ES2748388T3

ES2748388T3 - Dextranos que tienen una masa molar muy alta

Info

Publication number: ES2748388T3
Application number: ES15732192T
Authority: ES
Inventors: Marlène Vuillemin; Marion Claverie; Claire Moulis; Magali Remaud-Simeon; Florent Grimaud; Pierre Monsan; Agnès Sabate; Catherine Garnier; Marguerite Dols-Lafargue; Patrick Lucas
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Universite de Bordeaux; Institut Polytechnique de Bordeaux
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Universite de Bordeaux; Institut Polytechnique de Bordeaux
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2020-03-16
Anticipated expiration: 2035-06-19
Also published as: FR3022556B1; PT3158062T; EP3158062A1; US10308724B2; US20170145120A1; WO2015193492A1; HUE045761T2; EP3158062B1; FR3022556A1

Abstract

Dextranos caracterizados por que tienen entre 95 % y 99 %, preferentemente entre 97 % y 98 %, preferentemente aún entre 97,4 % y 97,6 %, de enlaces glucosídicos α-1,6, una masa molar promedio en peso Mw al menos igual a 0,7.109 g.mol-1 y un índice de dispersión Di comprendido entre 1,3 y 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Dextranos que tienen una masa molar muy alta

Sector de la técnica

El objeto de la invención son dextranos que tienen una masa molar muy alta, al mismo tiempo que tienen un índice de dispersión bajo.

Estado de la técnica

Salvo que se indique lo contrario, en la presente invención, por "masa molar' o "masas molares promedio" se entiende que es la masa molar promedio en peso.

La invención también se refiere a una dextransacarasa que permite fabricar dichos dextranos, y a un procedimiento de fabricación de dichos dextranos.

Las glucansacarasas de origen bacteriano son transglucosilasas que pertenecen a las familias 13 y 70 de las glucósidohidrolasas. A partir de sacarosa, estas enzimas catalizan la síntesis de a-glucanos formados por de unidades de glucosilo. También pueden sintetizar oligosacáridos o glucoconjugados por reacción de transglucosilación en aceptores exógenos de diversa naturaleza. Las glucansacarasas tienen diferentes especificidades de productos, tanto a nivel de enlaces osídicos sintetizados (a-1,2; a-1,3; a-1,4 o a-1,6) como de la organización de estos enlaces en los productos formados.

De manera general, las bacterias lácticas, por ejemplo de los géneros Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus o Weissela sp., producen glucansacarasas.

Entre las glucansacarasas, las dextransacarasas producen dextrano, que generalmente tienen al menos un 50 % de enlaces osídicos a-1,6 en la cadena principal y ramificaciones en a-1,2, a-1,3 y/o a-1,4. El índice de ramificación y su disposición espacial varían según la enzima productora.

Los dextranos y derivados de dextrano tienen un número creciente de aplicaciones industriales, dependiendo de su tamaño.

Los dextranos de masa molar baja o media (que generalmente varía de 103 a 7.104 g mol'1) se utilizan principalmente para aplicaciones analíticas, por ejemplo, como soportes de cromatografía versátiles, en el campo de la medicina, por ejemplo, como un extensor de plasma sanguíneo gracias a su baja antigenicidad y baja viscosidad en solución salina, transportador de hierro o anticoagulante (después de la funcionalización), en la prevención de complicaciones postoperatorias, en el tratamiento de quemaduras o en la reducción del riesgo de trombosis o embolia.

La cepa NRRL B-512F de Leuconostoc mesenteroides, es uno de los microorganismos que más se han utilizado durante muchos años para la producción industrial de dextranos. Esta cepa permite obtener dextranos de masa molar muy alta, que varía de 106 a más de 108 g.mol -1. La enzima responsable de esta síntesis es la dextransacarasa denominada DSR-S. Este homopolímero de glucosa presenta 95 % de enlaces glucosídicos a-1,6 y 5 % de enlaces glucosídicos a-1,3 (1). Sin embargo, los dextranos producidos por la cepa NRRL B-512F de Leuconostoc mesenteroides, son muy polidispersos y tienen un comportamiento reológico y, principalmente, un poder viscosificante, que limita su uso como agente texturizante.

El gen que codifica la DSR-S ha podido clonarse en Escherichia coli (1,2), permitiendo la construcción de diferentes variantes de DSR-S. Principalmente, formas truncadas a nivel de los dominios N y C terminal de DSR-S sintetizan, directamente a partir de sacarosa, dextranos de masas molares controladas de 4,1.108, 40.103 o 1.103 g.mol-1. Uno de ellos, denominado DSR-S vardel A4N y producido en forma recombinante por Escherichia coli, cataliza, a partir de sacarosa, la síntesis de un dextrano de masa molar estimada de 4.1.108 g.mol-1 y está constituido por 96 % de enlaces a-1,6 y 4 % de enlaces a-1,3. La solución de dextrano obtenida con DSR-S vardel A4N presenta una viscosidad superior de un factor de 10 a 100 dependiendo del esfuerzo de cizalla aplicado en comparación con la obtenida con la enzima DSR-S, y presenta un comportamiento de reofluidificante. Por tanto, el dextrano obtenido con DSR-S vardel A4N es particularmente interesante para aplicaciones en el campo de los agentes texturizantes. Sin embargo, la viscosidad de este polímero disminuye bruscamente cuando se aplican esfuerzos de cizalla constantes de larga duración.

Por tanto, los dextranos producidos por las glucansacarasas conocidas hasta ahora, tienen inconvenientes, en particular, relacionados con índices de dispersión elevados o con masas molares promedio que no superan aproximadamente 108 g.mol-1, así como con propiedades reológicas, principalmente un poder texturizante, relativamente limitadas.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de nuevos dextranos cuyas propiedades permitan ampliar el campo de aplicaciones de este tipo de polímeros.

Objeto de la invención

Los inventores se atribuyen por tanto el mérito de haber elaborado dextranos que tienen una masa molar extremadamente elevada, significativamente superior a lo que hasta ahora se había realizado, al mismo tiempo que tienen un índice de dispersión bajo. Estas características les otorgan principalmente propiedades fisicoquímicas particularmente originales en comparación con los dextranos hasta ahora sintetizados.

Los dextranos de conformidad con la invención se caracterizan por que tienen entre 95 % y 99 %, preferentemente entre 97 % y 98 %, preferentemente aún entre 97,4 % y 97,6 %, de enlaces glucosídicos a-1,6, una masa molar promedio en peso Mw al menos igual a 0,7.109 g.mol-1 y un índice de dispersión Di comprendido entre 1,3 y 3.

Normalmente, para determinar la masa molar promedio en peso, se podrá utilizar el método descrito en los ejemplos.

Según una realización particular de la invención, los dextranos de conformidad con la invención tienen una masa molar promedio en peso Mw al menos igual a 1.109 g.moM. Normalmente, la masa molar promedio en peso Mw de los dextranos de conformidad con la invención es inferior a 5.1010, preferentemente inferior a 1.1010, preferentemente inferior a 5.109 g.mol-1.

Por tanto, los dextranos de conformidad con la invención tienen la ventaja de tener una masa molar extremadamente elevada y controlada, del orden de 10 veces superior al de los dextranos sintetizados hasta ahora.

Asimismo, los dextranos de conformidad con la invención tienen un índice de dispersión Di comprendido entre 1,3 y 3, preferentemente comprendido entre 1,5 y 2,5. Preferentemente aún, el índice de dispersión Di es de 1,8 ± 0,3. De esta manera, aunque su masa molar sea muy elevada, los dextranos de conformidad con la invención también tienen la ventaja de tener un índice de dispersión bajo. En comparación, un dextrano comercial de 2.106 Da tiene un índice de dispersión de 3,49 (11).

