ES2715889T3 - Estructura cristalina del dominio de tipo proteína de transferencia de glicolípidos de la proteína adaptadora de cuatro fosfatos 2 humana - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un compuesto que se une a la proteína adaptadora fosfoinositol 4-fosfato 2 (FAPP2), que comprende identificar computacionalmente un compuesto que se une a FAPP2 mediante las coordenadas atómicas de (i) al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2; o (ii) al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Estructura cristalina del dominio de tipo proteína de transferencia de glicolípidos de la proteína adaptadora de cuatro fosfatos 2 humana

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la provisión de una estructura cristalina de alta resolución del dominio de tipo proteína de transferencia de glicolípidos (GLTP) de la proteína adaptadora de cuatro fosfatos 2 (FAPP2) humana y al uso de esta estructura en el descubrimiento de fármacos.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Fabry (a veces llamada también enfermedad de Anderson-Fabry) es un trastorno ligado al cromosoma X raro caracterizado por la ausencia de la a-galactosidasa A (a-Gal A), una enzima requerida para el procesamiento normal de glicoesfingolípidos en lisosomas de mamíferos. La pérdida de a-Gal A conduce a la acumulación de la globotriaosilceramida neutra (Gb3), también conocida como ceramida trihexósido (CTH), dentro de las células del corazón, riñón, hígado y endotelio vascular. Las enfermedades renales y cardíacas son la causa más común de mortalidad y morbilidad en los pacientes con Fabry [1, 2]. Los machos hemicigotos, las hembras homocigotas y algunas hembras heterocigotas experimentan disfunción progresiva de órganos que se manifiesta clínicamente como angioqueratomas, acroparatesis, accidente cerebrovascular, cardiomiopatías, infarto del miocardio e insuficiencia renal [1]. El riñón es excepcionalmente susceptible al daño por la deposición de Gb3 con varios informes publicados de glicoesfingolípidos localizados en los podocitos, las células del endotelio vascular, y las células epiteliales del glomérulo. La pérdida de podocitos por la apoptosis conduce a glomeruloesclerosis y reduce drásticamente la función renal. Los individuos afectados varían en la progresión de la enfermedad y la gravedad de los síntomas.

Históricamente, las opciones de tratamiento para pacientes con Fabry se limitaron al alivio de los síntomas de las complicaciones renales y cardiovasculares [3]. Los intentos de tratamientos más severos, a saber trasplante de órganos [4,5] y plasmaféresis [6], no tuvieron éxito. Actualmente, están disponibles dos fármacos de galactosidasa para el tratamiento de la enfermedad de Fabry a través de la terapia de reemplazo enzimático (ERT): agalsidasa alfa (Replagal®, TKT/Shire) y agalsidasa beta (Fabrazyme®, Genzyme). Estas terapias basadas en proteína se administran mediante (aprobada para) inyección intravenosa y suministran actividad galactosidasa a los lisosomas de órganos afectados para reducir el nivel de acumulación de Gb3. Se necesitan enfoques adicionales a ERT para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosomal, tal como la enfermedad de Fabry.

Una estrategia alternativa a ERT es la terapia de reducción de sustratos (SRT). Esta funciona sobre la base de limitar la cantidad de sustrato patológico (es decir, Gb3) en el paciente. La patología de la enfermedad de Fabry surge como un resultado de la capacidad reducida del paciente de degradar Gb3 y la acumulación resultante del sustrato, y el objetivo de la SRT es reducir la cantidad de esta sustancia patológica que está presente.

Gb3, como los otros glicoesfingolípidos complejos se sintetiza a partir de la glucosilceramida (GlcCer) en el aparato de Golgi. Recientemente se ha demostrado que FAPP2, una proteína de transferencia citosólica, tiene un papel importante en la división de GlcCer en diferentes vías para la síntesis posterior de diferentes GSL en diferentes compartimentos celulares. Se ha demostrado que FAPP2 es responsable de suministrar GlcCer directamente a la red de Trans Golgi (TGN). En la TGN los globo y asialoesfingolípidos, incluido Gb3, se sintetizan a partir de GlcCer. Otra GlcCer se mueve a través de la ruta vesicular a las cisternas del aparato de Golgi, para producir la serie ganglio de esfingolípidos en las cisternas del aparato de Golgi. Se ha demostrado además que los ratones FAPP-2 -/- tienen una disminución selectiva en Gb3 en los riñones [7].

En vista de este papel de FAPP2 en la síntesis de Gb3, FAPP2 representa una diana para el SRT para el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Se ha propuesto el SRT para los trastornos de almacenamiento lisosomal tale como enfermedad de Gaucher y enfermedad de Niemann-Pick tipo C, y Zavesca® (Actelion) se ha aprobado para el tratamiento de pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1 leve a moderada quienes no pudieron recibir el tratamiento estándar de ERT y para el tratamiento de los síntomas neurológicos de los pacientes enfermos de todas las edades con la enfermedad de Niemann-Pick tipo C. Los inhibidores de FAPP2 que son adecuados para el SRT de la enfermedad de Fabry, sin embargo, no están disponibles actualmente.

Si bien la estructura del dominio GLTP de FAPP2 humana se ha modelado, en base a la estructura cristalina de la proteína de trasferencia de glicolípidos humana (GLTP) [8], se necesita una estructura cristalina de alta resolución de la porción de unión a glicolípidos de FAPP2 para desarrollar inhibidores de FAPP2 adecuados para el SRT. En particular, se conoce que FAPP2 tiene una especificidad de transferencia de lípidos diferente a GLTP, siendo FAPP2 incapaz de transferir determinados glicolípidos que la GLTP transfiere fácilmente, tales como los glicolípidos cargados negativamente. Además, existen diferencias en la estructura de las dos proteínas, que se reflejan en su diferente contenido de hélices y la Tm relativamente baja del dominio GLTP de FAPP2, el cual exhibe desplegado térmico con una Tm de aproximadamente 41 °C, en comparación con 53 °C para GLTP [8].

Es de particular interés el desarrollo de inhibidores que sean específicos para FAPP2, y la comprensión de la estructura de FAPP2 y de cómo esta puede diferir de otras moléculas relacionadas y no relacionadas es importante en este proceso.

Breve descripción de la invención

Se ha generado una estructura cristalina de alta resolución del dominio GLTP de FAPP2 (FAPP2-C212). La estructura muestra que los residuos que interactúan con el grupo principal azúcar de GlcCer (incluidos D360, N364, W407) están bien refinados y también que otros residuos (por ejemplo, hidrófobos) interactúan con las cadenas acilo/esfingosina de la ceramida. La estructura de alta resolución puede usarse para diseñar y optimizar los inhibidores de FAPP2. La información estructural del nivel atómico no estuvo disponible para el dominio GLTP de FAPP2 antes de la presente invención y esta información es importante para comprender las relaciones de estructura-función en la actividad de FAPP2 y permite el diseño y el análisis de nuevos inhibidores de FAPP2.

Los aspectos de la invención se basan en la cristalización exitosa de los inventores del dominio GLTP de FAPP2 y la posterior determinación de la estructura polipeptídica tridimensional. El dominio GLTP de FAPP2 corresponde a los 212 aminoácidos en dirección C terminal en FAPP2 humana (residuos 308-519 mediante el uso de la numeración de FAPP2 humana). Es particularmente sorprendente que haya sido posible cristalizar el dominio GLTP de FAPP2, ya que este es una molécula relativamente flexible e inestable (como se evidencia por su baja Tm) y se despliega completamente incluso a alrededor de 45 °C. Los amplios esfuerzos anteriores para generar cristales del dominio GLTP de FAPP2 no fueron exitosos. Solo cuando el inventor escogió la lisozima T4L como una etiqueta de fusión cristalizable fue posible generar cristales, a partir de los cuales se generó la estructura como se define con más detalle más adelante.

Por lo tanto, en la presente descripción se describe un polipéptido que comprende el dominio GLTP de FAPP2, fusionado a T4L.

Específicamente, la invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 95 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 308-519 de FAPP2 (sec. con núm. de ident.:1) y una secuencia de aminoácidos con al menos 95 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 2-164 de la lisozima T4L (sec. con núm. de ident.:2), en donde opcionalmente el polipéptido comprende:

a) los residuos D360, N364, W407 de FAPP2 humana, en donde la numeración es de acuerdo con la sec. con núm. de ident.:4, y/o

b) la secuencia sec. con núm. de ident.:3 o un fragmento de esta, en donde opcionalmente el polipéptido consiste en la secuencia sec. con núm. de ident.:3.

Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes y los vectores se proporcionan además, al igual que las células huésped que las contienen.

Se describe además la forma cristalina del polipéptido de la invención.

Se describe además un método para obtener la forma cristalina del polipéptido de la invención que comprende proporcionar un polipéptido de la invención, y concentrar el polipéptido a una concentración de polipéptido a la cual este precipita y forma cristales. Se proporciona además la forma cristalina obtenible a partir de este método.

Las coordenadas atómicas proporcionadas en la presente descripción para el dominio GLTP de FAPP2, y los subconjuntos de estas y los modelos de la estructura tridimensional que pueden generarse mediante el uso de las coordenadas atómicas proporcionadas en la presente descripción pueden usarse para identificar, diseñar, seleccionar, y/u optimizar los compuestos de unión a FAPP2. Tales compuestos podrían usarse para inhibir FAPP2, y de este modo reducir los niveles de Gb3.

Los aspectos de la invención se relacionan por lo tanto con métodos para identificar un compuesto que se une a FAPP2. Este método comprende identificar computacionalmente un compuesto que se une a FAPP2 mediante el uso de las coordenadas atómicas de (i) al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2; o (ii) al menos el dominio GLTP de FAPP2, como se expone en la Tabla 3. Un compuesto que se une a un polipéptido de FAPP2 puede identificarse computacionalmente mediante el uso de dichas coordenadas. En un aspecto adicional la invención proporciona un método para diseñar, seleccionar y/u optimizar un compuesto que se une a FAPP2 que comprende: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2 y b) diseñar, seleccionar y/u optimizar computacionalmente dicho compuesto realizando una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para diseñar, seleccionar y/u optimizar un compuesto que se une a FAPP2 que comprende: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas para al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3 y b) diseñar, seleccionar y/u optimizar computacionalmente dicho compuesto realizando una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 que comprende: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2; b) realizar computacionalmente una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas; y c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y FAPP2.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 que comprende: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas para al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3 y b) realizar computacionalmente una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas; y c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y FAPP2.

En la presente descripción se describe además un método para usar una computadora para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 en donde dicha computadora comprende un medio de almacenamiento de datos legible en máquina que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con las coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, por ejemplo, como se expone en la Tabla 2 y los medios para generar una representación gráfica tridimensional de la estructura de dichos aminoácidos y dicho método comprende: a) ubicar un primer compuesto mediante el uso de una representación gráfica tridimensional de la estructura del compuesto y todo o parte del bolsillo de unión a sustrato de FAPP2; b) realizar una operación de ajuste entre el compuesto y el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2 mediante el empleo de medios computacionales; y c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2.

En la presente descripción se describe además un método para usar una computadora para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 en donde dicha computadora comprende un medio de almacenamiento de datos legible en máquina que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con las coordenadas atómicas para al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3 y los medios para generar una representación gráfica tridimensional de este y dicho método comprende: a) ubicar un primer compuesto mediante el uso de una representación tridimensional gráfica de la estructura del compuesto y todo o parte del dominio GLTP de FAPP2; b) realizar una operación de ajuste entre dicho compuesto y el dominio GLTP de FAPP2 mediante el empleo de medios computacionales; y c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre dicho compuesto y el dominio GLTP de FAPP2.

En la presente descripción se describe además un medio legible por computadora que comprende las coordenadas atómicas para el polipéptido de la invención o un subconjunto de estas, y una computadora que comprende el medio legible por computadora de la invención.

Un sistema informático que comprende una unidad de memoria que comprende las coordenadas de la estructura cristalográfica por rayos X que definen el polipéptido de la invención o un subconjunto de estas; y un procesador en comunicación eléctrica con la unidad de memoria; en donde el procesador genera un modelo molecular que tiene una estructura tridimensional representativa de al menos una porción de dicho polipéptido también forma parte de la descripción.

En la presente descripción se describe además un método para producir una composición farmacéutica que comprende diseñar, seleccionar y/u optimizar un compuesto con los métodos de la invención, modificar el compuesto identificado para la administración como un producto farmacéutico y formular el producto obtenido con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En la presente descripción se describe además el uso de la estructura de la forma cristalina de la invención o una porción de la estructura en el modelado de un compuesto de unión que se une a FAPP2, así como también el uso de las coordenadas atómicas de la forma cristalina de la invención o un subconjunto de las coordenadas atómicas, en el modelado de un compuesto de unión que se une a FAPP2.

Se describe además un compuesto identificado, diseñado, seleccionado y/u optimizado mediante un método de la invención, y el cual opcionalmente se ha modificado para la administración como un producto farmacéutico, y/o el cual se ha formulado como un producto farmacéutico. Tales compuestos pueden usarse como un medicamento, por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Se describen además los métodos para tratar o evitar la enfermedad de Fabry que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto o producto farmacéutico tal a un paciente que lo necesite.

