ES2689558T3

ES2689558T3 - Formulaciones, composiciones y metabolitos de Chromobacterium y sus usos

Info

Publication number: ES2689558T3
Application number: ES12842863.8T
Authority: ES
Inventors: Ratnakar Asolkar; James NAMNATH; Pamela Marrone
Original assignee: Marrone Bio Innovations Inc
Current assignee: Pro Farm Group Inc
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2018-11-14
Anticipated expiration: 2032-10-23
Also published as: CL2014001066A1; ZA201401782B; AU2012327216B2; CN103997895A; WO2013062977A1; KR102005592B1; AR088502A1; BR112014009140A2; CA2852531A1; BR112014009140A8; IL231388A0; US9259007B2; MX363097B; PL2770836T3; CA2852531C; US20160128339A1; CN103997895B; TW201322925A; NZ621971A; KR20140084235A

Abstract

Un método no terapéutico para modular una infestación por plagas, en donde dicha plaga se selecciona entre Acari, Anthomyidae, Triozidae, Tenebrionidae, Scarabaiedae, en una ubicación donde se desea la modulación, que comprende aplicar una cantidad de una composición obtenida de Chromobacterium subtsugae cepa Nov (NRRL B-30655), eficaz para modular dicha infestación.

Description

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DESCRIPCION

Formulaciones, composiciones y metabolitos de Chromobacterium y sus usos Campo técnico

Se proporciona un método para modular una infestación por plagas, en donde dicha plaga se selecciona entre Acari, Anthomyidae, Triozidae, Tenebrionidae, Scarabaiedae, en una ubicación donde se desea la modulación que comprende aplicar una cantidad de una composición obtenida de Chromobacterium subtsugae cepa Nov (NRRL B- 30655), eficaz para modular dicha infestación.

En el presente documento también se divulga el uso de composiciones o formulaciones que comprenden especies de Chromobacterium, filtrado, sobrenadante, extracto, compuesto con actividad plaguicida o metabolito procedente del mismo como acaricida e insecticida, en particular contra la infestación de una más plagas pertenecientes a las familias Acarina, Scarabeidae, Triozidae, Aphidae, Anthomyiidae o Tenebrionidae. Además, se proporcionan formulaciones de plaguicida biológico (también citadas como bioplaguicida), particularmente aquellas que comprenden especies deChromobacterium, filtrado, sobrenadante, extracto, metabolitos o compuestos con actividad plaguicida procedentes de los mismos, métodos para producirlos y métodos de uso para modular la infestación por plagas. Más específicamente, se proporcionan plaguicidas biológicos estabilizados que tienen una vida útil mejorada debido a que mantienen la uniformidad física y una actividad insecticida más duradera tras su uso debido a su mayor resistencia a la degradación cuando se exponen a la luz.

Antecedentes

Los productos naturales son sustancias producidas por microbios, plantas y otros organismos. Los productos microbianos naturales ofrecen una fuente abundante de diversidad química y existe un largo historial de uso de productos naturales con fines farmacéuticos. A pesar del énfasis en los productos naturales para agentes terapéuticos en seres humanos, donde más de un 50% proceden de productos naturales, solo un 11% de los plaguicidas proceden de fuentes naturales. No obstante, los plaguicidas de productos naturales tienen el potencial de desempeñar un papel importante para controlar plagas en granjas tanto convencionales como orgánicas. Los metabolitos secundarios producidos por microbios (bacterias, actinomicetos y hongos) proporcionan nuevos compuestos químicos que pueden usarse solos o en combinación con compuestos conocidos para controlar de manera eficaz plagas de insectos y para reducir el riesgo de desarrollo de resistencia. Existen varios ejemplos bien conocidos de productos microbianos naturales que son exitosos como insecticidas agrícolas (Thompson et al., 2000; Arena et al., 1995; Krieg et al. 1983).

El desarrollo de un plaguicida microbiano comienza con el aislamiento de un microbio en un cultivo puro. Después, continúa con la evaluación de su eficacia y espectro usando ensayos in vitro, in vivo o piloto a escala en un invernadero y en el campo. Al mismo tiempo, se aíslan e identifican los compuestos activos producidos por el microbio. Para la comercialización de un plaguicida microbiano, el microbio ha de producirse de manera económica mediante fermentación a escala industrial y se formula con aditivos biocompatibles y aprobados para aumentar la eficacia y maximizar la facilidad de aplicación, así como su estabilidad durante el almacenamiento en condiciones de campo.

El documento WO 2012/061082 A2 divulga composiciones bioactivas y metabolitos de Chromobacterium. El documento WO 97/15187 describe composiciones plaguicidas protegidas frente a la radiación ultravioleta. P. A. W. MARTIN ET AL. divulgan Chromobacterium subtsugae sp. nov., una betaproteobacteria tóxica para el escarabajo de la patata de Colorado y otras plagas de insecto. PHYLLIS A W MARTIN ET AL. divulgan la toxicidad de Chromobacterium subtsugae para la chinche verde del sur (Heteroptera: Pentatomidae) y para el gusano de la raíz del maíz (Coleoptera: Chrysomelidae).

Chromobacterium

En 2000, la Dra. Martin y sus colaboradores en la USDA aislaron una bacteria con pigmentación púrpura (PRAA4-1) de un suelo forestal en Maryland (Martin et al., 2007a). En la evaluación inicial, observaron que esta bacteria era tóxica para el escarabajo de la patata de Colorado y otras plagas de insectos (Martin et al., 2007b). Esta bacteria gramnegativa móvil se identificó como una nueva especie de Chromobacterium, Chromobacterium substsugae sp. nov (Martin et al., 2007c). Es una betaproteobacteria gramnegativa, móvil, aeróbica facultativa con flagelos polares. Las colonias que se forman a los 2-3 días en una placa de L-agar a 25°C tienen inicialmente un color crema, que vira gradualmente de violeta claro a oscuro durante las 24 horas posteriores. Las colonias de PRAA4-1 crecen bien en medio a base de peptona con un punto óptimo a 25°C, pH 6,5-8,0 y con NaCl al 0-1,5 % (p/v) (Martin et al., 2007a).

Desde el descubrimiento de C. substugae por Martin y sus colaboradores, se han aislado y caracterizado al menos tres nuevas especies de Chromobacteria; Young et al. (2008) aislaron una nueva especie de Chromobacterium, C. aquaticum, de muestras de agua de manantial en Taiwán y Kampfer et al. (2009) aislaron dos especies, C. piscinae y C. pseudoviolaceum, de muestras ambientales recogidas en Malasia.

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De todas las especies de Chromobacteria conocidas, C. violaceum, un saprofito gramnegativo del suelo y el agua. La información publicada acerca de los metabolitos secundarios producidos por Chromobacteria se basa únicamente en estudios en C. violaceum (véase, por ejemplo, Durán y Menck (2001) para una revisión exhaustiva de las perspectivas farmacológicas e industriales de C. violaceum). Normalmente se considera no patógena para seres humanos, sino un patógeno oportunista, en ocasiones ha sido el agente causante de septicemia e infecciones letales en seres humanos y animales. Se sabe que C. violaceum produce un pigmento púrpura, la violaceína, que es una molécula de bisindol generada por una fusión de dos moléculas de L-triptófano en presencia de oxígeno (Hoshino et al., 1987; Ryan y Drennan; 2009). La biosíntesis de la violaceína está regulada por detección de quórum, un mecanismo común que regula diversas rutas metabólicas secundarias diferentes en bacterias gramnegativas (McClean et al., 1997).

Otros metabolitos conocidos de C. violaceum recogidos por Durán y Menck (2001) incluyen cianuro de hidrógeno, ferrioxamina E, los glucopéptidos B-lactámicos SQ28.504 y SQ28.546, antibióticos, tales como aerocianidina, aerocarvina, 3,6-dihidroxi-indoxaceno y monobactam SB-26.180 y un depsipéptido antitumoral, FR901228. Según el artículo de revisión de Durán y Menck (2001), C. violaceum también produce compuestos de azúcar infrecuentes, tales como polisacáridos y lipopolisacáridos extracelulares.

La Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° US20120100236 también divulga compuestos que pueden obtenerse o proceden de especies de Chromobacterium, más particularmente, Chromobacterium substugae.

Ácaros y acaricidas

Tetranychus urticae (araña roja) es un miembro de la familia Tetranychidae. Las arañas rojas son quizá la plaga de ácaros más importante de las plantas ornamentales. También provocan un daño considerable en más de 180 especies de cultivos de invernadero y campo. Estos ácaros también se encuentran entre las plagas de artrópodos más difíciles de controlar y pueden desarrollar rápidamente resistencia a productos químicos (Stamps y Osborne, 2009, Osborne, Ehler y Nechols, 1999).

Los acaricidas son compuestos que eliminan a los ácaros (miticidas) y las garrapatas (ixodicidas). Esta clase de plaguicidas es extensa e incluye antibióticos, carbamatos, acaricidas de formamidina, piretroides, reguladores del crecimiento de ácaros y acaricidas organofosforados. Aparte de los plaguicidas químicos, pueden usarse para controlar a los ácaros tierra de diatomeas y ácidos grasos. Normalmente actúan alterando la cutícula, lo que deseca al ácaro. Además, para controlar a los ácaros se usan algunos aceites esenciales, tales como el aceite de menta. A pesar de la gran variedad de compuestos acaricidas conocidos, los ácaros siguen siendo un grave problema en la agricultura, debido al daño que causan en los cultivos. Pueden producir varias generaciones durante una estación, lo que facilita un rápido desarrollo de resistencia a los productos acaricidas usados. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevos productos plaguicidas con nuevos sitios diana y nuevos modos de acción.

Moscas domésticas

Musca domestica (moscas domésticas) son miembros de la familia Muscidae. Se considera que esta familia es un problema económico tanto a nivel doméstico como en todo el mundo. Otros miembros de la familia Muscidae incluyen la mosca de cara, la mosca del establo y la mosca paletera. Se consideran una molestia y son vectores para enfermedades en seres humanos y animales. Sus hábitats de deambulación y alimentación, sobre basura y excrementos y sobre los seres humanos y su comida las convierten en agentes ideales para transferir organismos causantes de enfermedades. Estas especies también pueden ser una plaga para animales y transmitirles enfermedades a través de heridas abiertas.

