ES2647316T3 - Uso de melatonina para tratar y/o prevenir mucositis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende melatonina o un derivado de la misma en una proporción del 2,5% al 5% p/v para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis. La mucositis preferiblemente está causada por radioterapia y/o quimioterapia y se refiere preferiblemente a mucositis oral.

Description

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DESCRIPCION

Uso de melatonina para tratar y/o prevenir mucositis

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) o sus derivados en una concentración del 2,5% al 5% peso/volumen (p/v) para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis. Preferentemente la mucositis está causada por radioterapia y/o quimioterapia. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la medicina.

Estado de la técnica

El tratamiento de los tumores malignos con radioterapia o quimioterapia, o la asociación de ambas, es cada vez más efectivo, pero se asocia a efectos secundarios a corto y largo plazo. Entre estos efectos secundarios se encuentran los trastornos en la función e integridad de la mucosa bucal. Las consecuencias incluyen ulceración grave (mucositis) y sobreinfección fúngica de la boca (candidiasis, estomatomicosis). Estas complicaciones inducidas por la enfermedad y sus tratamientos, conllevan dolor en la deglución, disfagia, desnutrición, retrasos en la administración de quimioterapia, interrupciones del esquema de radioterapia, pérdida de la efectividad de los tratamientos oncológicos, estancias hospitalarias prolongadas, costes elevados y, en algunos pacientes, infecciones potencialmente letales (septicemia).

La mucositis es una reacción inflamatoria que afecta a todo el aparato digestivo, desde la boca al ano, y es uno de los principales efectos adversos de la quimioterapia y/o radioterapia y de los trasplantes de médula ósea. La mucositis también puede estar causada por agentes químicos tales como corticoides, fármacos inmunosupresores (azatioprina, ciclosporina A), fármacos xerostomizantes, ansiolíticos, antidepresivos, antihistamínicos, estimulantes simpaticomiméticos, antiparkinsonianos, antipsicóticos, tratamientos gingivales, hidantoínas o antibióticos de amplio espectro.

La mucositis oral (u oromucositis) inducida por radiaciones ionizantes (también denominada, mucosistis oral radioinducida) y por agentes quimioterápicos constituye actualmente uno de los principales problemas de la terapia de los pacientes con cáncer. Un 40% de los pacientes que reciben quimioterapia y/o radioterapia, y hasta un 76% de los pacientes trasplantados con médula ósea, desarrollan problemas bucales, siendo los más frecuentes: mucositis, infección local, dolor y hemorragia. En los pacientes con cáncer de cabeza y cuello, el 97% desarrolla algún grado de mucositis, y el 100% de los sometidos a radioterapia fraccionada durante un tiempo prolongado también la desarrollan (Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003, 66:253-262). El daño producido por las radiaciones ionizantes es debido a mecanismos directos e indirectos. Los efectos directos se deben a la acción mutagénica de la radiación en el ácido desoxirribonucleico (ADN), mientras que los mecanismos indirectos (aproximadamente el 70% de tales mecanismos) son debidos al efecto de la radiación sobre las moléculas de agua dando lugar a la formación de radicales libres (Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003, 66:253-262).

La mucositis se clasifica, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), en diferentes grados atendiendo a la sintomatología. Grado 0: normalidad; grado 1: eritema generalizado, mucosa rosada no dolorosa y con abundante saliva, voz normal; grado 2: eritema, úlceras poco extensas, se mantiene la deglución de sólidos; grado 3: eritema, edema o úlceras extensas, el paciente sólo puede deglutir líquidos, dolor y dificultad para hablar; grado 4: úlceras muy extensas, encías sangrantes, infecciones, no hay saliva, dolor muy intenso, soporte enteral o parenteral.

La mucositis aparece como consecuencia de una serie de sucesos biológicos que empiezan en la submucosa y progresan hacia el epitelio y son comunes para las mucositis de distintas etiologías. En radioterapia y quimioterapia se ha descrito que en una primera fase hay un aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y daño al ADN. Se activan factores de transcripción como el factor nuclear kappa-B (NF-kB). Hay un aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias, incluidas la interleuquina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), que provocan apoptosis y daño celular. Esta reacción inflamatoria produce daño en la mucosa con la consecuente aparición de úlceras. Estas células van a ser colonizadas por bacterias y se activan macrófagos que producen más citoquinas responsables de todo el daño tisular. En todo este proceso hay un gran aumento de radicales libres que contribuyen a incrementar el proceso inflamatorio y el daño celular. En una segunda fase, la radioterapia y/o la quimioterapia inhiben la replicación de las células epiteliales disminuyendo la renovación celular. En una tercera fase la colonización bacteriana y la superficie ulcerada sigue incrementándose, facilitando la aparición de una infección sistémica (Volpato LE et al. Mol Cancer Ther 2007, 6:3122-3130). La mucositis es una patología inflamatoria que no responde al tratamiento con los antiinflamatorios conocidos. La mucositis es un proceso en el cual podría intervenir algún mecanismo bioquímico diferente al resto de los procesos inflamatorios, tal como la ruta del inflamasoma (Escames G, et al. Hum Genet, Julio, 2011, DOI 10.1007/s00439-011-1057). En la actualidad no hay tratamiento que provoque una reversión total de la mucositis o que prevenga totalmente su aparición.

Con el fin de tratar y prevenir la mucositis se han utilizado una gran variedad de terapias hasta el momento sin resultados de reversión total de la mucositis, por ejemplo, se ha descrito el tratamiento con aciclovir, bencidamina, beta-caroteno, fosfato de calcio, enjuagues con alopurinol, aloe vera, clorhexidina, manzanilla, etopósido, ácido

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folínico, glutamina, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), nistatina, misonidazol, povidona, pilocarpina, hematoxifilina, prednisona o sucralfato (Worthington HV et al. Cochrane Database Syst Rev. Octubre de 2007,17;(4) DOI: 10.1002/14651858.CD000978.pub3; Clarkson JE et al., Cochrane Database Syst Rev. Agosto de 2010, 4;(8)), DOI: 10.1002/14651858.CD001973.pub4.

En consecuencia, existe la necesidad de una herramienta que permita la reversión y la prevención total de la mucositis, concretamente en pacientes sometidos a radioterapia y/o quimioterapia.

Descripción de la invención

La presente invención describe una composición en gel que comprende melatonina o un derivado de la misma a una concentración del 2,5 al 5% p/v para uso en el tratamiento y/o prevención de la mucositis, en donde dicha composición en gel se va a administrar por vía tópica en la superficie de la mucosa bucal.

Se muestran resultados in vivo de protección de la mucosa bucal contra el daño producido por radioterapia o quimioterapia. La composición en gel de la invención es útil para proteger la mucosa bucal, así como la mucosa gastrointestinal. La presente invención demuestra que concentraciones inferiores a las descritas en la composición de la invención no son capaces de revertir por completo la mucositis, mientras que concentraciones iguales o superiores al 3% p/v son capaces de tratar y de revertir por completo la mucositis causada por radiaciones ionizantes. Se muestran resultados de distintas vías de administración, siendo la vía tópica la que ofrece mejor protección a la mucositis oral.

Basado en lo que se describe, la presente invención se refiere al uso de una composición en gel que comprende melatonina o un derivado de la misma a una concentración del 2,5% al 5% p/v para uso en el tratamiento y/o prevención de la mucositis, en donde dicha composición en gel se va a administrar por vía tópica a la superficie de la mucosa bucal. En adelante se denominará la “composición de la invención”.

Se entiende por “concentración del 2,5 al 5% p/v” que la composición comprende entre 2,5 a 5 gramos de melatonina o un derivado de la misma en 100 ml de composición final. La abreviatura “p/v” se refiere a peso/volumen o masa/volumen (m/v).

