ES2711455T3

ES2711455T3 - Un método de purificación de proteínas terapéuticas

Info

Publication number: ES2711455T3
Application number: ES13861334T
Authority: ES
Inventors: Hung Pham; Jeffrey Hey; Darren Nguy
Original assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date: 2012-12-05
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2033-12-05
Also published as: DK2928905T3; SG10201911709RA; TR201902450T4; JP2021073280A

Abstract

Un método de reducción del nivel de al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en plasminógeno, activador de plasminógeno tisular en una disolución que comprende al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en fibrinógeno, comprendiendo el método: (i) hacer pasar una materia prima que comprende fibrinógeno a través de una resina de cromatografía por inducción de carga hidrófoba en condiciones seleccionadas de modo que al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en plasminógeno, activador de plasminógeno tisular presente en la materia prima se une a la resina; y (ii) recuperar una disolución que comprende el fibrinógeno que pasa a través de la resina, reduciéndose la concentración de la al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en plasminógeno, activador de plasminógeno tisular en la disolución en al menos el 50% en comparación con la materia prima; equilibrándose la resina de cromatografía por inducción de carga hidrófoba a un pH de desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,5 antes de hacer pasar la materia prima y/o la disolución que comprende el fibrinógeno a través de la resina de cromatografía por inducción de carga hidrófoba.

Description

DESCRIPCION

Un metodo de purificacion de protemas terapeuticas

Campo tecnico

La presente invencion se refiere en general a un metodo de reduccion del nivel de impurezas en una disolucion que contiene al menos una protema terapeutica. Mas espedficamente, a un metodo de reduccion del nivel de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular en una materia prima que comprende fibrinogeno.

Antecedentes

Los metodos actuales de purificacion de una protema terapeutica que se produce de manera natural o recombinante a partir de una disolucion que comprende dicha protema llevan habitualmente al menos algo de impurezas a la preparacion final. En algunos casos, la presencia de impurezas, tales como proteasas, desestabilizara la protema terapeutica en disolucion, particularmente durante su almacenamiento. Por este motivo, muchas protemas terapeuticas se almacenan como preparaciones liofilizadas o congeladas.

Aunque los niveles desestabilizantes de impurezas pueden afectar a muchos tipos de protemas terapeuticas diferentes, son particularmente relevantes para las usadas para mantener la hemostasia. La hemostasia es un proceso fisiologico importante que impide el sangrado tras un dano (por ejemplo, una rotura) de vasos sangumeos. Existen tres mecanismos basicos que promueven la hemostasia: (i) la vasoconstriccion, (ii) la agregacion plaquetaria en el sitio de rotura; y (iii) la coagulacion. Durante la coagulacion, las celulas endoteliales danadas liberan factor tisular (factor III), que a su vez activa el factor VII con la ayuda de Ca2+. El factor XII, que se libera por plaquetas activadas, activa el factor XI. El factor VII y el factor XI activados promueven una cascada de reacciones enzimaticas que conducen a la activacion del factor X. El factor X activo (factor Xa), junto con el factor III, el factor V, Ca2+ y el factor tromboplastico plaquetario (PF3), activan el activador de protrombina. El activador de protrombina convierte la protrombina en trombina, que convierte el fibrinogeno (factor I) en fibrina, que forma una malla inicial sobre el sitio del dano. La malla inicial se convierte entonces en un coagulo de fibrina denso mediante el factor XIII, sellando la rotura hasta que se repara el sitio. Durante la cascada de coagulacion, la trombina tambien activara el factor VIII, un pro-cofactor de glicoprotema que en la circulacion esta principalmente complejado con el factor de von Willebrand (VWF). El factor VIII interacciona con el factor IXa para activar el factor X en presencia de Ca+2 y fosfolfpidos.

Una deficiencia en el nivel de una cualquiera o mas de las protemas implicadas en la coagulacion, incluyendo fibrinogeno, factor VIII y/o factor de von Willebrand (VWF), ya sea congenita o adquirida, puede conducir a una coagulacion insuficiente de la sangre y al riesgo de hemorragia. Las opciones de tratamiento actuales se limitan a la administracion de una preparacion farmaceutica de una o mas protemas terapeuticas, con vistas a restaurar los niveles endogenos de dichas protemas y mantener la hemostasia. Sin embargo, las preparaciones farmaceuticas existentes, que se derivan normalmente de plasma sangumeo donado o una fuente recombinante, comprenden zimogenos y proteasas (por ejemplo, protrombina, plasminogeno, activador de plasminogeno tisular (tPA) y/u otras proteasas), que pueden desestabilizar las protemas terapeuticas, tales como fibrinogeno, factor VIII o VWF durante su almacenamiento. En consecuencia, tales preparaciones son relativamente inestables en disolucion acuosa, con un almacenamiento a largo plazo limitado a preparaciones liofilizadas o congeladas.

Para aplicaciones clmicas, el fibrinogeno se purifica normalmente a partir de plasma humano, en el que representa solo aproximadamente el 2-5% (1,5 - 4,0 g/l) de las protemas plasmaticas totales. Tradicionalmente, la purificacion de fibrinogeno a partir de plasma se lleva a cabo mediante fraccionamiento de plasma clasico, en el que el fibrinogeno se crioprecipita del plasma seguido de precipitacion con o bien etanol, o bien sulfato de amonio, o bien palanina/glicina, o bien polfmeros (por ejemplo, polietilenglicol) o bien disoluciones de fuerza ionica baja. Tales metodos pueden conseguir un rendimiento y homogeneidad relativamente altos. Cuando se requiere un nivel de pureza mayor, a menudo se emplean tecnicas cromatograficas. Sin embargo, las tecnicas de precipitacion y cromatograficas existentes susceptibles de procesos de fabricacion a escala comercial producen normalmente preparaciones de fibrinogeno que comprenden protemas contaminantes, tales como zimogenos o proteasas (por ejemplo, protrombina, activador de plasminogeno tisular (tPA) y plasminogeno), que pueden desestabilizar el fibrinogeno en disolucion. Por ejemplo, cuando esta presente protrombina, puede activarse para dar serina proteasa trombina, que convertira a su vez el fibrinogeno en fibrina. De manera similar, cuando estan presentes tanto tPA como plasminogeno, el tPA puede activar el plasminogeno a su forma activa plasmina, que hidrolizara a su vez el fibrinogeno para dar fibrina. En consecuencia, las preparaciones de fibrinogeno son relativamente inestables en disolucion acuosa, con un almacenamiento a largo plazo limitado a preparaciones liofilizadas o congeladas.

Contaminantes espedficos pueden eliminarse mediante absorcion; por ejemplo, la fibronectina en gelatina inmovilizada y plasminogeno en lisina inmovilizada (Vuento et al. 1979, Biochem. J., 183(2):331-337). Sin embargo, el uso de resinas de afinidad espedficas no es susceptible de procesos comerciales a gran escala. Los motivos para esto incluyen que las propias resinas de afinidad no son suficientemente robustas como para usarse repetidamente e incrementan en general significativamente tanto el tiempo como los costes de procesamiento.

El documento EP1240200 (US6960463) se refiere a metodos de purificacion de fibrinogeno a partir de una disolucion que contiene fibrinogeno usando cromatograffa de intercambio ionico (IEX). En particular, el metodo implica aplicar una disolucion que contiene fibrinogeno a una matriz de intercambio ionico en condiciones que permiten que el fibrinogeno se una a la matriz y entonces lavar la matriz de intercambio ionico con una disolucion que comprende al menos un omega-aminoacido. Esto se hace para promover la retirada diferencial de plasminogeno de la resina. El fibrinogeno que se ha unido a la matriz se eluye entonces de la matriz.

El documento WO2012038410 proporciona un metodo de purificacion de fibrinogeno que usa resinas de intercambio anionico que contienen un soporte polimerico hidroxilado injertado con aminas terciarias o cuaternarias que se unen al fibrinogeno.

El documento EP1519944 ensena el uso de una matriz de cromatograffa de afinidad por iones metalicos inmovilizados en condiciones en las que el fibrinogeno y el plasminogeno se unen a la matriz, y la elucion selectiva del fibrinogeno y del plasminogeno por separado, de modo que la fraccion de fibrinogeno principal contiene aproximadamente 600 ng de plasminogeno por mg de protema.

El documento US20050197493 se refiere a un proceso para purificar fibrinogeno, que comprende una o mas etapas de proceso en las que una o mas protemas contaminantes se agotan mediante cromatograffa negativa y/o adsorcion negativa usando un intercambiador cationico, gel hidrofobo y/o gel de tincion.

La presente invencion proporciona un metodo de reduccion del nivel de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular en una disolucion que comprende fibrinogeno. La(s) protema(s) purificada(s) son estables durante su almacenamiento como preparaciones ffquidas y pueden usarse para aplicaciones cffnicas o veterinarias, incluyendo el tratamiento o la prevencion de estados asociados con una deficiencia en el nivel de dicha(s) protema(s).

Sumario de la invencion

En un aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de reduccion del nivel de al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular en una disolucion que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, comprendiendo el metodo: (i) hacer pasar una materia prima que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno a traves de una resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba en condiciones seleccionadas de modo que al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular presente en la materia prima se une a la resina; y

(ii) recuperar una disolucion que comprende la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, que pasa a traves de la resina, reduciendose la concentracion de la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular en la disolucion en al menos el 50% en comparacion con la materia prima, estando equilibrada la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba a un pH de desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,5 antes de hacer pasar la materia prima y/o la disolucion que comprende el fibrinogeno a traves de la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba. En un ejemplo descrito en el presente documento, se proporciona un metodo de reduccion del nivel de al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular y otra(s) proteasa(s) en una disolucion que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, factor VIII y factor de von Willebrand (VWF), comprendiendo el metodo:

(i) hacer pasar una materia prima que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, factor VIII y VWF a traves de una primera resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba; (ii) recuperar una disolucion que comprende la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, factor VIII y VWF que pasa a traves de la primera resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba;

(iii) hacer pasar la disolucion que se ha recuperado en la etapa (ii) a traves de una segunda resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba; y

(iv) recuperar la disolucion que comprende la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, factor VIII y VWF que pasa a traves de la segunda resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba;

siendo las condiciones de las etapas cromatograficas tales que al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular y otra(s) proteasa(s) presente en la materia prima se une a la primera y/o segunda resina, y reduciendose la concentracion de la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular y otra(s) proteasa(s) en la disolucion que se ha recuperado en la etapa (iv) en al menos el 50% en comparacion con la materia prima.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, factor VIII y VWF recuperados mediante el metodo descrito en el presente documento.

En otro ejemplo, se proporciona un recipiente que contiene al menos 5 ml de una disolucion de fibrinogeno farmaceuticamente aceptable, siendo la concentracion de fibrinogeno de al menos 20 mg/ml.

En otro ejemplo, se proporciona una formulacion farmaceutica que comprende una disolucion que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, factor VIII y VWF recuperados mediante el metodo descrito en el presente documento, y un portador farmaceuticamente aceptable.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende:

(a) al menos el 75% de la protema total de fibrinogeno;

(b) menos de 50 pg/mg de la protema total de activador de plasminogeno tisular; y/o

(c) menos de 1 pg/mg de la protema total de plasminogeno.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende:

(a) al menos el 90% de la protema total de fibrinogeno;

(c) menos de 150 ng/mg de la protema total de plasminogeno.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende:

(a) al menos el 90% de la protema total de fibrinogeno;

(b) menos de 20 pg/mg de la protema total de activador de plasminogeno tisular; y/o

(c) menos de 10 ng/mg de la protema total de plasminogeno.

En otro ejemplo, se proporciona un metodo de tratamiento o de prevencion de un estado asociado con deficiencia de fibrinogeno, comprendiendo el metodo administrar a un sujeto que lo necesita la disolucion o formulacion farmaceutica descrita en el presente documento.

En otro ejemplo, se proporciona el uso de la disolucion descrita en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para tratar o prevenir un estado asociado con deficiencia de fibrinogeno.

En otro ejemplo, se proporciona un pegamento de fibrina que comprende la disolucion descrita en el presente documento.

En otro ejemplo, se proporciona un metodo de produccion de una disolucion de fibrinogeno lfquida estable, comprendiendo el metodo:

(i) hacer pasar una materia prima que comprende fibrinogeno a traves de una resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba en condiciones seleccionadas de modo que al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular y otra(s) proteasa(s) presente en la materia prima se une a la resina; y

(ii) recuperar una disolucion que comprende fibrinogeno que pasa a traves de la resina, reduciendose la concentracion de la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular y otra(s) proteasa(s) en la disolucion en al menos el 50% en comparacion con la materia prima. En otro ejemplo, se proporciona un metodo de produccion de una disolucion de fibrinogeno lfquida estable, comprendiendo el metodo:

(i) hacer pasar una materia prima que comprende fibrinogeno a traves de una primera resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba;

(ii) recuperar una disolucion que comprende fibrinogeno que pasa a traves de la primera resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba;

(iv) recuperar una disolucion que comprende fibrinogeno que pasa a traves de la segunda resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba;

En otro ejemplo, se proporciona un metodo para purificar fibrinogeno, comprendiendo el metodo las etapas de: (i) hacer pasar una disolucion que comprende fibrinogeno a traves de una resina de cromatograffa de intercambio ionico en condiciones seleccionadas de modo que se une monomero de fibrinogeno a la resina;

(ii) eluir el monomero de fibrinogeno de la resina con un tampon de elucion; y

(iii) filtrar el monomero de fibrinogeno eluido de la etapa (ii) a traves de un filtro que tiene un tamano de poro en el intervalo de desde aproximadamente 15 nm hasta aproximadamente 35 nm.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra el porcentaje de recuperacion de fibrinogeno, plasminogeno y t-PA a partir de una disolucion de fibrinogeno a lo largo de un intervalo de niveles de pH cuando se hace pasar la disolucion a traves de un HEA Hypercel™ en modo negativo con respecto a fibrinogeno. Las barras dentro de cada grupo representan (de izquierda a derecha): recuperacion de fibrinogeno, recuperacion de plasminogeno y recuperacion de t-PA.