Moscas que se alimentan de plantas - Mosca de alas manchadas

La mosca de alas manchadas, Drosophila suzukii es un invasor reciente en las áreas de cultivo de fruta y vegetales en los Estados Unidos. Es mucho más destructiva que la conocida especie relacionada, Drosophila melanogaster y otras Drosophila debido a que D. suzukii puede alimentarse y dañar a frutos y vegetales intactos, mientras que otras Drosophila solo se alimentan de material vegetal en proceso de putrefacción.

Gusanos de las raíces

Los gusanos de las raíces de la familia Anthomyidae se alimentan de las raíces de varias plantas distintas. El gusano de la raíz del repollo afecta al repollo, la coliflor, el brécol y las coles de Bruselas. (A este grupo de vegetales también se le conoce como "cultivos de col"). También existen diferentes tipos de gusanos de las raíces que afectan a las zanahorias, cebollas y otros cultivos de hortalizas. Ya que los cultivos de coles son vegetales de estaciones frías, los gusanos de la raíz del repollo son mucho más prominentes en las zonas del norte de los Estados Unidos. Son difíciles de controlar, debido a que eclosionan y se alimentan bajo el suelo, por lo que solo se percibirá su presencia cuando se aprecie retraso en el crecimiento o follaje marchito.

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Pulgón verde del melocotonero

Myzus persicae, (pulgón verde del melocotonero) es un miembro de la familia Aphididae (véase el documento US20110054022). Tal como resulta evidente por su nombre común, los pulgones verdes del melocotonero son plagas de una gran variedad de frutales, vegetales y plantas ornamentales y tienen una presencia mundial. Estos insectos son particularmente dañinos, ya que no solo provocan un daño directo alimentándose de la savia del floema, sino que también son vectores potenciales para el virus de la viruela del ciruelo, el agente causante de la enfermedad de la Sharka, que provoca la deformación y decoloración de la fruta. Como resultado, los árboles infectados han de arrancarse de raíz. Se ha tratado de controlar estas plagas con diversos plaguicidas. Sin embargo, a menudo desarrollan resistencia.

Psílido de la patata

Bactericera cockerelli, (psílido de la patata) es un miembro de la familia Triozidae y es un agente causante de la enfermedad de la patata rayada por una infestación de bacterias gramnegativas. Aunque es nativo de Norteamérica, también se ha encontrado en Nueva Zelanda (
www.biosecurity.govt.nz/files/pests/potato-tomato-psyllid/psyillid- factsheet.pdf). El psílido de la patata normalmente cría en hospedadores de solanáceas (tales como los tomates y las patatas). Sin embargo, se han encontrado en otras plantas, así como en pimientos, chiles, berenjena, kumara, poroporo, tamarillo y estramonio.

Escarabajos del estiércol

Alphitobius diaperinus es una grave plaga en la industria de las aves de corral y es un miembro de la familia Tenebrionidae. La cepa de Bt PS86B1 tiene según se ha comunicado actividad contra Alphitobius (Patente de los Estados Unidos n.° 5.100.665 de Hickle et al.). Bt tenebrionis también puede tener actividad contra larvas de este escarabajo (Patente de los Estados Unidos n.° 5.244.660). Los escarabajos del estiércol y algunas especies más de coleópteros actúan como vectores para enfermedades causadas por protozoos, bacterias y virus en pollos y pavos, causando una pérdida económica significativa. Los escarabajos del estiércol actúan como un significativo reservorio para especies patógenas de Salmonella, incluyendo las variedades más patógenas, tales como S. enterica serotipo enteritidis. El problema es que las aves de corral contaminadas con organismos patógenos, tales como Salmonella, amenazan a la salud humana. Estos escarabajos habitan en el estiércol, madera, espuma de poliestireno, fibra de vidrio y paneles aislantes de poliestireno de los corrales. Las larvas y los escarabajos adultos prosperan tanto sobre las heces de las aves como en los granos que se usan como alimento para los pollos. Estas grandes poblaciones de escarabajos y sus diversos hábitats dentro de los corrales hacen que sea más difícil erradicar la Salmonella que portan. En medio de una fuerte infestación por el escarabajo del estiércol o antes de establecer una nueva población de pollos, ni la retirada frecuente de los desechos ni el espolvoreado con múltiples insecticidas químicos resultan completamente eficaces para controlar esta plaga.

Larvas y escarabajos

Se ha observado que las larvas, tales como las larvas blancas (Cyclocephala lurida), el escarabajo enmascarado del sur (Rhizotrogus majalis), las larvas del escarabajo japonés (Popillia japonica), las larvas de gorgojo de la vid negra (Otiorhynchus sulcatus), las larvas del escarabajo oriental (Anomala orientalis), miembros de la familia Scarabaeidae, infestan el césped y las hierbas de pasto. Se ha observado que los escarabajos adultos infestan plantas ornamentales y numerosos cultivos por todo el mundo. Se han probado diversos plaguicidas que incluyen plaguicidas químicos, nematodos (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.641.573) y Bacillus thuringiensis (véase la Patente de los Estados Unidos n.° 5.185.158), feromonas y repelentes naturales, tales como hierba gatera y cebollino.

Polihidroxialcanoatos (PHA)

El bioplástico se define como una forma de plástico sintetizada a partir de fuentes renovables, tales como almidón vegetal y especies microbianas. Algunos de los materiales plásticos degradables en desarrollo incluyen polihidroxialcanoato (PHA), polilactida, poliésteres alifáticos, polisacáridos y los copolímeros y/o las mezclas de estos. Los PHA, en particular, incluyen varios ésteres poliméricos, tales como polihidroxibutiratos, co-hidroxivaleratos de polihidroxibutirato (PHBV), co-hidroxihexanoato de polihidroxibutirato (PHBHx) y co-hidroxioctanoato de polihidroxibutirato (PHBO). El poli-ácido 3-hidroxibutírico (PHB) es el PHA microbiano natural más común. Los polihidroxialcanoatos son polímeros 100% biodegradables. Ya que tienen propiedades similares a las de diversos termoplásticos sintéticos, tales como el polipropileno, los PHA pueden usarse en su lugar. También se degradan totalmente en agua y dióxido de carbono en condiciones aerobias y en metano en condiciones anaerobias por los microorganismos del suelo, el agua lacustre, las aguas residuales y el agua marina. Dependiendo del número de átomos de carbono en la cadena, los PHA se han dividido en dos grupos: longitud de cadena corta (SCL), que consiste en 3-5 átomos de carbono y longitud de cadena media (MCL), que consiste en 6-14 átomos de carbono (Khanna S, Srivastava AK. 2005). Estas diferencias se deben principalmente a la especificidad de sustrato de las PHA sintasas que pueden aceptar 3HA de un cierto intervalo de átomos de carbono. El otro PHA bien conocido es el copolímero, poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) P(3HB-co-3HV), cuyo SCL está formado por unidades

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monoméricas de cuatro y cinco carbonos. La proporción de estas unidades monoméricas puede variar y esto afecta a las propiedades físicas del polímero, es decir, menos frágil a medida que aumenta la proporción de unidades de 3HV.

En algunas especies microbianas, la acumulación de PHA se produce durante la presencia de un exceso de carbono y una limitación de las fuentes de nitrógeno (Verlinden et al., 2007). Los PHA producidos en respuesta a condiciones estresantes sirven como moléculas de almacenamiento de energía que se usan cuando escasean las fuentes de energía convencionales (Solaiman y Ashby, 2005). Los polímeros plásticos se acumulan intracelularmente como gránulos de almacenamiento amorfos que refractan la luz en estos organismos (Mukhopadhyay et al., 2005). El PHB se sintetiza a partir de acetil-CoA usando tres etapas enzimáticas (Krans et al., 1997). Desde un punto de vista biotecnológico, esta capacidad de biodegradación de los bioplásticos los convierte en un sustituto deseable para los plásticos a base de petroquímicos, un contaminante ambiental (Lee, 1996). El aumento de la producción de bioplásticos puede reducir significativamente las emisiones de dióxido de carbono, recortar la generación de residuos plásticos y reducir el consumo de combustibles fósiles.

Los PHA pueden obtenerse mediante los tres métodos siguientes: biosíntesis por microorganismos, fotosíntesis por plantas transgénicas y biosíntesis in vitro usando enzimas adecuadas (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.455.999, documento WO9914313). En la mayoría de bacterias, las células sintetizan PHA en sustratos que limitan el crecimiento distintos de fuentes de carbono, tales como nitrógeno, fósforo u oxígeno.

La acumulación de PHA sirve como fuente tanto de carbono como de energía durante los periodos de escasez. El PHA también sirve como sumidero para reducir la energía y por tanto, podría considerarse como un regulador redox dentro de la célula. Los PHA también son útiles como compuestos estéreo regulares, que pueden servir como precursores químicos para la química sintética de compuestos ópticamente activos. Dichos compuestos se usan en particular como vehículos biodegradables para la dosificación a largo plazo de fármacos, medicinas, hormonas, insecticidas y herbicidas (Reddy, 2003). También se usan como materiales osteosintéticos en la estimulación del crecimiento óseo debido a sus propiedades piezoeléctricas, en placas óseas, suturas quirúrgicas y reemplazos de vasos sanguíneos (Schaefer et al., 2000). Además, se ha divulgado un método de producción de copolímeros mediante procesos biológicos usando diversas bacterias, por ejemplo, Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 (documento EP. 0431883A2) y Patente de los Estados Unidos n.° 7.455.999. El documento EP n.° 2236089A1 divulga usos de estos polímeros en implantes multizona para dispositivos de reparación ortopédica y dispositivos de fijación de tejidos blandos. El documento WO 91/00917A1 divulga un método para controlar y modificar un nuevo biopolímero de poliéster mediante la manipulación de la genética y la enzimología de síntesis de poliésteres de polihidroxibutirato (PHB) y polihidroxialcanoato (PHA) a nivel molecular en células procariotas y eucariotas, especialmente en plantas. El documento WO 2005/030482A1 divulga métodos y usos de materiales de empaquetado compostables. El documento WO2008/110541 divulga un método de estabilización de los polihidroxibutiratos frente a la degradación térmica.

