ES2731528T3 - Adenovirus oncolíticos que tienen una proporción aumentada de la isoforma de escisión 156R de la proteína E1 B - Google Patents

Abstract

Un adenovirus recombinante en el que la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula cancerosa, y en el que el adenovirus recombinante lleva una mutación en la secuencia del gen E1B del adenovirus y la mutación en el gen E1B es A3216G en donde la numeración es relativa al genoma Ad5 del adenovirus (número de acceso) AC_000008.1) (SEQ ID NO: 41) (posición 1503 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)) o una mutación puntual de guanina en una posición equivalente a 3216 en cualquier otro serotipo de adenovirus.

Description

DESCRIPCIÓN

Adenovirus oncolíticos que tienen una proporción aumentada de la isoterma de escisión 156R de la proteína E1 B CAMPO TÉCNICO

[0001] Esta invención se refiere a adenovirus oncolíticos y su uso en el tratamiento de la enfermedad neoplásica. Más particularmente, la invención se refiere a mutaciones del gen E1B que modulan los niveles de isotermas de empalme de este gen, mejorando así el índice terapéutico del adenovirus oncolítico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Virus oncolíticos

[0002] La viroterapia oncolítica es una plataforma de tratamiento emergente para la terapia del cáncer. Los virus oncolíticos son virus que se replican selectivamente en las células cancerosas que poseen fenotipos oncogénicos específicos, matando así las células cancerosas y evitando las células normales. La investigación inicial se centró en los virus no patógenos de origen natural, sin embargo, estos estudios tuvieron un éxito limitado. Aunque se observó que el crecimiento del tumor disminuía y el tejido normal no estaba dañado, no hubo alteración en el curso de la enfermedad.

[0003] Estudios recientes, por lo tanto, se han centrado en la modificación de virus recombinantes que se dirigen selectivamente a células cancerosas. Un ejemplo de esta clase de virus diseñados son los adenovirus que están mutados en la región E1B del genoma viral.

E1B y p53 adenovirales

[0004] Una función del tumor p53 supresor de la proteína de mamífero es mediar la detención del ciclo celular y/o apoptosis en respuesta al daño del ADN o síntesis de ADN extraño. En consecuencia, algunos virus, como el adenovirus, codifican proteínas que desactivan p53 en las células infectadas para permitir una replicación viral eficiente. Una de estas proteínas, la proteína de 55 kiloDalton de la región E1B del adenovirus (E1B-55K o E1B-496R), se une a p53, causando una pérdida sustancial de p53. En consecuencia, esto previene la apoptosis mediada por p53 de la célula infectada. E1B-496R es, por lo tanto, esencial para la replicación adenoviral en células que contienen p53 funcional.

[0005] Las células tumorales humanas son frecuentemente homocigotas o heterocigotas para alelos de p53 mutados (por ejemplo, sustitución, deleción, cambio de marco mutado), y carecen de la función de p53 necesaria para el control normal del ciclo celular (Hollstein et al (1991) Science 253: 49; Levine y otros (1991) Nature; 351 (6326): 453-6). Muchas células neoplásicas son, por lo tanto, p53(-) porque carecen de niveles suficientes de p53 y/o porque expresan formas mutantes de p53 que son incapaces de una función sustancial de p53.

Adenovirus E1B mutados

[0006] Sieber T. (Dissertation, Universitat Regensburg, mayo de 2008, páginas 1-158) describe estudios sobre el mecanismo de corte y empalme en el gen E1B al hacer mutantes de adenovirus.

[0007] Adenovirus oncolíticos han sido diseñados que se aprovechan de la diferencia en la funcionalidad de p53 entre las células neoplásicas y normales. Al mutar la proteína E1B-496R para eliminar las interacciones de unión con p53 o al hacer varias deleciones dentro del locus E1B (ver, por ejemplo, US5,677,178), los adenovirus resultantes pueden replicarse y finalmente lisar las células cancerosas que carecen sustancialmente de la función de p53, pero no en células que poseen una función p53 normal.

[0008] Un ejemplo es ONYX-015 (dl1520 originalmente llamado y también referido como H101), un adenovirus mutante que no expresa la proteína E1B-496R (Heise et al (1997) Nat Med 3 (6): 639-645). El virus contiene un codón de parada inmediatamente después del codón de inicio de la traducción y también tiene una gran eliminación de la secuencia de codificación E1B-496R. Como resultado, este virus carece de la capacidad de unirse e inactivar p53 y, por lo tanto, solo puede replicarse eficientemente en células defectuosas en la función de p53, como las células neoplásicas y los tumores. Desafortunadamente, E1B-496R lleva a cabo otras funciones además de unir e inactivar p53 (Eager et al. (2001) Cancer Gene Ther. 18 (5): 305-317). En consecuencia, el virus ONYX-015 es defectuoso en la acumulación citoplásmica de los ARNm tardíos virales, el apagado de la célula huésped y la traducción de los ARNm tardíos. Por lo tanto, la mutación en ONYX-015 compromete la capacidad del virus mutante para reproducirse en las células tumorales. Un problema adicional es que las grandes eliminaciones desestabilizan el genoma viral.

[0009] Ejemplos adicionales son ONYX-051 y ONYX-053, adenovirus mutantes que contienen mutaciones puntuales (R240A y H260A, respectivamente) en la proteína E1B-496R que impiden su unión a p53. Estas mutaciones permiten que el virus se replique selectivamente en las células que tienen una función p53 deficiente, sin comprometer la capacidad del virus para replicarse en estas células (Shen et al. (2001) J. Virol. 75 (9): 4297-4307 y US 7.785.887).

[0010] Choi et al. (Advanced Drug Delivery Reviews (2012), 64: 720-729) revisa el desarrollo de los virus de la enfermedad para el tratamiento del cáncer.

[0011] Sin embargo, sigue habiendo una gran necesidad de mejorar los virus mutantes cuya capacidad oncolítica se ha mejorado y que son útiles en la terapia del cáncer.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0012] La invención proporciona un adenovirus recombinante en el que la proporción de la isoforma E1B-156r aumenta en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula de cáncer, y en el que el adenovirus recombinante lleva una mutación en la secuencia del gen E1B del adenovirus y la mutación en el gen E1B es A3216G en donde la numeración es relativa al genoma Ad5 del adenovirus (número de acceso AC_000008,1) (SEQ ID NO: 41) (posición 1503 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1) o una mutación puntual de guanina en una posición equivalente a 3216 en cualquier otro serotipo de adenovirus.

[0013] La invención también proporciona un polinucleótido que codifica el adenovirus recombinante de la invención, que es opcionalmente un vector adecuado para la producción de adenovirus en una célula huésped. La invención proporciona además una célula huésped aislada que comprende un polinucleótido que codifica el adenovirus recombinante de la invención.

[0014] La invención proporciona un adenovirus recombinante para uso en el tratamiento del cáncer, en el que el adenovirus recombinante se caracteriza porque la proporción de la isoforma E1B 156r aumenta en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalentes, y en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula cancerosa.

[0015] La invención también proporciona una composición que comprende un adenovirus recombinante para su uso como un agente terapéutico, en el que el adenovirus recombinante se caracteriza porque la proporción de la isoforma E1B 156r aumenta en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, y en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula de cáncer.

[0016] La invención proporciona además una composición que comprende un adenovirus recombinante para uso en el tratamiento de un paciente con cáncer, en el que el adenovirus recombinante se caracteriza porque la proporción de la isoforma E1B 156r aumenta en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente y en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula cancerosa.

[0017] La invención proporciona un método para hacer un adenovirus oncolítico mediante la modificación de la secuencia del gen E1B para aumentar el nivel de la isoforma de E1B-156r en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, en el que el gen E1B está mutado a A3216G donde la numeración es relativa al genoma Ad5 del adenovirus (número de acceso AC_000008,1) (SEQ ID NO: 41) (posición 1503 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)) o una mutación puntual de guanina en una posición equivalente a 3216 en cualquier otro serotipo de adenovirus.

DECLARACIÓN DETALLADA

[0018] Se ha encontrado ahora por el presente inventor de que modulando el nivel y tipo de isoformas de empalme del producto del gen E1B, expresado a partir del gen E1B, la actividad oncolítica de tales virus se puede mejorar. Por consiguiente, se describe un adenovirus recombinante en el que la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta con respecto a los niveles de tipo salvaje, en donde el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula cancerosa. El adenovirus recombinante puede llevar una mutación tal que la proporción de la isoforma E1B-156R se incremente en relación con los niveles de tipo salvaje, de modo que el adenovirus tenga un efecto oncolítico en una célula cancerosa. La mutación puede estar en la secuencia del gen E1B del adenovirus. Un virus de acuerdo con la invención es, por lo tanto, inhibido de la replicación en células no neoplásicas, pero es capaz de expresar un fenotipo de replicación en células neoplásicas, incluidas las células neoplásicas que carecen sustancialmente de p53 funcional.

[0019] En los ejemplos específicos de los adenovirus descritos en el presente documento, se cree que la sobreexpresión de E1B-156r es un desequilibrio causado por un sitio de empalme 93R mutado en el gen e 1b del adenovirus. La 156R es capaz de complementar algunas de las funciones de la 496R, pero no las esenciales para la oncoselectividad. A diferencia de los virus de la técnica anterior de tipo similar, los virus de acuerdo con la presente invención incluyen una región E3B funcional para una mejor eficacia in vivo. Por ejemplo, Onyx-015 carece de E3B. De hecho, el virus Onyx-015 y su selectividad son superados por los virus de acuerdo con la invención, en todos los aspectos. Además, la invención ha ensayado virus preparados según la invención en células normales y los resultados muestran que los virus tienen un perfil de seguridad excepcional, especialmente en comparación con el virus conocido Onyx-015.

[0020] Aquí, el término "virus de replicación inhibida" o "defectuoso en la replicación" se refiere a un virus que inhibe preferentemente la proliferación celular o induce la apoptosis en una población celular predeterminada que se transforma en un estado canceroso o neoplásico. Dicho virus es sustancialmente incapaz de inhibir la proliferación celular, inducir la apoptosis o expresar un fenotipo de replicación en células que comprenden niveles de función de p53 normales que son característicos de células no replicadas, no transformadas. Dichas células transformadas pueden carecer sustancialmente de la función p53, que admite la expresión de un fenotipo de replicación de virus. Sin embargo, la selectividad de los virus de acuerdo con la invención para el tejido neoplásico podría ser más general que solo para el estado de p53; el estado transformado como tal podría ser la base para la selección. Por ejemplo, se ha sugerido que la selectividad oncolítica observada con el virus ONYX-015 puede deberse a la capacidad de algunas líneas celulares de cáncer para soportar la exportación tardía de ARN viral desde el núcleo, una función que se pierde en ONYX-015 en células normales debido a la eliminación E1B-496R. Un mecanismo similar puede operar en los adenovirus recombinantes de la presente invención, que tienen niveles reducidos de proteína E1B-496R. Aún no está claro exactamente cómo un aumento en los niveles de E1B-156R en los adenovirus recombinantes de la presente invención da como resultado la selectividad oncolítica.

[0021] Típicamente, un virus de replicación inhibido de acuerdo con la invención presenta una disminución sustancial en la eficiencia de formación de placas en células que comprenden la función de p53 normal (para un ensayo adecuado, ver Wang, Y., G. Hallden, et al. (2003). "Las manipulaciones del gen E3 afectan la actividad del adenovirus oncolítico en modelos de tumores inmunocompetentes". Nature biotechnology 21 (11): 1328-1335). Otro ejemplo de un ensayo adecuado que se puede usar es un ensayo de citotoxicidad para medir la pérdida de células viables, utilizando por ejemplo un tinte de tetrazolio como MTT, XTT, MTS o WST (ver Berridge et al., Biotechnology Annual Review, 11: 127-152 (2005).

[0022] Tal como se utiliza aquí, el término "fenotipo de replicación" se refiere a una o más de las siguientes características fenotípicas de las células infectadas con un virus como un adenovirus inhibido por replicación: (1) la expresión sustancial de productos de los genes tardíos, tales como las proteínas de cápside (p. ej., polipéptido de base de penton adenovírico) o transcritos de ARN iniciados a partir de uno o más promotores de genes tardíos virales; (2) replicación de genomas virales o formación de intermediarios replicativos; (3) ensamblaje de cápsides virales o partículas de virión empaquetadas; (4) aparición de efecto citopático (CPE) en la célula infectada; (5) finalización de un ciclo lítico viral; y (6) otras alteraciones fenotípicas que suelen depender de la supresión de la función de p53 en células no neoplásicas infectadas con un virus de ADN competente para la replicación que codifica oncoproteínas funcionales. Un fenotipo de replicación según la presente invención comprende al menos una de las características fenotípicas enumeradas anteriormente, preferiblemente más de una de las características fenotípicas, tales como 2, 3, 4, 5, 6 o más características.

[0023] Las técnicas para la medición de estos fenotipos serán conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para evaluar la apariencia de CPE se describen en los ejemplos de este documento y se evalúan utilizando una dosis infectiva de cultivo tisular al 50% (TCID50) y el número de unidades formadoras de placa (pfu)/célula (recuento de células en el día de la infección).

