ES2643392T3 - Apoaecuorina para reducir lesiones neuronales debidas a isquemia - Google Patents
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Description
DESCRIPCION
Apoaecuorina para reducir lesiones neuronales debidas a isquemia
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de Estados Unidos n° 61/559.816, presentada el 15 de noviembre de 2011.
5 Campo de la invencion
La presente divulgacion se refiere a composiciones para reducir lesiones neuronales debidas a isquemia. En particular, la presente divulgacion se dirige a apoaecuorina y a su uso en la reduccion de lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral en un sujeto.
Antecedentes de la invencion
10 De acuerdo con la American Heart Association, cada 40 segundos, alguien padece un ictus en los Estados Unidos. Actualmente, existe solo un tratamiento para el ictus homologado por la Food and Drug Administration, el activador del plasminogeno tisular recombinante (rTPA). Aunque rTPA ayuda a muchas personas, tambien pueden tener efectos secundarios perjudiciales, tales como hemorragias. Durante la isquemia, las neuronas experimentan un exceso de calcio intracelular. Aunque el calcio intracelular es necesario para las funciones neuronales normales, 15 demasiado calcio puede estimular cascadas de acontecimientos, que conducen a, e incluyen, la muerte celular. Algunos mecanismos permiten a las neuronas limitar o controlar los niveles de calcio citosolicos, incluyendo las protemas de union al calcio (CaBP). Se ha mostrado que el tratamiento con la CaBP, calbindina D-28k, reduce los efectos perjudiciales de la isquemia. Desafortunadamente, existe una carencia de terapeuticas alternativas para prevenir la muerte neuronal debida a isquemia y, de acuerdo con ello, existe una necesidad de nuevas terapeuticas 20 utiles en el tratamiento de los efectos perjudiciales de la isquemia sobre las neuronas. La invencion se define en las reivindicaciones. En el presente documento, los inventores demuestran el uso de apoaecuorina para proporcionar proteccion isquemica a las neuronas. Por consiguiente, la divulgacion abarca, en un primer aspecto, apoaecuorina para su uso en el preacondicionamiento de neuronas en un sujeto, preferentemente un ser humano, para reducir las lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral. Dicho uso incluye administrar apoaecuorina al sujeto, en el que la 25 apoaecuorina inicia un cambio en los niveles de expresion de las citoquinas en las neuronas que dan como resultado en una reduccion de las lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral.
La administracion se lleva a cabo mediante inyeccion en el area CA1 del hipocampo dorsal 48 horas antes de que se produzca la isquemia cerebral.
En determinadas realizaciones, el efecto de la reduccion en la lesion neuronal dura al menos 24 horas desde el 30 momento de administracion de la apoaecuorina. En otras realizaciones, el efecto de la reduccion en la lesion neuronal dura al menos 48 horas desde el momento de administracion de la apoaecuorina.
Se desvela ademas el uso de apoaecuorina en la fabricacion de un medicamento para preacondicionamiento de neuronas en un sujeto para reducir las lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral.
La invencion abarca ademas una composicion para su uso en el preacondicionamiento de neuronas en un sujeto 35 para reducir las lesiones cerebrales debidas a la isquemia cerebral con las caractensticas de la reivindicacion 7. Las composiciones preferidas se formulan como dosificaciones inyectables.
Se desvela ademas un kit para el preacondicionamiento de neuronas en un sujeto para reducir lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral. Dicho kit incluye: (a) una dosificacion terapeuticamente eficaz de apoaecuorina para preacondicionar neuronas en un sujeto para reducir las lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral, y (b) un 40 dispositivo de administracion configurado para administrar la cantidad de apoaecuorina al sujeto.
Otros objetos, caractensticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes tras la revision de la memoria descriptiva, las reivindicaciones y los dibujos.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 representa un aumento dependiente con el tiempo en el ARNm de IL-10 tras la infusion de 45 apoaecuorina (A) como un porcentaje del vehnculo control. No se observaron cambios en el ARNm de la p-actina
(B). (La apoaecuorina se abrevia como "AQ").
