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ES2709491T3 - Mejora de procedimientos de fermentación y subproductos - Google Patents

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ES2709491T3
ES2709491T3 ES11815437T ES11815437T ES2709491T3 ES 2709491 T3 ES2709491 T3 ES 2709491T3 ES 11815437 T ES11815437 T ES 11815437T ES 11815437 T ES11815437 T ES 11815437T ES 2709491 T3 ES2709491 T3 ES 2709491T3
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ES
Spain
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fermentation
beta
glucanase
ethanol
xylanase
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English (en)
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Klaudija Milos
Steffen Köhler
Christian Elend
Léonie Degener
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Direvo Industrial Biotechnology GmbH
BASF Enzymes LLC
Original Assignee
Direvo Industrial Biotechnology GmbH
BASF Enzymes LLC
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Abstract

Un método para mejorar la calidad nutricional de subproductos o residuos derivados de material que contiene almidón en un procedimiento para producir etanol, que comprende las etapas de: i) someter el mosto fermentado después de la fermentación a una composición de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa y una xilanasa, ii) separar el producto de fermentación deseado por destilación.

Description

DESCRIPCION
Mejora de procedimientos de fermentacion y subproductos
Campo de la invencion
La presente descripcion se refiere a un procedimiento mejorado de produccion de un producto de fermentacion, en particular etanol. La presente descripcion se refiere tambien al uso de enzimas para mejorar la calidad de subproductos en los procedimientos de produccion fermentativos y a composiciones que comprenden enzimas capaces de degradar componentes en el mosto fermentado en el procedimiento de fermentacion.
Antecedentes de la invencion
Los productos de fermentacion, tales como el etanol, se producen primero por degradacion del material que contiene almidon en azucares fermentables por licuefaccion y sacarificacion y despues conversion de los azucares directa o indirectamente en el producto de fermentacion deseado usando un organismo fermentador. Los productos de fermentacion lfquidos tales como el etanol se recuperan del mosto fermentado (denominado a menudo "macerado" o "mosto macerado"), p. ej., por destilacion, que separa el producto de fermentacion deseado de otros lfquidos y/o solidos. La fraccion que queda, denominada "vinaza entera", se deshidrata y se separa en una fase solida y una fase lfquida, p. ej., por centrifugacion. La fase solida se denomina "torta humeda" (o "granos humedos" o "WDG") y la fase lfquida (lfquido sobrenadante) se denomina "vinaza fina". La torta humeda deshidratada se seca para proporcionar los "granos secos de destilena" (DDG) usados como nutrientes en piensos animales. La vinaza fina tipicamente se evapora para proporcionar el condensado y jarabe (o "vinaza densa") o alternativamente se puede recircular directamente al tanque de suspension como "vinaza reciclada". El condensado se puede enviar a un metanizador antes de descargarlo o se puede recircular al tanque de suspension. El jarabe que consiste principalmente en dextrinas lfmite y azucares no fermentables, se puede mezclar en los DDG o anadir a la torta humeda antes de secado para producir los DDGS (granos secos de destilena con solubles).
Se conoce el uso comercial de diferentes subproductos y residuos derivados de los procedimientos de fermentacion como el procedimiento de produccion de etanol. Se sabe que los residuos o subproductos de destilenas, asf como los subproductos de cereales y otros de fabricacion de la industria alimentaria, tienen un cierto valor como fuentes de protemas y energfa para piensos animales. Ademas, el aceite de los subproductos como los DDGS se puede recuperar como un subproducto separado para usar en la produccion de biodiesel o se buscan otros productos biorrenovables.
Los subproductos como DDG, DDGS o WDG comprenden protemas, fibras, grasa y almidon no convertido. Por ejemplo, los DDGS contienen tfpicamente aproximadamente 30% de protema. Aunque el contenido de protemas es alto, la composicion de aminoacidos no es adecuada para animales monogastricos si se usa como pienso animal. En general, el procesamiento de los DDGS, en especial tiempo y temperatura de secado afectan a la disponibilidad y digestibilidad de los aminoacidos, en especial la lisina.
Ademas, los subproductos son principalmente subproductos fibrosos que comprenden fibra bruta (CF), que son hidratos de carbono estructurales que consisten en celulosa, hemicelulosa y materiales indigeribles como la lignina. Los hidratos de carbono estructurales no son digestibles en el intestino delgado de los animales. Las fibras se caracterizan y analizan por diferentes metodos, y se pueden dividir en fibra bruta (CF), fibra detergente neutro (NDF) y fibra detergente acido (ADF). La proporcion de celulosa y lignina en la fraccion de fibra bruta tambien determina la digestibilidad de la fibra bruta o su solubilidad en el intestino. Concentraciones altas en celulosa y lignina significa digestibilidad reducida y viceversa. Las hemicelulosas son capaces de unir agua. La parte soluble de las fibras, los polisacaridos no amilaceos solubles (NSP), no pueden ser digeridos por animales monogastricos como cerdos y aves de corral, pero aumentan la viscosidad debido a su capacidad para unir agua, y son una restriccion nutricional, puesto que pueden producir heces humedas, pegajosas y suciedad humeda. El efecto antinutricional de los NSP solubles esta relacionado principalmente con el aumento de la viscosidad de la digesta. La mayor viscosidad ralentiza la velocidad de paso del pienso y dificulta la absorcion intestinal de nutrientes y puede conducir a una menor absorcion de pienso. El aumento de viscosidad a) dificulta la absorcion intestinal de nutrientes y puede dar como resultado un efecto negativo en la consistencia de las heces e incluso smtomas de diarrea, b) ralentiza la velocidad de paso del pienso y posiblemente disminuye la ingesta de pienso. Otro efecto de los NSP es la llamada "encapsulacion de nutrientes". Los NSP en la pared celular de las plantas encapsulaban almidon, protemas, aceite y otros nutrientes dentro de la celula de la planta, lo cual es una barrera impermeable que previene el uso completo de los nutrientes dentro de la celula.
Ademas, los NSP solubles son responsables de altas viscosidades durante la fermentacion e influyen directamente en las condiciones de separacion y secado de los subproductos de fermentacion como los DDGS en el procedimiento de produccion. El agua unida o encapsulada en el producto es diffcil de eliminar y causa el uso de temperaturas de secado mas altas y tambien tiempo de secado mas prolongado, afectando de forma adversa a la calidad de productos sensibles a la temperatura como los aminoacidos. La disponibilidad y digestibilidad de aminoacidos esenciales en los subproductos disminuyen por las altas temperaturas y el tiempo de secado largo durante la produccion. Los ejemplos de NSP son arabinoxilanos, beta-glucanos, galactomananos y alfagalactosidos.
Puesto que los subproductos se usan en piensos animales para animales monogastricos como cerdos y aves de corral, es importante que los subproductos tengan concentraciones altas de protema con una buena composicion de aminoacidos y alta disponibilidad y bajo contenido en fibras solubles.
Por lo tanto, las dos formas para mejorar una planta de produccion fermentativa para aumentar su eficacia y rentabilidad, son un procedimiento de produccion mejorado y la mejora de la calidad de los subproductos.
En la tecnica anterior, se describen muchos procedimientos espedficos o metodos de tratamiento para mejorar procedimientos de produccion fermentativos.
Por ejemplo, el documento WO 2007/056321 A1 describe un metodo de deshidratacion de la vinaza entera que comprende anadir enzimas a la vinaza entera en la produccion de etanol para mejorar la separacion de solidolfquido en el procedimiento.
El documento WO 02/38786 describe un procedimiento de produccion de etanol, por el cual se usan enzimas para adelgazar el mosto de granos enteros licuado y la vinaza fina. Las enzimas se aplican al mosto licuado antes de empezar la fermentacion, asf como a la vinaza fina despues de centrifugacion de la vinaza entera.
El documento US 2006/0275882 A1 describe un procedimiento para producir un producto de fermentacion en donde la viscosidad del mosto se reduce por aplicacion de enzimas antes o durante la fermentacion.
El documento US 2006/0233864 A1 describe un metodo para mejorar la calidad nutricional de los subproductos fibrosos para un procedimiento de fabricacion de alimento, en donde se inocula en los subproductos fibrosos como los DDGS un hongo filamentoso para mejorar la calidad del subproducto.
Algunas plantas de etanol usan milo, trigo o cebada en el procedimiento de fermentacion, dependiendo de la localizacion geografica y la epoca del ano. Como resultado, la composicion de nutrientes puede variar entre las fuentes de DDGS. Debido a la fermentacion casi completa del almidon, el resto de los aminoacidos, grasa, minerales y vitaminas aumentan aproximadamente tres veces en concentracion en comparacion con los niveles encontrados en el mafz. A pesar del aumento significativo en protema bruta, se debe abordar el mal equilibrio de aminoacidos de los DDGS cuando se formulan dietas para cerdos y aves de corral.
Por lo tanto, un objeto de la presente descripcion es proporcionar metodos mejorados para mejorar la calidad de los subproductos de los procedimientos de fermentacion. Se necesitan ademas metodos para mejorar mas la eficacia del procedimiento por deshidratacion de la vinaza y proporcionar metodos mejorados para aumentar la cantidad de aceite recuperable.
Resumen de la descripcion
La presente descripcion se refiere a metodos para la mejora de la calidad de los subproductos o residuos derivados de material que contiene almidon en un procedimiento para producir etanol, que comprenden las etapas de: i) someter el mosto fermentado despues de la fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa y una xilanasa, ii) separar el producto de fermentacion deseado por destilacion. La presente invencion esta definida solo por las reivindicaciones. Las expresiones "realizaciones" y "aspectos de la invencion", etc. como se mencionan mas adelante, tienen solo fines ilustrativos.
La presente descripcion se refiere tambien a metodos de produccion de etanol a partir de material que contiene almidon, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
i) Convertir el material que contiene almidon en azucares fermentables
ii) Fermentar los azucares fermentables con un microorganismo al mosto fermentado
iii) Someter el mosto fermentado despues del procedimiento de fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa y una xilanasa, o una beta-1,3-glucanasa, una xilanasa y una 1,6-betaglucanasa
iv) Separacion del etanol en el mosto fermentado por destilacion
La presente descripcion tambien se refiere a usos de una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa y/o una xilanasa, para mejorar la calidad nutricional de los subproductos o residuos derivados del mosto fermentado en un procedimiento de produccion fermentativo.
La presente descripcion se refiere a un procedimiento de fermentacion de un material que contiene almidon en un producto de fermentacion, que comprende una etapa de fermentacion sin la presencia de una beta-1,3-glucanasa y/o una xilanasa. Despues de la fermentacion, se anade una composicion de enzimas al mosto fermentado para mejorar los subproductos como subproductos fibrosos tales como granos gastados de destilena, granos secos de destilena, soluble seco de destilena, granos secos de destilena con solubles, granos humedos, y sus mezclas. Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra de forma esquematica un procedimiento de produccion de etanol.
