ES2647764T3 - Diagnósticos de vacunación mejorados - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de determinación de la presencia o ausencia de un anticuerpo que se une específicamente a una proteína Erns del virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en un ensayo ELISA, competitivo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) incubar una muestra de suero de ganado en presencia de la proteína Erns del pestivirus de antilocapra americana a la cual los anticuerpos que reaccionan en cruzado con la proteína Erns del VDVB de tipo silvestre son capaces de unirse, en el que dicha muestra se incuba o bien antes de o bien simultáneamente con la etapa b); b) añadir dicha muestra incubada a una placa de ensayo recubierta con la proteína Erns del VDVB a la cual dicho anticuerpo a detectar se une específicamente; y c) detectar posteriormente en dicha muestra la presencia o ausencia de dicho anticuerpo
Description
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vacunados-proporciona un medio para evaluzar la historia de exposición del animal sujeto. Esta diferenciación puede lograrse a través de cualquier de los diversos procedimientos de diagnóstico, que incluyen pero no quedan limitados al ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), que puede ser competitivo, directo o indirecto, ensayo de flujo lateral, transferencia de Western, PCR, radioinmunoensayo, inmunoensayo de fase sólida (SPRIA), ensayo electroquimoluminiscente (ECL), inmunotransferencia, inmunoprecipitación e inmunotinción. Estos y otros procedimientos son fácilmente reconocidos y conocidos para un experto en la técnica.
Los pestivirus quiméricos descritos en el presente documentos pueden distinguirse de las cepas del VDVB de tipo silvestre en tanto su composición genómico y proteínas expresadas. Tal distinción puede permitir la discriminación entre animales vacunados e infectados. Por ejemplo, puede realizarse una determinación en cuanto a si un animal que resulta positivo en VDVB en determinados ensayos de laboratorio porta una cepa de VDVB de tipo salvaje o ha sido inmunizado con una vacuna de VDVB convencional o si ha sido administrado con un pestivirus quimérico o no está infectado.
Pueden emplearse una variedad de ensayos para realizar la determinación. Por ejemplo, el virus puede aislarse del animal que resulta positivo para la infección. Los ensayos a base de ácido nucleico pueden incluir, aunque no de forma limitativa, análisis por transferencia Southern o Northern, PCR y secuenciación. Como alternativa, pueden emplearse ensayos a base de proteínas. En los ensayos a base de proteína, las células o tejidos sospechosos de una infección pueden aislarse del animal que resulta positivo para el VDVB. Los extractos celulares pueden realizarse de tales células o tejidos y pueden ser sometidos a, por ejemplo, Transferencia Western, usando anticuerpos adecuados frente a proteínas virales que pueden identifican de forma distintiva la presencia de bien el pestivirus quimérico administrado en una vacuna o el VDVB de tipo silvestre.
El alcance y la naturaleza de las respuestas inmunes inducidas en el animal pueden evaluarse usando una variedad de técnicas. Por ejemplo, Se pueden recoger sueros a partir de animales inoculados y analizar para la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para el virus quimérico.
En la realización de tal evaluación, es crítico que los anticuerpos generados por el animal sean específicos para el antígeno de prueba en el ensayo y no reaccionen en cruzado con el mismo antígeno de otros pestivirus. No se esperaba que los anticuerpos que reconocen y se unen a la proteína Erns del pestivirus de antilocapra americana también se unieran a la proteína Erns presente en el VDVB de tipo silvestre. Sin embargo, las administraciones repetidas del pestivirus quimérico a ganado llevó ocasionalmente a la generación de anticuerpos que exhibían reactividad en cruzado limitada a la proteína Erns del VDVB de tipo silvestre. Estos anticuerpos reactivos en cruzado son capaces de unirse a la proteína Erns del VDVB de tipo silvestre unida a la placa (es decir, el antígeno de prueba), lo que condujo a resultados que sugerían la infección previa con VDVB de tipo silvestre o vacunación con una vacuna de VDVB convencional, es decir, un resultado positivo falso. Por lo tanto, existe una necesidad de mejorar la exactitud y especificidad del ensayo. Esto puede lograrse mediante la incubación de los sueros a partir de animales en la presencia de la proteína Erns de antilocapra americana. La proteína puede ser nativa -es decir, purificada a partir de pesivirus de antilocapra americana-o expresada de forma recombinante. La adición de la proteína Erns de antilocapra americana puede realizarse antes de la adición de los sueros a la(s) placa(s) de ensayo, o al mismo tiempo que se añaden los sueros a la(s) placa(s) de ensayo. Esto es eficaz en la retiración de anticuerpos reactivos en cruzado Erns, y da como resultado en ensayo más exacto y fiable.