Lignina

La lignina es un constituyente principal de la estructura leñosa de las plantas superiores. La lignina procesada se obtiene como subproducto de las reacciones de pulpado de la madera. Los productos de la lignina incluyen, por ejemplo, sulfonatos de lignina, ligninas alcalinas y oxiligninas que pueden obtenerse a partir de licores de desecho de sulfitos, sulfatos y álcalis (Snook, 1982, Handbook for Pulp & Paper Technologists, TAPPI, Atlanta).

Se ha observado que la lignina tiene diversos usos comerciales. Por ejemplo, la lignina alcalina soluble se ha usado como agente dispersante. La Patente de los Estados Unidos n.° 3.726.850 divulga el uso de un producto de lignina alcalino soluble tratado con ozono, que está esencialmente libre de azufre unido de manera orgánica, como agente dispersante para arcillas, colorantes, plaguicidas, negro de carbono y otros materiales. La Patente de los Estados Unidos n.° 4.666.522 divulga el uso de productos de lignosulfato para preparar emulsiones de ceras, aceites, grasas, asfaltos y mezclas de los mismos. Se ha comunicado que el acetato de lignina es útil para aplicaciones, tales como actuar como aglutinante en composiciones de tinta de imprenta a base de agua. (Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 4.612.051). La Patente de los Estados Unidos n.° 5.668.183 divulga el uso de productos de sulfonatos de lignina para dispersas sustancias liposolubles. Además, se ha divulgado la unión de complejos de lignina-plaguicida (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 3.813.236, la Patente de los Estados Unidos n.° 3.929.453, reeditada como Re. n.° 29.238, la Patente de los Estados Unidos n.° 4.381.194, la Publicación de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos n.° 20110015237, la Publicación de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos n.° 2010136132, la Publicación de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos n.° 20100278890, la Publicación de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos n.° 20080113920, la Publicación de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos n.° 2006247130, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.867.507, el documento WO2003/005816, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.994.266).

Benzoato de sodio

El benzoato de sodio se ha usado en diversas formulaciones como antimicrobiano en preparaciones de alimentos. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 6.599.514 divulga composiciones antifúngicas sinérgicas que

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comprenden un agente antifúngico y un aditivo alimentario, que produce un efecto sinérgico en la actividad antifúngica general de la composición antifúngica. Los aditivos alimentarios divulgados en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.599.514 incluyeron ácido sórbico y sorbatos, ácido benzoico y benzoatos, hidroxibenzoatos, dióxido de azufre y sulfitos, bifenilo y derivados, nitritos, nitratos, ácido láctico, lactatos, ácido cítrico y citratos, ácido tartárico y tartratos, ácido ortofosfórico y ortofosfatos, malatos, ácido adípico, ácido succínico, 1,4-heptonolactona, ácido nicotínico, citrato de triamonio, citrato férrico de amonio, EDTA disódico y cálcico, glicerol, di, tri y polifosfatos, ácidos grasos (E470), mono y diglicéridos de ácidos grasos (E4 71), éteres de mono y diglicéridos de ácidos grasos, carbonatos, gluconatos, cloro (E92S), hexametafosfato de sodio, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT) (E321), hidroquinona de t-butilo (THBQ), galato de propilo, heptonato de calcio, fitato de calcio, éter dietílico, EDTA, EDTA disódico de dihidrógeno, acetato de etilo, mono, di y triacetatos de glicerol, glicina, oxiestearina, propano-1,2-diol y heptonato de propan-2-ol y de sodio.

El benzoato de sodio también se ha usado en formulaciones plaguicidas. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 4.668.507 de SC Johnson enseña el uso de benzoato de sodio en plaguicidas contenidos en sistemas de suministro en aerosol en acero a presión donde el principal modo de estabilización es la inhibición de la corrosión. La Patente de los Estados Unidos n.° 5.620.678 divulga una formulación insecticida que incluye benzoato de sodio como inhibidor de la corrosión. La Patente de los Estados Unidos n.° 4.731.379 enseña composiciones insecticidas que contienen benzoato de sodio cuando se usan como champú para animales para eliminar pulgas. En esta patente, no se muestra que el uso del benzoato de sodio aumente la eficacia del insecticida o que estabilice el producto, sino que se cree que ayuda a curar las heridas del animal tratado. La Patente de los Estados Unidos n.° 5.017.620 enseña composiciones insecticidas que contienen benzoato de sodio y otros conservantes conocidos, cuando se usa como antimicrobiano, para estabilizar el producto durante su almacenamiento. La Patente de los Estados Unidos n.° 6.841.572 divulga una solución acuosa para tratar plantas vivas, cultivos, árboles, frutos antes de la cosecha, hortalizas, hojas, tallos, raíces y flores que tienen un pH de entre 4,0 y 6,5 y que consiste esencialmente en concentraciones eficaces desde el punto de vista fungicida y/o bactericida de uno o más compuestos conservantes seleccionados entre el grupo que consiste en ácido sórbico, benzoico y láctico; las sales de sodio, potasio, calcio y amonio del ácido benzoico, sórbico, hidroximetil glicínico, láctico y propiónico; y metil, etil, propil y butil parabeno, al menos un tensioactivo aniónico y opcionalmente un acidulante.

Sumario

Específicamente, se proporcionan composiciones y métodos para modular la infestación de una o más plagas de Acari (arácnidos), Anthomyidae, Triozidae, Tenebrionidae y/o Scarabaiedae que comprenden o usan un sobrenadante, filtrado y/o extracto y/o uno o más de los metabolitos de dicho sobrenadante, filtrado y/o extracto de una cepa de Chromobacterium sp., en particular, una cepa productora de violaceína, incluyendo, pero sin limitación, Chromobacterium piscinae, C. pseudoviolaceum, Chromobacterium substugae y más particularmente, una cepa de Chromobacterium substugae sp. nov. y aún más particularmente, una cepa de Chromobacterium substugae sp. nov. que tenga la características identificativas de NRRL B-30655 descritas en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.244.607.

También se divulgan en el presente documento infestaciones por plagas de Muscidae, Drosophilidae y/o Aphididae.

En una realización específica, la infestación por Acari es infestación por Tetranychidae (ácaros). En una realización más específica, la infestación por ácaros es infestación por Tetranychus urticae.

En otra realización específica, la infestación por plagas de insectos es una infestación por Musca sp., Myzus sp., Bactericera sp., Cyclocephala sp. o Alphitobius sp. Drosophila sp. Delia sp., Rhizotrogus sp. Popillia sp., Anomala sp. o Otiorhynchus sp. En una realización aún más específica, la infestación por plagas de insectos es por Delia radicum (gusano de la raíz del repollo), Myzus persicae (pulgón verde del melocotonero), Bactericera cockerelli (psílido de la patata), Alphitobius diaperinusxi (escarabajo del estiércol), Cyclocephala lurida (larva blanca), Rhizotrogus majalis (escarabajo enmascarado del sur), Popilla japonica (escarabajo japonés), Otiorhynchus sulcatus (gorgojo de la vid negra), Anomala orientalis (escarabajo oriental). También se divulga en el presente documento una infestación por plagas de insectos, en donde la infestación por plagas de insectos es por Musca domesitca (mosca doméstica) y/o Drosophila suzukii (mosca de alas manchadas).

También se divulga en el presente documento una combinación plaguicida que modula la infestación de al menos un arácnido y/o una o más plagas de insectos que pertenecen a las familias Acari, Anthomyidae, Drosophifidae, Muscidae, Aphididae, Triozidae, Tenebrionidae o Scarabaiedae que comprende, como componentes activos: (a) un sobrenadante, filtrado y/o extracto de Chromobacterium sp. y/o uno o más metabolitos de dicho sobrenadante, filtrado y/o extracto de Chromobacterium sp. y (b) otra sustancia plaguicida, particularmente, un acaricida y/o insecticida que pueda ser eficaz contra una o más plagas de insectos que pertenecen a las familias Acari,

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Anthomyidae, Drosophilidae, Muscidae, Aphididae, Triozidae, Tenebrionidae o Scarabaiedae, en donde (a) y (b) pueden estar opcionalmente presentes en cantidades sinérgicas. La sustancia plaguicida puede (a) proceder de un microorganismo; (b) ser un producto natural y/o (c) un plaguicida químico y en particular, un insecticida químico.

En una realización, el metabolito puede ser un compuesto que (a) tiene actividad pesticida; (b) tiene un peso molecular de aproximadamente 840-900 según se determina mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas (CL/EM) y (c) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un sistema disolvente de agua: acetonitrilo (CH3CN) con gradiente (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a un caudal de 0,5 ml/min y detección UV de 210 nm y (d) se obtiene de manera opcional a partir de una especie de Chromobacterium. En una realización el compuesto puede ser un péptido.

En una realización particular, el compuesto tiene 43 carbonos, siete metilos, diez carbonos metileno, doce metinos, 6 metinos olefínicos y ocho carbonos cuaternarios tal como se determina mediante RMN 13C. En más realizaciones particulares, el compuesto incluye a los compuestos "A", "B", "C", "D", representados como ##STR001#. ##STR001a##, ##STR001b##, ##STR001c## respectivamente.

