCE-OCT3/4, pCE-hSK, pCE-hUL, pCE-p53mDD, pCE-EBNA1, Alhydrogel al 2% (Invitrogen, vac-alu-50), medio de células madre pluripotentes (CMP) n° 7 de Lonza, solución de azul tripán al 0,4% (Invitrogen, n° de cat. 15250061), 1xDPBS (Lonza, n° de cat. 17-512F), 1xDPBS++ (Lonza, n° de cat.

17-513F) y kit 4D-NucleofectorTM X L de células primarias P3 (Lonza, n° de cat. V4XP-3012).

El equipo utilizado incluye un sistema 4D-NucleofectorTM de Lonza (Lonza, n° de cat. AAF-1001B, AAF-1001X), un incubador humidificado a 37°C ± 2°C con 5% de CO2± 2%, 3,8% de O2, recipiente de residuos biopeligrosos, campana de cultivo de tejidos, hemocitómetro, microscopio, baño de agua a 37°C, centrífuga capaz de 200 x g con rotores para tubos de 15 ml, pipetas serológicas de poliestireno desechables envueltas en papel Costar Stripette de 10 ml (ThermoFisher, n° de cat. 07-200-574), pipetas serológicas de poliestireno desechables envueltas en papel Costar Stripette de 10 ml (ThermoFisher, n° de cat. 07-200-573), llenadores/dispensadores Pipet-Aid portátiles Drummond XP (ThermoFisher, n° de cat. 13-681-15E), tubos de microcentrífuga libres de AARNsa Costar estériles de 1,7 ml Natural (ThermoFisher, n° de cat. 07-200-534), puntas de micropipeta con filtro de 1000 pl estériles (Rainin, n° de cat. RT-1000F), punta de micropipeta con filtro de 200 pl estériles (Rainin, n° de cat. RT-200F), puntas de micropipeta con filtro de 20 pl estériles (Rainin, n° de cat. RT-20F), puntas de micropipeta con filtro de 10 pl estériles (Rainin, n° de cat. RT-10GF), micropipeta Pipet-Lite XLS de 1000 pl (Rainin, n° de cat. SL-STARTXLS), micropipeta Pipet-Lite XLS de 200 pl (Rainin, n° de cat. SL-STARTXLS), micropipeta Pipet-Lite XLS de 20 pl (Rainin, n° de cat. Sl-STARTXLS), micropipeta Pipet-Lite XLS con RFID de 0,1 a 2 pl (Rainin, n° de cat. SL-2XLS), placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos Corning (Corning, n° de cat. 3513), placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos (ThermoFisher, n° de cat. 08-772-1B), tubo de centrífuga cónico Falcon de 15 ml (ThermoFisher, n° de cat. 14-959-70C).

El día 0, los procedimientos incluían la nucleofección celular de la manera siguiente: recubrir placas de cultivo de tejidos (9,6 cm2/pocillo) con 1 ml de vitronectina a una concentración de 10 pg/ml. Permitir la incubación del recubrimiento durante 1 hora. Asegurarse de que el Alhydrogel está suspendido uniformemente mediante agitación con vórtex. Combinar el Alhydrogel con SFM en una proporción de 3 pl por cada ml de SFM. Para cada muestra de transfección, transferir 2 ml de SFM a 1 pocillo de una placa de 6 pocillos. Introducir la placa en un incubador humidificado a 37°C para precalentar el medio. Recoger las células sanguíneas humanas en un tubo cónico Falcon de 15 ml. Extraer 10 pl de suspensión celular y mezclar bien con 10 pl de azul tripán. Contar las células viables utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio. Para cada muestra de transfección, introducir 106 células viables en un nuevo tubo de 15 ml y centrifugar las células a 200 g durante cinco (5) minutos. Eliminar el sobrenadante. Congelar las células rápidamente sobre hielo seco y almacenar a -80°C para análisis futuros de STR. Combinar 82 pl de solución P3 y 18 pl de complemento del kit L Cell 4D-NucleofectorTM X de células primarias P3 en un tubo de microcentrífuga estéril. Añadir los plásmidos pEB-C5: pEB-Tg o pCE-OCT3/4: pCE-hSK: pCE-hUL: pCE-p53mDD: pCE-EBNA1 en las proporciones 8:2 o 0,63:0,63:0,63:0,63:0,5 pg, respectivamente, y mezclar bien. Resuspender las células con solución Nucleofection™ premezclada, preparada previamente. Mezclar bien con micropipeta y transferir a una cubeta Nucleofection™ (proporcionada con el kit). Nucleofectar células utilizando 4D-NucleofectorTM utilizando el programa EO-100. Tras la nucleofección, extraer 0,5 ml de SFM precalentado y añadir a la cubeta utilizando una micropipeta en la campana de cultivo de tejidos. A continuación, utilizar una pipeta de transferencia proporcionada con el kit Nucleofection™ para transferir las células al SFM precalentamiento en 1 pocillo de una placa de 6 pocillos. Introducir la placa en un incubador humidificado.

El día 2 el procedimiento fue el siguiente: diluir 40 pl de vitronectina 250 pg/ml en 1 ml de 1 x DPBS++ y añadir lo anterior a 1 pocillo de una placa de 6 pocillos. Recubrir la placa en un incubador durante tres (3) horas. Transferir las células CD34+ nucleofectadas a un tubo de 15 ml y centrifugar las células a 200 g durante cinco (5) minutos. Eliminar el medio y resuspender las células en 2 ml de medio n° 7 de Lonza. Añadir 0,2 pl de A8301 10 pM (f.c. 1 pM) en la

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para potenciar la reprogramación nuclear de una célula somática de mamífero, comprendiendo el método: poner en contacto una población de células somáticas de mamífero con

(a) una dosis eficaz de una composición de aluminio, en donde la composición de aluminio se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio, y

(b) un cóctel de factores de reprogramación, durante un periodo de tiempo suficiente para reprogramar las células somáticas de mamífero en un tipo celular de interés deseado, en donde el tipo celular de interés deseado es una célula madre pluripotente inducida (CMPi).

2. El método según la reivindicación 1, en donde la composición de aluminio y los factores de reprogramación se proporcionan secuencial o simultáneamente.

3. El método según la reivindicación 1, en donde la composición de aluminio es hidróxido de aluminio.

4. El método según la reivindicación 3, en donde la dosis eficaz de hidróxido de aluminio es aproximadamente o por lo menos 40-80 microgramos/ml.

5. El método según la reivindicación 1, en donde la composición de aluminio es fosfato de aluminio.

6. El método según la reivindicación 1, en donde las células somáticas de mamífero son células humanas.

7. El método según la reivindicación 1, en donde el cóctel de factores de reprogramación comprende la utilización de ácidos nucleicos codificantes de (i) Oct4, Sox2, Lin28 y Nanog, o sus péptidos correspondientes que penetran en las células, y las células se reprograman a pluripotencialidad, o (ii) Oct4, Sox2, c-Myc y KLF4, o sus péptidos correspondientes que penetran en las células, y las células se reprograman a pluripotencialidad.

8. El método según la reivindicación 1, en donde la célula somática de mamífero es una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), una célula mononuclear de sangre de cordón umbilical, o un fibroblasto.

9. El método según la reivindicación 1, en donde los factores de reprogramación se proporcionan como (i) proteínas que penetran en las células, o (ii) ácidos nucleicos codificantes de las proteínas.