La figura 2 muestra de forma esquematica un procedimiento de etanol que incluye tanque de fermentacion en el sitio para la produccion de enzimas basada en WDG.
La figura 3 muestra de forma esquematica un procedimiento de etanol que incluye tanque de fermentacion en el sitio para la produccion de enzimas basada en vinaza entera.
La figura 4 es un diagrama que muestra la reduccion de ADF y NDF en los DDGS usando 1,3-p-glucanasa.
La figura 5 es un diagrama que muestra la reduccion de ADF y NDF en los DDGS usando xilanasa.
La figura 6 es un diagrama que muestra la reduccion de ADF y NDF en los DDGS usando una composicion de enzimas que comprende 1,3-p-glucanasa y xilanasa.
La figura 7 es un diagrama que muestra la reduccion de ADF y NDF en los DDGS usando una composicion de enzimas que comprende 1,3-p-glucanasa y xilanasa y una pectinasa o una proteasa.
La figura 8 muestra una imagen de vinaza fina de macerado no tratado con enzimas, de modo que no se puede mostrar separacion de aceite.
La figura 9 muestra una imagen de vinaza fina de macerado tratado con enzimas, de modo que se muestra una clara separacion del aceite que se forma en una capa de aceite espesa.
La figura 10 es un diagrama que muestra la ganancia de peso de codornices alimentadas con diferente pienso. La figura 11 es un diagrama que muestra la eficacia de deshidratacion de un procedimiento basado en enzimas de acuerdo con la presente descripcion, usando una composicion de enzimas que comprende 1,3-p-glucanasa y xilanasa.
La figura 12 es un diagrama que muestra un ensayo de digestibilidad in vitro de DDGS producidos usando una composicion de enzimas que comprende 1,3-p-glucanasa y xilanasa en un procedimiento de acuerdo con la presente descripcion.
La figura 13 es un diagrama que muestra la mejor disponibilidad de protemas de los DDGS producidos usando una composicion de enzimas que comprende 1,3-p-glucanasa y xilanasa en un procedimiento de acuerdo con la presente descripcion.
Descripcion de la invencion
El objeto de la presente invencion es proporcionar procedimientos de produccion fermentativos mejorados debido a una mejor eficacia del procedimiento y a proporcionar subproductos del procedimiento de fermentacion con una calidad mejorada.
Un aspecto de la presente descripcion se refiere a metodos para mejorar la calidad de subproductos o residuos derivados de material que contiene almidon en procedimientos para la produccion de productos de fermentacion, que comprenden las etapas de: i) someter el mosto fermentado despues de la fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una enzima o una mezcla de enzimas capaz de degradar uno o mas componentes del mosto fermentado, ii) separar el producto de fermentacion deseado.
Los subproductos o residuos del procedimiento de fermentacion incluyen grano de destilena, granos de coccion, granos secos de destilena, solubles secos de destilena, granos secos de destilena con solubles, WDG y/o residuos de la industria de procesamiento de cereales, o sus mezclas. Por ejemplo, los DDGS son el residuo seco que queda despues de que la fraccion de almidon del mafz sea fermentada con levaduras y enzimas seleccionadas para producir etanol y dioxido de carbono. Despues de completarse la fermentacion, el alcohol se separa por destilacion y los residuos de fermentacion que quedan se secan.
La vinaza es el producto que queda despues de que el mosto se haya convertido en azucar, fermentado y destilado el etanol. La vinaza se puede separar en dos fracciones, tal como por centrifugacion o cribado: (1) torta humeda (fase solida), y (2) la vinaza fina (lfquido sobrenadante). La fraccion solida o grano humedo de destilena (DWG) se puede prensar para separar el exceso de humedad y despues secar para producir los granos secos de destilena (DDG). Despues de separar el etanol de la fraccion lfquida, el lfquido que queda se puede evaporar para concentrar el material soluble en los solubles de destilena (DS) condensados o secar y triturar para crear los solubles secos de destilena (DDS). Los DDS a menudo se mezclan con los DDG para formar los granos secos de destilena con solubles (DDGS). Los DDG, DDGS y DWG se denominan colectivamente grano(s) de destilena.
En una realizacion de la presente descripcion, las enzimas se anadieron durante y/o preferiblemente despues de la fermentacion en el procedimiento de produccion al mosto fermentado y antes de la etapa de separacion como destilacion, donde se separa el principal producto de fermentacion deseado del resto del mosto fermentado. Las enzimas de acuerdo con la presente descripcion eran capaces de degradar componentes en el mosto fermentado (macerado o mosto macerado) lo que mejora la calidad de los subproductos o residuos como granos de coccion, granos secos de destilena, solubles secos de destilena, granos secos de destilena con solubles, WDG y/o residuos de la industria de procesamiento de cereales, o sus mezclas. Los componentes del mosto fermentado pueden ser paredes celulares, paredes celulares de microorganismos fermentadores, microorganismos, fibras, etc.
Sorprendentemente, la degradacion de los propios microorganismos fermentadores por adicion de la composicion de enzimas de acuerdo con la presente descripcion, en particular usando la beta-1,3-glucanasa y/o la beta-1,6-glucanasa, en particular en combinacion con una xilanasa y/o una mananasa, da como resultado un aumento del contenido nutricional en el mosto macerado lo cual produce una mejora de la calidad nutricional como el contenido de protemas de los subproductos, asf como la reduccion de NPS que resultan de la pared celular del organismo fermentadortal como la pared celular de levaduras.
Por lo tanto, en realizaciones ventajosas, las composiciones de enzimas usadas en los metodos de acuerdo con la presente descripcion son capaces de degradar los componentes de la pared celular de los organismos fermentadores despues de la etapa de fermentacion, asf como las fibras en el macerado.
En un aspecto de la presente descripcion, la calidad de los subproductos de un procedimiento de produccion fermentativo como DDG, DDGS o WDG, se puede mejorar con los metodos de acuerdo con la presente descripcion, reduciendo el contenido de fibra de los subproductos.
Otro aspecto de la presente descripcion es una mejor deshidratacion de la vinaza entera del procedimiento de produccion fermentativo para mejorar las condiciones de secado de los subproductos.
Otro aspecto mas de la presente descripcion es la evaporacion de agua mejorada de la vinaza fina para mejorar la produccion y composicion de la vinaza densa o jarabe.
En otro aspecto de la presente descripcion, aumenta la cantidad de aceite recuperable. Los DDGS despues de un procedimiento de produccion de etanol a partir de mafz, contienen tfpicamente aproximadamente 13% de aceite, 31% de protemas y 56% de hidratos de carbono y otros componentes. La eliminacion de parte del aceite de los DDGS mejorara la calidad de los DDGS para el mercado del pienso, ya que muchos productores de pienso prefieren menos aceite y grasa en los DDGS para hacer pienso de mejor calidad.
El metodo de la invencion se puede usar en macerado derivado de la produccion de cualquier producto de fermentacion adecuado. La materia prima para producir el producto de fermentacion puede ser cualquier material que contiene almidon y/o azucar, preferiblemente material vegetal que contiene almidon y/o azucar, que incluyen: azucar de cana, tuberculos, rames, grano entero; y cualquier combinacion de los mismos.
El material que contiene almidon se puede obtener de cereales. El material que contiene almidon adecuado incluye grano de mafz (mafz), trigo, cebada, mandioca, sorgo, centeno, triticale, patata o cualquier combinacion. El mafz es la materia prima preferida, en especial cuando el producto de fermentacion es etanol. El material que contiene almidon tambien puede consistir o comprender, p. ej., una corriente lateral del procesamiento de almidon, p. ej., corrientes de procedimiento que contienen hidratos de carbono C6 que pueden no ser adecuados para la produccion de jarabes. Los componentes del macerado incluyen fibra, cascara, germen, aceite y componentes proteicos de la materia prima que contiene almidon, asf como almidon no fermentado, levaduras, paredes celulares de levaduras y residuos. La produccion de un producto de fermentacion se divide tfpicamente en las siguientes etapas del procedimiento principales: a) reducir el tamano de partmulas del material que contiene almidon, p. ej., por molienda seca o humeda; b) cocer el material que contiene almidon en una suspension acuosa para gelatinizar el almidon, c) licuar el material que contiene almidon gelatinizado con el fin de romper el almidon (por hidrolisis) en maltodextrinas (dextrinas); c) sacarificar las maltodextrinas (dextrinas) para producir azucares de bajo peso molecular (p. ej., DP1-2) que pueden ser metabolizados por un organismo fermentador; e) fermentar el material sacarificado usando un organismo fermentador adecuado convirtiendo directa o indirectamente los azucares de bajo peso molecular en el producto de fermentacion deseado; f) recuperar el producto de fermentacion, p. ej., por destilacion con el fin de separar el producto de fermentacion del mosto de fermentacion.
Como se ha mencionado antes, el macerado (o mosto fermentado) es el producto de fermentacion que consiste en etanol, otros lfquidos y solidos de un producto de fermentacion deseado. De acuerdo con la invencion el producto de fermentacion puede ser cualquier producto de fermentacion, incluyendo alcoholes (p. ej., etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol); acidos organicos (p. ej., acido dtrico, acido acetico, acido itaconico, acido lactico, acido gluconico, gluconato, acido succmico, acido 2,5-diceto-D-gluconico); cetonas (p. ej., acetona); aminoacidos (p. ej., acido glutamico); gases (p. ej., H2 y CO2), y compuestos mas complejos, que incluyen, por ejemplo, antibioticos (p. ej., penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (p. ej., riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. La fermentacion tambien se usa habitualmente en la produccion de alcohol consumible (p. ej., licores, cerveza y vino), productos lacteos (p. ej., en la produccion de yogur y queso), cuero e industrias del tabaco. En una realizacion preferida, el producto de fermentacion es un Ifquido, preferiblemente un alcohol, en especial etanol. El macerado contemplado de acuerdo con la invencion puede ser el producto resultante de un procedimiento de produccion del producto de fermentacion que incluye las etapas mencionadas antes a) a f). Sin embargo, el macerado tambien puede ser el producto resultante de otros procedimientos de produccion de productos de fermentacion basados en material de partida que contiene almidon y/o lignocelulosa.
El organismo fermentador puede ser un organismo fungico, tal como levaduras o bacterias. Las bacterias adecuadas pueden ser, por ejemplo, del genero Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis y E. coli. Los ejemplos de hongos filamentosos incluyen cepas del genero Penicillium. Los organismos preferidos para la produccion de etanol son levaduras, tales como p. ej. Pichia o Saccharomyces. Las levaduras preferidas de acuerdo con la descripcion son del genero Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae o levadura de panadena.