En una realización específica, el compuesto "A": (a) se obtiene a partir de una especie de Chromobacterium; (b) es tóxico para una plaga; (c) tiene un peso molecular de aproximadamente 840-890 y más particularmente, 860 según se determina por cromatografía líquida/espectrometría de masas (CL/EM); (d) tiene valores de RMN 1H de 8 8,89, 8,44, 8,24, 8,23, 7,96, 7,63, 6,66, 5,42, 5,36, 5,31, 5,10, 4,13, 4,07, 4,05, 3,96, 3,95, 3,88, 3,77, 3,73, 3,51, 3,44,

3,17, 2,40, 2,27, 2,11, 2,08, 2,03, 2,01, 1,97, 1,95, 1,90, 1,81, 1,68, 1,63, 1,57, 1,53, 1,48, 1,43, 1,35, 1,24, 1,07,

1,02, 0,96, 0,89, 0,88, 0,87, 0,80 y tiene valores de RMN 13C de 8 173,62, 172,92, 172,25, 172,17, 171,66, 171,28,

170,45, 132,13, 130,04, 129,98, 129,69, 129,69, 125,48, 98,05, 70,11, 69,75, 68,30, 68,25, 64,34, 60,94, 54,54,

52,82, 49,72, 48,57, 45,68, 40,38, 39,90, 38,18, 36,60, 31,98, 31,62, 31,58, 29,53, 28,83, 27,78, 24,41, 23,06, 22,09, 20,56, 19,31, 18,78, 17,66, 15,80 (e) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, más específicamente de aproximadamente 9 minutos e incluso más específicamente de aproximadamente 9,08 min en una columna de HPLC C-18 de fase inversa (Phenomenex, Luna 5|j C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando un sistema disolvente de agua: acetonitrilo (CH3CN) con gradiente (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a un caudal de 0,5 ml/min caudal y detección UV de 210 nm.

En otra realización específica, el compuesto "B" tiene las siguientes características: (a) se obtiene a partir de una especie de Chromobacterium; (b) es tóxico para una plaga; (c) tiene un peso molecular de aproximadamente 850900 y más particularmente, 874 según se determina por cromatografía líquida/espectrometría de masas (CL/EM); (d) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, más específicamente de aproximadamente 9 minutos e incluso más específicamente de aproximadamente 9,54 min en una columna de HPLC C-18 de fase inversa (Phenomenex, Luna 5 j C18 (2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando un sistema disolvente de agua:acetonitrilo (CH3CN) con gradiente (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90% de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a un caudal de 0,5 ml/min caudal y detección UV de 210 nm.

El metabolito también puede ser un compuesto que incluye, pero sin limitación:

(A) un compuesto que tiene la estructura ##STR001##

imagen1

o una sal o estereoisómeros del mismo aceptables como pesticidas, donde R es -H, cadena de alquilo inferior que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos alquilo, resto arilalquilo o arilo, alquilo inferior sustituido; X es O, NH, Nr o S; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs, R9, R10, R11 son cada uno independientemente H, son iguales o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno,

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amino, amido, carboxilo, -C(O)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida o sulfu rilo;

(B) un compuesto que tiene la estructura ##STR001a##

imagen2

donde R es -H, cadena de alquilo inferior que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos alquilo, resto arilalquilo o arilo, alquilo inferior sustituido; X es O, NH, NR o S; R2a, R2b se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en-H, alquilo, alquilo inferior, alquilo sustituido y alquilo inferior sustituido; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 son cada uno independientemente H, son iguales o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(O)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida o sulfurilo.

(C) un compuesto que tiene la estructura ##STR001b##

imagen3

donde R es -H, cadena de alquilo inferior que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos alquilo, resto arilalquilo o arilo, alquilo inferior sustituido; X es O, NH, NR o S; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9; R2a, R2b se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en -H, alquilo, alquilo inferior, alquilo sustituido y alquilo inferior sustituido; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 son cada uno independientemente H, son iguales o

diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, - C(O)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida o sulfurilo.

(D) un compuesto que tiene la estructura ##STR001c##

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donde R es -H, cadena de alquilo inferior, resto arilalquilo o arilo, alquilo inferior sustituido que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos alquilo; X es O, nH, NR o S; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9; R2a, R2b se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en-H, alquilo, alquilo inferior, alquilo sustituido y alquilo inferior sustituido; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 son cada uno independientemente H, son iguales o

En una realización más particular, el metabolito es cromamida A (1).

imagen5

En una realización particular, el metabolito es el compuesto "C", tiene las siguientes características: (a) se obtiene a partir de una especie de Chromobacterium; (b) es tóxico para una o más plagas; (c) tiene un peso molecular de aproximadamente 325-360 y más particularmente, aproximadamente 343 según se determina mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas (CL/EM); (d) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente 8-14 minutos, más específicamente de aproximadamente 10 minutos e incluso más específicamente de aproximadamente 10,88 min en una columna de HPLC C-18 de fase inversa (Phenomenex, Luna 5 |j C18 (2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando un sistema disolvente de agua:acetonitrilo (CH3CN) con gradiente (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0 - 90% de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a un caudal de 0,5 ml/min caudal y detección UV de 210 nm. En una realización particular, el compuesto "C" puede ser violaceína (2), un compuesto conocido aislado anteriormente de Chromobacterium violaceum.

En otra realización, otro metabolito usado en las composiciones y métodos expuestos anteriormente, es el compuesto "D", tiene las siguientes características: (a) se obtiene a partir de una especie de Chromobacterium; (b) es tóxico para una plaga; (c) tiene un peso molecular de aproximadamente 315-350 y más particularmente, aproximadamente 327 según se determina mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas (CL/EM); (d) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, más específicamente de aproximadamente 12 minutos e incluso más específicamente de aproximadamente 12,69 min en una columna de HPLC C-18 de fase inversa (Phenomenex, Luna 5 j C18 (2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando un sistema disolvente de agua:acetonitrilo (CH3CN) con gradiente (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0 - 90% de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a un caudal de 0,5 ml/min caudal y detección UV de 210 nm. En una realización particular, el compuesto "D" puede denominarse deoxiviolaceína (3), un compuesto conocido aislado anteriormente de Chromobacterium violaceum.

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En otra realización específica, el compuesto puede tener la siguiente estructura

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donde R es -H, cadena de alquilo inferior que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos alquilo, resto arilalquilo o arilo, alquilo inferior sustituido, halógenos; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 son cada uno independientemente H, son iguales o diferentes, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(O)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida o sulfurilo.

También se proporciona un método para (1) control de infestación de plagas (por ejemplo, nemátodos, insectos, bacterias transmitidas por el suelo) en una planta que comprende aplicar a la planta y/o sus semillas y/o sustrato usado para hacer crecer dicha planta o un método para controlar una bacteria transmitida por el suelo en el suelo que comprende aplicar a la planta, las semillas y/o el sustrato una cantidad de

(I) un compuesto que

(a) tiene una actividad antimicrobiana y/o pesticida;

(b) tiene un peso molecular de aproximadamente 950 - 1450 según se determina mediante espetrómetro de masas por transformada de Fourier híbrido LTQ Orbitrap XL.

(c) tiene valores RMN 1H 5 de 5,22 (sext, 1H), 2,62 (dd, 1H), 2,53 (dd, 1H) y 1,31 (d, 3H) (d) tiene valores RMN 13C 5 de 169,2, 67,6, 40,9 y 19,8.

(d) comprende la estructura -(-O-CHCH3-CH2-CO-)n-, donde n=6-50

(e) se obtiene a partir de una especie de Chromobacterium

(II) opcionalmente otra sustancia pesticida

eficaz para controlar las infestaciones en dicha planta.

El compuesto (I) puede tener la estructura:

imagen7

En la que

X, es independientemente -O, -NR o -S, donde R es H o alquilo C1-C10; Y, es independientemente -O, -S; n = 6-50; R1, R2 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(O)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida o sulfurilo.

En particular, el compuesto (I) tiene la estructura:

imagen8

en la que n = 10-25.

En una realización más específica, (I) es un ácido alfa-butírico.

Además, se proporciona un método para obtener los compuestos expuestos anteriormente. El método comprende cultivar una cepa de Chromobacterium sp. en caldo celular completo en condiciones suficientes para producir el

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compuesto y aislar el compuesto producido del caldo celular completo.

En un aspecto relacionado, se divulgan métodos para estabilizar composiciones plaguicidas biológicas frente a la separación física y la pérdida de actividad a causa de la exposición a la luz del sol mediante la aplicación de un agente estabilizante a dicha composición plaguicida biológica, eficaz para estabilizar la composición de plaguicida biológico frente a la separación física y la pérdida de actividad a causa de la exposición a la luz del sol. También se proporcionan composiciones que comprenden dichos agentes. En una realización particular, la composición plaguicida comprende filtrado, sobrenadante, extracto o una sustancia con actividad plaguicida de Chromobacterium sp. procedente del mismo que puede estar presente en una cantidad de al menos aproximadamente el 0,5% y en particular, entre aproximadamente un 0,5% en peso basándose en el peso celular seco a aproximadamente un 30% en peso. El agente estabilizante puede ser, en una realización particular, una sal de ácido benzoico y/o una sal de lignina, en particular, sal de sulfonato de lignina, incluyendo, pero sin limitación, de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio y combinaciones de las mismas y puede estar presente en una cantidad de al menos aproximadamente el 2.5 % en peso y puede estar preferentemente presente en una cantidad de aproximadamente el 5%-15%.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación esquemática del esquema de purificación para obtener cromamida A (1), violaceína (2) y desoxiviolaceína (3) a partir de caldo de cultivo.

La figura 2 representa estructuras químicas para cromamida A (1), violaceína (2) y desoxiviolaceína (3).

La figura 3 muestra los resultados de los ensayos en discos foliares en TSSM con MBI-203. CFD representa células criodesecadas, que después se reconstituyeron en agua para representar una dosis de 1/2x, 1x y 2,5x del caldo celular completo.

La figura 4 muestra el número de huevos puestos por hembras de psílido de la patata expuestas a hojas de pimiento tratadas con MBI-203.

La figura 5 muestra el número medio de huevos ovipositados por hembras de psílido 5 días después de la exposición a discos foliares de pimiento tratados y no tratados con MBI-203.

La figura 6 muestra el número medio de ninfas y adultos de pulgón verde del melocotonero (GPA) en discos foliares tratados 24 horas después de la exposición de los adultos (P < 0,0001, LSD, a = 0,05). Las medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre sí. dH2O - control negativo, 203 al 10% v/v - control positivo.

La figura 7 muestra el número medio de descendientes (ninfas) de pulgón verde del melocotonero en discos foliares de pimiento tratados con MBI-203 3 días después de la exposición de los adultos (P < 0,0001, LSD, a = 0,05). Las medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre sí. dH2O - control negativo, Avid al 10% v/v - control positivo.