[0024] El término "células neoplásicas" se refiere a células que exhiben un crecimiento relativamente autónomo, de forma que exhiben un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular. Las células neoplásicas comprenden células que pueden replicarse activamente o en un estado de reposo no replicativo temporal (G1 o G0); de manera similar, las células neoplásicas pueden comprender células que tienen un fenotipo bien diferenciado, un fenotipo pobremente diferenciado o una mezcla de ambos tipos de células. Por lo tanto, no todas las células neoplásicas están replicando necesariamente células en un punto de tiempo dado. El conjunto de células definido aquí como células neoplásicas consiste en células en neoplasias benignas y células en neoplasias malignas (o francas). Las células francamente neoplásicas se denominan con frecuencia cancerosas, típicamente carcinoma si se originan a partir de células de origen histológico endodérmico o ectodérmico, o sarcoma si se originan a partir de tipos de células derivados del mesodermo. Los términos célula neoplásica y célula cancerosa se usan indistintamente en este documento.

[0025] En este documento, el término "función de p53" se refiere a la propiedad de tener un nivel esencialmente normal de un polipéptido codificado por el gen p53 (es decir, respecto a las células no neoplásicas del mismo tipo histológico), en donde el polipéptido p53 es capaz de la unión al polipéptido E1B-496R de adenovirus de tipo salvaje. Por ejemplo, la función de p53 puede perderse por la producción de una forma inactiva (es decir, mutante) de p53 o por disminución sustancial o pérdida total de la expresión del polipéptido p53. La función de p53 también puede estar sustancialmente ausente en las células neoplásicas que comprenden alelos p53 que codifican un polipéptido de tipo salvaje; por ejemplo, una alteración genética fuera del locus p53, como las mutaciones que resultan en un procesamiento subcelular aberrante o la localización de p53 (por ejemplo, una mutación que resulta en la localización de p53 predominantemente en el citoplasma en lugar del núcleo) puede resultar en la pérdida de la función de p53. Muchas células neoplásicas son, por lo tanto, p53(-) porque carecen de niveles suficientes de p53 y/o porque expresan formas mutantes de p53 que son incapaces de una función sustancial de p53. En el contexto de la presente invención, la función clave de p53 es la capacidad de mediar la detención del ciclo celular y/o mediar la apoptosis en respuesta al daño del ADN o la síntesis de ADN extraño. Las células neoplásicas carecen de p53 funcional, si dicha reducción en la función de p53 impide el control normal del ciclo celular y la apoptosis. Esto puede consistir en una disminución de p53 localizada y expresada correctamente procesada, localizada y expresada que se puede unir a E1B-496R en 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 50 veces o más, en comparación con las células no neoplásicas correspondientes del mismo tipo. Por lo tanto, estas células se denominan "p53(-)”.

[0026] Se cree que las especies de adenovirus deficientes en la replicación que carecen de la capacidad de p53 complejo pero sustancialmente retienen otras funciones replicativas virales esenciales que exhibirán un fenotipo de replicación en células que son deficientes en la función de p53 (por ejemplo, células que son homocigotas para alelos p53 sustancialmente eliminados, o células que comprenden proteínas p53 mutantes que son esencialmente no funcionales, pero no exhibirán sustancialmente un fenotipo replicativo en células no neoplásicas no replicantes. Dichas especies de adenovirus inhibidos de la replicación se mencionan aquí por conveniencia como adenovirus deficientes en la replicación E1B-p53(-).

[0027] Un "virus oncolítico" es un virus que infecta preferentemente y lisa las células cancerosas. El efecto oncolítico se ve cuando la comparación de la eficacia en las células de cáncer frente a células normales. Un virus se considera oncolítico si la proporción de células cancerosas lisadas y células no cancerosas es 2:1, 4:1, 10:1,20:1, 50:1, 100:1 o más. Preferiblemente, un virus se identifica como oncolítico mediante la evaluación del índice oncolítico (ver más abajo). En este documento, el efecto oncolítico comprende a) infección viral de células; b) la replicación selectiva del genoma viral en células cancerosas (deficientes en la función de p53) que conduce a una lisis celular preferencial mediada por virus en células cancerosas (que puede ser deficiente en p53) y la liberación de partículas virales para futuros eventos de infección. El efecto oncolítico se puede medir utilizando varios ensayos. En estos ensayos se debe usar un virus de control, a menudo la versión de tipo silvestre/natural. Como tal, se puede usar cualquiera de los siguientes ejemplos de ensayos: MTS (citotoxicidad), TCID50 (capacidad de replicación), ensayos de LDH (lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima estable, presente en todos los tipos de células, y se libera rápidamente en el medio de cultivo celular tras el daño de la membrana plasmática), FACS (clasificación celular), transferencia western y QPCR (expresión génica tardía o número de copia del genoma). Otros ejemplos serán claros para los expertos en la técnica.

[0028] Una ventaja de un virus de acuerdo con la presente invención es que un virus de este tipo tiene aberraciones genéticas mínimas. Las mutaciones puntuales (incluidas las inserciones, las eliminaciones, las adiciones y las sustituciones) son mejores para la salud del virus. Los cambios más grandes ponen una tensión evolutiva en el virus. Además, el tamaño genómico y la integridad pueden ser importantes.

[0029] Un virus de acuerdo con la presente invención tiene un índice de selección cáncer o el índice de oncolítico (los dos términos son intercambiables) que se ha mejorado mucho en comparación con los virus oncolíticos existentes que están disponibles, tales como el virus H101. Esto se refiere a la capacidad de replicación en células normales en comparación con las células cancerosas, que puede expresarse de acuerdo con la siguiente ecuación:

(OVc/OVn)/(WTc/WTn) = Índice de selección de cáncer

en donde OV = capacidad de replicación del virus oncolítico; WT es la capacidad de replicación del virus de control; c es células cancerosas; n es células normales.

[0030] Un virus de acuerdo con la invención puede tener un índice de selección de cáncer de entre 2 y 10.000, dependiendo del tipo de célula, preferiblemente entre 5 y 5000, 10 y 1000, o 50 y 500. En el caso de un ejemplo representativo de un virus de acuerdo con la invención, Ixovex, este virus exhibe un índice de selección de cáncer frente al control de 3,5 en células HeLa; 14 en células A549; 2000 en células H1299 y 450 en células H460. En los mismos tipos de células, los valores para el virus Onyx-015 frente a Ixo-ctrl son HeLa = 0,1x; A549 = 0,1x; H1299 = 0,05x; y H460 = 0,004x. Como tal, es posible aplicar un virus de acuerdo con la invención a la mayoría de los tipos de tumores. Una teoría es que los virus oncolíticos de la invención son selectivos para el estado negativo de p53 y las células que se replican rápidamente.

[0031] Además, un virus de acuerdo con la invención será objeto de defensa inmune del huésped y en última instancia será limpiado, esto antes de la erradicación completa del tumor. Esto no solo se presenta como una forma de eliminar el virus, lo que anula cualquier posible toxicidad para el hígado como resultado de una sobrecarga viral, sino que también brinda la posibilidad de inducir una respuesta inmune contra el cáncer en el huésped, ya que se alertará al sistema inmunitario de la presencia viral en el tumor.

Adenovirus

[0032] Un virus de acuerdo con la invención es un adenovirus recombinante. Al momento de escribir este artículo, hay más de 65 serotipos descritos en humanos (HAdV-1 a 65) distribuidos en siete especies (adenovirus humano A a G) y tantos de otros mamíferos y aves (ver Strauss, "Infecciones por adenovirus en humanos", en The Adenoviruses (1984) ed. Ginsberg, pp. 451-596 Plenum Press, Nueva York. Para una descripción general de la biología del adenovirus, ver Virology, Segunda edición, eds. Fields y Knipe. Vol,2, pp1651-1740, Raven Press, Nueva York). El término "adenovirus" como se usa en el presente documento, abarca cualquiera de estas especies de adenovirus. Preferiblemente, un adenovirus según la invención es un adenovirus humano del grupo C de subfamilia, a saber, uno de los serotipos 1,2, 5, 6 o 57. Más preferiblemente, el término adenovirus se aplica a dos serotipos humanos, Ad2 y Ad5.

[0033] En una realización preferida de la invención, el adenovirus es un adenovirus de serotipo Ad5. El adenovirus puede ser adenovirus serotipo Ad5 cepa pTG3602. La cepa pTG3602 tiene aproximadamente 15 mutaciones puntuales dispersas a lo largo del genoma de adenovirus de 35.000 nucleótidos, sin embargo, ninguna de estas mutaciones está dentro del gen E1B. En este documento, el adenovirus tipo 5 proporciona un punto de referencia común para la convención de numeración de nucleótidos de los polinucleótidos virales y la numeración de aminoácidos de los polipéptidos codificados por virus en la región del gen viral E1B. Los expertos en la materia identificarán fácilmente las posiciones correspondientes en otros serotipos adenovirales. En este documento, el término "recombinante" indica que una construcción polinucleotídica (por ejemplo, un genoma de adenovirus) se ha generado, en parte, por modificación intencional por parte del hombre.

Gen E1B

[0034] El virus de acuerdo con la invención lleva una mutación en la secuencia del gen E1B. Todos los serotipos codifican un gen al que se hace referencia a través de los serotipos como región temprana 1B (E1B), que codifica los productos génicos de la fase temprana de la replicación del a Dn . En este documento, el "gen E1B" se refiere a la unidad de transcripción de longitud completa del gen E1B en cualquier adenovirus, preferiblemente adenovirus humano. Un ejemplo representativo de un gen E1B es el del adenovirus tipo 5 (Ad5) que tiene la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. El lector experto conocerá otros ejemplos y los detalles se pueden encontrar en las bases de datos de uso común, como, por ejemplo, Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene). En el adenovirus humano tipo 5, la región de codificación E1B comienza en el número de nucleótido genómico 1714 y termina en el sitio poliA E1B en el número de nucleótido genómico 4043. Hay regiones similares en todos los adenovirus ensayados hasta ahora, por ejemplo, incluyendo especies tan diversas como la oveja, serpiente e incluso adenovirus murciélago.

[0035] La unidad de transcripción E1B del adenovirus humano codifica al menos cinco isoformas de empalme diferentes (véase la Figura 2) (Takayesu et al (1994) J. Gen. Virol. 75: 789-798). Nuevamente, dando el ejemplo de Ad5, el principal ARNm precursor de E1B de 2.28 kb codifica dos marcos de lectura superpuestos, uno para la proteína E1B-19K de 176 residuos (E1B-176R) y el otro para la proteína E1B-55K (496 residuos; E1B-496R). Las isoformas E1B-156R, E1B-93R, E1B-84R (nombradas por el número de aminoácidos en el producto expresado) se generan mediante un empalme alternativo del ARNm precursor para E1B-496R, entre un donante de empalme común (SD1) y uno de los tres sitios aceptores de empalme (SA1-3). Los ARNm resultantes codifican los 79 aminoácidos del término N de E1B-496R, y mientras que E1B-93R y E1B-84R tienen términos C únicos, E1B-156R se completa con los 77 residuos C-terminales de E1B-496R. El empalme alternativo se explica en Kelemen, O., P. Convertini, et al. (2012). "Función de empalme alternativo". Gene. Será evidente para la persona experta que las isoformas E1B en otros serotipos de adenovirus pueden tener longitudes ligeramente diferentes a las analizadas anteriormente para Ad5 (por ejemplo, el equivalente de E1B-156R en Ad2 tiene una longitud de 155 aminoácidos y, por lo tanto, a menudo se denomina 155r ). Aquí, los nombres de las isoformas E1B-156R, E1B-93R, E1B-84R, E1B-176R y E1B-496R se refieren a la isoforma equivalente del mismo tamaño aproximado en todos los adenovirus, independientemente del número real de aminoácidos en la isoforma equivalente.

[0036] Se ha confirmado que existe la isoforma E1B-156r en una amplia sección transversal de variantes de adenovirus, mediante el uso de PCR para amplificar los ADNc específicos para E1B-156r utilizando cebadores de inicio y parada específicos para cada gen E1B-55K respectivo (Fig. 14). Nuestros experimentos muestran patrones de empalme similares en virus representativos de cada uno de los diferentes géneros (A-Ad12, B1-Ad3, B2-Ad11, C-Ad5, D-Ad37, E-Ad4 y F-Ad40). De hecho, Ad1wt y Ad57wt tienen secuencias de proteínas E1B-156R idénticas; Ad2wt y Ad6wt también tienen secuencias idénticas; y Ad5wt difiere solo un poco de todos ellos. Esto hace que solo tres secuencias de proteínas E1B-156R diferentes en toda la subfamilia C difieran en un total de cinco posiciones de aminoácidos individuales y en la longitud de un estiramiento interno de polialanina. Por lo tanto, se espera que los resultados demostrados en este documento en los serotipos Ad2 y Ad5 se reflejen en otras variantes de adenovirus.

[0037] Una serie de experimentos de complementación se han realizado para demostrar que un aumento de E1B-156r es responsable (por lo menos en parte) para el aumento del índice oncolítico (OI) que se ha observado, de manera que la sobreexpresión de la Ad5-156R da un aumento potente en la OI de los adenovirus en general. En las Figuras 11A, B y C y en la Figura 12 en este documento, se muestra que el adenovirus tipo 5 E1B-156R es un potente potenciador de la OI en el grupo C de la subfamilia. Además, el equivalente E1B-156R de Ad2wt mostró un positivo efecto en la OI de Ad5wt, lo que significa que el efecto parece no estar limitado a un serotipo de adenovirus en particular.