Una realización preferida se refiere a la composición en gel para uso en donde la concentración de melatonina o de un derivado de la misma es del 3% p/v. Por lo tanto, dicha composición preferida se refiere a una composición que comprende 3 gramos de melatonina o un derivado de la misma en 100 ml de volumen total de la composición. En adelante se denominará la “composición preferida de la invención”.

Se entiende por “melatonina o un derivado de la misma” cualquier compuesto comprendido dentro de la fórmula general I, así como las sales, solvatos o profármacos, farmacéuticamente aceptables del mismo que son útiles para el tratamiento y/o prevención de la mucositis.

Los compuestos de fórmula general I se refieren a:

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donde:

“n” es un número entero entre 1 y 4;

R1 y R3 son, iguales o diferente, un grupo alquilo (C1-C4) lineal o ramificado; y

R2 es hidrógeno, alquilo C1-C4, lineal o ramificado, un grupo -C(=O)O-Ra o un grupo -C(=O)-N(H)-Ra, en donde Ra es un grupo alquilo C1-C4, lineal o ramificado,

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El término “alquilo” se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n-pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 2 átomos de carbono. Y más preferiblemente son un grupo metilo.

En una realización preferida de la presente invención R1 y R3 son un grupo metilo. Más preferiblemente n es 1 y aún más preferiblemente R2 es hidrógeno.

El término “melatonina” se refiere a la N-acetil-5-metoxi-triptamina, también denominada en la bibliografía melatonin, melatonine, melatol, melovina, circadin, regulin, acetamida, N-acetil-metoxi-tryitamina, 5-metoxi-N-acetiltriptamina, N- [2-(5-metoxi-1H-indol-3-il)etil]acetamida o N-[2-(5-metoxiindol-3-il)etil]acetamida o cuando en el compuesto de fórmula general (I) R1 y R3 son un grupo metilo, n es 1 y R2 es hidrógeno. El número CAS de la melatonina es el 7331-4.

La melatonina es una neurohormona endógena producida fisiológicamente en animales, entre ellos seres humanos por la glándula pineal (epífisis cerebri), y por otros órganos, como por ejemplo el aparato digestivo, la retina, linfocitos y células de la médula ósea.

La melatonina se produce en animales, entre ellos seres humanos, a partir de serotonina (5-hidroxtriptamina, 5-HT), la cual deriva a su vez del aminoácido triptófano. Por lo tanto, la presente invención podría referirse también al uso de una composición que comprende cualquiera de los precursores de melatonina (5-HT, triptófano o metabolitos intermedios tales como la N-acetilserotonina, o NAS), en una concentración suficiente para que en el cuerpo humano se transformen a melatonina en las concentraciones descritas en la presente invención, para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a las sales farmacéuticamente aceptables de melatonina o de sus derivados que pueden ser generadas mediante métodos químicos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante una reacción con un ácido en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Como disolvente orgánico puede utilizarse éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Los ejemplos de las sales de adición de ácido incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato, y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y ptoluenosulfonato.

El término “profármaco” tal como se usa en esta solicitud se refiere a un compuesto químico que ha experimentado una derivación química, por ejemplo, una sustitución o una adición de un grupo químico adicional, para modificar cualquiera de sus propiedades fisicoquímicas, tales como la solubilidad o biodisponibilidad, pero que no modifica las características técnicas de la molécula original. Un profármaco podría ser, por ejemplo, un derivado de éster, de éter o de amida. La biodisponibilidad se refiere a la disponibilidad del mismo en un compartimento biológico concreto.

El término “solvato” según esta invención debe entenderse como aquel derivado de melatonina que tiene otra molécula, por ejemplo, un disolvente polar, unido por medio de un enlace no covalente. Los ejemplos de tales solvatos incluyen hidratos y alcoholatos, por ejemplo, metanolatos.

La preparación de sales, solvatos y profármacos puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en el estado de la técnica. Las sales, solvatos o profármacos no farmacéuticamente aceptables también se encuentran dentro del ámbito de la invención puesto que pueden ser útiles en la preparación de sales, solvatos o profármacos farmacéuticamente aceptables.

La composición de la invención o la composición preferida de la invención también se pueden referir a una composición que comprende un equivalente biológico funcional de la melatonina en una concentración que sea equivalente a la descrita en las composiciones de la invención.

El término “equivalente biológico funcional” o “variable bioequivalente” tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una molécula con la misma función que la molécula descrita, que puede presentar ligeras variaciones con respecto a la molécula descrita sin que dichas variaciones aporten ningún efecto técnico añadido a dicha molécula. En la presente invención se refiere por lo tanto a variantes de melatonina que tienen la misma función y que presentan ligeras variaciones sin que dichas variaciones aporten ningún efecto técnico añadido a la melatonina.

Por “concentración que sea equivalente” se entiende aquella concentración necesaria para que el equivalente biológico funcional de melatonina produzca el mismo efecto que el descrito en la presente invención por la composición de la invención.

La melatonina también se produce en vegetales. Por ejemplo, se ha descrito la presencia de melatonina en algas, plantas comestibles, cereales, frutos, semillas, raíces, tallos, hojas y hierbas medicinales. (Paredes SD te al. J Exp

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Bot 20089, 60(1):57-69). Por ejemplo, se ha descrito la presencia de melatonina en el cacao, las uvas, los tomates, el té, el té verde, algas, cereales y las aceitunas. El origen de la melatonina de la composición de la invención puede ser vegetal. La melatonina de origen vegetal (también conocida como fitomelatonina) se puede obtener por cualquier método conocido por el experto en la materia para tal fin.

El origen de la melatonina utilizada en la composición de la invención también puede ser sintético. La melatonina se puede sintetizar químicamente mediante las técnicas conocidas por el experto en la materia para tal fin.

El término “composición farmacéutica”, o “medicamento”, se refiere a cualquier sustancia usada para la prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre o los animales. En el contexto de la presente invención se refiere, a una composición capaz de tratar y/o prevenir la mucositis.

En la presente invención “tratamiento y/o prevención” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas. Aquellas situaciones susceptibles de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones, así como aquellas en las que se previene la alteración. Una “alteración” es cualquier estado que se beneficiaría del tratamiento con la composición de la invención, tal y como se describe en el presente documento.

El término “mucositis” tal y como se usa aquí, se refiere principalmente a la enfermedad que cursa con inflamación de las mucosas del aparato digestivo, es decir, mucosa bucal, faríngea, esofágica, estomacal e intestinal, y que se caracteriza por tener un impacto en la integridad y función de la mucosa y que puede producir ulceración e infección en la misma. La mucositis puede ser causada por diversas etiologías, entre ellas tratamiento de radioterapia, tratamiento con quimioterapia, trasplantes de médula ósea o tratamientos con fármacos.

Una realización preferida se refiere a una composición en gel para uso donde la mucositis está causada por radioterapia y/o quimioterapia.

Se entiende por radioterapia un tratamiento basado en el empleo de radiaciones ionizantes capaces de ionizar la materia, como por ejemplo rayos X o radiactividad, por ejemplo, que incluye tanto rayos gamma como partículas alfa. La presente invención se refiere al tratamiento con radiaciones ionizantes que se utiliza en tratamientos de cáncer y que incluye cualquier tratamiento conocido por el experto en la materia que genere mucositis.

Se entiende por quimioterapia un tratamiento basado en la administración de un agente que produce inhibición en el crecimiento tumoral y que incluye cualquier tratamiento conocido por el experto en la materia que genere mucositis. Por ejemplo, el agente químico se puede referir a metotrexato, procarbacina, tioguanina, mercaptopurina, citarabina, fluoruracilo, floxuridina, vinblastina, vincristina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitramicina, bleomicina, asparaginasa o irinotecano.