Polipéptido

Anteriormente ha fue posible cristalizar el dominio GLTP de FAPP2, al menos porque este es un péptido muy flexible con una baja temperatura de fusión. Mediante la fusión de los aminoácidos 2-164 de la secuencia de lisozimas del fago T4 al dominio GLTP de FAPP2 (aminoácidos 308-519 de FAPP2), los inventores encontraron sorprendentemente que era posible generar cristales. Los cristales de la proteína de fusión que se generaron contenían dos moléculas de la proteína de fusión en cada unidad asimétrica. La T4L de las moléculas adyacentes en la red cristalina hace amplios contactos que parecen haber facilitado la cristalización (Figuras 1A y B). La fusión de la secuencia de T4L al dominio GLTP de FAPP2 por lo tanto tiene ventajas en que permite que se generen los cristales de este polipéptido para su análisis. Anteriormente se ha usado T4L como una fusión solo con los receptores acoplados a proteína G (GPCR), ya sea en el extremo N-terminal o en el medio de la molécula [9, 10, 11]. Estas son proteína de una naturaleza muy diferente a la del dominio GLTP de FAPP2. En la presente descripción se describe un polipéptido que comprende el dominio GLTP de FAPP2, fusionado a un polipéptido de T4L. El dominio GLTP de FAPP2 puede estar en dirección C terminal o N terminal al polipéptido de T4L. En determinadas modalidades la FAPP2 es la FAPP2 humana. La secuencia de longitud completa de FAPP2 humana se establece en la sec. con núm. de ident.:4. La secuencia de los 212 aminoácidos del extremo C terminal de FAPP2 humana (aminoácidos 308-519 de FAPP2) que conforma el dominio GLTP se establece en la sec. con núm. de ident.:1 y la secuencia de aminoácidos 2-164 del polipéptido de T4L se establece en la sec. con núm. de ident.:2.

La invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 95 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 308-519 de FAPP2 (sec. con núm. de ident.:1) y una secuencia de aminoácidos con al menos 95 % identidad de secuencia con los aminoácidos 2-164 de la lisozima T4L (sec. con núm. de ident.:2), en donde opcionalmente el polipéptido comprende:

a) los residuos D360, N364, W407 de FAPP2 humana, en donde la numeración es de acuerdo con la sec. con núm. de ident.:4, y/o

b) la secuencia sec. con núm. de ident.:3 o un fragmento de esta, en donde opcionalmente el polipéptido consiste en la secuencia sec. con núm. de ident.:3.

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 95 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 308-519 de FAPP2 (sec. con núm. de ident.:1) y una secuencia de aminoácidos con al menos 95 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 2-164 de la lisozima T4L (sec. con núm. de ident.:2) por lo tanto forma parte de la invención. Opcionalmente el polipéptido tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia sec. con núm. de ident.:3.

El polipéptido de la invención comprende los residuos L349, D360 N364, K367, W407 R410, F414, 1429, Y437, L441, H445, V449, F453, A456, F466, L470, V342, L346, V357, L361, L433, V452, L488, Y491, V345, N399, E403, R398, F311 y F312 en una modalidad, y en una modalidad adicional comprende la secuencia sec. con núm. de ident.:3 o un fragmento de esta. En otra modalidad el polipéptido de la invención consiste en la secuencia sec. con núm. de ident.:3 o un fragmento de esta. El polipéptido que consiste en la secuencia sec. con núm. de ident.:3 puede denominarse como T4L-FAPP2-C212.

Los polipéptidos de mayor preferencia tienen un porcentaje de identidad mayor que 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 %, respectivamente con la secuencia de aminoácidos 308-519 de FAPP2 (sec. con núm. de ident.:1) y/o aminoácidos 2­ 164 de la lisozima T4L (sec. con núm. de ident.:2), y/o pueden tener un porcentaje de identidad mayor que 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 %, respectivamente con la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:3. El porcentaje de identidad, como se menciona en la presente descripción, se determina mediante el uso de BLAST versión 2.1.3 que usa los parámetros predeterminados especificados por el NCBI (el Centro Nacional para la Información Biotecnológica; www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matriz; penalización por apertura de interrupción=11 y penalización por amplitud de interrupción=1].

Tales polipéptidos pueden contener una secuencia que difiere de las secuencias de referencia por sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos de la secuencia de referencia, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, 15, 20 25, 30 o 35 o más aminoácidos, o hasta este número de aminoácidos. Tales secuencias incluyen proteínas que contienen sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan la función o actividad de la proteína de una manera adversa.

Las inserciones pueden incluir enlazadores, por ejemplo, entre la secuencia de T4L y la secuencia de FAPP2. Los ejemplos adecuados de aminoácidos que pueden usarse en enlazadores incluyen treonina, serina, prolina, asparagina, glicina. Preferentemente, el enlazador comprende uno o más residuos de glicina. Con mayor preferencia el enlazador consiste en uno o más residuos de glicina (por ejemplo, es una única glicina).

Los fragmentos de los polipéptidos de referencia contienen por lo tanto deleciones (por ejemplo, desde el extremo N o C terminal o internamente) de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos.

El polipéptido de la invención puede comprender adicionalmente una etiqueta, por ejemplo, para el uso en la preparación y/o purificación del péptido. Tales etiquetas se conocen bien en la técnica e incluyen por lo tanto sus etiquetas. Un enlazador también puede estar presente entre cualquier etiqueta y la secuencia de T4L o secuencia de FAPP2.

En determinadas modalidades, se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de la invención. En determinadas modalidades, el ácido nucleico comprende la secuencia como se expone en la sec. con núm. de ident.: 5, o un fragmento de esta.

Las sustituciones, adiciones y deleciones en el polipéptido de la invención pueden generarse cuando se hacen cambios apropiados en la molécula de ácido nucleico codificante de la invención y como tal, el ácido nucleico de la invención puede comprender una o más sustituciones, adiciones, deleciones o duplicaciones de nucleótidos.

Las modificaciones y mutaciones que generan un polipéptido con una variante de sustitución, adición y/o deleciones pueden hacerse dentro de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de la invención.

Las modificaciones y mutaciones incluyen deleciones, mutaciones puntuales, truncaciones, cambios de ácidos nucleicos que conducen a sustituciones de aminoácidos, y cambios de ácidos nucleicos que conducen a la adición de aminoácidos.

Las modificaciones de ácidos nucleicos pueden hacerse para generar variantes que son silentes con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado, pero que proporcionan codones preferidos para la traducción en un huésped particular. Los codones preferidos para la traducción de un ácido nucleico en sistemas de expresión específicos no de mamíferos, tales como sistemas procariotas, se conocen bien en la técnica, por ejemplo, [12;13;14]. Todavía pueden hacerse otras modificaciones a las secuencias no codificantes para potenciar o controlar la expresión del gen codificante.

La secuencia de ácidos nucleicos codificante puede estar presente en un vector. El vector puede incluir una secuencia codificante asociada operativamente con una o más secuencias reguladoras. Una secuencia codificante y las secuencias reguladoras se "asocian operativamente con" cuando se enlazan covalentemente para ubicar la expresión o transcripción de la secuencia codificante bajo el control de la secuencia reguladora. Una región promotora se asocia operativamente con una secuencia codificante si la región promotora es capaz de modular la transcripción de la secuencia codificante.

La naturaleza de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre especies o tipos celulares, pero pueden incluir en general secuencias no transcritas 5' y secuencias no traducidas 5' implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción respectivamente, tales como, por ejemplo, caja TATA, secuencia caperuza, secuencia CAAT. Las secuencias reguladoras no transcritas 5' pueden incluir una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen asociado operativamente. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Las secuencias reguladoras pueden incluir además secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en dirección corriente arriba.

Una secuencia de ADN asociada operativamente con una secuencia reguladora puede insertarse mediante la restricción y ligación en un vector, por ejemplo, para el transporte entre diferentes ambientes genéticos o para la expresión en una célula huésped. Los vectores se componen típicamente de ADN o ARN. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, cósmidos, cromosomas artificiales y fagémidos. Un vector de clonación es uno que es capaz de replicarse en una célula huésped, y el cual se caracteriza además por uno o más sitios de restricción por endonucleasas en los cuales el vector puede cortarse y en los cuales puede insertarse una secuencia de ácidos nucleicos deseada (por ejemplo, un marco de lectura abierto). Los vectores pueden contener una o más secuencias de marcadores adecuadas para el uso en la identificación de células que se han transformado o transfectado o no con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que aumentan o disminuyen ya sea la resistencia o la sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades son detectables mediante ensayos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina o luciferasa), y genes que afectan visiblemente el fenotipo de células, huéspedes, colonias o placas transformadas o transfectadas.

Para sistemas procariotas, pueden usarse vectores plasmídicos que contengan sitios de replicación y secuencias de control derivadas de una especie compatible con el huésped. Preferentemente, el vector tiene la capacidad de replicarse de manera autónoma en la célula huésped. Los huéspedes procariotas útiles incluyen bacterias tales como E. coli. Para expresar un polipéptido en una célula procariota, es deseable unir operativamente su secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc) a un promotor procariota funcional. Tal promotor puede ser ya sea constitutivo o regulable (por ejemplo, mediante inducción o desrepresión).

Las células eucariotas incluyen, por ejemplo levadura, hongos, células de insectos, y células de mamíferos. Además, las células vegetales también están disponibles como huéspedes, y se conocen en la técnica las secuencias de control compatibles con las células vegetales.

Puede emplearse una amplia variedad de secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, en dependencia de la naturaleza del huésped. Las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden derivarse de fuentes virales, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino y virus de simios. Pueden emplearse promotores de mamíferos, tales como, por ejemplo, actina, colágeno y miosina. Pueden seleccionarse señales reguladoras de inicio de la transcripción que permitan la represión o activación, de manera que pueda modularse la expresión de las secuencias génicas, por ejemplo, mediante señales reguladoras, tales como la represión/iniciación a través de cambios en la temperatura o mediante la adición de una molécula de modulación química o biológica.

Pueden emplearse vectores que sean capaces de integrar unas secuencias génicas deseadas en el cromosoma de la célula huésped. Las células que han integrado establemente el ácido nucleico introducido en sus cromosomas pueden seleccionarse además mediante la introducción de uno o más marcadores que permiten la selección de células huésped que contengan el vector de expresión. La secuencia del gen marcador de selección puede enlazarse directamente a las secuencias génicas a expresar o introducirse en la misma célula mediante cotransfección. También pueden necesitarse elementos adicionales, tales como señales de corte y empalme, promotores de la transcripción, potenciadores y señales de terminación para la síntesis óptima de ARNm.

Una vez que se ha preparado un vector deseado o secuencia de ácidos nucleicos deseada, el vector o la secuencia de ácidos nucleicos se introduce en una célula huésped apropiada mediante cualquiera de una variedad de medios adecuados, por ejemplo, transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, o microinyección directa. Después de la introducción del vector, las células receptoras se cultivan en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de células que contienen el vector. La expresión de la secuencia génica clonada da como resultado la producción del polipéptido recombinante.

Preparación de cristales

En la presente descripción se describen los métodos para cristalizar el polipéptido de la invención, por ejemplo, proporcionando un polipéptido de la invención, y concentrando el polipéptido a una concentración de polipéptido a la cual este precipita y forma cristales.

En determinadas modalidades, los métodos para cristalizar el polipéptido de la invención implican cristalizar el polipéptido recombinante purificado de la invención.

Puede emplearse una amplia variedad de condiciones de cristalización para proporcionar cristales del polipéptido de la invención, por lo tanto, se contempla una amplia variedad de condiciones de cristalización. Cada proteína cristaliza bajo un único conjunto de condiciones, tales como, por ejemplo, sobresaturar la solución que contiene la proteína; y/o añadir agentes precipitantes o cristalizantes, sales, metales y/o tampones a la solución que contiene la proteína.

Puede emplearse cualquier técnica de cristalización conocida por los expertos en la técnica para obtener los cristales del polipéptido de la invención, que incluye, pero no se limita a, cristalización discontinua, difusión por vapor (por ejemplo, ya sea mediante gota asentada o gota colgante), y micro diálisis. En algunos casos puede requerirse la siembra para obtener cristales de calidad para rayos X. Por lo tanto, puede usarse la micro y/o macro siembra estándar de cristales. En determinadas modalidades, los cristales del polipéptido de la invención se cultivan mediante el uso del método de difusión por vapor con gota colgante.

Los cristales del polipéptido de la invención pueden cultivarse a cualquier temperatura adecuada para la cristalización. Por ejemplo, los cristales pueden cultivarse a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 30 °C. En determinadas modalidades, los cristales de la presente invención se cultivan a una temperatura de entre aproximadamente 0 °C a aproximadamente 10 °C. En determinadas modalidades, los cristales de la presente invención se cultivan a una temperatura de entre aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C. En otras modalidades los cristales de la presente invención se cultivan a una temperatura de entre aproximadamente 5 °C-aproximadamente 10 °C, aproximadamente 10 °C a aproximadamente 15 °C, aproximadamente 15 °C a aproximadamente 20 °C, aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C, aproximadamente 25 °C a aproximadamente 30 °C.