En una realizacion adicional, los solidos de la etapa de fermentacion se pueden fraccionar. Despues de la fermentacion se podnan separar trozos grandes de fibras antes o despues de la destilacion. La separacion se puede realizar con una espumadera de superficie antes de la destilacion del macerado. El material se puede separar de la mezcla de etanol/agua, p. ej., por centrifugacion. Alternativamente, las fibras y germenes se pueden separar por cribado de la vinaza entera despues de destilacion o los granos triturados antes de fermentacion. Despues de separar los germenes y trozos grandes de fibras, el macerado que queda o vinaza entera se tratan con enzimas o combinaciones de enzimas para mejorar mas la calidad nutricional del subproducto final como los DDGS que se van a usar.
Basandose en la vinaza entera o WDG en una realizacion de la presente descripcion se puede introducir un fermentador adicional para una produccion de enzimas en el sitio, que produce una mezcla de enzimas espedfica de la planta y procedimiento con hongos filamentosos. El lfquido sobrenadante de esta fermentacion que comprende enzimas, se transfiere directamente al fermentador principal o tanque pulmon para reducir el contenido de fibra y mejorar la calidad y factores nutricionales de los DDGS, WDG y/u otros subproductos.
Ademas, el uso de las composiciones de enzimas de acuerdo con la presente descripcion en el mosto macerado despues de la fermentacion y antes del procedimiento de destilacion puede reducir la viscosidad del mosto macerado por la degradacion de fibras y/o los microorganismos fermentativos en el macerado. La reduccion de las fibras en el macerado da como resultado una reduccion del contenido de fibras en los subproductos. La degradacion temprana de los NSP tiene una influencia directa en la separacion y las condiciones de secado de los subproductos como los DDGS en el procedimiento de produccion. La menor viscosidad da como resultado temperaturas de secado menores y tambien un tiempo de secado mas corto, dando una mejor calidad de los subproductos. Por ejemplo, los productos sensibles a la temperatura como protemas y aminoacidos no se destruyen.
Ademas, la adicion de enzimas de acuerdo con la presente descripcion al mosto fermentado antes de la etapa de destilacion, es una ventaja puesto que las enzimas en las composiciones de enzimas son inactivadas durante la destilacion.
Debido a la calidad mejorada, los subproductos y residuos se pueden usar como pienso animal de alta calidad con bajo contenido en fibra y aceite y alto contenido en protema.
En una realizacion, la descripcion se refiere a metodos para formular aditivos de piensos nutricionalmente utiles como coproductos de los metodos mencionados antes para mejorar las caractensticas nutriciones de un producto alimenticio fibroso.
Los procedimientos para producir productos de fermentacion incluyen la produccion de un gran numero de productos de fermentacion que comprenden, pero no se limitan a alcoholes (en particular etanol); acidos, tales como acido dtrico, acido itaconico, acido lactico, acido gluconico, lisina; cetonas; aminoacidos, tales como acido glutamico, pero tambien compuestos mas complejos tales como antibioticos tales como penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas tales como riboflavina, B12, beta-caroteno; hormonas, tales como inulina. Se prefiere el etanol bebible, asf como etanol industrial y combustible.
Los procedimientos para producir productos de fermentacion, tales como etanol, a partir de un material que contiene almidon o lignocelulosa, son bien conocidos en la tecnica. La preparacion del material que contiene almidon tal como mafz para usar en dichos procedimientos de fermentacion, tfpicamente empieza con la trituracion del mafz en un procedimiento de trituracion seca o molienda humeda. Los procedimientos de molienda humeda implican fraccionamiento del mafz en diferentes componentes, donde solo la fraccion de almidon entra en el procedimiento de fermentacion. Los procedimientos de trituracion seca implican la trituracion de los granos de mafz en harina y mezclamiento de la harina con agua y enzimas. En general se usan dos tipos diferentes de procedimientos de trituracion humeda. El procedimiento usado mas habitualmente, denominado con frecuencia un "procedimiento convencional", incluye trituracion del material que contiene almidon y despues licuefaccion del almidon gelatinizado a una temperatura alta usando tfpicamente una alfa-amilasa bacteriana, seguido de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF) llevadas a cabo en presencia de una glucoamilasa y un organismo fermentador. Otro procedimiento bien conocido, denominado a menudo un procedimiento de "hidrolisis de almidon bruto" (procedimiento RSH), incluye la trituracion del material que contiene almidon y despues la sacarificacion y fermentacion simultaneas del almidon granular por debajo de la temperatura de gelatinizacion inicial, tfpicamente en presencia de una alfa-amilasa acida fungica y una glucoamilasa.
En un procedimiento para producir etanol a partir de ir^z , siguiendo el procedimiento SSF o el RSH, el etanol se destila del mosto entero despues de fermentacion. La suspension sin etanol resultante, normalmente denominada vinaza entera, se separa en fracciones solida y lfquida (es decir, torta humeda y vinaza fina que contienen aproximadamente 35 y 7% de solidos, respectivamente). La vinaza fina a menudo se condensa por evaporacion en una vinaza densa o jarabe y se recombina con la torta humeda y se seca mas a los granos secos de destilena con solubles, grano seco de destilena con solubles (DDGS) para usar en el pienso animal.
Las enzimas usadas para degradar los componentes del macerado incluyen carbohidrasas tales como alfa-amilasa, glucoamilasa, celulasa y/o hemicelulasas, tales como mananasas, xilanasas y beta-glucanasas, pectinasas y proteasas, o una mezcla de las mismas.
En una realizacion ventajosa, las composiciones de enzimas comprenden una beta-1,3-glucanasa, en particular para la degradacion de las paredes celulares de los microorganismos fermentadores. Para evitar la degradacion de los microorganismos fermentativos la composicion de enzimas se anade despues de la etapa de fermentacion. Como se usa en la presente memoria, "despues de fermentacion" o "despues de la etapa de fermentacion" significa que una gran parte o todos los azucares fermentables tales como glucosa se convierten en los productos de fermentacion deseados tales como etanol.
En una realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y una 1,6-beta-glucanasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una xilanasa. En una realizacion ventajosa, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y una xilanasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una 1,6-beta-glucanasa y una xilanasa.
En realizaciones adicionales, la composicion de enzimas comprende ademas una pectinasa y/o una proteasa. En un ejemplo la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una xilanasa y una proteasa. En otro ejemplo la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una xilanasa y una pectinasa.
En una realizacion adicional, la composicion de enzimas comprende una mananasa. En una realizacion ventajosa, la composicion de enzimas comprende a mananasa y una beta-1,3-glucanasa.
Las paredes celulares de la mayona de los microorganismos fungicos verdaderos y levaduras contienen una red de glucanos, que da resistencia a la pared celular. Constituyentes de las paredes celulares fungicas principales adicionales son la manoprotema y quitina. Para la degradacion de los componentes del mosto fermentado, en particular para la degradacion de las fibras y microorganismos fermentadores, se pueden usar las siguientes enzimas.
Las beta-1,3-glucanasas, como se usan en la presente memoria, son enzimas capaces de degradar glucanos. Los glucanos y la quitina son mucho mas resistentes a la degradacion microbiana que la celulosa, que es el constituyente principal de la pared celular de muchas levaduras y organismos tipo hongos. El glucano tiene predominantemente enlaces beta-1,3 con alguna ramificacion por enlaces 1,6 (Manners et al., Biotechnol. Bioeng, 38, pag. 977, 1973), y se sabe que puede ser degradado por algunos sistemas de beta-1,3-glucanasa. La beta-1,3-glucanasa incluye el grupo de endo-beta-1,3-glucanasas llamadas tambien laminarinasas (E.C. 3.2.1.39 y E.C.
3.2.1.6, Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc. 1992).
En la tecnica anterior se ha descrito una serie de genes de beta-1,3-glucanasa y sus usos. Un ejemplo es el documento DD 226012 (Akad. Wissenshaft, DDR) que se refiere a un metodo para la produccion de una beta-1,3-glucanasa de Bacillus. Ademas, el documento JP 61040792 A (DOI K) describe un plasmido recombinante de citolasa beta-1,3-glucanasa de pared celular para eliminar las paredes celulares de levaduras. El gen procede de Arthrobacter y se transforma en bacterias del grupo Escherichia. El documento EP 440.304 se refiere a plantas provistas de resistencia mejorada contra hongos patogenos transformadas con al menos un gen que codifica una quitinasa intracelular o beta-1,3-glucanasa intra o extracelular. Tambien se describen los polinucleotidos recombinantes de emparejamiento. El documento WO 87/01388 (The Trustees of Columbia University) describe un metodo para preparar enzimas lfticas celulares, tales como beta-1,3-glucanasas, que pueden ser producidas por Oerksovia. WO 92/03557 (Majesty (Her) in Right of Canada) describe un vector de expresion de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de 2,7 kb, procedente de Oerskovia xanthineolytica, que codifica una beta-1,3-glucanasa. Del documento WO 92/16632 se conoce una secuencia de ADN recombinante que codifica una nueva protema con actividad de beta-1,3-glucanasa.
Ejemplos de beta-1,3-glucanasa disponibles en el mercado son Rohalase BX de AB Enzymes y Rapidase Glucalees de DSM.
Las hemicelulasas como se usan en la presente memoria, son enzimas capaces de romper la hemicelulosa. Cualquier hemicelulasa adecuada para usar en la hidrolisis de hemicelulosa, puede ser acetilxilano esterasas, endoarabinasas, exo-arabinasas, arabinofuranosidasas, feruloil esterasa, endo-galactanasas, exo-galactanasas, glucuronidasas, manasas, xilanasas, y mezclas de dos o mas de las mismas. Preferiblemente, la hemicelulasa para usar en la presente invencion es una hemicelulasa que actua en endo, y mas preferiblemente, la hemicelulasa es una hemicelulasa que actua en exo, que tiene la capacidad de hidrolizar hemicelulosa en condiciones acidas inferiores a pH 7, preferiblemente pH 3-7.
En un aspecto, la(s) hemicelulasa(s) comprende(n) una preparacion de enzimas hemiceluloltticas comerciales. Ejemplos de preparaciones de enzimas hemiceluloltticas comerciales adecuadas para usar en la presente invencion incluyen, por ejemplo, SHEARZYME(TM) (Novozymes AS), CELLIC(TM) HTec (Novozymes AS), CELLIC(TM) HTec2 (Novozymes AS), VISCOZYME(R) (Novozymes A/S), ULTRAFLO(R) (Novozymes AS), PULPZYME(R) HC (Novozymes A/S), Xilanasa MULTIFECT(R) (Genencor), ACCELLERASE(R) XY (Genencor), ACCELLERASE(R) XC (Genencor), ECOPULP(R) TX-200A (AB Enzymes), Xilanasa HSP 6000 (DSM), DEPOL(TM) 333P (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido), DEPOl(t M) 740l . (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido), y DEPOL(TM) 762P (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido).