La Figura 2 muestra (A) el efecto dependiente de la dosis de AQ sobre el rescate celular; (B) un 4% de AQ administrado 2 dfas antes de la isquemia es neuroprotector (senalar la reduccion en las neuronas marcadas con azul tripan tras la administracion de AQ); (C) la ventana de neuroproteccion proporcionada por AQ; (D) 50 disponibilidad de AQ tras la inyeccion en el hipocampo.
La Figura 3 representa graficamente (A) la expresion del ARNm de IL-10; (B) la expresion del ARNm de la p- actina; y (C) las matrices de la PCR que expresan cambios en multiples citoquinas y quimioquinas tras la administracion de AQ.
La Figura 4 representa una grafica que muestra como las citoquinas quedan significativamente alteradas con la
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inyeccion de AQ.
La Figura 5 representa graficamente un esquema que muestra la interaccion de los genes de respuesta inmunitaria examinados por los inventores.
La Figura 6 representa graficas que muestran (A) el cambio en los genes de respuestas inflamatorias agudas tras la inyeccion de AQ; (B) el cambio en los activadores de linfocitos T/B tras la inyeccion de AQ; (C) el cambio en los genes de la angiogenesis/proliferadores celular tras la inyeccion de AQ; (D) el modelo de cambio en los genes atractores de macrofagos tras la inyeccion de AQ; (E) el cambio en los genes mediadores del calcio tras la inyeccion de AQ; y (F) los genes (agrupados por sus funciones) que cambian con la inyeccion de AQ.
Descripcion detallada de la invencion
I. EN GENERAL
Antes de describir los presentes materiales y procedimientos, se entiende que la presente invencion no esta limitada a la metodologfa, protocolos materiales y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar. Debe entenderse tambien que la terminologfa utilizada en el presente documento tiene el fin unico de describir las realizaciones concretas, y no se pretende que limite el ambito de la presente invencion, que estara limitada solo por algunas solicitudes no provisionales presentadas posteriormente.
Se debe indicar que, tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y “el” incluyen las referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Analogamente, los terminos "un" (o "uno"), "uno o mas" y "al menos uno" se pueden utilizar de forma indistinta en el presente documento. Se debe indicar tambien que los terminos "que comprende", "que incluye", y "que tiene" se pueden utilizar de manera indistinta.
Salvo que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente una persona normalmente experta en la tecnica a la cual pertenece la presente invencion. Aunque se pueden usar cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para llevar a la practica o en el ensayo de la presente invencion, se describen ahora los procedimientos y materiales preferidos. Todas las referencias citadas en esta memoria descriptiva deben tomarse como indicativas del nivel del experto en la tecnica. Nada de lo indicado en el presente documento debe considerarse como una admision de que la invencion no tiene el derecho de anteceder a la descripcion en virtud de la invencion anterior.
II. LA INVENCION
Tal como se usa en el presente documento, "sujeto" significa mairnferos y no mamfferos. "Mairnferos" significa cualquier miembro de la clase Mammalia, incluyendo, aunque no de forma limitativa, seres humanos, primates no humanos, tales como chimpances y otros simios y especies de monos; animales de granja, tales como ganado, caballos, ovejas, cabras y cerdos; animales domesticos, tales como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio, incluyendo roedores, tales como ratas, ratones y cobayas; y similares. Los ejemplos de no mairnferos incluyen, aunque no de forma limitativa, pajaros, y similares. El termino "sujeto" no denota una edad o sexo concreto.
Tal como se usa en el presente documento, "administrar" o "administracion" incluye cualquier medio para introducir apoaecuorina en el cuerpo, preferentemente en el cerebro del sujeto, mas preferentemente en el hipocampo del sujeto. Los ejemplos de administracion incluyen, aunque no de forma limitativa, la oral, nasal, otica, oftalmica, bucal, sublingual, pulmonar, transdermica, transmucosal, asf como inyeccion subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, epidural e intramuscular.