Otra realización preferida se refiere a la composición en el gel para uso donde la mucositis es mucositis oral, faríngea, esofágica, estomacal o intestinal. Otra realización preferida se refiere a la composición en gel para uso donde la mucositis es mucositis oral.

Otra realización preferida se refiere a la composición en el gel para uso donde la mucositis es en humanos.

Otra realización preferida se refiere a la composición en gel para uso donde la composición comprende además al menos un excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de la composición farmacéutica o medicamento de la invención, estabiliza dicha composición farmacéutica o ayuda a su preparación en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos tal como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas; la función de endulzar; la función de actuar como un colorante; la función de protección del medicamento como por ejemplo aislarlo del aire y/o la humedad; la función de relleno de una píldora, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico; una función disgregante para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Para que la composición de la invención tenga un sabor agradable se puede añadir una esencia como, por ejemplo, esencia de canela, limón, naranja, mandarina o vainilla.

El término “adyuvante” se refiere a cualquier sustancia que potencie la respuesta de un principio activo. En la presente invención, dicho término se refiere a cualquier sustancia que potencie los efectos de la composición de la invención, puede referirse a cualquier adyuvante conocido por el experto en la materia.

El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

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Otra realización preferida se refiere a la composición en gel para uso donde la composición además comprende un agente gelificante. Preferiblemente el agente gelificante se selecciona de la lista que comprende copolímero de polietileno y polipropileno, celulosa y goma guar. Preferentemente se refiere a copolímero de polietileno y polipropileno. Por lo aquí descrito, otra realización referida se refiere a la composición en gel para uso donde la composición es un gel (o también denominado “hidrogel”).

El término “agente gelificante” se refiere a una sustancia que forma un gel, es decir, una red tridimensional formada por el agente gelificante y que generalmente contiene una fase líquida. El agente gelificante que puede utilizarse pueden ser aquellos conocidos por el experto en la materia para la elaboración de una composición farmacéutica. Por ejemplo, entre los copolímeros de polietileno y polipropileno se podría utilizar copolimeros de poloxámero (o poloxámero), por ejemplo, los agentes denominados Pluronic®, entre ellos, Pluronic® F127 (número CAS 9003-11 - 6) o Pluronic® F127NF.

Otra realización preferida se refiere a la composición en gel para uso donde la composición además comprende al menos un conservante.

Se entiende por conservante una sustancia que mantiene las propiedades del medicamento al inhibir la contaminación por gérmenes, pueden ser conservante iónico o no iónico. El conservante empleado no será tóxico, será estable químicamente, y compatible con la melatonina. Como agentes conservantes pueden utilizarse los conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, el conservante puede referirse a ácido benzoico, benzoato sódico, ácido ascórbico, sorbato potásico, metilparabeno, etilparabeno o butilparabeno. Se entiende por “gérmenes” cualquier célula que pueda crecer y multiplicarse en la composición de la invención, por ejemplo, bacterias, hongos y levaduras.

Otra realización preferida se refiere a la composición en gel para uso donde la composición además comprende un antioxidante.

El término “antioxidante” se refiere a aquella sustancia que es capaz de retrasar o prevenir la oxidación. Como agentes antioxidantes pueden utilizarse los conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, tocoferol, ácido ascórbico, ascorbato sódico, ácido tartárico, butilhidroxianisol, ácido cítrico, vitamina A o vitamina E.

Otra realización preferida se refiere a la composición en gel para uso donde la composición además comprende al menos otro principio activo.

Como se emplea en el presente documento, los términos “principio activo”, “sustancia activa”, “sustancia farmacéuticamente activa”, “ingrediente activo” o “ingrediente farmacéuticamente activo” se refiere a cualquier componente que pueda potencialmente proporcionar una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que pueda afectar a la estructura o función del cuerpo de seres humanos u otros animales. Por ejemplo, se podría utilizar alopurinol.

Otra realización preferida se refiere a la composición en gel para uso donde la composición además comprende un soporte farmacéuticamente aceptable.

Un “soporte farmacéuticamente aceptable”, o soporte farmacológicamente aceptable, se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse a, sólidos, líquidos, disolventes o tensoactivos. El soporte puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención. La función del soporte es facilitar la incorporación del producto de expresión de la invención, así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Los soportes farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la invención pueden ser los conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, lisosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, miliesferas, microesferas, nanoesferas, milipartículas, micropartículas y nanopartículas.

La composición farmacéutica de la invención se va a administrar a un animal y, preferiblemente, a un mamífero, y más preferiblemente a un ser humano, mediante administración tópica en la superficie de la mucosa bucal.

Basado en lo descrito en el presente documento, se divulga la composición en gel para uso donde la composición está en una forma farmacéutica adecuada para la administración tópica en la superficie de la mucosa bucal.

El término “administración tópica” en la presente invención se refiere a la composición que se administra en la superficie de la mucosa, preferiblemente en la superficie de la mucosa bucal.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, tal como, por ejemplo, edad, peso, sexo o tolerancia del animal, preferentemente mamífero y más preferentemente ser humano. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la

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cantidad farmacéuticamente efectiva de la composición que produce el efecto deseado y, en general, vendrá determinada entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y del efecto terapéutico a conseguir.

Una realización preferida divulga la composición en gel para uso donde la dosis diaria administrada es de entre 37,5 mg y 75 mg. Una realización aún más preferida divulga la composición en gel para uso donde la dosis diaria administrada es entre 45 mg. Otra realización aún más preferida divulga la composición en gel para uso donde la dosis se administra en una pauta de 15 mg 3 veces al día.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitantes de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1. Niveles de agresión oxidativa en homogenizado de lengua de ratas. Muestra los resultados del índice de peroxidación lipídica (LPO) en ratas control, ratas irradiadas y ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 1%, 3% o 5% p/v por vía tópica en la cavidad bucal. Grupo control (C); grupo irradiado (IR); grupos irradiados tratados con gel de melatonina al 1%, 3% o 5%. (IR + melatonina). MDA, malonildialdehido; 4-HDA, hidroxialquenal; **p<0,01 y ***p<0,001 frente a C; ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 2. Niveles de agresión oxidativa en mitocondrias de lengua de rata. Muestra los resultados del índice de peroxidación lipídica (LPO) en ratas control, ratas irradiadas y ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 1%, 3% o 5% p/v por vía tópica en la cavidad bucal. Grupo control (C); grupo irradiado (IR); grupos irradiados tratados con gel de melatonina al 1%, 3% o 5% (IR+melatonina). MDA, malonildialdehido; 4-HDA, hidroxialquenal; **p<0,01 y ***p<0,001 frente a C; ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 3. Niveles de glutatión en lengua de rata. Muestra los resultados de los niveles de glutatión en ratas control, ratas irradiadas y ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 1%, 3% o 5% p/v por vía tópica en la cavidad bucal. A, Niveles de glutatión reducido (GSH); B, oxidado (GSSG); C, glutatión total (Gt); D, proporción (GSSG/GSH) en mitocondrias de lengua de ratas controles (C), ratas irradiadas (IR), y ratas tratadas con melatonina al 1%, 3% y 5% (IR+melatonina). ***p<0,001 frente a C; ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 4. Actividad de glutatión peroxidasa y glutatión reductasa en mitocondrias de lengua de rata. Muestra los resultados de la actividad de: A, glutatión peroxidasa (GPx); y B, de glutatión reductasa (GRd), ambas en ratas control, ratas irradiadas y ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 1%, 3% o 5%. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), y ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 1%, 3% y 5% p/v por vía tópica en la cavidad bucal (IR+melatonina). **p<0,01 y ***p<0,001 frente a C; ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 5. Aspecto macroscópico de la lengua de rata tras tratamiento con la composición de la invención. Muestra los resultados macroscópicos de la lengua de ratas control, ratas irradiadas y ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 1%, 3% o 5% p/v por vía tópica en la cavidad bucal. Ratas control, ratas irradiadas (IR), y ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 1%, 3% y 5% (IR+MT 1%; IR+MT 3%, e IR+MT 5%, respectivamente).