Preferiblemente, la hemicelulasa para usar en la presente descripcion es una hemicelulasa que actua en endo, que tiene la capacidad de hidrolizar hemicelulosa en condiciones acidas inferiores a pH 7. Un ejemplo de hemicelulasa adecuada para usar en la presente invencion incluye VISCOZYME L(TM) (disponible en Novozymes A/S, Dinamarca), Rohament GMP™ (disponible en AB Enzymes).
En una realizacion, la hemicelulasa es una xilanasa. En una realizacion, la xilanasa puede ser preferiblemente de origen microbiano, tal como de origen fungico (p. ej., Aspergillus, Fusarium, Humicola, Meripilus, Trichoderma) o de una bacteria (p. ej., Bacillus). En una realizacion preferida, la xilanasa procede de un hongo filamentoso, preferiblemente procede de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus; o una cepa de Humicola, preferiblemente Humicola lanuginosa. Los ejemplos de xilanasas utiles en los metodos de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a xilanasa de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), xilanasas de Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256), y xilanasas de Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210). La xilanasa puede ser preferiblemente una endo-1,4-beta-xilanasa, mas preferiblemente una endo-1,4-beta-xilanasa de GH 10 o GH 11. Los ejemplos de xilanasas comerciales incluyen SHEARZYME(TM), BIOFEED WHEAT(TM), HTec y HTec2 de Novozymes A/S, Dinamarca.
Los ejemplos de beta-xilosidasas utiles en los metodos de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a betaxilosidasa de Trichoderma reesei (numero de acceso de UniProtKB/TrEMBL Q92458), Talaromyces emersonii (numero de acceso de SwissProt Q8X212) y Neurospora crassa (numero de acceso de SwissProt Q7SOW4).
De acuerdo con la invencion, el macerado en la etapa i) se puede someter a una cantidad eficaz de cualquier xilanasa (EC 3.2.1.8), tal como cualquiera de las xilanasas mencionadas mas adelante. La actividad de xilanasa puede proceder de cualquier organismo adecuado, incluyendo organismos fungicos y bacterianos. Las xilanasas fungicas pueden proceder de cepas de generos que incluyen Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium y Trichoderma.
Los ejemplos de xilanasas bacterianas adecuadas incluyen xilanasas procedentes de una cepa de Bacillus, las xilanasas disponibles en el mercado contempladas incluyen SHEARZYM E (TM), BIOFEED WHEAT(TM), (de Novozymes AjS), Econase CE™ (de AB Enzymes), Depol 676™ (de Biocatalysts Ltd.) y SPEZYME(TM) CP (de Genencor Int.).).
La xilanasa se puede anadir en una cantidad eficaz en el intervalo de 0,16x106 - 460x106 Unidades por tonelada de mosto macerado.
Las mananasas son hemicelulasas clasificadas como EC 3.2.1.78, y llamadas endo-1,4-beta-manosidasa. La mananasa incluye beta-mananasa, endo-1,4-mananasa, y galacto-mananasa. La mananasa preferiblemente es capaz de catalizar la hidrolisis de enlaces 1,4-beta-D-manosfdicos en mananos, que incluyen glucomananos, galactomananos y galactoglucomananos. Los mananos son polisacaridos compuestos principal o enteramente de unidades de D-manosa. La mananasa puede ser de cualquier origen tal como un organismo bacteriano o fungico, En una realizacion espedfica la mananasa procede de una cepa del genero de hongos filamentosos Trichoderma, preferiblemente Trichoderma reseei. En una realizacion, la mananasa es una de las mananasas descritas en el documento WO2008/009673.
Las mananasas se han identificado en varios organismos Bacillus. Por ejemplo, Talbot et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.56, No. 11, pag. 3505-3510 (1990) describe una beta-mananasa derivada de Bacillus stearothermophilus. Mendoza et al., World J. Microbiol. Biotech., Vol. 10, No. 5, pag. 551-555 (1994) describe una beta-mananasa derivada de Bacillus subtilis. El documento JP-A-03047076 describe una beta-mananasa derivada de Bacillus sp. El documento JP-A-63056289 describe la produccion de una beta-mananasa termoestable, alcalina. El documento JP-A-63036775 se refiere al microorganismo Bacillus FERM P-8856 que produce beta-mananasa y beta-manosidasa. El documento JP-A-08051975 describe beta-mananasas alcalinas de Bacillus sp. alcalofilos AM-001. Se describe una mananasa purificada de Bacillus amyloliquefaciens en el documento Wo 97/11164. El documento WO 91/18974 describe una hemicelulasa tal como una glucanasa, xilanasa o mananasa activa. Los ejemplos de mananasas disponibles en el mercado incluyen GAMANASE(TM) disponible en Novozymes A/S Dinamarca y Rohapect GMP™ disponible en AB Enzymes GmbH.
La mananasa se puede anadir en una cantidad eficaz en el intervalo de 0,3x106 - 1,6x106 Unidades por tonelada de mosto macerado.
Una celulasa, usada de acuerdo con la descripcion, puede ser cualquier celulasa, en particular de origen microbiano, en particular de origen fungico o bacteriano tal como una celulasa que se puede obtener de una cepa de un hongo filamentoso (p. ej., Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Fusarium). Preferiblemente, la celulasa actua tanto en material celulosico como lignocelulosico. Las celulasas preferidas para usar en la presente invencion incluyen celulasas que actuan en endo, celulasas que actuan en exo y celobiasas, y sus combinaciones. Los ejemplos de celulasas disponibles en el mercado adecuadas de acuerdo con la presente invencion incluyen, por ejemplo, CELLULCLAST(TM) (disponible en Novozymes A/S), , LAMINEX(TM) y SPEZYME(TM) CP (Genencor Int.) y Econase CE™ (de Ab Enzymes GmbH), Rohalase bX™ (de Ab Enzymes GmbH), Celulasa 13P™ (de Biocatalysts Ltd.). La celulasa se puede anadir en cantidades eficaces en el intervalo de 0,03x106 - 16x106 Unidades por tonelada de sustrato (en mosto macerado)
La pectinasa usada en los metodos de acuerdo con la presente descripcion puede ser cualquier pectinasa, en particular de origen microbiano, en particular de origen bacteriano, tal como una pectinasa derivada de una especie dentro de los generos Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Xanthomonas y Erwinia, o de origen fungico, tal como una pectinasa derivada de una especie dentro de los generos Trichoderma o Aspergillus, en particular de una cepa dentro de las especies A. niger y A. aculeatus. Las pectinasas disponibles en el mercado contempladas incluyen Pectinex Ultra-SPL™ (de Novozymes), Pectinex Ultra Color (de Novozymes), Rohapect Classic (de AB Enzymes), Rohapect 10L (de AB Enzymes).
La pectinasa se puede anadir en una cantidad eficaz en el intervalo de 1,4x109 - 23.500x109 Unidades por tonelada de mosto macerado.
Las proteasas como se usan en la presente descripcion, son enzimas que catalizan la escision de enlaces peptfdicos. Las proteasas adecuadas incluyen proteasas fungicas y bacterianas. Las proteasas preferidas son proteasas acidas, es decir, proteasas caracterizadas por la capacidad de hidrolizar protemas en condiciones acidas inferiores a pH 7.
Las proteasas fungicas acidas adecuadas incluyen proteasas fungicas derivadas de Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Penicillium, Sclerotium y Toru-lopsis. Las proteasas comerciales incluyen GC 106(TM) y SPEZYME(TM) FAN (disponible en Genencor, EE.u U.). Las proteasas bacterianas adecuadas, aunque no son proteasas acidas, incluyen los productos disponibles en el mercado ALCALASE(TM) y NEUTRASE(TM) (disponibles en Novozymes A/S).
La proteasa se puede anadir en una cantidad eficaz en el intervalo de 0,002x106-314x106 Unidades por tonelada de mosto macerado.
Se puede usar cualquier fitasa en los metodos de la presente descripcion. Las fitasas son enzimas que degradan fitatos y/o acido fftico por hidrolisis espedfica del enlace ester entre inositol y fosforo. La actividad de fitasa se muestra con la disponibilidad de fosforo e iones en muchos ingredientes. En algunas realizaciones, la fitasa puede liberar al menos un fosfato inorganico de un hexafosfato de inositol (p. ej., acido fftico). Las fitasas se pueden agrupar de acuerdo con su preferencia por una posicion espedfica del grupo ester fosfato en la molecula de fitato en la que se inicia la hidrolisis (p. ej., 3-fitasa (EC 3.1.3.8) o 6-fitasa (EC 3.1.3.26)). Un ejemplo de fitasa es la mioinositolhexakisfosfato-3-fosfohidrolasa. Las fitasas se pueden obtener de microorganismos tales como organismos fungicos y bacterianos. Por ejemplo, la fitasa se puede obtener de hongos filamentosos tales como Aspergillus (p. ej., A. ficuum, A. fumigatus, A. niger y A. terreus), Cladospirum, Mucor (p. ej., Mucor piriformis), Myceliop t ora (p. ej., M. t ermop ila), Penicillium (p. ej., P. ordei (At Cc N° 22053)), P. piceum (ATCC N° 10519), o P. brevi-compactum (ATCC N° 48944), Talaromyces (p. ej., T. thermophilus), Thermomyces (WO 99/49740), y Trichoderma spp. (p. ej., T. reesei). En una realizacion, la fitasa deriva de Buttiauxiella spp. tal como B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae, y B. warmboldiae. En algunas realizaciones, la fitasa es una fitasa descrita en el documento WO 2006/043178.
El ejemplo 1 muestra la deshidratacion enzimatica de la vinaza entera despues de tratar el mosto macerado con enzimas capaces de degradar al menos un componente del mosto macerado. Por lo tanto, un aspecto de la descripcion se refiere a un metodo para mejorar la calidad de los WDG, DDG y/o DDGS, que comprende las etapas de: i) someter el macerado a una o mas enzimas capaces de degradar uno o mas componentes del macerado, ii) destilacion, iii) separar el material en una fraccion solida y una fraccion ftquida. La fraccion solida se denomina a menudo "torta humeda" y la fraccion ftquida se denomina a menudo "vinaza fina".
De acuerdo con el proposito de la presente invencion como se describe en la presente memoria, en un aspecto de la presente descripcion, se proporciona un metodo para mejorar la calidad nutricional de un subproducto o residuo de un procedimiento de produccion fermentativo, que comprende inocular en el subproducto o residuo al menos un hongo filamentosos, fermentar el subproducto o residuo y separar al menos una enzima del subproducto o residuo fermentado; y proporcionar la enzima al mosto fermentado (mosto macerado) de un procedimiento de produccion fermentativo, preferiblemente un procedimiento de produccion de etanol. El hongo filamentoso se puede seleccionar del grupo que consiste en Rhizopus, Aspergillus, Trichoderma, y cualquiera de sus combinaciones. El subproducto o residuo preferiblemente es un subproducto fibroso y se puede seleccionar del grupo que consiste en granos gastados de coccion, granos secos de destilena, solubles secos de destilena, granos secos de destilena con solubles y WDG, y sus mezclas.