[0038] En este documento, la isoforma E1B-156r de Ad5 humano tiene la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y la secuencia de polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3. En este documento, la isoforma 496R tiene la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 4 y una secuencia de polipéptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5. En este documento, la isoforma E1B-93R tiene la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 y la secuencia de polipéptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 7. En este documento, la isoforma E1B-84R tiene la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 y la secuencia de polipéptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 9. El lector experto apreciará que existe un grado de variación en la secuencia en las variantes virales naturales; por consiguiente, la invención abarca secuencias de isotermas que difieren de las secuencias específicas expuestas en las secuencias de referencia referidas aproximadamente, pero son 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más homólogas o idénticas a esas secuencias, según lo calculado por los programas comunes de alineación de secuencias, por ejemplo, BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), que puede ser el nucleótido BLAST (blastn) o la proteína BLAST (blastp). Se dice que dos secuencias son "homólogas", como se usa el término en este documento, si una de las secuencias tiene un grado suficientemente alto de identidad o similitud con la otra secuencia. "Identidad" indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el nucleótido es idéntico entre las secuencias. La "similitud" indica que, en cualquier posición particular en las secuencias de polipéptidos alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Los grados de identidad y similitud se pueden calcular fácilmente (Biología Molecular Computacional, Lesk, AM, editor, Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputación. Informática y proyectos del genoma, Smith, DW, editor, Academic Press, Nueva York, 1993; Análisis por computadora de los datos de secuencia, Parte 1, Griffin, AM y Griffin, HG, eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Análisis de secuencia en biología molecular, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991).

[0039] Por consiguiente, las realizaciones de la invención incluyen adenovirus recombinantes variantes en los que la isoforma E1B-156R tiene una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia para SEQ ID NO: 3; donde la isoforma E1B-496R tiene una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 y una secuencia de polipéptidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5; donde la isoforma E1B-93R tiene una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 y una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7; y donde la isoforma E1B-84R tiene una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8 y una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9. Ejemplos representativos de las secuencias de isoformas E1B 156R variantes se dan aquí (Fig. 13). Las secuencias equivalentes incluidas para Ad5 E1B-156R son aquellas con 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más identidad con las secuencias proporcionadas en la FIG. 13 (como se describe anteriormente para Ad5).

Modulación de los niveles de isoformas por modificación.

[0040] Según la descripción, el nivel y/o el tipo de isoformas de empalme del producto del gen E1B, expresada a partir del gen E1B, se modifica, y como resultado los virus se vuelven oncolíticos. Los niveles y/o tipos de isoformas E1B pueden modularse por cualquier medio, por ejemplo, utilizando ribozimas diseñadas para escindir específicamente los ARNm de isoforma E1B en posiciones seleccionadas y, por lo tanto, evitar la traducción de los ARNm en polipéptidos funcionales. Los métodos alternativos serán evidentes para los expertos en la técnica, e incluyen la inserción de múltiples copias de la secuencia del gen E1B, o formas que codifican E1B-156R; activación de la regulación de la expresión del gen E1B, o formas que codifican E1B-156R, por ejemplo, mediante la modulación de secuencias promotoras o potenciadoras; inserción de secuencias reguladoras, etc.

[0041] En el presente documento se describen ejemplos de adenovirus variantes que incluyen una o más mutaciones en las regiones de empalme del gen E1B que logran este efecto. Como se sabe que el reconocimiento del sitio de empalme por el spliceosoma se ve afectado por la estructura secundaria del ARNm, las mutaciones en el gen E1B que afectan la estructura secundaria de su ARNm también pueden modular los niveles y tipos de isoformas E1B. Por ejemplo, la mutación puede eliminar un sitio de empalme cambiando la secuencia de polinucleótidos y polipéptidos del gen E1B; o puede eliminar un sitio de empalme cambiando la secuencia polinucleotídica del gen E1B y conservando la secuencia polipeptídica original.

[0042] Este efecto se puede lograr cuando el gen E1B está mutado en una o más de las regiones de reconocimiento de corte y empalme que comprende: a) el sitio donante de corte y empalme 1 (SD1); el aceptador de empalme E1B-93R (SA1); c) aceptador de empalme E1B-156R (SA2); d) aceptador de empalme E1B-84R (SA3); y/o e) empalme el sitio donante 2 (s D2).

[0043] En el caso del ejemplo de Ad5, estos sitios de empalme se encuentran en las siguientes posiciones y tienen las siguientes secuencias: SD1 tiene la secuencia de GTGGC en la posición 2251 a 2255 del genoma Ad5 (posición 2256 a 2260 del número de acceso del genoma Ad5 AC_000008,1 (SEQ ID NO: 41) y posición 543-547 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)). El aceptador de empalme E1B-93R (SA1) tiene la secuencia AACAG en la posición 3218-3222 del genoma Ad5 (posición 3213-3217 del número de acceso del genoma Ad5 AC_000008,1 (SEQ ID NO: 41) y la posición 1500-1504 en el Gen E1B (SEQ ID NO: 1)). El aceptador de empalme E1B-156R (SA2) tiene la secuencia TTGAG en la posición 3276-3280 del genoma Ad5 (posición 3271-3275 del número de acceso del genoma Ad5 AC_000008,1 (SEQ ID NO: 41) y la posición 1558-1562 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)). El aceptador de empalme E1B-84R (SA3) tiene la secuencia TGCAG en la posición 3595-3599 del genoma Ad5 (posición 3590-3594 del número de acceso del genoma Ad5 AC_000008,1 (SEQ ID NO: 41) y la posición 1877-1881 en el Gen E1B (SEQ ID NO: 1)). El sitio donante de empalme 2 (SD2) tiene la secuencia GTACT en la posición 3506-3510 del genoma Ad5 (posición 3511-3515 del número de acceso del genoma Ad5 AC_000008,1 (Se Q ID NO: 41) y posición 1798-1802 en la E1B gen (SEQ ID NO: 1)). Los sitios equivalentes en posiciones equivalentes en otros serotipos humanos serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, imbuidos de las enseñanzas de este documento.

[0044] Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación es un adenovirus recombinante en el que las regiones de reconocimiento de empalme del gen E1B se mutan en una o más de las siguientes posiciones en el genoma de Ad5: a) nucleótido 3216 del genoma de adenovirus Ad5 (número de acceso AC_000008.1) (SEQ ID NO: 41) (posición 1503 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1); b) nucleótido 3218 del genoma Ad5 del adenovirus (número de acceso AC_000008,1) (SEQ ID NO: 41) (posición 1505 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1) y/o c) nucleótido 3221 del genoma Ad5 del adenovirus (número de acceso AC_000008,1) (SEQ ID NO: 41) (posición 1508 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1) En algunos aspectos de la divulgación, el gen E1B puede contener una o más de las siguientes mutaciones: a) A3216G en el genoma Ad5 del adenovirus (posición 1503 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)); b) G3218A en el genoma Ad5 de adenovirus (posición 1505 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)); y/o c) G3221A en el genoma Ad5 de adenovirus (posición 1508 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)). En este documento, las posiciones de todas las mutaciones puntuales se numeran de acuerdo con el número de acceso del genoma de Ad5 AC_000008,1 (SEQ ID NO: 41).

[0045] La siguiente tabla identifica las secuencias y posiciones de las regiones de reconocimiento de corte y empalme del gen de E1B en el genoma de Ad5. La "posición del genoma del Ad5" y la "posición del gen E1B" corresponden a los cinco residuos inmediatamente aguas arriba de los sitios donantes de empalme (SD1 y SD2), e inmediatamente

aguas abajo de los sitios aceptores de empalmes (SA1, SA2 y SA3).

[0046] La "barra diagonal" indica el sitio de empalme real.

[0047] La mutación de la secuencia viral dentro de las regiones de reconocimiento de empalme del gen E1B puede involucrar a) eliminar un sitio de empalme cambiando la secuencia polinucleotídica y polipeptídica del gen E1B; o b) eliminar un sitio de empalme cambiando la secuencia de polinucleótidos del gen E1B y conservando la secuencia polipeptídica original. Como apreciarán los expertos, existe una redundancia en el código genético, es decir, algunos aminoácidos están codificados por múltiples codones. Las secuencias de sitios de empalme pueden eliminarse del ARNm de E1B transcrito mutando el ADN adenoviral correspondiente para usar uno o más codones alternativos para los aminoácidos que codifica la secuencia de polinucleótidos en estos sitios. Por lo tanto, la proteína traducida resultante preferiblemente no contendrá ningún cambio de aminoácidos. La siguiente tabla de codones muestra la redundancia en el código genético.

[0048] El aumento de los niveles de la isoforma E1B-156r se consiguen como resultado de un sitio de empalme 93R mutado en el gen E1B.

[0049] En una realización preferida de la descripción, las regiones de reconocimiento de empalme de genes E1B están mutados en una o más de las siguientes posiciones: a) nucleótido 3216 (por ejemplo, cagGAGG -> cggGAGG) del genoma Ad5 del adenovirus (número de acceso AC_000008,1) (SEQ ID NO: 41); b) el nucleótido 3218 del genoma Ad5 de adenovirus (número de acceso AC_000008,1) (SEQ ID NO: 41); y/o c) el nucleótido 3221 del genoma Ad5 del adenovirus (número de acceso AC_000008,1) (SEQ ID NO: 41). Las mutaciones equivalentes en otros serotipos de adenovirus serán claras para el lector experto.

[0050] En una realización más preferida de la descripción, el gen E1B contiene una o más de las siguientes mutaciones: a) A3216G (cagGAGG -> cggGAGG); b) G3218A; y/o c) G3221A, correspondiente a las posiciones 1503, 1505 y 1508 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1) respectivamente. Las mutaciones equivalentes en otros serotipos de adenovirus serán claras para el lector experto.

Niveles de ¡soformas

[0051] Cualquier mutación como la descrita se introduce en la secuencia de un genoma de adenovirus debería tener el efecto que la proporción de al menos una de las isoformas de empalme E1B, E1B-156R, E1B-496R, E1B-93R y E1B-84R, (y potencialmente dos, tres o las cuatro isoformas) varía con respecto a los niveles que están presentes en el tipo salvaje en condiciones similares. Preferiblemente, la proporción de la isoforma E1B-496R se reduce en relación con los niveles de tipo salvaje, o incluso se apaga totalmente. Alternativamente, la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta con respecto a la isoforma E1B-496R, la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta con respecto a la isoforma E1B-93R y/o la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta en relación a la isoforma E1B-84R. Estos cambios en los niveles de isoformas particulares tienen el efecto de mejorar la oncolisis, que también puede expresarse como un aumento del índice oncolítico.

[0052] En un virus de acuerdo con la invención, el nivel de la isoforma de E1B-156r se incrementará en relación con el E1B-156r en la secuencia de adenovirus de tipo silvestre equivalente. En este documento, "incrementado" significa que la proporción de la isoforma E1B-156R se incrementa al menos 2 veces, 4 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 1,000 veces o 10,000 veces en relación con los niveles de tipo salvaje.

[0053] En este documento, "disminución" significa que la proporción de la isoterma de E1B-496R se reduce al menos 2 veces, 4 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 1000 veces o 10.000 veces en relación con los niveles de tipo salvaje.

[0054] En este documento, "niveles de tipo salvaje" se refiere a los niveles de isotermas que son evidentes por la expresión de estas proteínas a partir del adenovirus de tipo salvaje E1B-156r, E1B-496R, E1B-93R, y E1B-84R, sin mutaciones en la secuencia de referencia del gen E1B (es decir, SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, la proporción de la isoterma E1B-156R de Ad5 mutante puede aumentar en relación con los niveles en el adenovirus Ad5 de tipo salvaje, de modo que el adenovirus mutante tenga un efecto oncolítico en una célula cancerosa. La isoforma mutante de Ad2 E1B-156R puede incrementarse en relación con los niveles en el adenovirus Ad2 de tipo salvaje.

[0055] Los virus preferidos de acuerdo con la invención pueden haberse disminuido o inhibido la expresión de E1B-93R, y preferiblemente no expresan E1B-93R. Por "no se expresa" se entiende aquí que el nivel detectable de la secuencia E1B-93R es menor que 50%, 10%, 1% del nivel de la secuencia E1B-93R en el adenovirus de tipo salvaje en condiciones equivalentes, preferiblemente menos de 0,1%, menos de 0,01% o incluso menos. Esto tiene el efecto de elevar la expresión de E1B-156R.

[0056] Preferiblemente, una relación óptima de los niveles de proteína isoforma E1B-156r, E1B-496R, E1B-93R, y E1B-84R residiría lo largo de las líneas de aproximadamente 67:0:0:33, en comparación con aproximadamente 5:70:10:15 para virus de tipo salvaje. Sin embargo, como apreciará el lector experto, es difícil o imposible ser exacto con respecto a los niveles relativos de este tipo, ya que dependen del punto en el ciclo de infección evaluado, es decir, temprano/intermedio/tardío. Las proporciones cambian en beneficio de las formas de empalme más cortas a un costo de 496R (que es el ARN de longitud completa sin empalmes). En particular, proporciones favorecidas de la isoforma E1B-156r a la isoforma E1B-496R son 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 50:1, 100:1, 1000:1 o 10.000:1 o más. Se prefiere una relación de 100:1 o más.