FIG. 6. Comparación entre la administración tópica y la administración intraperitoneal respecto a los niveles de glutatión en lengua de rata. Muestra los resultados de los niveles de glutatión en ratas control, ratas irradiadas y ratas irradiadas tratadas con melatonina al 3% p/v por vía tópica o al 3% p/v por vía intraperitoneal (i.p.). A, Niveles de glutatión reducido (GSH); B, niveles de glutatión oxidado (GSSG); C, niveles de glutatión total (Gt); D, y proporción GSSG/GSH en mitocondrias de lengua de ratas. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% (IR+3%), y ratas tratadas con melatonina por vía i.p. (IR+IP). ***p<0,001 frente a C; ##p<0,01 y ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 7. Actividad y expresión de GPx en lengua de rata en ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Actividad de GPx; B, Análisis de la densitometría de inmunotransferencia de GPx C, Imagen de inmunotransferencia de GPx en mitocondrias de lengua de ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad bucal (IR+ 3%), y ratas tratadas con melatonina al 3% p/v por vía i.p. (IR+IP). **p<0,01 y ***p<0,05 frente a C; ##p<0,01 y ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 8. Actividad y expresión de GRd en lengua de rata en ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Actividad de GRd; B, Análisis de la densitometría de inmunotransferencia de GRd y C, Imagen de inmunotransferencia de GRd en mitocondrias de lengua en ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la

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cavidad bucal (IR+ 3%), y tratadas con melatonina al 3% p/v por vía i.p. (IR+IP). ***p<0,001 frente a C; #p<0,05 y ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 9. Actividad comparativa de los complejos CI, CII, CIII y CIV de la cadena respiratoria mitocondrial en mitocondrias de lengua en ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Complejo I; B, complejo II; C, complejo III; D, complejo IV. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad bucal (IR+ 3%), y tratadas con melatonina al 3% p/v por vía i.p. (IR+IP). *p<0,05, **p<0,01, y ***p<0,001 frente a C; #p<0,05, y ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 10. Resultados comparativos de la expresión de los complejos CI, CIII, CIV y CV de la cadena respiratoria mitocondrial en la lengua mediante inmunotransferencia en ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 3% y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas de inmunotransferencia correspondiente al Complejo I; B, al complejo III; C, al complejo IV; D, al complejo V. E. Imagen de inmunotransferencia correspondiente a los complejos I, III, IV y V. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad bucal (IR+3%), y tratadas con melatonina al 3% p/v por vía i.p. (IR+IP). *p<0,05, **p<0,01, y ***p<0,001 frente a C; #p<0,05 y ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 11. Comparación entre los niveles de melatonina en mitocondrias de lengua de rata en ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad bucal (IR+aMT 3%), y ratas irradiadas tratadas con melatonina al 3% p/v administrada por vía i.p. (IR+IP). ***p<0,001 frente a C; p<0,001 frente a IR.

FIG. 12. Aspecto macroscópico de la lengua de rata tras el tratamiento con la composición de la invención por vía intraperitoneal para fines ilustrativos. Se muestra el resultado macroscópico de la lengua de rata en una rata irradiada, tratada con melatonina al 3% p/v y por vía intraperitoneal.

FIG. 13. Comparación entre la expresión de PGC-1a, NRF1 y TFAM mediante inmunotransferencia en homogenizado de lengua de rata de ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas de inmunotransferencia correspondiente a PGC-1a; B, a NRF1; C, a TFAM; D, imagen de inmunotransferencia correspondiente a PGC-1a, NRF1 y TFAM. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001 frente a C; ###p<0,001 frente a IR.

FIG. 14. Comparación entre la expresión de NFkB mediante inmunotransferencia en lengua de rata de ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas de inmunotransferencia correspondiente a NFkB en citosol; B, a NFkB en núcleo; C, imagen de inmunotransferencia correspondiente a NFkB en citosol y a NFkB en núcleo. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). ***p<0,0o1 y **p<0,01 frente a C; ##p<0,01 frente IR.

FIG. 15. Comparación entre la expresión de NLRP3, ASC y caspasa 1 mediante inmunotransferencia en homogenizado de lengua de rata de ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas de inmunotransferencia correspondiente a NLRP3; B, a ASC; C, a caspasa 1 (casp. 1); D, imagen de inmunotransferencia correspondiente a NLRP3, ASC y caspasa 1. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). ***p<0,001 frente a C; #p<0,05 frente a IR.

FIG. 16. Comparación entre la expresión de IL-1 y de TNF-a mediante inmunotransferencia en homogenizado de lengua de rata de ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas de inmunotransferencia correspondiente a IL-1; B, a TNF-a; C, imagen de inmunotransferencia correspondiente a IL-1 y TNF-a. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). **p<0,01 y *p<0,05 frente a C; ##p<0,01 y #p<0,05 frente a IR.

FIG. 17. Comparación entre la expresión de P53, Bax y Bcl2 mediante inmunotransferencia en homogenizado de lengua de rata en ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad bucal y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas de inmunotransferencia correspondiente a P53; B, a Bax; C, a Bcl2; D, proporción Bax/Bcl2; E, imagen inmunotransferencia correspondiente a P53, Bax y Bcl2. Ratas control (C), ratas irradiadas (IR), ratas tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). ***p<0,001, **p<0,01 y *p<0,05 frente a C; ###p<0,001 y ##p<0,01 frente a IR.

Ejemplos de realizaciones de la invención

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Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no se deben interpretar como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

A continuación, se ilustrará la invención mediante ensayos realizados por los inventores, que muestran claramente la utilidad del gel de melatonina en mucositis y se muestran resultados a distintas concentraciones.

A. Material y métodos:

Para fines comparativos, se administró la composición de la invención a animales de experimentación por diferentes vías de administración y también se realizaron experimentos con pacientes humanos.

Para la administración tópica en la cavidad bucal, la composición empleada fue un hidrogel (gel) que comprendía melatonina al 1%, 3% o al 5% (1, 3 o 5 gramos de melatonina en 100 ml del volumen final de la composición respectivamente) y en la que se emplearon copolímeros de polietileno y polipropileno al 20% como sustancia gelificante. Como copolímeros de polietileno y polipropileno se utilizó Pluronic® F127, (poloxámero). Se empleó benzoato sódico al 0,3%como conservante. Se utilizó esencia de naranja dulce al 0,5 %. Todos los componentes utilizados se obtuvieron de FAGRON IBERICA, S.A.U., números de referencia: melatonina, 33457-27; Pluronic® F127, 33353-SP; benzoato de solio, 31360-12; esencia de naranja, 30620-08. La estructura química de la melatonina se muestra a continuación:

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Los animales usados en los experimentos eran ratas, de 280 g de peso, y se sometieron, en condiciones controladas, a radiaciones ionizantes en la Unidad de Radiología Experimental del Centro de Investigación Biomédica de la Universidad de Granada. Los animales se sometieron a una exposición total de 50 grays (Gy). La dosis de irradiación utilizada cada día fue de 10 Gy que se administran a 100,75 cGy/min, 210 kilovoltios (kV) y 12 miliamperios (mA), y colocando el animal a una distancia de 40 cm con respecto a la fuente de radiación.