En otro aspecto, la presente descripcion se refiere a metodos de produccion de etanol a partir de material que contiene almidon, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
v) Convertir el material que contiene almidon en azucares fermentables
vi) Fermentacion de los azucares fermentables con un microorganismo en mosto fermentado
vii) Someter el mosto fermentado despues del procedimiento de fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una enzima o una mezcla de enzimas
viii) Separacion del etanol en el mosto fermentado por destilacion
La conversion del material que contiene almidon en azucares fermentables se puede hacer por (a) licuefaccion de un material que contiene almidon y (b) sacarificacion del material licuado obtenido en la etapa (a).
La licuefaccion se lleva a cabo preferiblemente en presencia de una alfa-amilasa, preferiblemente una alfa-amilasa bacteriana o alfa-amilasa fungica acida. En una realizacion, se anade una pululanasa, isoamilasa y y/o fitasa durante la licuefaccion.
Los organismos preferidos para la produccion de etanol son levaduras, tales como, p. ej., Pichia o Saccharomyces. La levadura preferida de acuerdo con la descripcion es del genero Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae o levadura de panadena. Las celulas de levadura se pueden anadir en cantidades de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, en especial 5x107 de levaduras viables contadas por ml de caldo de fermentacion. Durante la fase de produccion de etanol, el recuento de celulas de levadura debena estar preferiblemente en el intervalo de 107 a 1010, en especial aproximadamente 2 x 108. Se puede encontrar orientacion adicional con respecto al uso de levaduras para la fermentacion, p. ej., en "The alcohol Textbook" (Editors K. Jacques, T. P. Lyons y D. R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que se incorpora en la presente memoria por referencia El microorganismo usado para la fermentacion se anade al mosto y la fermentacion procede hasta que se produce la cantidad deseada de producto de fermentacion; en una realizacion preferida en donde el producto de fermentacion que se va a recuperar es etanol, esta puede ser, p. ej., durante 24-96 horas, tal como 35-60 horas. La temperatura y el pH durante la fermentacion es una temperatura y pH adecuados para el microorganismo en cuestion y con respecto al uso previsto del producto de fermentacion, tal como, p. ej., en una realizacion en donde el organismo fermentador es levadura y el producto para recuperar es etanol, la temperatura preferida esta en el intervalo de aproximadamente 26-34°C, p. ej., aproximadamente 32°C, y a un pH p. ej. en el intervalo de aproximadamente pH 3­ 6, p. ej., aproximadamente pH 4-5.
En otra realizacion en donde el organismo fermentador es levadura, y el mosto fermentado se va a usar como un macerado, la temperatura del mosto, la temperatura preferida es aproximadamente 12-16°C, tal como aproximadamente 14°C.
Como se ha mencionado antes, el organismo fermentador preferiblemente es levadura, p. ej. una cepa de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces diastaticus. En una realizacion ventajosa, se usa una cepa de levadura de Saccharomyces diastaticus (SIHA Amyloferm®, E. Begerow GmbH&Co, Langenlonsheim, Alemania) puesto que su actividad de exo-amilasa puede dividir el almidon lfquido y tambien la dextrina, maltosa y melibiosa.
En la etapa de licuefaccion, el almidon gelatinizado (mosto corriente abajo) se rompe (hidroliza) en maltodextrinas (dextrinas). Para lograr la hidrolisis del almidon se anade una enzima adecuada, preferiblemente una alfa-amilasa. La licuefaccion se puede llevar a cabo como un procedimiento de suspension en caliente de tres etapas. La suspension se calienta entre 60-95°C, preferiblemente 80-85°C, y se puede anadir una alfa-amilasa para iniciar la licuefaccion (adelgazamiento). Despues la suspension se puede cocer con vapor a presion (jet-cokked) a una temperatura entre 95-140°C, preferiblemente l05-125°C, durante aproximadamente 1-15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3-10 minutos, en especial alrededor de aproximadamente 5 minutos. La suspension se enfna a 60-95°C y se puede anadir mas alfa-amilasa para completar la hidrolisis (licuefaccion secundaria). El procedimiento de licuefaccion normalmente se lleva a cabo a un pH de 4,0 a 6,5, en particular a un pH de 4,5 a 6. La etapa de sacarificacion y la etapa de fermentacion se pueden llevar a cabo como etapas del procedimiento separadas o como una etapa de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF). La sacarificacion se lleva a cabo en presencia de una enzima de sacarificacion, p. ej., una glucoamilasa, una beta-amilasa o amilasa maltogenica. Opcionalmente se anade una fitasa y/o una proteasa.
La sacarificacion se puede llevar a cabo usando condiciones bien conocidas en la tecnica con una enzima de sacarificacion, p. ej., beta-amilasa, glucoamilasa o amilasa maltogenica, y opcionalmente una enzima desramificadora, tal como una isoamilasa o una pululanasa. Por ejemplo, un procedimiento de sacarificacion completo puede durar hasta de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 72 horas, sin embargo, es comun hacer una pre-sacarificacion durante tipicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65°C, tipicamente aproximadamente 60°C, seguido de la sacarificacion completa durante la fermentacion en un procedimiento de sacarificacion y fermentacion simultaneas (procedimiento sSf ). La sacarificacion se lleva a cabo tfpicamente a una temperatura de 20-75°C, preferiblemente de 40-70°C, tfpicamente aproximadamente 60°C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4,5.
El procedimiento mas ampliamente usado para producir un producto de fermentacion, en especial etanol, es el procedimiento de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF), en el que no hay etapa de mantenimiento para la sacarificacion, lo que significa que se puede anadir todo junto un organismo fermentador, tal como una levadura, y enzima(s), que incluye(n) la(s) hemicelulasa(s) y/o endoglucanasa(s) espedfica(s). El SSF se lleva a cabo tfpicamente a una temperatura de 25°C a 40°C, tal como de 28°C a 35°C, de 30°C a 34°C, preferiblemente alrededor de aproximadamente 32°C. En una realizacion, la fermentacion procede durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.
Despues de la fermentacion, el mosto fermentado se somete a una composicion de enzimas de acuerdo con la presente descripcion. En una realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa. En otra realizacion la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y una 1,6-beta-glucanasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una xilanasa. En una realizacion ventajosa, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa y una xilanasa. En otra realizacion, la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una 1,6-beta-glucanasa y una xilanasa. En realizaciones adicionales, la composicion de enzimas comprende ademas una pectinasa y/o una proteasa. En un ejemplo la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una xilanasa y una proteasa. En otro ejemplo la composicion de enzimas comprende una beta-1,3-glucanasa, una xilanasa y una pectinasa. En una realizacion adicional, la composicion de enzimas comprende una mananasa. En una realizacion ventajosa, la composicion de enzimas comprende una mananasa y una beta-1,3-glucanasa.
En una realizacion particular, el procedimiento de la invencion comprende ademas, antes de la licuefaccion del material que contiene almidon, las etapas de:
- reduccion del tamano de partfculas del material que contiene almidon, preferiblemente por molienda; y
- formacion de una suspension que comprende el material que contiene almidon y agua.
La suspension acuosa puede contener 10-55% en p/p de solidos secos (DS), preferiblemente 25-45% en p/p de solidos secos (DS), mas preferiblemente 30-40% en p/p de solidos secos (DS) del material que contiene almidon. La suspension se calienta por encima de la temperatura de gelatinizacion y se puede anadir una alfa-amilasa, preferiblemente una alfa-amilasa bacteriana y/o fungica acida, para iniciar la licuefaccion (adelgazamiento). La suspension se puede cocer con vapor a presion para gelatinizar mas la suspension antes de someterla a una alfaamilasa en la etapa (a).
En una realizacion preferida, el material que contiene almidon son cereales molidos, preferiblemente cebada o mafz, y los metodos comprenden una etapa de molienda de los cereales antes de la etapa (a). En otras palabras, la descripcion tambien abarca metodos, en donde el material que contiene almidon se puede obtener por un procedimiento que comprende la molienda de cereales, preferiblemente molienda seca, p. ej., por molinos de martillos o de rodillos. La trituracion tambien se entiende como molienda, como lo es cualquier procedimiento adecuado para abrir los granos individuales y exponer el endospermo al procesamiento adicional. Normalmente se usan dos procedimientos de molienda en la produccion de alcohol: molienda humeda y seca. La expresion "molienda seca" indica molienda del grano entero. En la molienda seca se muele el grano entero y se usa en la parte restante del procedimiento de formacion de mosto. El mosto se puede proporcionar formando una suspension que comprende el material que contiene almidon molido y agua de coccion. El agua de coccion se puede calentar a una temperatura adecuada antes de combinarla con el material que contiene almidon molido con el fin de lograr una temperatura del mosto de 45 a 70°C, preferiblemente de 53 a 66°C, mas preferiblemente de 55 a 60°C. El mosto tfpicamente se forma en un tanque conocido como tanque de suspension.
Despues de la fermentacion se puede separar el producto de fermentacion del medio de fermentacion. La suspension se puede destilar para extraer el producto de fermentacion deseado o el producto de fermentacion deseado del medio de fermentacion mediante tecnicas filtracion o microfiltracion por membrana. Alternativamente, el producto de fermentacion se puede recuperar por separacion de los componentes volatiles. Los metodos para recuperar los productos de fermentacion son bien conocidos en la tecnica. Tfpicamente, el producto de fermentacion, p. ej. etanol, se obtiene con una pureza de hasta, p. ej. aproximadamente 96% en vol de etanol.
Despues de completarse el procedimiento de fermentacion, el material que queda se considera la vinaza entera. Como se usa en la presente memoria, la expresion "vinaza entera" incluye el material que queda al final del procedimiento de fermentacion tanto antes como despues de recuperar el producto de fermentacion, p. ej., etanol. El producto de fermentacion se puede recuperar opcionalmente por cualquier metodo conocido en la tecnica. En una realizacion, la vinaza entera se separa o divide en una fase solida y Ifquida por uno o mas metodos para separar la vinaza fina de la torta humeda. Dichos metodos incluyen, por ejemplo, centrifugacion y decantacion. El producto de fermentacion se pude recuperar opcionalmente antes o despues de que la vinaza entera se separe en una fase solida y lfquida.
Por lo tanto, en una realizacion, los metodos de la descripcion comprenden ademas destilacion para obtener el producto de fermentacion, p. ej., etanol. La fermentacion y la destilacion se pueden llevar a cabo simultaneamente y/o por separado/secuencialmente; opcionalmente seguido por una o mas etapas de procedimiento para el refinado adicional del producto de fermentacion.