[0057] La referencia aquí a "la proporción" de las isoformas E1B-156r, E1B-496R, E1B-93R, o E1B-84R se refiere a: a) el nivel de la proteína isoforma que se expresa; y/o b) el nivel del ARNm de isoforma que se produce.

[0058] Las técnicas para medir los niveles de ARNm serán conocidas por los expertos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, PCR, RT-PCR, metodologías basadas en TaqMan, Protección de RNasa, transferencia de Northern y técnicas de hibridación in situ, y versiónes cuantitativas de estos métodos. Los cambios en los niveles de expresión de ARNm pueden ser de naturaleza temporal, espacial o cuantitativa. El número de copias de cada ARNm de la isoforma E1B se puede calcular y comparar con una referencia, por ejemplo, un gen de mantenimiento como la beta-actina o GAPDH o un plásmido que lleva el "amplicón de interés" específico.

[0059] Si se va a controlar en los niveles de polipéptido, cualquier técnica de ensayo se puede usar que puede determinar niveles de un polipéptido específico, incluyendo radioinmunoensayos (RIA), ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western, FACS y ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los anticuerpos que se unen específicamente a isoformas particulares de empalme pueden usarse, por ejemplo. Los anticuerpos pueden usarse con o sin modificación, y pueden etiquetarse uniéndolos, ya sea covalentemente o no covalentemente, con un reactivo analíticamente detectable tal como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima u otra molécula informadora. Se puede usar una amplia variedad de moléculas informadoras conocidas en la técnica.

Isoformas E1B

[0060] Se sabe muy poco acerca de la E1B-156r, E1B-93R, isoformas de E1B-84R. La producción de diferentes ARNm de E1B se regula durante el proceso de infección. Aunque principalmente la forma de 2,28 kb se produce temprano en la infección, la proporción de ARNm empalmados más cortos aumenta con el tiempo y el transcrito E1B-84R se vuelve predominante en la fase tardía de la infección. La expresión de la proteína isoforma sigue de cerca el patrón de transcripción de los ARNm (Chow et al (1979) J. Mol Biol 134: 265-303; Montell et al (1984) Mol Cell Biol 4:966-972; Spector et al (1978) J. Mol Biol 126: 395-414; Virtanen y Pettersson (1985) J. Virol. 54: 383-391; Wilson y Darnell (1981) J. Mol Biol 148: 231-251).

[0061] Se ha demostrado que diferentes espliceotipos pueden interactuar tanto hetero como homogéneamente entre sí a través del N-terminal y el C-terminal debe llevar a funciones específicas que no pueden ser complementadas por espliceotipos E1B alternativos. Cuando se infecta con virus que carecen de la expresión de un espliceotipo específico, la pérdida de viabilidad puede complementarse mediante la cotransfectación con un plásmido de expresión para el correspondiente espliceotipo. La cotransfección con un espliceotipo alternativo no complementa la pérdida.

Adenovirus mutantes

[0062] La siguiente tabla resume los detalles de algunos mutantes de adenovirus representativos proporcionados como ejemplos de la enseñanza de este documento, junto con algunos virus de control experimental.

[0063] El adenovirus en el presente documento denominado el virus Ixovex ha disminuido o inhibe la expresión de E1B-93R, y preferiblemente no expresa E1B-93R. Por "no expresa" se entiende en este documento que el nivel detectable de la secuencia de E1B-93R es de menos de 50%, 10%, 1% del nivel de la secuencia de E1B-93R en el adenovirus de tipo salvaje en condiciones equivalentes, preferiblemente menos de 0,1%, menos de 0,01% o incluso menos. Esto tiene el efecto de elevar la expresión de E1B-156R.

[0064] Además, en este virus completo la proteína de longitud E1B E1B-496R se desestabiliza. Por "desestabilizado" se entiende que la proteína se vuelve sustancialmente indetectable debido a la mutación. Esto deja solo E1B-156R y E1B-84R aún expresados desde el marco de lectura 496. La naturaleza inestable de E1B-55k se discute en Gabler et al. 1998 J. Virol.; y González 2002, J. Virol.

[0065] La eficacia de Ixovex en comparación con H101 sugiere que, en cierta medida, E1B-496R y E1B-156r tienen funciones superpuestas (Sieber et al (2007) J. Virol 81 (1): 95-105). Se ha encontrado que E1B-496R y E1B-156R se unen a muchos factores similares. E1B-156R puede unirse a E4orf6, el socio de enlace con el que E1B-496R utiliza la mayoría de sus funciones importantes. Curiosamente, también se ha encontrado que E1B-156R se une a p53, aunque con menos afinidad. E1B-156R puede sustituir a E1B55k en experimentos de transformación celular. Además, E1B-156R induce tumores en modelos in vivo, cuando se sobreexpresan junto con E1A. Específicamente, se encontró que el espliceómero E1B-156R tiene un potencial de transformación celular separado de la proteína E1B-496R.

[0066] Es una ventaja de la presente invención que con el fin de lograr el efecto oncogénico descrito, los virus según la presente invención no requieren la eliminación de la totalidad del gen E1B.

Métodos de generación de virus recombinantes.

[0067] Se describen polinucleótidos que codifican los adenovirus recombinantes, opcionalmente codificados dentro de un vector adecuado para la producción de virus en una célula huésped.

[0068] Se describen células huésped que comprenden polinucleótidos que codifican el adenovirus recombinante.

[0069] También se describe un método para hacer un adenovirus oncolítico. Dicho método implica la modificación de un adenovirus mutante en el que la secuencia del gen E1B se ha modificado para aumentar el nivel de la isoforma E1B-156R en relación con el nivel en el adenovirus equivalente de tipo salvaje. El tipo de adenovirus puede ser cualquiera de los descritos anteriormente, y preferiblemente es un adenovirus humano de grupo subfamilia C, a saber, uno de los serotipos 1, 2, 5, 6, o 57, incluso más preferiblemente, el término adenovirus se aplica a dos serotipos humanos, Ad2 y Ad5. De manera similar, la mutación puede ser cualquiera de las descritas o ejemplificadas en el presente documento. En ciertas realizaciones, un virus híbrido puede diseñarse, por ejemplo, en el que un E1B-156R de una variante de adenovirus se expresa en otra variante de adenovirus. Por ejemplo, un Ad2 E1B-156R puede expresarse en un adenovirus Ad5; se ha demostrado en este documento que agregar Ad2 E1B-156R a Ad5 aumenta la actividad oncolítica en 10 veces.

[0070] Las técnicas adecuadas para diseñar mutaciones en adenovirus alternativos serán conocidas por los expertos en la técnica. Un método preferido podría ser usar el sistema pShuttle ampliamente utilizado (Agilent Technologies) o usar el método desarrollado por el Dr. Oberg (la invención de IXOvex y miembro de la junta directiva de IXOgen)) utilizando el sistema pSuperShuttle (ver Ingemarsdotter, CK, SK Baird, CM Connell, D. Oberg, G. Hallden y IA McNeish. 2010. Paclitaxel en dosis bajas sinergiza con adenovirus oncolíticos a través del deslizamiento mitótico y la apoptosis en el cáncer de ovario (Oncogene 29: 6051-6063). Esto permite la inserción o mutación de cualquier secuencia en cualquier parte del adenovirus, lo que pShuttle no puede hacer, estando limitado a las regiones finales del genoma adenoviral. En breve, las secuencias flanqueantes (brazo izquierdo y derecho) de la región de interés pueden clonarse en el plásmido pSuperShuttle en cada lado de un gen de selección de antibióticos (ASG). Si se desea una mutación de cualquier tipo (sustitución, eliminación o adición), se puede incorporar en cualquiera de los brazos. Para la inserción de un gen de interés o un casete de expresión completo en el virus, se pueden usar los sitios de clonación múltiple extensos en cada lado del ASG. Cuando el constructo pSupershuttle completo está secuenciado y listo, se fusiona con el virus mediante recombinación homóloga. El ASG insertado permite una selección positiva. El ASG se digiere, dejando una pequeña cicatriz en forma de un sitio único de enzimas de restricción, que se puede utilizar en futuras modificaciones del virus. Los expertos en la técnica conocerán otras variaciones adecuadas de esta técnica.

Construcción de mutantes E1B-55K de adenovirus

[0071] Los métodos para la construcción de mutantes adenovirales son generalmente conocidos en la técnica. Ver, Mittal (1993) Virus Res., 28: 67-90 y Hermiston et al., Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols (1999) ed. Wold, Humana Press. Además, el genoma del adenovirus 5 está registrado como Secuencia de referencia NCBI: AC_000008,1, y el virus está disponible en la American Type Culture Collection, Rockville, Md., EE.UU., con el número de acceso: VR-1516.

[0072] En general, la construcción de adenovirus vector implica una deleción inicial o la modificación de una región deseada del genoma adenoviral, preferiblemente del genoma de Ad5, en un casete de plásmido usando técnicas convencionales.

[0073] Algunos de los materiales y métodos utilizados para construir mutantes de adenovirus se describen por Hanke et. Alabama. (1990) Virology, 177: 437-444 y Bett et. al., (1993) J. Virol. 67: 5911-5921, y en PCT/CA96/00375. Muchos de los materiales utilizados para construir mutantes de adenovirus se proporcionan comercialmente. Ver también, Hermiston et al., Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols (1999) ed. Wold, Humana Press. Otros detalles se proporcionan aquí.

[0074] Las líneas celulares que se utilizaron para llevar a cabo los experimentos descritos en este documento son fácilmente disponibles de instituciones depositarias reconocidas. Por ejemplo, las siguientes líneas celulares se usaron aquí para evaluar la citotoxicidad: H1299, FaDu, H460, A549, HeLa, Hek293, JH293 y NHBE.

[0075] Un procedimiento preferido para la construcción de los mutantes del gen E1B adenovirales de la presente invención es hacer mutaciones específicas de sitio en el genoma adenoviral en un casete de plásmido utilizando técnicas bien establecidas de la biología molecular, o modificaciones de estas técnicas, se hace referencia en el presente documento. Esto se puede realizar utilizando diversos materiales y métodos.

Métodos de tratamiento del cáncer.

[0076] Se divulgan adenovirus recombinantes que producen un efecto oncolítico en una célula cancerosa. La célula cancerosa puede ser una célula neoplásica. También se describen nuevos métodos para tratar el cáncer, caracterizados por células neoplásicas. Las células neoplásicas pueden preferiblemente carecer sustancialmente de la función de p53 (p53H). Dicho método puede comprender:

a) administrar una dosis del adenovirus recombinante de acuerdo con la invención, que porta una mutación en el gen E1B, a un paciente que necesita tratamiento;

b) dejar suficiente tiempo para que el adenovirus recombinante infecte células neoplásicas de dicho cáncer, en el que el adenovirus mutante tiene un efecto oncolítico que es selectivo para las células cancerosas en relación con las células no neoplásicas; y

c) opcionalmente, administrar dosis adicionales del adenovirus recombinante.

[0077] La célula de cáncer o célula neoplásica puede carecer sustancialmente de la función de p53.

[0078] En el presente documento se describen adenovirus recombinantes para uso como un agente terapéutico en el tratamiento de un paciente con cáncer. Preferiblemente el cáncer se caracteriza por células neoplásicas. Preferiblemente, esas células neoplásicas carecen sustancialmente de la función de p53.

[0079] Las composiciones también descritas comprenden los adenovirus recombinantes de la invención y las composiciones farmacéuticas que comprenden un adenovirus recombinante de la invención.

[0080] Los procesos para preparar una composición farmacéutica que implica la combinación de un adenovirus recombinante de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable también se describen.

[0081] Las composiciones pueden comprender adicionalmente un agente para la quimioterapia.

[0082] En el presente documento se describen varios métodos y composiciones novedosas para la ablación de células neoplásicas infectando las células neoplásicas con un adenovirus recombinante que es sustancialmente deficiente en replicación en células no neoplásicas y que exhibe al menos un fenotipo de replicación parcial en células neoplásicas. La diferencia en el fenotipo de replicación de las construcciones de adenovirus de la invención en células neoplásicas y no neoplásicas proporciona una base biológica para la terapia del cáncer basada en virus.

[0083] Una población celular (como un cultivo celular mixto, paciente de cáncer humano o sujeto mamífero no humano) que comprende una subpoblación de células neoplásicas que carecen de la función de p53 y una subpoblación de células no neoplásicas que expresan la función de p53 esencialmente normal puede ser contactada en condiciones infecciosas (es decir, condiciones adecuadas para la infección adenovírica de la población celular, típicamente condiciones fisiológicas) con una composición que comprende una dosis infecciosa de un adenovirus inhibido por replicación E1B-p53(-). Dicha etapa de contacto da como resultado la infección de la población celular con el adenovirus deficiente en la replicación E1B-p53(-). La infección produce una expresión preferencial de un fenotipo de replicación en una fracción significativa de las células que comprenden la subpoblación de células neoplásicas que carecen de la función p53, pero no produce una expresión sustancial de un fenotipo replicativo en la subpoblación de células no neoplásicas que tienen una función p53 esencialmente normal. La expresión del fenotipo de replicación en una célula p53(-) infectada provoca la muerte de la célula, como el efecto citopático (CPE), la lisis celular, la apoptosis o similar, lo que da como resultado una ablación selectiva de células neoplásico p53(-) de la población celular.