Se aplicaron las diferentes formulaciones en los animales de la siguiente manera. Una aplicación tópica se aplicó en la cavidad bucal antes de la irradiación, otra después, y otras sucesivas cada 8 horas durante 21 días. Los animales se sacrificaron después de 21 días del inicio de la irradiación que es cuando se observó en los animales irradiados sin tratamiento con melatonina el grado máximo de mucositis. Las formulaciones utilizadas en los animales usados en los experimentos fueron las siguientes: gel de Pluronic F-127 con melatonina al 1%, 3% o al 5% (1, 3 o 5 gramos de melatonina/100 ml gel respectivamente), aplicados tres veces al día por vía tópica en la cavidad bucal en un volumen de 500 pl/cada vez, lo que hace un total de 1,5 ml/día. La aplicación tópica en la cavidad bucal conlleva que los animales ingieran el gel que se aplica en la cavidad bucal.

Para fines comparativos, también realizaron los experimentos, administrando a los animales la misma concentración de melatonina que la utilizada con el hidrogel al 3% p/v, pero por vía intraperitoneal, para comprobar si la melatonina plasmática podría reducir la mucositis o es necesaria la aplicación de dicha molécula por vía tópica. Para la vía parenteral comparativa se utilizó una solución isotónica que comprendía un 70% v/v (volumen/volumen) de solución salina isotónica, y el 30% v/v de propilenglicol, medidos en relación al volumen total de la disolución. Se inyectó una dosis diaria de 45 mg de melatonina durante 21 días. Los animales se sacrificaron 21 días después del inicio de la irradiación, al igual que los animales tratados con el gel de melatonina aplicado por vía tópica en la cavidad bucal.

También evaluó el papel protector de la composición de melatonina al 3% p/v en pacientes con cáncer de cabeza y cuello sometidos a radioterapia. El estudio era un estudio con doble enmascaramiento (5 pacientes tratados con un gel de melatonina al 3% p/v y 5 pacientes con gel sin melatonina). Los pacientes se sometieron a enjuagues bucales con el gel descrito anteriormente, con 500 microlitros tres veces al día, es decir, los pacientes recibieron un total de 45 mg/día de melatonina repartidos en una pauta de 15 mg 3 veces al día. Los pacientes mantuvieron el gel con melatonina en la cavidad bucal durante 2 minutos, y a continuación lo ingirieron para que el gel pudiera impregnar toda la mucosa gastrointestinal. Se realizaron dos evaluaciones semanales en consulta programada para determinar

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el grado objetivo de oromucositis (Escala objetiva de toxicidad RTOG (Radiotherapy Oncology Group) según la OMS): Grado 0-4.

B. Parámetros evaluados

B.1. Marcadores del daño oxidativo

-Evaluación de la oxidación de las membranas celulares y membranas subcelulares (LPO)

Un mecanismo muy importante por el que los radicales libres de oxígeno son capaces de producir lesión celular, es mediante la peroxidación lipídica de sus membranas, tanto celulares como mitocondriales. La peroxidación lipídica se produce debido a la acción de los radicales libres sobre los ácidos grasos poliinsaturados. Estas modificaciones en la estructura de la membrana celular provocan cambios en sus propiedades fisicoquímicas, con un aumento de su permeabilidad y pérdida progresiva de sus funciones, que pueden producir la posterior muerte celular. La medida del grado de peroxidación lipídica de las membranas se ha considerado siempre un parámetro muy importante como indicador de agresión oxidativa. El índice de peroxidación lipídica (LPO) está proporcionado por la cuantificación del malonildialdehido y 4-hidroxialquenal (MDA + 4-HDA) presentes en la muestra, los cuales son importantes productos de descomposición de los peróxidos derivados de los ácidos grasos poliinsaturados y ésteres relacionados. Las concentraciones de malonildialdehido y 4-hidroxialquenal, así como la concentración de hidroperóxidos, proporcionan un índice conveniente de la peroxidación lipídica.

B.2. Evaluación de las defensas antioxidantes

Dentro del sistema antioxidante celular, hay un grupo de enzimas que se encargan de detoxificar la célula de los radicales libres en condiciones fisiológicas, estas enzimas son fundamentalmente:

-Glutatión peroxidasa (GPx): esta enzima utiliza como cofactor el glutatión reducido y elimina el peróxido de hidrógeno (H2O2).

-Glutatión reductasa (GRd): esta enzima reconvierte el glutatión oxidado, producido por la actividad de la glutatión peroxidasa, en glutatión reducido.

También es un índice importante de la evaluación del estado redox el índice obtenido del cociente entre el glutatión oxidado/reducido (GSSG/GSH).

B. 3. Evaluación de marcadores de la actividad mitocondrial

La disfunción mitocondrial, asociada a un incremento de la producción de radicales libres, es responsable de la muerte celular. Por tanto, medir la actividad de los complejos de la cadena de transporte respiratorio (I, II, III y IV) y la expresión de los complejos es fundamental para conocer el grado de daño mitocondrial.

B.4. Mitocondria y estrés oxidativo: activación del inflamasoma:

En las mitocondrias dañadas por la irradiación aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) provocando alteraciones oxidativas de los componentes mitocondriales y apertura del poro de transición mitocondrial (PTM). La permeabilización de la membrana mitocondrial representa un punto irreversible de la activación de las rutas de muerte celular programada que culminan en apoptosis o necrosis (Schroder K, et al. Cell. 2010; 140:821- 832; Latz E, Curr. Opin. Inmunol, 2010; 22: 28-33. Epub 2010).

Estudios recientes demuestran que la mitocondria también regula la respuesta inmunitaria innata (Kastner DL, et al. Eur J Immunol. 2010; 40:611-615). Se ha observado que los radicales libres originados en la mitocondria son los responsables de la activación de los mecanismos inflamatorios celulares; específicamente, del llamado inflamasoma tal como NLRP3 (familia de receptores de tipo NOD, que contiene dominio de piridina 3) (Zhou R, et al. Nature 2011; 469:221-226). El NLRP3 es un complejo de proteínas que media la producción del mensajero inmunitario IL-1beta y la inflamación.

Una gran variedad de factores puede activar la respuesta inmunitaria innata, incluyendo agentes patógenos o moléculas que producen daño celular como consecuencia de un aumento de estrés. Cuando NLRP3 se activa, forma un complejo multiproteico constituido por NLRP3, la molécula adaptadora ASC (proteína asociado a apoptosis de tipo speck que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas), así como la pro-caspasa-1. En situaciones de estrés celular, NLRP3 recluta a la proteína ASC y a la procaspasa 1, que activa caspasa-1 provocando una serie de reacciones intracelulares que incluyen la activación de las citoquinas proinflamatorias.

B.5. Respuesta inflamatoria y NF-kB

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En la respuesta inflamatoria también participa la ruta del factor nuclear kappa B (NF-kB). La diferencia con el inflamasoma, es que la ruta de NF-kB se activa a través de los receptores de membrana de tipo Toll (TLR), mientras que el inflamasoma se activa a través de receptores citosólicos de tipo NOD (NLR) (receptores de dominio de oligomerización de nucleótidos), NLR. NF-kB y NLRP3 funcionan conjuntamente para activar las citoquinas proinflamatorias tal como IL-1p. Paralelamente, esta citoquina puede inducir daño mitocondrial e incrementar la producción de ROS, que inducen daño en el ADN mitocondrial (ADNmt) y apertura del PTM, provocando apoptosis.

Además, NF-kB activa la expresión de una gran variedad de genes implicados en la respuesta inflamatoria tal como la ciclooxigenasa 2 (COX-2), la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y moléculas de adhesión vascular (VCAM-1). Por tanto, la irradiación provoca un aumento de moléculas pro-inflamatorias que contribuyen a la apoptosis y, por tanto, a la aparición de la mucositis.