En una realizacion, el subproducto acuoso (vinaza entera) procedente del procedimiento de destilacion se separa en dos fracciones, p. ej., por centrifugacion: grano humedo (fase solida) y vinaza fina (lfquido sobrenadante). En otra realizacion los metodos de la descripcion comprenden ademas la separacion de la vinaza entera producida por destilacion, en grano humedo y vinaza fina; y la recirculacion de la vinaza fina al material que contiene almidon antes de licuefaccion. En una realizacion, la vinaza fina se recircula a la suspension de granos enteros molidos. La fraccion de granos humedos se puede secar, tfpicamente en un secador de tambor. El producto seco se denomina granos secos de destilena, y se pueden usar como se ha mencionado antes como pienso animal de alta calidad. La fraccion de vinaza fina se puede evaporar proporcionando dos fracciones (vease la fig. 1 y fig. 2), (i) una fraccion de condensado de 4-6% de DS (principalmente de almidon, protemas, aceite y componentes de la pared celular), y (ii) una fraccion de jarabe, que consiste principalmente en dextrinas lfmite y azucares no fermentables, que se pueden introducir en un secador junto con los granos humedos (de la etapa de separacion de la vinaza entera) para proporcionar un producto denominado grano seco de destilena con solubles, que tambien se puede usar como pienso animal. La vinaza fina es el termino usado para el lfquido sobrenadante de la centrifugacion de la vinaza entera. Tfpicamente, la vinaza fina contiene 4-6% de DS (principalmente almidon y protemas) y tiene una temperatura de aproximadamente 60-90°C. En otra realizacion, la vinaza fina no se recircula, pero se recircula la corriente de condensado de la vinaza fina evaporada a la suspension que contiene el grano entero molido para ser cocida con vapor a presion.
Detalles adicionales de como llevar a cabo la licuefaccion, sacarificacion, fermentacion, destilacion y recuperacion del etanol, son bien conocidos por el experto.
Los metodos para deshidratar la vinaza y para extraer aceite de un producto de fermentacion se conocen en la tecnica. Estos metodos incluyen la decantacion u separacion de otra forma de la vinaza entera en torta humeda y vinaza fina. Vease, p. ej., las patentes de EE.UU. 6.433.146, 7.601.858 y 7.608.729, y publicacion de solicitud de EE.UU. N° 2010/0058649. Ademas, la vinaza fina se puede evaporar o condensar en un jarabe o vinaza densa de la cual se puede extraer el aceite usando centrifugacion, filtracion, calor, temperatura alta, presion mayor, o una combinacion de los mismos. Otra forma de extraer aceite es disminuir el pH de la vinaza fina o jarabe. El uso de tensioactivos para romper emulsiones tambien mejora la extraccion de aceite. Tambien se pueden usar prensas para la deshidratacion. En una realizacion de la descripcion, la presencia de beta-1,3-glucanasa y/o xilanasa en el mosto fermentado despues de la fermentacion aumenta la cantidad de aceite en la vinaza fina y ademas en el jarabe o vinaza espesa.
El(los) producto(s) de fermentacion se puede(n) recuperar opcionalmente del medio de fermentacion usando cualquier metodo conocido en la tecnica incluyendo, pero no limitado a cromatograffa, procedimientos electroforeticos, solubilidad diferencial, destilacion o extraccion. Por ejemplo, el alcohol se separa del material celulosico fermentado y se purifica por metodos convencionales de destilacion como se ha mencionado antes. Se puede obtener etanol con una pureza de hasta aproximadamente 96% en vol, que se puede usar, por ejemplo, como etanol combustible, etanol bebible, es decir, alcoholes neutros potables o etanol industrial.
Las invenciones descritas y reivindicadas en la presente memoria no estan limitadas en el alcance por las realizaciones espedficas descritas en la presente memoria, puesto que se pretende que estas realizaciones sean ilustraciones de varios aspectos de la invencion. Se pretende que cualquier realizacion equivalente este dentro del alcance de esta invencion. De hecho, diferentes modificaciones de la invencion ademas de las mostradas y descritas en la presente memoria seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior. Tambien se pretende que dichas modificaciones esten dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. En el caso de conflicto, controlara la presente descripcion incluyendo las definiciones. Se citan varias referencias en la presente memoria, cuyas descripciones se incorporan por referencia en su totalidad. La presente invencion se describe ademas mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes del alcance de la invencion.
Ejemplos
A) Procedimientos para producir productos de fermentacion
En una realizacion, el procedimiento de produccion de etanol a partir de mafz se llevo a cabo como sigue:
a) reduccion del tamano de partmulas del material que contiene almidon mediante molienda:
- el mafz se molio a < 2 mm de tamano de partmulas
b) formacion de una suspension que comprende el material que contiene almidon y agua
- se mezclaron 10 kg de mafz con agua corriente a 35°C para obtener una disolucion de ~31,25% de solidos, volumen total de 30 litros
- el intervalo de pH era 5,6 - 6,0
c) licuefaccion del material que contiene almidon
- la temperatura se aumento a 90°C
- se anadieron 7 ml de alfa-amilasa (Novozymes Liquozyme SC)
- se anadio 1%o de antiespumante (30 ml)
- incubacion durante 90 min a 90°C y agitacion a 150 rpm
d) sacarificacion del material licuado obtenido
- la suspension se enfrio a 30°C, el pH se ajusto ~4 con (NH4)2SO4 1 M - se anadieron 12 ml de glucoamilasa (Novozymes Spirizyme Ultra)
e) fermentacion
- Propagacion de levaduras: se incubaron 200 ml de medio YNB-almidon durante la noche (30°C, 150 rpm) y se inocularon 2 g de levaduras (SIHA Amyloferm), el precultivo completo se anadio a la fermentacion
- adicion de 10 g de ((NH^SO 4) como fuente de nitrogeno
- adicion de levaduras
- se valoro el pH a 4,0 con solucion de amoniaco (25%), - incubacion durante max. 48 h a 30°C y 100 rpm
- se tomaron muestras de 2 ml cada 12 h para seguir el progreso de la fermentacion (azucar-, concentracion de etanol)
B) Enzimas:
Se usaron las siguientes enzimas citadas en la tabla 1, solas o en diferentes combinaciones.
Tabla 1
Figure imgf000013_0001
C) Determinacion de la actividad del producto enzimatico con DNSA:
Sustratos: -endo Glucanasa: p-Glucano de cebada, baja viscosidad (Megazyme)
Xilanasa: Xilano de Birchwood (Sigma)
Mananasa: Galactomanano, carob
Pectinasa: Poli(acido galacturonico) (Sigma)
Los sustratos se disolvieron en tampon a una concentracion de 0,8% (p/v)
Tampon: NaAcetat 50 mM, pH 4,5
Las enzimas se diluyeron en tampon, se debe determinar para cada enzima la concentracion enzimatica correcta. Se mezclaron 90 pl de sustrato y 10 pl de solucion enzimatica. Se midio un blanco sustituyendo la solucion enzimatica por agua. Incubacion durante 30 min a 37°C (Los azucares reductores se midieron despues de mezclar 50 |il de la mezcla de sustrato-enzima incubada con 50 pl de reactivo DNSA.
La actividad se calcula como Unidades por pl o mg de producto de enzima. 1 unidad se define como la cantidad de extremos reductores formados en pmol por minuto.
D) Ensayo en endo-beta-1,3-glucanasa
El sustrato usado es azurina-pachyman reticulado (AZCL-Pachyman). El sustrato se prepara portenido y reticulacion de pachyman altamente purificado para producir un material que se hidrata en agua, pero es insoluble en agua. La hidrolisis por endo-beta-1,3-glucanasa produce fragmentos tenidos solubles en agua, y la tasa de liberacion de estos (aumento de absorbancia a 590 nm) se puede relacionar directamente con la actividad enzimatica. El sustrato se suministra comercialmente en una forma de comprimido listo para usar como comprimidos de 1,3-Beta-Glucazima (Megazyme International Ireland Ltd, 1,3-BETA-GLUCAZYME TABLETS)
E) Ensayo de proteasa
La actividad de proteasa de los productos de enzimas se determino con el ensayo de TNBS como se describe en el ejemplo 6.
Una unidad de proteasa se define como la formacion de equivalentes de glicina por minuto. Las actividades enzimaticas se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
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Figure imgf000015_0001
Ejemplo 1
Deshidratacion de la vinaza entera
Se uso como sustrato macerado (8,7% en peso de solidos secos, pH=4,0 de la fermentacion de etanol con molienda seca convencional.
Se puso una parte alfcuota (50 ml) de la vinaza entera en un tubo de centnfuga y se calento a 37°C. La concentracion total de enzima anadida era 200 ppm, la mezcla se agito suavemente durante la noche en un agitador rotatorio.
El tubo se centrifugo durante 5 minutos a 2000 rpm. El lfquido sobrenadante se decanto y la torta humeda resultante se peso y se comparo con el control sin la adicion de ninguna enzima. Los resultados, junto con varias enzimas y combinaciones de enzimas ensayadas, se muestran en la tabla 2 y tabla 3.
Tabla 2
Figure imgf000015_0002
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Tabla 3
Figure imgf000016_0002
Ejemplo 2
Reduccion de fibras en los DDGS despues de tratamiento enzimatico medida por determinacion de ADF y NDF Las fibras detergente acido (ADF) y fibras detergente neutro (NDF) son fibras dieteticas y pueden ser solubles e insolubles. Las ADF contienen lignina y celulosa, las NDF contienen ADF y hemicelulosas. Las fibras solubles son responsables de los efectos de viscosidad en el procedimiento de digestion y responsables de la menor energfa y absorcion de protemas (efecto jaula). Los valores reducidos de ADF/NDF conducen a una mejor digestion dentro del intestino debido a la menor viscosidad coincidente con mejor liberacion de protema y energfa.
Se uso como sustrato macerado (10% en peso de solidos secos, pH=4,0) de la fermentacion de etanol con molienda seca convencional.
Se puso una parte alfcuota (50 ml) de macerado en un tubo de centnfuga y se calento a 37°C. La cantidad total de enzima anadida estaba en el intervalo de 100 ppm a 400 ppm, la mezcla se agito suavemente durante 6 horas en un agitador rotatorio. Despues de inactivacion enzimatica termica (1 hora a 80°C) la vinaza entera se seco y molio. Se analizo en la vinaza seca la ADF/NDF de acuerdo con los protocolos de VDLUFA Bd. III, 6.5.2. (Method book III "The chemical analysis of feedstuff' de VDLUFA 1a-7a entregas de suplementos)
Los resultados se muestran en la figura 4 a 7. La figura 4 muestra el resultado de anadir una composicion de enzimas que comprende beta-1,3-glucanasa como la actividad principal (Rohalase BX, AB Enzymes). Los parametros medidos son las fibras detergente neutro (NDF) y las fibras detergente acido (ADF). La dosis de enzima era 200 g/t de macerado. Estos resultados muestran claramente que la enzima beta-1,3-glucanasa reduce los valores de ADF y NDF en 9% y 10,6%.