Una "cantidad terapeuticamente eficaz" significa una cantidad de apoaecuorina que, cuando se administra a un sujeto para tratar un trastorno, dolencia, o enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento del trastorno, o dolencia, o enfermedad. La "cantidad terapeuticamente eficaz" variara dependiendo del trastorno, o dolencia, o patologfa que se esta tratando, de la gravedad o del trastorno, o dolencia, o enfermedad tratada, de la edad y del estado de salud relativo del paciente, de la via y forma de administracion, del criterio del especialista medico o veterinario a cargo del tratamiento, y de otros factores.
Para los fines de la presente invencion, "tratar" o "tratamiento" describe la gestion y el cuidado de un paciente con el fin de combatir la enfermedad, la dolencia o el trastorno. Los terminos abarcan tratamientos tanto preventivos, es decir, profilacticos, como paliativos. Tratar incluye la administracion de apoaecuorina para evitar el inicio de los smtomas o complicaciones, aliviar los smtomas o complicaciones, o eliminar la enfermedad, dolencia o trastorno.
El termino "apoaecuorina" se refiere a la porcion de apoprotema de la protema de union al calcio, la aecuorina. La aecuorina esta compuesta por dos unidades distintas, la apoprotema respectiva, apoaecuorina, con un peso molecular promedio de 22 kDa, y el grupo prostetico coelenterazina, una luciferina. La aecuorina es una fotoprotema aislada de medusas luminiscentes (tales como de especies de Aequorea, por ejemplo, Aequorea victoria) y de una variedad de otros organismos marinos. Se aislo originalmente de celentereos por Osamu Shimomura. La apoaecuorina util en la presente invencion esta disponible de su fuente natural, mediante esquemas de aislamiento y purificacion previamente conocidos, o procedimientos recombinantes publicamente conocidos que utilizan sistemas
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de expresion que utilizan, por ejemplo, construcciones de ADN recombinante y celulas hospedadoras geneticamente modificadas, utiles para la expresion heterologa de apoaecuorina.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "citoquina" debe referirse a moleculas pequenas de protemas senalizadoras de celulas que se secretan por las celulas gliales del sistema nervioso y por numerosas celulas del sistema inmunitario y son una categona de moleculas de senalizacion utilizadas ampliamente en la comunicacion intercelular. Las citoquinas se pueden clasificar como protemas, peptidos, o glicoprotemas; de acuerdo con ello, el termino "citoquina" abarca una gran y diversa familia de reguladores producidos en todo el cuerpo por celulas de origen embriologico diverso. El termino "citoquina" debe abarcar agentes inmunomoduladores, tales como interleuquinas e interferones.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "preacondicionamiento se refiere a una tecnica para producir resistencia a la perdida de suministro de sangre, y por tanto, de oxfgeno, a los tejidos del cuerpo. En este caso, preacondicionamiento se refiere a producir resistencia a la perdida del suministro de sangre a neuronas, tal como se mide, por ejemplo, mediante evaluacion del porcentaje o del numero de celulas rescatadas tras la administracion de apoaecuorina en comparacion con un control.
Los inventores han mostrado que, cuando se inyecta directamente en el hipocampo dorsal (dhpc), la CaBP apoaecuorina de 22 kD (AQ) derivada del celentereo Aequoria victoria disminuye significativamente la muerte celular cuando se somete a una lesion de tipo isquemico in vitro (Detert y col., 2009; 2011). Esta disminucion en la muerte celular fue evidente a las 24 y las 48 horas, pero no 1 hora despues de la inyeccion de AQ. De manera interesante, la protema AQ estaba presente en 1 hora, con niveles significativamente menores a las 24 horas, y a las 48 horas despues de la inyeccion, apenas estaba presente. El modelo inverso entre el efecto de la AQ y su presencia hace que los inventores se pregunten si este cambio fue debido o no a una respuesta neuroinmunomoduladora. Algunas formas de preacondicionamiento isquemico, tales como pequenas lesiones isquemicas, reducen los infartos cuando se administran antes de lesiones globales mayores (Ara y col., 2010; Jones y Bergeron, 2001). Los efectos protectores del preacondicionamiento isquemico se han asociado con la activacion del sistema inmunitario (Rehni y Singh, 2012; Wei y col., 2012). Aunque no se adopta ningun mecanismo de accion en el presente documento, es posible que si AQ es activadora de citoquinas, disminuya la muerte celular por algun tipo de preacondicionamiento isquemico donde la respuesta neuroprotectora que se observa derivada de las inyecciones de aecuorina puede deberse, en parte, a una respuesta neuroinmunomoduladora.