B. 6. Mecanismos de apoptosis:

Las proteínas que regulan la apoptosis se agrupan en proteínas antiapoptóticas como Bcl2 (linfoma de células B 2), y proteínas proapoptóticas tal como Bax. Por tanto, la proporción Bax/Bcl2 es un índice sumamente importante ya que refleja directamente el nivel de apoptosis. La proteína p53 activa las enzimas de reparación del ADN para corregir los daños detectados. La entrada en apoptosis es el último mecanismo protector, si el daño en el ADN es irreparable, para prevenir la proliferación de las células que contienen ADN anormal. p53 activa la expresión de genes pro-apoptosis, como BAX.

Por tanto, las consecuencias de una producción incrementada de ROS mitocondriales, de daño en el ADNmt y de la apertura del PTM, implican el mantenimiento del proceso inflamatorio, por lo que el tratamiento dirigido hacia el inflamasoma puede ser una ruta para el uso de nuevas terapias en las enfermedades inflamatorias que no responden a los anti-inflamatorios como sucede con la mucositis inducida por radioterapia.

C. EJEMPLO 1: Resultados obtenidos en lengua de rata

C.1-Utilizac¡ón de melatonina en un gel al 1%, 3%, y 5% p/v por vía tópica en la cavidad bucal

La agresión oxidativa causada por las radiaciones produce daño en las membranas celulares, que se refleja en un aumento de la oxidación de los lípidos de membrana superior al 50% con respecto al control (Figura 1, p<0,001). Este daño indica que las radiaciones lesionan estos tejidos causando mucositis. La melatonina al 3% revierte totalmente los efectos de la radioterapia, mientras que la melatonina al 1%, tan sólo, revierte parcialmente los niveles de LPO. Cuando se usa una concentración de melatonina superior al 3%, tal como el 5%, tiene los mismos efectos que la concentración al 3% para contrarrestar la agresión oxidativa (Figura 1).

La irradiación también produce un intenso daño mitocondrial que se refleja por un aumento de LPO en membranas mitocondriales (Figura 2). Este daño mitocondrial produce muerte celular (Acuña-Castroviejo et al. Curr Top Med Chem 2010, 11(2):221-240). Cuando se tratan ratas irradiadas con melatonina, se observa un potente efecto antioxidante de la melatonina cuando se aplica al 3%, revirtiendo totalmente los efectos de la radioterapia (p<0,001) en la mitocondria. No se conoce ninguna molécula existente en la actualidad que sea capaz de ejercer estos efectos. Sin embargo, cuando se aplica la melatonina al 1%, prácticamente no tiene ningún efecto para contrarrestar el daño oxidativo producido por irradiación en la mitocondria. Cuando se usa una concentración de melatonina al 5%, tiene los mismos efectos que la concentración al 3 % para contrarrestar la agresión oxidativa mitocondrial.

La irradiación también produce una disminución muy significativa de los niveles de GSH (p<0,001) (Figura 3A), al mismo tiempo que se elevan los niveles de GSSG (p<0,001) (Figura 3B) en las mitocondrias de la lengua, provocando un aumento de glutatión total (GSH+GSSG) (Figura 3C). Estos cambios reflejan un considerable aumento de la agresión oxidativa mitocondrial, que es reflejo de los efectos adversos provocados por la irradiación. El aumento del cociente GSS/GSH (p<0,001) (Figura 3D), que es el mejor índice de agresión oxidativa intracelular y, en este caso intramitocondrial, avala ese efecto nocivo de la irradiación. Por su parte, la administración de melatonina al 1% es incapaz de aumentar los niveles de GSH (Figura 3A) y reducir los niveles de GSSG (Figura 3B), ni puede normalizar el cociente GSSG/GSH (Figura 3D) y, por tanto, neutralizar la agresión oxidativa. Cuando se usa una concentración de melatonina al 5%, se observa que tiene los mismos efectos que la concentración al 3% para contrarrestar la agresión oxidativa mitocondrial, revirtiendo en ambos casos totalmente el efecto de la irradiación.

Cuando se mide la actividad de la glutatión peroxidasa (GPx) (Figura 4A), se observa un aumento de la actividad causada por la irradiación como respuesta a un aumento de los peróxidos producidos. La administración del gel de melatonina al 3% contrarresta parcialmente los efectos de la irradiación. La melatonina al 5% tiene los mismos efectos que la concentración al 3%, mientras que la concentración al 1% no tiene ningún efecto.

Cuando se mide la actividad de la glutatión reductasa (GRd) (Figura 4B), se observa que, igualmente, la melatonina al 5% tiene el mismo efecto que la concentración al 3%, mientras que la concentración al 1% no tiene ningún efecto.

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La GRd mitocondrial es una enzima fácilmente inhibida por agresión oxidativa y, por eso, su actividad disminuye significativamente con la irradiación (Figura 4B, p<0,001), efecto que es contrarrestado por la administración de melatonina (p<0,001), tanto al 3 como al 5%.

La importancia de estas acciones de la melatonina radica en que, además de los cambios bioquímicos antes indicados, la reducción de agresión oxidativa mitocondrial se traduce en una prevención total de la mucositis, no observándose ningún tipo de lesión en las ratas tratadas (Figura 5). No se incluyen imágenes de los animales tratados con el gel de melatonina al 1%, ya que dicha concentración no tuvo ningún efecto.

Por tanto, la dosis mínima efectiva para el tratamiento de la mucositis corresponde a una concentración de melatonina al 3% en el gel aplicado tres veces al día (500 pl en cada aplicación), lo que produce una dosis diaria de 45 mg de melatonina.

C.2-Comparación entre la aplicación del gel de melatonina al 3% p/v y la administración de la misma concentración de melatonina por vía parenteral.

Para determinar cuál es la vía de administración más adecuada para la reversión de la mucositis, se comparó la administración del gel de melatonina al 3% por vía tópica en la cavidad bucal y la administración de melatonina por vía intraperitoneal (i.p.) a la misma dosis (45 mg al día).

Se observa que los efectos de la melatonina administrada con el gel y la administración de la melatonina por vía parenteral difieren en algunos aspectos clave, tal como una menor eficacia de la administración i.p. en recuperar el GSH y en disminuir el GSSG, lo que mantiene un cociente GSSG/GSH más alto, indicando agresión oxidativa intramitocondrial mayor que tras la aplicación del gel (Figura 6). La figura 6 compara los niveles de glutatión en lengua de rata en ratas tratadas con el gel al 3% y tratadas con la melatonina por vía intraperitoneal.

Con respecto a la glutatión peroxidasa mitocondrial (GPx) (Figura 7) los resultados indican un aumento de su actividad (Figura 7A) y de la expresión de la enzima (Figuras 7B y 7C) por la irradiación, como respuesta al aumento de los peróxidos producidos. Los estudios de expresión de proteínas se hacen mediante inmunotransferencia (7C), y en los análisis de densitometría de estas inmunotransferencias se observa (Figura 7B) un aumento de la cantidad de proteína indicando un aumento de la expresión de dicha enzima con la irradiación. Tanto la administración tópica como la administración intraperitoneal de melatonina contrarrestan parcialmente el efecto de la irradiación.

La glutatión reductasa mitocondrial (GRd) (Figura 8) sigue un curso completamente distinto. Es una enzima fácilmente inhibida por la agresión oxidativa, y por eso su actividad (Figura 8A) y expresión (Figura 8B y 8C) disminuyen significativamente con la irradiación. Los estudios de expresión de proteína se hacen mediante inmunotransferencia (8C), y en los análisis de densitometría de estas inmunotransferencias se observa (Figura 8B) una disminución de la cantidad proteína con la irradiación indicando una inhibición de la expresión de dicha enzima. Se observa un efecto significativo del gel de melatonina para recuperar la actividad y expresión de la GRd, mientras que la administración intraperitoneal de melatonina no consigue recuperar la enzima. Si la GRd permanece inhibida, la mitocondria es incapaz de contrarrestar el daño oxidativo y favorece la muerte celular.

