ES2645022T3 - Dispositivo de extracción de sangre que contiene inhibidor de lisofosfolipasa - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Dispositivo de extraccion de sangre que contiene inhibidor de lisofosfolipasa ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La diabetes es un sfndrome de metabolismo alterado, normalmente debido a una combinacion de causas hereditarias y ambientales, que dan lugar a unos niveles de azucar en sangre anormalmente altos (hiperglucemia). Los niveles de glucosa en sangre son controlados por una interaccion compleja de multiples productos qufmicos y hormonas en el cuerpo que incluyen la hormona insulina generada en las celulas beta del pancreas. La diabetes mellitus se refiere al grupo de enfermedades que conduce a unos elevados niveles de glucosa en sangre debido a los defectos o bien en la secrecion de insulina o bien el la accion de la insulina en el cuerpo.

La diabetes se desarrolla debido a una produccion disminuida de insulina (en el tipo 1) o a la resistencia a sus efectos (tipo 2 y gestacional). Ambas conducen a la hiperglucemia, que en gran parte producen los sfntomas de la diabetes, a saber, excesiva produccion de orina, lo que da lugar a una sed compensatoria e ingesta de fluidos aumentada, vision borrosa, perdida de peso inexplicable, aletargamiento, y cambios en el metabolismo de la energfa.

Las inyecciones mediante una jeringuilla, bomba de insulina, o bolfgrafo de insulina administran insulina, que es un tratamiento basico de la diabetes de tipo 1. La diabetes de grupo 2 se trata con una combinacion de un tratamiento dietetico, ejercicio, medicamentos y suplemento de insulina. Todas las formas de diabetes son tratables dado que la insulina esta medicamente disponible, pero todavfa no tiene cura.

De acuerdo con un informe de la Organizacion Mundial de la Salud en 2000, al menos 171 millones de personas en el mundo padecfan diabetes, o el 2,8 % de la poblacion. Su incidencia esta aumentando rapidamente, sin embargo se estima que para el ano 2030, este numero sera de casi el doble. La diabetes mellitus se produce en todo el mundo, pero es mas comun (especialmente el tipo 2) en los pafses mas desarrollados. El mayor incremento de preponderancia, sin embargo, se espera que se produzca en Asia y Africa, en donde es probable que se encuentren la mayorfa de los pacientes para el ano 2030.

El peptido como glucagon (GLP-1), peptido de inhibicion gastrica (GIP), glucagon y grelina han sido reportados como biomarcadores pepticos de las enfermedades metabolicas tales como la diabetes. La principal fuente de GLP- 1 en el cuerpo se encuentra en los intestinos. La concentracion en sangre tfpica normal de GLP-1 en circulacion esta comprendida entre 3-85 picomolar. GLP-1 posee varias propiedades fisiologicas que lo convierten en una materia de intensa investigacion como tratamiento potencial de la diabetes. Gautier et al., Diabetes Met. 31; 233-42 (2005). Se sabe que el GLP-1 aumenta la secrecion de insulina del pancreas, disminuye la secrecion de glucagon del pancreas, aumenta la masa de celulas beta y la expresion del gen de insulina, inhibe la secrecion de acido y el vaciado gastrico del estomago y disminuye la entrada de comida por aumentar la saciedad. Baggio, el al., J, Gastroenterol. 132:2131-57 (2007). Una vez en circulacion, sin embrago, se ha reportado que el GLP-1 presenta una media vida biologica corta de aproximadamente 1,5 - 5 minutos (Hui, et al. Eur. J. Endocrinol. 146;863-9 (2002)), debido a la degradacion proteolftica causada por las proteasas que incluyen la dipeptidil peptidasa (DPP) - IV.

La forma activa de GIP es un 42-amino acido polipeptido representado por la secuencia: YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDKHNITGO ("GIP (1.42)"). El GIP (1.42) es sintetizado por las celulas K que se encuentran en la mucosa del duodeno y el yeyuno del conducto gastrointestinal. Se cree que GIP(1-42) induce la secrecion de insulina a traves de un mecanismo que implica la interaccion entre GIP y 7 receptores transmembrana GIP(1-42) en las celulas beta pancreaticas. La concentracion normal en ayunas de GIP (1-42) en plasma es de aproximadamente 6-12 pmol/L, mientras que la concentracion normal no en ayunas es de

aproximadamente 80-300 pmol/L. Se ha reportado que GIP (1-42) presenta una media vida en circulacion de

aproximadamente 5 minutos.

Glucagon, un 29-amino acido peptido, esta implicado en el metabolismo de los carbohidratos. Producido por el pancreas se libera cuando el nivel de glucosa en la sangre es bajo (hipoglucemia). Se une a los receptores en las celulas del hfgado (hepatocitos) haciendo que el hfgado convierta el glicogeno almacenado en glucosa y libere despues de glucosa al torrente sangufneo. Cuando estos almacenes se reducen, el glucagon entonces estimula la sfntesis de glucosa adicional en el hfgado. La accion de glucagon es de este modo opuesta a la de la insulina, que

da instrucciones a las celulas del cuerpo para asimilar la glucosa procedente de la sangre. El glucagon tambien

regula el regimen de produccion de glucosa a traves de un proceso conocido como lipolisis. La concentracion en sangre tfpica normal de glucagon en circulacion es de 11 - 17 picomolar. Una vez en circulacion, el glucagon tiene una media vida de aproximadamente 8 - 18 minutos.

La grelina es una hormona producida principalmente por las celulas P/D1 que recubren el fundus del estomago humano y las celulas epsilon del pancreas que estimulan el apetito. La concentracion en sangre tfpica normal esta tambien en el rango picomolar. La grelina es un 28-amino acido peptido que tiene la secuencia NH2- GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR-COOH. Una de las formas biologicamente activas de este peptido, conocida como grelina acilada, contiene un grupo n-octanol en Ser3 (es decir, -CH3(CH2)6COO-).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Este peptido ejerce acciones endocrinas tales como la estimulacion de la liberacion de Hormona del Crecimiento (GH) de la glandula pituitaria, y diversos efectos fisiologicos tales como la induccion de adiposidad (aumento del tejido graso) y aumento de peso corporal debido a los efectos de estimulacion del apetito e ingesta de comida aumentada, y estimulacion de la secrecion de acido gastrico y la motilidad. Kojima et al., Trends Endocrinol. Metab. 12;118-122 (2001); Kojima, et al., Physiol. Rev. 85:495-532 (2005). De este modo, ademas de la diabetes, la grelina acilada es un biomarcador metabolico conocido para condiciones relacionadas, tales como perdida de peso inducida por la dieta y por el ayuno. Otra forma de peptido de grelina se conoce como des-acil-grelina, que es una forma metabolicamente inactiva que tiene sus propias funciones que incluyen la modulacion de la proliferacion de celulas (Balzani, et al., J, Cell Biol. 159:1029 - 37 (2002); Ariyasu, et al., Endocrinol. 2005: 355 - 64 (2005)) y adipogenesis (Muccioli, et al., Eur. J. Pharmacol. 498:27 - 35 (2004)). La concentracion en plasma normal de la grelina, incluyendo tanto las formas activa como inactiva, esta comprendida entre aproximadamente 300 y aproximadamente 700 pg/ml (o aproximadamente 0,08 y aproximadamente 01,9 nM o aproximadamente 0,09 y aproximadamente 0,19 fmol/pl), y fluctua con el tiempo. La forma de circulacion principal de grelina es dec-acil grelina [Hodosa, et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 279:909-13 (2001)], y de este modo la mayorfa de esta cantidad no esta en la forma de biomarcador metabolico mas preciso. Una vez en circulacion, la grelina tiene una media vida de aproximadamente 30 minutos.

Yi, et al., J. Proteome Res. 6(5):1768-81 (2007), por ejemplo, reporta que la degradacion proteolftica de las protefnas del suero y del plasma causada por las proteasas intrfnsecas se produce durante los primeros minutos de la extraccion y manipulacion de la muestra (que sugiere la rapida degradacion proteolftica fuera del organismo). En una publicacion posterior, Yi el al., J. Proteome Res. 7(12):5112-8 (2008), reporta que aunque el descubrimiento de los marcadores de enfermedades en los fluidos de la sangre continua para acelerar a medida que la terminologfa de los proteomicos se hace tanto mas potente y mas ampliamente disponible, ha habido considerablemente menos exitos en la transicion de estos descubrimientos a utilidad clfnica, estimulando un interes creciente en el entendimiento de las barreras de esta transicion. Aparte de las medias vidas cortas y las concentraciones bastante pequenas de GLP- 1, GIP, glucagon y grelina (y particularmente las formas biologicamente activas de los mismos) en el plasma, surgen complicaciones debido a la variabilidad pre-analftica especialmente durante la extraccion de sangre y el manejo temprano de la muestra. Yi (2008) tambien reporta que en el caso de algunos biomarcadores de peptido, la degradacion proteolftica se produce en cuestion de segundos.

La publicacion Direct activation of CA2+ Channels by palmitoyl, carnitine, a putative edogenous ligand por Michael Spedding et al., Br. J. Fharmac (1987), 92, 457 - 468, se refiere a la carnitina de palmitol, un metabolito lfpido que se acumula en las membranas citoplasmicas durante las isquemia, y que se ha mostrado que se asemeja al activador de canal Ca2+, Bay K 8644, en el musculo liso K+-despolarizado.