La Figura 2 muestra el porcentaje de recuperacion de fibrinogeno, plasminogeno, t-PA y factor II a partir de una disolucion de fibrinogeno a lo largo de un intervalo de niveles de pH cuando se hace pasar la disolucion a traves de un PPA Hypercel™ en modo negativo con respecto a fibrinogeno. Las barras dentro de cada grupo representan (de izquierda a derecha): recuperacion de fibrinogeno, recuperacion de plasminogeno, recuperacion de t-PA y factor II. La Figura 3 muestra el porcentaje de recuperacion de fibrinogeno, plasminogeno, t-PA y factor II a partir de una disolucion de fibrinogeno a lo largo de un intervalo de niveles de pH cuando se hace pasar la disolucion a traves de un MEP Hypercel™ en modo negativo con respecto a fibrinogeno. Las barras dentro de cada grupo representan (de izquierda a derecha): recuperacion de fibrinogeno, recuperacion de plasminogeno, recuperacion de t-PA y factor II. La Figura 4a muestra el porcentaje de recuperacion de fibrinogeno, plasminogeno, t-PA y factor II a partir de una disolucion que contiene fibrinogeno a lo largo de un intervalo de niveles de pH cuando se hace pasar la disolucion a traves de un HEA Hypercel™ en modo negativo con respecto a fibrinogeno. Las barras dentro de cada grupo representan (de izquierda a derecha): recuperacion de fibrinogeno, recuperacion de plasminogeno, recuperacion de t-PA y recuperacion de factor II.

La Figura 4b muestra la estabilidad de la disolucion que contiene fibrinogeno recuperada de la fraccion de cafda a traves de la columna de HEA Hypercel™ (Figura 4a) a lo largo de 6 dfas a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C), medida mediante el % de protema coagulable inicial. Las barras dentro de cada grupo representan (de izquierda a derecha): T = 1 dfa, T = 3 dfas, T = 6 dfas.

La Figura 4c muestra la estabilidad de la disolucion que contiene fibrinogeno recuperada de la fraccion de cafda a traves de la columna de HEA Hypercel™ (Figura 4a) a lo largo de 6 dfas a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C), medida mediante el % protema coagulable. Las barras dentro de cada grupo representan (de izquierda a derecha): T = 1, T = 3 dfas, T = 6 dfas.

La Figura 5 muestra el porcentaje de recuperacion de proceso para fibrinogeno, t-PA, plasminogeno y factor II en fracciones derivadas de un metodo segun una realizacion de la presente invencion, desde el crioprecipitado de plasma hasta el eluato de MacroPrep™-HQ. Las barras dentro de cada grupo representan (de izquierda a derecha): fibrinogeno, fibronectina, plasminogeno, t-PA y factor II.

La Figura 6 muestra la pureza de fibrinogeno monomerico que se recupero de la resina cromatografica MacroPrep™-HQ medida mediante un cromatograma de HPLC de exclusion por tamano analffica.

La Figura 7 muestra la capacidad de filtracion de fibrinogeno recuperado de la resina cromatografica MacroPrep™-HQ usando tampones de elucion con diferentes conductividades (NaCl 190 mM, 21,5 mS/cm (rombos); NaCI 200 mM, 22,5 mS/cm (cuadrados); NaCl 210 mM, 23,5 mS/cm (triangulos); 1% (p/p) arginina/NaCl 200 mM, 25 mS/cm (cruz)).

La Figura 8 muestra la actividad de fibrinogeno como porcentaje de la actividad de fibrinogeno inicial en t=0 de fibrinogeno lfquido recuperado de la resina cromatografica MacroPrep™-HQ que se almacena a o bien 2-8°C (rombos) durante un periodo de 9 semanas o bien 30°C (cuadrados) durante un periodo de 7 semanas.

Descripcion detallada

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entendera que la palabra “comprender”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, implica la inclusion de un elemento o numero entero o grupo de elementos o numeros enteros expresado, pero no la exclusion de cualquier otro elemento o numero entero o grupo de elementos o numeros enteros.

La referencia en esta memoria descriptiva a cualquier publicacion anterior (o informacion derivada de la misma), o a cualquier materia conocida, no es y no debe tomarse come un reconocimiento o admision o ninguna forma de sugerencia de que esa publicacion anterior (o informacion derivada de la misma) o materia conocida forme parte del conocimiento general comun en el campo de trabajo al que se refiere esta memoria descriptiva.

Debe observarse que, tal como se usa en la memoria descriptiva objeto, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen aspectos en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una formulacion” incluye una unica formulacion, asf como dos o mas formulaciones.

En ausencia de cualquier indicacion en contra, la referencia hecha a un contenido en “%”a lo largo de esta memoria descriptiva debe tomarse como que significa % p/p (peso/peso). Por ejemplo, una disolucion que comprende al menos el 80% de la protema total de fibrinogeno debe tomarse como que significa una disolucion que comprende fibrinogeno a una concentracion de al menos el 80% p/p de la protema total. Esto puede calcularse, por ejemplo, dividiendo la cantidad de fibrinogeno derivada del ensayo de protema coagulable entre la cantidad de protema total derivada de un ensayo de protema convencional (por ejemplo, biuret) y multiplicando por 100. En el ensayo de protema coagulable, se anade trombina a una muestra para formar un coagulo, que es casi todo de fibrina. El coagulo puede separarse del sobrenadante que contiene protemas no coagulables mediante centrifugacion. Posteriormente, el coagulo se lava y se disuelve mediante urea alcalina u otras sustancias y la concentracion de protema se determina mediante espectrofotometna. Dado que la mayona del coagulo es fibrina, la concentracion de protema sera equivalente a la concentracion de fibrinogeno. Por tanto, la cantidad de protema coagulable en una muestra es equivalente a la diferencia entre la protema total y el componente de protema no coagulable de la muestra.

La purificacion de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF a partir de una materia prima (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular o de plasma) se lleva a cabo normalmente mediante fraccionamiento convencional, en el que el fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se precipita a partir de la disolucion usando, por ejemplo, etanol, sulfato de amonio, p-alanina/glicina, polfmeros (por ejemplo, polietilenglicol) y/o disoluciones de fuerza ionica baja. Los metodos de purificacion de plasma actuales que emplean diferentes etapas cromatograficas pueden conseguirse un rendimiento relativamente alto y preparaciones homogeneas de una protema de interes. Sin embargo, estos metodos normalmente dan como resultado preparaciones que comprenden cantidades residuales de impurezas que pueden no ser adecuadas para formular una preparacion lfquida estable para aplicaciones clmicas. Las impurezas tales como protrombina, activador de plasminogeno tisular (tPA) y plasminogeno son particularmente problematicas, ya que niveles desestabilizantes de estas impurezas pueden hidrolizar el fibrinogeno en disolucion acuosa, convirtiendo asf el fibrinogeno en inestable, particularmente durante la fabricacion y/o el almacenamiento a largo plazo.

La presente invencion se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que hacer pasar una materia prima que comprende fibrinogeno a traves de una resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba (HCIC) y recuperar la disolucion que comprende fibrinogeno que pasa a traves de la resina es una alternativa eficiente a los procesos de purificacion existentes para reducir el nivel desestabilizante de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular en la disolucion.

Por tanto, en un aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de reduccion del nivel de al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular en una disolucion que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, comprendiendo el metodo:

(i) hacer pasar una materia prima que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno a traves de una resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba en condiciones seleccionadas de modo que al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular presente en la materia prima se une a la resina; y

(ii) recuperar una disolucion que comprende la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno que pasa a traves de la resina, reduciendose la concentracion de la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular en la disolucion en al menos el 50% en comparacion con la materia prima; equilibrandose la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba a un pH de desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,5 antes de hacer pasar la materia prima y/o la disolucion que comprende el fibrinogeno a traves de la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba. En una realizacion, la concentracion del plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular en la disolucion recuperada que comprende fibrinogeno se reduce en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% o en al menos el 95% o en al menos el 98% en comparacion con la materia prima.

(ii) recuperar una disolucion que comprende fibrinogeno que pasa a traves de la resina, reduciendose la concentracion de la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular y otra(s) proteasa(s) en la disolucion en al menos el 50% en comparacion con la materia prima. En una realizacion, la concentracion del plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) en la disolucion recuperada que comprende fibrinogeno se reduce en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% o en al menos el 95% o en al menos el 98% en comparacion con la materia prima.

Los procesos cromatograficos emplean normalmente un soporte solido, tambien denominado de manera intercambiable en el presente documento resina o matriz. Soportes solidos adecuados seran familiar para los expertos en la tecnica. Los ejemplos incluyen portadores inorganicos, tales como vidrio y gel de sflice, portadores organicos, sinteticos o que se producen de manera natural, tales como agarosa, celulosa, dextrano, poliamida, poliacrilamidas, copolfmeros de vinilo de acrilatos bifuncionales, y diversos monomeros hidroxilados, y similares. Portadores disponibles comercialmente se venden con los nombres de resinas Sephadex™, Sepharose™, Hypercel™, Capto™, Fractogel™, MacroPrep™, Unosphere™, GigaCap™, Trisacryl™, Ultrogel™, Dynospheres™, Macrosorb™ y XAD™.

Las etapas de cromatograffa se llevaran a cabo generalmente en condiciones no desnaturalizantes y a temperaturas convenientes en el intervalo de aproximadamente 10°C a 30°C, mas habitualmente a temperaturas aproximadamente ambientales. Las etapas cromatograficas pueden realizarse por lotes o de manera continua, segun sea conveniente. Puede emplearse cualquier metodo de separacion conveniente, tal como columna, centrifugacion, filtracion, decantacion, o similares.

La cromatograffa por induccion de carga hidrofoba (HCIC), que a menudo tambien se denomina cromatograffa o bien de modo mixto o bien multimodal, resultara familiar para los expertos en la tecnica. La HCIC usa restos de union acoplados a un soporte solido, pudiendo tener los restos de union especificidad por una o mas protemas que, segun los metodos de la presente invencion, representan impurezas en la materia prima (por ejemplo, zimogenos y proteasas, tales como protrombina, tPA y plasminogeno).

Puede usarse cualquier resina de HCIC adecuada conocida por los expertos en la tecnica. En una realizacion, la resina de HCIC comprende un ligando seleccionado del grupo que consiste en mercaptoetilpiridina (4-mercaptoetilpiridina, por ejemplo, MEP Hypercel™), n-hexilamina (por ejemplo, HEA Hypercel™) y fenilpropilamina (por ejemplo, PPA Hypercel™). En una realizacion, la resina de HCIC comprende n-hexilamina.

Los ligandos de HCIC, tales como HEA, MEP y PPA, tienen una ventana porque permiten la separacion basada en la hidrofobicidad superficial de protemas, pero no requieren la adicion de sales liotropicas vistas a menudo en otros procesos para la purificacion de fibrinogeno usando cromatograffa hidrofoba (por ejemplo, cromatograffa por interaccion hidrofoba; HIC). A diferencia de la cromatograffa por interaccion hidrofoba tradicional, la HCIC se controla en base al pH, en vez de la concentracion de sal. Las resinas de HCIC tambien proporcionan una alta capacidad de union y altas tasas de flujo, ideales para la purificacion tanto a escala de laboratorio como a escala industrial.

Las resinas de HCIC se apilan a menudo en columnas con alturas de lecho de desde aproximadamente 2 cm hasta aproximadamente 40 cm. A escala industrial, las alturas de lecho son habitualmente de al menos 10 cm y estan normalmente en el intervalo de desde aproximadamente 15 cm hasta 25 cm. Los diametros de columna de columnas industriales pueden oscilar entre 20 cm y aproximadamente 1,5 m. Tales columnas se hacen funcionar a tasas de flujo segun las instrucciones de fabricacion de resina de HCIC con tasas de flujo en el intervalo tfpico de 50 100 cm/h. La limitacion de tasa de flujo superior se debe en parte a las restricciones de presion de la resina de HCIC. Para la resina HEA, por ejemplo, el lfmite de presion de funcionamiento superior es < 3 bar (< 300 kPa). Las capacidades de union dinamicas tfpicas (saturacion del 10% de una protema de union) para resinas de HCIC son de aproximadamente 20 a 30 mg de protema unida por ml de resina. Para la presente invencion, esto posibilita que se carguen cantidades relativamente grandes de protema en la columna de HCIC ya que las protemas abundantes, como el fibrinogeno, pueden pasar a traves de la columna, mientras que protemas menos abundantes tales como el plasminogeno y/o el activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) se unen a la resina de HCIC. Esto resulta ventajoso para la fabricacion a escala industrial, ya que se requieren o bien columnas de tamano mas pequeno y/o menos ciclos de columnas para procesar un lote.

Los presentes inventores tambien han encontrado que el pH de la disolucion o materia prima que comprende fibrinogeno que se hace pasar a traves de la resina de HCIC segun los metodos de la presente invencion puede ajustarse para controlar la recuperacion del fibrinogeno y la eliminacion de impurezas. Por tanto, en una realizacion dada a conocer en el presente documento, la disolucion o materia prima que comprende fibrinogeno que se hace pasar a traves de la resina de HCIC tiene un pH de desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,5. En ejemplos particulares, la disolucion o materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se hace pasar a traves de la resina de HCIC, preferiblemente a un pH de aproximadamente 4,0, 5,0, 5,25, 5,5, 5,75, 6,0, 6.25, 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75, 8,0, 8,25, 8,5, 8,75, 9,0, 9,25, 9,5 o 10,0. En una realizacion particular, la disolucion o materia prima que comprende fibrinogeno que se hace pasar a traves de la resina de HCIC tiene un pH de aproximadamente 7,0. En ejemplos particulares, la resina de HCIC se equilibra antes de cargar la disolucion o materia prima a un pH de aproximadamente 4,0, 5,0, 5,25, 5,5, 5,75, 6,0, 6,25, 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75, 8,0, 8.25, 8,5, 8,75, 9,0, 9,25, 9,5 o 10,0.

El metodo de la presente invencion tambien puede emplear el uso de mas de una etapa de cromatograffa adicional para eliminar impurezas adicionales, si es necesario, y mejorar asf la pureza de la preparacion final. Pueden implementarse etapas de purificacion cromatografica adicionales o bien antes o bien despues de la purificacion de fibrinogeno a traves de la resina de HCIC segun la presente invencion. Por ejemplo, la disolucion que comprende fibrinogeno que se recupera de la resina de HCIC en la etapa (ii) puede hacerse pasar a traves de otra resina cromatografica.

Las etapas de purificacion cromatografica adicionales pueden emplear otra resina de HCIC. Por tanto, en otro ejemplo, se proporciona un metodo de reduccion del nivel de al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular y otra(s) proteasa(s) en una disolucion que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, factor VIII y factor de von Willebrand (VWF), comprendiendo el metodo:

En un ejemplo, la concentracion del plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) en la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF que se ha recuperado en la etapa (iv) se reduce en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% o en al menos el 95% o en al menos el 98% en comparacion con la materia prima.