Un kit para su uso en llevar a cabo el procedimiento de la presente invención puede comprender uno o más reactivos útiles para la detección de y diferenciación entre (1) un animal infectado por VDVB o uno inmunizado con una vacuna de VDVB convencional y (2) un animal administrado con un pestivirus quimérico. El kit puede incluir reactivos para analizar una muestra para la presencia del VDVB completo o polipéptidos del VDVB, epítopos o secuencias polinucleótidas que no están presentes en el pestivirus quimérico. Como alternativa, los kits de la presente invención pueden incluir reactivos para analizar una muestra para la presencia de un pestivirus quimérico o polipéptidos, epítopos o secuencias polinucleótidas que no están presentes en el VDVB de tipo silvestre. La presencia de virus, polipéptidos o secuancias polinucleótidas pueden determinarse usando anticuerpos, PCR, hibridación u otro procedimiento de detección conocido para aquellos expertos en la materia.
Otro kit para su uso en llevar a cabo el procedimiento de la presente invención puede proporcionar reactivos para la detección de anticuerpos frente a epítopos particulares. Los epítopos están o bien presentes en el pestivirus quimérico y no presentes en el VDVB de tipo silvestres o bien, de modo alternativo, presentes en el VDVB de tipo silvestres y no presentes en el pestivirus quimérico. Tales reactivos son útiles para el análisis de una muestra para la presencia de anticuerpos, y son fácilmente conocidos y disponibles para un experto habitual en la materia. La presencia de anticuerpos puede determinarse usando procedimientos de detección estándar conocidos por los expertos en la materia.
Los kits pueden incluir un conjunto de instrucciones impresas o una etiqueta que indique que el kit es útil para la detección y diferenciación de animales infectados por VDVB o vacunados de VDVB a partir de animales administrados con un pestivirus quimérico.
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Anticuerpo, Anticuerpos
Los anticuerpos pueden ser bien monoclonales, policlonales o recombinantes. Los anticuerpos pueden prepararse frente el inmunogen o una parte del mismo. Por ejemplo, un péptido sintético basado en la secuencia de aminoácido del inmunogen, o preparado de forma recombinante mediante técnicas de clonación o el producto de gen natural y/o partes del mismo puede aislarse y usarse como el inmunogen. Los inmunogenes pueden usarse para producir anticuerpos mediante tecnología de producción de anticuerpos estándar bien conocida para aquellos expertos en la materia, tal como se describe generalmente en Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Los fragmentos de anticuerpo también pueden prepararse a partir de los anticuerpos, e incluyen Fab, F(ab’)2, y Fv, mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
En la producción de anticuerpos, puede lograrse la detección del anticuerpo deseado mediante procedimientos estándar en inmunología conocida en la técnica. En general, tanto el ELISA como transferencia de Western son tipos de inmunoensayos que pueden usarse, y ambos son bien conocidos por los expertos en la materia. Pueden usarse tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales en los ensayos. El anticuerpo usado para unir la proteína Erns de VDVB puede enlazarse a un sustrato de soporte sólido. El anticuerpo puede conjugarse con un resto o etiqueta detectable. Los restos detectables contemplados para su uso en la presente invención pueden incluir, aunque no de forma limitativa, marcadores fluorescentes, metálicos, enzimáticos y radioactivos entre los que se incluye, aunque no de forma limitativa biotina, oro, ferritina, fosfatasa alcalina, galactosidasa b, peroxidasa, ureasa, fluoresceína, rodamina, tritio, 14C, y yodación. El anticuerpo conjugado con un resto detectable puede unirse a la proteína Erns de VDVB, como en el ensayo ELISA competitivo o puede unirse a anticuerpos de un animal que se une a la proteína Erns de VDVB, como en un ensayo ELISA indirecto.