El documento EP 1 113 269 A2 se refiere a una bandeja, kits y metodos de ensayo, para filtrar fluidos corporales de recien nacido mediante espectrometrfa de masas en tandem.

La publicacion Lysophospholipase I identified as a ghrelin deacylation enzyme in rat stomach by Shanado, Y., et al., Biochem Biophys Res Commun., 24 de Dic de 2004; 325 (4); 1487-94, se refiere a una grelina, descubierta en el estomago de las ratas como una hormona de crecimiento endogena secretagogo, que esta octanoilada en el residuo Ser3.

La publicacion Identificacion and characterization of acyl-protein thioesterase 1/lysophospholipase I as a ghrelin deacylation/lysophospholipid hydrolyzing enzyme in fetal bovine serum and conditioned medium por Satou M. et al., Endocrinology, Octubre de 2010; 151(10): 4765-75, se refiere a grelina que contiene acido octanoico en la tercera serina de residuo, siendo la presencia de acido octanoico en la glicerina crftica para sus funciones fisiologicas.

M. Satou et al. "Identification and Characterization of Acyl-Protein Thioesterase 1/Lysophospholipase I As a Ghrelin Deacylation/Lysophospholipid Hydrolyzing Enzyme in Fetal Bovine Serum and Conditioned Medium" ENdOcRINOLoGy, (20101001), vol. 151, no. 10, Paginas 4765-4775, se refiere al papel de la actividad del suero de APT1 en la determinacion de la concentracion de la des-acil grelina en circulacion, especialmente bajo inflamacion septica.

SUMARIO DE INVENCION

La materia objeto de la presente invencion esta definida en las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes se refieren a las realizaciones preferidas.

La grelina contiene un eje central peptido y una cadena lateral que contiene un grupo 8-carbono ester, que es susceptible para las proteasas endogenas y las esterasas respetivamente, que estan presentes en el plasma humado. Como se muestra en los ejemplos de trabajo, los Solicitantes han descubierto que la grelina puede ser estabilizada de forma mas efectiva en las muestras de sangre recogida o en el componente fluido (por ejemplo suero o plasma) mediante la inclusion de un inhibidor de lisofosfolipasa (LisoPLA), opuesto a un inhibidor de proteasa o una esterasa. En efecto, los datos de los Solicitantes muestran que la presencia adicional de un inhibidor de esterasa de estabilidad reducida o disminuida de grelina in vitro. Aparte del hecho de que la cadena lateral de grelina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

es un grupo "ester", estos descubrimientos son sorprendentes y no esperados especialmente a la vista de los informes en los que la actividad de LisoPLA es detectada en el estomago e intestino, pero no en el plasma. De este modo, la presente invencion ofrece estabilidad de almacenamiento relativamente mas larga de la sangre o der un componente de la misma con el fin de realizar ensayos clfnicos fiables, tales como la medida de los biomarcadores tales como la grelina.

Por consiguiente, un primer aspecto esta dirigido a un dispositivo de extraccion para extraer y estabilizar la sangre completa o un componente de la misma, que incluye un primer extremo y un segundo extremo y al menos una pared interior que define un deposito, en el que el deposito contiene un agente de estabilizacion que incluye un inhibidor de lisofosfolipasa (LisoPLA). En algunos ejemplos, el agente de estabilizacion incluye tambien al menos un inhibidor de otro tipo de enzima que esta normalmente presente en la sangre y que degrada los marcadores de diagnostico de las enfermedades metabolicas. Estas enzimas incluyen esterasas y proteasas. De este modo, en otros ejemplos, el dispositivo de extraccion de sangre incluye tambien un inhibidor de esterasa, tal como una butilcolinesterasa (BChE) o un inhibidor acetilcolinesterasa (AchE), y/o un inhibidor de proteasa (por ejemplo un inhibidor de proteasa serina, un inhibidor de una exopeptidasa, un inhibidor de dipeptidil peptidasa, y combinaciones de dos o mas de los mismos.

Tambien se proporcionan metodos de fabricacion y utilizacion de los dispositivos para la finalidad de extraer y almacenar sangre completa o componente(s) de la misma.

Un aspecto mas esta dirigido a un metodo para diagnosticar una enfermedad o monitorizar un tratamiento de un individuo con una enfermedad tal como una enfermedad metabolica (por ejemplo diabetes), que comprende medir a lo largo del tiempo (o al menos en un momento predeterminado a o intervalos de tiempo) la presencia o cantidad de uno o mas marcadores para la enfermedad, incluyendo grelina biologicamente activa (metabolicamente) en una muestra de sangre o componente de la misma extrafda de un paciente utilizando un dispositivo de extraccion de sangre de la invencion. En algunos ejemplos, el metodo incluye tambien medir al menos un marcador de enfermedad adicional seleccionado de glucagon, GIP, grelina y gLP-1 (que incluye GLP-1-(7-36)NH2 y GLP-1-(7- 37)), y combinaciones de dos o mas de los mismos.

Todavfa un aspecto mas esta dirigido a un metodo para monitorizar niveles en sangre de un profarmaco que contiene un grupo lateral de ester alifatico (por ejemplo grupo acil) en un individuo al que se le ha administrado el profarmaco, que incluye extraer una muestra de sangre del paciente utilizando el dispositivo de extraccion de sangre de la invencion, y medir la presencia o cantidad del profarmaco y/o un metabolito activo del mismo, en la muestra o componente de la misma. La presencia o cantidad del profarmaco y de un metabolito activo del profarmaco pueden ser medidas. La medida de los niveles en sangre del profarmaco y/o el metabolito pueden ser realizados mas de una vez, tal como a intervalos de tiempo predeterminados.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una vista en perspectiva de un dispositivo de extraccion de sangre tfpico de la presente invencion.

La Figura 2 es un grafico que muestra una comparacion de la estabilidad de acil-grelina en 30 horas en cuatro tubos de extraccion de sangre diferentes que contienen: 1) el inhibidor LisoPLA metil araquidonil fluorofosfato (MAFP), EDTA, el inhibidor de esterasa, tacrina, y los inhibidores de proteasa, L-treo-isoleucil tiazolidina, bestatina y leupeptina (un agente de estabilizacion de la invencion "ISA", designado en la figura comoA); 2) otro agente de estabilizacion de la invencion que incluye el anticoagulante EDTA y MAFP (designado en la figura como x); 3) EDTA e inhibidor de esterasa y los inhibidores de proteasa (el agente de estabilizacion comparativo "CSA" designado en las figuras como ♦) y 4) EDTA solo (designado en la figura como ■) seguido por la adicion de una cantidad conocida de 1 pg/uL de acil-g relina.

La Figura 3 es un grafico que muestra la estabilidad de la grelina en una muestra de sangre, extrafda de un sujeto humando en ayunas, a lo largo del tiempo, y extrafda y almacenada tanto el los tubos de EDTA con cantidad anadida conocida (♦) como no anadida (■) y tubos de extraccion que contienen un agente de estabilizacion representativo (que incluye MAFP como inhibidor LisoPLA) de la presente invencion (tanto con cantidad conocida anadida (A) como no anadida (x)).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Los dispositivos de extraccion de la presente invencion se utilizan para extraer y estabilizar la sangre completa o un componente de la misma, tal como concentrados de globulos rojos, concentrados de plaquetas, concentrados de leucocitos, y compontes fluidos de sangre que incluyen plasma y suero.

En general, los dispositivos de extraccion de muestra de sangre pueden abarcar cualquier dispositivo de extraccion que incluya tubos tales como tubos de ensayo y tubos de centrifugacion; dispositivos de extraccion de sangre de sistema cerrado, tales como bolsas de extraccion de sangre; jeringuillas, especialmente jeringuillas prerellenas; cateteres, placas microtituladoras y otras placas de multiples pocillos; configuraciones, tubos, vasos de laboratorio tales como frascos, matraces agitadores, botellas roller, viales, placas de microscopio, conjunto de placas de microscopio, cubreplacas, pelfculas y sustratos y conjuntos porosos; pipetas y puntas de pipeta; tejido y otros contenedores de extraccion de muestras biologicas; y cualquier otro recipiente adecuado para contener una muestra

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

biologica, asf como recipientes y elementos implicados en la transmision de las muestras. Ejemplos e ilustraciones en tales dispositivos se describen el la Patente de Estados Unidos de propiedad comun 7.309.468 concedida a Stevens et al.