En otro ejemplo, se proporciona un metodo de produccion de una disolucion de fibrinogeno Kquida estable, comprendiendo el metodo:

En un ejemplo, la concentracion del plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) en la disolucion que comprende fibrinogeno que se ha recuperado en la etapa (iv) se reduce en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% o en al menos el 95% o en al menos el 98% en comparacion con la materia prima.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, la segunda resina de HCIC es diferente de la primera resina de HCIC. En otro ejemplo dado a conocer en el presente documento, la primera y la segunda resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofobas son iguales. Cuando la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF que se recupera de la resina de HCIC en la etapa (ii) se hace pasar a traves de la misma resina de HCIC, puede ser deseable lavar la resina de HCIC tras la etapa (ii) y antes de hacer pasar la disolucion recuperada a traves de la resina de HCIC en la etapa (iii) de nuevo con el fin de eliminar cualquier impureza que pueda estar unida a la resina.

La resina cromatografica adicional tambien puede ser una resina cromatografica de intercambio anionico. En la cromatograffa de intercambio anionico, las moleculas cargadas negativamente son atrafdas por un soporte solido cargado positivamente. Un soporte solido cargado positivamente puede prepararse mediante cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica e implicara habitualmente el acoplamiento covalente de un ligando funciona cargado negativamente sobre un soporte solido. Los ligandos funcionales cargados negativamente adecuados dependeran invariablemente de la molecula que debe separarse de la disolucion. Ejemplos de resinas de intercambio anionico adecuadas son aquellos que comprenden un grupo amina cuaternaria (Q) y/o un grupo amina terciaria (DEAE) funcional, o un grupo dietilaminopropilo (ANX). Las matrices de cromatograffa de intercambio anionico disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, DEAE-celulosa, Poros™ PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 de Applied Biosystems, MonoQ™, MiniQ™, Source™ 15Q y 30Q, Q, DEAE y ANX Sepharose Fast Flow™, Q Sepharose high Performance™, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ de GE Healthcare, WP PEI™, WP DEAM™, WP QUAT™ de J.T. Baker, Hydrocell™ DEAE y Hydrocell™ QA de Biochrom Labs Inc., UNOsphere™ Q, Macro-Prep™ DEAE y Macro-Prep™ High Q de Biorad, Ceramic HyperD™ Q, ceramic HyperD™ DEAE, Q HyperZ™, Trisacryl™ M y LS™ DEAE, Spherodex™ LS DEAE, QMA Spherosil™ LS, QMA Spherosil™ M de Pall Technologies, DOWEX™ Fine Mesh Strong Base Type I and Type II Anion Matrix y DOWEX™ MONOSPHER E 77, anion de base debil de Dow Liquid Separations, Matrex Cellufine™ A200, A500, Q500 y Q800, de Millipore, Fractogel™ EMD TMAE3 Fractogel™ e Md DEAE y Fractogel™ EMD DMAE de EMD, intercambiadores anionicos debiles y fuertes tipo I y II Amberlite™, intercambiadores anionicos debiles y fuertes tipo I y II DOWEX™, intercambiadores anionicos debiles y fuertes tipo I y II Diaion™, Duolite™ de Sigma-Aldrich, t Sk ™ gel Q y DEAE 5PW y 5PW-HR, Toyopearl™ SuperQ-650S, 650M y 650C3 QAE-- 26 - 550C y 650S, DEAE- 65OM y 650C de Tosoh, y QA52™, DE23™, DE32™, DE51™, DE52™, DE53™, Express-Ion™ D y Express-Ion™ Q de Whatman. Si es deseable, puede usarse una membrana de cromatograffa de intercambio anionico en lugar de una matriz de cromatograffa de intercambio anionico. Las membranas de intercambio anionico disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, Sartobind™ Q de Sartorius, Mustang™ Q de Pall Technologies y membrana Intercept™ Q de Millipore.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, la resina de intercambio anionico es una resina de intercambio anionico fuerte. En otra realizacion dada a conocer en el presente documento, la resina de intercambio anionico fuerte comprende un ligando funcional de amina cuaternaria (por ejemplo, -N+(CH3)3 tal como se ve, por ejemplo, en MacroPrep™-HQ; Bio-Rad Laboratories). En aun otro ejemplo, la resina de intercambio anionico son grupos trimetilamina injertados en un polfmero metacfflico hidroxilado por medio de un grupo de conexion, tal como GigaCap Q-650M®.

En un ejemplo, la cromatograffa de intercambio anionico se realiza en modo positivo con respecto al fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF. Es decir, las condiciones usadas son tales que, cuando la disolucion o materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se hace pasar a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico, el fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se une(n) a los grupos funcionales cargados positivamente acoplados a la resina, permitiendo que impurezas en la disolucion pasen a traves de la resina en la fraccion de flujo a traves (de cafda a traves), cuando pueden desecharse o recuperarse para otros propositos. Una vez que la fraccion de flujo a traves pasa a traves de la resina, la resina de cromatograffa de intercambio anionico puede lavarse con un tampon de lavado adecuado conocido por los expertos en la tecnica. Los constituyentes del tampon de lavado y las condiciones de la etapa de lavado se seleccionaran normalmente para retener el fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF unido a la resina durante la etapa de lavado. El experto en la tecnica tambien reconocera que la referencia a tampon de lavado, tampon de elucion o similar en relacion con cromatograffa puede incluir disoluciones que tienen una capacidad de tamponamiento limitada o ninguna capacidad.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, antes de eluir el fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF de la resina de cromatograffa de intercambio anionico, la resina se lava con una disolucion de lavado que comprende el acido epsilon-aminocaproico (e-ACA). La adicion de £-ACA al tampon de lavado puede promover la elucion de proteasas (tal como plasminogeno) que pueden unirse a la resina de cromatograffa de intercambio anionico durante el primer pase. Un ejemplo de una etapa de lavado adecuada se describe en la patente estadounidense 6.960.463.

Para eluir el fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF que permanece unido a la resina de cromatograffa de intercambio anionico, puede usarse cualquier tampon de elucion adecuado conocido por los expertos en la tecnica. Para la eliminacion de plasminogeno y/o t-PA y/u otra(s) proteasa(s) de una disolucion que comprende fibrinogeno, los presentes inventores han encontrado que un tampon de elucion que comprende NaCl desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 300 mM permite que se eluyan monomeros de fibrinogeno de la resina de intercambio anionico al tiempo que se minimiza la elucion de agregados de fibrinogeno y/u otras protemas (por ejemplo, factor VIII, VWF, fibronectina o proteasas) que tambien pueden estar unidos a la resina. Por tanto, en un ejemplo dado a conocer en el presente documento, el fibrinogeno se eluye de la resina de intercambio anionico con un tampon de elucion que comprende NaCl desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 300 mM. Esto equivale a un tampon de elucion que tiene un intervalo de conductividad de aproximadamente 18 mS/cm (NaCl 150 mM) a aproximadamente 32 mS/cm (NaCl 300 mM).

En otro ejemplo, el fibrinogeno se eluye de la resina de intercambio anionico con un tampon de elucion que comprende NaCl desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 270 mM. Esto equivale a un tampon de elucion que tiene un intervalo de conductividad de aproximadamente 18 mS/cm (NaCl 150 mM) a aproximadamente 29 mS/cm (NaCl 270 mM).

En otro ejemplo, el fibrinogeno se eluye de la resina de intercambio anionico con un tampon de elucion que comprende NaCl desde aproximadamente 170 mM hasta aproximadamente 230 mM. Esto equivale a un tampon de elucion que tiene un intervalo de conductividad de aproximadamente 19 mS/cm (NaCl 170 mM) a aproximadamente 25 mS/cm (NaCl 230 mM).

En otro ejemplo, el fibrinogeno se eluye de la resina de intercambio anionico con un tampon de elucion que comprende NaCl desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 220 mM. Esto equivale a un tampon de elucion que tiene un intervalo de conductividad de aproximadamente 22 mS/cm (NaCl 200 mM) a aproximadamente 24 mS/cm (NaCl 220 mM).

En otro ejemplo, el fibrinogeno se eluye de la resina de intercambio anionico con un tampon de elucion que comprende NaCl desde aproximadamente 190 mM hasta aproximadamente 210 mM.

En otro ejemplo, el fibrinogeno se eluye de la resina de intercambio anionico con un tampon de elucion que comprende NaCl desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 190 mM.

En otro ejemplo, el tampon de elucion tiene una conductividad en el intervalo de 18 a 32 mS/cm; o de 20 a 25 mS/cm; o de 21 a 23,5 mS/cm; o de 22 a 23 mS/cm. En un ejemplo preferido, la conductividad del tampon de elucion es de aproximadamente 22,5 mS/cm.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, el tampon de elucion comprende un aminoacido libre a una concentracion que promueve la elucion de monomero de fibrinogeno sobre agregados del mismo. En otro ejemplo, el tampon de elucion comprende un aminoacido libre a una concentracion de aproximadamente el 0,5 al 10% (p/p). Puede usarse cualquier aminoacido libre adecuado en esta capacidad. En un ejemplo, el aminoacido libre es arginina. En otro ejemplo, el tampon de elucion comprende arginina en el intervalo de aproximadamente el 4 a aproximadamente el 10% (p/p).

En otros ejemplos, el tampon de elucion comprende NaCI 200 mM, arginina al 0,5% (p/p); o NaCI 160 mM, arginina al 1% (p/p).

En un ejemplo, la cromatograffa de intercambio anionico se realiza en modo negativo con respecto al fibrinogeno y modo positivo con respecto a factor VIII y/o VWF. Es decir, las condiciones usadas son tales que, cuando la disolucion o materia prima que comprende fibrinogeno y factor VIII y/o VWF se hace pasar a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico, el factor VIII y/o VWF se une(n) a los grupos funcionales cargados positivamente acoplados a la resina, permitiendo que el fibrinogeno en la disolucion pase a traves de la resina en la fraccion de flujo a traves (de cafda a traves). Una vez que la fraccion de flujo a traves que contiene fibrinogeno pasa a traves de la resina, la resina de cromatograffa de intercambio anionico puede lavarse con un tampon de lavado adecuado conocido por los expertos en la tecnica. Los constituyentes del tampon de lavado y las condiciones de la etapa de lavado se seleccionaran normalmente para retener el factor VIII y/o VWF unido a la resina durante la etapa de lavado.

En un ejemplo, la disolucion o materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se hace pasar a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico en presencia de NaCl de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 270 mM. Esto equivale a un intervalo de conductividad de aproximadamente 18 mS/cm (NaCl 150 mM) a aproximadamente 29 mS/cm (NaCl 270 mM). En estas condiciones, el fibrinogeno, particularmente la forma monomerica, pasa a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico mientras que los agregados que contienen fibrinogeno y otras impurezas, tales como IgG y fibronectina, se unen a la resina. En ejemplos adicionales, la disolucion o materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se hace pasar a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico en presencia de NaCl de aproximadamente 170 mM a aproximadamente 230 mM (de aproximadamente 19 mS/cm a aproximadamente 25 mS/cm) o NaCl de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 220 mM (de aproximadamente 22 mS/cm a aproximadamente 24 mS/cm). En estos tipos de condiciones, se espera que el factor VIII y/o vWF se uniran a la resina de cromatograffa de intercambio anionico. El factor VIII y/o VWF pueden eluirse de la resina de intercambio anionico con un tampon de elucion que comprende al menos 300 mM de una sal, tal como NaCl. En una realizacion particular el factor VIII y/o VWF se eluyen de la resina de intercambio anionico con NaCl aproximadamente 500 mM. Cuando se unen fibrinogeno y factor VIII y/o VWF a la resina de intercambio anionico, la etapa de elucion puede realizarse de modo que el fibrinogeno se eluya inicialmente (por ejemplo, usando las condiciones expuestas anteriormente) y entonces el factor VIII y/o VWF puede eluirse usando una concentracion mayor de sal, tal como NaCl 500 mM.

Cuando se emplea una etapa de cromatograffa de intercambio anionico, puede realizarse o bien antes y/o bien despues de hacer pasar la materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF a traves de la resina de HCIC. En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, el metodo comprende ademas hacer pasar la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF que se ha recuperado en la etapa (ii) a traves de una resina de cromatograffa de intercambio anionico. En otro ejemplo, cuando se emplean etapas de cromatograffa HCIC primera y segunda, tal como se describe en el presente documento, el metodo que comprende ademas hacer pasar la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF que se ha recuperado en la etapa (ii) y/o etapa (iv) a traves de una resina de cromatograffa de intercambio anionico.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, el metodo comprende ademas hacer pasar la materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF a traves de una resina de cromatograffa de intercambio anionico antes de la etapa (i).

Los expertos en la tecnica entenderan que el numero de etapas cromatograficas adicionales usadas segun la presente invencion dependera del nivel de pureza requerido en la preparacion final. Por ejemplo, el metodo de la presente invencion puede comprender 2, 3, 4 o 5 etapas de cromatograffa, tal como se dan a conocer en el presente documento. Por ejemplo, cuando el metodo comprende 2 etapas de cromatograffa, la secuencia de etapas sera HCIC/IEX o HCIC/HCIC o IEX/HCIC; cuando el metodo comprende 3 etapas de cromatograffa, la secuencia de etapas sera HCIC/IEX/HCIC o HCIC/HCIC/IEX o HCIC/HCIC/HCIC o HCIC/IEX/IEX o IEX/HCIC/HCIC o IEX/HCIC/IEX o IEX/IEX/HCIC; cuando el metodo comprende 4 etapas de cromatograffa, la secuencia de etapas sera HCIC/IEX/HCIC/HCIC o HCIC/HCIC/IEX/HCIC o HCIC/HCIC/HCIC/IEX o HCIC/HCIC/HCIC/HCIC o HCIC/IEX/IEX/HCIC o HCIC/IEX/IEX/IEX o HCIC/HCIC/IEX/IEX o HCIC/IEX/HCIC/IEX o IEX/HCIC/IEX/HCIC o IEX/HCIC/HCIC/IEX o IEX/HCIC/HCIC/HCIC o IEX/HCIC/IEX/IEX o IEX/IEX/HCIC/HCIC o IEX/IEX/HCIC/IEX o IEX/IEX/IEX/HCIC; etcetera (donde “IEX” indica cromatograffa de intercambio anionico). El nivel de pureza requerido puede estar dictado por el uso pretendido de la disolucion (por ejemplo, para el tratamiento de un paciente con una deficiencia de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF) y/o cuando se requiere un periodo de almacenamiento mas prolongado como preparacion acuosa.