[0084] Es deseable que el virus mutante sea replicable y forme viriones infecciosos que contengan el genoma viral mutante que puede propagarse e infectar otras células, amplificando así la acción antineoplásica de una dosificación inicial de virus mutante.

[0085] En este documento, la replicación de E1B-p53(-) del adenovirus inhibe construcciones adecuadas para la destrucción selectiva de las células neoplásicas p53(-)son las descritas anteriormente.

[0086] Mutantes de adenovirus antineoplásicos candidatos se pueden evaluar además por su capacidad para reducir tumourigénesis o la carga de células neoplásicas en ratones nu/nu que albergan un trasplante de células neoplásicas que carecen de la función de p53, en comparación con los ratones no tratados que albergan un trasplante equivalente de las células neoplásicas.

[0087] Los mutantes de adenovirus deficientes en replicación antineoplástica pueden formularse para administración terapéutica, profiláctica y, potencialmente, diagnóstica a un paciente que tiene una enfermedad neoplásica. Para usos terapéuticos o profilácticos, se administra a un paciente una composición estéril que contiene una dosis farmacológicamente eficaz de una o más especies de mutantes adenovirus inhibidos de la replicación antineoplásica para el tratamiento de una afección neoplásica. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se emplea a menudo en tales composiciones estériles. Se puede usar una variedad de soluciones acuosas, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de partículas diferentes a los viriones adenovirales deseados. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y tampones, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. Se puede incluir excipientes que mejoran de la infección de las células por el adenovirus.

[0088] La terapia de la enfermedad neoplásica puede proporcionarse administrando a un paciente o sujeto una composición que comprende los adenovirus defectuosos de la replicación de la invención. Diversas neoplasias humanas y de mamíferos que comprenden células que carecen de la función de p53 pueden tratarse con construcciones adenovirales inhibidas por replicación. Por ejemplo (pero sin limitarse a) un paciente humano o un mamífero no humano que tiene un carcinoma broncogénico, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de laringe, carcinoma de pulmón de células pequeñas y células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, hepatocarcinoma, carcinoma pancreático, carcinoma de vejiga, carcinoma de colon, carcinoma de mama, carcinoma de cérvix, carcinoma de ovario o leucemias linfocíticas se pueden tratar administrando una dosis antineoplásica eficaz de un adenovirus inhibido por replicación adecuada.

[0089] Las suspensiones de partículas infecciosas de adenovirus pueden aplicarse al tejido neoplásico por varias vías, incluidas la intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica y tópica. Una suspensión de adenovirus, preferiblemente una suspensión acuosa, que contiene entre aproximadamente 103 y 1015 o más partículas de virión por ml (como por ejemplo entre aproximadamente 105 a 1012 o más partículas de virión por ml, entre aproximadamente 107 y 1010 o más virión). las partículas por ml, o aproximadamente 109 partículas de virión por ml) se pueden inhalar como una neblina (por ejemplo, para el suministro pulmonar para tratar el carcinoma broncogénico, el carcinoma pulmonar de células pequeñas, el carcinoma pulmonar de células no pequeñas, el adenocarcinoma pulmonar o el cáncer de laringe). Alternativamente, dicha suspensión se puede limpiar directamente en un sitio del tumor para tratar un tumor (por ejemplo, carcinoma broncogénico, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de laringe, carcinoma cervical) o se puede administrar por infusión (por ejemplo, en la cavidad peritoneal para tratar el cáncer de ovario, en la vena porta para el tratamiento de hepatocarcinoma o metástasis hepáticas de otros tumores no primarios hepáticos) u otra vía adecuada, incluida la inyección directa en una masa tumoral (por ejemplo, un tumor de mama), enema (por ejemplo, cáncer de colon) o catéter (por ejemplo, cáncer de vejiga).

[0090] Virus inhibidos por replicación también se pueden suministrar a las células neoplásicas por entrega de liposoma o inmunoliposoma; dicha administración puede dirigirse selectivamente a las células neoplásicas sobre la base de una propiedad de la superficie celular presente en la población de células neoplásicas (por ejemplo, la presencia de una proteína de la superficie celular que se une a una inmunoglobulina en una inmunoliposoma). Por ejemplo, una suspensión de viriones de adenovirus inhibidos de la replicación se puede encapsular en micelas para formar inmunoliposomas por métodos convencionales (por ejemplo, véase la Patente de e E.UU. N° 5.043,164, Patente de EE.UU. N° 4.957.735, Patente de EE.UU. N° 4.925.661; Connor y Huang (1985) Cell J. Biol 101: 582; Lasic DD (1992) Nature 355: 279; Novel Drug Delivery (1989) eds Prescott y Nimmo, Wiley, Nueva York; y Reddy et al (1992) J. Immunol.. 148: 1585). Los inmunoliposomas que comprenden un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de células cancerosas (por ejemplo, CALLA, CEA) presente en las células cancerosas del individuo pueden usarse para dirigir viriones a esas células.

[0091] Las composiciones que contienen los presentes adenovirus o cócteles de replicación deficiente antineoplásicos de los mismos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos de enfermedades neoplásicas. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente ya afectado por la enfermedad neoplásica particular, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz" o "dosis eficaz". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad de la afección, el estado general del paciente y la vía de administración.

[0092] En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen la replicación antineoplásica inhibieron adenovirus o cócteles de los mismos se administran a un paciente no presentemente en un estado de enfermedad neoplásica para mejorar la resistencia del paciente a la recurrencia de un neoplasma o para prolongar el tiempo de remisión. Dicha cantidad se define como una "dosis profilácticamente eficaz". En este uso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud del paciente y del nivel general de inmunidad.

[0093] Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones pueden llevarse a cabo con niveles y patrones de dosis seleccionados por el médico tratante. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad de adenovirus inhibidos por la replicación antineoplásica de esta invención, suficientes para tratar al paciente de manera efectiva.

[0094] La terapia adenovírica inhibida por replicación antineoplásica de la presente invención puede combinarse con otros protocolos antineoplásicos, tales como quimioterapia convencional.

General

[0095] El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste en", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional por ejemplo X Y.

[0096] La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

[0097] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia de los que trabajan en la técnica.

[0098] La mayoría de las técnicas de biología molecular general, la microbiología de tecnología de ADN recombinante e inmunológicas se pueden encontrar en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001) Cold Harbor-Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY o Ausubel et al., Protocolos actuales en biología molecular (1990) John Wiley and Sons, NY

[0099] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0100]

FIGURA 1. Descripción esquemática de un virus oncolítico.

FIGURA 2. Mapa de empalme E1B que muestra los productos del gen E1B alternativo. La transcripción completa de e 1b lleva el marco de lectura abierto (ORF) E1B-176R y E1B-496R. Mediante el empalme alternativo en el ORF E1B-496 se expresan otras tres proteínas, E1B-93R, E1B-156R y E1B-84R. Las proteínas menores tienen los 79 aminoácidos amino terminales en común con E1B-496R pero difieren en el terminal carboxi, excepto en E1B-156R, que se empalma en el marco con E1B-496R.

FIGURA 3. Un cambio de aminoácido en Ixovex en la proteína E1B-55k inhibe su expresión. Las células A549 se infectaron con el virus respectivo a 5 pfu/célula y el lisado celular total se recogió 48 horas después de la infección (hpi). Se muestra una transferencia de Western teñida con anticuerpo policlonal Ab6982 de proteína a-cápsida (panel superior), anticuerpo monoclonal a-E1B-55k 2A6 (panel medio) y anticuerpo monoclonal aactina I-19-SC como control de carga (panel más bajo).

FIGURA 4. La mutación puntual en el marco de lectura abierto E1B55k en Ixovex inhibe el empalme del aceptador de empalme 93r . Las células A549 se infectaron con el virus respectivo a 5 pfu/célula y el ARN total se recolectó a 48 hpi. El ADNc se hizo usando un cebador oligo-dT. La PCR se realizó utilizando un cebador de sentido común corriente arriba del donante de empalme de 55k y cebadores específicos corriente abajo del respectivo aceptor de empalme. Las reacciones de PCR se realizaron en un gel de agarosa TBE al 2% teñido con GelRed.

FIGURA 5. Ixovex se inhibe para inducir la degradación de p53. Las células A549 se infectaron con el virus respectivo a 5 pfu/célula y el lisado celular se recogió 48 hpi. Se muestra una tinción de transferencia western con un anticuerpo monoclonal a-p53 n.° 9282 CS (panel superior) y el anticuerpo monoclonal a-actina I-19-SC como control de carga (panel inferior).

FIGURA 6. Ensayo de replicación en líneas celulares de cáncer. Cada línea celular se infectó con 5 pfu/célula del virus respectivo. Las células y los medios se recogieron a 24, 48 y 72 hpi y se analizaron mediante un ensayo de dilución limitada. El CpE se anotó visualmente después de 10 días y se calcularon los resultados de TCID50 (pfu/célula), como se describe en los materiales y métodos.

FIGURA 7. La citotoxicidad relativa de los virus Ixovex, Ad5wt y Onyx-015 en células cancerosas. La línea celular respectiva se infectó con los virus indicados en una serie de dilución de 5 veces. La citotoxicidad se midió 6 días después de la infección (ppp) utilizando el ensayo MTS y se calcularon los valores de EC50.

FIGURA 8. Eficacia de la replicación en células epiteliales bronquiales humanas normales. Cada línea celular se infectó con 5 pfu/célula del virus respectivo. Las células y los medios se recogieron a 24, 48 y 72 hpi y se analizaron mediante un ensayo de dilución limitada. El CPE se anotó visualmente después de 10 días y se calcularon los resultados de TCID50 (pfu/célula), como se describe aquí.

FIGURA 9. Ixovex muestra más de 500 veces menos citotoxicidad para las células normales en comparación con el virus no modificado (Ad5wt). Se presenta la inhibición del pliegue de la citotoxicidad en relación con Ad5wt (fila inferior) y los valores de CE50 sin procesar (fila superior). La citotoxicidad se midió a 6 dpi utilizando el ensayo MTS.

FIGURA 10. La proteína E1B-156R está sobreexpresada por Ixovex. La transferencia western se realizó en proteína total extraída a 48 hpi de células H1299 infectadas con 10 pfu/célula de Ixovex o Ad5wt.

FIGURA 11. Las proteínas Ad5 y Ad2-156R mejoraron el índice oncolítico (OI) en células cancerosas en comparación con las células normales. A) Los plásmidos de expresión Ad5 y Ad2-156R se transfectaron en células HeLa y NHBE infectadas con Ad5wt. En paralelo, se incluyó una línea celular de cáncer adicional (H460, carcinoma de pulmón de células grandes) en la complementación de Ad5-156R. B) Ad5-156R se transfectó en células infectadas con ONYX-015. C) Ad5-156R se transfectó en células infectadas con Ad2wt. Las células se infectaron con 2,5 pfu/célula y se complementaron de forma cruzada con plásmidos de expresión para el respectivo E1B-156R. Las muestras se analizaron con un ensayo de Ráfaga (replicación viral), en el hpi indicado.

FIGURA 12. Tabla que muestra los puntos de datos de 48 hpi para las Figuras 11A-C (excepto los puntos de datos H460 que se recolectaron 72 hpi) y el cálculo de los índices oncolíticos, donde OI = ((a/b)/(c/d)). a = pfu/células de cáncer de células 156R, b = pfu/células de células normales 156R, c = pfu/células de cáncer de células - 156R, d = pfu/células de células normales - 156R.

FIGURA 13. La secuencia proteica de E1B-156R para los serotipos de la subfamilia C de adenovirus alineada con las secuencias para los serotipos de las subfamilias B, D y E. Campo sombreado: las similitudes dentro del grupo C. Las brechas indican dónde difieren. Subrayado en Ad5: los aminoácidos que separan a Ad5-156R de las otras proteínas E1B-156R en la subfamilia C.

FIGURA 14. Geles de ADN que muestran bandas de ADNc amplificadas correspondientes a E1B-156R en Ad2, Ad4 y Ad11. Todas las bandas en los geles se clonaron en el vector romo de PCR Topo-II (Invitrogen) y se secuenciaron para confirmar que las bandas indicadas correspondían a la E1B-156R de cada virus respectivo.