La Figura 1 que esta ilustrada tambien en la Patente de Estados Unidos 7.309.468, muestra un dispositivo de extraccion de sangre tfpico 10, util para la presente invencion, que incluye un recipiente 12 que define una camara interna o deposito 14. En la realizacion ilustrada, el recipiente 12 es un tubo hueco que tiene una pared lateral 16, un extremo inferior cerrado 18 y un extremo superior abierto 20. Opcionalmente, un miembro de separacion 13 esta dispuesto dentro de la camara de recipiente 14. El miembro de separacion 13 sirve para ayudar a separar los componentes de la muestra de sangre, por ejemplo, mediante centrifugacion. El recipiente 12 esta dimensionado para recoger un volumen de sangre. Unos medios de cierre 22 para cubrir el extremo abierto 20 para cerrar el recipiente 12 son necesarios cuando se demande un producto esteril. En algunos ejemplos, el tubo esta configurado para una tapa de rosca. En los ejemplos en los que el tubo es evacuado, sin embargo, como en el caso en el que el recipiente contiene un inhibidor BChE pero no un inhibidor de proteasa, un tapon elastomero de fijacion estanca es generalmente empleado para contener el vacfo durante los periodos de almacenamiento requeridos. Preferiblemente, el cierre 22 forma una obturacion capaz de cerrar de forma efectiva el recipiente 12 y contener una muestra biologica en la camara 14. El cierre 22 puede ser uno de una variedad de formas que incluyen, pero no se limitan a, cierre de goma, cierres HEMOGUARD™, obturaciones metalicas, obturaciones de goma con bandas de metal, y obturaciones de diferentes polfmeros y disenos. Un escudo protector 24 puede recubrir el cierre 22.

El recipiente 12 puede estar hecho de cualquier material adecuado para vasos de laboratorio, incluyendo, por ejemplo, plastico (por ejemplo poliolefinas, poliamidas, poliesteres, siliconas, poliuretanos, epoxis, acrflicos, poliacrilatos, polisulfonas, polimetracrilatos, PEEK, poliamida y fluoropolfmeros) y productos de vidrio que incluyen cristal de sflice. Preferiblemente, el recipiente 12 es transparente. Ejemplos de materiales termoplasticos transparentes adecuados para el recipiente 12 incluyen policarbonatos, polietileno, polipropileno y polietilenotereftalato. Los materiales plasticos pueden ser materiales impermeables al oxigeno o pueden contener una capa impermeable o semi-impermeable al oxigeno. Alternativamente, el recipiente 12 puede estar hecho de un material plastico impermeable al agua y al aire.

La presion en la camara 14 esta seleccionada para introducir un volumen predeterminado de muestra biologica al interior de la camara 14. Preferiblemente, el cierre 22 esta hecho de un material elastico que es capaz de mantener la diferencia de presion interna entre la presion atmosferica y una presion menor que la atmosferica. El cierre 22 es tal que se puede perforar con una aguja 26 u otra canula para introducir una muestra biologica en el recipiente 12 como se conoce en la tecnica. Preferiblemente el cierre 22 es liberable. Los materiales adecuados para el cierre 22 incluyen, por ejemplo, goma de silicona, goma natural, goma de estireno butadieno, copolimeros de etileno-propileno y policloropreno.

Ejemplos adecuados de recipiente 12 incluyen tubos de pared unica o de multiples paredes. Un ejemplo mas especffico de un recipiente adecuado 12 se describe en la Patente de Estados Unidos 5.860.937.

El recipiente 12 puede contener tambien un separador tal como un gel, un separador mecanico u otro tipo de miembro de separacion (por ejemplo, papel de filtro o similar). Los separadores son utiles para la preparacion de plasma de sangre, especfficamente para separar plasma de la sangre humana o de animal completa. El gel es de manera deseable una formulacion de gel polimerico tixotropico. El gel puede ser un homopolfmero o un copolfmero y puede incluir geles con base de silicona tales como, por ejemplo, polisiloxanos o geles con base de hidrocarburo organico tales como por ejemplo, poliacrflicos, poliesteres, poliolefinas, polibutadienos cis oxidados, polibutenos, mezclas de aceite de soja epoxidizado e hidrocarburos clorinados, copolimeros de diacidos y propandioles, ciclopentadienos hidrogenados y copolimeros de alfa-olefinas con dialquilmaleatos. Ejemplos de separadores mecanicos que pueden ser utiles en la presente invencion se describen en las Patentes de Estados Unidos N° 6.516.953; 6.406.671; 6.409.528; y 6.497.325.

El recipiente 12 tambien puede estar adaptado para separar de forma centrffuga los linfocitos y los monocitos de las fases mas pesadas de una muestra de sangre completa. En tales realizaciones, los dispositivos tambien pueden contener un medio de gradiente de densidad de lfquido y unos medios para evitar el mezclado del medio de gradiente de densidad de lfquido con una muestra de sangre antes de la centrifugacion. Un ejemplo de tubo de extraccion de linfocito/monocito adecuado se describe el la Patente de Estados Unidos 5.053.134.

Aparte del ejemplo ilustrado en la Figura 1, otros tubos de extraccion de sangre comercialmente disponibles incluyen lo siguiente, todos ellos vendidos por Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes., N.J, con todos los registros y marcas registradas pertenecientes a Becton, Dickinson and Company; tubos de hematologfa VACUTAINER® (por ejemplo N° en catalogo 367650-1, 367661, 6405, 6385, 6564, 367653, 367665, 367658, 367669, 6450-8, 6535-37 y 367662); tubos K2EDTA VACUTAINER® (por ejemplo n° de catalogo 367841-2, 367856 y 367861); tubos PST VACUTAINER®, por ejemplo n° de catalogo 367793-4, 6698, 6595 y 6672); tubos CPT VACUTAINER® (por ejemplo n° en catalogo 362753 y 362760-1); tubos SST VACUTAINER®, por ejemplo n° de catalogo 367782-89, 6509-17 y 6590-92); y tubos ACD VACUTAINER® (por ejemplo n° de catalogo 367756, 364012 y 4816), y Tubos Microtainer® BD no evacuados con cierre Microgard™ BD (por ejemplo, 365987, 365965 y 365974) o Tubos Microtainer® BD

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

convencionales (por ejemplo, 365956, 365957, 365958, 365959, 365971, y 365973). Muchos tubos de extraccion de sangre comerciales tienen volumenes estandar comprendidos tfpicamente entre 250 microlitros a y que incluyen aproximadamente 10,0 ml, y en algunos casos hasta 16 ml. Volumenes tfpicos incluyen 250, 400 y 500 microlitros, asf como 200 ml, 3,5 ml, 4,0 ml, 5,0 ml, 8,0 ml, 8,5 ml y 10,0 ml.

En otros ejemplos, el dispositivo puede comprender un deposito integrado dentro de un cartucho de ensayo, el deposito capaz de contener un volumen de sangre completa comprendido entre 2 y 200 microlitros, mas preferiblemente 50 - 150 microlitros. Tales cartuchos se venden por ejemplo bajo la marca comercial i-STAT Point de Care System por Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois), y son utiles con un analizador de mano capaz de interactuar con el cartucho. Ejemplos de tales cartuchos y analizadores de mano utiles con la presente invencion incluyen el cartucho i-STAT CHEM8+ y el analizador de mano i-STAT® 1 respetivamente. Tales dispositivos se ensenan en las Patentes de Estados Unidos 5.096.669, 5.112.455, 5.821.399, 5.628.961, 7.419.821, 6.750.053 y US D337. 164.

Las lisofosfolipasas (LisoPLA) son enzimas que hidrolizan los lisofosfolfpidos (LisoPL) y especfficamente en las uniones de ester de acido carboxflico, que son intermediarios a modo de detergente en el metabolismo de los fosfolfpidos y juegan un papel esencial en muchos procesos fisiologicos y patologicos. La lisofosfatidilcolina (LisoPC), un constituyente normal de las membranas de la celula y que se cree que actua como un mensajero de lfpidos, que transforma las senales iniciadas desde los receptores de membrana, es un sustrato endogeno para LisoPLA. El amino acido y las correspondientes secuencias de acido nucleico de las LisoPLAs humanas se conocen en la tecnica. Veanse por ejemplo las Patentes de Estados Unidos 5.858.756; 6.004.792 and 7.294.496. De acuerdo con una pieza de evidencia presentada en la Patente de Estados Unidos 7.294.496, el mRNA de LisoPLA esta ampliamente distribuido en muchos tejidos, con corazon, placenta y musculo del esqueleto que son los mas abundantes, seguido del hfgado, pancreas, rinon, cerebro y pulmon y en otra pieza de evidencia (que contenfa mensajeros de mas tejidos), fueron observados patrones similares aunque la intensidad relativa para unos pocos tejidos fue cambiada en que la placenta y los testfculos son las fuentes mas abundantes para la hLisoPLA seguido pos las glandulas suprarrenal y salivares, hfgado, corazon, musculos del esqueleto, y el colon. Tambien se ha reportado que las lisofosfolipasas se producen en numerosas isoformas.

Ejemplos representativos de inhibidores de LisoPLA que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invencion incluyen etil octilfosfonofluoridato, isopropila dodecilfosfonofluoridato, n-dodecil-benzodioxafosforina 2- oxido, paltomil carnitina, bromoenol lactona, permitir trifluorometil cetona, y metil araquidionil fluorofosfonato (MAFP). Otros inhibidores pueden ser identificados utilizando metodos de ensayo conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo la Patente de Estados Unidos 7.294.496.