La cromatograffa puede realizarse usando cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, las etapas de cromatograffa segun la presente invencion pueden usar columnas de flujo axial, tales como las disponibles de GE Healthcare, Pall Corporation y Bio-Rad, o columnas de flujo radial, tales como las disponibles de Proxcys. Las etapas de cromatograffa segun la presente invencion tambien pueden realizarse usando tecnologfas de lecho expandido.

En un ejemplo, la concentracion del plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisulary/u otra(s) proteasa(s) en la disolucion recuperada que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se reduce en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% o en al menos el 95% en comparacion con la materia prima.

Metodos que maximizan la eliminacion de impurezas tales como plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) son particularmente ventajosos, porque se mejora de manera decisiva la estabilidad y eficacia del fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF en disolucion, particularmente durante su almacenamiento a largo plazo. El almacenamiento en forma lfquida es particularmente ventajoso para disoluciones que comprenden fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF porque es posible el uso inmediato en un paciente. Esto esta en contraste con el uso de preparaciones liofilizadas de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF purificado, que requieren la reconstitucion de la(s) protema(s) liofilizada(s) en un tampon adecuado y/o agua para inyeccion inmediatamente antes de la administracion a un sujeto que lo necesita.

Una ventaja de agotar las proteasas o sus zimogenos (tal como plasminogeno) de una disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF es que esto minimiza la necesidad de anadir agentes antifibrinolfticos para inhibir cualquier proteasa y/o zimogeno residual (por ejemplo, plasmina o plasminogeno). Los ejemplos de tales agentes incluyen aprotinina, un inhibidor proteico bovino de plasmina; acido ortranexamico, un inhibidor de plasmina sintetico tambien asociado con efectos secundarios neurotoxicos.

Una caractenstica ventajosa adicional es que el plasminogeno, que se ha separado de la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF mediante HCIC, puede procesarse adicionalmente para producir un concentrado que contiene plasminogeno para, por ejemplo, uso clmico. Por tanto, la HCIC puede usarse para preparar tanto plasminogeno como disoluciones que comprenden fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF a partir de una unica disolucion de partida.

Una caractenstica ventajosa adicional es que los costes de produccion de la resina de HCIC son mucho mas economicos que el coste la resina de lisina-Sepharose™ o de lisina inmovilizada que se usan en procedimientos de cromatograffa por afinidad.

Una caractenstica ventajosa adicional es que la HCIC podna usarse para sustituir las etapas de hidroxido de aluminio (por ejemplo, Alhydrogel™) para la eliminacion de proteasas (por ejemplo, factor II). Alhydrogel™ actualmente se usa ampliamente en la produccion comercial de factor VIII y VWF. Sin embargo, el material es relativamente costoso, usandose normalmente cientos de kg por lote. Ademas, alhydrogel™ a menudo requiere manipulacion manual y el material se desecha tras un unico uso. Por el contrario, las etapas de HCIC pueden ser completamente automatizadas y la resina puede usarse en la fabricacion de multiples lotes.

Otra caractenstica ventajosa es que la resina de HCIC es compatible con NaOH 1 M, que puede usarse para la inactivacion y eliminacion de patogenos, incluyendo virus y priones durante procedimientos de limpieza de columnas y de saneamiento de resinas.

Las preparaciones lfquidas derivadas de los metodos de la presente invencion tambien tienen ventajas con respecto al uso de preparaciones congeladas, que requieren medios de almacenamiento y transporte caros y tienen que descongelarse antes de su uso inmediato. Incluso cuando el fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se almacena como preparacion liofilizada o congelada, resulta ventajoso que la protema reconstituida o descongelada sea estable durante mas tiempo. Esto resulta evidente, por ejemplo, cuando se ha reconstituido material como precaucion para un procedimiento medico, pero su uso no se requena basandose en consideraciones medicas. Este material se desecha normalmente, ya que el fibrinogeno solo es estable a lo largo de un periodo de corto plazo debido a la presencia de protrombina y/o t-PA y/u otra(s) proteasa(s).

En ejemplos particulares, las preparaciones lfquidas que contienen fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se almacenan como preparacion lfquida o liofilizada o congelada.

(ii) eluir el monomero de fibrinogeno de la resina con un tampon de elucion; y

En un ejemplo, la disolucion que comprende fibrinogeno (etapa (i)) se recupera tras hacer pasar una materia prima que comprende fibrinogeno a traves de una resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba en condiciones seleccionadas de modo que el plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) se une a la resina y el fibrinogeno pasa a traves de la resina.

En un ejemplo, la resina de cromatograffa de intercambio ionico se selecciona de una resina cromatografica de intercambio anionico o una resina de cromatograffa de intercambio cationico.

En un ejemplo, la resina de cromatograffa de intercambio anionico es una resina cromatografica de intercambio anionico fuerte o una resina cromatografica de intercambio anionico debil. En un ejemplo, la resina de cromatograffa de intercambio anionico comprende un grupo amino cuaternario. Los ejemplos incluyen alquilamina cuaternaria y alquilalcanolamina cuaternaria, o amina, dietilamina, dietilaminopropilo, amino, trimetilamonioetilo, trimetilbencilo amonio, dimetiletanolbencilamonio y poliamina. En algunas realizaciones, la resina de cromatograffa de intercambio anionico es un soporte polimerico injertado con aminas terciarias o cuaternarias o es un soporte polimerico hidroxilado injertado con aminas terciarias o cuaternarias. En algunas realizaciones, la resina de cromatograffa de intercambio anionico comprende un soporte polimerico de metacrilato. En un ejemplo, la resina de cromatograffa de intercambio anionico es una MacroPrep™ HQ. En otro ejemplo, la resina de cromatograffa de intercambio anionico es una GigaCap™ Q-650M. En otros ejemplos, la resina de cromatograffa de intercambio anionico se empaqueta en una columna.

Si es deseable, puede usarse una membrana de cromatograffa de intercambio anionico en lugar de una resina de cromatograffa de intercambio anionico. Las membranas de cromatograffa de intercambio anionico disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, Sartobind™ Q de Sartorius, Mustang™ Q de Pall Technologies y membrana Intercept™ Q de Millipore.

En un ejemplo, la resina de cromatograffa de intercambio cationico es una resina de cromatograffa de intercambio cationico fuerte o una resina de cromatograffa de intercambio cationico debil.

Las resinas de cromatograffa de intercambio cationico disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, aquellas que tienen un grupo a base de sulfonato (por ejemplo, MonoS, MiniS, Source™ 15S y 30S, SP Sepharose Fast Flow™, SP Sepharose High Performance™ de GE Healthcare, Toyopearl™ SP-650S y SP-650M de Tosoh, Macro-Prep High™ S de BioRad, Ceramic HyperD™ S, Trisacryl™ M y LS™ SP y Spherodex™ LS SP de Pall Technologies,); un grupo a base de sulfoetilo (por ejemplo, Fractogel™ SE de EMD, Poros™ S-10 y S-20 de Applied Biosystems); un grupo a base de sulfopropilo (por ejemplo, TSK™ Gel SP 5PW y SP-5PW-HR de Tosoh, Poros™ HS-20 y HS 50 de Applied Biosystems); un grupo a base de sulfoisobutilo (por ejemplo, Fractogel™ EMD SO3” de EMD); un grupo a base de sulfoxietilo (por ejemplo, SE52, SE53 y Express-Ion S de Whatman), un grupo a base de carboximetilo (por ejemplo, CM Sepharose Fast Flow™ de GE Healthcare, Hydrocell™ CM de Biochrom Labs Inc., Macro-Prep™ CM de BioRad, Ceramic HyperD™ CM, Trisacryl™ M CM, Trisacryl™ LS CM, de Pall Technologies, Matrex Cellufine™ C500 y C200 de Millipore, CM52™, CM32™, CM23™ y Express™ - Ion C de Whatman, Toyopearl™ CM-650S, CM-650M y CM-650C de Tosoh); grupos a base de acido sulfonico y carboxflico (por ejemplo, BAKERBOND™ Carboxy-Sulfon de J.T. Baker); un grupo a base de acido carboxflico (por ejemplo, Wp™ CBX de J.T Baker, DOWEX MAC-3™ de Dow Liquid Separations, Amberlite™ Weak Cation Exchangers, DOWEX™ Weak Cation Exchanger, y Diaion™ Weak Cation Exchangers de Sigma-Aldrich y Fractogel™ EMD COO- de EMD); un grupo a base de acido sulfonico (por ejemplo, Hydrocell™ SP de Biochrom Labs Inc., DOWEX™ Fine Mesh Strong Acid Cation Matrix de Dow Liquid Separations, UNOsphere™ S, WP Sulfonic de J. T. Baker, membrana Sartobind™ S de Sartorius, Amberlite™ Strong Cation Exchangers, DOWEX™ Strong Cation y Diaion Strong Cation Exchanger de Sigma-Aldrich); y un grupo a base de ortofosfato (por ejemplo, Pl 1 de Whatman). Si es deseable, puede usarse una membrana de cromatograffa de intercambio cationico en lugar de una matriz de intercambio cationico, por ejemplo, Sartobind™ S (Sartorius; Edgewood, NY).

En un ejemplo, la disolucion que comprende fibrinogeno tiene un pH en el intervalo de aproximadamente pH 7 a pH 10. En un ejemplo, el pH de la disolucion que comprende fibrinogeno es de aproximadamente pH 8. En algunos ejemplos, la resina de cromatograffa de intercambio anionico se preequilibrara y lavara tras cargar el fibrinogeno con tampon/tampones que tiene(n) un pH similar al de la disolucion que comprende el fibrinogeno.

En un ejemplo, el tampon de elucion tiene una conductividad en el intervalo de desde aproximadamente 18 hasta aproximadamente 30 mS/cm. Por ejemplo, la conductividad del tampon de elucion puede estar en el intervalo de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 mS/cm; o de aproximadamente 19 a aproximadamente 24 mS/cm; o de aproximadamente 20 a aproximadamente 24 mS/cm; o de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 mS/cm. En un ejemplo, la conductividad del tampon de elucion es de aproximadamente 22 mS/cm. En otros ejemplos, el tampon de elucion comprende NaCl. En un ejemplo, el tampon de elucion comprende NaCl a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 180 mM a aproximadamente 230 mM, o de aproximadamente 190 mM a aproximadamente 210 mM. En un ejemplo, la concentracion de NaCl en el tampon de elucion es de aproximadamente 200 mM.

En un ejemplo, el tampon de elucion que comprende el fibrinogeno contiene una concentracion de protema de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/ml. En algunos ejemplos, la concentracion de protema del tampon de elucion que comprende el fibrinogeno esta en el intervalo de desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 mg/ml. En ejemplos particulares, el tampon de elucion que comprende el fibrinogeno es de aproximadamente 6 mg/ml.

En un ejemplo el monomero de fibrinogeno eluido se formula con uno o mas aminoacidos antes de filtrar (etapa (iii)). En un ejemplo, el aminoacido es arginina o glicina o una combinacion de las mismas. En algunos ejemplos, la concentracion del aminoacido en el tampon de elucion que comprende fibrinogeno esta en el intervalo de desde aproximadamente el 0,5 hasta aproximadamente el 10% (p/p). En un ejemplo, la concentracion del aminoacido en el tampon de elucion que comprende fibrinogeno es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 6% (p/p), o de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 6% (p/p) o de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 5% (p/p). En un ejemplo, el tampon de elucion que comprende el fibrinogeno se formula con aproximadamente el 2% o aproximadamente el 3% o aproximadamente el 4% o aproximadamente el 5% (p/p) de arginina.

En un ejemplo, el monomero de fibrinogeno eluido tiene un pH de desde aproximadamente pH 7 hasta aproximadamente pH 9.

En un ejemplo, el filtro de etapa (ii) tiene un tamano de poro en el intervalo de desde aproximadamente 15 nm hasta aproximadamente 35 nm; o desde aproximadamente 15 nm hasta aproximadamente 30 nm; o desde aproximadamente 15 nm hasta aproximadamente 25 nm; o desde aproximadamente 15 nm hasta aproximadamente 20 nm.

La filtracion de virus puede realizarse usando o bien filtracion de flujo tangencial (TFF) o filtracion “terminal” (tambien conocida como filtracion de flujo normal). Los filtros de virus se disenaron originariamente para su uso en TFF con la alimentacion fluyendo adyacente a la capa delgada superior de la membrana asimetrica. La TFF proporciona un alto flujo barriendo la superficie de la membrana para reducir la incrustacion y la polarizacion por concentracion. Sin embargo, la simplicidad y el menor coste de capital de la filtracion terminal ha conducido al uso extendido de filtros de virus disenados espedficamente para filtracion terminal. A diferencia de la TFF, estos filtros terminales se hacen funcionar normalmente con el lado mas abierto de la membrana dirigido hacia la corriente de alimentacion, permitiendo que los agregados de protema y otros incrustantes grandes se capturen dentro de la subestructura macroporosa protegiendo de ese modo la capa delgada de retencion de virus. Las ventajas de usar filtros terminales de un solo uso incluyen que tanto simplifican el diseno como la validacion del sistema, reduciendo los costes de trabajo y de capital.

La filtracion terminal implica normalmente usar una unica bomba para forzar fluido a traves de la membrana desde la superficie.

La filtracion tangencial requiere generalmente una primera bomba para mantener una tasa de flujo constante en la superficie de la membrana de filtro y una segunda bomba extrae la protema a traves de la membrana creando una presion negativa en la parte trasera de la membrana.

En un ejemplo, la filtracion se realiza mediante filtracion terminal.

En un ejemplo, el proceso de filtracion terminal se realiza usando o bien filtracion a presion constante o bien filtracion a velocidad constante. En un ejemplo, el proceso de filtracion terminal se realiza usando filtracion a presion constante.

La filtracion se realiza normalmente con una presion de filtracion que es igual a o esta por debajo del nivel que puede resistir la membrana, dependiendo del material de una membrana de eliminacion de virus para su uso en el presente documento, por ejemplo, con presiones de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3,4 bar. En una realizacion, la presion de filtracion se mantiene entre aproximadamente 0,2 bar y aproximadamente 3,4 bar. En otro ejemplo, la presion de filtracion se mantiene a de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 bar; o a de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 bar; o a de aproximadamente 1,2 a aproximadamente 2 bar. En otro ejemplo, la presion de filtracion se mantiene a de aproximadamente 1,5 bar a aproximadamente 1,9 bar.