La figura 5 muestra el efecto de una composicion de enzimas que comprende una xilanasa como la actividad principal (Xilanasa 2 XP Conc, Dyadic) aplicada en dos concentraciones de 100 y 200 g/t de macerado. La xilanasa reduce el contenido de fibra de los DDGS lo cual puede verse en la clara reduccion de las ADF y NDF. Con una dosis de enzimas de 100 g/t la concentracion de NDF se reduce solo en 1,2% mientras que la reduccion era de 17,3% para una dosis de 200 g/t.
La figura 6 muestra el efecto de una composicion de enzimas que comprende como actividades principales actividad de xilanasa y 1,3-beta-glucanasa, anadida en concentraciones de 200 g/t de macerado cada una.
En comparacion con la fig. 5 donde la xilanasa usada en una concentracion de solo 100 g/t mostro solo un efecto mmimo en la reduccion de fibras, la combinacion de xilanasa y 1,3-beta-glucanasa tiene un efecto mayor. El valor de ADF se reduce en 2,8% y el valor de NDF en 8,2%.
La figura 7 muestra la reduccion de ADF/NDF de la combinacion de xilanasa y 1,3-beta-glucanasa en dos combinaciones, cada una con enzimas adicionales. Una composicion de enzimas que comprende ademas actividad de pectinasa (Rohapect Classic, AB Enzymes) muestra una reduccion adicional de NDF (5,8%) pero la enzima anula el efecto para las ADF. La aplicacion adicional de proteasas (Protease A, Amano Japon) afecta a la reduccion positiva de ADF y NDF. El valor de NDF se reduce de nuevo en 3,2%.
Ejemplo 3
Mejora del desaceitado
El contenido de aceite de los DDGS a veces es mayor de lo deseado y se buscan metodos para recuperar mas aceite como un subproducto separado para usar en la produccion de biodiesel y otros productos biorrenovables. La mayor parte del trabajo en la recuperacion de aceite de procedimientos de fermentacion se ha centrado en mejorar la capacidad de extraccion del aceite de la vinaza entera. Como se ha mencionado en la memoria descriptiva, un mejor desaceitado conduce a una mejor separacion del aceite dentro del procedimiento de ETOH. La produccion de aceite de mafz es un subproducto con alto valor para la industria alimentaria y de piensos, tambien para la produccion de biodiesel.
Despues de la reaccion de una composicion de enzimas que comprende como actividades principales actividad de xilanasa (200 ppm, Xylanase 2 XP Conc, Dyadic) y 1,3-beta-glucanasa (200 ppm, Rohalase BX, AB Enzymes), seguido de centrifugacion (condiciones: 3000 rpm durante 10 min) de la vinaza entera, se observo una separacion del aceite mejorada en la vinaza fina. Las figuras 8 y 9 muestran los resultados de las vinazas finas despues de centrifugacion. La vinaza fina donde el macerado se trato con la composicion de enzimas que comprende como actividades principales actividad de xilanasa y 1,3-glucanasa (fig. 9) muestra una capa de aceite mucho mayor en el lfquido sobrenadante en comparacion con la vinaza fina donde el macerado no se trato con enzimas (fig. 8). La fig. 8 muestra que no se ha ajustado separacion de aceite. La fig. 9 muestra que se puede observar una clara separacion de aceite que forma una capa de aceite espesa.
Ejemplo 4
Ensayos de alimentacion
Con el siguiente ensayo en animales se mostro que se pueden cambiar los ingredientes de piensos caros, como la harina de soja, mafz o trigo, por DDGS, en especial DDGS que es modificado durante los procedimientos de produccion y metodos de acuerdo con la presente descripcion, y no produce ganancias de peso inferiores. El objetivo era mostrar que los DDGS tratados pueden sustituir la harina de soja y trigo sin efectos negativos en el crecimiento animal.
- Codornices como animales de ensayo alimentadas desde el dfa 1 - dfa 23
- Repeticiones de 10 jaulas con 2 animales para cada tratamiento
- Inclusion de DDGS en el pienso 20%
- El control positivo era dieta con trigo y harina de soja estandar sin DDGS
- Todas las relaciones de piensos se equilibraron para ser isonitrogenadas (cada pienso contiene la misma cantidad de CP) e isocaloricas (cada pienso contiene la misma cantidad de energfa metabolizada)
- Grupos de 3 animales con pienso normal, DDGS no tratados y DDGS optimizados enzimaticamente
- Parametros de rendimiento: ganancia de peso, relacion de conversion de pienso
Para los ensayos, se produjeron dostipos diferentes de DDGS:
a) DDGS que resultan de un tratamiento del mosto fermentado en la produccion de etanol de A) de la presente descripcion con una composicion de enzimas que comprende una xilanasa (200 ppm, Xylanase 2 XP Conc, Dyadic) y una 1,3-glucanasa (200 ppm, Rohalase BX, AB Enzymes) (DDGS-tratados)
b) DDGS producidos sin un tratamiento enzimatico del mosto fermentado (DDGS-blanco).
Como un control positivo se uso pienso para codornices estandar. La figura 10 muestra los resultados y la ganancia de peso de las codornices alimentadas con diferentes piensos. En la fase inicial (dfa 0-14) el pienso normal conduce a la mayor ganancia de peso. En la fase de crecimiento, el pienso con 20% de DDGS-tratados, condujo a la mayor ganancia de peso y supero a los otros dos piensos. Basandose en los datos del ensayo con animales, el pienso que contiene DDGS-tratados muestra que es claramente superior. Los DDGS-tratados se pueden incluir en el pienso de codornices en una concentracion de 20% sin efectos negativos en el rendimiento del crecimiento.
Ejemplo 5
Deshidratacion de la vinaza entera
Como se ha mencionado antes en la memoria descriptiva, una mejor deshidratacion de la vinaza entera da como resultado una torta humeda con una masa seca mayor. La ventaja aqu es el menor consumo de energfa durante el secado.
Para este ejemplo, se ensayo y determino la capacidad de deshidratacion de la vinaza entera durante la centrifugacion. Se ensayaron dos configuraciones diferentes. En el primer ensayo el macerado despues de fermentacion no se trato con enzimas (DDGS blanco), en el segundo ensayo el macerado se trato con la composicion de enzimas que comprendfa una xilanasa (200 ppm) y una 1,3-glucanasa (200 ppm) despues de la fermentacion (DDGS tratados).
Los ensayos se llevaron a cabo en una escala 301. Cada ensayo se llevo a cabo por duplicado. La concentracion de enzimas total anadida era 400 g/t de macerado. Despues de la destilacion el fermentador se dreno y la vinaza entera se centrifugo para obtener la vinaza fina y la torta humeda.
Fermentacion de mafz a etanol 301 con aplicacion de enzima y produccion de DDGS:
- mafz premolido < 2 mm de tamano de partfculas
- se mezclaron 10 kg de mafz con agua corriente a 35°C para alcanzar una concentracion de ~32% (p/p)
- el intervalo de pH era 5,6-6,0
- la temperatura se aumento a 90°C
- se anadieron 7 ml de alfa-amilasa (Liquozyme de Novozymes)
- se anadio 1%o de antiespumante (30 ml)
- incubacion durante 90 min a 90°C y 150 rpm
- se anadieron 12 ml de glucoamilasa (Novozymes Spirizyme Ultra)
- adicion de 300 ppm de ((NH4)2SO4) como fuente de nitrogeno
- inoculacion directa de levaduras secas
- ajuste del pH a 5,5
- fermentacion durante 62 h a 33°C y 150 rpm para obtener el macerado
- despues el macerado se trata con enzimas durante 6 horas a 37°C
- despues de 68 horas se separa el etanol por destilacion obteniendose un residuo llamado vinaza entera
- despues la vinaza entera se centrifuga a 3000 rpm dando la vinaza densa y vinaza fina
- concentracion de la vinaza fina a 50% de DM por evaporacion - La torta humeda se mezcla con la vinaza fina y se seca en un secador de tambor a aproximadamente 120°C hasta 90% de materia seca.
La figura 11 muestra la cantidad de vinaza fina (lfquido sobrenadante) en % de la vinaza entera, separada despues de centrifugacion a 3000 rpm durante 10 minutos. Aqrn se mostro que un tratamiento con la composicion de enzimas que comprende una xilanasa y una 1,3-glucanasa aumenta la capacidad de deshidratacion en 18,7%.
Ejemplo 6
Digestibilidad de DDGS in vitro
Los ensayos de digestibilidad in vitro (simulando la digestion en animales) son bien aceptados para predecir la digestibilidad de piensos.
Se ensayaron dos configuraciones diferentes. En el primer ensayo el macerado despues de fermentacion no se trato con enzimas (DDGS blanco), para el segundo ensayo el macerado se trato con la composicion de enzimas que comprendfa una xilanasa (200 ppm) y una 1,3-glucanasa (200 ppm) despues de la fermentacion (DDGS tratados). A continuacion se describe el ensayo de digestibilidad de protemas in vitro:
Se digieren muestras de DDGS con una solucion de pepsina/HCl: HCl 0,1 M con pepsina 20 mg/ml. (Pepsina de mucosa gastrica porcina, en polvo, 400-800 unidades/mg de protema, Sigma: P7l25). El lfquido sobrenadante se usa para la determinacion de los grupos amino libres por el ensayo de TNBS.
Digestion de protemas:
- Se mezclan 0,5 g de DDGS con 8 ml de HCl 0,1 M con pepsina 20 mg/ml.
- Despues de mezclar con un Vortexer las muestras se incuban durante 60 min a 40°C
- Despues de 60 min, la muestra se centrifuga durante 20 min a 4000 rpm.
- Despues de la centrifugacion se mide la protema en el lfquido sobrenadante
Determinacion de protemas con ensayo de TNBS:
El acido 2,4,6-trinitrobencenosulfonico (TNBSA o TNBS (acido 2,4,6-trinitrobencenosulfonico) es un reactivo de ensayo rapido y sensible para la determinacion de grupos amino libres. Las aminas primarias, tras la reaccion con el TNBSA, forman un derivado muy cromogenico, que se puede medir a 335 nm (vease la figura). Tambien se han obtenido mediciones cualitativas de aminas, sulfhidrilos o hidrazidas, 3 y mediciones cuantitativas de grupos amino libres de la L-lisina usando TNBSA.