La figura 8 muestra el número medio de descendientes (ninfas) de pulgón verde del melocotonero en discos foliares de pimiento tratados con MBI-203 y DF2 (producto formulado de MBI-203) 3 días después de la exposición de los adultos (P < 0,0001, LSD, a = 0,05). Las medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre sí. dH2O - control negativo, Avid al 10% v/v - control positivo.

La figura 9 es una representación esquemática del esquema de purificación para violaceína (2) y oligo-(ácido p- hidroxibutírico) (4) a partir de caldo de cultivo.

La figura 10 representa los resultados de bioensayos nematicidas de diversas fracciones y del compuesto oligo- ácido hidroxibutírico (1).

Las figuras 11A y 11B muestran el número medio de pulgón verde del melocotonero, Myzus persicae (ninfas y adultos) en discos foliares de pimiento tratados, 24 horas después de la exposición. Las medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre sí (LSD, P < 0,0001, a = 0,05). 203 Me - Extracto en bruto de MBI- 203 en disolvente metanólico, Me - Metanol (tratamiento de blanco), 203, Ace - Extracto en bruto de MBI-203 en disolvente de acetona, Ace - Acetona (tratamiento de blanco), dH2O - control negativo, Avid al 10% - control positivo.

Las figuras 12A y 12B muestran el número medio de pulgón verde del melocotonero, Myzus persicae (ninfas y adultos) en discos foliares de pimiento tratados, 24 horas después de la exposición. Las medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre sí. Ace - solo acetona (tratamiento de blanco), DCM -, EA -, Lavado -, MeOH -, dH2O - control negativo, 203 al 10% - Patrón de MBI-203 (control positivo).

La figura 13 muestra el número medio de descendientes (ninfas) de pulgón verde del melocotonero en discos foliares de pimiento tratados 3 días después de la exposición de los adultos (P < 0,0018, LSD, a = 0,05). Las medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre sí. VL1 - violaceína a 0,5 pg/ml, VL2 - violaceína a 1,0 pg/ml, Acetona - tratamiento de blanco, dH2O - control negativo, Avid al 10% v/v - control positivo.

La figura 14 muestra el número medio de ninfas y adultos de pulgón verde del melocotonero (GPA) en discos foliares tratados 24 horas después de la exposición de los adultos (P < 0,0001, LSD, a = 0,05). Las medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre sí. dH2O - control negativo, 203 al 10% v/v - control positivo.

La figura 15 muestra el número medio de ninfas y adultos de pulgón verde del melocotonero (GPA) en discos foliares tratados 24 horas después de la exposición de los adultos (P < 0,0001, LSD, a = 0,05). Las medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre sí. dH2O - control negativo, 203 al 10% v/v - control positivo.

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La figura 16 muestra la mortalidad antes de la exposición al sol frente a después de la exposición al sol de MBI- 203 al 3%, puesto a cero para agua.

La figura 17 muestra MBI-203: pulverización en plantas de EP/EP + BenzNa para pulgón del repollo.

La figura 18 muestra la pulverización de MBI-203 EP +/- Benz Na en pulgones de la col, corregida.

La figura 19 muestra MBI-203: EP + CaCO3/BenzNa ANTES/DESPUÉS DE LA EXPOSICIÓN AL SOL, normalizado la control negativo.

La figura 20 muestra MBI-203 EP SDP después de la exposición al sol, ensayos de 3 y 6 días.

La figura 21 muestra MBI-203 EP con Benz Na + lignina en el sol, ensayo día 4, corregido.

La figura 22 muestra MBI-203 EP con Benz Na + lignina en el sol, porcentaje de pérdida de actividad, ensayo día 4.

La figura 23 muestra MBI-203: EP + lignina + sol, ensayo de CL en brécol, día 3.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Aunque las composiciones y métodos hasta ahora son susceptibles de diversas modificaciones y formas alternativas, en el presente documento se describirán en detalle realizaciones ejemplares. Debería entenderse, sin embargo, que no se pretende limitar la invención a las formas particulares divulgadas, sino al contrario, la invención ha de abarcar todas las modificaciones, equivalente y alternativas que se encuentren dentro del espíritu y el alcance de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que se incluye en el mismo cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado. También se incluyen intervalos menores. También se incluyen en el mismo los límites superior e inferior de estos intervalos menores, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Aunque también pueden usarse en la puesta en práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen los métodos y materiales preferidos.

Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a" y “el/la” incluyen las referencias en plural salvo que el contexto indique claramente otra cosa.

Como se define en el presente documento, "procedente de" significa aislado u obtenido directamente de una fuente particular o, como alternativa, que tiene características identificativas de una sustancia u organismo aislado u obtenido de una fuente particular.

Un "vehículo", como se define en el presente documento, es un material inerte, orgánico o inorgánico, con el que se mezcla o formula el principio activo para facilitar su aplicación a una planta u otro objeto que se vaya a tratar o su almacenamiento, transporte y/o manipulación.

El término "modular", como se define en el presente documento, se usa para referirse a alterar la cantidad de infestación por plaga o a la velocidad de dispersión de la infestación por plaga.

La expresión "infestación por plaga", como se define en el presente documento, es la presencia de una plaga en una cantidad que provoca un efecto dañino, incluyendo una enfermedad o infección en una población hospedadora o la aparición de una mala hierba no deseada en un sistema de crecimiento.

Un "plaguicida", como se define en el presente documento, es una sustancia procedente de un producto biológico o una sustancia química que aumenta la mortalidad o inhibe la velocidad de crecimiento de plagas de plantas e incluye, pero sin limitación, nematicidas, insecticidas, herbicidas, fungicidas para plantas, bactericidas para plantas y viricidas para plantas.

Un "plaguicida biológico", como se define en el presente documento, es un microorganismo con propiedades plaguicidas.

MÉTODOS DE PRODUCCIÓN

Como se ha señalado anteriormente, el plaguicida biológico puede comprender o proceder de un organismo que tiene las características identificativas de una especie de Chromobacterium, más particularmente, de un organismo que tiene las características identificativas de una cepa de Chromobacterium substugae, más particularmente, de una cepa de Chromobacterium substugae sp. nov. que puede tener las características identificativas de NRRL B- 30655 o como alternativa, de cualquier otro microorganismo. Los métodos comprenden cultivar estos organismos y obtener los compuestos y/o composiciones de la presente invención aislando estos compuestos del cultivo de estos

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organismos.

En particular, los organismos se cultivan en medio nutriente usando métodos conocidos en la técnica. Los organismos pueden cultivarse mediante cultivo en matraces de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo, pero sin limitación, a fermentaciones continuas, discontinuas, discontinuas alimentadas o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales, llevadas a cabo en un medio adecuado y en condiciones que permitan el crecimiento celular. El cultivo puede producirse en medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados pueden estar disponibles de fuentes comerciales o prepararse de acuerdo con composiciones publicadas.

Tras el cultivo, los compuestos y/o las composiciones de la presente invención pueden extraerse del caldo de cultivo. El extracto puede fraccionarse mediante cromatografía.

Composiciones

Las sustancias expuestas anteriormente usadas en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento pueden formularse de cualquier modo. Los ejemplos no limitantes de formulación incluyen, pero sin limitación, concentrados emulsionables (EC), polvos humectables (WP), líquidos solubles (SL), aerosoles, soluciones concentradas de volumen ultra-bajo (ULV), polvos solubles (SP), microencapsulación, gránulos dispersos en agua, fluidos (FL), microemulsiones (ME), nanoemulsiones (NE), etc. En cualquier formulación descrita en el presente documento, el porcentaje del principio activo se encuentra dentro de un intervalo del 0,01% al 99,99%.

Las composiciones pueden estar en forma de un líquido, gel o sólido. Las composiciones líquidas comprenden compuestos plaguicidas procedentes de una cepa de Chromobacterium, por ejemplo, una cepa que tiene las características identificativas de Chromobacterium substugae sp. Nov y más particularmente, que tienen las características identificativas de NRRL B-30655 (véase la Patente de los Estados Unidos n.° 7.244.607).

Puede prepararse una composición sólida suspendiendo un vehículo sólido en una solución de compuestos plaguicidas y secar la suspensión en condiciones suaves, tales como evaporación a temperatura ambiente o evaporación al vacío a 65°C o menor.

Una composición puede comprender compuestos encapsulados en gel procedentes de la cepa de Chromobacterium. Dichos materiales encapsulados en gel pueden prepararse mezclando un agente formador de gel (por ejemplo, gelatina, celulosa o lignina) con un cultivo o suspensión de Chromobacterium vivo o inactivado, o un filtrado sin células o una fracción celular de un cultivo o suspensión de Chromobacterium o un cultivo, célula o fracción celular secado por pulverización o congelación o en una solución de compuestos plaguicidas usados en el método de la invención; e inducir la formación de gel del agente.

La composición puede comprender adicionalmente un tensioactivo para usarlo con el fin de emulsificación, dispersión, humectación, dispersión, integración, control de la disgregación, estabilización de principios activos y mejora de la fluidez o inhibición del óxido. En una realización particular, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico y no fitotóxico que pertenece preferentemente a la lista 4B de inertes de la EPA. En otra realización particular, el tensioactivo no iónico es monolaurato de polioxietileno (20). La concentración de tensioactivos puede variar entre el 0,1-35% de la formulación total, siendo el intervalo preferido del 5-25%. La elección de agentes dispersantes y emulsionantes, tales como agentes dispersantes y emulsionantes no iónicos, aniónicos, anfóteros y catiónicos y la cantidad empleada se determina dependiendo de la naturaleza de la composición y la capacidad del agente para facilitar la dispersión de las composiciones de la presente invención.

La composición como se ha expuesto anteriormente también comprende un agente estabilizante, que estabiliza una composición plaguicida biológica frente a la separación física y la pérdida de actividad debido a la exposición a la luz solar. Este agente estabilizante puede ser una sal del ácido benzoico o una sal de sulfonato de lignina.