Apoaecuorina se administra a un paciente en una cantidad terapeuticamente eficaz. Apoaecuorina puede administrarse sola o como parte de una composicion farmaceuticamente aceptable. Ademas, apoaecuorina o una composicion puede administrarse de una vez, como por ejemplo, mediante una inyeccion en bolo, multiples veces, tal como mediante una serie de comprimidos, o administrarse de forma sustancialmente uniforme durante un periodo de tiempo, como por ejemplo, utilizando la administracion transdermica. Ademas, la dosis del principio activo puede variarse en el tiempo. Apoaecuorina se puede administrar utilizando una formulacion de liberacion inmediata, una formulacion de liberacion controlada, o combinaciones de las mismas. El termino "liberacion controlada" incluye liberacion sostenida, liberacion retardada, y combinaciones de las mismas.
Una composicion de la invencion se puede preparar, envasarse, o comercializarse a granel, como una dosis unitaria unica, o como una pluralidad de dosis unitarias unicas. Tal como se usa en el presente documento, una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composicion que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente igual a la dosificacion del principio activo que se administrana a un paciente o una fraccion conveniente de dicha dosificacion tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de dicha dosificacion.
Las cantidades relativas del principio activo, el transportador farmaceuticamente aceptable, y cualesquiera ingredientes adicionales en una composicion variaran, dependiendo de la identidad, el tamano, y la dolencia del ser humano tratado y dependiendo ademas de la ruta por la cual se va a administrar la composicion.
Se desvela tambien en el presente documento un kit que comprende una composicion de la invencion y un material de instruccion. El material de instruccion incluye una publicacion, un registro, un diagrama o cualquier otro medio de expresion que se utiliza para comunicar la utilidad de la composicion de la invencion para uno de los objetivos que se definen en el presente documento en un ser humano. El material de instruccion puede describir tambien, por ejemplo, una dosis adecuada de la composicion farmaceutica de la invencion. El material de instruccion del kit puede, por ejemplo, prefijarse a un envase que contiene una composicion farmaceutica de la invencion o enviarse junto con un envase que contiene la composicion farmaceutica. Como alternativa, el material de instruccion puede enviarse por separado del envase con la intencion de que el material de instruccion y la composicion farmaceutica se utilicen cooperativamente por el receptor.
Se desvela tambien en el presente documento un kit que comprende una composicion de la invencion y un dispositivo de administracion para administrar la composicion a un ser humano. A modo de ejemplo, el dispositivo de administracion puede ser una jeringuilla, una aguja, o un recipiente medidor de la dosificacion. El kit puede comprender ademas un material de instruccion, como se describe en el presente documento. El kit comprende tambien un recipiente para las composiciones separadas, tal como una botella dividida o un paquete de papel
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dividido. Los ejemplos adicionales de recipientes incluyen jeringuillas, cajas, bolsas y similares. Normalmente, un kit comprende instrucciones para administrar los componentes separados. La forma del kit es particularmente ventajosa cuando los componentes separados se administran preferentemente en formas de dosificacion diferentes (por ejemplo, oral y parenteral), administrados en diferentes intervalos de dosificacion, o cuando se desea la valoracion de los componentes individuales de la combinacion por el medico a cargo del tratamiento.