En el presente documento, un polímero o dextrano denominado "casi lineal", es un polímero o un dextrano cuyo índice de ramificación es bajo y/o cuyo coeficiente hidrodinámico ug está comprendido entre 0,44 y 0,52, preferentemente comprendido entre 0,46 y 0,50, preferentemente es de 0,48. De esta manera, los dextranos de conformidad con la invención tienen entre 95 % y 99 %, preferentemente entre 97 % y 98 %, preferentemente aún entre 97,4 % y 97,6 %, de enlaces glucosídicos a-1,6. Asimismo, los dextranos de conformidad con la invención tienen, de manera ventajosa, entre 1 % y 5 %, preferentemente entre 2 % y 3 %, preferentemente aún entre 2 % y 2,5 %, de enlaces glucosídicos a-1,3. De manera particularmente ventajosa, los dextranos de conformidad con la invención tienen 97,55 % de enlaces glucosídicos a-1,6 y 2,45 % de enlaces glucosídicos a-1,3. Los dextranos de conformidad con la invención son, por tanto, casi lineales.

Las características estructurales particulares de los dextranos según la invención les confieren propiedades fisicoquímicas particularmente interesantes, permitiendo su uso en numerosas aplicaciones, y principalmente en la industria petrolera, cosmética o agroalimentaria.

Con respecto a las propiedades reológicas, los dextranos de conformidad con la invención tienen una viscosidad dinámica elevada a bajas velocidades de cizalla y presentan un comportamiento de tipo reofluidificante o pseudoplástico, disminuyendo su viscosidad dinámica al aumentar el gradiente de velocidad (o velocidad de cizalla), como se describe en el ejemplo 12.

Por otro lado, la viscosidad de los dextranos de conformidad con la invención se ve poco afectada por los esfuerzos de cizalla constantes de larga duración, permitiendo que se adapten a procedimientos industriales en los que se requiere una agitación permanente. Por ejemplo, cuando el esfuerzo de cizalla se establece a 50 s_1 durante un período de aproximadamente 10 minutos, se observa una disminución de la viscosidad del dextrano en solución sintetizado por DSR-S vardel A4N, cosa que no ocurre en los dextranos de conformidad con la invención, principalmente sintetizados por la dextransacarasa DSR-OK recombinante como se revela en el Ejemplo 12.

Asimismo, los dextranos de conformidad con la invención tienen un umbral de flujo relativamente elevado, en particular comprendido entre 25 y 40 Pa, dependiendo de la cantidad inicial de sacarosa presente en el medio de reacción, como se muestra en el ejemplo 12.

Los dextranos de conformidad con la invención tienen un comportamiento débil similar a un gel. Esto se caracteriza por mediciones de reología en condiciones dinámicas, con detección de módulos elásticos o módulo de conservación G' y el módulo viscoso o módulo de pérdida G ". Para un gel, G' es superior a G" en el intervalo de frecuencia estudiado, como se observa en el ejemplo 12.

Finalmente, los dextranos de conformidad con la invención tienen temperaturas de transición vítrea de 95 °C para un contenido hídrico de 6,6 %, y de 25 °C para un contenido hídrico de 12,9 %. En otras palabras, para un contenido hídrico de aproximadamente 13 %, los dextranos según la invención tienen un estado correoso, flexible a temperaturas superiores a aproximadamente 25 °C y se consideran como "quebradizos" por debajo de aproximadamente 25 °C.

La presente descripción también se refiere a una nueva dextransacarasa, denominada DSR-OK, que permite sintetizar dextranos de conformidad con la invención.

Por tanto, un objeto de la presente descripción se refiere a una dextransacarasa cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID NO: 1.

La secuencia del ADN genómico de la cepa Oenococcus kitaharae DSM 17330 se publicó en 2012 con la referencia de Genbank n°CM001398.1 (whole genome shotgun sequence, secuencia hologenómica de escopeta) (4). En la base de datos del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica), el gen que codifica DSR-OK se describe como supuesta glucosiltransferasa (número de registro EHN59583).

Los inventores han descubierto sorprendentemente que esta secuencia proteica codifica una enzima, una dextransacarasa muy activa y particularmente interesante. Este resultado fue inesperado por varias razones.

En primer lugar, esta enzima se obtiene de una bacteria láctica, Oenococcus kitaharae DSM17330, aislada por primera vez en 2006 en subproductos de destilería del Shochu (3). Esta nueva especie, kitaharae, fue identificada en ese momento como una bacteria láctica perteneciente al género Oenococcus, pero alejada de Oenococcus oeni al no ser acidófila y al no realizar fermentación maloláctica. Asimismo, en el 2006, los investigadores llegaron a la conclusión de que cultivando esta cepa en un medio MRS, es decir, un medio tradicional para el crecimiento de bacterias lácticas, complementado con sacarosa, la cepa Oenococcus kitaharae DSM17330 no produce dextrano en el medio extracelular a partir de sacarosa. Por tanto, habría sido posible suponer que esta glucosiltranferasa es inactiva en sacarosa.

Finalmente, la secuencia de DSR-OK solo posee una identidad máxima de 58 % (en el 97 % de su secuencia) con la dextransacarasa DSR-N de Leuconostoc mesenteroides KIBGE IB-22 cuya secuencia está disponible en las bases de datos con el número de registro del Genbank AFP53921.1. En comparación con otras supuestas secuencias de glucansacarasas que pueden identificarse después de las campañas de secuenciación de genomas bacterianos, este porcentaje de identidad es bajo. Por otro lado, la base de datos CAZy, que recoge todas las enzimas activas en los azúcares, no menciona en absoluto esta cepa y este gen en la familia g H-70, familia de las glucansacarasas.

Por lo tanto, el experto en la materia no se ha planteado considerar esta supuesta enzima como una posible dextransacarasa interesante por sus propiedades catalíticas y por los dextranos sintetizados.

Los inventores han revelado finalmente las excepcionales propiedades de DSR-OK como dextransacarasa.

La dextransacarasa DSR-OK se compone de 1484 aminoácidos, que posee la triada catalítica DED y los 4 motivos conservados habitualmente descritos en las enzimas de la familia 70 de las glucósidohidrolasas. Los motivos proteicos conservados del núcleo catalítico (I a IV) se han identificado desde la posición 936 a la posición 942 para el motivo I, de la posición 458 a la posición 468 para el motivo II, de posición 495 a la posición 505 para el motivo III y de la posición 568 a posición 582 para el motivo IV. En comparación con la secuencia proteica de la glucansacarasa GTF-180, los cinco dominios estructurales tradicionalmente descritos para las glucansacarasas (A, B, C, IV y V) (5) pueden identificarse en la estructura primaria de DSR-OK (Figura 1).

La DSR-OK es una dextransacarasa muy específica de la polimerización a través de enlaces glucosídicos de tipo a-1,6 y es una excelente polimerasa. En efecto, como se observa en el ejemplo 5, los análisis cromatográficos realizados después de una síntesis de dextrano a partir de 100 g.M de sacarosa muestran que, para la producción de polímero, se utiliza aproximadamente un 89 % de unidades de glucosilo derivadas del sustrato.

Asimismo, la DSR-OK tiene una temperatura de funcionamiento óptima de aproximadamente 30 °C y un pH óptimo de aproximadamente 5,75. A 30 °C, esta dextransacarasa es estable y fuerte, siendo su semivida de aproximadamente 111 h durante una caracterización en medio sin procesar, es decir, no purificado, como se observa en la Figura 2. Esta propiedad es particularmente interesante y rara en las glucansacarasas. De esta manera, en comparación, la DSR-S vardel A4N, otra glucansacarasa recombinante, tiene una semivida de tan solo 24 horas en las mismas condiciones.