La temperatura puede tener un efecto sobre la viscosidad de una disolucion de protema y sobre el flujo tras la filtracion con una membrana de eliminacion de virus. Se entendera por parte de los expertos en la tecnica que la disolucion que debe usarse en la etapa de filtracion debe tener normalmente una temperatura dentro del intervalo de desde aproximadamente 0°C hasta la temperatura a la que se desnaturaliza la protema de interes. La temperatura de la disolucion se encuentra de manera adecuada dentro del intervalo de desde aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 50°C. En una realizacion, la temperatura de la disolucion se encuentra dentro del intervalo de desde aproximadamente 18°C hasta aproximadamente 35°C. En otra realizacion, la disolucion se filtra a temperatura ambiente de desde aproximadamente 18°C hasta aproximadamente 26°C.

En un ejemplo, la capacidad de filtro de virus es de al menos 0,20 kg o al menos 0,50 kg o al menos 0,75 kg o al menos 1,00 kg o al menos 1,25 kg o al menos 1,50 kg o al menos 2 kg de fibrinogeno por m2 de area superficial de filtro.

Opcionalmente, puede realizarse una etapa de prefiltracion o filtracion por clarificacion antes de la filtracion de virus con el fin de eliminar las parffculas de tamano macroscopico. En un ejemplo, se realiza una prefiltracion con un prefiltro que comprende una membrana con un diametro de poro mas grande que el de la membrana de eliminacion de virus. En un ejemplo, el prefiltro es un filtro de membrana que tiene un tamano de poro de aproximadamente 0,1 pm. En otro ejemplo, el prefiltro se selecciona del filtro de membrana Pall Nylon (SKL 7002 NTP 0,1 pm o FTKNI), u otros prefiltros disponibles comercialmente que tienen propiedades similares para la eliminacion de agregados y/o particulados de protema. La prefiltracion puede realizarse o bien en lmea con el filtro de virus o bien fuera de lmea con respecto al filtro de virus. En un ejemplo, la prefiltracion se realiza en lmea con respecto al filtro de virus.

Los expertos en la tecnica conoceran filtros adecuados para el metodo de filtracion de virus segun este aspecto de la invencion. Un ejemplo incluye Planova BioEx™, entre otros. Tales filtros se denominan en ocasiones filtros de eliminacion “de virus pequenos”.

En un ejemplo, la membrana de filtro es una lamina plana o una membrana de fibras huecas. Los ejemplos de membranas de lamina plana incluyen membranas de filtro PVDF hidrofiladas tales como los filtros de eliminacion de virus pequenos Pegasus™ Grade SV4 (Pall Corporation). En un ejemplo, el filtro es el Pegasus™ Grade SV4.

En otros ejemplos, el filtro es una membrana de fibras huecas. Una membrana de fibras huecas puede contener un haz de fibras huecas en forma de pajita conteniendo la pared de cada fibra hueca una estructura de red tridimensional de poros compuestos de huecos interconectados mediante capilares finos. Los ejemplos de filtros de fibras huecas incluyen los filtros Planova™ BioEX™ (Asahi Kasei Corporation) que incorporan poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) modificado hidrofilo en un formato de membrana de fibras huecas. En una realizacion, el filtro es el Planova™ BioEX.

En un ejemplo, se usan dos o mas filtros de virus pequenos en serie. En una realizacion, la filtracion se realiza usando dos filtros en serie que tienen un tamano de poro en el intervalo de desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20 nm. Tales etapas de filtracion tienen el potencial de posibilitar que se fabrique fibrinogeno con al menos LRV 6,9 log LRV para MVM similar a parvovirus.

En otro ejemplo, la disolucion que comprende fibrinogeno se hace pasar a traves de una resina de cromatograffa de intercambio ionico en condiciones seleccionadas de modo que el fibrinogeno presente en la disolucion pasa a traves de la resina. Es decir, la cromatograffa de intercambio ionico se realiza en modo negativo con respecto a fibrinogeno en condiciones tales que, cuando la disolucion se hace pasar a traves de la resina, impurezas tales como agregados de fibrinogeno, plasminogeno y fibronectina presentes en la disolucion se une(n) a los grupos funcionales cargados acoplados a la resina, permitiendo que el fibrinogeno presente en la disolucion, particularmente monomero de fibrinogeno, pase a traves de la resina en la fraccion de flujo a traves (de cafda a traves). Una vez que la fraccion de flujo a traves que contiene fibrinogeno pasa a traves de la resina, la resina de cromatograffa de intercambio ionico puede lavarse con un tampon de lavado adecuado conocido por los expertos en la tecnica. Los constituyentes del tampon de lavado y las condiciones de la etapa de lavado se seleccionaran normalmente para retener las impurezas unidas a la resina durante la etapa de lavado.

En un ejemplo, la disolucion que comprende fibrinogeno se hace pasar a traves de una resina de cromatograffa de intercambio anionico en presencia de NaCl de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 270 mM. Esto equivale a un intervalo de conductividad de aproximadamente 18 mS/cm (NaCl 150 mM) a aproximadamente 29 mS/cm (NaCl 270 mM). En estas condiciones el fibrinogeno, particularmente la forma monomerica, pasa a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico mientras que los agregados que contienen fibrinogeno y otras impurezas tales como plasminogeno y fibronectina se unen a la resina. En ejemplos adicionales, la disolucion que comprende fibrinogeno se hace pasar a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico en presencia de NaCl de aproximadamente 170 mM a aproximadamente 230 mM (de aproximadamente 19 mS/cm a aproximadamente 25 mS/cm) o NaCl de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 220 mM (de aproximadamente 22 mS/cm a aproximadamente 24 mS/cm). En estos tipos de condiciones, se espera que las impurezas se unan a la resina de cromatograffa de intercambio anionico, permitiendo que el fibrinogeno pase a traves de la resina en la fraccion de flujo a traves.

La disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF recuperados mediante los metodos descritos en el presente documento son ventajosas porque proporcionan una preparacion de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF que tiene una mayor estabilidad que las preparaciones liofilizadas existentes, incluso a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso en rutas de transporte largas, en la que puede que las bajas temperaturas, cuando sea apropiado, no esten garantizadas durante todo el transporte y/o almacenamiento. El almacenamiento estable de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF en disolucion tambien facilita, en muchos aspectos, la produccion, la utilizacion, el transporte y la administracion a un paciente que lo necesite. Debido a la estabilidad aumentada del fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF preparados segun los metodos descritos en el presente documento, es posible en muchas preparaciones farmaceuticas prescindir de la adicion de agentes de estabilidad, tales como inhibidores de la fibrinolisis o fibrinogenolisis que pueden, en algunas circunstancias, conducir a efectos secundarios no deseados o que deben evitarse para reducir riesgos potenciales.

El termino “estable”, tal como se usa en el presente documento, significa que hay poca o ninguna perdida sustancial de actividad del fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF tras un periodo de tiempo en almacenamiento en comparacion con el nivel de actividad del fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF antes del almacenamiento (por ejemplo, en comparacion con el nivel de actividad determinado inmediatamente tras la recuperacion de la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF segun los metodos descritos en el presente documento). En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF retiene al menos el 70% de actividad, preferiblemente al menos el 80% de actividad, mas preferiblemente al menos el 90% de actividad, incluso mas preferiblemente al menos el 95% de actividad y lo mas preferiblemente el 100% de actividad tras un periodo de tiempo en almacenamiento a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 30°C. El experto en la tecnica entendera que la actividad de fibrinogeno puede determinarse para la preparacion de fibrinogeno inmediatamente antes del inicio del periodo de almacenamiento y este valor inicial puede usarse para designar el 100% de actividad a partir de la que la actividad de fibrinogeno determinada en diferentes puntos de tiempo durante el periodo de almacenamiento puede compararse y expresarse como porcentaje de este valor inicial.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, el fibrinogeno recuperado mediante los metodos descritos en el presente documento retiene desde aproximadamente el 90% hasta el 100% de actividad tras al menos 4 semanas en almacenamiento de la disolucion a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C, preferiblemente retiene aproximadamente el 90% de actividad tras 4 semanas en almacenamiento de la disolucion a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. En otro ejemplo dado a conocer en el presente documento, el fibrinogeno retiene desde aproximadamente el 60% hasta aproximadamente el 80% de actividad tras al menos 4 semanas en almacenamiento de la disolucion a una temperatura de aproximadamente 30°C, preferiblemente retiene desde aproximadamente el 60% hasta aproximadamente el 70% de actividad tras 5 semanas en almacenamiento de la disolucion a una temperatura de aproximadamente 30°C. El nivel de actividad del fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF puede determinarse mediante cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica. Ejemplos de metodos adecuados para determinar la actividad de fibrinogeno, por ejemplo, se resumen por Mackie et al. (British J. Haematol. 121:396-404, 2003). Metodos particulares incluyen Clauss (Clauss, 1957, Acta-Haematol. 17, 237-246) y/o protema coagulable (Jacobsson K., Scand J Clin Lab Invest 1955;7 (supp 14):1 -54 o Fibrin sealant Ph. Eur. Monograph 903, 2012). Los resultados pueden notificarse como % de protema coagulable; % de protema coagulable inicial, y/o % de actividad de fibrinogeno inicial determinados usando el metodo Clauss o similares.

El experto en la tecnica entendera que es probable que la concentracion del plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) en la disolucion recuperada que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF dicte la longitud de almacenamiento y/o las condiciones de almacenamiento (por ejemplo, temperatura). Por ejemplo, se entendera que una preparacion en la que la concentracion del plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) en la disolucion recuperada se reduce en el 80% en comparacion con la materia prima puede almacenarse durante un periodo de tiempo mas prolongado y/o a temperaturas mas altas sin desestabilizar significativamente la actividad del fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF en comparacion con una preparacion en la que la concentracion del plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) en la disolucion recuperada que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se reduce en solo el 50% en comparacion con la materia prima.

Aunque los metodos de la presente invencion pueden realizarse a escala de laboratorio, pueden escalarse hasta tamano industrial sin cambios significativos en las condiciones. Por tanto, en una realizacion dada a conocer en el presente documento, los metodos de la presente invencion se realizan a escala industrial o comercial. Preferiblemente, los metodos de la invencion son adecuados para la fabricacion a escala comercial de fibrinogeno. Por ejemplo, cuando se usan fracciones de plasma como material de partida en el metodo de la invencion, entonces la fabricacion a escala comercial implicana el uso de una fraccion de plasma derivada de al menos aproximadamente 500 kg de plasma. Mas preferiblemente, la fraccion de plasma de partida se derivara de al menos aproximadamente 5.000 kg, 7.500 kg, 10.000 kg y/o 15.000 kg de plasma por lote. En ejemplos particulares, las disoluciones y formulaciones farmaceuticas que comprenden fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se fabrican a escala comercial a partir de una fraccion de plasma o una materia prima recombinante.

Cuando deba usarse una disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF para aplicaciones clmicas o veterinarias (por ejemplo, para su administracion a un sujeto con deficiencia de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF o para su uso como pegamento de fibrina), los expertos en la tecnica entenderan que puede ser deseable reducir el nivel de contenido de virus activo (tftulo de virus) y otros agentes infecciosos potenciales (por ejemplo, priones) en la disolucion. Esto puede ser deseable particularmente cuando la materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF (es decir, el material de partida) se deriva de plasma sangumeo. Los expertos en la tecnica conoceran metodos de reduccion del tftulo de virus en una disolucion. Los ejemplos incluyen pasteurizacion (por ejemplo, incubando la disolucion a 60°C durante 10 horas en presencia de altas concentraciones de estabilizadores tales como glicina (por ejemplo, 2,75 M) y sacarosa (por ejemplo, al 50%) y/u otras sales o excipientes seleccionados), tratamiento por calor seco, filtracion de virus (hacer pasar la disolucion a traves de un nanofiltro; por ejemplo, punto de corte de 20 nm) y/o sometiendo la disolucion a tratamiento con un detergente o disolvente organico adecuado durante un periodo de tiempo y en condiciones para inactivar el virus en la disolucion. El disolvente/detergente se ha usado durante mas de 20 anos para inactivar virus con envuelta, particularmente en productos derivados de plasma, incluyendo fibrinogeno y factor VIII y/o VWF. Por tanto, puede llevarse a cabo usando diversos reactivos y metodos conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, los documentos US 4540573 y US4764369 que se incorporan por la presente como referencia). Los disolventes adecuados incluyen fosfato de tri-n-butilo (TnBP) y eter, preferiblemente TnBP (normalmente a aproximadamente el 0,3%). Los detergentes adecuados incluyen polisorbato (Tween) 80, polisorbato (Tween) 20 y Triton X-100 (normalmente a aproximadamente el 0,3%). La seleccion de condiciones de tratamiento, incluyendo concentraciones de disolvente y de detergente, depende en parte de las caractensticas de la materia prima, requiriendo generalmente materias primas menos puras concentraciones mas altas de reactivos y mas condiciones de reaccion mas extremas. Un detergente preferido es polisorbato 80 y una combinacion particularmente preferida es polisorbato 80 y TnBP. La materia prima puede agitarse con reactivos de disolvente y detergente a una temperatura y durante un tiempo suficiente para inactivar cualquier virus con envuelta que pueda estar presente. Por ejemplo, el tratamiento con disolvente/detergente puede llevarse a cabo durante aproximadamente 4 horas a 25°C. Los productos qmmicos de disolvente/detergente se eliminan posteriormente mediante, por ejemplo, adsorcion sobre medios cromatograficos tal como resinas hidrofobas C-18 o eluyendolas en la fraccion de cafda a traves de resinas de intercambio ionico en condiciones que adsorben la protema de interes.

La etapa de inactivacion de virus puede realizarse en cualquier fase de los metodos dados a conocer en el presente documento. En un ejemplo, la materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se somete a una etapa de inactivacion viral antes de la etapa (i). En otra realizacion, la disolucion que comprende fibrinogeno que se recupera de la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba (es decir, de las etapas (ii) y/o (iv)) se somete a una etapa de inactivacion viral. En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, la etapa de inactivacion viral comprende pasteurizacion o tratamiento con un detergente y disolvente organico. En otro ejemplo dado a conocer en el presente documento, la etapa de inactivacion de virus comprende filtracion de virus. Cuando se usa filtracion de virus, los inventores han encontrado que la adicion de un aminoacido libre (por ejemplo, arginina) antes de la etapa de filtracion puede mejorar significativamente la tasa de flujo y la recuperacion de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF a traves del filtro. Un ejemplo de tal metodo se describe en el documento US7919592.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, la materia prima o disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se somete a una etapa de inactivacion viral antes de hacerla pasar a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico. La ventaja de emplear una etapa de inactivacion de virus tal como tratamiento con disolvente/detergente antes de hacer pasar la disolucion o materia prima tratada a traves de una resina de cromatograffa de intercambio anionico es que la resina de intercambio anionico permite la eliminacion del detergente y disolvente organico de la disolucion tratada utilizando condiciones que promueven la union del fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF a la resina y la eliminacion del detergente y disolvente organico con la fraccion de flujo a traves (de cafda a traves).