La composición expuesta anteriormente puede combinarse con otro microorganismo y/o plaguicida (por ejemplo, agente nematicida, fungicida, insecticida, antibiótico o antimicrobiano). El microorganismo puede incluir, pero sin limitación, un agente procedente de Bacillus sp., Pseudomonas sp., Brevabacillus sp., Lecanicillium sp., no- Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces sp, Burkholderia sp, Trichoderma sp, Gliocladium sp. Como alternativa, el agente puede ser un aceite natural o un producto oleoso que tiene actividad fungicida y/o insecticida (por ejemplo, aceite parafínico, aceite del árbol del té, aceite de hierba de limón, aceite de clavo, aceite de canela, aceite de cítrico, aceite de romero). Además, el plaguicida puede ser un agente antifúngico de un solo sitio que puede incluir, pero sin limitación, bencimidazol, un inhibidor de la desmetilación (DMI) (por ejemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolina, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inhibidor fuera de quinona, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarburo aromático, ácido cinámico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, bencenoide (xililalanina), un inhibidor de la desmetilación seleccionado entre el grupo que consiste en imidazol, piperazina, pirimidina y triazol (por ejemplo, bitertanol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, triadimefón, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol,

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fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol), miclobutanilo y un inhibidor fuera de quinona (por ejemplo, estrobilurina). La estrobilurina puede incluir, pero sin limitación, azoxiestrobina, kresoxima-metoilo o trofloxiestrobina. En otra realización particular más, el agente antifúngico es una quinona, por ejemplo, quinoxifeno (4-fluorofenil éter de 5,7-dicloro-4-quinolilo). El agente antifúngico también puede proceder de un extracto de Reynoutria.

El fungicida también puede ser un fungicida químico multisitio no inorgánico seleccionado entre el grupo que consiste en cloronitrilo, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquiltios, fenilpiridinamina, ciano-acetamida oxima.

La composición, como se ha indicado anteriormente, puede comprender además un insecticida. El insecticida puede incluir, pero sin limitación, avermectina, Bt, aceite de neem, espinosads, Burkholderdia sp. tal como se expone en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2011-0207604, hongos entomopatógenos, tales como Beauveria bassiana e insecticidas químicos, incluyendo, pero sin limitación, compuestos de organocloro, compuestos organofosforados, carbamatos, piretroides y neonicotinoides.

Como se ha señalado anteriormente, la composición puede comprender además un nematicida. Este nematicida puede incluir, pero sin limitación, avermectina, productos microbianos, tales como Biome (Bacillus firmus), Pasteuria spp y productos orgánicos, tales como saponinas.

Usos

Las composiciones, cultivos y sobrenadantes y compuestos plaguicidas expuestos anteriormente pueden usarse como plaguicidas. En particular, los compuestos o composiciones expuestos anteriormente pueden usarse como insecticidas, bactericidas (contra bacterias presentes en el suelo) y nematicidas. Específicamente, los nematodos que pueden controlarse usando el método expuesto anteriormente incluyen, pero sin limitación, nematodos parásitos, tales como nematodos formadores de agallas, quistes y lesiones, incluyendo, pero sin limitación, Meloidogyne sp. Tylenchorhynchus sp, Hoplolaimus sp., Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp., Heterodera sp., Globodera, sp., Trichodorus sp. Paratrichodorus sp., Xiphinema sp., y Criconema sp.; en particular, Meloidogyne incognita (nematodos agalladores), así como Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos del quiste de la patata); Heterodera glycines (nematodo del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nematodo del quiste de la remolacha); y Heterodera avenae (nematodo del quiste de los cereales).

Como se ha señalado anteriormente, los principios activos y las composiciones expuestas anteriormente también pueden aplicarse a ubicaciones que contienen Acari (arácnidos), tales como ácaros, incluyendo, pero sin limitación, Panonychus sp., tales como Panonychus citri (araña roja de los cítricos) y Panonychus ulmi (arañuela roja), Tetranychus sp., tales como Tetranychus kanzawi (araña de Kanzawa), Tetranychus urticae (araña roja), Tetranychus pacificus (araña del pacífico), Tetranychus turkestanii (araña de la fresa) y Tetranychus cinnabarinus (araña del carmín), Oligonychus sp., tales como Oligonychus panicae (araña parda del aguacate), Oligonychus perseae (ácaro persea), Oligonychus pratensis (ácaro de la hierba de los bancos) y Oligonychus coffeae, Aculus sp., tales como Aculus cornatus (araña plateada del melocotonero), Aculus fockeni (ácaro de la ciruela) y Aculus lycopersici (ácaro pardo del tomate), Eotetranychus sp., tales como Eotetranychus wilametti, Eotetranychus yumensis (araña de Yuma) y Eotetranychus sexmaculatis (araña de 6 puntos), Bryobia rubrioculus (ácaro pardo), Epitrimerus pyri (ácaro de la pera), Phytoptus pyri (ácaro de la ampolla de la hoja del peral), Acalitis essigi (ácaro rojo de las bayas), Polyphagotarsonemus latus (araña blanca), Eriophyes sheldoni (ácaro de los brotes de los cítricos), Brevipalpus lewisi (ácaro plano de los cítricos), Phylocoptruta oleivora (ácaro de la roya de los cítricos), Petrobia lateens (ácaro pardo del trigo), Oxyenus maxwelli (ácaro del olivo), Rhizoglyphus spp., Tyrophagus spp., Diptacus gigantorhyncus (ácaro cabezón de la ciruela) y Penthaleaa major (ácaro del grano del invierno), ácaro rojo del aguacate, ácaro plano, arañuela negra y roja del mango, araña enrolladora del borde de la hoja de la papaya, araña de los cítricos de Texas, ácaro rojo europeo, ácaro del eriné de la uva (ácaro ampollador), arañuela del pacífico, arañuela de Willamette; ácaro rosado del moho de los cítricos. Dichas ubicaciones pueden incluir, pero sin limitación, cultivos que se infestan por dichos ácaros u otros arácnidos (por ejemplo, afénidos). Dichas ubicaciones pueden incluir, pero sin limitación, cultivos que se infestan por dichos ácaros u otros arácnidos (por ejemplo, afénidos).

Los insectos fitopatógenos controlados mediante el método expuesto anteriormente incluyen, pero sin limitación, larvas de insectos no-Culicidae del orden Lepidoptera, por ejemplo, Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp., Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e Yponomeuta spp.; (b) Coleoptera, por

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ejemplo, Agriotes spp., Alphitobius sp., Anomola spp., por ejemplo, Anómala orientalis; Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Cyclocephala spp., por ejemplo, Cyclocephala lurida, Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Otiorhynchus sulcatus, Phlyctinus spp., Popillia spp., por ejemplo, Popilla japonica, Psylliodes spp., Rhizopertha spp., por ejemplo, Rhizotrogus majalis, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp.; (c) Orthoptera, por ejemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp. y Schistocerca spp.; (d) Isoptera, por ejemplo, Reticulitermes spp.; (e) Psocoptera, por ejemplo, Liposcelis spp.; (f) Anoplura, por ejemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. y Phylloxera spp.; (g) Mallophaga, por ejemplo, Damalinea spp. y Trichodectes spp.; (h) Thysanoptera, por ejemplo, Frankliniella spp., Hercinotnrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips aurantii; (i) Heteroptera, por ejemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp. y Tniatoma spp.; (j) Homoptera, por ejemplo, Aleurothrix usfloccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bactericera spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lecanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nephotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla spp., Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Triozidae spp., Trioza erytreae y Unaspis citri; (k) Hymenoptera, por ejemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp., Solenopsis spp. y Vespa spp.; (l) Diptera, por ejemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Delia spp., Delia radicum, Drosophila spp., por ejemplo, Drosophila suzukii; Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca spp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. y Tipula spp.; (m) Siphonaptera, por ejemplo, Ceratophyllus spp. y Xenopsylla cheopis; (n) del orden Thysanura, por ejemplo, Lepisma saccharina; (o) Hemiptera, por ejemplo, Bactericera sp., por ejemplo, Bactericera cockerelli,.

Los principios activos pueden aplicarse a ubicaciones que contienen plagas de Scarabaeidae. Estas incluyen, pero sin limitación, suelo, hierba y diversas plantas ornamentales, árboles y hortalizas.

Los principios activos y las composiciones expuestas anteriormente también pueden aplicarse a ubicaciones que contienen la plaga de Muscidae. Estos incluyen, pero sin limitación, ambientes interiores, basura, animales, vallas, corrales, graneros, salas de ordeño, corrales de parto, etc. que contienen animales (ganado bovino, cerdos, ovejas, caballos, etc.).

Los principios activos y las composiciones expuestas anteriormente pueden aplicarse además a ubicaciones que contienen los principios activos y composiciones que contienen una plaga de Tenebrionidae. Estas incluyen, pero sin limitación, granos, aves de corral y acorralamientos (vallas, corrales, graneros, salas de ordeño, corrales de parto, etc.) que contienen animales (ganado bovino, cerdos, ovejas, caballos, etc.).

Ejemplos

Las composiciones y métodos expuestos anteriormente se ilustrarán adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes. Los ejemplos son meramente ilustrativos de diversas realizaciones y no limitan la invención reivindicada en lo referente a los materiales, las condiciones, las relaciones en peso, los parámetros de procesos y similares citados en el presente documento.

También se divulga un ensayo que describe (anterior ejemplo 1): Extracción de cromamida, desoxiviolaceína y violaceína de Chromobacterium substugae

El siguiente procedimiento se usa para la purificación de compuestos extraídos del cultivo de Chromobacterium substugae:

Se extrajo el caldo de cultivo procedente de la fermentación de 10 l de C. substugae en caldo L con resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) agitando la suspensión celular con resina a 225 rpm durante dos horas a temperatura ambiente. La resina y la masa celular se recogen por filtración a través de estopilla y se lavan con agua DI para retirar las sales. La resina, la masa celular y la estopilla se empapan durante 2 h en acetona/metanol (50/50) tras lo que la acetona/metanol se filtra y seca al vacío usando un evaporador rotatorio para proporcionar el extracto en bruto. Después, se fracciona el extracto en bruto usando cromatografía de exclusión por tamaños Sephadex LH 20 (CH2CI2/cHsOH; 50/50) para dar 7 fracciones (figura 1). Después, se concentraron estas fracciones a sequedad usando un evaporador rotatorio y se evalúa en los residuos secos resultantes su actividad biológica usando un ensayo de alimentación con oruga de la col (Trichoplusia ni) o la gardama (Spodoptera exigua). Después, se sometió a las fracciones activas a HPLC en fase reversa (Spectra System P4000 (Thermo Scientific)) para proporcionar compuestos puros, que después se evaluaron en los bioensayos anteriormente mencionados para

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localizar/identificar los compuestos activos. Para confirmar la identidad del compuesto, se registraron datos espectroscópicos adicionales, tales como CL/EM y RMN.