La irradiación produce una inhibición de los complejos de la cadena de transporte electrónico mitocondrial, fundamentalmente el complejo I, II y IV (Figura 9A, 9B y 9D). No se observan cambios significativos en el complejo III (Figura 9C). Cuando se dañan los complejos de la cadena respiratoria, se generan más radicales libres, disminuye la eficiencia de la cadena respiratoria, se produce menos ATP, se activan factores apoptóticos y aumenta la apoptosis. La melatonina en gel es más eficiente para recuperar la actividad de los complejos que la administración parenteral, incluso aumentando la actividad por encima de los valores controles (Figura 9).

Al igual que ocurre con su actividad, la irradiación también inhibe la expresión de los complejos de la cadena respiratoria, siendo muy significativa la inhibición de la expresión de los complejos I, III, IV y V (Figura 10A, 10B, 10C, 10D y 10E). Mediante los estudios de inmunotransferencia, se observa una disminución de la cantidad de proteínas de los complejos I, III, IV y V, indicando una disminución en la síntesis de estos complejos con la irradiación. El gel de melatonina es mucho más eficaz para recuperar la expresión de los complejos que la administración parenteral. Además, se puede observar, que la aplicación parenteral es totalmente incapaz de recuperar la expresión del complejo V o ATP sintasa, la enzima responsable de la síntesis de ATP (Figura 10D). Este dato es muy relevante, ya que, si el complejo V está inhibido, no hay síntesis de ATP y, por tanto, la célula muere por apoptosis o necrosis (Escames G, et al. Hum Genet, Julio, 2011, DOI 10.1007/s00439-011-1057). La composición del gel al 3% es significativamente mejor que la vía parenteral para reactivar la expresión de los complejos de la cadena respiratoria según los resultados mostrados.

Se encontró que la irradiación suprime los niveles endógenos de melatonina en la lengua. Con la administración de la composición de la invención por vía tópica en la cavidad bucal se recuperan dichos niveles, lo que favorece su acción antioxidante local. Sin embargo, con la administración parenteral de melatonina no se recuperan tales niveles

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en la lengua (Figura 11). Estos resultados explican que la administración tópica sea mucho más eficaz que la administración parenteral de la melatonina.

Estas diferencias de eficiencia en cuanto a la acción de la melatonina según la vía de administración, se observan claramente al analizar las lesiones macroscópicas (Figuras 5 y 12). En efecto, la administración parenteral de melatonina no consigue recuperar las lesiones de la lengua tras la irradiación, mientras que la aplicación tópica en la cavidad bucal normaliza totalmente el aspecto morfológico de la lengua.

C-3 - Datos sobre la activación del inflamasoma, respuesta inflamatoria y mecanismos de apoptosis

Cuando se mide la biogénesis mitocondrial, midiendo PGC1a (Coactivador gamma de receptor del proliferador activado del peroxisoma 1 -alfa), NRF1 (factor respiratorio nuclear 1) y TFAM (factor de transcripción A, mitocondrial), se observa que la irradiación inhibía PGC1a, sin embargo, había un aumento en NRF1 y TFAm para compensar el daño mitocondrial (Figura 13).

Se encontró que la irradiación aumenta la activación de NFkB, incrementando los niveles tanto en núcleo como en citosol (Figura 14A y Figura 14B) y se activa la ruta del inflamasoma, aumentando NLRP3, ASC y caspasa-1 (Figura 15). Como consecuencia de la activación de la ruta de NFkB y la ruta del inflamasoma hay un aumento de citoquinas proinflamatorias IL-1 y TNF-a (Figuras 16A y 16B)

El daño mitocondrial implica también un aumento de apoptosis, con un aumento en las proteínas proapoptóticas p53 (Figura 17A) y Bax (Figura 17B), así como una disminución de las proteínas antiapoptóticas tal como Bcl2 (Figura 17C). Por tanto, hay un aumento del cociente Bax/Bcl2 y de p53 (Figura 17D), indicando un aumento significativo de apoptosis.

Es la primera vez que se demuestra la relación directa entre daño mitocondrial, activación del inflamasoma y mucositis radioinducida.

Por su parte, la administración del gel de melatonina al 3% neutraliza la agresión oxidativa, aumenta la actividad y expresión de enzimas antioxidantes, aumenta la función mitocondrial, reduce la producción de radicales libres disminuyendo la actividad de NFkB (Figura 14A y 14B) y del inflamasoma (Figura 15).

Por tanto, el gel de melatonina al 3% inhibe la apoptosis de forma significativa (Figura 17D), disminuyendo las proteínas inductoras de apoptosis tal como p53 y Bax (Figura 17A y 17B), y aumentando la expresión de las proteínas antiapoptóticas tal como Bcl2 (Figura 17C).

Además, el gel de melatonina al 3% aumenta la biogénesis mitocondrial, aumentando PGC1a, que se inhibe con la irradiación.

Todo ello se traduce en un aumento de la supervivencia celular. Además, con la administración del gel por vía tópica en la cavidad bucal se recuperan los niveles de melatonina, lo que favorece su acción antioxidante local.

Sin embargo, con la administración parenteral de melatonina no se recuperan tales niveles en la lengua. Estos resultados explican por qué la administración tópica es mucho más eficaz que la administración parenteral de la melatonina.

La histología también muestra lesiones macroscópicas Se usó tinción de hematoxilina-eosina, para determinar la presencia de lesiones histológicas en los tejidos estudiados. La tinción de tricrómico de Masson Goldner (TCMG) permitió diferenciar el tejido muscular, que se tiñe de rojo, del tejido conjuntivo que se tiñe de verde.

En el animal control sin tratamiento, la estructura histológica de la lengua no presenta alteraciones. Se mantiene el epitelio poliestratificado queratinizado de la mucosa con presencia de papilas filiformes en la zona dorsal y sin ellas en la zona ventral. Bajo la mucosa, se encuentra la lámina propia y la submucosa formadas por una pequeña capa de tejido conjuntivo y algunos vasos. Luego se encuentran capas musculares orientadas en distintas direcciones y con una pequeña cantidad de tejido conjuntivo entre los haces. Esta escasez de tejido conjuntivo se pone de manifiesto con la tinción de TCMG, donde la presencia de tinción verde es pequeña entre los músculos de la lengua.

En animales irradiados, aparece un aumento del tejido conjuntivo (fibrosis) entre las fibras musculares, separándolas. También aparecen congestión vascular y un marcado aumento del número de vasos (angiogénesis). A diferencia de lo que se observa en el animal control, en este caso la fibrosis teñida de color verde es mucho más abundante. Esta se observa sobre todo en la capa muscular donde las fibras se han cortado transversalmente.

En los animales tratados con melatonina se observa una disminución de la fibrosis y de la angiogénesis entre las fibras musculares de la lengua, en comparación con la observada en la lengua de los animales irradiados. Esta disminución del tejido conjuntivo fibroso se pone en evidencia mejor mediante la técnica de TCMG ya que se tiñe de

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verde, diferenciándose perfectamente de las fibras musculares que se tiñen de rojo. En cuanto a la diferencia entre ambos tratamientos, el gel de melatonina al 3% funcionó mejor que la administración parenteral, ya que la fibrosis es mucho menor.