La administracion parenteral de una composicion farmaceutica incluye cualquier ruta de administracion caracterizada por la rotura ffsica de un tejido de un ser humano y la administracion de la composicion farmaceutica a traves de la brecha en el tejido. La administracion parenteral incluye de esta manera la administracion de una composicion farmaceutica mediante la inyeccion de la composicion, mediante aplicacion de la composicion a traves de una incision quirurgica, mediante la aplicacion de la composicion a traves de una herida no quirurgica que penetra en el tejido, y similares. En particular, la administracion parenteral incluye la inyeccion subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramuscular, o intraesternal e intravenosa, intraarterial, o tecnicas de infusion dialftica en el rinon. Por ejemplo, las composiciones de la presente invencion pueden administrarse a un sujeto mediante inyecciones en el cerebro (mediante vPAG), inyecciones intratecales, inyecciones intraperitoneales, o inyecciones de sangre.
Las composiciones adecuadas para inyeccion parenteral comprenden el principio activo combinado con un transportador farmaceuticamente aceptable tal como soluciones acuosas o no acuosas esteriles, dispersiones, suspensiones, o emulsiones fisiologicamente aceptables, o puede comprender polvos esteriles para la reconstitucion en soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Los ejemplos de transportadores, diluyentes, disolventes, o vehnculos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, suero salino isotonico, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol y similares), mezclas adecuadas de los mismos, trigliceridos, incluyendo aceites vegetales como aceite de oliva, esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez correcta se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, manteniendo el tamano de partfcula necesario en el caso de las dispersiones, y/o mediante el uso de tensioactivos. Dichas formulaciones se pueden preparar, envasarse o comercializarse en una forma adecuada para la administracion en bolo o para la administracion continua. Se pueden preparar formulaciones inyectables, envasarse, o comercializarse en una forma de dosificacion unitaria, tal como ampollas, en recipientes multidosis que contienen un conservante o en dispositivos de un unico uso para la autoinyeccion o la inyeccion por un especialista medico.
Las formulaciones para administracion parenteral incluyen suspensiones, soluciones, emulsiones en vetnculos acuosos u oleosos, pastas y formulaciones de liberacion sostenida implantables o biodegradables. Dichas formulaciones pueden comprender ademas uno o mas ingredientes adicionales incluyendo agentes suspensores, estabilizantes, o dispersantes. En una realizacion de una formulacion para administracion parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (es decir, en polvo o en forma granular) para la reconstitucion con un vehnculo adecuado (por ejemplo, agua esteril exenta de pirogenos) antes de la administracion parenteral de la composicion reconstituida.
Las composiciones se pueden preparar, envasarse, o comercializarse en la forma de una suspension o solucion acuosa u oleosa (emulsion) inyectable esteril. Esta suspension o solucion puede formularse de acuerdo con la tecnica conocida, y puede comprender, ademas del principio activo, ingredientes adicionales tales como agentes dispersantes, agentes humectantes, o agentes suspensores descritos en el presente documento. Dichas formulaciones inyectables esteriles se pueden preparar utilizando un diluyente o disolvente no toxico parenteralmente aceptable, tal como, por ejemplo, agua o 1,3-butanodiol. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen solucion de Ringer, solucion de cloruro de sodio isotonica, y aceites fijos tales como monogliceridos o digliceridos sinteticos. Otras formulaciones administrables parenteralmente que son utiles incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparacion liposomica, o como un componente de sistemas de polfmeros biodegradables. Las composiciones para liberacion sostenida o implante pueden comprender materiales polimericos o hidrofobos farmaceuticamente aceptables tales como una emulsion, una resina de intercambio ionico, un polfmero escasamente soluble, o una sal escasamente soluble.
Las composiciones de la invencion pueden contener tambien adyuvantes tales como agentes conservantes humectantes, emulsionantes, y/o dispersantes, incluyendo, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, cloruro de sodio, y similares. La absorcion prolongada de composiciones farmaceuticas inyectables puede producirse mediante el uso de agentes capaces de retrasar la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y/o gelatina. En particular, liposomas, miosomas y emulsionantes se pueden usar para preparar los presentes compuestos de forma mas soluble para su administracion.