Por otro lado, la DSR-OK sigue un mecanismo Michaeliano, con una inhibición por exceso de sustrato, y es un catalizador con buen rendimiento en comparación con otras dextransacarasas similares, como se muestra en el ejemplo 8. Por ejemplo, la DSR-OK tiene una constante de afinidad, Km, de 8,99 mM y una constante catalítica, Kcat, de 550 s_1 (véanse las figuras 3 y 4). Por lo tanto, la enzima tiene una buena afinidad por el sustrato (Km), del mismo orden de magnitud que la mayoría de las dextransacarasas caracterizadas, y tiene una excelente constante catalítica (kcat), raramente observada en las glucansacarasas. Por lo tanto, la enzima es extremadamente eficaz para catalizar reacciones de polimerización a partir de sacarosa.

Finalmente, como se muestra en la figura 5, la constante de inhibición de DSR-OK se eleva a 1 M, lo que muestra que esta dextransacarasa está ligeramente inhibida por un exceso de sustrato. Esta característica permite su uso en procedimientos de síntesis de dextrano a partir de concentraciones de sacarosa iniciales muy variables según la masa molecular del dextrano deseado. En efecto, se sabe que el aumento en la concentración inicial de sustrato favorece la síntesis de dextranos de masas moleculares más bajas (2).

En la presente solicitud también se incluyen variantes de función conservadoras. Se denomina "variante de función conservadora", a una variante en la que, en una proteína, un resto (o más) de aminoácido dado, se ha modificado sin alterar la conformación global ni la actividad enzimática de la dextransacarasa, lo que permite sintetizar dextranos de conformidad con la invención. Normalmente, la modificación puede referirse a partes no sensibles de la enzima, y no se refiere principalmente a la triada catalítica.

De esta manera, una realización particular de la invención se refiere a variantes de función conservadora. Normalmente, dicha una variante de función conservadora es una dextransacarasa cuya secuencia de aminoácidos tiene al menos 80 %, preferentemente 85 %, preferentemente aún 90 %, preferentemente aún 95 %, preferentemente aún 98 % de identidad en las posiciones que van de la 359 a 1038 en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, que corresponde a los dominios A+B+C de la enzima, siempre que se conserve la actividad enzimática de la dextransacarasa, que permite sintetizar dextranos de conformidad con la invención.

Una dextransacarasa según la invención es una variante de la enzima dextransacarasa de secuencia SEQ ID NO: 1, siempre que esta sea una variante de función conservadora de la enzima.

Por lo tanto, un objeto de la invención se refiere a una dextransacarasa que tiene al menos 80 %, preferentemente 85 %, preferentemente aún 90 %, preferentemente aún 95 %, preferentemente aún 98 % de identidad con la secuencia que va de las posiciones 359 a 1038 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, no teniendo la dextransacarasa, como secuencia de aminoácidos, la secuencia SEQ ID NO: 1.

La actividad enzimática de una variante de dextransacarasa puede ensayarse según las técnicas conocidas por el experto en la materia, por ejemplo, mediante el método con ácido dinitrosalicílico (DNS) de Sumner y Howell (10) o mediante análisis de HPLC (siglas del inglés high performance liquid chromatography, cromatografía líquida de alto rendimiento).

Según un modo de realización particular, se puede preparar una dextransacarasa según la invención mediante técnicas conocidas de recombinación genética.

El experto en la materia sabrá cómo utilizar las tecnologías de biología molecular y podrá elegir un sistema de expresión adecuado según las técnicas conocidas. En este caso, se puede hacer referencia al ejemplo 2 a continuación.

La expresión "sistema de expresión" comprende una célula hospedadora y un vector compatible en condiciones apropiadas, es decir, condiciones que permiten la expresión de la proteína codificada por el ADN extraño transportado por el vector e introducido en la célula hospedadora. Normalmente, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una dextransacarasa, preferentemente una dextransacarasa DSR-OK tal como se ha descrito anteriormente o una variante de función conservadora, puede insertarse en un vector de expresión apropiado que después se introducirá en una célula hospedadora procariota o eucariota adecuada.

Un vector de expresión es normalmente un plásmido, un cósmido, un episoma, un cromosoma artificial, un fago o un vector vírico.

Normalmente, la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención puede realizarse en células hospedadoras procariotas o eucariotas. Como ejemplos no limitantes de cepas de células hospedadoras procariotas, pueden mencionarse cepas tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cepas de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Como ejemplos no limitantes de cepas de células hospedadoras eucariotas, pueden mencionarse cepas tales como las de los parásitos Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia) Leishmania o Trypanosoma, o células de levadura tales como Saccharomyces como Saccharomyces cerevisiae o pombe, Pichia pastoris etc.

Preferentemente, se utilizan células hospedadoras procariotas. Según un modo de realización ventajosa, las células utilizadas para la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención son Escherichia coli y, más preferentemente, las cepas se seleccionan entre TOP10, BL21AI, BL21 Star DE3, Arctic Express DE3.

De manera ventajosa, la dextransacarasa también puede comprender, en el extremo N terminal, una secuencia señal. Esta secuencia señal puede ser una de las secuencias señal conocidas por el experto en la materia, principalmente para que, cuando la proteína se sintetice en una célula hospedadora, la síntesis de dextrano pueda efectuarse extracelularmente. En efecto, la dextransacarasa DSR-OK no tiene péptido señal. La presencia de un péptido señal adecuado permite así la síntesis de dextrano extracelularmente. Además, las herramientas genéticas se están desarrollando cada vez más para la expresión heteróloga en microorganismos generalmente reconocidos como seguros (GRAS, por las siglas del inglés Generally Recognized ^ s Safe) de los géneros Bacillus y Lactococcus. De esta manera, actualmente existen diversos sistemas conocidos de excreción de proteínas recombinantes en estas bacterias, que el experto en la materia puede utilizar en este caso en cuestión.

Como se menciona en el ejemplo 2, la producción recombinante de dextransacarasa en Escherichia coli utilizando las condiciones descritas en el ejemplo 2, alcanza aproximadamente 30000 unidades de actividad enzimática por litro de cultivo, lo que permite su uso a bajo coste en procedimientos de síntesis de polímeros.

De esta manera, una dextransacarasa según la invención, puede prepararse cultivando células hospedadoras que contengan una secuencia de ácidos nucleicos que codifique una dextransacarasa, preferentemente una dextransacarasa DSR-OK tal como se ha descrito anteriormente o una variante de función conservadora, en condiciones que permitan la expresión de una dextransacarasa, y por aislamiento de dicha dextransacarasa del medio de cultivo según las técnicas conocidas por el experto en la materia.

Después, dichas dextransacarasas pueden purificarse mediante cualquier técnica de purificación conocida por el experto en la materia, por ejemplo, por precipitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio hidrófobo, filtración en gel, cromatografía HPLC de fase inversa, etcétera. Según un modo de realización preferido, la dextransacarasa obtenida mediante el cultivo de la célula hospedadora, se purifica por cromatografía de afinidad. También pueden inmovilizarse mediante técnicas conocidas por el experto en la materia, principalmente, por ejemplo, por adsorción, formación de enlace covalente entre el soporte y la proteína, inclusión o encapsulación.

Según otro modo de realización, una dextransacarasa según la invención puede prepararse directamente cultivando la cepa nativa Oenococcus kitaharae. La cepa Oenococcus kitaharae solo tiene un gen de dextransacarasa, que codifica la DSR-OK.

La invención también se refiere a la fabricación de dextranos de conformidad con la invención.

Por lo tanto, un objeto de la invención se refiere a un procedimiento de fabricación de dextranos de conformidad con la invención que comprende la reacción de una dextransacarasa de secuencia SEQ ID NO: 1, o una variante de función conservadora como se describió anteriormente, con sacarosa.

El experto en la materia sabrá cómo adaptar las condiciones de fermentación a aplicar para tener una producción optimizada de dextrano.

De manera general, la dextransacarasa debe incubarse en un medio de síntesis que contenga sacarosa.

Según un modo de realización particular, los microorganismos que secretan la dextransacarasa o extractos celulares de microorganismos que producen la dextransacarasa intracelularmente, pueden cultivarse o utilizarse en un medio que comprenda sacarosa, lo que conduce a la síntesis de dextrano según la invención.