EJEMPLOS

Materiales y métodos

Construcción de virus

[0101] Los nucleótidos 1 a 5.055 de adenovirus serotipo 5 (Ad5) se amplificaron por PCR con Phusion PFU polimerasa usando oligonucleótidos Ad5start (SEQ ID NO: 15 - ccacctcgagttaattaacatcatcaataatataccttattttg) y Ad5wt5055as (SEQ ID NO: 16 - gtgggtttaaacggatttggtcagggaaaacatg). El ADN genómico viral extraído de un lote de Ad5 purificado con CsCl se utilizó como plantilla. El producto de la PCR se clonó en pShuttle (Stratagene) utilizando las enzimas de restricción NotI y PmeI (NEB). Para producir mutaciones en el sitio de empalme E1B 93R en pShuttle-5055, los oligonucleótidos Mut93Rs (SEQ ID n O: 17 - ccttgcatttgggtaatagaagaggagtgttcctaccttaccaatg) y Mut93Ras (SEQ ID NO: 18 - cattggtaaggtaggaacactcctcttctattacccaaatgcaagg) se utilizaron en una reacción PCR Mutagenesis XL (Strategene), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los clones fueron seleccionados y enviados para secuenciación. Se linealizaron cinco |jg del clon correcto utilizando PmeI (NEB), se trataron con fenol/cloroformo y se precipitaron con etanol. Se mezclaron 200 ng junto con 100 ng del plásmido pTG3602. La mezcla se sometió a electroporación en células BJ5183 (Stratagene) y se colocó en placas de kanamicina (25 jg/m l) que contenían placas de agar. Los clones se seleccionaron por exclusión de tamaño en un gel de craqueo. En resumen, el sedimento de 1 j l de cultivo bacteriano se resuspendió en 50 j l de agua y se trató con 50 j l de fenol/cloroformo. La mezcla se centrifugó durante 1 minuto a 13.000 rpm y se recogió la fase acuosa. La fase acuosa que contenía todo el ADN y el ARN de la bacteria se trató durante 5 minutos con un colorante de carga de ADN que contenía RNasaH y luego se aplicó en un gel de agarosa al 0,7%. El ADN se preparó a partir de los clones seleccionados (kit Qiagen Maxi Prep) y se secuenció para garantizar que se había introducido la mutación correcta. Se digirieron cinco jg del mutante pT3602 correcto con PacI para extirpar el genoma viral, se trataron con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Dos jg del plásmido digerido se transfectaron en 10e5 células Hek293 en una placa de 6 pocillos utilizando transfecteno (Biorad). Cinco días después, las células se recogieron, se sometieron a tres rondas de congelación/descongelación y se aplicaron a una botella de T175 con un 80% de subconfluentes con células A549 para aumentar el volumen del lisado de células infectadas.

[0102] Un CF-10 (Thermo Scientific) se sembró con células HEK293 y se infectó a 80% de confluencia con una tercera parte del lisado celular. Tres días después se cosechó el CF-10. El sedimento celular se congeló/descongeó tres veces, se centrifugó para limpiar el lisado y se aplicó a un gradiente de CsCl de 1,25/1,4 g/ml y se centrifugó a 25.000 rpm en una ultracentrífuga. La banda del virus se recogió con una jeringa 21G y se distribuyó en columnas de CsCl de 1,35 g/ml. Las columnas se hicieron girar a 40.000 rpm durante la noche y la banda del virus se recogió con una jeringa 21G. El virus extraído se inyectó en un casete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific) y se dializó durante la noche a 4°C en TRIS 50 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM, MgCh 1 mM, glicerol al 10%. La actividad del virus, evaluada por el 50% de la dosis infecciosa de cultivo tisular (TCID50) (pfu/ml), se determinó mediante el uso de células JH293 como se describe en la sección de Replicación Viral a continuación. El ADN viral se purificó a partir de una pequeña alícuota y se determinó el número de genomas virales por j l (partículas/jl) utilizando un espectrofotómetro. Las relaciones entre las partículas y las actividades de todos los virus utilizados en este documento fueron menores que 20. El virus Ixoctrl es un clon de tipo salvaje de la cepa pTG3602 de serotipo 5 adenoviral.

[0103] En paralelo, se hicieron plásmidos pShuttle en los que todos los sitios de empalme se mutaron individualmente sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína E1B-496R, utilizando el Kit de Mutagénesis por PCR XL (Stratagene) según las recomendaciones del fabricante.

[0104] Todos estos plásmidos pShuttle se usaron en recombinación homóloga para generar un gran conjunto de virus (ver tabla 1).

Tabla 1. Mutantes de adenovirus descritos en el presente documento.

Cultivo de tejidos

[0105] Todas las células se cultivaron a 37°C y 5% de CO² y se analizaron regularmente para determinar la contaminación por micoplasma. Las líneas celulares utilizadas en este estudio se enumeran a continuación.

Ensayo de citotoxicidad

[0106] Se utilizó el 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5 (3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolim (MTS) de ensayo (CelITiter Cell 96 Aqueous Non-Radioactive Ensayo de proliferación (Promega, Wisconsin, EE.UU.) para evaluar la citotoxicidad de Ixovex y los virus de control. Con el objetivo de que las células fueran confluentes en el día 6, se sembraron 1,000-4,000 células/pozo (dependiendo de la tasa de crecimiento) en una placa de 96 pocillos en 90 pl de medio y 5% de FCS. Los virus (en 10 pl de medio y 5% de FCS) se agregaron 18 horas más tarde a nueve diluciones en serie de 1:10 comenzando a 10,000 partículas virales (vp)/célula, junto con un positivo (solo células sin virus) y un control negativo (sin células solo medianas).

[0107] Seis días después de la infección, la supervivencia se determinó usando el ensayo MTS. El MTS se mezcló con fenazinemetosulfato (PMS) en una proporción de 20:1 y se añadió a las células. Después de tres horas de incubación, se midió la absorbancia a 490 nm usando el Opsys MR de 96 pocillos plector de placas y software Revelación Quicklink 4.04 (Dynex Technologies, Virginia, EE.UU.). Los valores se establecieron para cada dilución y se compararon con el control negativo (100% de muerte celular) y el control positivo (0% de muerte celular). Los valores de CE50 (la mitad de la concentración efectiva máxima para destruir el 50% de las células - CE50) se calcularon mediante regresión no lineal (curva de dosis-respuesta sigmoidal) utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, California, EE.UU.), utilizando la siguiente fórmula:

Y = abajo+ (arriba-abajo)/1 10[log¹⁰CE⁵⁰'X) x Pendiente]

[0108] Y es la respuesta y comienza en "abajo" y va a "arriba" de una manera sigmoidal.

[0109] Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Ensayo de replicación viral

[0110] Las células se sembraron en placa de 6 pocillos en medio con 10% de FCS 24 horas antes de la infección. Se usaron 100 vp/célula para infectar 80% de células confluentes en un medio FCS al 2%. Dos horas después de la infección, el medio se reemplazó con un medio FCS al 10% (infección primaria). A las horas posteriores a la infección (especificada en la figura respectiva), el medio y las células se recolectaron (mediante raspado), se congelaron y descongelaron tres veces en nitrógeno líquido y 37°C, respectivamente, y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Se sembraron células JH293 a 10.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en 200 pl de medio con 5% de FCS. En la primera fila de la TCID50, la dilución inicial de las diferentes muestras fue entre sin diluir y 1:1000 dependiente de hpi y virus, estas diluciones de la infección primaria se usaron para infectar las células JH293. La última fila se dejó sin infectar como control negativo. Entre los días 9 y 11, las placas se inspeccionaron para determinar el efecto citopatógeno (CPE). El 50% de la dosis de infección de cultivo tisular (TCID50) y el número de pfu/célula (recuento de células en el día de la infección) se calcularon utilizando el método acumulativo Reed-Muench. Vea el ejemplo a continuación:

Ejemplo de una placa de 96 pocillos (+ indica bien con evidencia de CPE):

[0111]

• Calcule la distancia proporcional: (% siguiente por encima del 50% - 50%)/(% siguiente por encima del 50% - % siguiente por debajo del 50%) = (100% - 50%) / (100% - 42%) = 0,86

• Calcule el punto final del 50%: log-10 (dilución en la que la posición está por encima del 50%) = log-1010^{' 5} = -5 • Combine los valores para obtener el log-10 TCID50 = -5- 0,86 = -5,86

• TCID50 título = 10^{' 586} (o 1 en 7,24 x 10⁵ de dilución de la cantidad agregada a la fila superior). Como 22 pl (0,022 ml) se añadió a la fila superior, TCID50/ml = 7,24 x 10⁵ / 0,022 = 3,29 x 10⁷

• Múltiple por una constante: 3,29 x 10⁷ x 0,69 = 2,27 x 10⁷ pfu/ml

[0112] Para pfu/célula, multiplique lo anterior con el volumen de virus agregado a cada pocillo de la placa de 6 pocillos (2 ml) y divídalo por el recuento de células el día de la infección (por ejemplo, 2,4 x l0⁵): (2,27 x 10⁷ x 2)/2,4 x 10⁵ = -89 pfu/célula.

Transferencia western

[0113] Las células A549 o H1299 se infectaron con 5 pfu/célula, la proteína total se extrajo a las 48 h después de la infección usando tampón RIPA. La concentración de proteína se determinó utilizando reactivo de Bradford. Veinte pg de proteína total de cada muestra se cargaron en un gel PAGE al 10%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (BioRad) mediante transferencia húmeda. La membrana se bloqueó utilizando una solución de BSA TBS al 3% durante 1 h. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: proteínas de la cápside Ad (AbCam-6982), E1B-55k (2A6, Sarnow, Sullivan Levine 1982, dilución 1: 500), E1A (Santa cruz, M73), actina (Santa Cruz, I-19) y p53 (Señalización Celular, N° 9282). Todos los anticuerpos se diluyeron según lo recomendado en 1,5% BSA TBS. Las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios durante 15-24 horas a 4°C, donde después se lavaron con 1xTBS 3% Tween-20 tres veces durante 10 min. Los anticuerpos secundarios acoplados con HRP contra el anticuerpo primario respectivo se diluyeron 1:5000 en BSA TBS al 1,5% y se aplicaron a la membrana durante 1 h. Después de eliminar la dilución del anticuerpo, las membranas se lavaron con 1xTBS Tween-20 al 3% tres veces durante 10 min. Cada membrana se expuso durante 1 minuto con ECL Plus (GE, RPN2132). Después de envolverse en una lámina de plástico, las membranas se colocaron en un Hypercassette junto con Hyperfilm (GE) y las películas se desarrollaron a intervalos de tiempo seleccionados. Alternativamente, se usaron anticuerpos secundarios marcados con IRDyes de LI-COR. El análisis se llevó a cabo utilizando un Odyssey Imager.

RT-PCR

[0114] Las células A549 se infectaron con 5 pfu/célula de virus respectivo, el ARN total se extrajo a las 48 h después de la infección utilizando Trizol (Invitrogen). El ARN se trató con ADNasa (NEB, ADNasa I), se trató con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Una RNA total pm se utilizó para la síntesis de ADNc (Invitrogen, Superscript® III) de acuerdo con recomendaciones de los fabricantes. ADNc se usó como plantilla en las reacciones de PCR (NEB Taq DNA Polimerase) con un oligonucleótido de sentido común (55kSense, SEQ ID NO: 29 -gcctgctactgttgtcttccg) y cualquiera de los siguientes nucleótidos antisentido: 93Ras, SEQ ID NO: 30 -cacccccctcctgtacaac, 156Ras, SEQ ID NO: 31 - gacatgctctcgggctgtacaac o 84Ras, SEQ ID NO: 32 caaacgagttggtgctcatg. La longitud del amplicón de cada uno fue de aproximadamente 200 nucleótidos. La reacción de PCR se detuvo después de 20 ciclos y se realizó una alícuota en un gel de agarosa al 2%.

Fabricación del mutante aceptor de sitio de empalme E1B-93R adenoviral

[0115] Los primeros 5000 nucleótidos del genoma Ad5wt (NCBI Referencia de secuencia: AC_000008,1) fueron amplificados por PCR (cebadores Ad5wt5000 inicio: SEQ ID NO: 15 -ccacctcgagttaattaaCATCATCAATAATATACCTTATTTTG; Ad5wt5000as: SEQ ID NO: 16 -gtgggtttaaacGGATTTGGTCAGGGAAAACATG) y gel de agarosa purificado. El producto purificado se digirió con las enzimas de restricción NotI y PmeI (New England Biolabs) y se clonó en el plásmido pShuttle (gen Stratagene), reemplazando el brazo izquierdo existente para la recombinación homóloga, produciendo pShuttle-LA, según Agilent Technologies, AdEasy http://www.genomics.agilent.com/CoNectionSubpage. aspx?PageType=Product&SubPageTyp e=ProductData&PageID=592. Este plásmido se recombinó con el plásmido pTG3602, que contiene el genoma completo Ad5wt, según lo recomendado por Agilent Technologies en su sistema AdEasy utilizando células competentes para la recombinación BJ5183. Después de la recombinación, las bacterias BJ5183 se colocaron en placas de agar que contenían kanamicina. Se seleccionaron colonias individuales, se cultivaron y se preparó ADN a partir de cultivos grandes. Cada preparación de ADN se seleccionó para el evento de recombinación correcto. La digestión de los genomas se realizó con PacI (New England Biolabs). Después de que los clones correctos se habían cultivado en placas de agar, los genomas se digirieron y se transfectaron en células HEK293 usando un reactivo de transfección de transfectina (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuatro días después de la transfección, se recogieron los lisados del virus [se recogieron las células mediante raspado junto con el medio y se recogieron en un tubo de halcón de 15 ml. La muestra se congeló/descongeló tres veces y se usó para infectar una botella de T175 aproximadamente 90% confluente con células Hek293. Tres días después, las células y los medios se recolectaron y congelaron/descongelaron tres veces] y luego se usaron para infectar las fábricas de producción viral llamadas CF-10s (Nunc). Éstas tienen el área de superficie aproximada de cuarenta botellas T175, es decir, 7000 cm2, y se utilizan para cultivar un gran número de células para la producción de un gran número de virus. Brevemente, las células de cuatro botellas confluentes de T175 fueron transferidas en 1 L de 5% de medio FCS DMEM a un CF10. Se aplicaron veinticinco ml (1/40) de los medios que contienen células a un nuevo T175 como control de crecimiento. El día en que el T175 era 90% confluente, el CF10 estaba en la misma etapa. La mitad del lisado celular se inyectó en el CF10 y el medio se movió para una distribución uniforme. Tres días después, el CF10 se agitó para desalojar las células que aún no habían comenzado a flotar debido a una infección viral. La CF10 se vació, las células se centrifugaron, se lavaron en PBS y finalmente se suspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 7,8. La purificación se llevó a cabo mediante bandas de cloruro de cesio. Los virus se purificaron y se analizaron para determinar el título (partículas) y la actividad (pfu). La proporción de unidades vp:pfu (unidades vp:pfu) para todos los virus estaba entre 10-20. La secuenciación de uno de los clones virales mostró que tenía una mutación puntual en el sitio del aceptador de empalme E1B-93R.