En determinadas modalidades, los cristales del polipéptido de la invención se cultivan a una temperatura de aproximadamente, 10 °C, 11 °C, 12 °C, 13 °C, 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C o temperatura ambiente. Los cristales del polipéptido de la invención se cultivan típicamente a partir de una solución de cristalización que comprende uno o más precipitantes. En determinadas modalidades los precipitantes pueden seleccionarse de polímeros, poliéteres, alcoholes, sales y/o polioles. En determinadas modalidades, estos precipitantes se seleccionan del grupo que consiste en monometil éter (ME); polietilenglicol PEG-400; PEG- 1000; PEG-2000; PEG-3000; PEG-8000; PEG 20,000; ((NH^SO4); 2-propanol; 1,4-butanediol; tartrato de K/Na; etanol; NaCl; citrato de sodio; NaH2P0^K2HP04; etilenglicol; dioxano; 2-metil-2,4-pentanediol (MPD);polietileneimina; terc-butanol; y 1,6-hexanodiol.

En determinadas modalidades, las condiciones de cristalización pueden comprender además una o más sales. Por lo tanto, en determinadas modalidades las condiciones de cristalización comprenden además una o más sales seleccionadas del grupo que consiste en MgCh; Zn(OAc)2, LÍSO4, Ca(OAc)2, NaCI; (NH^S04, CdCl2, C0CI2, MgS04, y NÍCI2, preferentemente MgCl2 y/o NaCl. En determinadas modalidades, las condiciones de cristalización comprenden además uno o más tampones seleccionados del grupo que consiste en ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico (CHES); ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES); ácido N-ciclohexil-3-aminopropanosulfónico (CAPS); ácido N-ciclohexil-2-hidroxil3-aminopropanosulfónico (CASPO); ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina- 1 - etano sulfónico (HEPES); ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS); 2-amino-2-(hidroximetil)- 1,3-propanediol (Tris); piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES); ácido N-(2-Acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES); ácido N,N-Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES); ácido N-Tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico (TES); ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (ADA); tris(2-carboxiletil)fosfina (TCEP); acetamido glicina; cloruro de colamina; glicinamida; bicina; N-(2-Hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)glicina (tricina); imidazol; citrato de sodio; acetato de sodio; cacodilato; fosfato de Na/K, y tampones como se describe en [15], preferentemente tris. Los precipitantes que pueden usarse para cristalizar el polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, sulfato de litio; PEG-400; p EG-550 MME; PEG-2000; PEG-6000; PEG-8000; PEG 20000; y/o 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD).

En determinadas modalidades, el pH de la solución de cristalización está entre aproximadamente un pH de aproximadamente 4 a pH de aproximadamente 9. En determinadas modalidades, el pH de la solución de cristalización está entre aproximadamente un pH de aproximadamente 6,5 a un pH de aproximadamente 9. En determinadas modalidades, el pH de la solución de cristalización es de aproximadamente 7,0. En determinadas modalidades, el pH de la solución de cristalización está cerca del punto isoeléctrico de la proteína.

En una modalidad específica, el polipéptido de la invención se tamiza a una concentración de aproximadamente 6 mg/ml para condiciones de cristalización mediante el uso del método de difusión por vapor con gota asentada empleando un kit de tamizaje de cristalización de matriz aleatoria. Tales kits están disponibles comercialmente, por ejemplo, el kit de cristalización de matriz aleatoria JCSG-I de Qiagen. En una modalidad específica, el polipéptido de la invención se cristaliza bajo las condiciones #6 (MgCh 0,2 M, Tris 0,1 M, pH 7,0, NaCl 2,5 M). En otras modalidades las condiciones son MgCh 0,1 -0,3 M, NaCl 1,5-3 M, Tris 0,1 M pH7. Puede usarse aproximadamente 6-20 mg/ml de proteína.

En determinadas modalidades, los cristales se tamizan para condiciones criogénicas óptimas para congelar los cristales a la temperatura de nitrógeno líquido, por ejemplo, para atenuar el daño por radiación de los cristales que se produce durante la recolección de datos. En determinadas modalidades, el tamizaje para condiciones criogénicas óptimas puede llevarse a cabo en tampones de cristalización que contienen 20-35 % v/v de polioles, tales como glicerol, etilenglicol o 2-metil-2,4-pentanediol (MPD), o 35-70 % p/v de azúcares, tales como sacarosa o xilitol. Los cristales pueden empaparse en el tampón criogénico durante aproximadamente 5-15 minutos. En una modalidad específica, la protección criogénica de los cristales de la invención, cultivados en la condición #6 (MgCh 0,2 M, Tris 0,1 M, pH 7,0, NaCl 2,5 M) se logra empapando los cristales en un tampón criogénico que contiene glicerol y xilitol (MgCh 0,2 M, Tris 0,1 M, pH 7,0, NaCl 2,5 M, glicerol al 10 % y xilitol al 5 %).

Los cristales del polipéptido de la invención pueden incluir además un compuesto de unión unido al dominio GLTP del polipéptido de FAPP2. El complejo del polipéptido y el compuesto de unión pueden formarse antes, después o durante la cristalización. En determinadas modalidades, los cristales del polipéptido de la invención y las condiciones de cristalización comprenden además un compuesto de unión. Por lo tanto, en determinadas modalidades, la solución de cristalización del método anterior comprende además un compuesto de unión para proporcionar un complejo de polipéptido de dominio GLTP de FAPP2 -compuesto de unión. En determinadas modalidades, el polipéptido de dominio GLTP de FAPP2 proporcionado por el método anterior se empapa en una solución de un compuesto de unión para proporcionar un complejo de polipéptido de dominio GLTP de FAPP2-compuesto de unión.

En determinadas modalidades, un compuesto de unión se une en el bolsillo de unión a sustrato del polipéptido de dominio GLTP de FAPP2. En algunas modalidades, el inhibidor es un inhibidor reversible.

En otras modalidades, el compuesto de unión se une fuera del bolsillo de unión a sustrato en uno o más sitios exo. En algunas modalidades, el compuesto de unión, ya sea si está unido en el bolsillo de unión a sustrato o en uno o más sitios exo, ayuda a estabilizar la proteína para cristalización y/o difracción por rayos x.

La etapa de proporcionar el polipéptido de la invención puede comprender opcionalmente expresar un polipéptido apropiado en una célula huésped y opcionalmente puede comprender además purificar dicho polipéptido.

El polipéptido que se expresa es cualquier polipéptido a partir del cual después puede obtenerse el polipéptido de la invención, por ejemplo, mediante escisión proteolítica. El polipéptido que se expresa puede contener por lo tanto una etiqueta, la cual se elimina posteriormente durante o después de la purificación de la proteína a partir de la célula huésped. La etiqueta puede usarse para facilitar la purificación, por ejemplo, permitiendo la unión a una matriz, o permitiendo la secreción del polipéptido desde la célula huésped.

Los ejemplos de métodos de purificación apropiados incluyen una etapa en columna de Ni. La columna de Ni se une a los residuos de histidina, por ejemplo, en una de su etiqueta. También puede usarse una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), por ejemplo, para separar polipéptidos de diferentes tamaños. Puede usarse adicionalmente o alternativamente una columna de intercambio aniónico, por ejemplo, después de la columna de Ni. Esto puede aumentar la pureza de la proteína.

Forma cristalina del polipéptido

Se describe además una forma cristalina del polipéptido de la invención. En determinadas modalidades, los cristales son del dominio GLTP de FAPP2 humana, fusionado a un polipéptido de T4L. En determinadas modalidades, los cristales son de un polipéptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

Un cristal del polipéptido de la presente invención puede tener una variedad de formas. En determinadas modalidades, el cristal puede tener un tamaño de aproximadamente 50-100 x 30-50 x 20-30 pm. En determinadas modalidades, los cristales tienen la apariencia óptica como se ilustra en la Figura 5 y/o los cristales pueden crecer en forma de varillas, algunos sin caras evidentes. Un cristal del polipéptido de la invención puede ser obtenible mediante los métodos de cristalización de polipéptidos mencionados en otra parte de la presente descripción.

La forma cristalina del polipéptido de la invención puede caracterizarse con el grupo espacial P2i2i2 y tiene parámetros de celdas unitarias de /-5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de a=100,02 A, b=130,87 A, c=88,73 A, a=90°, p=90°, y=90°, opcionalmente parámetros de celdas unitarias de a=100,02 A, b=130,87 A, c=88,73 A, a=90°, p=90°, y=90°, parámetros de celdas unitarias de a=100,02 A, b=130,87 A, c=88,73 A, parámetros de celdas unitarias de a=90°, p=90°, y=90°. Los valores de a, b y c pueden definirse a un lugar decimal adicional (por ejemplo, a= 100,020, b=130,872, c=88,733). El término "grupo espacial" se refiere a la disposición de elementos simétricos en un cristal. El término "celda unitaria" se refiere al bloque en forma de paralelopípedo básico. Todo el volumen de un cristal puede construirse mediante el ensamblaje regular de tales bloques.

Estructura cristalina del dominio GLTP de FAPP2

En la presente descripción se describe la información de la estructura tridimensional del polipéptido de la invención. En la presente descripción se describe además la información de la estructura tridimensional de un subconjunto de aminoácidos del polipéptido de la invención. Por ejemplo, este subconjunto puede ser los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, los aminoácidos que conforman el sitio de reconocimiento del grupo principal azúcar de FAPP2, y/o los aminoácidos que conforman el dominio GLTP de FAPP2.

En determinadas modalidades, la recolección de datos por difracción de rayos X puede realizarse en una instalación de cristalografía de rayos X. Pueden recolectarse uno, dos, tres o más conjuntos de datos de difracción de uno o más cristales. En determinadas modalidades, los cristales del polipéptido de la invención difractan a un límite de resolución de al menos aproximadamente 8 angstrom (A). En determinadas modalidades, los cristales difractan a un límite de resolución de al menos aproximadamente 6 A, 4 A o 3 A.

En determinadas modalidades, el cristal difracta los rayos x para una determinación de coordenadas estructurales a una resolución máxima de aproximadamente 3,9 A, de aproximadamente 3,2 A, de aproximadamente 2,9 A o aproximadamente 2,6 A. Los cristales pueden difractar a una resolución máxima de aproximadamente 2,0-4,0 A (por ejemplo, aproximadamente 2,5 A a aproximadamente 3,5 A, de aproximadamente 2,0 A a aproximadamente 3,0 A, de aproximadamente 2,5 A a aproximadamente 3,0 A, o de aproximadamente 3,0 A a aproximadamente 3,5 A).

Los datos de difracción pueden recolectarse mediante el uso de unos ángulos de oscilación variables, el número de marcos y los tiempos de exposición que dependen todos del equipo usado y de la calidad del (de los) cristal(es) usados para recolectar los datos. Un experto debe conocer cómo optimizar estos parámetros [16; 17]). En determinadas modalidades, los datos de difracción pueden recolectarse con 1° de oscilación. Puede usarse otra oscilación, por ejemplo, oscilaciones menores que o mayores que 1°. Por ejemplo, los datos de difracción pueden recolectarse con 0,1°, 0,3°, 0,5°, 1°, 1,5°, 2°, 3°, 4°, 5°, o 10° de oscilación, o cualquier ángulo de oscilación entre estos ángulos. En determinadas modalidades, se recolectan 120 marcos. Pueden recolectarse más o menos de 120 marcos. Por ejemplo, pueden recolectarse 10, 20, 50, 100, 200, 300. 400, 500, 1000, o 5000 marcos, o cualquier número de marcos entre estos números. En determinadas modalidades, la exposición es de 10 minutos por marco. Pueden usarse además otros tiempos de exposición de marcos, tales como, por ejemplo, 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 40 segundos, 50 segundos, 60 segundos, 120 segundos, 180 segundos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos por marco o cualquier tiempo de exposición entre estos tiempos. La combinación y el escalado de los datos pueden hacerse, por ejemplo, mediante el uso del paquete de software HKL2000 (HKL Research, Inc., Charlottesville, VA). La determinación de la estructura, la construcción del modelo y el refinamiento pueden realizarse, por ejemplo, mediante el uso de un software tal como Molrep, coot y Refmac que son parte del paquete de software CCP4. MolRep es un programa para el reemplazo molecular automatizado (por ejemplo, MolRep, versión 10.2.35). Coot Graphical Interface de Paul Emsley (www.ysbl.york.ac.uk/~emsley) para la construcción del modelo incluye una interfaz para refmac5 (Gnu Public License; refmac5, por ejemplo, versión 5.5.0072 o versión 5.5.0109). Un programa de refinamiento macromolecular de Garib Murshudov y otros se integra en el paquete de programas CCP4 (www.ccp4.ac.uk, CCP4, versión 6.1.3). Los análisis de la estructura pueden realizarse mediante el uso del software de visualización molecular PYMOL (pymol.org). En determinadas modalidades, los modelos del polipéptido pueden obtenerse mediante el método de reemplazo molecular mediante el uso del programa Molrep y la información estructural disponible para T4L (ID de PDB:3G3V) y GLTP humana (ID de PDB 1SWX) como modelos de búsqueda. Por ejemplo, las fases iniciales pueden obtenerse eliminando de las coordenadas de los modelos de búsqueda todas las cadenas laterales que dan como resultado un modelo de polialanina. Tales modelos pueden usarse para la construcción adicional del modelo y el refinamiento, por ejemplo, mediante el uso de programas tales como coot y Refmac.