La pasteurizacion puede generar agregados de protema y polfmeros, particularmente en una disolucion que comprende fibrinogeno (tambien denominada en el presente documento “disolucion de fibrinogeno”). Por tanto, puede ser deseable en algunos casos reducir el nivel de agregados/polfmeros en una disolucion pasteurizada. Esto puede conseguirse mediante cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica, aunque convenientemente puede conseguirse mediante una purificacion cromatografica adicional. En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, la disolucion o materia prima pasteurizada se hace pasar a traves de una resina de cromatograffa de intercambio anionico en modo positivo con respecto al fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF de modo que se elimina cualquier agregado o polfmero con la fraccion de flujo a traves (de cafda a traves).

El termino “materia prima” se usa en el presente documento para designar cualquier disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF. La materia prima tambien puede comprender otras protemas (por ejemplo, protemas terapeuticas) conocidas por los expertos en la tecnica. Los ejemplos incluyen protemas implicadas en la cascada de coagulacion sangumea. En una realizacion dada a conocer en el presente documento, la materia prima comprende fibrinogeno.

Los expertos en la tecnica conoceran una materia prima adecuada que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF. Los ejemplos incluyen plasma o fracciones de plasma tales como crioprecipitado de plasma solubilizado o pasta de fraccion I solubilizada derivada de plasma humano o animal o una fraccion de plasma, fracciones de cultivo celular de tecnologfa recombinante, fracciones derivadas de leche de animales transgenicos, etc. Fuentes de protemas de fibrinogeno recombinantes tambien son adecuadas para su uso como materia prima segun la presente invencion. Cuando la materia prima es plasma o una fraccion de plasma, pueden ser o bien donaciones de plasma combinadas o bien puede ser de un donante individual. En una realizacion dada a conocer en el presente documento, la materia prima que comprende fibrinogeno es un crioprecipitado de plasma solubilizado. Este componente, o bien derivado de sangre completa o bien recogido por medio de aferesis, se prepara mediante la descongelacion controlada de plasma recien congelado entre 1-6°C y la recuperacion del precipitado. El precipitado insoluble en fno vuelve a congelarse. Una unidad de aferesis de crioprecipitado es equivalente aproximadamente a 2 unidades de crioprecipitado derivado de sangre completa. Contiene la mayor parte del fibrinogeno, factor VIII y VWF junto con otras protemas tales como factor XIII y fibronectina de plasma recien congelado. Una fuente alternativa de fibrinogeno es el precipitado de fraccion I que puede prepararse a partir de plasma congelado descongelando y eliminando el crioprecipitado mediante o bien centrifugacion o bien filtracion. El criosobrenadante resultante se mezcla entonces con etanol para precipitar la fraccion I. Por ejemplo, puede obtenerse un precipitado de fraccion I anadiendo etanol aproximadamente al 8% (v/v) a pH 7,2 y controlando la temperatura hasta aproximadamente -3°C (Cohn, et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 62: 459-475). En una realizacion, la materia prima que comprende fibrinogeno es crioprecipitado.

La referencia en la memoria descriptiva a “proteasa(s)” puede ser a cualquier proteasa y/o su zimogeno presente en la materia prima o disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF que, cuando se expone a una resina de HCIC, puede unirse a resina de HCIC en condiciones en las que el fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF pasa a traves de la resina. Las proteasas pueden ser de cualquier tipo, incluyendo serina proteasas (por ejemplo, plasmina, trombina, tripsina), treonina proteasas, cistema proteasas (por ejemplo, catepsina B y catepsina H), aspartato proteasas (por ejemplo, pepsina), metaloproteasas (por ejemplo, colagenasas y gelatinasas) y proteasas glutamicas. Cuando la materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se deriva de plasma humano o animal, las proteasas/zimogenos pueden incluir plasminogeno, activador de plasminogeno tisular (tPA), trombina, elastasa, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor XIa, factor XIIa, factor XIIIa, calicremas plasmaticas y similares. Con respecto a las disoluciones que comprenden fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF, una proteasa/zimogeno preferida particular que debe eliminarse es plasminogeno. Otras proteasas/zimogenos preferidos que deben eliminarse de una disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF son t-PA, protrombina y/o trombina activa (factor II/IIa). Cuando la materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF se deriva de sobrenadante de cultivo celular, la proteasa/zimogeno puede incluir cualquier proteasa de celula huesped, tal como serina proteasas (por ejemplo, caseinasas), metaloproteasas (por ejemplo, gelatinasas, metaloproteasas de matriz (MMP), incluyendo MMP3, MMP10 o MMP12), proteasas asparticas (catepsina D), proteasas acidas entre otras.

En algunos casos, puede ser deseable eliminar o reducir el nivel de impurezas de la materia prima antes de hacer pasar la materia prima a traves de una resina de HCIC en la etapa (i). Eliminar o reducir el nivel de impurezas de la materia prima puede reducir la carga sobre la resina de HCIC durante la purificacion cromatografica y mejorar asf la eficiencia de separacion de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) de la materia prima. Las impurezas pueden eliminarse o reducirse, por ejemplo, precipitando fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF a partir de la materia prima y recuperando la(s) protema(s) precipitada(s). Los expertos en la tecnica conoceran metodos adecuados de precipitacion de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF a partir de una materia prima que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF. Un ejemplo incluye anadir suspension de hidroxido de aluminio a la materia prima, que es particularmente util para eliminar protemas dependientes de la vitamina K (por ejemplo, los factores de coagulacion II, VII, IX, y X) y otras protemas que tienen afinidad de union por el hidroxido de aluminio, tal como protrombina (factor II) y t-PA, de plasma o crioprecipitado de plasma.

Por tanto, en un ejemplo dado a conocer en el presente documento, antes de la etapa (i), las protemas dependientes de la vitamina K se eliminan o se reducen de la materia prima. En un ejemplo adicional, las protemas dependientes de la vitamina K se eliminan o se reducen mediante la adicion de hidroxido de aluminio a la materia prima. El hidroxido de aluminio puede estar en forma de Alhydrogel®, anadido a la materia prima hasta una concentracion final de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 80% p/p. En algunos ejemplos, el hidroxido de aluminio se anade a la materia prima hasta una concentracion final en el intervalo de desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 50% (p/p). En otros ejemplos, el hidroxido de aluminio se anade a la materia prima hasta una concentracion final en el intervalo de desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 30% (p/p). En ejemplos preferidos, la concentracion es de desde aproximadamente el 15% hasta aproximadamente el 30% (p/p). Lo mas preferiblemente, el hidroxido de aluminio se anade a la materia prima a de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 25% (p/p) para una recuperacion de fibrinogeno optima y una eliminacion de impurezas tales como protrombina. En otro ejemplo, las protemas dependientes de la vitamina K se eliminan de la materia prima mediante adsorcion por lotes usando hidroxido de aluminio.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF que se recuperado mediante el metodo descrito en el presente documento. En un ejemplo, el nivel de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) en la disolucion sera de menos del 20% de la protema total, preferiblemente menos del 10% de la protema total y mas preferiblemente menos del 5% de la protema total, o menos del 1% de la protema total o menos del 0,1% de la protema total o menos del 0,01% de la protema total o menos del 0,001% de la protema total o menos del 0,0001% de la protema total. El experto en la tecnica entendera que el nivel de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) que esta presente en la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF puede depender del uso pretendido de la disolucion o la duracion de almacenamiento. Por ejemplo, cuando la disolucion debe almacenarse durante al menos 4 semanas a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 8°C, puede ser aceptable que la disolucion comprenda mas de aproximadamente el 10% de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) (de la protema total). Cuando la disolucion debe almacenarse durante al menos 4 semanas a una temperatura de aproximadamente 30°C, puede ser deseable que la disolucion comprenda menos de aproximadamente el 10% de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s) (de la protema total).

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, se proporciona una disolucion que comprende fibrinogeno recuperado mediante el metodo descrito en el presente documento. En otro ejemplo, la disolucion comprende al menos el 80% de la protema total de fibrinogeno.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende:

(a) al menos el 75% de la protema total de fibrinogeno;

(c) menos de 1 pg/mg de la protema total de plasminogeno.

En un ejemplo, la disolucion comprende ademas menos de 1,5 x 10-5 U/mg de la protema total de factor II.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende:

(a) al menos el 90% de la protema total de fibrinogeno;

(c) menos de 150 ng/mg de la protema total de plasminogeno.

En un ejemplo, la disolucion comprende ademas:

(a) menos de 3,5 x 10-6 U/mg de la protema total de factor II; y/o

(b) menos de 150 pg/mg de la protema total de fibronectina.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende:

(a) al menos el 90% de la protema total de fibrinogeno;

(c) menos de 10 ng/mg de la protema total de plasminogeno.

En otro ejemplo, se proporciona una disolucion que comprende:

(a) al menos el 90% de la protema total de fibrinogeno;

(c) menos de 10 ng/mg de la protema total de plasminogeno.

En un ejemplo, la disolucion comprende ademas:

(a) menos de 2,7 x 10-6 U/mg de la protema total de factor II; y/o

(b) menos de 15 pg/mg de la protema total de fibronectina.

La concentracion del fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF en la disolucion recuperada mediante los metodos dados a conocer en el presente documento y la concentracion de impurezas (por ejemplo, plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s)) pueden medirse mediante cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica. Ejemplos de ensayos adecuados para medir fibrinogeno se describen por Mackie et al. (Br J Haematol. mayo de 2003;121(3):396-404). La HPLC de exclusion por tamano tambien puede usarse para medir la concentracion de fibrinogeno y/o factor VIII o una impureza en la disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII (por ejemplo, Cardinali et al. 2010, Arch. Biochem. Biphys. 493(2):157-168; y Kosloski et al. 2009, AAPS J.

11(3); 424-431). La HPLC tambien permite que el experto en la tecnica discrimine entre monomeros y agregados de fibrinogeno. Ademas, la concentracion de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF puede diferir dependiendo de la sensibilidad del ensayo que se usa. Por ejemplo, la concentracion de fibrinogeno en una disolucion medida usando el ensayo Clauss puede ser ligeramente menor que la concentracion medida en la misma disolucion mediante HPLC.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, la concentracion de fibrinogeno monomerico en la disolucion es de al menos el 75%, al menos el 80%, al menos 85%, al menos el 90% o al menos el 95% de la protema total medida mediante HPLC de exclusion por tamano.

En otro ejemplo, se proporciona una formulacion farmaceutica que comprende una disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF recuperados mediante los metodos dados a conocer en el presente documento, y un portador farmaceuticamente aceptable. Los expertos en la tecnica conoceran portadores farmaceuticamente aceptables adecuados, incluyendo diluyentes y/o excipientes farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos incluyen disolventes, medios de dispersion, agentes antifungicos y antibacterianos, tensioactivos, agentes isotonicos y de absorcion y similares.

La formulacion farmaceutica tambien puede formularse mediante la adicion de una combinacion de estabilizadores adecuados, por ejemplo, un aminoacido, un carbohidrato, una sal y un detergente. En ejemplos particulares, el estabilizador comprende una mezcla de un alcohol de azucar y un aminoacido. El estabilizador puede comprender una mezcla de un azucar (por ejemplo, sacarosa o trehalosa), un alcohol de azucar (por ejemplo, manitol o sorbitol), y un aminoacido (por ejemplo, prolina, glicina y arginina). En un ejemplo preferido, la formulacion comprende un aminoacido tal como arginina. En otros ejemplos, la formulacion comprende iones de metal divalente en una concentracion de hasta 100 mM y un agente complejante descrito en el documento US7045601. Los ejemplos particulares incluyen las formulaciones 1 a 7 descritas en el ejemplo 1 del documento US7045601. En ejemplos particulares, la formulacion se formula sin la adicion de ningun agente antifibrinolftico o protema estabilizante tal como albumina. En ejemplos en los que la formulacion comprende fibrinogeno, el pH es preferiblemente de aproximadamente 6,5 a 7,5 y la osmolalidad es de al menos 240 mOsmol/kg.

La formulacion farmaceutica tambien puede esterilizarse mediante filtracion antes de la dispensacion y el almacenamiento a largo plazo. Preferiblemente, la formulacion retendra sustancialmente sus caractensticas de estabilidad originales durante al menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36 o mas meses. Por ejemplo, las formulaciones almacenadas a 2-8°C o 25°C pueden normalmente retener sustancialmente la misma distribucion de tamano molecular medida mediante HPLC-SEC cuando se almacena durante 6 meses o mas. Ejemplos particulares de la formulacion farmaceutica pueden ser estables y adecuados para el uso farmaceutico comercial durante al menos 6 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 36 meses o incluso mas cuando se almacena a 2-8°C y/o temperatura ambiente.

Las disoluciones y formulaciones farmaceuticas, tal como se describen en el presente documento, pueden formularse en una de muchas formas de dosificacion posibles, tales como formulaciones inyectables. Las formulaciones y su administracion (dosificacion) posterior estan dentro del conocimiento de los expertos en la tecnica. La dosificacion depende de la respuesta del sujeto al tratamiento, pero durara invariablemente tanto como se requiera el efecto deseable (por ejemplo, una vuelta a niveles en plasma normales de fibrinogeno). Los expertos habituales en la tecnica pueden determinar facilmente dosificaciones optimas, metodologfas de dosificacion y tasas de repeticion.

En un ejemplo dado a conocer en el presente documento, la formulacion farmaceutica tiene un volumen de al menos 5 ml y comprende al menos 5 mg/ml de fibrinogeno. En otro ejemplo, la formulacion farmaceutica tiene un volumen de al menos 5 ml y comprende al menos 20 mg/ml de fibrinogeno. En realizaciones particulares, la formulacion farmaceutica tiene un volumen de al menos 5 ml y comprende fibrinogeno a una concentracion de aproximadamente 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml o 100 mg/ml. En otro ejemplo, se proporciona un recipiente que contiene al menos 5 ml de una disolucion de fibrinogeno farmaceuticamente aceptable, siendo la concentracion de fibrinogeno de al menos 20 mg/ml.