En técnicas de ensayo de unión específica de conjugado de etiqueta, se combina una muestra del medio líquido a analizar con diversas composiciones de reactivo. Tales composiciones incluyen un conjugado de etiqueta que comprende un componente de unión incorporado con una etiqueta. El componente de unión en el conjugado participa con otros constituyentes, en caso de haberlos, de la composición de reactivo y el ligando en el medio sometido a ensayo para formar un sistema de reacción de unión que produce dos especies o formas del conjugado, por ejemplo, una especie enlazada (complejo de conjugado) y una especie libre. En las especies enlazadas, el componente de unión del conjugado se une mediante un compañero de unión correspondiente, mientras que en las especies libres, el componente de unión no está enlazado. La cantidad de analito es proporcional a la cantidad del enlace frente al conjugado no enlazado.
Descripción general del desarrollo del ensayo
El ganado al que se le ha administrado un pestivirus quimérico, en el que la proteína Erns del VDVB se reemplaza con la proteína Erns de un pestivirus de antilocapra americana, puede distinguirse de ganado infectado de forma natural con un VDVB de tipo silvestre o inmunizado con un VDVB convencional a través del uso de la invención que se describe en el presente documento. Ganado de diversas edades o bien no se trata o se le administra tres dosis de bien un pestivirus quimérico vivo o inactivado, o un VDVB vivo o inactivado, con aproximadamente tres semanas entre cada dosis. Las muestras de suero se recogen 2-3 semanas o después de cada administración, pero antes de la siguiente administración. Para diferenciar entre ganado que recibió el pestivirus quimérico o aquellos que no reciben tratamiento, frente a aquellos infectados por una cepa de campo (tipo silvestre) de VDVB o inmunizados con una vacuna de VDVB convencional, las muestras de suero se analizan a través de un ensayo de diagnóstico diferencial.
Para un ELISA competitivo, puede usarse VDVB de tipo silvestre o proteína Erns de pestivirus quimérico (derivado de forma natural, sintética o recombinante) como una fuente de antígeno en el ensayo. Si se usa la proteína Erns presente en el VDVB de tipo silvestre como el antígeno de prueba, una carencia de unión por el mAb específico de
Erns
del VDVB de tipo salvaje marcado indica la presencia de anticuerpos en el suero de ganado que se une el epítopo específico de VDVB de tipo silvestre, indicativo de una infección natural (tipo silvestre) o inmunización con una vacuna de VDVB convencional. Por el contrario, el suero de ganado al que se ha proporcionado pestivirus quimérico no contendrá anticuerpos que se unen a la proteína Erns del VDVB de tipo salvaje que reviste la placa. Por lo tanto, el mAb específico de Erns del VDVB de tipo salvaje marcado se unirá a la proteína enlazada y resulta en el desarrollo de color posterior.
En el ensayo anteriormente descrito, fue sorprendente que los anticuerpos que reconocen y se unen a la proteína Erns
del pestivirus de antilocapra americana también se unieran a la proteína Erns presente en el VDVB de tipo silvestre. Debido a la administración repetida del pestivirus quimérico a ganado resultó ocasionalmente en la generación de anticuerpos que exhibían reactividad en cruzado limitada a la proteína Erns del VDVB de tipo silvestre, lo que condujo a resultados que sugerían la infección previa con VDVB o vacunación con una vacuna de VDVB convencional, existía una necesidad de mejorar la exactitud y especificidad del ensayo.
Para un ELISA de competición mejorada, se incuban muestras de suero con proteína Erns de pestivirus de antilocapra americana expresada de forma recombinante bien antes de o bien de forma concurrente con la adición de suero de ganado a las placas de ensayo. Esto retira de forma eficaz anticuerpos que pueden unirse a la proteína
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Erns
de pestivirus de antilocapra americana, pero también han desarrollad reactividad en cruzado con proteína Erns del VDVB de tipo silvestre. Por lo tanto, el desarrollo de color en el ensayo indica que el animal o bien no ha sido tratado previamente a la exposición de VDVB o bien está vacunado con pestivirus quimérico, mientras que el no desarrollo de color indica que el animal se expuso a VDVB de tipo silvestre o vacunó con una vacuna de VDVB convencional.