El término "reemplazo molecular" se refiere a un método que implica generar un modelo preliminar de la estructura tridimensional de un polipéptido o un polipéptido acomplejado con un compuesto de unión cuyas coordenadas estructurales no se conocen mediante la orientación y la ubicación de una estructura polipeptídica cuyas coordenadas atómicas se conocen. Las fases se calculan a partir de este modelo y se combinan con las amplitudes observadas de la estructura cristalina desconocida para proporcionar una estructura aproximada. Esta estructura se somete después a cualquiera de las varias formas de refinamiento para proporcionar una estructura final, precisa. Puede emplearse cualquier programa conocido por el experto para determinar la estructura mediante reemplazo molecular. Los programas de reemplazo molecular adecuados incluyen, pero no se limitan a, AMORE (1994) [18; 19] y CNS (1998) [20].

En determinadas modalidades, se proporcionan las coordenadas atómicas del polipéptido cristalino de la invención, o un subconjunto de estas (por ejemplo, para los residuos de unión a grupo principal azúcar, bolsillo de unión a sustrato y/o el dominio GLTP de FAPP2). En una modalidad, en donde el cristal difracta a una resolución de 3 Á el modelo puede refinarse a un factor R final de 25,5 % y Rlibre de 32,4 %. En una modalidad adicional en donde el cristal difracta a una resolución de 2,6 A el modelo puede refinarse a un factor R final de 20,5 % y Rlibre de 25,7 %.

En determinadas modalidades, se proporcionan las coordenadas atómicas de T4L-FAPP2-C212 cristalino (sec. con núm. de ident.:3). Los parámetros para los residuos 36-207 de la sec. con núm. de ident.:3 se exponen en la Tabla 1, en la cual se denominan como los residuos 136-307 para reflejar sus posiciones con respecto a los residuos 308 en adelante de la FAPP2 humana en la proteína de fusión. Los parámetros para los residuos del bolsillo de unión a sustrato se exponen en la Tabla 2 y los parámetros para el dominio GLTP de FAPP2 se exponen en la Tabla 3. La numeración de residuos en las Tablas 2 y 3 es de acuerdo con la numeración de residuos en la FAPP2 humana de longitud completa (los residuos 308 en adelante se refieren a la numeración que se usa para estos residuos en la FAPP2 humana de longitud completa (por ejemplo, 308 es Ile, 309 es Pro, 310 es Thr, 311 y 312 son ambos Phe etc.). Las coordenadas atómicas para los residuos 308-514 de la FAPP2 humana se proporcionan en la Tabla 3. Solo se proporcionan las coordenadas para la molécula A.

En una modalidad, el T4L-FAPP2-C212 cristalino a 3 A tiene un grupo espacial de P2-|2-|2 y parámetros de celdas unitarias de /-5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de a=99,8 A, b=130,6 A, c=88,6 A, a=90°, p=90°, y=90°, opcionalmente parámetros de celdas unitarias de a=99,8 A, b=130,6 A, c=88,6 A, a=90°, p=90°, y=90°. El T4L-FAPP2-C212 cristalino a 2,6 Atiene un grupo espacial de P2-|2-|2 y parámetros de celdas unitarias de /-5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de a=100,02 A, b=130,87 A, c=88,73 A, a=90°, p=90°, y=90°, opcionalmente parámetros de celdas unitarias de a=100,02 A, b=130,87 A, c=88,73 A, a=90°, p=90°, y=90° (los valores de a, b y c pueden definirse a un lugar decimal adicional (por ejemplo, a= 100,020, b=130,872, c=88,733).

El término "coordenadas atómicas" se refiere a coordenadas matemáticas derivadas de ecuaciones matemáticas relacionadas con los patrones obtenidos en la difracción de un haz monocromático de rayos X por los átomos (centros de dispersión) de una molécula proteica en la forma de cristal. Los datos de difracción se usan para calcular un mapa de densidad electrónica de la unidad de repetición del cristal. El mapa de densidad electrónica se usa después para establecer las posiciones de los átomos individuales dentro de la celda unitaria del cristal. Las coordenadas pueden obtenerse además por medio del análisis computacional.

El T4L-FAPP2-C212 cristalino tiene dos moléculas de T4L-FAPP2-C212 en la unidad asimétrica, denominada como Mol-A y Mol-B (Figura 1). La T4L de las moléculas adyacentes en la red cristalina hace amplios contactos que parecen haber facilitado la cristalización (Figura 1). En las Tablas solo se muestran las coordenadas para la molécula A.

El análisis muestra que los residuos de FAPP2 implicados en la unión de glucosilceramida, incluidos D360, N364, W407 (los cuales se consideran los residuos de unión a grupo principal azúcar) y otros residuos (por ejemplo, hidrófobos) que se acomodan y pueden interactuar con las cadenas acilo/esfingosina de glucosilceramida se refinan bien en el mapa de densidad electrónica. La Glucosilceramida que contiene la cadena oleoil acilo (18:1) de ID de PDB: 3S0K se acopló en el bolsillo de unión a ligando de la estructura de FAPP2 (Figura 3, donde los residuos de aminoácidos se enumeran de acuerdo con la sec. con núm. de ident.:4) y el mapa de densidad electrónica correspondiente se muestra en la Figura 4. No se hizo minimización de energía después del acoplamiento.

La estructura de FAPP2-C212 toma el plegamiento general de GLTP con ocho hélices alfa (Figura 6). W407 se localiza en la hélice 4. El grupo principal azúcar se apilaría en este triptófano y además haría contacto con D360 y N364. En FAPP2, E403 se ubica además en el bolsillo de unión a azúcar lo que podría proporcionar una interacción adicional con el anillo de azúcar. Se ha informado en la literatura, en base al modelado por homología, que E403 se ubica en el bolsillo de unión a azúcar y es capaz de discriminar los grupos principales azúcar negativamente cargados. Sin embargo en la presente estructura, este aparece como un residuo que podría estabilizar la unión del anillo de azúcar.

K367 que se une por un hidrógeno con N399 y el lazo proyectado alrededor de N399 parece ser el responsable de discriminar los grupos principales azúcar negativamente cargados en FAPP2 (Figura 7).

La mayoría de los residuos que forman el túnel de unión a ceramida ya sea se conservan o son similares en FAPP2 y hGLTP. Sin embargo existen además dos fenilanalinas, que no están presentes en hGLTP, F311 y F312 que se ubican en el extremo del túnel de unión a ceramida (Figuras 6 y 8 - en la Figura 8 Galactosil Cer 24:1 unida a hGLTP (ID de PDB:2EUK) se ha superpuesto sobre FAPP2). Estas dos fenilanalinas son únicas para FAPP2 y se ubican en el extremo N-terminal del dominio GLTP de FAPP2. Estos dos residuos se ajustan en el extremo del túnel hidrófobo y además hacen contactos hidrófobos con las hélices 1, 7 y 8 que por lo tanto estabilizan el plegamiento de GLTP. Además estos dos residuos de fenilanalina son parte de un motivo de tipo FFAT el cual se conoce que interactúa con VAP (proteínas asociadas a proteínas de membrana asociadas a vesículas). F311 de FAPP2 toma el mismo lugar que F33 de hGLTP ubicado entre las hélices 1 y 2. Estos dos residuos pueden jugar un papel en la liberación de ceramidas. La inhibición de la actividad de transferencia de FAPP2 puede lograrse mediante su desplazamiento.

El término "bolsillo de unión" se usa en la presente descripción para referirse al sitio en el cual la molécula a transferir (es decir, el sustrato) se une a FAPP2. La estructura y las propiedades químicas del bolsillo de unión permiten el reconocimiento y la unión de un compuesto de unión o sustrato. El bolsillo de unión incluye típicamente los residuos responsables de la especificidad de unión (por ejemplo, carga, hidrofobicidad, y/o impedimento estérico) de la molécula. Los inventores han identificado 30 residuos que están dentro de 5 A del sustrato acoplado en el modelo acoplado a ceramida (ver la Tabla 4). En una modalidad el bolsillo de unión a sustrato comprende los residuos de la Tabla 4. Estos residuos tienen el potencial de hacer contacto con el sustrato.

En determinadas modalidades, el bolsillo de unión puede definirse como que comprende los residuos de unión a grupo principal azúcar.

Los residuos de unión a grupo principal azúcar son los residuos que hacen contacto con el grupo principal glucosilo del sustrato (por ejemplo, GlcCer). Se considera que al menos los residuos D360, N364, y W407 hacen contacto con el grupo principal glucosilo de GlcCer, en base a estudios mutacionales en hGLTP [21](ver además la Figura 3). Los residuos de unión a grupo principal azúcar pueden contribuir a la selectividad de FAPP2 para determinados sustratos. Por ejemplo, se ha demostrado que FAPP2 permite una selectividad de sustrato diferente a la molécula de GLTP relacionada. FAPP2 permite una preferencia por monohexosil y dihexosilceramidas no cargadas, en comparación con la GLTP humana ampliamente selectiva [8]. Se ha demostrado que FAPP2 transfiere de manera eficiente GlcCer y otras glicosilceramidas simples neutras tales como GlaCer y LacCer, pero no moléculas negativamente cargadas tales como sulfátido. Las coordenadas atómicas de los residuos de unión a grupo principal azúcar se incluyen en la Tabla 2.

Además de los residuos de unión a grupo principal azúcar el bolsillo de unión a sustrato puede comprender además los residuos que permiten que FAPP2 se acomode a la porción no de azúcar del sustrato tal como GlcCer, por ejemplo, la porción ceramida de este. Está presente un túnel de acomodamiento de sustrato o ceramida (cadena de ácidos grasos), el cual comprende residuos hidrófobos (ver la Tabla 4). Este túnel, el cual puede definirse como que es hidrófobo, tendrá una forma que depende de la unión del sustrato (las hélices 2, 4, 5 y 6 pueden moverse ligeramente para acomodar las cadenas de ácidos grasos). El papel de los dos residuos de fenilanalina claves F311 y F312 en el túnel de acomodamiento de ceramida se analiza más adelante. Los residuos en el túnel de acomodamiento de ceramida incluyen L441, F453, Y491 (como se identifica por ejemplo, en [21]), además de otros residuos hidrófobos mencionados en la Tabla 4).

Se observará a partir de la Tabla 4 que algunos de los residuos claves en el bolsillo de unión a sustrato son idénticos a los que se encuentran en hGLTP, otros son similares pero un pequeño número son únicos para FAPP2, incluidos V345, N399, E403, R398, F311 y F312.

La presente estructura ha identificado a V345, N399, E403, R398, F311 y F312 como los residuos del bolsillo de unión a sustrato que son únicos para FAPP2 humana en comparación con GLTP humana. Estos pueden estar ausentes de la GLTP humana (en el caso de R398, F311 y F312) o ser diferentes a los residuos equivalentes en la GLTP humana. El papel potencial de F311 y F312 se analiza más adelante. N399, E403 y R398 se encuentran cerca del grupo principal azúcar.

En una modalidad, el modelo creado en base a la información estructural obtenida contiene la información posicional de los residuos de unión a grupo principal azúcar. En otras modalidades el modelo creado en base a la información estructural obtenida adicionalmente o alternativamente contiene la información posicional de los residuos en el túnel de acomodamiento de ceramida, incluidos L441, F453, Y491 (y opcionalmente los otros residuos hidrófobos mencionados en la Tabla 4). En modalidades adicionales el modelo creado en base a la información estructural obtenida adicionalmente o alternativamente contiene la información posicional de los residuos mencionados en la Tabla 4 como únicos para FAPP2 humana.