El inhibidor de LisoPLA esta presente en el dispositivo de extraccion en una cantidad efectiva para estabilizar diversas protefnas endogenas que pueden estar presentes en la muestra biologica, por ejemplo, grelina, y otras protefnas y peptidos que requieren un grupo ester alifatico para la actividad biologica. De este modo, aparte de grelina, que es un marcador de enfermedades metabolicas tales como diabetes, los dispositivos de extraccion proporcionan la estilizacion de otros neuropeptidos. Los inhibidores de LisoPLA funcionan por division de inhibicion del grupo ester alifatico. La determinacion de la cantidad del inhibidor LisoPLA para incluir en el dispositivo de extraccion de sangre depende de varios factores que incluyen potencia, solubilidad en agua, el volumen del dispositivo de extraccion de sangre, y la naturaleza y extension de las iteraciones no especificas (por ejemplo debido a la presencia de otras protefnas en la sangre tales como albumina de suero). Por consiguiente, para los fines de la presente invencion, la cantidad del inhibidor de LisoPLA (y las cantidades de agentes de estabilizacion adicionales se expresa mas convenientemente en terminos de un rango de concentracion (a partir del cual la cantidad real del inhibidor se puede calcular facilmente). La concentracion del inhibidor de LisoPLA generalmente esta comprendida entre aproximadamente 0,1 pM y aproximadamente 10 mM, y en algunas realizaciones entre aproximadamente 10 uM y aproximadamente 1 mM, y en algunas realizaciones entre aproximadamente 100 uM y aproximadamente 1mN (es decir, 10.000.000 nM). Tambien se contemplan todos los subrangos dentro de estos rangos. El termino "aproximadamente" como se ha utilizado en combinacion con todos los valores de concentracion expuestos aquf, se refiere a la variabilidad (valor mas/menos) del 50%.

Aunque no se pretende suscribir la teorfa, los presentes inventores creen que el inhibidor de LisoPLA puede proporcionar un doble beneficio, consistente en proyectar el grupo de ester alifatico procedente de la division por la LisoPLA, proteasas intrfnsecas normalmente encontradas en la sangre deberfa estar dificultada estericamente de la degradacion de la cadena amino acido del peptido. Dependiendo de tales factores como la naturaleza de analito, el formato de ensayo y el volumen de trabajo (es decir, manejo y almacenamiento de la sangre extrafda antes del analisis), los dispositivos de extraccion de sangre de la presente invencion pueden proporcionar estabilidad de marcadores bioqufmicos tales como la grelina durante horas o incluso uno o mas dfas mas que los dispositivos similares que no contienen el inhibidos LisoPLA.

En algunos ejemplos, el recipiente de extraccion de sangre de la invencion puede incluir al menos un agente de estabilizacion adicional, tal como un inhibidor de una esterasa, por ejemplo carboxiesterasas, tales como butilcolinesterasa y acetilcolinesterasa. Estos agentes de estabilizacion pueden proporcionar proteccion adicional contra la degradacion fuera del organismo de las protefnas y peptidos que requieren un grupo ester alifatico para la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

actividad biologica. De este modo aparte de la grelina, que es un marcador de enfermedades metabolicas tales como la diabetes, los inhibidores de esterasa pueden proporcionar estabilizacion mejorada de otros neuropeptidos. En algunas realizaciones, sin embargo, el agente de estabilizacion (y el dispositivo como un todo) no incluye un inhibidor de esterasa.

La butilcolinesterasa (BChE) (E.C. 3.1.1.8), tambien conocida como colinesterasa de suero o plasma, se cree que juega un papel en la capacidad del cuerpo para metabolizar la cocafna y otras drogas tales como la sucinilcolina y la aspirina. Vease, Lockridge, "Genetic Variants of Human Serum Butyrylcholinesterase influence the metabolism of the muscle relaxant succinylcholine". En, Kalow (ed.) Pharmacogenetics of Drug Metabolism New York: Pergamon Press, Inc, en pp. 15-50. BChE esta normalmente presente en el plasma humano en una cantidad de aproximadamente 5 mg/l (o aproximadamente 5 U/ml). Los inhibidores de BChE utiles para la presente invencion tienen un valor Ki no mayor de aproximadamente 0,5 pM (500 nM), o en algunas realizaciones un Ki no mayor de aproximadamente 0,05 pM (50 nM), o en todavfa otras realizaciones, un Ki no mayor de aproximadamente 0,010 pM (10 nM) (y que incluye todos los subrangos en el mismo). Kis son variables cineticas (opuestas a las propiedades ffsicas tales como el peso molecular, puntos de fusion y ebullicion, etc.) y como tales pueden estar sometidas a una variacion relativamente alta, especialmente dependiendo de la metodologfa utilizada para determinar este valor. De este modo el termino "aproximadamente" como se ha utilizado aquf en combinacion con los valores Ki, se refiere a una variabilidad (es decir un valor mas/menos) del 50%.

Un inhibidor BChE es el compuesto 9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina, tambien conocido como tacrina (y derivados del mismo). Vease la Patente de Estados Unidos 4.816.456. La tacrina es un inhibidor de colinesterasa que actua centralmente aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Esta registrado por Sciele Pharma bajo la marca registrada COGNEX. Ejemplos representativos de derivados de tacrina que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invencion se ensenan en la Patente de Estados Unidos 4.754.050, como se muestra en la siguiente formula:

imagen1

en donde n es 1, 2 o 3; X es hidrogeno, "loweralkyl", "loweralkoxy", halogeno, hidroxi, nitro, trifluorimetil, MHCOR2 en donde R2 es "loweralkyl", o NR3R4 en donde R3 y R4 son independientemente hidrogeno o "loweralkyl"; R es hidrogeno o "loweralkyl"; R1 es hidrogeno, "loweralkyl", "diloweralkylaminioloweralkyl", "arylloweralkyl", "diarylloweralkyl", "furilloweralkyl", "thienylloweralkyl, "arylloweralkyl" puenteado con oxfgeno, diarylloweralkyl puenteado con oxfgeno, "furilloweralkyl" o "thienilloweralkyl" puenteado con oxfgeno; Y es C = 0 o CR5OH en donde R5 es hidrogeno o loweralquilo; Z es CH2 o C = CR6R7, en donde R6 y R7 son independientemente hidrogeno o loweralkyl; o Y y Z tomados juntos es CR5 = CH en donde CR5 y CH corresponden a Y y Z respetivamente; una antfpoda optica de los mismos, o una sal de adicion de acido farmaceuticamente aceptable de los mismos.

Los derivados de tacrina especfficos abarcados por esta formula incluyen los siguientes:

9-Amino-3,4-dihidroacridina-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6-metilacridina-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6- metoxiacridina-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6-fluoroacridina-1 (2H)-ona; 9-Amino-6-cloro-3,4-

dihidroacridina-1 (2H)-ona; 9-Amino-7-cloro-3,4-dihdroacridina-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6-

trifluorometilacridina-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-7-nitroacridina-1 (2H)-ona; 7,9-Diamino-3,4-

dihidroacridina-1 (2H)-ona; N-[9-Amino-3,4-dihidro-1 (2H)-oxoacridina-7-il]acetamida; 3,4-Dihidro-9-

metilaminoacridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-metilamino-7-nitroacridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-

propilaminoacridina-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-[2-(dimetilamino)etil]aminoacridina-1(2H)-ona; 9-Benzilamino-

3.4- dihidroacridina-1 (2H)-ona; 9-Benzilamino-3,4-dihidro-6-metilacridina-1 (2H)-ona; 9-Benzilamino-3,4-dihidro-

6-fluoroacridina-1 (2H)-ona; 9-Benzilamino-6-chloro-3,4-dihidroacridina-1 (2H)-ona; 9-Benzilamino-3,4-dihidro- 6-trifluorometillacridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-metilbenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-

methilbenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4-metilbenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2- metoxibenzilamino)acridina-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-metoxibenzilamino)acridina-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9- (4-metoxibenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-fluorobenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro- 9-(3-fluorobenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4-fluorobenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 6-Chloro-

3.4- dihidro-9-(4-fluorobenzilamino)acridina-1(2H)-ona; 9-(2-Clorobenzilamino)-3,4-dihidroacridina-1(2H)-ona; 9-(3-Clorobenzolamino)-3,4-dihidroacridina-1(2H)-ona; 9-(4-Clorobenzilamino)-3,4-dihidroacridina-1(2H)-ona;

3.4- Dihidro-9-[(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)amino]acridina-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

trifluorometilbenzilamino)acridina-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-6-fluoro-9-(2-trifluorometilbenzilamino)acridina-1(2H)- ona; 3,4-Dihidro-9-(3-trifluorometilbenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4-

trifluorometilbenzilamino)acridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-fenetilaminoacridina-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4,4- difenilbutil)aminoacridina-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4,4-difenilbutilamino)-6-trifluorometilacridina-1(2H)-ona; 9- [4,4-Bis(3-fluorofenil)butilamino]-3,4-dihidroacridina-1(2H)-ona; 9-[4,4-bis(4-fluorofenil)butilamino]-3,4-

Dihidroacridina-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-fenoxipropilamino)acridina-1(2H)-ona; 9-[2-[Bis(4-

fluorofenil)metoxi]etilamino-3,4-dihidroacridina-1(2H)-ona; 9-[4-(Benziloxi)benzilamino]-3,4-dihidroacridina- 1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-[(2-tienil)metilamino]acridina-1 (2H)-ona; 9-Amino-2,3-dihidro-ciclopenta[b]quinolina- 1-ona; 9-Amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-Amino-6-cloro-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-Amino-7- cloro-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-Amino-6-methoxi-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-Amino-6-fluoro-