Como se describió anteriormente, la síntesis de dextrano puede realizarse a partir de dextransacarasa nativa o dextransacarasa recombinante, purificada o no.

De esta manera, según otro modo de realización particular, una dextransacarasa recombinante, preferentemente la dextransacarasa DSR-OK o una variante de función conservadora, se incuba en un medio de síntesis que contenga sacarosa.

De manera ventajosa, la reacción se realiza a una temperatura comprendida entre 20 °C y 40 °C, preferentemente comprendida entre 25 °C y 35 °C, preferentemente aún comprendida entre 30 °C y 33 °C. Normalmente, la reacción se realiza a una temperatura de aproximadamente 30 °C.

El experto en la materia sabrá adaptar la duración de la síntesis, en particular, dependiendo de la cantidad de enzima añadida al medio de reacción y en función de la temperatura. Normalmente, la reacción se realiza durante un período comprendido entre 4 horas y 20 horas, preferentemente entre 8 horas y 16 horas, preferentemente durante un período de aproximadamente 12 horas.

Además, la concentración de sacarosa está comprendida, preferentemente, entre aproximadamente 50 y 200 g.M, preferentemente, entre aproximadamente 50 y 150 g.M. Normalmente, la concentración de sacarosa es de aproximadamente 100 g.M. De manera general, se sabe que será más probable que la masa molar promedio en peso del dextrano sintetizado se eleve utilizando una concentración inicial de sacarosa baja.

De manera ventajosa, durante la reacción, el pH está comprendido entre aproximadamente 5 y 6,5, preferentemente, entre 5 y 6, preferentemente aún entre 5 y 5,8. Normalmente, durante la reacción, el pH es de aproximadamente 5,75. Un objeto de la invención se refiere a una composición cosmética o alimentaria que comprende dextranos, tales como los descritos anteriormente y al menos un soporte farmacéuticamente aceptable o alimentario.

Los dextranos de conformidad con la invención podrán utilizarse en cualquier tipo de aplicación para la cual se adapten sus propiedades fisicoquímicas, por ejemplo, aplicaciones que requieren dextranos de masa molar alta y/o una viscosidad importante a baja cizalla, un comportamiento reofluidificante, con una viscosidad estable a lo largo del tiempo durante esfuerzos de cizalla constantes de larga duración, y que tienen un umbral de flujo relativamente elevado (del orden de 30 Pa).

Por tanto, los dextranos de conformidad con la invención pueden utilizarse en la industria petrolera, cosmética o incluso en la industria agroalimentaria.

Como ejemplos no limitativos, los dextranos de conformidad con la invención pueden utilizarse para mejorar la recuperación de petróleo. También pueden utilizarse en los campos de perforación y minería, por ejemplo, como agente floculante, como se describe en la solicitud FR 2 978 773 A. Los dextranos de conformidad con la invención también pueden utilizarse como agentes espesantes, gelificantes y/o texturizantes, por ejemplo, como sustituto de goma arábiga, o en productos como los productos gelificados, las salsas, para productos de panadería, confitería o para helados. Por ejemplo, se puede hacer referencia a la patente US 6627235 que describe la utilización de dextranos de masa molar alta en productos de panadería para mejorar la textura de los productos, así como su resistencia a la cocción y al endurecimiento.

Por lo tanto, un objeto de la invención se refiere al uso de dextranos de conformidad con la invención como agente espesante, gelificante y/o texturizante.

La invención también se refiere a hidrolizados de dextranos.

En el presente documento por "hidrolizado de dextrano" se entiende que es un dextrano de conformidad con la invención y que se somete a una o más etapas de tratamiento adicionales capaces de conferirle una masa molar controlada inferior a la masa molar alcanzada según la presente invención. El experto en la materia conoce dichos métodos. Por ejemplo, puede aplicarse una hidrólisis ácida seguida de fraccionamiento, principalmente, mediante disolventes orgánicos.

La invención también se refiere a reacciones de aceptor realizadas a partir de sacarosa y glucooligosacáridos añadidos al medio de reacción al comienzo de la síntesis (glucosa o maltosa, por ejemplo). El experto en la técnica conoce bien esta reacción de aceptor para promover la síntesis de dextranos de masas molares más bajas que a partir de sacarosa sola, y los productos obtenidos pueden tener aplicaciones similares a las de los dextranos obtenidos por hidrolizados.

Por tanto, los dextranos obtenidos, de menor tamaño, pueden utilizarse en todos los campos en los que sea apropiado una masa molar mas baja, por ejemplo, para aplicaciones farmacéuticas (sustituto de plasma sanguíneo, transportador de hierro o anticoagulante), para aplicaciones analíticas (soportes de cromatografía versátiles), en el campo médico (expansor de plasma sanguíneo) etc. También puede hacerse referencia a la publicación de Vettori et al. (6).

Un objeto de la invención se refiere a un procedimiento de fabricación de un hidrolizado de dextrano, en el que el dextrano de conformidad con la invención se somete a etapas de hidrólisis y de fraccionamiento.

La invención también se refiere a derivados de dextrano.

En el presente documento, por "derivado de dextrano", se entiende que es un dextrano de conformidad con la invención y que se somete a una o más etapas de modificación química conocidas, principalmente seleccionadas entre una eterificación, una esterificación o una reticulación. Por lo tanto, es posible obtener un derivado de dextrano tal como un dextrano reticulado, un éster de dextrano, por ejemplo, un éster inorgánico de dextrano (fosfato de dextrano, sulfato de dextrano) o un éster orgánico de dextrano, un éter de dextrano, por ejemplo, un éter de dextrano no iónico (dextrano alquilado, hidroxialquil éter o hidroxialquil aril éter de dextrina, éter de dextrano poli(etilenglicol) o un éter de dextrano iónico (sulfopropil dextrano, dextrano carboximetilado, dextrano 2-(dietilamino)etilo). Dichas técnicas de modificación química, así como las aplicaciones para las cuales los dextranos así obtenidos son adecuados, son muy conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, puede hacerse referencia al documento de Heinze et al (7) y a la tesis de Ndegwa Henry Maina (8).

Por lo tanto, un objeto de la invención se refiere a un procedimiento de modificación de un dextrano de conformidad con la invención, en el que el dextrano se somete a uno o más etapas de modificación química.

De manera ventajosa, una etapa de modificación química se selecciona entre una eterificación, una esterificación y una reticulación.

Descripción de las figuras

Figura 1: Representación esquemática de la estructura primaria de DSR-OK (basada en el alineamiento de proteínas con la enzima GFT180 de Lactobacillus reuteri 180). Se diferencian cinco dominios: dominio V en rojo, dominio IV en amarillo, dominio B en verde, dominio A en azul y dominio C en morado. La triada catalítica se indica con las letras blancas "D", "E" y "D".

Figura 2: Representación gráfica de la actividad relativa de la dextransacarasa DSR-OK a 30 °C en función del tiempo.

Figura 3: Determinación de la constante de inhibición por exceso de sustrato (variación de la inversa de la velocidad inicial en función de la concentración inicial del sustrato).

Figura 4: Representación gráfica de Michaelis-Menten (variación de la velocidad inicial de producción de fructosa en función de la concentración inicial de sustrato).

Figura 5: Representación gráfica de Linweaver-Burk (variación de la inversa de la velocidad en función de la inversa de la concentración de sustrato).

Figura 6: Espectro obtenido por RMN de protones en el dextrano sintetizado por DSR-OK recombinante. Las flechas corresponden a los enlaces a-1,3 y a-1,6.