Debe entenderse que mientras que las Tablas 1-3 proporcionan las coordenadas atómicas para T4L-FAPP2-C212 cristalino y porciones de este, la presente descripción también contempla las modificaciones estructurales de este, por ejemplo, para polipéptidos que tienen homología estructural significativa (por ejemplo, solapamiento estructural significativo), particularmente en las áreas reconocidas como activas, y por lo tanto que proporcionan la misma o similar información de la estructura que se proporciona aquí. La homología estructural significativa se refiere a al menos uno de los siguientes criterios: (i) al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de homología estructural con T4L-FAPP2-C212 cristalina o el dominio GLTP de este; o (ii) al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de homología estructural con un bolsillo de unión reconocido de T4L-FAPP2-C212 cristalino o el dominio GLTP de este. En determinadas modalidades, la homología estructural significativa puede referirse además a al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de homología estructural con la secuencia de aminoácidos primaria de T4L-FAPP2-C212 o el dominio GLTP de este. Además, la secuencia de aminoácidos primaria de T4L-FAPP2-C212 puede ser una secuencia incluida como un segmento en una secuencia de aminoácidos más larga, o puede ser un fragmento de esta (por ejemplo, el dominio GLTP). En algunas modalidades, un fragmento de un polipéptido de T4L-FAPP2-C212 de longitud completa se proporciona o se usa en un método o sistema de la invención proporcionado en la presente descripción. En algunas modalidades, un fragmento comprende una secuencia de (o de al menos) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200 aminoácidos. En algunas modalidades, un fragmento de T4L-FAPP2-C212 no comprende una secuencia de T4L-FAPP2-C212 de longitud completa, por ejemplo, una secuencia de T4L-FAPP2-C212 humana de longitud completa. En algunas modalidades, un fragmento de T4L-FAPP2-C212 comprende todo o al menos parte de la porción responsable de la actividad de transferencia de FAPP2. En algunas modalidades, los fragmentos incluyen fragmentos que contienen los residuos que se ha demostrado que hacen contacto con el grupo principal glucosilo de GlcCer (por ejemplo, D360, N364, W407). La presente descripción contempla cualquiera y todas de tales variaciones y modificaciones de T4L-FAPP2-C212 o el dominio GLTP de este, y las cuales pueden usarse en los métodos y usos de la descripción (por ejemplo, 308-515, 308­ 514, 308-513, 308-512 de FAPP2).

La Tabla 1 proporciona un conjunto de coordenadas atómicas para T4L-FAPP2-C212 y la Tabla 3 proporciona las coordenadas atómicas para el dominio GLTP de este.

Usos de la información de la estructura

En la presente descripción se describen los métodos y/o usos de la información de la estructura, por ejemplo, los métodos para diseñar, identificar, y/o tamizar los compuestos de unión a FAPP2 que pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.

En determinadas modalidades de la invención, se proporcionan los métodos para identificar, diseñar, seleccionar, y/u optimizar compuestos de unión a FAPP2, como son los métodos para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2. Estos compuestos de unión pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Ya que la enfermedad de Fabry es provocada por la ausencia de a-galactosidasa A (a-Gal A), una enzima requerida para el procesamiento normal de los glicoesfingolípidos en lisosomas de mamíferos, reducir la cantidad de sustrato por esta enzima puede ser particularmente útil en el tratamiento de la enfermedad de Fabry. En determinadas modalidades, el compuesto de unión puede afectar la estabilización enzimática, por ejemplo, durante el plegamiento de proteínas. El compuesto puede afectar además los aspectos del tráfico intracelular de la enzima o los aspectos de la función de transferencia, tales como el reconocimiento del sustrato y/o la actividad de transferencia.

En determinadas modalidades, se proporcionan los métodos para el diseño, identificación, selección y/u optimización in silico de los compuestos de unión a FAPP2 mediante el uso de la información de la estructura tridimensional proporcionada en la presente descripción. En determinadas modalidades, se proporcionan los métodos que pueden usarse para identificar inhibidores, inhibidores reversibles, activadores y/o estabilizantes de la actividad de FAPP2. En determinadas modalidades, se proporcionan los métodos que pueden usarse para identificar compuestos de unión que modulen la estabilidad de FAPP2. En determinadas modalidades, se proporcionan los métodos que pueden usarse para identificar compuestos de unión que modulan la estabilidad, la actividad y/o el tráfico intracelular de FAPP2. En determinadas modalidades, se proporcionan los métodos que pueden usarse para analizar los compuestos de unión potenciales para su capacidad de unirse, modular la estabilidad, modular la actividad y/o modular el tráfico intracelular de FAPP2. En determinadas modalidades, estos métodos incluyen los métodos in silico, in vitro, e in vivo.

Diseño, identificación, selección y/u optimización de compuestos de unión a FAPP2 potenciales

Es un objetivo de la presente invención usar las coordenadas atómicas proporcionadas para T4L-FAPP2-C212 (Tablas 1 y 3) o un subconjunto de estas (por ejemplo, los proporcionados para los residuos del bolsillo de unión a sustrato y/o los proporcionados para el dominio GLTP de FAPP2) para diseñar, identificar, seleccionar y/u optimizar los compuestos de unión potenciales para FAPP2. En todos los casos cuando se hace referencia a FAPP2 en la presente descripción es preferentemente FAPP2 humana. Los compuestos obtenidos a partir de este método pueden identificarse además como capaces de tratar la enfermedad de Fabry en sujetos humanos. Como se analiza en otra parte, los métodos pueden utilizar las coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que son los residuos de unión a grupo principal azúcar y/o los residuos adicionales en el bolsillo de unión a sustrato. La Tabla 3 proporciona las coordenadas atómicas para los residuos 308-514 de FAPP2 humana. Los métodos pueden utilizar estas coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos 308-514 de la FAPP2 humana.

La invención proporciona por lo tanto un método para identificar un compuesto que se une a FAPP2, que comprende identificar computacionalmente un compuesto que se une a FAPP2 mediante el uso de las coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2. La invención proporciona además un método para identificar un compuesto que se une a FAPP2, que comprende identificar computacionalmente un compuesto que se une a FAPP2 mediante el uso de las coordenadas atómicas de al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para diseñar, seleccionar y/u optimizar un compuesto que se une a FAPP2 que comprende: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2 y b) diseñar, seleccionar y/u optimizar computacionalmente dicho compuesto realizando una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas. La invención proporciona además un método para diseñar, seleccionar y/u optimizar un compuesto que se une a FAPP2 que comprende: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas para al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3 y b) diseñar, seleccionar y/u optimizar computacionalmente dicho compuesto realizando una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 que comprende: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2; b) realizar computacionalmente una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas; y c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y dicho polipéptido de FAPP2. La invención proporciona además un método para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 que comprende: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas para al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3 y b) realizar computacionalmente una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas; y c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y FAPP2.

Los métodos pueden comprender además generar una representación gráfica tridimensional de la estructura antes de la etapa (b).

En la presente descripción se describe un método para usar una computadora para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 en donde dicha computadora comprende un medio de almacenamiento de datos legible en máquina que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con las coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, por ejemplo, como se expone en la Tabla 2 y los medios para generar una representación gráfica tridimensional de la estructura de dichos aminoácidos y dicho método comprende: a) ubicar un primer compuesto mediante el uso de una representación tridimensional gráfica de la estructura del compuesto y todo o parte del bolsillo de unión a sustrato de FAPP2; b) realizar una operación de ajuste entre el compuesto y el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2 mediante el empleo de medios computacionales; y c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2.

En la presente descripción se describe además un método para usar una computadora para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 en donde dicha computadora comprende un medio de almacenamiento de datos legible en máquina que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con las coordenadas atómicas para al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3 y los medios para generar una representación gráfica tridimensional de la estructura del dominio GLTP de FAPP2 y dicho método comprende: a) ubicar un primer compuesto mediante el uso de una representación tridimensional gráfica de la estructura del compuesto y todo o parte del dominio GLTP de FAPP2; b) realizar una operación de ajuste entre dicho compuesto y el dominio GLTP de FAPP2 mediante el empleo de medios computacionales; y c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre dicho compuesto y el dominio GLTP de FAPP2.

El método para usar una computadora para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 pueden comprender además las etapas de (d) repitiendo las etapas (a) a (c) con una segunda identidad química; y (e) seleccionar al menos una de la primera o segunda identidad química que se asocia con el dominio GLTP de FAPP2 o el bolsillo de unión a sustrato en base a la asociación cuantificada de la primera o segunda identidad química.

Los métodos anteriores pueden realizarse adicionalmente en base a las coordenadas atómicas de los residuos de unión a grupo principal azúcar solos, o con los residuos del túnel de acomodamiento de ceramida y/o los residuos definidos como únicos para FAPP2.

Se describe además el uso de la estructura de la forma cristalina del polipéptido de la invención, o un subconjunto de este en el modelado de un compuesto de unión que se une a FAPP2, y el uso de las coordenadas atómicas de la forma cristalina de la invención, o un subconjunto de estas en el modelado de un compuesto de unión que se une a FAPP2. Los subconjuntos útiles de las coordenadas de la estructura que pueden usarse en el método de la invención incluyen las coordenadas de la estructura que definen a) los residuos de unión a grupo principal azúcar de FAPP2 b) los residuos del bolsillo de unión a sustrato de FAPP2 y c) el dominio GLTP de FAPP2.

Debe entenderse que un compuesto de unión potencial de acuerdo con esta invención puede unirse en cualquier parte a FAPP2. En una modalidad un compuesto de unión potencial de acuerdo con esta invención puede unirse al dominio GLTP de FAPP2. El compuesto de unión puede unirse al bolsillo de unión o a cualquier otro sitio el cual no se identifica como un bolsillo de unión, por ejemplo, a un sitio que es adyacente a un bolsillo de unión. En determinadas modalidades, el compuesto de unión potencial de acuerdo con esta invención puede unirse específicamente a uno o más sitios en el polipéptido de FAPP2 (sea naciente, plegado parcialmente o completamente).

En muchas modalidades la molécula de unión se unirá al bolsillo de unión de FAPP2. En muchas modalidades la molécula de unión se unirá a los residuos de unión a grupo principal azúcar, de FAPP2, o a los residuos del túnel de acomodamiento de ceramida. "Unión a" una molécula o una porción definida de esta abarca la unión a toda o una parte de una molécula o a una porción definida de esta, de manera que la referencia a la unión a una molécula o a una porción definida de esta no requiere que se haga una interacción con cada residuo de esta molécula o porción.

En línea con esto, cuando los compuestos de unión se identifican mediante el uso de los métodos de la invención la identificación de un compuesto de unión puede usar la información sobre la molécula relevante o la porción definida de esta, o una parte de la molécula definida o porción de esta. Por lo tanto puede usar la información sobre la estructura del dominio GLTP de FAPP2, la estructura del bolsillo de unión de FAPP2, la estructura de los residuos de unión a grupo principal azúcar, o una porción de cualquiera de estos.

Como se usa en la presente descripción, un "compuesto de unión" se refiere a un compuesto se une reversiblemente o irreversiblemente a FAPP2. En determinadas modalidades, el compuesto de unión se une en un bolsillo de unión de FAPP2. La unión puede implicar la formación de enlaces que pueden ser covalentes o no covalentes. Los enlaces no covalentes pueden ser, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos o enlaces hidrófobos.

Un compuesto de unión puede afectar la actividad de FAPP2. Esto puede lograrse directamente mediante la modulación de la capacidad de la FAPP2 de transferir su sustrato, lo que puede lograrse al ser un inhibidor de FAPP2 (es decir que provoca la inhibición o reducción de la actividad de transferencia), o un activador de FAPP2 (es decir que provoca un aumento de la actividad de transferencia). En algunos casos el compuesto de unión puede afectar la estabilidad de FAPP2 que a su vez puede dar como resultado un efecto sobre la actividad de FAPP2 en cuyo caso la molécula de unión es un estabilizante o desestabilizante de FAPP2 (es decir, puede provocar un cambio en la estabilidad de FAPP2). En otros casos la molécula de unión puede afectar el tráfico intracelular de FAPP2. FAPP2 escoge su sustrato en el aparato de Golgi, por lo que se contemplan además las moléculas de unión que influyen en la capacidad de FAPP2 de localizarse en el aparato de Golgi (por ejemplo, que evitan que FAPP2 se localice en el aparato de Golgi, o que reducen la capacidad de FAPP2 de localizarse en el aparato de Golgi, o que aumentan la capacidad de FAPP2 de localizarse en el aparato de Golgi).

En determinadas modalidades, el compuesto de unión potencial es un compuesto inhibidor o activador potencial. En determinadas modalidades, el compuesto de unión potencial es un compuesto inhibidor o activador de FAPP2 potencial. En determinadas modalidades, el compuesto inhibidor o activador potencial es un compuesto inhibidor o activador competitivo, incompetitivo o no competitivo. En determinadas modalidades, el inhibidor potencial es un inhibidor reversible. Los expertos en la técnica pueden identificar inhibidores o activadores potenciales como inhibidores o activadores competitivos, incompetitivos o no competitivos o reversibles mediante el ajuste computacional de datos cinéticos mediante el uso de ecuaciones estándar [22], o mediante el empleo de ensayos que miden la capacidad de un inhibidor o activador de modular la actividad de transferencia de FAPP2.

Se conoce que FAPP2 funciona al menos para transferir glicolípidos tales como GlcCer desde el c/s-Golgi a la TGN. La actividad de FAPP2 incluye por lo tanto su actividad de transferencia, es decir, de transferir su sustrato de una membrana a otra membrana. Esta actividad de transferencia puede medirse mediante la medición de la transferencia de sustrato /n v/tro, por ejemplo, de una membrana a otra. Los ensayos en general implican vesículas donantes y aceptoras y se mide la transferencia del sustrato marcado. Existen al menos dos ensayos establecidos. En un ejemplo la transferencia del sustrato se mide mediante el recuento de centelleo líquido de vesículas aceptoras cuando el sustrato está radiomarcado. En otro ejemplo el monitoreo en tiempo real de la actividad de transferencia de glicolípidos se lleva a cabo mediante el uso de transferencia de energía por transferencia de Forster (FRET), donde se determina FRET entre una molécula de sustrato apropiadamente marcada y una molécula no transferible marcada en la membrana donante. La recuperación de la emisión de la molécula de sustrato apropiadamente marcada es indicativa de la transferencia. [23, 24, 25, 26, 27]

Los inhibidores o activadores de FAPP2 en una modalidad pueden conducir a una disminución o aumento estadísticamente significativo, respectivamente de la actividad de FAPP2.