La presente invención se ilustra además mediante, pero de ningún modo limitada a, los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Se construyó un baculovirus recombinante que expresa Erns BVDV-NADL. Una molécula de ADN que codificada una fusión genética de una parte de 3' del gen C del VDVB y la longitud completa del gen Erns se amplificó mediante PCR a partir de un plásmido que contiene la longitud completa de ADNc de BVDV-NADL con cebadores Oligo 250 (SEQ ID NO: 1; 5’-CACCATGAAAATAGTGCCCAAAGAATC-3’) y Oligo 252 (SEQ ID NO: 2; 5’-TTAAGCGTATGCTCCAAACCACGTC-3’). El producto PCR se clonó en pENTR™/D-TOPO (Invitrogen; Carlsbad, CA) y se transformó en One Shot® Competent de E. coli (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido recombinante se extrajo y el inserto se confirmó mediante secuenciación. El plásmido se denominó pENTR-Erns. La pENTR-Erns y el Sistema de Expresión de Baculovirus BaculoDirect™ (Invitrogen) se usaron para construir baculovirus recombinante que expresaba la proteína Erns de VDVB-NADL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se generó baculovirus recombinante que expresaba la proteína Erns de VDVB-NADL, se purificó por placa, se expandió y almacenó a tanto 4 ºC como a -80 °C. La expresión de la proteína Erns de VDVB-NADL en el baculovirus recombinante se confirmó mediante tinción inmunofluorescente y transferencias de Western usando MAb 15C5 específico de Erns de VDVB (Idexx Laboratories Inc.; Westbrook, ME).
La proteína Erns del pestivirus de antilocapra americana se expresó en el baculovirus usando una estrategia similar. La expresión de la proteína Erns de antilocapra americana se confirmó mediante tinción inmunofluorescente y transferencias de Western usando MAb (Invitrogen) anti-His (C-terminal).
Para la producción del antígeno ELISA, se infectaron células Sf21 o Sf9 en un cultivo de suspensión de 100 ml con materia de baculovirus recombinante en MOI de 0,2 a 5. Las células se recogieron después de 2 a 4 días de incubación a 27 ºC. Las células se centrifugaron a baja velocidad (aproximadamente 800 g) durante 10 min para recoger las células. Las células se sometieron a lisis con tampón de lisis/unión nativo (pH 8,0 50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol y 1 % de IGEPAL CA-630). La mezcla se pipeteó arriba y abajo para romper los grupos celulares y a continuación se congeló a -80 °C durante ≥ 1 hora. Después de descongelarla, la mezcla se clarificó mediante centrifugación a 8000 g durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante final, denominado lisato Erns de Baculo-Antilocapra americana, se alicuotó y almacenó a -80 °C.
En la realización del ensayo, las placas ELISA se revistieron durante la noche a 4 ºC con 100 μl/pocillo de MAb WB210 (Veterinary Laboratory Agency, Surrey, Reino Unido), que se une específicamente a la proteína Erns de VDVB de tipo 1, se diluyó a 1 ug/ml en tampón de carbonato/bicarbonato (pH 9,0). Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado PBST (PBS que contiene 0,05 % de Tween 20) y se incubó con tampón de bloqueo (PBST más 1 % de sal de sodio de caseína) a 37 °C durante 1 hora. Las placas se lavaron posteriormente tres veces con PBST, y se añadieron 100 μl de lisado Erns de Baculo-VDVB (diluido 1:1600 en PBS) a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Durante este periodo de incubación, se añadieron 60 μl de suero de ganado a 60 μl de diluyente de muestra que contenía tampón de bloqueo y una concentración pre-determinada de lisato Erns de Baculo-Antilocapra americana. Las mezclas de suero-diluyente se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Después de los tres lavados con PBST, las mezclas suero-diluyente se transfirieron a los pocillos de las placas ELISA. Múltiples pocillos se dejaron en blanco en cada placa, para servir como controles de 15C5-HRP no competitivos. Las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de tres lavados más con PBST, se añadieron 100 μl de conjugado de MAb 15C5-HRP (específico a Erns de VDVB; diluido en tampón de bloqueo) a cada pocillo a 37 ºC durante 1 hora. Después de tres lavados, se añadieron 100 μl de sustrato ABTS (KPL, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 -60 minutos para el desarrollo de color. La densidad óptica (DO) se midió a la longitud de onda de 405/490 nm. El porcentaje de inhibición de DO a partir del control de conjugado para cada muestra de suero se calcula mediante la siguiente fórmula:
% de inhibición = (DO de muestra) ÷ (Promedio de DO de Controles de 15C5-HRP) × 100 %.