Las formas de dosificacion pueden incluir implantes o depositos inyectables. En realizaciones preferidas, el implante comprende una cantidad eficaz de un principio activo y un polfmero biodegradable. En realizaciones preferidas, un polfmero biodegradable adecuado puede seleccionarse entre el grupo que consiste en poliaspartato, poliglutamato, poli(L-lactido), un poli(D,L-lactido), un poli(lactido-co-glicolido), una poli(e-caprolactona), un polianhndrido, un poli(beta-hidroxi-butirato), un poli(orto-ester) y un polifosfaceno. En otras realizaciones, el implante comprende una cantidad eficaz de un principio activo y un polfmero silastico. El implante proporciona la liberacion de una cantidad eficaz de
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Se pueden preparar soluciones Kquidas del principio activo en disolventes acuosos u oleosos de una manera sustancialmente igual que las suspensiones lfquidas, siendo la diferencia principal que el principio activo se disuelve, en lugar de que se suspende en el disolvente. Las soluciones lfquidas de la composicion de la invencion pueden comprender cada uno de los componentes descritos con respecto a las suspensiones lfquidas, se entiende que los agentes suspensores no ayudaran necesariamente a la disolucion del principio activo en el disolvente. Los disolventes acuosos incluyen, por ejemplo, agua y solucion salina isotonica. Los disolventes oleosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendra, esteres grasos, alcohol etflico, aceites vegetales como aceite de cacahuete, oliva, sesamo, o coco, aceites vegetales fraccionados, y aceites minerales tales como parafina lfquida.
Las composiciones de la presente invencion pueden incluir ademas un componente de ciclodextrina a fin de, por ejemplo, mejorar la solubilidad en agua de un principio farmaceutico activo, prolongar la liberacion del farmaco, y mejorar las caractensticas de empastillamiento. En general, los oligomeros de estructura dclica de glucosa ("ciclodextrina") se obtienen de las digestiones del almidon de determinadas bacterias. Las ciclodextrinas mas abundantes son la alfa, beta y gamma ciclodextrina que tienen 6, 7 y 8 unidades de glucosa, respectivamente. La cavidad interior de una ciclodextrina es hidrofoba y la superficie expuesta de la molecula es hidrofila. Se sabe que las ciclodextrinas potencian la estabilidad del principio activo farmaceutico, la solubilidad en medio acuoso, y reducen la volatilidad. Algunos ejemplos de ciclodextrinas comercialmente disponibles, o derivados de las mismas, son los siguientes: alfa-Ciclodextrina (n.° CAS: 10016-20-3); (2-Hidroxipropil)-alfa-ciclodextrina (n.° CAS: 128446-333); beta-Ciclodextrina (n.° CAS: 7585-39-9); 6-O-alfa-D-Glucosil-beta-ciclodextrina (n.° CAS: 92517-02-7); gamma- Ciclodextrina (n.° CAS: 17465-86-0); y (2-Hidroxipropil)-gamma-ciclodextrina (n.° CAS: 128446-34-4). Las ciclodextrinas particularmente utiles en la formulacion de un veldculo de administracion para administrar los presentes agentes activos incluyen: la sulfobutil eter beta-ciclodextrina (SBE-beta-CD) disponible de Cydex Pharmaceuticals, Inc. con el nombre comercial CAPTISOL; y la ciclodextrina e hidroxipropil betaciclodextrinas disponibles de Roquette Pharma con el nombre comercial KLEPTOSE.