La cromamida A (1) y el compuesto B se obtuvieron de las fracciones 1 y 2, respectivamente, mientras que la violaceína (2) y la desoxiviolaceína (3) se purificaron de la fracción 5 obtenida mediante cromatografía Sephadex LH 20.

Purificación de compuestos

La purificación de la cromamida A (1) se realizó usando una columna HPLC C-18 (Phenomenex, Luna 10 u C18 (2) 100 A, 250 x 10), sistema disolvente de agua:acetonitrilo con gradiente (0-10 min, 80-75% de CH3CN acuoso; 10-45 min, 75-60 % de CH3CN acuoso; 45-55 min, 60-50 % de CH3CN acuoso; 55-65 min, 50-100 % de CH3CN acuoso; 65-70 min, 100% CH3CN; 55-70 min, 0-80% de CH3CN acuoso) a un caudal de 2,5 ml/min y detección UV de 210 nm. El compuesto activo cromamida A (1), tiene un tiempo de retención de 23,19 min.

La purificación del compuesto B de la invención se realizó usando una columna de HPLC C-18 (Phenomenex, Luna 10 u C18 (2) 100 A, 250 x 10), sistema disolvente de agua:acetonitrilo con gradiente (0-10 min, 80-75% de CH3CN acuoso; 10-45 min, 75-60 % de CH3CN acuoso; 45-55 min, 60 - 50% de CH3CN acuoso; 55-65 min, 50-100% de CH3CN acuoso; 65-70 min, 100% CH3CN; 55-70 min, 0-80% de CH3CN acuoso) a un caudal de 2,5 ml/min y detección UV de 210 nm, el compuesto activo B, tiempo de retención 26,39 min.

La purificación de la violaceína (2) y la deoxiviolaceína (3) se realizó usando una columna de HPLC C-18 (Phenomenex, Luna 10 u C18 (2) 100 A, 250 x 10), sistema disolvente de agua:acetonitrilo con gradiente (0-10 min, 70-60 % de CH3CN acuoso; 10-40 min, 60 - 20% de CH3CN acuoso; 40-60 min, 20 - 0 % de CH3CN acuoso; 60-65 min, 100% CH3CN; 65-75 min, 0-70 % de CH3CN acuoso) a un caudal de 2,5 ml/min y detección UV de 210 nm, los compuestos activos de violaceína (2), tuvieron un tiempo de retención de 7,86 min y los de deoxiviolaceína (3) un tiempo de retención de 12,45 min.

Análisis de los compuestos por espectroscopia de masas

El análisis por espectrometría de masas de los picos activos se realiza en un instrumento de electronebulización (ESI) Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus usando los modos de ionización tanto positivo como negativo en un modo de escaneo completo (m/z 100-1500 Da) en un espectrómetro de masas LCQ DECA XPplus (Thermo Electron Corp., San José, CA). Instrumento de cromatografía líquida de alto rendimiento térmico (HPLC) equipado con detector Finnigan Surveyor PDA plus, autosampler plus, bomba MS y una columna 4,6 mm x 100 mm Luna C18 5 p 100 A (Phenomenex). El sistema disolvente consiste en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B). La fase móvil comienza al 10 % de disolvente B y se incrementa de forma lineal hasta el 100% de disolvente B durante 20 min y después se mantiene durante 4 min y finalmente se vuelve al 10% de disolvente B durante 3 min y se mantiene durante 3 min. El caudal es de 0,5 ml/min. El volumen de inyección fue de 10 pl y las muestras se mantienen a temperatura ambiente en un automuestreador. Los compuestos se analizaron mediante CL-EM utilizando la LC y cromatografía de fase inversa. El análisis por espectroscopía de masas de los presentes compuestos se realiza en las siguientes condiciones: El caudal del gas nitrógeno se fijó a 30 y 15 arb para el caudal del gas de impulsión y del aux/de barrido, respectivamente. La ionización por electronebulización se realizó con un voltaje de pulverización ajustado a 5000 V y un voltaje capilar a 35,0 V. La temperatura capilar se ajustó a 400 °C. Los datos se analizaron con un programa informático Xcalibur. La cromamida A (1) tiene una masa molecular de 860 en modo positivo de ionización. El cromatograma CL-EM para otro compuesto B activo sugiere una masa molecular de 874 en modo positivo de ionización. La violaceína (2) y la deoxiviolaceína (3) tenían masas moleculares de 313 y 327 respectivamente en modo positivo de ionización.

Análisis de los compuestos por espectroscopia de RMN

Los espectros RMN-RMN se midieron en un espectrómetro de gradiente de campo Bruker 600 MHz. La referencia se ajusta al patrón interno tetrametilsilano (TMS, 0,00 ppm). Los análisis de aminoácidos se llevaron a cabo en un analizador de aminoácidos Hitachi 8800.

Para la elucidación de la estructura, la cromamida A purificada con peso molecular 860 se volvió a analizar usando un instrumento de RMN de 600 MHz y tiene valores RMN 1H 8 a 8,89, 8,44, 8,24, 8,23, 7,96, 7,63, 6,66, 5,42, 5,36, 5,31, 5,10, 4,13, 4,07, 4,05, 3,96, 3,95, 3,88, 3,77, 3,73, 3,51, 3,44, 3,17, 2,40, 2,27, 2,11, 2,08, 2,03, 2,01, 1,97, 1,95, 1,90, 1,81, 1,68, 1,63, 1,57, 1,53, 1,48, 1,43, 1,35, 1,24, 1,07, 1,02, 0,96, 0,89, 0,88, 0,87, 0,80 (véase la FIG. 4) y tiene valores RMN 13C de 173,62, 172,92, 172,25, 172,17, 171,66, 171,28, 170,45, 132,13, 130,04, 129,98, 129,69, 129,69, 125,48, 98,05, 70,11, 69,75, 68,30, 68,25, 64,34, 60,94, 54,54, 52,82, 49,72, 48,57, 45,68, 40,38, 39,90, 38,18, 36,60, 31,98, 31,62, 31,58, 29,53, 28,83, 27,78, 24,41, 23,06, 22,09, 20,56, 19,31, 18,78, 17,66, 15,80. La cromamida A se aisló en forma de un sólido de color blanco, el cual se analizó para la fórmula molecular C43H68N6O12 (13 grados de insaturación), mediante espectrometría de masas de alta resolución ESI (obs. M+ m/z 861,5376, calc. M+ m/z 861,5343). Los datos espectrales de la RMN 1H de la cromamida A en DMSO-d6 exhibieron 68 señales de protones, en las que nueve protones [8h: 8,89, 8,44, 8,23, 8,22, 7,96, 7,64, 6,65, 5,10, 4,13], se

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asignaron como NH u OH debido a la falta de correlación de carbono en un análisis de RMN de correlación heteronuclear (HMQC). El espectro de RMN 13C, mostró siete señales de carbonilo [8c: 173,62, 172,92, 172,25, 172,17, 171,66, 171,28, 170,45] y en el espectro de RMN 1H, se observaron seis señales características de protones a-amino [8h: 4,07, 4,06, 3,96, 3,95, 3,88, 3,72] lo que demuestra que la cromamida A es un péptido.

La interpretación de los datos de la RMN 2D RMN condujo a la asignación de tres unidades de aminoácidos de los seis, una leucina (Leu), una valina (Val) y una glutamina (Gln). La presencia de estos aminoácidos se confirmó mediante los resultados de análisis de aminoácidos, que también mostraron la presencia de los anteriores tres aminoácidos. Otros análisis de DEPT y datos espectrales de la RMN 2D (COSY, HSQC y HMBC) establecieron la presencia de tres subestructuras I, II y III tal como se muestra a continuación.

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Las conexiones de las tres subestructuras en 1 se lograron mediante análisis de RMN HMBC rutinarios usando correlaciones entre el protón a-amino y/o el protón de amida secundaria y las resonancias de carbono carbonilo y la consideración de cambio químico. El enlace de C-9 de la subestructura I con C-10 de la subestructura II se estableció mediante correlaciones HMBC de CH3-40 [8h: 1,00] y el protón a-amino de alanina [8h: 3,42] con el carbono C-10 [8c: 70,11]. Esto se volvió a confirmar mediante correlación HMBC de hidroxilo en [8h: 5,10] con C-9 en [8c: 49,78]. El metileno en [8h: 3,50] de la subestructura III mostró una correlación HMBC de tres enlaces a C-19 [8c: 68,31] que conectó las subestructuras I y II. El carbono cuaternario en C-3 [8c: 98,09] se conectó con C-21 [8c: 64,40] a través de una correlación débil de H-21 [8h: 3,95] junto con sus valores de cambio químico para formar un sistema de anillo. Por último, el enlace de cierre del anillo se aseguró mediante una correlación HMBC de tres enlaces de H3-36 [8h: 1,43] a C-1 [8c: 172,17], lo que permitió asignar la estructura de la cromamida A (1).

El compuesto B con un peso molecular de 874 mostró datos similares de RMN y UV que sugieren que este compuesto B también pertenece a la clase de los péptidos.

La estructura de la violaceína (2) y la deoxiviolaceína (3) se asignaron por comparación de los datos de estos compuestos con los publicados en la bibliografía. Las estructuras de la cromamida A, la violaceína y la deoxiviolaceína son como se muestran en la figura 2.