Figura 7: Perfil de elución obtenido por AF4-MALLS (por las siglas del inglés Asymmetric Flow-Field-Flow-Fractionation - Multi-Angle Laser Light Scattering, Fraccionamiento asimétrico de flujo de campo de flujo con dispersión de luz láser de múltiples ángulos) (D1 = respuesta refractométrica, D1-Dl = dispersión de luz) y distribución en masa molar de dextrano producido por la preparación de DSR-OK recombinante (D1 Mw).

Figura 8: Perfiles de elución obtenidos por HPSEC de dextranos producidos a partir de 100 g.M de sacarosa por (a) la DSR-S nativa producida por la cepa NRRL B-512F de L. mesenteroides, (b) la enzima DSR-S vardel A4N recombinante y por (c) la enzima DSR-Ok recombinante. El pico 1 corresponde a dextrano de masa molar muy alta, el pico 2 corresponde a oligosacáridos con un grado de polimerización inferior a 7 y el pico 3 corresponde a la fructosa coproducida durante la reacción.

Figura 9: Representación del radio de giro (en nm) en función de la masa molar de diferentes dextranos: gcnl producido por un mutante DSR-S vardel A4N, el dextrano producido por DSR-OK y un dextrano comercial T2000 (Pharmacosmos) de 2.106 g.moM.

Figura 10: Comportamiento reológico del dextrano en función de la concentración de sacarosa midiendo la viscosidad del dextrano sintetizado por DSR-OK en el medio de síntesis sin procesar a partir de diferentes concentraciones de sacarosa: 50 g.M (•), 75 g.M (A), 100 g.M (■) y 150 g.M (o ).

Figura 11: Comportamiento reológico del dextrano purificado midiendo la viscosidad del dextrano sintetizado por DSR-OK, purificado por precipitación con etanol, y concentrado a 50 g.M en agua destilada.

Figura 12: Medición del umbral de flujo de dextrano producido por DSR-OK en el medio de síntesis sin procesar, a partir de 100 g.M de sacarosa por representación gráfica del índice de cizalla de dextrano a 33 g.M producido por DSR-OK en función del esfuerzo de cizalla aplicado.

Figura 13: Comportamiento reológico del dextrano producido por DSR-OK midiendo los módulos G' (•) y G" (o ) mediante barrido de frecuencia en condiciones oscilatorias (oscilaciones entre 10‘2 y 102 rad.s'1): comportamiento de tipo gel G'>G".

Figura 14: Comportamiento reológico de diferentes dextranos midiendo la viscosidad en función del esfuerzo de cizalla del dextrano producido en presencia de 100 g.M de sacarosa, por la DSR-OK recombinante (■), por la DSR-S nativa obtenida de la cepa Nr Rl B-512F (-) de L. mesenteroides, por la DSR-S vardel D4N (0).

Figura 15: Evolución de la viscosidad aparente de los dextranos en su medio de síntesis sin procesar sintetizados a partir de 100 g.M de sacarosa A: para la DSR-OK recombinante y B: para la DSR-S vardel D4N a un esfuerzo de cizalla constante de 50 s-1, a 20 °C y presión atmosférica ambiente.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1: Identificación del gen dsrok en el genoma de Oenococcus kitaharae DSM 17330 y análisis de la estructura primaria de la proteína correspondiente

El gen dsrok se ha identificado en el genoma de Oenococcus kitaharae DSM 17330 (disponible en la base de datos del NCBI con el número de registro NZ_CM001398) mediante blast nucleotídico contra una base de datos constituida por secuencias nucleotídicas de glucansacarasas clasificadas en la familia 70 de las glucósidohidrolasas según la CAZY (Carbohydrate Active enZYme, base de datos de enzimas activas sobre carbohidratos, www.cazy.org/GH70_all.html).

El gen se ha traducido a una secuencia de proteínas gracias al programa informático disponible en línea, Transeq de EMBOSS (www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/).

El programa informático SignalP versión 4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) ha previsto la ausencia de péptido señal.

Múltiples alineamientos de proteínas (con el programa informático de alineamiento global, ClustalW2, disponible en línea, www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) con otras glucansacarasas caracterizadas, han permitido identificar los motivos conservados del núcleo catalítico de DSR-OK y cortar la enzima en diferentes dominios proteicos ( A, B, C, IV y V).

Los diferentes porcentajes de identidad y de similitud entre secuencias proteicas, indicados en la ficha preliminar de la invención, se calcularon con la herramienta BlastP (Blast para proteína-proteína) del NCBI, disponible en línea y utilizando los parámetros predeterminados propuestos por el sitio.

Ejemplo 2: Clonación y expresión heteróloga de la proteína en Escherichia coli

En primer lugar, el gen dsrok se amplificó por PCR, a partir del ADN genómico de la cepa Oenococcus kitaharae DSM 17330, utilizando los dos cebadores mostrados en la tabla 1.

Tabla 1

La adición de las 4 bases, CACC, en la posición 5' del cebador directo, permitió la inserción correcta del fragmento de PCR en el vector de entrada pENTR/D/TOPO (Life Technologies), para después proceder a la clonación utilizando la tecnología Gateway.

Se seleccionó un clon de entrada positivo (vector de entrada que contenía el fragmento de PCR en la dirección deseada) y se recombinó con el vector de destino pET-53-DEST (Novagen) utilizando la mezcla II de enzima clonasa LR (Life technologies). Los clones recombinantes positivos se seleccionaron y analizaron por restricción. La ausencia de mutación dentro de los plásmidos se confirmó por secuenciación (GATC).

Para la producción de la enzima recombinante, células de Escherichia coli BL21 star DE3 se transformaron con el plásmido pET-53/DSR-OK construido como se indicó anteriormente. Se inocularon 300 pl de la mezcla de transformación en 30 ml de medio LB (caldo lisogénico), complementado con 100 pg.ml-1 de ampicilina e incubado durante la noche a 37 °C para preparar un precultivo.

Cultivos de IL en medio ZYM5052 modificado (glicerol al 1 %, glucosa al 0 %, lactosa al 1 %, Studier, 2005) se sembraron a una densidad óptica DO600 nm inicial de 0,05 a partir del precultivo del día anterior, y después se incubaron durante 24 horas a 23 °C y a 150 rpm. Al final de la fermentación, los medios de cultivo se centrifugaron (15 min, 6500 rpm, 4 °C) y los sedimentos se concentraron a una DO de 80 en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75.

Para obtener la enzima recombinante (producida por Escherichia coli intracelularmente), las células se degradaron con ultrasonido según el siguiente protocolo: 5 ciclos de 20 segundos al 30 % de la potencia máxima de la sonda, en frío, separados 4 minutos de descanso en hielo. El sobrenadante de la sonicación (que contiene la enzima recombinante soluble) se recupera después de 30 minutos de centrifugación (10000 rpm, 10 °C) y se conserva a 4 °C. La producción recombinante de dextransacarasa en Escherichia coli utilizando las condiciones descritas en este documento alcanza aproximadamente 30000 unidades de actividad enzimática por litro de cultivo, lo que permite su uso a bajo coste en procedimientos de síntesis de polímeros.

Ejemplo 3: Método de determinación de la actividad enzimática de la enzima DSR-OK.

Una unidad enzimática de glucansacarasa representa la cantidad de enzima que libera un pmol de fructosa por minuto, a 30 °C, a partir de 100 g.l-1 de sacarosa en tampón de acetato de sodio 50 mM, a pH 5,75.

La actividad se determina midiendo la velocidad de producción inicial de los azúcares reductores utilizando el método del ácido dinitrosalicílico (DNS). Durante una cinética, se toman 100 pl de medio de reacción y la reacción se detiene añadiendo un volumen equivalente de DNS. Después, las muestras se calientan durante 5 minutos a 95 °C, se enfrían en el hielo, se diluyen a la mitad en agua, y la absorbancia se lee a 540 nm. Un intervalo estándar de 0 a 2 g.l-1 de fructosa permite establecer la relación entre el valor de absorbancia y la concentración de azúcares reductores. Ejemplo 4: Determinación de las condiciones de trabajo óptimas de la enzima DSR-OK.