Se vacunaron seis ganados seronegativos de VDVB por grupo de tratamiento con VDVB activado (cepa NADL), el pestivirus quimérico o sin vacuna (NTX). Las vacunaciones se realizaron en intervalos de tres semanas. Las muestras de suero se recogieron en cata punto de tiempo, antes de administrar las vacunas. Las muestras a continuación de analizaron en el ensayo anteriormente descrito.
Resultados
Los datos que se presentan en la Tabla 1 representan una comparación de respuestas serológicas de ganado administrado con antigenes experimentales y controles sin tratar. Los datos presentados se generaron usando el ensayo de diagnóstico original y el ensayo de diagnóstico mejorado, el cual se encuentra en la presente invención.
Las muestras de suero se recogieron después de la administración al ganado de dos dosis de VDVB inactivado o dos doses de pestivirus quimérico inactivado. Basándose en varias muestras positivas y negativas de VDVB conocidas, los valores de corte para positivo ("Pos"), negativo ("Neg") o dudoso ("+/-") se definieron como sigue:
<40% = Pos 40% -50% = +/> 50% = Neg
Tabla 1.
- ID animal
- Tratamiento % de inhibición
- Ensayo original (sin diluir)
- Ensayo mejorado (1:1)
- 1358
- NTX Neg Neg
- 1364
- NTX Neg Neg
- 1365
- NTX Neg Neg
- 1368
- NTX Neg Neg
- 1372
- NTX Neg Neg
- 1374
- NTX Neg Neg
- 1351
- VDVB (cepa NADL) Pos Neg
- 1352
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1354
- VDVB (cepa NADL) Pos Neg
- 1361
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1363
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1370
- VDVB (cepa NADL) Pos Neg
- 1355
- Pestivirus quimérico NA Neg
- 1357
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1359
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1360
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1366
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1369
- Pestivirus quimérico Pos Neg
Los datos que se presentan en la Tabla 2 representan una continuación del experimento descrito anteriormente para la Tabla 1. En este caso, las muestras de suero se recogieron tras la administración de una tercera dosis de o bien el 10 VDVB inactivado o el pestivirus quimérico inactivado.
Tabla 2.
- ID animal
- Tratamiento % de inhibición
- Ensayo original (sin diluir)
- Ensayo mejorado (1:1)
- 1358
- NTX Neg Neg
- 1364
- NTX Neg Neg
- 1365
- NTX Neg Neg
- 1368
- NTX Neg Neg
- 1372
- NTX Neg Neg
- 1374
- NTX Neg Neg
- 1351
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
(continuación)
- ID animal
- Tratamiento % de inhibición
- Ensayo original (sin diluir)
- Ensayo mejorado (1:1)
- 1352
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1354
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1361
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1363
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1370
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1355
- Pestivirus quimérico Pos Neg
- 1357
- Pestivirus quimérico Pos Neg
- 1359
- Pestivirus quimérico Pos Neg
- 1360
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1366
- Pestivirus quimérico +/- Neg
- 1369
- Pestivirus quimérico Pos Neg
Los datos que se presentan en la Tabla 3, generados usando el ensayo DIVA Erns original y el ensayo DIVA Erns mejorado, representa una comparación de respuestas serológicas en ganado administrado con tres dosis de bien un VDVB atenuado vivo o un pestivirus quimérico vivo.
Tabla 3.
- ID animal
- Tratamiento % de inhibición
- Ensayo original (sin diluir)
- Ensayo mejorado (1:1)
- 5688
- NTX Neg Neg
- 5699
- NTX Neg Neg
- 5700
- NTX Neg Neg
- 5701
- NTX Neg Neg
- 5706
- NTX Neg Neg
- 5709
- NTX Neg Neg
- 1351
- VDVB (cepa NADL) Pos Neg
- 1352
- VDVB (cepa NADL) Pos Neg
- 1354
- VDVB (cepa NADL) Pos Neg
- 1361
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1363
- VDVB (cepa NADL) Pos Pos
- 1370
- VDVB (cepa NADL) Pos Neg
- 1355
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1357
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1359
- Pestivirus quimérico Pos Neg
- 1360
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1366
- Pestivirus quimérico Neg Neg
- 1369
- Pestivirus quimérico Neg Neg
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