Ejemplo 2: Análisis de aminoácidos de cromamida A

La cromamida A (0,05 mg) se hidrolizó usando hidrólisis en fase líquida (HCL 6N, fenol al 1%, 110°C, 24h, al vacío). Tras enfriar, se secó la mezcla de reacción y el producto hidrolizado se disolvió en tampón de dilución Norleu hasta un volumen de 1,0 ml. Se cargaron 50pl de la muestra en la columna de intercambio iónico para su análisis.

Para los patrones y la calibración, se usó la solución patrón de aminoácidos para hidrolizado de proteínas en el dispositivo Hitachi 8800 a base de Na (Sigma, A-9906) para determinar los factores de respuesta y de este modo calibrar el analizador Hitachi 8800 para todos los aminoácidos. Cada inyección contiene norleucina como patrón interno para permitir la corrección de los resultados respecto de variaciones en el volumen de la muestra y las variables de la cromatografía. El sistema utiliza tampones de Na de Pickerin, HCl de grado secuencial de Pierce (hidrólisis), una columna de intercambio iónico de Transgenomic y un método optimizado desarrollado por Molecular Structure Facility (MSF), UC Davis y se comunican los aminoácidos individuales presentes en la muestra. Se observó que los aminoácidos presentes en la muestra (cromamida A) eran Glx (glutamina/ácido glutámico), leu (leucina) y Val (valina).

Ejemplo 3: Efecto de Chromobacterium substugae (MBI-203) contra la araña roja-Plantas de leguminosas

Se mezcló MBI-203 criodesecado con agua destilada a diversas concentraciones de equivalente de caldo celular completo. Se rociaron plantas de leguminosas sin tratar, Phaseolus vulgaris, con MBI-203. Después, se tomaron discos foliares de las plantas rociadas y se colocaron en una placa de Petri como fuente de alimento para arañas rojas, Tetranychus urticae. Se colocaron 10 arañas en cada placa y se incubó a 24°C (75°F), 12:12 (L:D). Las evaluaciones de arañas vivas y muestras se registraron 1, 3 y 7 días después de la infestación. 1x CFD es material criodesecado reconstituido a concentraciones celulares de caldo celular completo (0,0103 g criodesecado/ml de dH2O). En la figura 3 se muestran los resultados.

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 4: Efecto de Chromobacterium substugae (MBI-203) contra la araña roja-Caléndula

Se infestó a plantas de caléndula, Tagetes erecta, con arañas rojas, Tetranychus urticae. Se aplicó producto formulado (MBI-203) o Chenopodium ambrosioides (comercializado como REQUIEM® por AgraQuest, Inc., Davis, CA) a plantas infestadas con intervalos de temperatura de aproximadamente 24-29°C (72-85°F). Para muestrear, se recogió una superficie foliar de 6 cm2 y se contó el número de ninfas e inmaduras vivas y muertas. En la tabla 1 se muestran los resultados.

Tabla 1: Comparación de MBI-203 con REQUIEM®


: Día 0 Día 3 Día 5 Día 7 Día 14

Tratamiento: Estadio Con vida Con vida Con vida Con vida Con vida

Sin tratar: ninfa 155 165 180 181 200

MBI-203 al 1%: ninfa 146 74 144 218 216

MBI-203 al 5%: ninfa 142 92,8 143 170 175

REQUIEM® (+): ninfa 142 145 147 158 153

Sin tratar: Adulto 48 60,8 75,3 77 115

MBI-203 al 1%: Adulto 61,3 84,3 94 88,8 105

MBI-203 al 5%: Adulto 35,5 72,3 93,8 113 111

REQUIEM® (+): Adulto 36,5 44 68 94,5 91,5

Ejemplo 5: Efecto de la exploración de Chromobacterium substugae (MBI-203) contra la araña roja (TSSM)- Judía verde

Se rociaron judías verdes infestadas con TSSM o TSSM resistentes a abamectina con diluciones al 0,5%, 1%, 2% y 4% v/v de MBI-203 formulado a aproximadamente 935 litros/hectárea (100 gal/acre). La mortalidad se evaluó 9 días después de la aplicación. En la tabla 2 se muestran los resultados.

Tabla 2: Efecto de MBI-203 en infestación por TSSM en judía verde

: TSSM susceptibles TSSM resistentes a abamectina

: % de reducción % de reducción

Concentración: Huevos Ninfas Adultos Huevos Ninfas Adultos

0,5%: 0 0 0 n/a n/a n/a

1%: 0 0 0 0 0 0

2%: 8 15 25 0 0 0

4%: 55 55 60 0 0 0

Ejemplo 6: Exploración de MBI-203 contra arañas rojas en la fresa

Se evaluó la eficacia de cinco compuestos tradicionales y los ingredientes de MBI-203 en el control de TSSM en trasplantes de fresa en campo en el Florida Gulf Coast Research and Education Center. Las plántulas se trasplantaron en el campo (día 0). Cada parcela de 3,8 m (12,5 pies) constaba de 20 plantas. Las parcelas se infestaron cuatro veces, desde el día 55 hasta el día 71 con 10 a 20 TSSM móviles por planta. Se replicaron diecisiete tratamientos de diversas tasas y pautas de aplicación de miticidas, algunos combinados con un adyuvante y un control no tratado cuatro veces en un diseño RCB. Los tratamientos se aplicaron usando un pulverizador manual con una varilla pulverizadora con una boquilla que contenía un centro a 45 grados y un disco del número cuatro. El pulverizador se presurizó con CO2, a 275 kPa (40 psi) y se calibró para suministrar 935 litros por hectárea (100 galones por acre). Las muestras se recogieron semanalmente desde el día 90 antes de la pulverización hasta 2 semanas después de la última aplicación de los tratamientos (día 154). Las muestras consistían en diez hojuelas seleccionadas al azar y se recogieron del estrato del primer tercio de las plantas. Se recogieron con un pincel TSSM móviles y sus huevos de las hojuelas en discos rotatorios adherentes y se contaron. No se observó fitotoxicidad. Los resultados se muestran en las tablas 3 y 4.

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. Un método no terapéutico para modular una infestación por plagas, en donde dicha plaga se selecciona entre Acari, Anthomyidae, Triozidae, Tenebrionidae, Scarabaiedae, en una ubicación donde se desea la modulación, que comprende

aplicar una cantidad de una composición obtenida de Chromobacterium subtsugae cepa Nov (NRRL B-30655), eficaz para modular dicha infestación.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la ubicación donde se desea la modulación es sobre una planta, semilla de planta o en el suelo.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho Acari es un ácaro.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho ácaro es Tetranychus sp.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha plaga se selecciona entre Bactericera sp., Cyclocephala sp., Alphitobius sp., Rhizotrogus sp. o Anomala sp.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha plaga se selecciona entre Bactericera cockerelli, Alphitobius diaperinusxi, Cyclocephala lurida, Rhizotrogus majalis o Anomala orientalis.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la plaga es una larva de un Scarabaiedae.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la composición comprende caldo celular completo, sobrenadante, filtrado o extracto obtenido de la cepa de Chromobacterium subtsugae Nov (NRRL B- 30655).
9. El método de la reivindicación 8, en donde el caldo celular completo, sobrenadante, filtrado o extracto comprende violaceína, desoxiviolaceína o cromamida A.

imagen1

imagen2

% de mortalidad

Mortalidad de TSSM en disco foliar con MBI-203

imagen3

Sin tratar Hi0,5x CFD CFD >2x CFD

Pylon (+]

medio de huevos puestos/4 hembras

imagen4

.° medio de huevos puestos

imagen5

medio de adultos y ninfas de GPA

imagen6

dH20 203 3% v/v 203 1% v/v 203 10% v/v

FIGURA 7

30 f

imagen7

dH20 MBI 203 Std 3% Avid 10% v/v v/v

N.° medio de ninfas

y

dH20

imagen8

MBI 203 Std

3% v/v

DF2 3% v/v Avid 10% v/v

imagen9

imagen10

N.° medio de adultos y ninfas de GPA

imagen11

FIGURA 11B

imagen12

,° medio de adultos y ninfas de GPA Zj N.° medio de adultos y ninfas de GPA

imagen13

ace dH20 DCM EA 203 10%

12B

14 a

imagen14

Ace dH20 Lavado MeOH 203 10%

medio de descendencia

imagen15

N.° medio de ninfas y adultos

30

imagen16

dH20 C. piscinae C. pseudoviol MBI203 Est. 10%

wwm

av

N,° medio de ninfas y adultos

imagen17

imagen18

FIGURA 17

MBI-203: pulverización en plantas para áfido de la col con EP/EP+BenzNa

imagen19

0 3 5 7

Días

imagen20

¡WffSSB

exposición

Pulverización en plantas de MBI-203 EP +/- Benz Na,

áridos de la col, corregido

100 90 f- 80 ...

60

SO ¡

40 i....

30
20 ......

w™EP + Benzoato de Na

Blanco de formulación

Avid

Días después de la infestación

FIGURA 19

MBI-203: EP + CaC03/Benz Na ANTES/DESPUES

DE EXPOSICION AL SOL, normalizado al control negativo

100

Día 4 antes

Día 4 después

de exposición al sol al 3 %

imagen21

Prueba con sol de MBI-203 EP SDP

V áridos de la col, muerte corregida

100 í

SSDia3

Solo pasta celular

pasta celular + lignina pasta celular + lignina pasta celular + Benz Na

pH 4,4

pH 4,4

pH 8,4

FIGURA 21

MBI-203 EP con Benz Na + lignina en el sol,

ensayo día 4, corregido

100

Sin sol

«s ce

+ al

Huí

w m ¡a

imagen22

FIGURA 23

MBI-203: EP + lignina + sol,

CL en brécol ensayo día 3

100

80 "t'"--"-

pq es O

+ ■§ :z

P 00

Ph S3 ) C

l -p

W ;

W — oo

W ;P oo

w ■-= oo

MBI-203 EP con Benz Na + lignina en el sol,

porcentaje de perdida de actividad, ensayo día 4

ce vi CT3 r=j ^ Ct3

C3 ^ CC cej

¡Z¡ ct

+ a-I

Oh CU CJj

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