El valor de la temperatura óptima se determinó midiendo la actividad del extracto enzimático sin procesar, a diferentes temperaturas (entre 23 y 40 °C) a partir de 100 g.l-1 de sacarosa en tampón de acetato de sodio 50 mM, a pH 5,75. La enzima dextransacarasa DSR-OK recombinante tiene una temperatura óptima de 30 °C.

El efecto del pH sobre la actividad enzimática del extracto enzimático sin procesar se mide a 30 °C a partir de 100 g.l-1 de sacarosa, en tampón de citrato fosfato 50 mM, para valores de pH comprendidos entre 3,5 y 8 (intervalo de 0,5). La enzima dextransacarasa DSR-OK recombinante tiene un pH óptimo comprendido entre 5 y 5,8.

Ejemplo 5 - Determinación de los rendimientos de producción y de la actividad polimerasa de la enzima dextransacarasa DSR-OK recombinante.

Los rendimientos de producción se determinan por cromatografía de intercambio aniónico (HPAEC-PAD, siglas del inglés High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection, cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada), para una reacción enzimática a 1 U.ml-1 de DSR-OK, a partir de 100 g.l-1 de sacarosa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75. Los azúcares, glucosa, fructosa, leucrosa y sacarosa, se separan en una columna Dionex CarboPac PA-100 mediante un gradiente de acetato de sodio de 6 a 500 mM en 36 minutos, que contiene hidróxido de sodio (sosa) 150 mM. Se realizan intervalos estándar de 5, 10, 15 y 20 mg.kg-1 de estos azúcares y se permite su cuantificación.

Los rendimientos de producción, es decir, la parte de glucosa obtenida de la sacarosa, incorporada en la formación de glucosa, leucrosa y dextrano libres, se calcula de la siguiente manera:

([Glucosa]tf -[Glucosa]t0) * 342

%G glucosa = * 100

([Sacarosa]t0 -[Sacarosa]tf) * 180

([Leucrosa]tf -[Leucrosa]t0)

%G leucrosa = ----------- j - 1- ---------- r r j - * 100

([Sacarosa]t0 -[Sacarosa]tf)

El análisis de los productos de reacción por cromatografía de exclusión por tamaño (HPSEC) muestra que solo se sintetiza glucosa, leucrosa y dextrano de masa molecular muy alta. Como consecuencia de los problemas recurrentes de colmatado de las columnas durante el análisis con este polímero, la cuantificación directa del dextrano de masa molecular muy alta no es factible. El porcentaje de unidades de glucosilo incorporado en la síntesis de dextrano se dedujo de los análisis HPAEC-PAD de la siguiente manera:

%G dextrano = 100 % -(%G glucosa %G leucrosa)

En este caso, se ha revelado que la enzima es una excelente polimerasa. En efecto, los análisis cromatográficos (HPAEC-PAD y HPSEC-RI) realizados después de una síntesis de dextrano a partir de 100 g.l'1 de sacarosa, muestran que aproximadamente el 89 % (más exactamente, 86 % ± 5 %) de las unidades de glucosilo obtenidas del sustrato, se utilizan para la producción del polímero en las condiciones de producción estándar (100 g.l-1 de sacarosa, a 30 °C y a pH 5,75).

Solo se pierde el 2 % y el 9 % de estas unidades al incorporarse en la síntesis de glucosa y leucrosa libres, respectivamente.

Ejemplo 6 - Estudio de la estabilidad de la enzima recombinante DSR-OK.

Para estudiar la estabilidad de DSR-OK a 30 °C, la enzima (purificada o no) se llevó a una temperatura de 30 °C, inicialmente a 40 U.ml-1, en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75. La actividad residual se midió, a intervalos regulares, a partir de 100 g.l-1 de sacarosa, en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75, hasta la desnaturalización completa de la proteína. El tiempo de semivida corresponde al tiempo en el cual la enzima ha perdido la mitad de su actividad enzimática inicial.

Como se observa en la figura 2, el tiempo de semivida de la enzima DSR-OK a 30 °C es de 111 h ± 10 h durante una caracterización en medio sin procesar (no purificado). Por lo tanto, la enzima DSR-OK es muy estable, lo que es una propiedad particularmente interesante para una glucansacarasa de la familia 70 de las glucósidohidrolasas.

En comparación, la DSR-S vardel A4N, otra glucansacarasa recombinante, tiene un tiempo de semivida solo de 24 horas en las mismas condiciones.

Ejemplo 7 Purificación de la enzima recombinante DSR-OK por cromatografía de afinidad.

La enzima recombinante DSR-OK producida en Escherichia coli se fusiona a dos etiquetas de purificación 6xHis y Strep Tag II en los extremos N y C terminal respectivamente, para permitir una purificación por afinidad. Una purificación doble en una columna StrepTactin (afinidad por la etiqueta Strep Tag II), ha demostrado ser el método más eficaz y de excelente calidad.

Las purificaciones enzimáticas se realizan en el sistema ÁKTAxpress de GE Healthcare, en un recinto a 8 °C. En una columna Strep Tactin Sepharose High PerformanceTM de 5 ml (GE Healthcare), preequilibrada con tampón PBS 1X, NaCl 280 mM, pH 7,4, se inyectan 10 ml de extracto enzimático que contiene la proteína DSR-Ok etiquetada. Después de una hora de fijación en circuito cerrado, la elución se realizó a 4 ml.min-1, mediante un gradiente de D-destiobiotina de 0,05 a 2,5 mM en tampón de fijación (PBS 1X, NaCl 280 mM, pH 7,4) en 20 volúmenes de columna. La fracción purificada se desaló en una columna 10 DG (Biorad) preequilibrada con tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75, CaCl²0,05 g.M, Tween80 al 0,1 %. Para mejorar el factor de purificación y la calidad de la preparación enzimática pura, el extracto obtenido anteriormente se purificó nuevamente según estas mismas condiciones.

La concentración de proteína se midió a 280 nm en el espectrofotómetro Nanodrop 1000 3.7.1 de Thermo Scientific, fijando el coeficiente de extinción molar de la enzima DSR-OK a 224160 M^.cirr1 y su peso molecular a 165124 Da (preestablecido por el programa ProtParam de Expasy disponible en línea).

Ejemplo 8 - Determinación de los parámetros cinéticos de la enzima dextransacarasa DSR-OK recombinante.

Los parámetros cinéticos (Vm, Km y Kcat) se determinaron a 30 °C, en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75, complementado con 250 mg.M de BSA. Las velocidades iniciales se miden para concentraciones de sacarosa que varían de 2 a 600 mM, utilizando la enzima purificada a 1 U.ml'1 final. Se toman muestras a intervalos regulares, y la reacción enzimática se detiene calentando a 95 °C durante 5 min.

Después, las muestras se analizan por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en una columna Aminex Biorad HPX-87K (300*7,8 mm, BioRad). La temperatura del horno de la columna se mantiene a 65 °C y como eluyente se utiliza agua ultrapura a un caudal de 0,6 ml.min-1. Para permitir la cuantificación de los diferentes azúcares, se realizan intervalos estándar de 5, 10, 15 y 20 g.kg_1 de sacarosa, leucrosa glucosa y fructosa. La detección se realiza por refractometría.

La DSR-OK es una enzima michaeliana, los parámetros cinéticos, Vm y Km se determinan a partir de la representación gráfica de Lineweaver y Burk, según la ecuación — =

H— V- en la que [S] representa la concentración inicial de sacarosa y vi, la velocidad inicial.

Los parámetros cinéticos de la enzima se determinaron en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75, en presencia de BSA (250 mg.l'1 ) y a 30 °C.

Por lo tanto, se ha revelado que la DSR-OK, que sigue un mecanismo Michaeliano con una inhibición por exceso de sustrato, es un catalizador que tiene un buen rendimiento y una constante de afinidad Km de 9 mM ± 1 mM y una constante catalítica Kcat de 550 s_1 (figuras 3 y 4).