Confirmar la existencia de E1B-156R en Ad2, Ad4 y Ad11

[0116] Las células A549 se infectaron con 5 pfu/célula de cada virus. A las 48 hpi, se extrajo el ARN total y 1 |jg se convirtió en ADNc utilizando Superscript-II (Invitrogen) con hexámeros aleatorios. Una j l de la 50ml total se utiliza como molde en una PCR con cebadores específicos de serotipo (Ad2 sentido, SEQ ID NO: 33 -ctcgaggaattcgccaccatggagcgaagaaacccatc, Ad2 antisentido,. SEQ ID NO 34 - cacttctagatcaatctgtatcttcatcgctag, Ad4 sentido, SEQ ID NO 35 - ggagatttggacggtcttgg, Ad4 antisentido, SEQ ID NO 36 - ggatcccatcacattttgacg, Ad11 sentido, SEQ ID NO 37 - catccatggaggtttggccc, Ad11 antisentido, SEQ ID NO 38 - ccttaaaagaaggcttttgccc -. La Figura 14 muestra un gel de ADN que muestra las bandas de ADNc y resalta las bandas correspondientes al ADNc de E1B-156R. Todas las bandas en los geles se purificaron (NucleoSpin Gel y PCR Clean-up, Macherey-Nagel) y se clonaron en un vector romo Topo-II PCR (Invitrogen). Los clones fueron enviados para su secuenciación. Ad2-156R y Ad5-156R se clonaron en el vector p3xFlag-CMV-14 utilizando EcoRI y XbaI.

Ensayar si la proteína E1B-156R mejora el índice oncolítico

[0117] El ADNc para E1B-156r de Ad2 y Ad5 fueron amplificados mediante PCR utilizando cebadores específicos de inicio y parada para cada respectivo E1B-55K como se discutió anteriormente. Los cebadores incluían un EcoRI en el cebador de inicio y un sitio XbaI en el cebador de parada. Los fragmentos de PCR se digirieron con las dos enzimas y se ligaron en p3xFlag-CMV-14 (Sigma-Aldrich). Las construcciones fueron secuenciadas para el inserto correcto.

[0118] Las células cancerosas (HeLa y H460) y células normales (NHBE) se transfectaron con 2 jg Ad2-156R o plásmidos de expresión Ad5-156R (o un plásmido de control) y se co-infectaron con Ad5wt, ONYX-015 o Ad2wt. La transfección se realizó utilizando el reactivo JetPRIME (POLIPlus) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La infección con los virus se realizó como se discutió anteriormente. Brevemente, cada pocillo en una placa de 6 pocillos se transfectaron con 2 j l de reactivo JetPRIME y 200 j l de tampón de transfección. Los pocillos de control se transfectaron con 2 jg de plásmido inerte, en forma de pUC19.

[0119] La replicación viral se midió en varios puntos de tiempo después de la infección usando los ensayos descritos anteriormente. Los datos se muestran en las Figuras 11A, B y C. El índice oncolítico se calculó como se muestra en la FIG. 12.

Resultados

Se pierde la proteína ElB-55k

[0120] Lisados de proteínas totales de células A549 infectadas con Ad5wt, Onyx-015, Ixovex e Ixo-CTRL mostraron que a 48 hpi todos los virus expresaron la proteína tardía (Fig. 3, panel superior), es decir, habían alcanzado la fase tardía de la replicación adenoviral. Tanto el virus Ixovex como el Onyx-015 expresaron menos proteínas tardías que Ad5wt e Ixo-ctrl, lo que refleja la reducción de la eficiencia de replicación que se observa en la FIG. 6 para las células A549. La mutación puntual de un solo nucleótido de Ixovex (SNP, ubicación genómica 3216), que cambia el aminoácido en la posición 400 en la proteína E1B-55k de una arginina a una glicina, indujo su desestabilización (Fig. 3, panel central). La cantidad reducida de E1B-55k en Ixo-ctrl en comparación con Ad5wt refleja la eficiencia de replicación ligeramente menor de Ixo-ctrl en las células A549 (Fig. 6, panel A549).

Dinámica en el uso de los aceptadores de empalme E1B.

[0121] El SNP también inhibió el uso del aceptor de empalme E1B-93R (Fig 4, segundo panel.) Cambiando la secuencia de aceptor de empalme putativo de CAG:GA a CGG:GA. Curiosamente, como efecto secundario de la inhibición del sitio de empalme 93R, hay un interruptor compensatorio para el uso del aceptador de empalme E1B-156R (Fig. 4, panel central). En ausencia de la mutación del aceptor de empalme E1B-93R, es decir, Ixo-ctrl, se restaura el uso relativo del sitio de empalme 93R (Fig. 4, panel inferior) en comparación con el virus Ad5wt (Fig. 4, panel superior). Onyx-015 no se pudo usar en este experimento ya que este virus se elimina en toda la región del gen E1B-55k.

Ixovex es incapaz de inducir la degradación de p53

[0122] El análisis de transferencia Western mostró que el SNP en Ixovex inhibió el virus de la inducción de la degradación de p53 (Fig. 5). En ausencia de la mutación aceptora de empalme E1B-93R (es decir, Ixo-ctrl), se restableció la capacidad del virus para inhibir p53. Curiosamente, hubo una expresión mucho mayor de p53 en las células infectadas con Onyx-015.

Eficacia de la replicación en células cancerosas.

[0123] Un ensayo de replicación se realizó utilizando Ad5wt, Onyx-015, Ixovex y virus Ixo-CTRL en las células A549, HeLa, H460, H1299 y FaDu. La eficiencia de replicación de todos los virus estaba por debajo del límite de detección en las células FaDu. En las células A549 y HeLa, todos los virus mostraron una eficiencia de replicación de hasta dos órdenes de magnitud inferior al virus Ad5wt (Fig. 6, paneles superiores). La atenuación de la replicación no se observó, o fue mucho menos pronunciada, en las células H460 y H1299 (Fig. 6, paneles inferiores). En las dos líneas celulares de cáncer más permisivas, se produjo de 100 a 1000 veces más el virus Ixovex, en comparación con Onyx-015. Citotoxicidad en células cancerígenas.

[0124] La Fig. 7 muestra la citotoxicidad de los virus Onyx-015 e Ixovex en relación con el virus Ad5wt en células cancerosas. En comparación con Onyx-015, Ixovex fue más eficiente en todas las células analizadas (aparte de las células H460, en las que Onyx-015 fue 2,5 veces más tóxico). La citotoxicidad del virus Ixovex fue similar (o mucho mayor que) al virus Ad5wt en las líneas de células de cáncer A549, HeLa y H1299.

Perfil de toxicidad en células normales.

[0125] La citotoxicidad de la Ad5wt, Onyx-015, Ixovex y virus Ixo-CTRL se midió en las células NHBE (células epiteliales bronquiales humanas normales). Como se ve en la FIG. 9, los virus Ad5wt, Onyx-015 e Ixo-ctrl son relativamente tóxicos en las células normales en comparación con las células cancerosas. Sin embargo, el virus Ixovex mostró un valor de CE50 de 23 pfu/célula, que fue más alto que su CE50 en las líneas celulares de cáncer A549, HeLa y H1299. Los virus Ad5wt y Ixo-ctrl tenían valores de CE50 de 0,042 y 0,031 pfu/célula, respectivamente, mientras que Onyx-015 tenía 0,63 pfu/célula. Por lo tanto, Ad5wt fue mayor que 500 veces, Ixo-ctrl más que 700 veces y Onyx-015 fue más tóxico para las células normales que Ixovex.

Eficacia de la replicación en células NHBE

[0126] A las 48 hpi, la actividad del virus fue 30 veces mayor en Ixo-ctrl y Onyx-015 y 500 veces mayor en Ad5wt en comparación con virus Ixovex (Fig. 8). Estas diferencias fueron aún más pronunciadas a las 72 hpi, donde la actividad del virus fue 50 veces mayor en Ixo-ctrl y Onyx-015 y más de 2000 veces mayor en Ad5wt. De hecho, estas diferencias podrían ser incluso más pronunciadas, ya que la replicación de Ixovex apenas alcanzó el límite de detección en todos los momentos.

Ixovex sobreexpresó la proteína E1B-156R

[0127] Los niveles de proteína de E1B-156r, proteínas de la cápside de adenovirus y E1A expresadas por Ad5wt- y Ixovex-infectaron células H1299 se analizaron por Transferencia western. La Figura 10 muestra que Ixovex expresó cantidades similares de todas las proteínas virales, excepto la proteína E1B-156R, cuyos niveles aumentaron en más de 20 veces, en comparación con Ad5wt.

La proteína E1B-156R mejora el índice oncolítico

[0128] Tenemos la hipótesis de que la adición de la proteína E1B-156r en trans mejoraría el índice oncolítico (OI) para Ad5wt si la proteína E1B-156r era responsable del efecto oncolítico. La transfectación de un plásmido de expresión Ad5-156R y la coinfección con Ad5wt aumentaron la OI en 4 veces utilizando células Hela y NHBE (FIG. 11A y FIG.

12). También se observó un aumento en el índice oncolítico cuando se realizó el mismo experimento en una línea celular de cáncer alternativa, H460 (carcinoma de pulmón de células grandes). La adición de Ad5-156R a las células infectadas con Ad5wt también tuvo un efecto de mejora en la replicación viral (FIG. 11A). Ad5-156R se transfectó en células coinfectadas con el virus ONYX-015, que carece por completo del gen E1B-156R. La adición de Ad-156R aumentó la OI del ONYX-015 más de 5 veces en el punto temporal de 48 hpi (FIG. 11B y FIG. 12). De manera similar, la adición de Ad5-156R a las células infectadas con Ad2 aumentó la OI en 15 veces. Los serotipos de adenovirus de la misma subfamilia tienen una diferencia muy pequeña en la secuencia de proteínas en comparación (FIG. 13). El miembro de la familia de adenovirus más cercano a Ad5 es Ad2. La adición de Ad2-156R a las células infectadas con Ad5wt aumentó la OI casi el triple.

Discusión

[0129] Se descubrió pronto que el ARN expresado a partir de la región del gen de adenovirus E1B tenía un patrón de empalme complejo. El ARN de longitud completa de 2,28 kb es policistrónico y tiene dos marcos de lectura superpuestos. El uso alternativo de un sitio de inicio de traducción de flujo descendente temprano fuerte o débil produce E1B-19k y E1B-55k, respectivamente (Perricaudet, Akusjarvi et al. 1979; Bos, Polder et al. 1981). Un donante de empalme común al inicio del ORF de 55 k se usa para empalmar a tres aceptadores de empalme alternativos, 93R SA, 156R SA y 84R SA (Anderson, Schmitt et al. 1984; Virtanen y Pettersson 1985; Anderson, Maude et al. 1987). El 93R AS se empalma fuera de cuadro con el ORF de 55 k agregando un término C de 15 aminoácidos. El 156R AS se empalma en el marco con E1B-55k eliminando los 340 aminoácidos medios. El 84R SA es un sitio de flujo descendente que agrega 6 aminoácidos al término N común.

[0130] Al crear un gran conjunto de virus modificados genéticamente en base a la cepa pTG3602 de adenovirus de tipo salvaje, un clon viral se mutó en una posición de un solo nucleótido (SNP) en la región del gen E1B-55k. La mutación se realizó dentro de la secuencia del aceptor de empalme de E1B-93R, o más precisamente, cambió el sitio putativo de cag/ga a cGg/ga. La mutación no solo cambió el sitio de empalme, sino que también cambió el aminoácido E1B-55k 400 de una arginina a una glicina. Este virus ha sido nombrado Ixovex. Hemos caracterizado este virus cuando se trata del potencial oncolítico, es decir, la retención de la capacidad de replicación y la citotoxicidad en las células cancerosas mientras se inhibe en ambas cuentas en las células normales.