Todos estos efectos de la irradiación conllevan a un daño mitocondrial que se puede observar mediante microscopía electrónica. En los animales irradiados, se puede observar vacuolización mitocondrial, así como mitocondrias rotas con pérdida de su contenido, provocando un aumento en los radicales libres y en la respuesta inflamatoria.

En los animales tratados con el gel, no se observan mitocondrias rotas y desaparecen las vacuolas. Sin embargo, en las ratas tratadas con melatonina por vía parenteral se observan mitocondrias rotas, al igual que en los animales sin tratar.

Por tanto, se ha demostrado, por primera vez que la melatonina permite proteger la mucosa gastrointestinal sometida a radioterapia, prevenir las lesiones provocadas por dichas radiaciones tal como la mucositis y curar dichas lesiones, siendo la administración por vía tópica más eficaz que la administración parenteral. La importancia de estas acciones de la melatonina radica en una reducción del daño mitocondrial, que se traduce en una prevención total de la mucositis, no observándose ningún tipo de lesión en las ratas tratadas a nivel macroscópico, o a nivel microscópico.

D- EJEMPLO 2: Resultados obtenidos en seres humanos:

Los pacientes tratados con el gel de melatonina al 3% resisten mucho mejor la radioterapia, no necesitando tratamiento con opioides. Ninguno de estos pacientes necesitó sonda nasogástrica, ninguno fue ingresado ni tuvo que interrumpir el tratamiento. Los no tratados con melatonina necesitaron todos opioides mayores y todos desarrollaron el grado máximo de radiodermitis. Algunos necesitaron ser ingresado con interrupción del tratamiento.

E- Conclusión de los ejemplos de la invención:

La composición farmacéutica que comprende melatonina al 1% no revierte la mucositis causada por radioterapia. Sin embargo, la composición farmacéutica que comprende melatonina al 3% revierte totalmente la mucositis producida por la radioterapia, lo mismo que sucede con la composición que comprende melatonina al 5%. Estos resultados demuestran la utilidad de una composición que comprenda melatonina entre el 3% y el 5% en el tratamiento de los efectos secundarios de la mucositis causada por radioterapia.

Los resultados mostrados en el presente documento demuestran que en la mucositis hay un daño mitocondrial y, por tanto, el éxito de este tratamiento radica en la aplicación oral de un gel de melatonina que impregna las mucosas y revierte el daño mitocondrial. Cualquier otro tipo aplicación de la melatonina no tiene un claro efecto en la mucositis, probablemente debido a que la melatonina se absorbe rápidamente, tiene una semivida muy corta (30 minutos), y no alcanza unos niveles terapéuticos suficientes en las mucosas, tanto de la cavidad bucal como las del aparato digestivo. Sin embargo, la composición de la invención que comprende el gel de Pluronic F-127 y melatonina a la concentración del 3% o superior, impregna las mucosas alcanzando concentraciones efectivas locales, permitiendo a la melatonina entrar en la mitocondria y ejercer sus efectos en todo el aparato digestivo.

Por tanto, estas formulaciones farmacéuticas para aplicación tópica en la cavidad bucal que contienen melatonina en dosis apropiadas para proteger la piel y mucosas frente al terrible daño producido por las radiaciones durante los periodos de radioterapia, tienen un gran interés clínico. Se ha encontrado que la administración parenteral de melatonina no aporta ningún beneficio respecto a la administración tópica en la cavidad bucal para el tratamiento y/o prevención de la mucositis, con el valor añadido de que una administración parenteral crónica es traumática para estos pacientes, siendo mucho más cómoda la administración tópica del gel.

Las mitocondrias desempeñan un papel importante en el control de la supervivencia celular, y se ha demostrado por primera vez, que la disfunción mitocondrial participa en gran medida en la fisiopatología de la mucositis (ver resultados). La disfunción mitocondrial se correlaciona con un agravamiento de la mucositis. Se ha encontrtado, por primera vez, que en las mitocondrias de lengua de ratas con mucositis, además del fallo bioenergético, hay un aumento de la glutatión peroxidasa (GPx), una reducción de la glutatión reductasa (GRd), y un aumento del cociente glutatión oxidado (GSSG)/glutatión reducido (GSH) (GSSG/GSH). Este último es un marcador preciso de la agresión oxidativa intracelular e intramitocondrial.

La presente invención demuestra que la melatonina a la concentración que contiene la composición de la invención reduce totalmente la agresión oxidativa mitocondrial en la mucositis aumentando la actividad de las enzimas antioxidantes mitocondriales, principalmente GRd. Paralelamente, hay un aumento de la actividad y expresión de los complejos de la cadena respiratoria, que están inhibidos en la mucositis. La composición de la invención tiene efectos antioxidantes y antiinflamatorios que composiciones con menor concentración no tienen. La aplicación tópica y oral de melatonina entre el 3 y el 5% (3 y 5 gramos de melatonina en 100 ml de la composición final) impide el deterioro de la función celular de las mucosas dañadas por radiaciones ionizantes.

Además, la aplicación tópica en la cavidad bucal mediante el gel de melatonina en mucositis es más eficaz que la administración parenteral, lo cual podría deberse a que la aplicación en la cavidad bucal en la formulación adecuada mantiene los niveles de melatonina más altos durante más tiempo en la cavidad bucal (y por extensión, en el aparato 5 digestivo), lo que facilita su acción local antioxidante y antiinflamatoria y, fundamentalmente, su acción dentro de la mitocondria impidiendo el daño tisular y, por tanto, el inicio de mucositis. Por ello, la aplicación tópica de melatonina entre el 3% y el 5%, en cavidad bucal, proporciona un potente sistema de defensa en estas patologías. Se ha demostrado que la composición de la invención permite proteger la mucosa gastrointestinal sometida a radioterapia, prevenir las lesiones provocadas por dichas radiaciones como la mucositis y curar dichas lesiones. Los resultados 10 obtenidos son extrapolables a quimioterapia.

Claims (15)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composición en gel que comprende un compuesto de fórmula general (I):

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   donde:

   “n” es un número entero entre 1 y 4;

   R1 y R3 son, iguales o diferente, un grupo alquilo (C1-C4) lineal o ramificado; y

   R2 es hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C4), lineal o ramificado, un grupo -C(=O)O-Ra o un grupo -C(=O)-N(H)- Ra; donde Ra es un grupo alquilo (C1-C4), lineal o ramificado, o las sales, profármaco y solvato del mismo,

   donde dicho compuesto está en una concentración del 2,5 a 5% p/v, para uso en el tratamiento y/o prevención de la mucositis, en donde dicha composición en gel se va a administrar por vía tópica a la superficie de la mucosa bucal.
2. 2. Composición en gel para uso según la reivindicación 1, donde R1 y R3 son, iguales o diferente, un grupo alquilo (C1-C2).
3. 3. Composición en gel para uso según la reivindicación 2, donde R1 y R3 son un grupo metilo.
4. 4. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R2 es hidrógeno.
5. 5. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el compuesto es la melatonina.
6. 6. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la concentración del compuesto es del 3% p/v.
7. 7. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la mucositis está causada por radioterapia y/o quimioterapia.
8. 8. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde la mucositis es mucositis oral, faríngea, esofágica, estomacal o intestinal.
9. 9. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la mucositis es mucositis oral.
10. 10. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la mucositis es en seres humanos.
11. 11. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde la composición comprende además al menos un excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable o un soporte farmacéuticamente aceptable.
12. 12. Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde la composición comprende un agente gelificante.
13. 13. Composición en gel para uso según la reivindicación 12, donde el agente gelificante se selecciona de la lista que comprende copolímero de polietileno y polipropileno, celulosa y goma guar.

14. 14.

    Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la composición además comprende al menos un conservante.

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    Composición en gel para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde la composición además comprende al menos un antioxidante.