Estos valores son muy similares a los de la dextransacarasa DSR-S vardel A4N, que es una de las enzimas que tienen mejor rendimiento entre las glucansacarasas caracterizadas de la familia 70 de las glucósidohidrolasas (Km de 7,5 M y Kcat de 584 s_1).

Sin embargo, la DSR-OK se diferencia de la dextransacarasa DSR-S vardel A4N porque se inhibe mucho menos por exceso de sustrato. En efecto, como se muestra en la figura 5, su constante de inhibición solo se eleva a 1 M contra 0,326 M para la DSR-S vardel A4N.

EJEMPLO 9 - Síntesis de dextrano por la dextransacarasa DSR-OK recombinante.

Las síntesis de dextrano se realiza a partir de concentraciones variables de sacarosa (generalmente 100 g.M), a 30 °C en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75 y utilizando 1 U.ml’1 de enzima durante un período de 15 horas. Para la mayoría de los análisis, el polímero se purificó mediante dos precipitaciones con etanol al 50 %, seguido de dos lavados y de una resuspensión en agua ultrapura antes de liofilizarse.

EJEMPLO - 10 Análisis de la naturaleza de los enlaces de dextrano producidos por la dextransacarasa DSR-OK recombinante.

Después de la liofilización, 20 mg de dextrano purificado se diluyen en 0,5 ml de agua deuterada y se analizan mediante RMN de protón con el espectrómetro Bruker Avance (500 MHz). Después, los espectros se tratan e interpretan con el programa informático TOPSPIN 3.0.

de esta manera, se ha revelado mediante análisis de RMN, que el producto sintetizado a partir de 100 g.l-1 de sacarosa, a 30 °C, pH 5.75, es un polímero de unidades de glucosilo unidas al 97,6 % (± 0,2 %) en a-1,6 y al 2,4 % en a-1,3, como se muestra en la figura 6.

Se trata por tanto de un dextrano casi lineal, y esto demuestra nuevamente que la dextransacarasa DSR-OK es una dextransacarasa muy específica de la polimerización mediante enlaces osídicos de tipo a-1,6.

Ejemplo 11 - Determinación de las características macromoleculares del dextrano producido por la dextransacarasa DSR-OK recombinante.

La masa molar promedio en número y en peso, y la estructura del dextrano sintetizado por la DSR-OK, se analizaron mediante AFFFF-MALLS (Fraccionamiento asimétrico de flujo de campo de flujo con dispersión de luz láser de múltiples ángulos), a partir de medios de síntesis sin procesar según las condiciones de producción descritas en el ejemplo 9.

Las muestras se diluyeron 500 veces en agua que contenía azida sódica al 0,02 % y se filtraron a través de una membrana Durapore de 0,45 pm antes de la inyección (rendimiento de filtración > 90 %). El procedimiento es el mismo que el utilizado para caracterizar los dextranos de masa molar alta sintetizados por variantes de DSR A4N (9). De esta manera, las muestras se inyectan a 0,2 ml.min-1 durante un período de 300 s con un flujo cruzado de 1 ml.min-1. Una vez finalizada la inyección, las muestras se someten a un tiempo de relajación de 60 segundos. La elución se realiza con un flujo de arrastre de 0,84 ml.min-1, a un flujo cruzado constante de 0,1 ml.min-1 durante 3125 segundos, a temperatura ambiente. Los valores de las masas molares (Mi) y los de los radios de giro (Rgí) se determinan con el programa informático ASTRA versión 5.3.2.13 (Wyatt Technology).

A cada intervalo de tiempo (i), la respuesta refractométrica permite determinar la concentración Ci. La masa molar y el radio de giro se determinan por extrapolación de la relación de la difusión de la luz en ángulo cero, utilizando un diagrama de Berry según:

Donde, K es la constante óptica, Re, la relación de Rayleigh, A, la longitud de onda del rayo láser incidente, n el índice de refracción de la luz y 0, el ángulo de observación.

El programa informático ASTRA calcula directamente las masas molares promedio en peso (Mw) y en número (Mn), así como el radio de giro promedio en z (R^{g z}) según las siguientes relaciones:

S ^jC^¡

M „ =

£ S■ — M¡

S ^jCⁱM ⁱ

M w

£ ¡c i

S ^jCⁱM ⁱR ^

R^{2 _}

Gz _ S iCiM i

La relación Mw/Mn representa el índice de dispersión, Di.

La densidad (dGapp) se calcula a partir de la siguiente ecuación:

dGapp

donde Rgw representa el radio de giro promedio en peso.

El coeficiente hidrodinámico, ug, se determina a partir de la representación gráfica del radio de giro (Rgí) en función de la masa molar (Mi) y según la ecuación:

Rgí = K g - M ^

donde Kg es una constante.

El valor del parámetro de ramificación gM se calcula según con la siguiente relación:

d

K2 Gw(br)

9m = ^r--------K Gw(lin)

donde RGw(br) y RGw(lin) representan los radios de giro promedio en peso del polímero ramificado de su equivalente lineal de la misma naturaleza química y de la misma masa molar.

De este modo, analizando las características macromoleculares, se ha revelado que el dextrano tiene una masa molar promedio en peso Mw muy alta de aproximadamente 1,01.109 g.mol-1 (± 0,3.109 g.mol-1), como se observa en la figura 7.

La masa molar promedio en número también es elevada, es decir, Mn = 5,5.108 g.mol-1 (± 1,6.108 g.mol-1).

El índice de dispersión Di del dextrano producido por DSR-OK es, por tanto, de aproximadamente 1,8, lo que representa un índice muy bajo en comparación con los dextranos producidos hasta ahora.

Por ejemplo, en comparación con el dextrano producido por la cepa histórica NRRL B-512F de L. mesenteroides, y con el dextrano producido por la enzima DSR-S vardel A4N recombinante, el dextrano producido por la dextransacarasa DSR-OK es de mayor tamaño y es significativamente menos polidisperso que el dextrano nativo producido por la cepa NRRL B-512F de L. mesenteroides.

El radio de giro del polímero también es extremadamente elevado, del orden de 370 nm (figura 9). El coeficiente hidrodinámico, es decir, la pendiente del gráfico que representa el radio de giro en función de la masa molar (figura 9) es de 0,48. Este valor muestra que se trata de un polímero casi lineal, muy poco ramificado.

La Tabla 2 revela las principales características macromoleculares del dextrano producido por la DSR-OK recombinante.

Tabla 2

Ejemplo 12: Análisis del comportamiento reológico del dextrano producido por la dextransacarasa DSR-OK recombinante.

Curva de flujo y determinación del umbral de flujo de dextrano en su medio de síntesis sin procesar a partir de diferentes concentraciones de sacarosa.

Las síntesis se realizaron en un volumen total de 20 ml, a partir de diferentes concentraciones iniciales de sacarosa (50, 75, 100 y 150 g.l-1), en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,75, a 1 U.ml'1 de enzima. La temperatura y la agitación se establecieron a 30 °C y a 60 rpm. La reacción enzimática se realizó durante un período de 15 horas. Los análisis reológicos de dextrano (en su medio de síntesis sin procesar) se realizaron en el reómetro HAAKE MARS III de Thermo Scientific, controlado por el programa informático HAAKE RheoWin 4. Todas las mediciones se determinaron utilizando una geometría plano-plano (35 mm de diámetro), a un entrehierro de 0,5 mm, a 20 ° (MTMC MarslII peltier) y a presión atmosférica.