Preparacion de tampones
Figure imgf000019_0001
Muestreo (en placa de 96 pocillos):
1. Para la curva de referencia
Glicina inicial 2500 pM, diluida 2x en SDS al 1%
Figure imgf000019_0002
2. Muestras, (diluidas 1000x) con SDS al 1%
Reaccion (placa de PCR de 96 pocillos):
1. 15 |il de la fila de glicina o muestras 90 |il del tampon n° 3 (vease la lista de tampones)
2. La placa de PCR se incuba en un ciclador de PCR, programa:
- 50°C durante 30 min
- 4°C durante 10 min
3. Se saca del ciclador de PCR, se mezcla adecuadamente
Medicion:
Se mezclan 50 |il de la etapa 3 anterior con 50 |il del tampon n° 2 (vease la lista de tampones), se mide la absorcion a 340 nm
Se ensayaron dos configuraciones diferentes. En el primer ensayo el macerado despues de fermentacion no se trato con enzimas (DDGS blanco), para el segundo ensayo el macerado se trato con la composicion de enzimas que comprendfa una xilanasa y una 1,3-glucanasa como actividades principales despues de la fermentacion (DDGS tratados).
Los DDGS tratados con enzima se produjeron con una composicion de enzimas que comprendfa una xilanasa y una 1,3-glucanasa como actividades principales con una concentracion total de 400 g/t de macerado. La figura 12 muestra los resultados.
La figura 12 muestra la liberacion de los grupos amino libres con diferentes sustratos. Los DDGS-tratados muestran una mayor concentracion de grupos amino libre en 20,4%, determinado por el ensayo de TNBS
Por lo tanto, se puede mostrar claramente que comparado con los DDGS-blanco la digestibilidad de protemas con pepsina/HCl aumenta para los DDGS-tratados. Esto da como resultado una mejora de la calidad nutricional de los DDGS como subproducto del procedimiento de fermentacion y por lo tanto es un pienso animal de alta calidad. Ejemplo 7
Solubilizacion de protemas en agua
Se ensayaron dos configuraciones diferentes. En el primer ensayo el macerado despues de fermentacion no se trato con enzimas (DDGS blanco), para el segundo ensayo el macerado se trato con la composicion de enzimas que comprendfa una xilanasa (200 ppm) y una 1,3-glucanasa (200 ppm) despues de la fermentacion (DDGS tratados). Para este ensayo se mezclaron 0,5 g de DDGS con 8 ml de agua destilada y se agitaron con un Vortexer. La solucion se incubo durante 60 min a 40°C. Despues de una etapa de centrifugacion (20 min, 4000 rpm, 4°C) se analizo la concentracion de protemas en el lfquido sobrenadante con el ensayo de TNBS (vease el ejemplo 6). En la figura 13 se muestra la liberacion de grupos amino libre de DDGS en agua. Los DDGS-tratados muestran un aumento de los grupos amino libres de 31,4%. La estructura de fibras del DDGS cambia y tambien son alteradas las paredes celulares de levaduras produciendo una mayor disponibilidad de protemas que pueden ser digeridas facilmente en el animal.
Este da como resultado una mejora de la calidad nutricional de los DDGS como subproducto de un procedimiento de fermentacion y por lo tanto un pienso animal de alta calidad.
Algunas realizaciones de la presente descripcion se refieren a:
A) Metodos para mejorar la calidad de los subproductos o residuos derivados de mosto fermentado que comprenden las etapas de: i) someter el mosto fermentado durante o despues de la fermentacion a una composicion que comprende una enzima o una mezcla de enzimas capaces de degradar uno o mas componentes del mosto fermentado, ii) separar el producto de fermentacion deseado, en donde
- el mosto fermentado puede derivar de un procedimiento de produccion de un producto de fermentacion lfquido. - el mosto fermentado puede derivar de un procedimiento de produccion de un producto de fermentacion que usa material que contiene azucar como materia prima.
- el mosto fermentado puede derivar de un procedimiento de produccion de un producto de fermentacion que usa material que contiene almidon como materia prima.
- la materia prima puede ser un cereal.
- la materia prima se puede seleccionar del grupo que consiste en mafz, trigo, cebada, triticale, mandioca, sorgo, centeno, patata o cualquier combinacion de los mismos.
- el producto de fermentacion lfquido puede ser un alcohol, preferiblemente etanol.
- la composicion puede comprender una enzima seleccionada del grupo que consiste en amilasa, tal como alfaamilasa, glucoamilasa, celulasa, beta-glucanasa, hemicelulasa, tal como xilanasa, pectinasa, mananasa y proteasa, o una mezcla de las mismas.
- la composicion puede comprender una mananasa.
- la composicion puede comprender una mananasa y una beta-glucanasa.
- el producto de fermentacion deseado se puede separar por destilacion.
B) Metodos para mejorar la calidad nutricional de un subproducto o residuo de un procedimiento de produccion de etanol fermentativo, que comprende las siguientes etapas:
i) Fermentacion de azucares fermentables con un microorganismo
ii) Someter el mosto fermentado a una composicion que comprende una enzima o una mezcla de enzimas despues del procedimiento de fermentacion
iii) Separacion del etanol
iv) Separacion del subproducto o residuo, en donde
- el subproducto o residuo se puede seleccionar del grupo que consiste en granos gastados de coccion, granos secos de destilena, solubles secos de destilena, granos secos de destilena con solubles, residuos de la industria de procesamiento de cereales, salvado de trigo, cascaras de soja, pulpa de cftricos, pulpa de remolacha, cascaras o vainas de arroz, bagazo, orujo de manzana, y mezclas de los mismos.
- la etapa iii) y etapa iv) se pueden llevar a cabo simultanea o secuencialmente.
- la composicion puede comprender una enzima seleccionada del grupo que consiste en amilasa, tal como alfaamilasa, glucoamilasa, celulasa, beta-glucanasa, hemicelulasa, tal como xilanasa, pectinasa, mananasa y proteasa, o una mezcla de las mismas.
- la composicion puede comprender una mananasa.
- la composicion puede comprender una mananasa y una beta-glucanasa.
C) Metodos de deshidratacion de la vinaza entera que comprenden las etapas de i) someter el mosto macerado a una o mas enzimas capaces de degradar uno o mas componentes del mosto macerado, ii) separar el etanol del mosto macerado, iii) separar la vinaza entera en una fraccion solida y una fraccion lfquida.
D) Metodos de produccion de etanol, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
i) Fermentacion de azucares fermentables con un microorganismo para producir etanol
ii) Someter el mosto fermentado a una composicion que comprende una enzima o una mezcla de enzimas despues del procedimiento de fermentacion
iii) Separacion del etanol, en donde
- el mosto fermentado se puede someter a la composicion de enzimas despues de la etapa de fermentacion y antes de la etapa de separacion.
- la etapa de separacion puede ser destilacion.
- la composicion puede comprender una enzima seleccionada del grupo que consiste en amilasa, tal como alfaamilasa, glucoamilasa, celulasa, beta-glucanasa, hemicelulasa, tal como xilanasa, pectinasa, mananasa y proteasa, o una mezcla de las mismas.
- la composicion pude comprender una mananasa.
- la composicion puede comprender una mananasa y una beta-glucanasa.
E) Metodos para mejorar la calidad y composicion nutricional de los subproductos o residuos derivados de azucares fermentables en un procedimiento de produccion de etanol, que comprenden las etapas de: i) someter el mosto fermentado a una composicion que comprende una enzima o una mezcla de enzimas capaces de degradar uno o mas componentes del mosto fermentado, ii) separar el etanol y los subproductos o residuos, en donde
- el mosto fermentado se puede someter a la composicion de enzimas despues de la etapa de fermentacion y antes de la etapa de separacion.
- la etapa de separacion puede ser destilacion.
- la composicion puede comprender una enzima seleccionada del grupo que consiste en amilasa, tal como alfaamilasa, glucoamilasa, celulasa, beta-glucanasa, hemicelulasa, tal como xilanasa, pectinasa, mananasa y proteasa, o una mezcla de las mismas.
- la composicion pude comprender una mananasa.
- la composicion puede comprender una mananasa y una beta-glucanasa.
- la fermentacion se puede llevar a cabo usando un microorganismo, tales como bacterias, levaduras u hongos. F) Metodos de deshidratacion de la vinaza entera que comprenden uno de los metodos mencionados antes y las etapas de i) someter la vinaza entera a una o mas enzimas capaces de degradar uno o mas componentes de la vinaza entera, ii) separar el material en una fraccion solida y una fraccion lfquida.
G) Uso de una hemicelulasa para la degradacion de los componentes del mosto fermentado en un procedimiento de produccion fermentativo.
H) Uso de xilanasa, amilasa, glucoamilasa, celulasa, hemicelulasa, pectinasa o proteasa, o una mezcla de las mismas, para la degradacion de los componentes del mosto fermentado en un procedimiento de produccion fermentativo.
I) Metodos para la fabricacion de una composicion de enzimas usada para tratar el mosto fermentado en un procedimiento de produccion fermentativo para mejorar la calidad nutricional de un subproducto o residuo y/o la eficacia de procedimiento, del procedimiento de produccion, que comprenden:
a) inocular en el subproducto o residuo al menos un hongo filamentoso;
b) fermentar el subproducto o residuo; y
c) separar al menos una enzima del subproducto o residuo fermentado, en donde
- el hongo filamentoso se puede seleccionar del grupo que consiste en Rhizopus, Aspergillus, Trichoderma, y cualquier combinacion de los mismos.
- el subproducto o residuo puede ser un subproducto fibroso seleccionado del grupo que consiste en granos gastados de coccion, granos secos de destilena, soluble seco de destilena, granos secos de destilena con solubles, granos humedos, y mezclas de los mismos.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para mejorar la calidad nutricional de subproductos o residuos derivados de material que contiene almidon en un procedimiento para producir etanol, que comprende las etapas de: i) someter el mosto fermentado despues de la fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa y una xilanasa, ii) separar el producto de fermentacion deseado por destilacion.
2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde la composicion de enzimas comprende ademas una 1,6-beta-glucanasa.
3. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el subproducto o residuo es un subproducto fibroso seleccionado del grupo que consiste en granos gastados de coccion, granos secos de destilena, soluble seco de destilena, granos secos de destilena con solubles, granos humedos y mezclas de los mismos.
4. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde el mosto fermentado deriva de un procedimiento de produccion de un producto de fermentacion que usa grano entero obtenido de cereales como materia prima, el producto de fermentacion es etanol, el etanol se separa por destilacion y el subproducto mejorado son granos secos de destilena con solubles (DDGS).
5. Un metodo de produccion de etanol a partir de material que contiene almidon, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
i) Convertir el material que contiene almidon en azucares fermentables
ii) Fermentacion de los azucares fermentables con un microorganismo en un mosto fermentado
iii) Someter el mosto fermentado despues del procedimiento de fermentacion a una composicion de enzimas que comprende una beta-1,3-glucanasa y una xilanasa, o una beta-1,3-glucanasa, una xilanasa y una 1,6-betaglucanasa
iv) Separacion del etanol en el mosto fermentado por destilacion
6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el material que contiene almidon se obtiene de cereales y/o tuberculos.
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