Para la administracion parenteral en animales no humanos, apoaecuorina puede prepararse en forma de una pasta o un aglomerado y se administra como un implante. Se pueden preparar formulaciones de pasta dispersando apoaecuorina en un aceite farmaceuticamente aceptable tal como aceite de cacahuete, aceite de sesamo, aceite de mafz o similares. Pueden prepararse granulos que contengan una cantidad terapeuticamente eficaz premezclando con un diluyente tal como carbowax, cera de carnauba, y similares, y un lubricante, tal como estearato de magnesio o calcio, se puede anadir para mejorar el procedimiento de granulacion. Se reconoce, por supuesto, que se puede administrar mas de un granulo a un animal para conseguir el nivel de dosis deseado. Por otra parte, se ha descubierto que dichos implantes pueden administrarse tambien periodicamente durante el periodo de tratamiento del animal a fin de mantener el nivel de principio activo adecuado en el cuerpo del animal.
Las composiciones de la presente invencion pueden administrarse a un paciente a niveles de dosificacion comprendidos en el intervalo de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 mg/kg por dfa. Para un ser humano adulto normal, una dosificacion en el intervalo de entre aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg es normalmente suficiente, con una dosificacion preferida de 0,1 a 10 mg/kg por dfa. Sin embargo, puede requerirse alguna variabilidad en el intervalo de dosificacion general dependiendo de la edad y el peso del sujeto que se esta tratando, la ruta prevista de administracion, el compuesto concreto que se esta administrando y similares. La determinacion de los intervalos de dosificacion y las dosificaciones optimas para un paciente concreto estan tambien comprendidas en la capacidad de una persona normalmente experta en la materia que tiene las ventajas de la presente descripcion. Se indica tambien que los compuestos de la presente invencion se pueden usar en formulaciones de liberacion sostenida, formulaciones de liberacion controlada, y formulaciones de liberacion retardada, cuyas formas son tambien conocidas por una persona normalmente experta en la materia.
La dosificacion espedfica y el intervalo de dosificacion que se pueden usar dependen de numerosos factores, incluyendo los requerimientos del paciente, la gravedad de la dolencia que se esta tratando, y la actividad farmacologica del principio activo que se administra. La determinacion de los intervalos de dosificacion y las dosificaciones optimas para un paciente concreto estan tambien comprendidas en el conocimiento de una persona normalmente experta en la materia a la vista de esta descripcion. Se entiende que los medicos, odontologos, o veterinarios normalmente expertos determinaran y prescribiran facilmente una cantidad eficaz de la composicion para conseguir el tratamiento deseado en el sujeto. En un procedimiento de este tipo, el medico o el veterinario pueden, por ejemplo, prescribir al principio una dosis relativamente baja, aumentando posteriormente la dosis hasta que se obtenga la respuesta adecuada. Se entiende ademas, sin embargo, que el nivel de dosis espedfico para cualquier ser humano concreto dependera de una variedad de factores que incluyen la actividad del composicion espedfica empleada, la edad, peso corporal, el estado de salud general, el sexo, y la alimentacion del ser humano, el momento de administracion, la via de administracion, la tasa de excrecion, cualquier combinacion del farmaco, y la gravedad de cualquier trastorno que se esta tratando.
En determinadas realizaciones, apoaecuorina se formula en la forma de una dosificacion farmaceutica inyectable, incluyendo apoaecuorina combinada con un sistema transportador inyectable. Tal como se usa en el presente documento, las formas de dosificacion inyectables y en infusion (es decir, las formas de dosificacion parenterales) incluyen, aunque no de forma limitativa, los inyectables liposomicos o una vesfcula de bicapa lipfdica que tiene fosfolfpidos que encapsula una sustancia farmacologica activa. La inyeccion incluye una preparacion esteril prevista para uso parenteral.