1.2.3.4- tetrahidroacridina-1-ol; 9-Amino-1,2,3,4-tetrahidro-6-trifluorometilacridina-1-ol; 9-Metilamino-1,2,3,4- tetrahidroacridina-1-ol; 9-Propilamino-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-[2-(Dimetilamino)etil]amino-1,2,3,4- tetrahidroacridina-1-o; 9-Benzilamino-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-Benzolamino-6-metil-1,2,3,4- tetrahidroacridina-1-ol; 9-Benzilamino-6-fluoro-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-Benzilamino-6-chloro-1,2,3,4- tetrahidroacridina-1-ol; 9-Benzilamino-1,2,3,4-tetrahidro-6-trifluorometilacridina-1-o; 9-(2-Metilbenzilamino)-

1.2.3.4- tetrahidroacridina-1-ol; 9-(3-Metilbenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-(4-Metilbenzilamino)-

1.2.3.4- tetrahidroacridina-1-ol; 9-(2-Metoxobenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-(3-

Metoxibenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-(4-Metoxibenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9- (2-Fluorobenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-(3-Fluorobenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-(4-Fluorobenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 6-Cloro-9-(4-fluorobenzilamino)- 1,2,3,4-

tetrahidroacridina-1-ol; 9-(2-Clorobenzilamino)- 1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-(3-Clorobenzilamino)-1,2,3,4- tetrahidroacridina-1-ol; 9-(4-Clorobenzilamino)- 1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 1,2,3,4-Tetrahidro-9-(2- trifluoromethylbenzyl)aminoacridina-1-ol; 6-Fluoro-1,2,3,4-tetrahidro-9-(2-trifluorometilbenzilamino)acridina-1- ol; 1,2,3,4-Tetrahidro-9-(3-trifluorometilbenzilamino)acridina-1-ol; 1,2,3,4-Tetrahidro-9-(4-

trifluorometilbenzilamino)acridina-1-ol; 9-[(2,3,4,5,6-Pentafluorobenzil)amino]-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9- Fenethilamino-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-(4, 4-Difenilbutil)amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-[4, 4- Bis(3-fluorofenil)butilamino]-1,2,3,4-tetrahydroacridina-1-ol; 9-[4,4-Bis(4-fluorofenil)butilamino]-1,2,3,4-

tetrahidroacridina-1-ol; 9-(3-Phenoxipropilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-[[2-[Bis(4-

fluorofenil)metoxi]ethil]amino]-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-[4-(Benziloxi)benzilamino]-1,2,3,4-

tetrahidroacridina-1-ol; 9-[(2-Tienil)metilamino]-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-Amino-3,4-dihodroacridina; 9- Amino-1-metil-1,2,3,4-tetrahidroacridina-1-ol; 9-Amino-3,4-dihidro-2-metileneacridina-1(2H)-ona; Amino-

1.2.3.4- tetrahidro-ciclopenta[b]quinolina-1-ol; 2-(3-0xoclohexen-1-il)aminobenzonitrilo; y 4-Cloro-2-(3- oxociclohexen-1-il)aminobenzonitrilo.

Otros inhibidores de butirilcolinesterasa que pueden ser: adecuados para utilizar en la presente invencion incluyen dfmeros de tacrina tales como etopropazina, (es decir, N,N,N-dietil-a-metil-lOH-fenotiazina-10-ethanamine; 10-(2- dietilamino-2-metiletil)fenotiazina; o fenopropazina), y derivados de los mismos. Vease, por ejemplo las patentes de Estados Unidos 2.607.773 and 4.833.138. Etopropazina, sal de hidrocloruro, ha sido aprobada por la FDA para utilizar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Todavfa otros inhibidores de butirilcolinesterasa incluyen hfbridos de tacrina y (-)-huperzina A (que es un alcaloide de licodina enantiomerico aislado del musgo de trebol Huperzia serrata de las especies Lycopodium, Huperziaceae). Ejemplos de hfbridos de Huperzina A-tacrina se conocen en la tecnica como compuestos 5a, 5b y 5c, y Huprina X. Sus correspondientes nombres qufmicos son los siguientes:

((9E)-Nl-(7-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilamino)heptil)-9-etilideno-4,4,7-trimetilbiciclo[3.3.l]non-6-eno-1,3- diamina) (5a); ( (9E) -N1-(7-(1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-ilamino)heptil) -9-etilideno-47-metilbiciclo [3 .3 .1] non-6-eno-1, 3-diamina) (5b); ( (9E) -N1-(7-(1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-ilamino)heptilamino) -9-etilideno-3- metilbiciclo [3 .3 .1] non-3-eno-1-carboxflico Acido Metil Ester) (5c); y (1S) -7-cloro-15-etil-10-azatetraciclo [ll .3 .1. 0A {2, 11}. 0 A {4, 9}] heptadeca-2(11),3,5,7,9,14-hexaen-3-amina)(Huprina X). Metodos de sintetizacion de estos componentes se describen el Gemma, et al., J. Med. Chem. 49(11): 3421-25 (2006) (5a, 5b and 5c), y Camps, et al., Mol. Pharmacol. 57:409-17 (2000) (Huprine X).

La concentracion de BChE generalmente esta comprendida entre aproximadamente 5 pM y aproximadamente 500 mM (es decir, 5x108 nM), y en algunas realizaciones rangos comprendidos ente aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 50 mM, y en todavfa otras realizaciones, entre aproximadamente 0,1 pM y aproximadamente 10 mM. Tambien se contemplan todos los subrangos dentro de estos rangos. Como en el caso de los valores Ki, el termino "aproximadamente" como se ha utilizado en combinacion con todos los valores de concentracion descritos aquf, se refiere a una variabilidad (valor mas/menos) del 50%.

El agente de estabilizacion tambien puede incluir un inhibidor de otro tipo de esterasa de suero, y especfficamente un inhibidor de otra B-esterasa (de la que BChE es un miembro). Estas esterasas incluyen acetilcolinesterasa (AChE) (EC3.1.1.7) y carboxilesterasa no especffica (EC 3.1.1.1). Inhibidores de AChE actuan sobre la colinesterasa y la inhiben de romper la acetilcolina que funciona en el cuerpo como un neurotransmisor. Algunos inhibidores de BChE tales como tacrina y huperazina A se sabe que inhiben la acetilcolinesterasa tambien. La tacrina tiene un Ki reportado para AChE de 6,9 nm (Bencharit, et al., Chem. Biol. 10:341-9 (2003)). La huperzina A

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tiene un Ki reportado para AChE de 47 nm (Gemma, et al., J. Med. Chem. 49: 3421-5 (2006)). Dado que BChE constituye una parte significativa de la actividad de esterasa total en el suero humado (es decir, aproximadamente 5 mg/L de BChE comparado con 0,008 mg/L para AChE), la inclusion de inhibidores en el tubo de extraccion de sangre es opcional.

Los Kis de los inhibidores de AChE adecuados son tfpicamente aproximadamente 500 nm o menos, y en otras realizaciones, menos de aproximadamente 400 nm, 300 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm o 10 nm. Como se ha expuesto aquf, los valores Ki de para un inhibidor de AChE dado se pueden determinar de acuerdo con tecnicas de ensayo estandar.

De este modo otros inhibidores de AChE incluyen los siguientes:

Huprina X ( (1S) -7-coloro-15-etil-10-azatetraciclo[11.3.1.0 A {2,1}.0 A {4,9}] heptadeca-2(11),3,5,7,9,14-hexae n-3-amina) (Ki de 0,026 nm); Dfmero de Tacrina 4a (methilbis[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9- ylamino)propil]amine) (Ki de 0.06 nm); Dfmero de Tacrina 4d (2-{bis[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9- ilamino)propil]amino}etan-1-ol | N,N-Bis[3-[ (1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-yl)amino]propil]-N-hidroxietilamina) (Ki de 0,65 nm); Derivativo de Tacrina 2 (6,8-dicloro-1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-amine) (Ki de 1,0 nm); Dfmero de Tacrina 3b Analogo de Tacrina Homodimerica 3b | N-[7-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9- ilamino)heptil]-1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-amina | compuesto 3a homobivalente de tacrina) (Ki de 1,3 nm); Dfmero de Tacrina 4c (N,N-Bis[3-[(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-il)amino]propil]-N-allilamina | prop-2-en-1- ilbis[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilamino) propil] amina) (Ki de 1,6 nm); Dfmero de Tacrina 3c (Analogo de tacrina Homodimerico 3c | N-[8-(l,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilamino)octil]-1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 1,9 nm); Dfmero de Tacrina 4b (N,N-Bis[3-[(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)amino]propil]-N-etilamina | etilbis [3-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilamino) propil] amina) (Ki de 2,8 nm) ; compuesto 3c heretobivalente de tacrina (N-{7-[(6,8-dicloro-1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-yl)amino]heptil}-1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 6,0 nm); Hfbrido 5c de Huperzina A-Tacrina ((9E)-7-(7-(1,2,3,4-Tetrahidroacridina-9-ilamino)heptilamino)-9- etilideno-3-metilbiciclo[3.3.1]non-3-eno-1- Acido Metil Ester carboxflico | metil (1S)-9-etilideno-3-metil-7-{[7- (1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilamino)heptil]amino}biciclo[3.3.l]non-3-eno-1-carboxilato) (Ki de 6,4 nm); Dfmero de Tacrina 4j (N-Metil-N-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-il)-N-[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilsulfanil)propil]-1,3- propanodiamina | metil [3-(1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-ilamino) propil] [ 3-(1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9- ilsulfanil) propil] amine) (Ki de 9,1 nm); Hfbrido 5b de Huperzina A-Tacrina ((9E)-N1-(7-(1,2,3,4- Tetrahidroacridina-9-ilamino)heptil)-9-ethilideno-7-metilbiciclo[3.3.l]non-6-eno-1,3-diamina | N-(7-{ [(1 S)-1 -