Un inhibidor de FAPP2 puede ser un sustrato catalítico de FAPP2. Tales compuestos pueden ser análogos del sustrato natural de FAPP2, GlcCer, o de otras moléculas que se unen al bolsillo de unión, por ejemplo, GalCer o LacCer. Tales análogos pueden tener modificaciones que provoquen que inhiban a FAPP2.

Los ejemplos adicionales de posibles inhibidores incluyen moléculas con un grupo principal hidrófilo o formador de enlaces de hidrógeno, por ejemplo, que pueden apilarse sobre W407 y llenar el bolsillo de unión a grupo principal azúcar; (2) moléculas hidrófobas que pueden unirse al túnel de acomodamiento de ceramida; (3) moléculas pequeñas que pueden desplazar F311/F312 ubicado en el extremo del túnel de acomodamiento de ceramida (en el lado opuesto al bolsillo de unión a azúcar).

Un compuesto de unión puede ser una molécula pequeña. El término "molécula pequeña" como se usa en la presente descripción pretende describir un compuesto orgánico de bajo peso molecular que no es un polímero. Una molécula pequeña puede unirse con alta o baja afinidad a un biopolímero tal como proteína, ácido nucleico, o polisacárido y además puede alterar actividad o función del biopolímero. El peso molecular del compuesto orgánico pequeño en general puede ser menor que aproximadamente 1500 Da. Las moléculas pequeñas pueden ser más pequeñas que aproximadamente 1000 Da, más pequeñas que aproximadamente 800 Da, o más pequeñas que aproximadamente 500 Da. Las moléculas pequeñas pueden difundir rápidamente a través de las membranas celulares y pueden tener biodisponibilidad oral. Los compuestos pueden ser naturales o sintéticos.

Es útil poder identificar las moléculas de unión que son específicas para FAPP2 (por ejemplo, para FAPP2 humana). Por específica se entiende que la molécula de unión tiene una preferencia por unirse a fApp2 (por ejemplo, no se une a una o más moléculas adicionales o muestra unión reducida, por ejemplo, una afinidad reducida al menos 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 veces por la una o más moléculas adicionales). La unión puede cuantificarse de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.

Preferentemente la molécula de unión es específica para FAPP2 en comparación con GLTP (por ejemplo, específica para FAPP2 humana en comparación con GLTP humana). El dominio GLTP de FAPP2 humana es similar en estructura a GLTP humana, pero no idéntico, como lo determinó el inventor, y existen diferencias claves entre estas dos moléculas. La identificación de la estructura de FAPP2 por el inventor significa que pueden obtenerse las moléculas de unión que tienen una especificidad requerida.

La disponibilidad de la información de la estructura para GLTP humana (por ejemplo, ID de PDB 1SWX, ID de PDB 2EUK, ID de PDB 4H2Z) significa además que además de los métodos anteriores (que usan la estructura del dominio GLTP de FAPP2 humana (o porciones de este)) pueden llevarse a cabo métodos en los cuales las etapas descritas anteriormente mediante el uso de las coordenadas atómicas o la información de la estructura para el dominio GLTP de FAPP2 humana (o porciones de este) se llevan a cabo mediante el uso de las coordenadas atómicas o la información de la estructura para GLTP humana. Esto puede hacerse en paralelo o en secuencia con los métodos que usan la estructura del dominio GLTP de FAPP2 humana (o porciones de este). Tales métodos son una forma adicional de determinar si una molécula de unión que se une a FAPP2 es específica para FAPP2 sobre GLTP.

De manera similar la información descrita en la presente descripción puede usarse para identificar compuestos de unión que se unen tanto a GLTP humana como a FAPP2 humana (por ejemplo, con igual o aproximadamente igual afinidad), o que son específicos para GLTP humana sobre FAPP2 humana. Los métodos mencionados anteriormente pueden llevarse a cabo mediante el uso de las coordenadas atómicas o la información de la estructura disponible para GLTP, y la información equivalente proporcionada en la presente descripción para FAPP2, simultáneamente o secuencialmente, para identificar compuestos de unión que se unen tanto a GLTP humana como a FAPP2 humana, o que son específicos para GLTP humana sobre FAPP2 humana.

A modo de ejemplo, los métodos mencionados anteriormente que identifican, diseñan, seleccionan, optimizan y/o evalúan un compuesto que se une a FAPP2 por lo tanto puede comprender adicionalmente una etapa de determinar si dicho compuesto se une a GLTP, y/o realizar una operación de ajuste entre el compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional de GLTP.

Los métodos mencionados anteriormente que se relacionan con el uso de una computadora para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 pueden requerir adicionalmente el material de almacenamiento de datos para que sea codificado con las coordenadas atómicas de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de GLTP (o toda la molécula) y adicionalmente requieren las etapas para cuantificar la asociación entre el compuesto y el bolsillo de unión a sustrato de GLTP.

Los usos mencionados anteriormente pueden incorporar adicionalmente el uso de la estructura de GLTP.

Tales métodos y usos pueden ser por lo tanto métodos que identifican, diseñan, seleccionan, optimizan y/o evalúan un compuesto que se une específicamente a FAPP2 (por ejemplo, sobre GLTP), o que se une a FAPP2 y GLTP.

Como un ejemplo adicional se describen además los métodos que identifican, diseñan, seleccionan, optimizan y/o evalúan un compuesto que se une específicamente a GLTP sobre FAPP2. Por ejemplo, un método para identificar un compuesto que se une específicamente a GLTP sobre FAPP2, comprende identificar computacionalmente un compuesto que se une específicamente a GLTP sobre FAPP2 mediante el uso de (i) las coordenadas atómicas de al menos el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, por ejemplo, como se expone en la Tabla 2 y las coordenadas atómicas de al menos el bolsillo de unión a sustrato de GLTP o (ii) las coordenadas atómicas para al menos el dominio GLTP de FAPP2, como se expone en la Tabla 3 y las coordenadas atómicas para GLTP.

Un método para diseñar, seleccionar y/u optimizar un compuesto que se une específicamente a GLTP sobre FAPP2 puede comprender: a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas de i) al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, por ejemplo, como se expone en la Tabla 2 y al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de GLTP, o ii) al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3, y GLTP b) diseñar, seleccionar y/u optimizar computacionalmente dicho compuesto realizando una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas.

Los métodos pueden comprender además generar una representación gráfica tridimensional de la estructura antes de la etapa (b).

El compuesto de unión potencial puede identificarse o seleccionarse de una biblioteca de compuestos, o identificarse o seleccionarse de una base de datos. En tales casos la identificación se hace a partir de una estructura molecular preexistente y el compuesto de unión potencial se escoge, por ejemplo, de un grupo de compuestos preexistentes. Se escogen uno o más miembros, tales como una molécula pequeña o un sustrato análogo que tiene o exhibe una propiedad o característica deseada.

El compuesto de unión potencial se diseña en algunas modalidades, por ejemplo, in silico. Cuando el compuesto de unión se diseña in silico esto puede ser a partir de un compuesto conocido. "Diseño" o "diseñar" como se usa en la presente descripción pretende proporcionar una estructura molecular nueva de, por ejemplo, un compuesto, tal como una molécula pequeña o un sustrato análogo.

Los programas informáticos adecuados que pueden usarse en el diseño e identificación de los compuestos de unión potenciales (por ejemplo, mediante la selección de fragmentos químicos adecuados) incluyen, pero no se limitan a, GRID [28], MCSS [29], AUTODOCK [30]; y DOCK [31].

Los programas informáticos adecuados que pueden usarse para conectar las entidades o fragmentos químicos individuales incluyen, pero no se limitan a, CAVEAT (Bartlett, (1989) Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Special Pub., Royal Chem. Soc. 78:182-19632); y sistemas de bases de datos 3D tales como MACCS-3D de MDL Information Systems, San Leandro, Calif), HOOK (Molecular Simulations, Burlington, Mass.) y según se revisa en la referencia [33].

Además de los métodos en los cuales los compuestos de unión potenciales se construyen o identifican de un modo en etapas (por ejemplo, un fragmento o entidad química a un tiempo como se describió anteriormente), los compuestos de unión potenciales pueden diseñarse como un todo o "de novo" mediante el uso ya sea de un sitio activo vacío u, opcionalmente, incluyendo alguna(s) porción(ones) de un(os) inhibidor(es), activador(es) o estabilizante(s) conocido(s). Los programas informáticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, LUDI [34], LEGEND [35]; y LEAPFROG (Tripos Associates, St. Louis, Mo.). También pueden emplearse otras técnicas de modelación molecular de acuerdo con esta invención [36,37].

Una vez que se ha diseñado, seleccionado, identificado, sintetizado o escogido un compuesto de unión potencial mediante los métodos descritos en la presente descripción, la afinidad con la cual ese compuesto se une a FAPP2 (y/o GLTP) puede analizarse y optimizarse mediante evaluación computacional. Un compuesto diseñado, o seleccionado, o sintetizado o escogido como compuesto de unión potencial o puede además optimizarse computacionalmente de manera que en su estado unido preferentemente carezca de interacción electrostática repulsiva con el sitio diana. Tales interacciones no complementarias (por ejemplo, electrostáticas) incluyen las interacciones repulsivas carga-carga, dipolo-dipolo y carga-dipolo. Específicamente, la suma de todas las interacciones electrostáticas entre el compuesto de unión potencial y el sitio al cual este se une a FAPP2, en determinadas modalidades, hace una contribución neutra o favorable a la entalpía de unión. El software informático adecuado que puede usarse para evaluar la energía de deformación del compuesto y las interacciones electrostáticas, incluye, pero no se limita a, Gaussian 92, revisión C de M. J. Frisch, Gaussian, Inc., (1992) Pittsburgh, Pa.; AMBER, versión 4.0 de P. A. Kollman, (1994) Universidad de California en San Francisco; QUANTA/CHARMM de Molecular Simulations, Inc., (1994) Burlington, Mass.; y Insight II/Discover de Biosysm Technologies Inc., (1994) San Diego, Calif. Estos programas pueden implementarse, por ejemplo, mediante el uso de una estación de trabajo de Silicon Graphics, estación de trabajo IRIS 4D/35 o IBM RISC/6000 modelo 550. Pueden usarse los sistemas de hardware, tales como una IBM thinkpad con sistema operativo LINUX o una DELL latitude D630 con sistema operativo WINDOWS. Otros sistemas de hardware y paquetes de software serán conocidos por los expertos en la técnica de los cuales se modifican continuamente la velocidad y capacidad.

En determinadas modalidades, los compuestos de unión pueden diseñarse y/o seleccionarse y/o sintetizarse y/o escogerse específicamente mediante los métodos anteriores para inducir interacciones de no complementariedad (por ejemplo, electrostáticas), tales como interacciones repulsivas de carga-carga, dipolo-dipolo y carga-dipolo. En determinadas modalidades, la suma de todas las interacciones electrostáticas entre el compuesto de unión potencial y el sitio en el cual este se une a FAPP2 hace una contribución a la entalpía de unión que no es neutra.

En determinadas modalidades, el método anterior comprende usar un programa informático adecuado para el diseño y/o selección de un compuesto de unión potencial.

Además, en determinadas modalidades, los métodos anteriores comprenden usar un programa informático adecuado junto con la síntesis y/o elección del compuesto de unión potencial.

Además, en determinadas modalidades, el método anterior comprende además las etapas de usar un ensayo adecuado, como los descritos en la presente descripción, para caracterizar la capacidad del compuesto de unión potencial de unirse a FAPP2 (y/o GLTP). Esto puede implicar analizar directamente capacidad del compuesto de unirse y/o determinar si el compuesto tiene una influencia en la actividad de FAPP2 (por ejemplo, afectando su actividad de transferencia, estabilidad, plegamiento, y/o localización intracelular).

Para evaluar las propiedades de unión de los compuestos de unión, pueden usarse ensayos, tales como, técnicas calorimétricas (por ejemplo, calorimetría de titulación isotérmica, calorimetría de barrido diferencial), o Biacore(TM). En determinadas modalidades, los métodos anteriores pueden comprender además determinar si el compuesto de unión potencial modula la actividad (por ejemplo, la actividad de transferencia), la estabilidad o el tráfico intracelular de FAPP2 (y/o GLTP). Esto puede llevarse a cabo mediante el uso de un ensayo biológico.