En otro ejemplo, se proporciona un metodo de tratamiento o de prevencion de un estado asociado con deficiencia de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF, comprendiendo el metodo administrar a un sujeto que lo necesita una disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF recuperado mediante el metodo, tal como se da a conocer en el presente documento, o la formulacion farmaceutica, tal como se da a conocer en el presente documento.

En otro ejemplo, se proporciona el uso de una disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF recuperado mediante el metodo, tal como se da a conocer en el presente documento, en la fabricacion de un medicamento para tratar o prevenir un estado asociado con deficiencia de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF. Los expertos en la tecnica estaran familiarizados con los tipos de estados asociados con deficiencia de fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF. En un ejemplo, el estado de fibrinogeno se selecciona del grupo que consiste en afibrinogenemia, hipofibrinogenemia y disfibrinogenemia. En un ejemplo, el estado de factor VIII y/o VWF se selecciona del grupo que consiste en hemofilia A, trastornos hemorragicos (por ejemplo, funcion plaquetaria defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand), lesion vascular, sangrado a partir de traumatismo o cirugfa, sangrado debido a terapia anticoagulante, sangrado debido a enfermedad hepatica.

Otros estados que pueden tratarse con una disolucion que comprende fibrinogeno y/o factor VIII y/o VWF recuperado mediante los metodos, tal como se da a conocer en el presente documento, incluyen heridas importantes y hemorragias y quemaduras graves. En casos de hipofibrinogenemia y afibrinogenemia, una disolucion que comprende fibrinogeno preparada mediante los metodos descritos en el presente documento puede inyectarse por v^a intravenosa en el paciente que lo necesite con el fin de compensar el estado de deficiencia de fibrinogeno y el experto en la tecnica puede determinar las dosificaciones basandose en el grado de deficiencia.

Una disolucion que comprende fibrinogeno recuperado mediante los metodos dados a conocer en el presente documento tambien tiene ventajas en el uso de pegamento de fibrinas (tambien conocido como sellantes de fibrina) debido a la ausencia de niveles desestabilizantes de plasminogeno y/o activador de plasminogeno tisular y/u otra(s) proteasa(s). El tPA convierte el plasminogeno en su forma activa plasmina, que a su vez digiere el coagulo de fibrina y reduce asf la formacion de coagulos tras la aplicacion topica (por ejemplo, para hemostasia).

Los pegamentos de fibrina comprenden normalmente dos componentes: (i) fibrinogeno (frecuentemente junto con factor XIII y un inhibidor de fibrinolisis tal como aprotinina), y (ii) trombina (frecuentemente junto con iones calcio). Los dos componentes se reconstituyen con el fin de preparar el pegamento listo para su uso. El pegamento de fibrina se usa en aplicaciones clmicas y veterinarias para simular la ultima etapa de coagulacion a traves de la formacion de fibras de fibrina ligadas en cruz usando una combinacion de fibrinogeno con trombina en presencia de calcio y factor XIII. El pegamento de fibrina tiene diversas aplicaciones en la medicina clmica y veterinaria, incluyendo hemostasia, cierre de heridas, profilaxis de adhesion y curacion de heridas. El pegamento de fibrina tambien puede usarse para cerrar heridas cutaneas (incluyendo trasplante de piel), para sellar suturas y para unir tejidos conjuntivos, tales como hueso, carftlago y tendones. Por tanto, en otro ejemplo dado a conocer en el presente documento, se proporciona un pegamento de fibrina que comprende la disolucion que comprende fibrinogeno recuperado mediante los metodos, tal como se da a conocer en el presente documento.

Los expertos en la tecnica apreciaran que la invencion descrita en el presente documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas a las descritas espedficamente. Debe entenderse que la invencion incluye todas de tales variaciones y modificaciones que se encuentren dentro del espmtu y el alcance. La invencion tambien incluye todas las etapas, caractensticas, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o indicados en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera de dos o mas de dichas etapas o caractensticas.

Ahora se describiran determinadas realizaciones de la invencion con referencia a los siguientes ejemplos que estan previstos solo con el proposito de ilustracion y no pretenden limitar el alcance de la generalidad descrita anteriormente en el presente documento.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Purificacion de fibrinogeno a traves de resina de cromatografta por induccion de carga hidrofoba (HCIC) HEA, PPA y MEP

Se uso crioprecipitado de plasma combinado humano como material de partida (es decir, material prima que contiene fibrinogeno). Brevemente, el crioprecipitado de plasma combinado se solubilizo en un tampon de extraccion que contema citrato de trisodio 20 mM, acido epsilon-aminocaproico (e-ACA) 200 mM, 60 IU/ml de heparina y NaCl 500 mM (pH 7,2 ± 2) a 31 ± 2°C durante 30 minutos (1 g crioprecipitado por 4 g de tampon). Entonces se anadio hidroxido de aluminio al 2% (p/p) al crioprecipitado solubilizado a una concentracion del 25% (p/p), tras lo cual se elimino el gel de hidroxido de aluminio mediante o bien centrifugacion o bien filtracion profunda y se recupero el sobrenadante que contema fibrinogeno para purificacion cromatografica adicional a traves de una resina de cromatografta HCIC.

El sobrenadante que contema fibrinogeno se aplico a columnas de cromatografta que se habfan empaquetado con 1,8 ml de resina o bien HEA, PPA o bien MEP Hypercel™. Las columnas de cromatografta se preequilibraron en Tris 25 mM a un pH diferente, que oscilaba entre 6,5 y 8,5. El sobrenadante que contema fibrinogeno se cargo en la columna de cromatografta a una razon de aproximadamente 11 ml/ml de resina. La purificacion mediante HCIC se realizo en modo negativo con respecto a fibrinogeno, en la que se permitio que el fibrinogeno cayera a traves en la fraccion de flujo a traves no unida, mientras que la mayona de t-PA, plasminogeno y factor II permanecio unida a la resina.

Las Figuras 1 a 3 muestran la recuperacion por etapas de fibrinogeno, plasminogeno, t-PA y factor II tras la purificacion cromatografica usando h Ea Hypercel™, PPA Hypercel™ y MEP Hypercel™. Los resultados muestran que el pH tiene poco o ningun efecto sobre la union de plasminogeno a estas resinas, mientras que la union de t-PA a las resinas parece ser lo mas efectiva en el intervalo de pH inferior. La columna HEA Hypercel™ mostro la mayor recuperacion de fibrinogeno en la fraccion de cafda a traves y el intervalo de pH operativo sometido a prueba pareda tener poco efecto sobre la recuperacion de fibrinogeno en comparacion con la observada para columnas tanto PPA como MEP Hypercel™. Las columnas tanto PPA como MEP mostraron la mayor recuperacion de fibrinogeno en la fraccion de cafda a traves a pH 8,5.

Ejemplo 2 - Nivel de impurezas en una disolucion de fibrinogeno reducida a traves de HEA Hypercel Se aplicaron aproximadamente 48,5 ml de crioprecipitado solubilizado que contema fibrinogeno preparado segun el ejemplo 1 sobre una columna HEA Hypercel™ de 5 ml que se habfa preequilibrado en Tris 25 mM a pH o bien 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 o bien 8,5. Se realizo la purificacion por HCIC en modo negativo con respecto a fibrinogeno, en el que se permitio que el fibrinogeno cayera a traves en la fraccion de flujo a traves no unida, mientras que el t-PA, plasminogeno y factor II permanecieron unidos a la resina. La Figura 4a muestra la recuperacion por etapas de fibrinogeno, plasminogeno, t-PA y factor II durante la purificacion postcromatografica usando HEA Hypercel™. Los resultados muestran que el pH tema poco o ningun efecto sobre la union de plasminogeno y factor II a la resina de HCIC, mientras que la union de t-PA a la resina parecfa ser lo mas efectiva al intervalo de pH inferior de 6,5-7,0. La recuperacion de fibrinogeno era mayor del 90% en la fraccion de cafda a traves en condiciones de pH diferentes a pesar de no realizar ningun lavado de columna. Tal como se muestra en la Figura 4a, estos resultados demuestran la eliminacion efectiva de proteasas en una materia prima que contiene fibrinogeno crudo, tal como crioprecipitado solubilizado, mediante la resina de HCIC. Por ejemplo, la condicion experimental realizada a pH 7,0 demostro una reduccion de > 99,9% para factor II, del 88,3% para t-PA y de > 98,2% para plasminogeno a partir de la disolucion de crioprecipitado solubilizado.

El fibrinogeno permanecio estable en disolucion durante al menos 6 dfas a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C). Los resultados se presentan en las Figuras 4b y 4c.

Ejemplo 3 - Nivel de impurezas en una disolucion de fibrinogeno purificada a traves de HEA Hypercel Se cargaron aproximadamente 500 ml del sobrenadante que contema fibrinogeno obtenido tras la etapa de adsorcion de alhydrogel™ generada segun el ejemplo 1 en una columna XK 16/30 empaquetada con 36 ml de resina HEA Hypercel™, preequilibrada en Tris 25 mM pH 7,0. La fraccion de cafda a traves se recogio para someter a prueba el fibrinogeno, plasminogeno, t-PA y factor II. Se proporciona un resumen de los resultados en la tabla 1 a continuacion.

Tabla 1

Ejemplo 4 - El efecto de la precipitacion de glicina sobre el nivel de impurezas en una disolucion de fibrinogeno purificada a traves de HEA Hypercel

Se sometio el sobrenadante que contema fibrinogeno tras la etapa de adsorcion de alhydrogel generada segun el ejemplo 1 a una etapa de precipitacion adicional anadiendo una solucion salina que comprendfa glicina 2,4 M, NaCl 2,7 M, CaCl22,1 mM y citrato de trisodio 23 mM (pH 6,6-7,3). El precipitado solubilizado se calento hasta 30°C antes de anadirse al tampon de glicina, que tambien se incubo hasta 30°C, a una razon de producto con respecto a tampon de 1:2. Se permitio que la mezcla se agitase durante 10 minutos y se recupero el precipitado resultante de la fase lfquida mediante centrifugacion. La fase lfquida, que contema predominantemente fibronectina e IgG, se desecho y se recogio el precipitado que contema fibrinogeno y se resuspendio en un tampon de solubilizacion que contema NaCl 100 mM, CaCl21,1 mM, citrato de trisodio 10 mM, Tris-(hidroximetilmetilamina) 10 mM y sacarosa 4,5 mM (pH 7,0). Se clarifico el producto intermedio de fibrinogeno solubilizado (250 ml) usando un filtro de 1 pm antes de hacerse pasar a traves de una columna XK 16/30 empaquetada con 36 ml de resina HEA Hypercel™ preequilibrada en Tris 25 mM pH 7,0. La fraccion de cafda a traves se recogio para someter a prueba el fibrinogeno, plasminogeno, t-PA y factor II y se proporciona un resumen de los resultados en la tabla 2 a continuacion.

Los resultados demuestran que la union de plasminogeno, t-PA y factor II a la resina HEA Hypercel™ era mas efectiva en estas condiciones de procesamiento en comparacion con la observada en las condiciones descritas en el ejemplo 2. Los resultados de caracterizacion muestran una recuperacion por etapas de aproximadamente el 93% para fibrinogeno, del 6% para plasminogeno, del 12% para t-PA y del 5% para factor II.

Tabla 2

Ejemplo 5 - Preparacion de fibrinogeno purificado a partir de crioprecipitado de plasma

Etapa de proceso 1 - solubilizacion de crioprecipitado de plasma;

Etapa de proceso 2 - adsorcion de Alhydrogel™ (hidroxido de aluminio) (concentracion de Alhydrogel™: objetivo del 15 al 20% p/p, oscilando entre el 10 y el 50% p/p) de crioprecipitado de plasma solubilizado y recuperacion de sobrenadante que contema fibrinogeno usando metodos tales como centrifugacion o filtracion profunda en presencia de una ayuda de filtro. Alternativamente, esta etapa puede sustituirse por o bien una etapa de cromatograffa HCIC en modo negativo (cafda a traves) con respecto a fibrinogeno o bien una combinacion de cromatograffa de HCIC y de intercambio anionico ambas en modo negativo con respecto al fibrinogeno. Si se usan cromatograffa tanto HClC como de intercambio anionico en combinacion, entonces la etapa de proceso 3 es opcional;

Etapa de proceso 3 - precipitacion de glicina de fibrinogeno a partir del sobrenadante que contema fibrinogeno de la etapa 2. Alternativamente, esta etapa puede sustituirse por una cromatograffa de intercambio anionico en modo negativo con respecto al fibrinogeno;

Etapa de proceso 4 - hacer pasar el precipitado de glicina solubilizado de la etapa 3 a traves de una resina de cromatograffa HCIC en modo negativo con respecto a fibrinogeno;

Etapa de proceso 5 - tratar la disolucion de fibrinogeno purificada recuperada en la etapa 4 con disolvente o detergente o pasteurizacion para inactivar patogenos;

Etapa de proceso 6 - hacer pasar la disolucion tratada de la etapa 5 a traves de una resina de cromatograffa de intercambio anionico en modo positivo con respecto a fibrinogeno, lavar las protemas unidas debilmente de la resina y eluir el fibrinogeno de la resina;

Etapa de proceso 7 - someter el fibrinogeno eluido de la resina de intercambio anionico en la etapa 6 a nanofiltracion (35 nm o 20 nm o una combinacion de 35/20 nm); y

Etapa de proceso 8 - someter el fibrinogeno filtrado de la etapa 7 a ultrafiltracion (filtros de membrana de 50, 100, 200 y 300 kDa).

Ejemplo 6 - Preparacion de fibrinogeno purificado mediante la combinacion de HCIC y cromatograffa de intercambio anionico

Se completaron tres experimentos a escala de laboratorio en los que se prepararon aproximadamente 100 g de crioprecipitado segun las etapas descritas en los ejemplos 1 a 3 hasta la etapa de cromatograffa de modo mixto usando una columna HEA Hypercel™.

La fraccion de cafda a traves de la columna HEA Hypercel™, que contema predominantemente fibrinogeno, se sometio a un tratamiento con disolvente/detergente durante la noche para la inactivacion de virus.