amino-9-ethilideno-7-metilbiciclo[3.3.1]non-6-en-3-il] amino}heptil) -1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 15,70 nm); Hfbrido 5a de Huperzina A-Tacrina (9E)-N1-(7-(1,2,3,4-Tetrahidroacridina-9-ilamino)heptil)-9- etilideno-4,4,7- trimetilbiciclo[3.3.l]non-6-eno-l,3-diamina | N-(7-{ [ (1S) -1-amino-9-etilideno-4,4,7-

trimetilbiciclo[3.3.1]non-6-en-3-il] amino}heptil) -1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 16,50 nm); AP2238 3-(4-{ [Benzil(metil)amino]metil}-fenil)-6,7-dimetoxi-2H-2-cromonona | 3-(4-

{[benzil(metil)amino]metil}fenil)-6,7-dimetoxi-2H-cromon-2-ona) (Ki de 21,70 nm); Dfmero de Tacrina 4i (N-(1, 2, 3, 4-Tetrahidroacridina-9-il) -N-[8-(l, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-il)oct-1-il]amina | N-[8-(1,2,3,4-

tetrahidroacridina-9-il) octil] -1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 30 nm); compuesto 3g heterobivalente de tacrina (6,8-dicloro-N-[7- (l,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilsulfanil)heptil]-1,2,3,4- tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 41 nm); Dfmero de Tacrina 4m (N-[3-(1, 2, 3, 4-Tetrahidroacridina-9-ilamino) propil] -N-[4-(1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-ilsulfanil) butil] acetamida) (Ki de 4 7 nm); 9-Amino-6-Cloro-2- Metoxiacridina (6-cloro-2-metoxiacridina-9-amina) (Ki de 49 nm); Dfmero de Tacrina 4k (N-[3-(1,2,3,4- Tetrahidroacridina-9-ilamino)propil]-N-[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilsulfanil) propil] acetamida) (Ki de 50 nm) ; compuesto 3i heterobivalente de tacrina (N-[6-(1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilsulfanil)hexil]-1,2,3,4- tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 100 nm); compuesto 3b homobivalente de tacrina (6,8-dicloro-N-{7-[(6,8- dicloro-1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-il)amino]heptil}-1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 150 nm); Dfmero de Tacrina 3a (N-[5-(1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-ilamino) pentil] -1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 210 nm); Dfmero de Tacrina 4g (N-[8-(1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina-9-ilsulfanil) octil] -1, 2, 3, 4- tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 250 nm); compuesto 3f heterobivalente de tacrina (N-{7-[(6,8-dicloro-

1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-il)sulfanil]heptil}-1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-amina) (Ki de 290 nm); 1, 2 - Compuesto con base de diona, 8 (1,2-dihidronaftaleno-1,2-diona | 1, 2 -naftoquinona) (Ki de 320 nM);

Dfmero de Tacrina 4f (N-[7- (1,2,3,4-tetrahidroacridina-9-ilsulfanil)heptil]-1,2,3,4- tetrahidroacridina-9-arnina | compuesto 3e heterobivalente de tacrina Ki de 340 nm); y 6, 9-Diamino-2-Etoxiacridina (7- etoxiacridina-3, 9- diamina) (Ki de 490 nm). Los valores Ki descritos aquf para los inhibidores de AchE anteriormente mencionados esta reportados en Gemma, et al., J. Med. Chem. 49:3421-5 (2006); Carnpiani, et al., J. Med. Chem. 48: 1919-29 005); Wong, et al., J. Am. Chem. Soc. 125:363-73 (2003); Savini, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 177 9-8 2 (2001); Piazzi, et al., J. Med. Chem. 46:2279-82 (2003); Bencharit, supra.; and Hyatt, et al., J. Med. Chem. 50:5727-34(2007).

Ejemplos adicionales de inhibidores de AChE incluyen los siguientes: organofosfatos (por ejemplo, Metrifonato, Ecotiofato, fluorofosfatos de diisopropil, Ciclosarfn, Dimetoato, Sarin, Sornan, Tabun, VX, VE, VG, VM, Diazinon, Malation y Paration); carbamatos (por ejemplo, Fisostigmina, Neostigmina, Piridostigmina, Ambenonio, Demarcario, Rivastigmina, Aldicarb, Bendiocarb, Bufencarb, Carbaril, Carbendazima, Carbetarnida, Carbofuran, Clorbufam, Cloroprofam, Etiofencarb, Formetanato, Metiocarb, Metormil, Oxamil, Fenmedifam, Pinmicarb, Pirimicarb,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Propamocarb, Profam y Propoxur); derivados de Penantreno (por ejemplo, galantamina); piperidinas (por ejemplo, Donepezil (E2020) (Ki de 2.9 nm)); Edrofonio; y compuestos naturales (por ejemplo, galantamina y Onchidal).

Dado que algunos inhibidores BChE tambien presentan una potente actividad inhibidora de AChE, los ejemplos de la presente invencion incluyen un unico inhibidor de esterasa que posee tanto actividades inhibitorias de BChE como de AChE.

La concentracion de inhibidor de esterasa adicional que puede estar presente en el dispositivo de extraccion de sangre generalmente esta comprendida entre aproximadamente 0,1 pM y aproximadamente 70 mM, y en algunos ejemplos, entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 7 mM.

El agente de estabilizacion tambien puede incluir un inhibidor de proteasa. Los inhibidores de proteasa presentan actividad inhibidora contra una o mas clases de proteasas que incluyen, por ejemplo proteasas de serina, exopeptidasas y dipeptidil peptidasas. De este modo, el dispositivo puede contener un coctel de dos o mas de tales inhibidores incluyendo, por ejemplo, un inhibidor de proteasa de serina y un inhibidor de una exopeptidasa, un inhibidor de una proteasa de serina y un inhibidor de una dipeptidil peptidasa, y un inhibidor de una proteasa de serina, un inhibidor de dipeptidil peptidasa. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 7.309.468 concedida a Stevens, et al.

Ejemplos representativos de inhibidores de proteasa de serina incluyen antipaina, aprotinina, antitrombina, quimostatina, DFP, elastatinal, APMSF, fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), AeBSF, TLCK, TPCK, leupeptina, tripsina e inhibidor de tripsina de soja. Concentraciones de inhibidores de proteasa de serina estan generalmente comprendidas entre aproximadamente 0,1 pM y aproximadamente 100 pM.

Ejemplos representativos de inhibidores de exopeptidasa incluyen amastatina, bestatina, diprotina A and diprotina B. las concentraciones de inhibidores de exopeptidasa generalmente estan comprendidas entre 0,01 mM y aproximadamente 1 mM.

La actividad de dipeptidil peptidasa (que incluye actividades DPP-IV y similares a DPP-IV) presentes en la circulacion es altamente especffica en la liberacion de dipeptidos del extremo N-terminal de los peptidos biologicamente activos con prolina o alanina en la penultima posicion de la secuencia N-terminal del sustrato peptido. Los polipetidos insulinotropicos dependientes de glucosa GI P1-42 y GLP-17-36, potencian la secrecion de insulina inducida por la glucosa desde el pancreas (incretinas), son sustratos de DPP-IV. La enzima DPP-IV libera los dipeptidos tirosinil-alanina y histidil-alanina, respetivamente, de los N-terminales de estos peptidos tanto in vitro como in vivo. Mentlein, et al., Eur. J. Biochem. 214, 829 (1993). Ejemplos representativos de inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) incluyen vildagliptina, sitagliptina, saxagliptina, linagliptina y alogliptina. Otros inhibidores de DPP-IV incluyen compuestos de dipeptido formados a partir de un aminoacido tal como la isoleucina, Asn, Asp, Glu, His, Pro y Val, y un grupo tiazolidina o pirrolidina, y esterioisomeros, por ejemplo, formas L-tero y L-alo de los mismos, y sales inorganicas y organicas de los mismo (por ejemplo, fosfato, sulfato, acetato, tartarato, succinato y fumarato). Ejemplos especfficos de los compuestos de dipeptido incluyen L-treo-isoleucil tiazolidina, L-alo-isoleucil tiazolidina, L-treo-isoleucil pirrolidida, y L-alo-isoleucil pirrolidida. Concentraciones de inhibidor de dipeptidil peptidasa estan generalmente comprendidas entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 1 mM.