Determinar si el compuesto de unión potencial modula la actividad de transferencia de FAPP2 puede implicar poner en contacto el compuesto de unión potencial con FAPP2 en la presencia de un sustrato (por ejemplo, GlcCer) y determinar la cantidad de transferencia de sustrato. Esto puede ser en comparación con la cantidad de transferencia de sustrato en la ausencia del compuesto de unión potencial para determinar el efecto del compuesto de unión potencial en la actividad de transferencia de FAPP2. Los ensayos adecuados para FAPP2 se conocen en la técnica y se analizan a continuación. Determinar si el compuesto de unión potencial modula la estabilidad de FAPP2 (y/o GLTP) puede implicar, por ejemplo, calorimetría de barrido diferencial (DSC), análisis de espectros por dicroísmo circular (CD).

Determinar si el compuesto de unión potencial modula el tráfico intracelular de FAPP2 (y/o GLTP) puede implicar ensayos basados en células.

Los métodos de la invención pueden comprender además la etapa de modificar el compuesto de unión para la administración como un producto farmacéutico. El compuesto de unión puede tener la capacidad requerida para unirse a FAPP2 (y/o GLTP), como se analizó anteriormente, pero todavía puede beneficiarse de una optimización adicional. En tales casos la estructura química del compuesto de unión se usa como un punto de partida para modificaciones químicas. Tales modificaciones pueden diseñarse para mejorar la potencia, selectividad, parámetros farmacocinéticos o propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, estabilidad, solubilidad).

Los métodos de la invención pueden comprender además la etapa de formular el compuesto de unión, o el compuesto de unión modificado como un producto farmacéutico. Esto implicará en general mezclar el agente con un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente descripción, incluye cualquier agente que por sí mismo no induce efectos de toxicidad o provoca la producción de anticuerpos que son perjudiciales para el individuo que recibe la composición farmacéutica. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol, etanol o sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH y similares. El portador farmacéutico empleado por lo tanto variará en dependencia de la ruta de administración. Los portadores pueden permitir que las composiciones farmacéuticas se formulen como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones para ayudar la ingesta del paciente. Un análisis detallado de los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en [38].

Medios legibles en computadora

La descripción describe medios legibles en computadora que comprenden las coordenadas atómicas para el polipéptido de la invención, o un subconjunto de estas. El medio legible en computadora puede comprender además la programación para mostrar un modelo molecular del polipéptido o una porción de este. El medio legible en computadora puede comprender además la programación para identificar una molécula de unión y para ayudar con esto puede comprender además una base de datos de las estructuras de los compuestos de prueba. Tales compuestos de prueba pueden ser, por ejemplo, en base a inhibidores conocidos de FAPP2 y pueden ser, por ejemplo, análogos de GlcCer. Dichas coordenadas atómicas se exponen en la Tablas 1 a 3.

"Los medios legibles en computadora" se refiere a cualquier medio que puede leerse y accederse directamente por una computadora. Tales medios incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magnéticos tales como disquetes, medio de almacenamiento de disco duro y cinta magnética; medios de almacenamiento óptico tales como discos ópticos o CD-ROM; medios de almacenamiento electrónicos tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnético/óptico.

Se describe una computadora que comprende el medio legible en computadora de la descripción, así como un sistema informático que comprende una unidad de memoria que comprende coordenadas de la estructura cristalográfica de rayos X que definen el polipéptido de la invención como se expone en la Tabla 1, o un subconjunto de este; y un procesador en comunicación eléctrica con la unidad de memoria; en donde el procesador genera un modelo molecular que tiene una estructura tridimensional representativa de al menos una porción de dicho polipéptido.

Un "sistema informático" se refiere a los medios de hardware, medios de software y medios de almacenamiento de datos usados para analizar los datos de coordenadas atómicas descritas en la presente descripción. Los medios de hardware mínimos de los sistemas basados en computadora de la presente descripción comprenden una unidad de procesamiento central (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Deseablemente, se proporciona un monitor para visualizar los datos de estructura. Los medios de almacenamiento de datos pueden ser RAM o medios para acceder a medios legibles en computadora de la descripción. Los ejemplos de tales sistemas son estaciones de trabajo de microcomputadoras disponibles de Silicon Graphics Incorporated y Sun Microsystems que ejecutan basado en Unix, Windows.

Es otro objetivo de la descripción proporcionar métodos para resolver las estructuras de otras proteínas. Todas o parte de las coordenadas estructurales proporcionadas en la presente descripción pueden usarse para determinar la estructura de otra molécula cristalizada más rápidamente y eficientemente que intentando este proceso ab initio. Esto puede ser útil, por ejemplo, para resolver las estructuras o resolver parcialmente la estructura de otras proteínas que comprenden dominios proteicos de similar función, otros dominios de homología, o proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos de alta homología o identidad. Tales estructuras proteicas pueden resolverse mediante el uso de alguna o toda la información estructural proporcionada en las Tablas. En algunas modalidades, los métodos de reemplazo molecular pueden emplearse para resolver tales estructuras mediante el uso de la información estructural descrita en la presente descripción.

Compuesto y productos farmacéuticos

Se describe en la presente descripción un compuesto identificado, diseñado, seleccionado y/u optimizado mediante un método de la invención, como lo son tales compuestos que se han modificado para la administración como un producto farmacéutico y/o que se han formulado como un producto farmacéutico. Tales compuestos pueden usarse como un medicamento, por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Se proporcionan además los métodos para tratar o evitar la enfermedad de Fabry que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto o producto farmacéutico tal a un paciente que lo necesite.

En la presente descripción se describe además un método para producir una composición farmacéutica que comprende diseñar, seleccionar y/u optimizar un compuesto con los métodos de la invención, modificar el compuesto identificado para la administración como un producto farmacéutico y formular el producto obtenido con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Cualquier producto farmacéutico puede suministrarse mediante una ruta de administración conocida. El producto farmacéutico puede suministrarse por vía local o por vía sistémica. Puede suministrarse mediante una ruta parenteral (por ejemplo, mediante inyección, ya sea por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por vía intramuscular o suministrarse al espacio intersticial de un tejido), o en una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas, agujas y pulverizadores hipodérmicos.

El producto farmacéutico puede administrarse solo o como parte de un régimen de tratamiento que implica además la administración de otros fármacos usados actualmente en el tratamiento de pacientes con la enfermedad de Fabry. Por ejemplo, puede administrarse en combinación con terapia de reemplazo enzimático o con tratamientos asociados con el tratamiento de las manifestaciones clínicas de la enfermedad, tales como analgésicos, anticonvulsionantes y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID).

El agente puede administrarse simultáneamente, secuencialmente o por separado con el(los) otros(s) fármaco(s). Por ejemplo, el agente puede administrarse antes o después de la administración del (de los) otro(s) fármaco(s).

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10 %.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Dos moléculas de T4L-FAPP2-C212 en AU cristalográfico (Mol-A y Mol-B en ciano y verde respectivamente) Figura 2: Dos moléculas de T4L-FAPP2-C212 adyacentes en la red cristalina, que muestran amplia interacción entre T4L

Figura 3: La Glucosil Ceramida 18:1 (GlcCer, mostrada en palos verdes) se acopla en la estructura de FAPP2-C212, sin minimización de energía adicional. Las coordenadas de GlcCer se tomaron a partir de la ID de PDB: 3S0K. Los residuos hidrófobos de FAPP2 en las proximidades de las cadenas de oleilo y esfingosina se muestran en el modelo de palos. Los residuos que hacen contacto con el grupo principal glucosilo se muestran en el modelo de palos y se marcan. Figura 4: El mapa de densidad electrónica alrededor de W407 se muestra con GlcCer 18:1 acoplada (ver la Fig-3). No se hizo minimización de energía después del acoplamiento.

Figura 5: Cristales de T4L-FAPP2-C212.

Figura 6: Estructura de FAPP2-C212 (T4L se ha eliminado para mayor claridad) (a) con hGLTP para comparación (b). Figura 7: Unión del grupo principal azúcar: FAPP2-C212 (apo) frente a complejo de hGLTP (PDB: 4H2Z). FAPP2 se muestra en verde y GLTp en ciano. La Monosulfo-Galactosil Ceramida unida a hGLTP se muestra en rosa. Existe más carga negativa cerca del bolsillo de unión a azúcar en FAPP2 y en FAPP2 la K367 se ubica y el lazo negativamente cargado alrededor de R398 se proyecta por el enlace de hidrógeno.

Figura 8: Motivo de tipo FFAT en FAPP2 y GLTP (ID de PDB: 2EUK). El motivo FFAT (dos Phe en la pista ácida) interactúa con proteínas VAP (proteínas asociadas a proteínas de membrana asociadas a vesículas). F311 de FAPP2 y F33 de hGLTP toman el mismo lugar (en la cola de ceramida 24:1). FAPP2 se muestra en ciano y hGLTP en verde. La Galactosilceramida 24:1 unida a hGLTP está en naranja. El motivo de tipo FAPP2 de FFAT está implicado potencialmente en la estabilidad del plegamiento de GLTP y la liberación de ceramidas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1-Tamizaje de cristalización para FAPP2-C212:

Los 212 aminoácidos del extremo C-terminal, aa 308-519, de FAPP2 (FAPP2-C212) se expresaron como SUMO o sus fusiones y se purificaron como proteínas de fusión o como FAPP2-C212 con etiqueta eliminada. Estas proteínas se concentraron a 6-16 mg/ml para estudios de cristalización. El tamizaje de cristalización se llevó a cabo con moléculas de FAPP2-C212 purificadas mediante el uso de los kits de tamizaje de cristalización comerciales de Qiagen (JCSG kits I -IV) mediante método de difusión por vapor con gota asentada. El tamizaje de cristalización se llevó a cabo además para FAPP2-C212 incubada con diversos ligandos que se conoce que se unen a FAPP2 o proteínas GLTP humanas, que incluye C8-ceramida, Phlorizin, disulfo o monosulfo galactosil ceramidas. Estos ensayos de cristalización no rindieron ningún éxito prometedor de cristalización.

Ejemplo 2-fusión de lisozima a FAPP2-C212:

Como una estrategia alternativa para cristalizar FAPP2-C212, se escogió la lisozima (T4L), como etiqueta de fusión cristalizable, para facilitar la cristalización.

His-T4L-FAPP2-C212 (T4L-FAPP2-C212) se clonó en el vector pRSET (Life Technologies), expresado en E.coli y se purificó mediante los procesos en columna de Ni y en columna de SEC. La proteína purificada tiene un peso molecular de 47,2 kDa. T4L-FAPP2-C212 se concentró a 6 mg/ml y el ensayo de cristalización se llevó a cabo mediante el uso del kit de cristalización de matriz aleatoria JCSG-I de Qiagen. Todos los experimentos de cristalización se realizaron mediante el método de difusión por vapor con gota asentada en incubadoras a 16 °C. El éxito de la cristalización inicial se observó en la condición# C6 del kit-1 de JCSG después de tres días.

Ejemplo 3-Optimización de la cristalización para T4L-FAPP2-C212:

La condición de cristalización (JCSG-#C6) que produjo cristales de T4L-FAPP2-C212 fue MgCh 0,2 M, Tris 0,1 M pH=7,0 y NaCl 2,5 M. La optimización adicional de la cristalización se llevó a cabo mediante el aumento de la concentración de proteínas hasta 20 mg/ml, el tamizaje de la concentración de MgCh y NaCl en la solución de cristalización y mediante la microsiembra de las gotas de cristalización. La nucleación de cristales puede observarse a las 18-24 horas y los cristales se cultivaron aproximadamente una semana. Los cristales de 50-100 micrones de tamaño se generaron de forma reproducible bajo esta condición de cristalización.

Ejemplo 4-Recolección de los datos de difracción:

Los datos de difracción por rayos X se recolectaron en una instalación núcleo de difracción de rayos X BIDMC mediante el uso de un difractómetro de rayos X Rigaku con ánodo de Cu. Los cristales de aproximadamente 50-100 micrones de tamaño se usaron para la recolección de datos, después de congelarlos en nitrógeno líquido mediante el uso de un tampón criogénico de MgCh 0,2 M, Tris 0,1 M pH=7,0, NaCl 2,5 M, glicerol al 10 % y xilitol al 5 %. Se recolectaron aproximadamente 120 marcos de los datos de difracción por rayos X con oscilación de 1° y exposición de 10 min. El conjunto de datos de difracción por rayos X se procesó y se escaló al grupo espacial P222 mediante el uso de HKL2000 en BiDMC. El conjunto de datos de difracción por rayos X con una resolución de 3,0 Á, con una totalidad del 95 % y una I/sigma de >1,5 en la capa de resolución más alta, se usó para la determinación de la estructura inicial. Posteriormente, se usó un conjunto de datos a una resolución de 2,6 Á.

Ejemplo 5-Determinación y refinamiento de la estructura:

A 3,0 Á las dimensiones de la celda unitaria son a=99,8 Á, b=130,6 Á, c=88,6 Á, a=90°, p=90°, ^y=90°. A 2,6 Á las dimensiones de la celda unitaria son a=100,02 Á, b=130,87 Á, c=88,73 Á, a=90°, p=90°, y=90°.

Se usó el reemplazo molecular (MR) para determinar la estructura de T4L-FAPP2-C212. La estructura de T4L (ID de PDB: 3G3V) y la estructura de hGLTP (ID de PDB: 1SWX) se usaron como modelos de búsqueda. Molrep se usó para MR, refmac5 se usó para el refinamiento y coot se usó para la construcción del modelo.