Las curvas de flujo se obtuvieron modificando el gradiente de velocidad de 10"1 a 103 s-1. Los valores de umbral de flujo se determinaron a partir de la representación gráfica trazando los valores de la tensión en función del gradiente de velocidad. El umbral de flujo está determinado por la tensión obtenida a la velocidad de cizalla más baja (que tiende hacia una meseta)

Curva de viscosidad y medidas viscoelásticas del dextrano purificado

El polímero, purificado por dos precipitaciones con etanol y liofilizado, se resuspende a 50 pl-1 en agua destilada y se solubiliza durante una noche a 25 °C, con suave agitación. Las propiedades reológicas se miden con un reómetro de deformación controlada (ARES, TA.) utilizando una geometría de plano cónico (5 cm de diámetro, ángulo de cono de 0,05 rad) a 20 °C y a presión atmosférica. La curva de flujo se determina modificando el gradiente de velocidad de 10 2 a 102 s-1. Los espectros mecánicos (módulos G' y G" en función de la frecuencia) se determinan dinámicamente, modificando la frecuencia de 10-2 a 102 rad.s-1, a una amplitud de deformación controlada ubicada en el dominio de viscoelasticidad lineal.

Se observa que el polímero de dextrano es muy viscoso a simple vista y que es necesario aplicar una fuerza para que fluya.

En la figura 10 se muestran las curvas de flujo determinadas a partir del medio de síntesis sin procesar para diferentes concentraciones iniciales de sacarosa (50, 75, 100 y 150 g.l-1) y en la figura 11 se muestran las curvas de flujo determinadas a partir de polímero purificado por precipitación con alcohol y preparado a una concentración del 5 % (p/v) en agua destilada.

En ambos casos, la viscosidad dinámica de la solución es muy elevada para velocidades de cizalla bajas (del orden de 100 Pa.s a 0,1 s-1, figuras 10 y 11). El polímero adopta un comportamiento reofluidificante o pseudoplástico, es decir, su viscosidad dinámica disminuye a medida que aumenta el gradiente de velocidad (o velocidad de cizalla).

Como se observa en la figura 14, el dextrano producido por la dextransacarasa DSR-OK tiene una viscosidad que es aproximadamente 500 veces mayor que la del dextrano nativo producido por la cepa NRRL B-512F de L. mesenteroides para esfuerzos de cizalla aplicados bajos. Asimismo, a diferencia de los dextranos producidos por DSR-OK o DSR-S vardel A4N, que son reofluidificantes, el dextrano nativo tiene un comportamiento newtoniano.

Además, El dextrano en solución tiene un umbral de flujo. De esta manera, se midieron umbrales de flujo de 26 Pa y 38 Pa para el dextrano en el medio de síntesis sin procesar a partir de 100 g.l-1 y 200 g.l-1 de sacarosa respectivamente (figura 12).

En comparación, el dextrano del medio de síntesis producido por la enzima DSR-S vardel A4N recombinante a partir de 100 g.l-1 tiene un umbral de flujo de 12 Pa.

Para productos que requieren un umbral de flujo, podrían utilizarse concentraciones bajas de dextrano, por ejemplo, como reemplazo de la solución de goma de xantano o de solución de guar, utilizadas como agentes espesantes y con umbrales de flujo a 10 g.l-1 de 7 y 4 Pa, respectivamente. Por lo tanto, el dextrano de conformidad con la presente invención puede utilizarse en productos de tipo dentífrico, salsas etc.

Ensayos de barridos de frecuencia, en condiciones oscilatorias, indican por otro lado que el polímero es un gel débil. En efecto, como se muestra en la figura 13, el módulo elástico G' es superior al módulo viscoso G" en el intervalo de frecuencias ensayadas, de 10-2 a 102 rad.s-1.

Finalmente, se observa que la viscosidad del polímero producido por DSR-OK se mantiene estable cuando se aplican tensiones de cizalla constantes de larga duración, mientras que la viscosidad del polímero producido por DSR-S vadel A4N disminuye en las mismas condiciones (figura 15). Por lo tanto, el dextrano de conformidad con la presente invención, puede utilizarse en procedimientos industriales en los que se requiere una agitación permanente.

Ejemplo 13: Determinación de la temperatura de transición vitrea y del contenido hídrico del dextrano producido por la dextransacarasa DSR-OK recombinante.

El polímero purificado por dos precipitaciones con etanol y liofilizado se equilibra a 57 % y 43 % de humedad relativa al colocarlo al vacío en presencia de soluciones saturadas de NaBr y K²CO³a temperatura ambiente durante una semana. Las temperaturas de transición vítrea (Tg) se determinan mediante un sistema de análisis de entalpía diferencial, el DSC Q100 (TA Instruments, Francia). El dispositivo está calibrado con indio. Las mediciones se efectúan en 2 a 30 mg de muestra utilizando cápsulas de aluminio selladas (TA Instruments, Guyancourt, Francia), calentadas de 0 a 120 °C a 3 °C min-1. Se realizaron dos escaneos de calentamiento, separados por una fase de enfriamiento de 0 °C a 10 °C min-1, para evitar cualquier firma debido al envejecimiento de la muestra. Como referencia se utiliza una cápsula vacía. La temperatura de transición vítrea (Tg) se toma en el punto de inflexión de cambio de capacidad calorífica.

El contenido hídrico se determina después de cada medición calorimétrica por análisis termogravimétrico (TGA) utilizando un sistema TGA2050 (TA). Instruments, New Castle, DE, U.S.A.). El contenido hídrico corresponde a la pérdida de masa cuando la muestra se calienta a 130 °C a 10 °C min-1 y después se mantiene a esta temperatura durante 40 minutos.

Los análisis de DSC (siglas del inglés Differential Scanning Calorimetry, calorimetría diferencial de barrido) permitieron determinar temperaturas de transición vítrea de 95 °C (± 1 °C) para un contenido hídrico de 6,6 % y de 25 °C (± 1 °C) para un contenido hídrico de 12,9 %.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Dextranos caracterizados por que tienen entre 95 % y 99 %, preferentemente entre 97 % y 98 %, preferentemente aún entre 97,4 % y 97,6 %, de enlaces glucosídicos a-1,6, una masa molar promedio en peso Mw al menos igual a 0,7.109 g.mol-1 y un índice de dispersión Di comprendido entre 1,3 y 3.

2. Dextranos según la reivindicación 1, caracterizados por que tienen una masa molar promedio en peso Mw al menos igual a 1.109 g.mol-1.

3. Dextransacarasa que tiene al menos 80 %, preferentemente 85 %, preferentemente aún 90 %, preferentemente aún 95 %, preferentemente aún 98 % de identidad con la secuencia que va de las posiciones 359 a 1038 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, no teniendo la dextransacarasa, como secuencia de aminoácidos, la secuencia SEQ ID NO: 1.

4. Procedimiento de fabricación de dextranos según la reivindicación 1 o 2, que comprende la reacción de una dextransacarasa que tiene como secuencia de aminoácidos la secuencia SEQ ID NO: 1, o al menos 80 %, preferentemente 85 %, preferentemente aún 90 %, preferentemente aún 95 %, preferentemente aún 98 % de identidad con la secuencia que va de las posiciones 359 a 1038 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 con sacarosa.

5. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 4, caracterizado por que la reacción se realiza a una temperatura comprendida entre 20 °C y 40 °C, preferentemente comprendida entre 25 °C y 35 °C, preferentemente aún comprendida entre 30 °C y 33 °C.

6. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 4 o 5, caracterizado por que la concentración de sacarosa está comprendida entre aproximadamente 50 y 200 g.l-1, preferentemente, entre aproximadamente 50 y 150 g.M.

7. Procedimiento de fabricación según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado por que durante la reacción el pH está comprendido entre aproximadamente 5 y 6,5, preferentemente entre 5 y 6, preferentemente aún entre 5 y 5,8.

8. Composición cosmética o alimentaria que comprende dextranos según la reivindicación 1 o 2 y al menos un soporte farmacéuticamente aceptable o alimentario.

9. Uso de dextranos según la reivindicación 1 o 2 como agente espesante, gelificante y/o texturizante.