El agente de estabilizacion puede contener ademas inhibidores de otras clases de proteasas. De este modo, en ejemplos adicionales, los dispositivos de extraccion de sangre tambien pueden contener un inhibidor de una proteasa de cisterina (por ejemplo IAA (acido indolacetico) y E-64), una proteasa de serina/cisterina (por ejemplo. leupeptina, TPCK, PLCK-HCL, 2- heptanona-HCL, y antipain-HCl), una proteasa arpartica (por ejemplo, pepstatina y VdLPFFVdL), una metaloproteasa (por ejemplo, EDTA, bestatina, 1, 10-phenanthroline y fosforamodon), una tiol proteasa, una proteasa aspartica/calpaina (por ejemplo, pepstatina, N-acetil-leu-leu-norleucinal y N-acetil-leu-leu- metioninal), una caspasa, una endopeptidasa (por ejemplo, a2-macroglobulina (referido como un inhibidor de endopeptidasa universal), a1-anti-tripsina y tiorfan), y combinaciones de dos o mas de los mismos. Ejemplos adicionales de inhibidores de proteasas incluyen inhibidor de tripsina de soja y judfa, inhibidora de proteasa pancreatica, ovostatina blanca de huevo y cistatina blanca de huevo. Los expertos en el campo de los proteomicos apreciaran que un inhibidor dado puede presentar actividad inhibidora contra una o mas proteasas en la misma clase de proteasas, asf como una actividad inhibidora contra una o mas proteasas de diferentes clases de proteasas. La bestatina y la amastatina, por ejemplo, presentan actividad inhibidora contra las metaloproteasas asf como contra las exopeptidasas.

Ejemplos que emplean una pluralidad de agentes de estabilizacion, por ejemplo, ademas de un inhibidor de LisoPLA, un inhibidor de proteasas, o un inhibidor de BChE y un inhibidor de proteasa), tambien estan referidos aquf como un coctel de agentes de estabilizacion.

El agente de estabilizacion puede estar presente en cualquier forma adecuada, incluyendo lfquidos (por ejemplo, soluciones y suspensiones) y solidos (por ejemplo pelets, tabletas, capsulas, material secado por rociado, material secado por congelacion, polvo, partfculas, cristales y materiales liofilizado) y semi-solidos (por ejemplo gel). La liofilizacion puede ser particularmente util ya que proporciona buena estabilidad (por ejemplo, en terminos de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

maximizar la propia vida del agente de estabilizacion) y tambien permite la posterior esterilizacion. Por ejemplo, el agente estabilizante puede ser introducido en el recipiente del dispositivo en forma de una composicion lfquida, y despues ser liofilizado mediante tecnicas estandar. El secado por congelacion, por ejemplo, implica la congelacion de la composicion lfquida y despues el calentamiento lento despues de la congelacion a la vez que se aplica simultaneamente un vacm, de manera que un polvo secado con congelacion permanece en el dispositivo de extraccion. Se pueden anadir diversos aditivos tanes como PVP o trehalosa a la composicion lfquida antes del secado pro congelacion para facilitar la formacion de pelets del agente de estabilizacion y la reconstruccion de los agentes liofilizados despues del contacto con la sangre. Tambien se puede utilizar el secado por vacm despues de anadir la composicion lfquida. En otras realizaciones, el agente de estabilizacion esta formado en un lfquido o aerosol solido, y es rociado cobre una o mas superficies del interior de recipiente. La encapsulacion o formulacion del agente de estabilizacion en forma de pastilla lo protege de la exposicion a la luz y evita otras interacciones indeseables entre los inhibidores y otros elementos en el recipiente. Los materiales de encapsulacion y excipientes utiles en la fabricacion de pastillas y capsulas que se disuelven en la extraccion de la muestra son bien conocidos en la tecnica.

Ademas de estar dispuesto en el deposito, el agente de estabilizacion puede estar situado en cualquier superficie del dispositivo de extraccion que entre en contacto con la sangre extrafda. Por ejemplo, el agente de estabilizacion puede estar tambien situado en tapones y obturaciones para cerrar el dispositivo, o en elementos mecanicos, u otros insertos situados dentro del dispositivo.

Ademas del agente de estabilizacion, el dispositivo a modo de ejemplo tambien puede contener un medio portador (por ejemplo, agua o alcohol), medios de estabilizacion o reconstruccion (por ejemplo, polivinilpirrolidona, trehalosa, manitol, etc.) y/o uno o mas de otros aditivos para tratar la muestra biologica. Los aditivos tfpicos incluyen fenol, mezclas de fenol/cloroformo, alcoholes, aldehfdos, cetonas, acidos organicos, sales de acidos organicos, sales de metal de alcalis de haluros, agentes de quelatizacion organica, tintes fluorescentes, anticuerpos, agentes ligantes, anticoagulantes tales como citrato de sodio, heparina, EDTA y sus sales (por ejemplo, EDTA de potasio), antioxidantes, agentes reductores y agentes amortiguadores. Preferiblemente, el portador y los aditivos no degradan las protemas. Cuando los inhibidores estan en forma de pastilla, pueden ser incluidos materiales de desintegracion de pastilla farmaceuticos, que son conocidos en la tecnica, si se desea.

Un proceso de fabricacion util pata un dispositivo implica obtener un recipiente de extraccion, tal como un tubo; anadir el agente de estabilizacion (por ejemplo un inhibidor de LisoPLA y un inhibidor de proteasa) al recipiente; liofilizar los inhibidores; evacuar el recipiente; y esterilizar el recipiente. Se puede anadir un miembro de separacion al recipiente, si se desea. Un ejemplo de proceso de liofilizacion/evacuacion adecuado es como sigue: el recipiente es congelado a una temperatura de aproximadamente -40 °C a una presion de aproximadamente 760 mm durante aproximadamente 6 a 8 horas; el recipiente se seca a una temperatura creciente de -40 °C a aproximadamente 25 °C, a una presion de aproximadamente 0,05 mm, durante aproximadamente 8 a 10 horas; y el recipiente es entonces evacuado a una temperatura de aproximadamente 25 °C y a una presion de aproximadamente 120 mm durante aproximadamente 0,1 horas. Preferiblemente, la tecnica de esterilizacion es con radiacion de cobalto 60.

La sangre completa o componente(s) de la misma pueden ser extrafdos del paciente directamente al interior de un dispositivo de extraccion de sangre sin ninguna etapa de proceso interviniente. Se ha encontrado que la extraccion de la sangre completa directamente del paciente, y la introduccion de la muestra directamente en el dispositivo que contiene el agente de estabilizacion evita de manera sustancial la degradacion y/o fragmentacion de las protemas que de otro modo se producina cuando la muestra es almacenada antes de combinarla con el agente de estabilizacion. El metodo de la presente invencion es util tanto con dispositivos de extraccion abiertos como con dispositivos de extraccion cerrados, en los que la abertura esta cerrada mediante medios de cierre.

En un ejemplo preferido, el dispositivo de extraccion es un tubo que se utiliza para extraer una muestra de sangre completa directamente de un paciente para estabilizar las protemas inmediatamente en el punto de extraccion. El tubo de extraccion puede ser un sistema evacuado para la extraccion de sangre. Alternativamente, el tubo puede ser un sistema parcialmente evacuado o no evacuado para la extraccion de sangre. Un ejemplo adecuado de un sistema evacuado es un tubo cerrado. Una extraccion de jeringuilla manual es un ejemplo adecuado tanto de sistema, parcialmente evacuado como no evacuado. Los sistemas no evacuados tambien pueden incluir sistemas de extraccion automaticos. Son particularmente preferidos los sistemas evacuados.

Los dispositivos de extraccion de sangre son particularmente adecuados para estabilizar las protemas que contienen cadenas laterales de ester alifatico, tales como grelina, y en las realizaciones que incluyen un inhibidor de proteasas, biomarcadores de protema adicionales de enfermedades, por ejemplo GLP-1, GIP y glucagon, que son biomarcadores para enfermedades metabolicas, tales como la diabetes. De este modo, los dispositivos de extraccion se pueden utilizar para proporcionar estandares fiables en los que se facilite el diseno de ensayos tales como ELISA que permitira la deteccion de estas protemas en el rango de 10"9 - 10"11 M, que incluye niveles de circulacion de estas protemas en individuos sanos asf como niveles terapeuticos. De este modo, ademas de los metodos para el diagnostico de una enfermedad, tales como un desorden metabolico (en donde los niveles elevados del marcador con relacion a un control (tal como el criterio medico establecido y/o un rango de concentracion derivado de la poblacion estadfsticamente significativa de donantes no patologicos) es indicativo de la presencia de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

una enfermedad), pueden permitir los metodos para terapia de monitorizacion en un paciente que padece enfermedades tales como desordenes metabolicos, en donde la normalizacion (o una tendencia hacia la normalizacion) de las cantidades de estas protefnas es indicativa de terapia exitosa.