Se identificaron dos moléculas de T4L y GLTP en la unidad asimétrica (AU) mediante el método de reemplazo molecular en el grupo espacial de P2i2i2. La construcción del modelo y el refinamiento adicionales se realizaron de forma iterativa mediante el uso de refmacy coot. La estructura de 3 Á se refinó a un R=25,5 % y Rlibre=32,4 %. La estructura de 2,6 Á se ha refinado a un factor R final de 20,5 % y Rlibre de 25,7 %.

Ejemplo 6-Breve descripción de la estructura:

Existen dos moléculas de T4L-FAPP2-C212 en la unidad asimétrica, referidas como Mol-A y Mol-B (Fig-1). La T4L de moléculas adyacentes en la red cristalina hace amplios contactos que parecen haber facilitado la cristalización (Fig-2). En el mapa de densidad electrónica, podrían observarse los aa 308-514 de FAPP2 para la molécula-A y 308-515 de FAPP2 para la molécula-B, sin ambigüedad. Las densidades electrónicas no son claras para las cadenas laterales de K190, 1322, E326, S328, E333 y E509 de la molécula-A y K190, L324, L325, E326, K377, E378 y R398 de la molécula-B

Los residuos implicados en la unión a ceramida, incluidos W407, H445, D360 y otros residuos hidrófobos que interactúan con las cadenas acilo/esfingosina de la ceramida están bien refinados en el mapa de densidad electrónica. La Glucosilceramida que contiene la cadena oleoil acilo (18:1) de ID de PDB: 3S0K se acopló en el bolsillo de unión a ligando de la estructura de FAPP2 actual (Fig-3) y el mapa de densidad electrónica correspondiente se muestra en la Fig-4. No se hizo minimización de energía después del acoplamiento.

La Figura 6 muestra la estructura de FAPP2-C212, en comparación con la de hGLTP (ID de PDB 1SWX). Los residuos de unión a grupo principal azúcar de FAPP-C212 se compararon con los del complejo de hGLTP con monosulfogalactosil ceramida (ID de PDB 4H2Z). Se observó que existe más carga negativa cerca del grupo principal azúcar en FAPP2, y además en FAPP2 se ubica el K367 y el lazo negativamente cargado alrededor de R398 se proyecta mediante un enlace de hidrógeno entre K367 y N399 (Figura 7).

La comparación de la estructura de hGLTP más galactosilceramida 24:1 (ID de PDB 2EUK) con la de FAPP2-C212 muestra que el motivo FFAT en FAPP2 probablemente es importante en la estabilidad del plegamiento de GLTP y la liberación de ceramidas (Figura 8). F311 ocupa la posición de F33 de hGLTP (Figura 8).

Secuencias del listado de secuencias:

sec. con núm. de ident.:1 308-519 de FAPP2 humana

sec. con núm. de ident.:2 secuencia de T4L (aminoácidos 2-164)

sec. con núm. de ident.:4 FAPP2 humana de longitud completa

sec. con núm. de ident.:5 secuencia de ácidos nucleicos de T4L-C212-FAPP2

Tablas

TABLA 1 Datos de la estructura para los residuos 36-207 de la sec. con núm. de ident.:3

TABLA 2 Coordenadas atómicas de bolsillo de unión del sustrato

R es iduos que son similares a hGLTP

ÁTOMO 2306 HH2 ARG A -133 25.527 40.231 18.711 1.00 61.80

ÁTOMO 2307 C ARG A 488 23.579 44,943 24.136 1.00 45.15

ÁTOMO 230$ 0 ARG A 4$$ 23,5$2 14.05$ 25-041 1.00 4332

ÁTOMO 2325 N SER A 191 21.495 43.694 27.179 1.00 30.94

ÁTOMO 2326 CA SER A 491 21.332 42.252 27.413 L .00 30.71

ÁTOMO 2327 CB SER A 491 20.762 11.550 26.177 1.00 30.02

ÁTOMO 232$ QG SER A 491 21.642 41.664 25-035 1.00 30.25

ÁTOMO 2923 C SER A 491 22.646 41.587 27.667 1.00 30.97

ÁTOMO 2930 0 SER A 191 22.617 40.539 23.514 1.00 29.7$

Residuos que sor diferentes de liGLTP

ÁTOMO L4Ü2 11 PÍ1E A 311 26.769 54.540 27.003 1,00 32.07

ÁTOMO L4G3 CA PHE A 311 26-94$ 54,601 28-45$ 1,00 $4.09

ÁTOMO L4Ü4 CB PHE A 311 25.760 55.376 29.044 1.00 34.32

ÁTOMO L4Ü5 CG PHE A 311 25.775 55.510 30.544 1.00 33.87

ÁTOMO 1406 CDl PHE A 311 26.415 56.577 31.147 1.00 33.81

ÁTOMO 1407 CEL FHE A 311 26-417 56.714 32.526 1.00 34.72

ÁTOMO 1403 CE FHE A 311 25.756 55.736 33.316 1.00 34.67

ÁTOMO 1409 C£2 PHE A 311 25.100 54.722 32.724 1.00 34.28

ÁTOMO 1410 CD2 FUE A 311 25.106 54.591 31.345 1.00 33.99

ÁTOMO 1411 C ^PHE A 31 l 27.090 53.223 29.145 1.00 36.32

ÁTOMO 1412 0 PHE A 311 27.765 53.126 30.192 1.00 37.54

ÁTOMO 1413 H PHE A 312 26.476 52.173 2S.571 1.00 36.34

ÁTOMO 1414 CA ^PHE A 312 26.419 50,339 29.215 1.00 36.37

ÁTOMO 1415 CB ^PHE A 312 2S.0S5 50.166 23,925 1.00 36.19

ÁTOMO 1416 CG PHE A 312 23.930 50.342 29.577 1.00 37.19

ÁTOMO 1417 CDl FHE A 312 23.719 50.703 30.943 1.00 37.96

ÁTOMO 1413 CE1 ^PHE A 312 22.641 51.330 31.553 1.00 33.86

ÁTOMO 1419 CZ ^PHE A 312 21.773 52.112 30,307 1.00 33.12

ÁTOMO L42Ü CE2 PHE A 312 21.990 52.270 29.443 1.00 $7.60

ÁTOMO 1421 CD2 PHE A 312 23.059 51.636 20,635 1.00 36.59

ÁTOMO 1422 C ^PHE A 312 27.541 19,344 28.902 1.00 36.28

ÁTOMO 1423 0 ^PHE A 312 27.575 43.767 29,505 1.00 36.76

ÁTOMO 1661 H VAL A 345 22.049 57.173 35.593 1.00 33.84

ÁTOMO 1662 CA VAL A 345 20.753 56,336 34.924 1.00 39.53

ÁTOMO 1663 CB VAL A 345 20.379 55.377 34,941 1.00 40.42

ÁTOMO 1664 CG1 VAL A 345 13.94$ 55.156 34,450 1.00 42 r L $

ÁTOMO 1665 CG2 VAL A 345 21.316 54,534 34.057 1.00 40.90

ÁTOMO 1666 C VAL A 345 19.572 57,691 35.497 1.00 $7.21

ÁTOMO 1667 0 VAL A 345 13.332 58.324 34.745 1.00 36.62

ÁTOMO L661 H VAL A 345 22.049 57.173 35.593 1.00 33.84

ÁTOMO 1662 CA VAL A 345 20.753 56,836 34.924 1.00 39.53

ÁTOMO 1663 CB VAL A 345 20.379 55.377 34,941 1.00 40.42

ÁTOMO 1664 CGL VAL A 345 13.94$ 55.156 34,450 1.00 42,16

ÁTOMO 1665 CG2 VAL A 345 21.316 54.584 34.057 1.00 40.90

ÁTOMO 1666 C VAL A 345 19.572 57,691 35.497 1.00 $7.21

ÁTOMO 1667 0 VAL A 345 13.332 58.324 34.745 1.00 36.62

ÁTOMO 207$ 11 ARG A 3$ 9 13.836 48.606 63.326 1.00 54.38

ÁTOMO 2080 CA ARG A $9$ 13.67$ 49.392 62.62$ 1,00 53.73

ÁTOMO 2081 CB ARG A 398 19.486 51-053 63.613 1,00 54,59

ÁTOMO 2082 CG ARG A 39$ 1$.0$$ 51.275 64, 036 1.00 55,66

ÁTOMO 2083 CD ARG A $$$ 17,533 50,165 64.93$ 1.00 56.49

ÁTOMO 2084 HE ARG A 39$ 18.208 50.176 66.2$6 1,00 58.33

ÁTOMO 2085 CE ARG A 398 17.946 43.340 67.236 1.00 59.28

ÁTOMO 2086 HHL ARG A 39$ 17.015 4$.39$ 67.108 1.00 60.24

ÁTOMO 2087 14H2 ARG A 398 18.616 49,442 68.381 1.00 57.85

ÁTOMO 208$ C ARG A 39$ 20.741 50.220 61.552 1,00 51.17

ÁTOMO 203$ O ARG A 333 20.714 43.623 60.476 1.00 53.64

ÁTOMO 2090 14 ASI] A 399 21.681 51.129 61.826 1.00 47.16 ii ÁTOMO 2091 CA ASN A 399 22.566 51.657 60.761 L.ÜQ 43.46 c ÁTOMO 2092 ^CB A5H A 399 23.240 52,973 61.198 1.00 43.11 c ÁTOMO 2093 ^CG A3H A 399 22.665 54.187 60,486 1.00 42.49 c ÁTOMO 2094 001 ASN A 399 22.237 54.104 59.330 1.00 40.36 o

TABLA 3 coordenadas atómicas de dominio GLTP de FAPP2

Tabla 4

Referencias citadas

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un método para identificar un compuesto que se une a la proteína adaptadora fosfoinositol 4-fosfato 2 (FAPP2), que comprende identificar computacionalmente un compuesto que se une a FAPP2 mediante las coordenadas atómicas de (i) al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2; o (ii) al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el compuesto

   a) se une al bolsillo de unión a sustrato de FAPP2 o se une adyacente al bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, b) es un inhibidor de FAPP2,

   c) es un sustrato de FAPP2,

   d) es específico para FAPP2, preferentemente sobre GLTP, y/o

   e) es una molécula pequeña.
3. 3. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior en donde dicha identificación computacional incluye identificar dicho compuesto a partir de una biblioteca de compuestos o identificar dicho compuesto en una base de datos.
4. 4. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, que comprende además analizar la unión del compuesto identificado al polipéptido de FAPP2, en donde opcionalmente dicho análisis del compuesto de unión incluye analizar la capacidad del compuesto de unión para modular la actividad del polipéptido de FAPP2, además en donde opcionalmente el análisis de dicho compuesto de unión se realiza mediante el uso de un ensayo biológico para determinar si el compuesto de unión:

   a) modula la actividad de transferencia del polipéptido de FAPP2;

   b) modula la estabilidad del polipéptido de FAPP2; y/o

   c) modula el tráfico intracelular del polipéptido de FAPP2,

   además en donde opcionalmente el compuesto de unión disminuye la actividad de transferencia o estabilidad de FAPP2, o reduce la cantidad de FAPP2 que está presente en el aparato de Golgi.
5. 5. Un método para diseñar, seleccionar y/u optimizar un compuesto que se une a FAPP2 que comprende:

   a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas (i) de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2; o (ii) para al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3; y

   b) diseñar, seleccionar y/u optimizar computacionalmente dicho compuesto realizando una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas,

   opcionalmente en donde dicha identificación computacional incluye diseñar in silico un compuesto de unión que se une a FAPP2, además en donde opcionalmente dicho compuesto de unión se diseña a partir de un compuesto conocido.
6. 6. Un método para evaluar la capacidad de un compuesto de asociarse con FAPP2 que comprende:

   a) proporcionar un conjunto de coordenadas atómicas (i) de al menos los aminoácidos que conforman el bolsillo de unión a sustrato de FAPP2, como se expone en la Tabla 2; o (ii) para al menos el dominio GLTP de FAPP2 como se expone en la Tabla 3;

   b) realizar computacionalmente una operación de ajuste entre dicho compuesto y toda o parte de la información de la estructura tridimensional que se genera a partir de las coordenadas atómicas; y

   c) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre el compuesto y FAPP2.
7. 7. Un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 95 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 308-519 de FAPP2 (sec. con núm. de ident.:1) y una secuencia de aminoácidos con al menos 95 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 2-164 de la lisozima T4L (sec. con núm. de ident.:2), en donde opcionalmente el polipéptido comprende:

   a) los residuos D360, N364, W407 de FAPP2 humana, en donde la numeración es de acuerdo con la sec. con núm. de ident.:4, y/o b) la secuencia sec. con núm. de ident.:3 o un fragmento de esta, en donde opcionalmente el polipéptido consiste en la secuencia sec. con núm. de ident.:3.
8. 8. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 7.
9. 9. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8.
10. 10. Una célula huésped que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 9.