La disolucion inactivada para los virus se diluyo entonces hasta < 10 mS/cm usando Tris 25 mM (pH 8,0) antes de cargarse en una columna de intercambio anionico (XK 50/30, GE Healthcare), empaquetada con aproximadamente 412 ml de resina MacroPrep™-HQ que se habfa preequilibrado con Tris 25 mM (pH 8,0). Se desecho la fraccion de flujo a traves y se lavo la columna MacroPrep™-HQ con 4 volumenes de columna de un tampon de lavado que contema NaCl 90 mM, Tris 50 mM, EACA 20 mM (pH 8,0). En estas condiciones cromatograficas, la fraccion de flujo a traves inicial y las fracciones de lavado conteman predominantemente plasminogeno y t-PA, mientras que el fibrinogeno permaneda unido a la resina cromatografica. La forma monomerica de fibrinogeno se eluyo selectivamente de la columna MacroPrep™-HQ usando un tampon de elucion que comprendfa NaCl 200 mM, Tris 10 mM, citrato de trisodio 10 mM, sacarosa 46 mM y CaCl21,1 mM (pH 7,0), dejando agregados de fibrinogeno y protemas de bajo peso molecular unidas a la resina MacroPrep™-HQ.

Los productos intermedios de producto generados a partir del crioprecipitado solubilizado hasta el eluato de cromatograffa MacroPrep™-HQ se caracterizaron para los niveles de fibrinogeno, t-PA, plasminogeno, fibronectina y factor II y las recuperaciones de etapa de proceso para cada una de estas protemas en las diversas fases de proceso. Los resultados se muestran en la tabla 3, que representan un valor medio de tres lotes de consistencia a escala de laboratorio independientes. La recuperacion de proceso global para fibrinogeno y protemas purificadas conjuntamente partiendo del crioprecipitado de plasma hasta el eluato MacroPrep™-HQ se muestra en la Figura 5. La pureza de fibrinogeno que se recupero de la resina cromatografica MacroPrep™-HQ era mayor del 95%, tal como se revelo mediante cromatograffa HPLC de exclusion por tamano analttica. Un representante del perfil de HPLC de fibrinogeno analizado en TSKGel™ G4000SWXL (Tosoh Corporation) se muestra en la Figura 6. Tal como se muestra en la Figura 6, el monomero de fibrinogeno se eluye a un tiempo de retencion de aproximadamente 17,4 minutos y contribuyo al 96,6% del area pico total, mientras que el dfmero de fibrinogeno y/u otras protemas de alto peso molecular se eluyen a un tiempo de retencion de aproximadamente 14,8 minutos.

Se fabricaron lotes de fibrinogeno adicionales a escala piloto (81 kg de equivalente de plasma) siguiendo el proceso descrito en los ejemplos 5 y 6. Las caractensticas de las preparaciones de fibrinogeno se proporcionan en la tabla 4.

Ejemplo 7 - Filtracion de virus de fibrinogeno purificado

Se examino la capacidad de filtracion a traves de un filtro de virus de 20 nm para preparaciones de fibrinogeno obtenidas siguiendo el metodo del ejemplo 6, siendo la etapa de elucion MacroPrep™-HQ usada o bien NaCl 190 mM (21,5mS/cm), NaCl 200 mM (22,5 mS/cm), NaCl 2 l0 mM (23,5 mS/cm) o un tampon NaCl 200 mM que contema el 1% (p/p) de arginina (25 mS/cm).

El metodo implicaba formular las preparaciones con el 3% (p/p) de arginina a un pH de aproximadamente 7,5 (la concentracion de protema de las muestras era de aproximadamente 6 g/l). Las preparaciones formuladas se filtraron entonces usando un filtro de 0,1 pm antes de la etapa de filtracion de virus. La etapa de filtracion de virus se llevo a cabo usando un filtro Pall SV4™ de 47 mm en modo terminal usando una presion constante de 1,8 bar. Los resultados indican que las preparaciones de fibrinogeno obtenidas de la columna MacroPrep™ HQ usando o bien 190 mM, 200 mM o bien 210 mM dieron como resultado caractensticas de filtracion similares. Por el contrario, la preparacion de fibrinogeno eluida de la columna MacroPrep™ HQ usando tampon NaCl 200 mM que contema el 1% (p/p) de arginina ensucio rapidamente el filtro (Figura 7).

Ejemplo 8 - Estudio de estabilidad

La disolucion de fibrinogeno purificada recuperada mediante el metodo descrito en el ejemplo 5 antes se sometio a filtracion esteril y a un estudio de estabilidad a lo largo de un periodo de 9/7 semanas a 2°-8°C o 30°C. La preparacion de fibrinogeno lfquido puesta a 2°-8°C retuvo desde aproximadamente el 90% de su actividad original medida mediante el metodo Clauss tras el periodo de almacenamiento de 9 semanas. La preparacion de fibrinogeno lfquido puesta a 30°C retuvo aproximadamente el 70% de su actividad original tras el periodo de almacenamiento de 2 semanas y no perdio mas actividad durante al menos 5 semanas. Una reduccion adicional en la actividad hasta menos del 60% se observo en la semana 7 de incubacion a 30°C. La perdida de actividad de fibrinogeno a 30°C puede atribuirse probablemente a la desnaturalizacion termica, en vez de a una degradacion proteolftica, ya que la adicion de un inhibidor de proteasa (C1 esterasa) no inhibfa la perdida de actividad de fibrinogeno a lo largo del periodo de almacenamiento de 5 semanas. Se proporciona un resumen de los datos de estabilidad en la Figura 8.

Tabla 3

Tabla 4

Ejemplo 9 - Reduccion de los niveles de proteasa en plasma en una disolucion que contiene factor VIII y/o VWF usando HEA Hypercel

Este ejemplo demuestra que la etapa de cromatograffa HCIC tambien puede emplearse para reducir las proteasas en preparaciones que contienen factor VIII y/o VWF. El metodo implicaba clarificar la disolucion que contema fibrinogeno obtenida del ejemplo 4 usando un filtro profundo antes de hacer pasar entonces la disolucion clarificada a traves de una segunda resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba (HCIC). La etapa de HCIC se hizo funcionar en condiciones para permitir que proteasas tales como plasminogeno se uniesen a la resina, mientras que el factor VIII y VWF podfan pasar a traves de la resina. En particular, se empaqueto una columna XK 50/30 con 340 ml de resina HEA Hypercel™. La columna se preequilibro en Tris 50 mM pH 6,7. La disolucion de fibrinogeno clarificada preparada segun el ejemplo 4 se cargo entonces en la columna y se lavo la columna con Tris 50 mM pH 6,7. Se recogio la fraccion de cafda a traves y se determinaron los niveles de factor VIII, VWF, plasminogeno y t-PA (VWF:RCo = factor de von Willebrand-cofactor de ristocetina). Se proporciona un resumen de los resultados promedio obtenidos de 4 pases individuals en la tabla 5. Los resultados indican que la etapa de cromatograffa HCIC elimino de manera efectiva proteasas tales como plasminogeno y tPA de la fraccion que comprend^a el factor VIII y VWF. Ademas se observaron buenas recuperaciones de factor VIII y VWF.

Tabla 5

Ejemplo 10 - Estudio comparativo de fibrinogeno purificado a partir de diferentes metodos

La preparacion de fibrinogeno fabricada segun el metodo descrito en el ejemplo 6 se comparo con preparaciones de fibrinogeno fabricadas mediante los metodos descritos en los documentos WO2001048016, WO2012038410 y WO2013135684.

(a) Preparacion de fibrinogeno fabricada mediante una realizacion preferida de los metodos descritos en el documento WO2001048016.

Brevemente, el metodo implicaba suspender pasta de la fraccion I en tampon de extraccion (NaCl 0,8 M, EACA (acido epsilon-aminocaproico) 5 mM, citrato de Na 20 mM, 60 IU/ml de heparina, pH 7,3) (1 g de fraccion I con respecto a 8,33 g de tampon de extraccion). La disolucion se mezclo entonces a 37°C durante 1,5 horas antes de anadir 50 g de una disolucion de Al(OH)3 (Alhydrogel) al 2% por gramo de fraccion I (10,8%). Se agito la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente y entonces se centrifugo a 5000 g durante 10 minutos desechandose el sedimento. Al sobrenadante tratado con Alhydrogel se le anadio un tampon de glicina/NaCl (glicina 2,1 M, citrato de Na 20 mM, NaCl 3,6 M y CaCl2 2,4mM) (ambas disoluciones se preequilibraron hasta 30°C). La adicion del sobrenadante al tampon se completo en aproximadamente 4,5 minutos (1 parte de sobrenadante con respecto a 2,05 partes de tampon). Entonces se agito la mezcla durante 20 minutos a 30°C antes de centrifugarse durante 10 minutos a 5010 g (se desecho el sobrenadante). Entonces volvio a solubilizarse el precipitado en tampon D (NaCl 100 mM, CaCl2 1,1 mM, citrato de Na 10 mM, tris 10 mM, sacarosa 45 mM, pH 6,9) a temperatura ambiente mezclando durante 2 horas (1/3 del volumen del usado para resuspender la fraccion I) (ejemplo 1, secciones 1.1.1 1.1.6, documento WO0148016). La disolucion que contema fibrinogeno resolubilizada se cargo entonces en una columna MacroPrep™ HQ (XK26 con una altura de lecho de 20 cm). La columna se preequilibro con al menos 1,5 volumenes de columna (CV) de tampon MQ (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EACA 20 mM, pH 8,0 a 10 ml/min (113cm/h). Se continuo el equilibrado hasta que la conductividad tras la columna era del 90-110% del tampon preparado. Entonces se cargo la disolucion de fibrinogeno en la columna y se lavo la columna con 6 CV de tampon MQ. El fibrinogeno se eluyo como un unico pico usando tampon ME (NaCl 500 mM, CaCl2 1,1 mM, citrato de Na 10 mM, Tris 10 mM y sacarosa 45 mM, pH 7,0). La columna puede regenerarse usando 2CV de NaCl 1 M (ejemplo 2, documento WO2001048016).

(b) Preparacion de fibrinogeno fabricada mediante una realizacion preferida de los metodos descritos anteriormente en los documentos WO2012038410 y WO2013135684.

El crioprecipitado, producido a partir de plasma mediante los metodos establecidos, se reconstituyo o solubilizo a aproximadamente pH neutro, se sometio a adsorcion con Al(OH)3 y el gel resultante se elimino mediante centrifugacion. El sobrenadante se inactivo entonces para virus mediante tratamiento con disolvente/detergente (S/D). Los compuestos de S/D, Triton y TnBP se extrajeron con aceite vegetal y la fase acuosa se puso en contacto con Fractogel® EMD-TMAE. Se emplearon condiciones cromatograficas (valor de pH de 6,9-7,1 y una osmolalidad de 570-610 mosmol/1) en las que el fibrinogeno no se uma al gel y por tanto se encontraba en el flujo a traves o sobrenadante. La disolucion de fibrinogeno no unido se agito durante aproximadamente 90 minutos tras la adicion de glicina (concentracion final de 1 mol/l y pH=7,4) en presencia de EDT^a20 mM para precipitar el fibrinogeno. El precipitado que contema fibrinogeno se separo entonces mediante centrifugacion, produciendo una pasta de fibrinogeno intermedia. La pasta de fibrinogeno intermedia se resuspendio en tampon Tris 20 mM (pH= aproximadamente 8,0). La suspension obtenida se filtro y se sometio entonces a ultra/diafiltracion. La disolucion que contema fibrinogeno resultante se cargo entonces en GigaCap Q-650M® y el gel o la resina cromatografica se preequilibro con el mismo tampon Tris usado para la resuspension antes de aplicar la disolucion de fibrinogeno. Las sustancias unidas de manera holgada se lavaron con el tampon de equilibrado seguido de lavado con un tampon de lavado (citrato de sodio 1,5 g /1, cloruro de sodio 6,0 g/1, ajustado a aproximadamente pH=7,0 y una conductividad de aproximadamente 12,0 mS/cm). Entones se eluyo el fibrinogeno de la columna cromatografica con un tampon de elucion (citrato de sodio 1,5 g/1 y glicina 10,0 g/1, ajustado al mismo pH que el tampon de lavado y ajustado con NaCI aproximadamente 7,0 g/1 a la conductividad de 13,1-15 mS/cm.).

Las disoluciones que conteman fibrinogeno obtenidas de los metodos descritos en los documentos WO2001048016, WO2012038410 y WO2013135684 se sometieron a prueba para determinar los niveles de protema total (biuret), fibronectina y plasminogeno. Ademas, se pusieron muestras en el ensayo de estabilidad a 2-8°C y 30°C.

Se proporciona una comparacion de las propiedades de las preparaciones de fibrinogeno en la tabla 6. Los resultados del estudio indican que el fibrinogeno fabricado a partir de los metodos descritos en el presente documento contiene niveles menores de plasminogeno en comparacion con los otros metodos.

Tabla 6

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un metodo de reduccion del nivel de al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular en una disolucion que comprende al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, comprendiendo el metodo:

(i) hacer pasar una materia prima que comprende fibrinogeno a traves de una resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba en condiciones seleccionadas de modo que al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular presente en la materia prima se une a la resina; y (ii) recuperar una disolucion que comprende el fibrinogeno que pasa a traves de la resina, reduciendose la concentracion de la al menos una protema seleccionada del grupo que consiste en plasminogeno, activador de plasminogeno tisular en la disolucion en al menos el 50% en comparacion con la materia prima;

equilibrandose la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba a un pH de desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,5 antes de hacer pasar la materia prima y/o la disolucion que comprende el fibrinogeno a traves de la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba.

2. - El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas hacer pasar la disolucion que comprende el fibrinogeno recuperada en la etapa (ii) a traves de una resina de cromatograffa de intercambio anionico.

3. - El metodo segun la reivindicacion 2, en el que la disolucion que comprende el fibrinogeno se hace pasar a traves de la resina de cromatograffa de intercambio anionico en presencia de NaCl aproximadamente 150 mM a aproximadamente 270 mM.

4. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que el fibrinogeno se eluye de la resina de cromatograffa de intercambio anionico con un tampon de elucion que comprende NaCl desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 300 mM.

5. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la materia prima se somete a una etapa de inactivacion viral antes de la etapa (i).

6. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la disolucion que comprende el fibrinogeno recuperado de la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba se somete a una etapa de inactivacion viral.

7. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la materia prima es un crioprecipitado de plasma solubilizado.

8. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que, antes de la etapa (i), se eliminan o se reducen de la materia prima protemas dependientes de la vitamina K.

9. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la materia prima o disolucion que comprende el fibrinogeno, que se hace pasar a traves de la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba tiene un pH de desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,5.

10. - El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la resina de cromatograffa por induccion de carga hidrofoba comprende un ligando seleccionado del grupo que consiste en mercaptoetilpiridina, nhexilamina y fenilpropilamina.