Los dispositivos de extraccion de sangre tambien pueden ser utilizados para los fines de extraer y almacenar sangre de los pacientes que han ingerido profarmacos que son asociados (tambien denominados aquf como profarmacos que soportan cadenas laterales de ester alifatico), para fines terapeuticos, por ejemplo como parte de un regimen de tratamiento para una enfermedad o condicion inflamatoria. Se entiende generalmente por profarmaco un agente de farmaco activo que realmente es una forma precursora de un farmaco que es terapeuticamente inactivo o significativamente menos activo que la mitad activa del agente (que puede ser un metabolito). Despues de la administracion tal como la ingestion oral, muchos profarmacos se convierten en el farmaco/metabolito activos mediante la division del la union ester a traves de las lisofosfolipasas intrfnsecas. Por ejemplo enalapril se convierte en el metabolito activo enalaprilat, y el profarmaco valaciclovir se convierte en el farmaco/metabolito activo aciclovir. La herofna es desacelizada al farmaco/metabolito activo morfina. En ajustes clfnicos, y en particular en pruebas clfnicas, es ventajoso monitorizar los niveles de sangre del profarmaco asf como del metabolito activo en pacientes en el transcurso del tiempo, por ejemplo, desde uno o mas de los puntos de vista de seguridad, eficacia, bioactividad y bioequivalencia.

Por ejemplo, en estudios de bioactiovidad, que miden la velocidad y extension a la que el ingrediente activo o mitad activa es absorbida de un producto de farmaco y se hace disponible en el sitio de accion, se recomienda que la concentracion y actividad tanto del farmaco padre como del metabolito sean determinadas. En estudios de bioequivalencia (que estudian la extension de la diferencia de velocidad y extension a la que el ingrediente o mitad activa en los equivalentes farmaceuticos o alternativas se hacen disponibles en el sitio de la accion de farmaco cuando se administra en la misma dosis molar bajo condiciones similares), medida de la forma padre profarmaco) es generalmente recomendada (excepto en situaciones en las que los niveles de farmaco padre son demasiado bajos para permitir la medida analftica fiable en la sangre, suero o plasma para una duracion adecuada de tiempo, o cuando el metabolito contribuye significativamente a la seguridad y/o eficacia, en cuyos casos, se miden la concentracion y actividad tanto del profarmaco como del metabolito).

El analisis cualitativo o cuantitativo de la sangre extrafda de los pacientes que han sido sometidos a tal terapia (que incluye pacientes que actualmente estan sometidos a tal terapia) utilizando los dispositivos de extraccion de sangre de la invencion aumenta la precision de cualquiera de tales analisis ya que la degradacion de esterasa catalizada fuera del organismo del profarmaco en la sangre extrafda se inhibe durante el almacenamiento. El procesamiento de las muestras de sangre, por ejemplo, la extraccion del plasma de la sangre extrafda, y la separacion del profarmaco y el metabolito activo, y la posterior medida de estas entidades se puede realizar de acuerdo con tecnicas estandar. Por ejemplo, el profarmaco y el metabolito activos se pueden separar por HPLC de fase inversa. La deteccion de presencia o cantidades relativas de profarmaco y metabolito activos puede ser realizada de acuerdo con tecnicas estandar, tales como espectrometrfa de masas, seguidas del analisis de los resultados, por ejemplo, regresion cuadratica ponderara o lineal. Vease, por ejemplo, Wiltshire, et al., J. Chromatogr. B745:373-88 (2000) (y las referencias citadas aquf). Los controles a los que los valores medidos se pueden comparar incluyen calibracion y muestras de control de calidad (referidas como curvas de calibracion in Wiltshire, supra).

A continuacion se describiran los siguientes ejemplos no limitativos. A menos que se indique lo contrario, todas las partes y porcentajes estan referidos al peso.

EJEMPLO 1 - ESTABILIDAD COMPARATIVA DE GRELINA EN MUESTRAS DE PLASMA

Se extrajo sangre en 4 tubos separados que contenfan 1) el inhibidor de LisoPLA metil araquidonil fluorofosfonato (MAFP), EDTA, el inhibidor de esterasa, tacrina, y los inhibidores de proteasa L-treo-isoleucil tiazolidina, bestatina y leupeptina (un agente de estabilizacion de la invencion "ISA" designados en la figura como ▲), 2) otro agente de estabilizacion de la invencion que incluye el anticoagulante EDTA y MAFP (designado en la figura como x), 3) EDTA y el inhibidor de esterasa y los inhibidores de proteasa (el agente de estabilizacion comparativo "CSA" designado en la figura como ♦) y 4) EDTA solo (designado en la figura como ■), seguido de la adicion de cantidad conocida de 1 pg/uL acil-grelina. Todos los cuatro tubos fueron extrafdos indirectamente del mismo sujeto para este experimento y procesados de identica manera. Los datos ilustrados en la Figura 2 indican claramente que en los tubos 3 y 4 la acil- grelina se degradaba con el tiempo. Sin embargo, los dos tubos (n° 1 y 2) que contenfan MAFP mostraban estabilizacion en las 30 horas de tiempo de incubacion de plasma. El tubo 2, que contenfa MAFP y EDTA, supero al tubo 1 que contenfa en inhibidor de esterasa y los inhibidores de proteasa.

En un experimento separado, la sangre fue extrafda de un sujeto en ayunas en EDTA y EDTA + MAFP. La concentracion del tubo de MAFP final en este experimento fue de 0,1 mM, El plasma fue separado de cada tubo en dos viales separados. A un vial se le anadio 1 pg/uL de grelina mientras que al otro no se le anadio. El plasma anadido y no anadido procedente tanto de EDTA como de EDTA + MAFP fueron incubados a temperatura ambiente durante 4 horas. La Figura 3 muestra los niveles de grelina medidos a intervalos de tiempo especfficos. Los datos claramente demuestran mayor estabilidad de acil-grelina e los tubos que contienen MAFP.

Todas las publicaciones de patente y publicaciones no de patente son indicativas del nivel de aptitudes de los

expertos en la tecnica a la que esta invencion pertenece.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   REIVINDICACIONES

   1. Un dispositivo de extraccion para extraer y estabilizar sangre completa o un componente de la misma, que comprende un primer extremo y un segundo extremo y al menos una pared interior que define un deposito y en el que el deposito comprende un agente de estabilizacion, un inhibidor de lisofosfolipasa (LisoPLA) y un anticoagulante, en el que el dispositivo es un tubo al menos parcialmente evacuado y comprende ademas un cierre perforable por una aguja para suministrar la sangre al deposito.
2. 2. El dispositivo de la reivindicacion 1, en el que el tubo es esteril.
3. 3. El dispositivo de la reivindicacion 1 a 2, en el que el inhibidor de LisoPLa es seleccionando del grupo que comprende bromoenol lactona, etil octilfosfonofluoridato, isopropil dodecilfosfonofluoridato, n-dodecil- benzodioxafosforina 2-oxido, palmitil trifluorometil cetona, palmitoil carnitina y araquidronil fluorofosfonato (MAFP).
4. 4. El dispositivo de la reivindicacion 1 o 3, en el que el agente de estabilizacion comprende ademas un inhibidor de proteasa.
5. 5. El dispositivo de la reivindicacion 4, en el que el inhibidor de proteasa es un inhibidor de una proteasa de serina, un inhibidor de una endoproteasa, un inhibidor de una exoproteasa, un inhibidor de una dipeptidil peptidasa, o una combinacion de dos o mas de los mismos.
6. 6. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente anticoagulante es EDTA o una sal del mismo, o heparina.
7. 7. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticoagulante esta revestido o secado por rociado sobre al menos una parte de la pared interior.
8. 8. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el agente de estabilizacion comprende ademas un inhibidor de esterasa seleccionado del grupo formado por inhibidor de butil colinesterasa (BChE), inhibidor de acetil colinesterasa (AChE), y una combinacion de los mismos.
9. 9. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la pared interior puede estar compuesta de plastico o cristal.
10. 10. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el agente de estabilizacion puede estar liofilizado.
11. 11. El uso de un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para extraer y estabilizar sangre completa o un componente de la misma de un paciente.
12. 12. El uso de la reivindicacion 11, en el que el paciente es un paciente con diabetes y en donde el componente es plasma, grelina, glucagon, GIP(l-42), GLP-1-(7-36)NH2, GLP-1-(7-37), o una combinacion de dos o mas de los mismos.
13. 13. El uso de un dispositivo de extraccion de sangre de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para diagnosticar una enfermedad metabolica o para monitorizar el tratamiento de un paciente con una enfermedad metabolica midiendo al menos en un momento predeterminado la presencia o cantidad de grelina en una muestra de sangre o en un componente de la misma, que es extrafda de un paciente al interior de un dispositivo de extraccion, en donde una cantidad medida mayor que un control es indicativa de la presencia de una enfermedad metabolica, o de la eficacia de la terapia.
14. 14. El uso de un dispositivo de extraccion de sangre de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para detectar la presencia o cantidad de un profarmaco y/o un metabolito activo del mismo en sangre o en un componente fluido de la misma, que es extrafda de un paciente al que se le ha administrado el profarmaco, al interior del dispositivo, mediante la deteccion de la presencia o midiendo la cantidad de un profarmaco que soporta un grupo ester alifatico en la muestra y comparando la presencia detectada o cantidad medida con un control.