[0131] Nuestros resultados muestran que la mutación conduce a una falta de la proteína E1B-55K expresada en las células infectadas (FIG. 3). Creemos que esto se debe a que el cambio de aminoácidos desestabiliza la proteína E1B-55k. Otros han introducido cambios de aminoácidos en E1B-55k y varios de ellos hicieron que el nivel de proteína fuera inestable. Además, nuestra mutación cambia un importante nucleótido en el sitio 93R aceptor de empalme E1B-55k, lo que anula el empalme a ese sitio de empalme particular (FIG. 4). Para compensar, el empalme parece ser redirigido al aceptador de empalme E1B-156R. Con la falta de E1B-55k en la infección, la capacidad de Ixovex para inhibir la expresión de p53 se reduce considerablemente (FIG. 5). El nivel reducido de p53 inducido por Ixovex en comparación con Onyx-015 podría haber sido debido a la eficiencia de replicación ligeramente menor de Ixovex en células A549, es decir, las células están menos afectadas, por lo tanto, se expresa menos p53. Alternativamente, y lo que creemos, el aumento del empalme al aceptor de empalme 156R (FIG. 4) también puede aumentar la expresión de la proteína E1B-156R. El empalme 156R empalma en marco con la parte C-(carboxi)-terminal de E1B-55k. Esto elimina los 340 aminoácidos del medio, dejando los 78 aminoácidos C-terminales fusionados con los aminoácidos N-(amino)-terminal 79. El laboratorio de Dobner ha demostrado (Sieber y Dobner 2007) que la proteína E1B-156R conserva cierta capacidad para inhibir la p53 a través de su extremo C-terminal. También es posible que E1B-156R retenga otras funciones de la proteína E1B-55k. La proteína E1B-55k y E1B-156R interactúa con muchos factores similares (Sieber y Dobner 2007; Schreiner, Wimmer et al. 2010; Schreiner, Wimmer et al. 2011; Wimmer, Blanchette et al. 2012). A E1B-55k se le han asignado varias funciones además de mediar la degradación de p53. También está relacionado con la regulación de la exportación nuclear selectiva de ARN viral tardío (Dobner y Kzhyshkowska 2001; Flint y González 2003) e inhibe la traducción del ARN celular mientras promueve la traducción del ARN viral (Blackford y Grand 2009). Las funciones principales de E1B-55k están mediadas cuando la proteína está en complejo con otra proteína viral, la E4orf6. Curiosamente, se ha demostrado que la proteína E1B-156R interactúa con la proteína E4orf6 (Sieber y Dobner 2007). El E1B-156R puede compensar algunas de estas funciones, que se ajustan al aumento de la expresión de E1B-156R de Ixovex.

[0132] En las células normales, la toxicidad de cada virus reflejó en gran parte la respectiva capacidad de replicación. La falta de toxicidad y el cierre casi completo de la replicación en células normales indican un sorprendente perfil de seguridad de Ixovex. El hecho de que el virus Onyx-015 se replique mejor en células normales que en Ixovex es intrigante, ya que la eliminación que conlleva el virus Onyx-015 elimina todas las posibilidades de expresar las proteínas E1B-55k, -93R y -156R (Barker y Berk, 1987). Esto indica que es el desequilibrio de expresión en la región E1B que tuvo un impacto extenso en la atenuación de Ixovex en células normales en comparación con los otros virus. Curiosamente, la diferencia en la replicación en las células normales entre Onyx-015 y Ixo-ctrl por un lado y Ixovex por el otro no se observó en las células cancerosas. Esto indica que la infección por Ixovex en las células normales se ha vuelto no permisiva, es decir, es probable que haya un bloqueo importante al principio de la infección, lo que le da tiempo a las células para eliminar el virus, mientras que el estado transformado de las células cancerosas compensa la falta de algunas función(es) E1B-55k.

[0133] El efecto de la expresión de E1B desequilibrada en las células cancerosas era diferente dependiendo de la línea celular de cáncer. La citotoxicidad de Ixovex en las dos líneas celulares altamente permisivas para la replicación H1299 y H460 fue baja, mientras que la citotoxicidad fue alta en las líneas celulares atenuadas para la replicación, A549 y HeLa. La razón de esto es probablemente debido a la toxicidad, las células murieron antes de producir un alto número de virus.

[0134] La familia de adenovirus se divide en 7 géneros, llamado AG, con un total de más de 65 serotipos diferentes. El serotipo 5 (Ad5) pertenece a los géneros C. Creemos que el patrón de empalme observado en Ad5 se conserva entre todos los serotipos de adenovirus y que el desequilibrio a través de la mutación del sitio de empalme que causa una oncoselectividad muy ventajosa para Ad5 se reflejaría en la mayoría, si no en todos los otros serotipos. Nuestros experimentos preliminares muestran patrones de empalme similares en virus representativos de cada uno de los diferentes géneros (A-Ad12, B1-Ad3, B2-Ad11, C-Ad5, D-Ad37, E-Ad4 y F-Ad40).

[0135] La mayor eficacia global del virus Ad5wt a todos los otros virus es probablemente debido a la cepa de tipo salvaje pTG3602 (Oberg, Yanover et al. 2010), utilizado como columna vertebral del genoma para Ixovex y Ixo-ctrl. Esta columna vertebral transporta algunas mutaciones puntuales dispersas por todo el genoma. Nuestro virus Ixo-ctrl es en realidad pTG3602 en esencia. El SNP en Ixovex se revertió al estado de tipo salvaje que produce el virus Ixoctrl. En los numerosos experimentos en los que se ha empleado pTG3602, se ha observado una eficacia inferior constante, en comparación con el Ad5wt.

[0136] Una ventaja adicional de Ixovex en comparación con los vectores de adenovirus patentados de enfoque similar es que el Onyx-015 (Heise, Sampson-Johannes et al. 1997), -051 y -053 (Shen, Kitzes et al. 2001) todos faltan la región del gen E3B del virus. Esta región se eliminó originalmente para mejorar el perfil de seguridad de Onyx-015. Más tarde, se descubrió que la eliminación de esta región hacía que el vector se eliminara prematuramente del tumor mediante la defensa inmune (Wang, Hallden et al. 2003).

[0137] A través del análisis de transferencia Western en infecciones en células H1299 se demostró que Ixovex se replica y expresa proteínas virales al mismo nivel que Ad5wt. La única diferencia entre los virus se observó al usar un anticuerpo específico para la región N-terminal de E1B-55k (ratón-m2A6), un aumento drástico en la espliceoforma E1B-156R de la proteína E1B-55k (FIG. 10). Decidimos realizar una serie de experimentos de complementación para verificar si de hecho un aumento en E1B-156R podría ser responsable del aumento en el Índice Oncolítico (OI). En las figuras 11A, B y C y en la FIG. 12, mostramos que el adenovirus tipo 5 E1B-156R es un potente potenciador de el OI en el grupo C de la subfamilia. El equivalente E1B-156R de Ad2wt también demostró tener un efecto positivo en el OI de Ad5wt. Curiosamente, la adición de Ad5-156R a las células H460 infectadas con Ad5wt aumentó la replicación del virus, lo que estuvo en línea con el nivel de replicación mucho mayor de Ixovex en comparación con el virus ONYX-015 (que carece del gen E1B-156R) en las células H460 (Ver Figura 6).

[0138] Es importante señalar que estos experimentos, en los que E1B-156r se complementa a las células infectadas por virus no se parece completamente la infección con Ixovex u otro virus modificado que expresa E1B-156r. Por ejemplo, durante la infección viral con Ixovex Ad5-156R los niveles aumentan cuando el virus se replica, es decir, la cantidad de la plantilla de expresión (ADN viral) aumenta. En contraste, en los experimentos de complementación, el E1B-156R se proporciona a un nivel de plantilla constante, es decir, a medida que las células continúan dividiéndose durante la fase temprana de la infección, el plásmido que alberga el gen E1B-156R se diluye. Por lo tanto, cuando el virus comience a replicar la expresión de E1B-156R no aumentará exponencialmente (como sería el caso de una copia viral). Sin embargo, estos experimentos muestran claramente que la adición de E1B-156R tiene el efecto de aumentar el índice oncolítico y sugiere que E1B-156R es responsable de este efecto.

Referencias

[0139]

Anderson, C. W., R. C. Schmitt, et al. (1984). "Early region 1B of adenovirus 2 encodes two coterminal proteins of 495 and 155 amino acid residues." Journal of virology 50(2): 387-396.

Anderson, R. E., M. B. Maude, et al. (1987). "Abnormal plasma levels of polyunsaturated fatty acid in autosomal dominant retinitis pigmentosa." Experimental eye research 44(1): 155-159.

Barker, D. D. and A. J. Berk (1987). "Adenovirus proteins from both E1B reading frames are required for transformation of rodent cells by viral infection and DNA transfection." Virology 156(1): 107-121.

Beatty, M. S. and D. T. Curiel (2012). "Adenovirus strategies for tissue-specific targeting." Advances in cancer research 115: 39-67.

Blackford, A. N. and R. J. Grand (2009). "Adenovirus E1B 55-kilodalton protein: multiple roles in viral infection and cell transformation." Journal of virology 83(9): 4000-4012.

Bos, J. L., L. J. Polder, et al. (1981). "The 2.2 kb E1b mRNA of human Ad12 and Ad5 codes for two tumor antigens starting at different AUG triplets." Cell 27(1 Pt 2): 121-131.

Bradshaw, A. C. and A. H. Baker (2012). "Gene therapy for cardiovascular disease: Perspectives and potential." Vascular pharmacology.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un adenovirus recombinante en el que la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula cancerosa, y en el que el adenovirus recombinante lleva una mutación en la secuencia del gen E1B del adenovirus y la mutación en el gen E1B es A3216G en donde la numeración es relativa al genoma Ad5 del adenovirus (número de acceso) AC_000008.1) (SEQ ID NO: 41) (posición 1503 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)) o una mutación puntual de guanina en una posición equivalente a 3216 en cualquier otro serotipo de adenovirus.

2. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1, en el que el adenovirus es adenovirus serotipo Ad5, tal como adenovirus serotipo Ad5 cepa pTG3602.

3. El adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente, donde el gen E1B tiene la secuencia de polinucleótido de acuerdo con SEQ ID NO: 1.

4. El adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente, donde:

(a) la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta con relación a la isoforma E1B-496R;

(b) la proporción de la isoforma E1B-496R disminuye en relación con los niveles de tipo salvaje;

(c) la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta con relación a la isoforma E1B-93R;

(d) la proporción de la isoforma E1B-156R aumenta con relación a la isoforma E1B-84R; y/o

(e) la proporción de la isoforma E1B-93R disminuye en relación con los niveles de tipo salvaje.

5. El adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente, donde la proporción de la isoforma E1B-156R se incrementa en por lo menos 2 veces, 4 veces, 10 veces, 100 veces, 1000 veces o 10.000 veces y/o la proporción de la isoforma E1B-496R se disminuyó al menos 2 veces, 4 veces, 10 veces, 100 veces, 1000 veces o 10.000 veces.

6. El adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente, donde la proporción de isoformas E1B-156R, E1B-496R, E1B-93R, o E1B-84R se refiere a:

(a) el nivel de la proteína isoforma que se expresa; y/o

(b) el nivel del ARNm de la isoforma que se transcribe.

7. El adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente, donde:

(a) La isoforma E1B-156R tiene una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2;

(b) la isoforma E1B-156R tiene una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3;

(c) La isoforma E1B-496R tiene una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 4;

(d) la isoforma E1B-496R tiene una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5;

(e) la isoforma E1B-93R tiene una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6;

(f) la isoforma E1B-93R tiene una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7;

(g) la isoforma E1B-84R tiene una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8; y/o

(h) la isoforma E1B-84R tiene una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9.

8. El adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente, donde la célula cancerosa es una célula neoplásica.

9. El adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente, donde el efecto oncolítico medido por:

(a) infección viral de células;

(b) la replicación selectiva del genoma viral en células cancerosas que conduce a una lisis celular mediada por virus preferencial en células cancerosas y la liberación de partículas virales para futuros eventos de infección.

10. Un polinucleótido que codifica el adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente, que es opcionalmente un vector adecuado para la producción de adenovirus en una célula huésped.

11. Una célula huésped aislada que comprende un polinucleótido que codifica el adenovirus recombinante de cualquier reivindicación precedente.

12. Un adenovirus recombinante para uso en el tratamiento del cáncer, en el que el adenovirus recombinante se caracteriza porque la proporción de la isoterma E1B-156R aumenta en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, y en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula cancerosa.

13. Una composición que comprende un adenovirus recombinante para uso como agente terapéutico, en donde el adenovirus recombinante se caracteriza porque la proporción de la isoterma E1B-156R aumenta con respecto al nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, y en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula cancerosa.

14. Una composición que comprende un adenovirus recombinante para uso en el tratamiento de un paciente con cáncer, en donde el adenovirus recombinante se caracteriza porque la proporción de la isoforma E1B-156R se incrementa en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, y en el que el adenovirus tiene un efecto oncolítico en una célula cancerosa.

15. Un método para convertir un adenovirus oncolítico mediante la modificación de la secuencia del gen E1B para aumentar el nivel de la isoforma E1B-156R en relación con el nivel en el adenovirus de tipo salvaje equivalente, en donde el gen E1B está mutado a A3216G donde la numeración es relativa al genoma Ad5 de adenovirus (número de acceso AC_000008.1) (SEQ ID NO: 41) (posición 1503 en el gen E1B (SEQ ID NO: 1)) o una mutación de punto de guanina en una posición equivalente a 3216 en cualquier otro serotipo de adenovirus.