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Existen cinco clases distintas de inyecciones como define la USP: emulsiones, Kpidos, polvos, soluciones y suspensiones. La inyeccion de emulsion incluye una emulsion que comprende una preparacion esteril, exenta de pirogenos prevista para administrate parenteralmente. El complejo lip^dico y el polvo para la inyeccion de solucion son preparaciones esteriles previstas para reconstitucion para formar una solucion para uso parenteral. El polvo para inyeccion de suspension es una preparacion esteril prevista para reconstitucion para formar una suspension para uso parenteral. El polvo liofilizado para inyeccion de suspension liposomica es una preparacion criodesecada esteril prevista para la reconstitucion para uso parenteral que se formula de una manera que permite la incorporacion de liposomas, tal como una vesfcula de bicapa lipfdica que tiene fosfolfpidos utilizados para encapsular una sustancia farmacologica activa en una bicapa lipfdica o en un espacio acuoso, por lo cual, la formulacion puede formarse tras la reconstitucion. El polvo liofilizado para inyeccion de solucion es una forma de dosificacion prevista para la solucion preparada mediante liofilizacion ("criodesecacion"), por lo cual, el procedimiento implica retirar el agua de los productos en un estado congelado a presiones extremadamente bajas, y por lo cual, la posterior adicion de lfquido crea una solucion que se ajusta en todos los aspectos a los requisitos para las inyecciones. El polvo liofilizado para inyeccion de suspension es una preparacion lfquida prevista para uso parenteral que contiene solidos suspendidos en un medio fluido adecuado, y esto se ajusta en todos los aspectos a los requisitos para suspensiones esteriles, por lo cual, los agentes medicinales previstos para la suspension se preparan mediante liofilizacion. La inyeccion de solucion implica una preparacion lfquida que contiene una o mas sustancias farmacologicas disueltas en un disolvente adecuado o mezcla de disolventes mutuamente miscibles que es adecuado para la inyeccion. La inyeccion de concentrado de solucion implica una preparacion esteril para uso parenteral que, tras la adicion de disolventes adecuados, da como resultado una solucion que se ajusta en todos los aspectos a los requisitos para inyecciones. La inyeccion de suspension implica una preparacion lfquida (adecuada para inyeccion) que contiene partfculas solidas dispersas a traves de una fase lfquida, por lo cual las partfculas son insolubles, y por lo cual, una fase oleosa se dispersa a traves de una fase acuosa o viceversa. La inyeccion de suspension liposomica es una preparacion lfquida (adecuada para inyeccion) que tiene una fase oleosa dispersa en una fase acuosa de tal manera que se forman liposomas (una vesfcula de una bicapa lipfdica que contiene normalmente fosfolfpidos utilizados para encapsular una sustancia farmacologica activa tanto en una bicapa lipfdica como en un espacio acuoso). La inyeccion de suspension sonicada es una preparacion lfquida (adecuada para inyeccion) que contiene partfculas solidas dispersas a traves de una fase lfquida, por lo cual, las partfculas son insolubles. Ademas, el producto que puede sonicarse a medida que un gas se hace burbujear a traves de la suspension, dando como resultado la formacion de microesferas mediante partfculas solidas.
El sistema de transportador parenteral incluye uno o mas excipientes farmaceuticamente adecuados, tales como disolventes y cosolventes, agentes solubilizantes, agentes humectantes, agentes suspensores, agentes espesantes, agentes emulsionantes, agentes quelantes, tampones, ajustadores del pH, antioxidantes, agentes reductores, conservantes antimicrobianos, agentes de carga, protectores, ajustadores de la tonicidad, y aditivos especiales.
Diversas realizaciones ilustrativas de composiciones de acuerdo con la presente invencion y los procedimientos desvelados en el presente documento se describen ahora en los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen solo a fines ilustrativos y no se pretende que limiten en ningun modo el ambito de la presente invencion. De hecho, diversas modificaciones de la invencion ademas de aquellas que se muestran y describen en el presente documento seran evidentes para los expertos en la materia a partir de la anterior descripcion y los siguientes ejemplo y se encuentran comprendidos en el ambito de las reivindicaciones adjuntas.
III. Ejemplos
Ejemplo 1: Curso temporal y eficacia de apoaecuorina en la alteracion de los niveles de expresion de IL-10.
En este ejemplo, los inventores demuestran la eficacia de apoaecuorina aumentando la expresion del ARNm de la citoquina IL-10 antiinflamatoria. El preacondicionamiento es un fenomeno en el que un episodio isquemico breve, no letal atenua el dano producido por una lesion isquemica mas grave posterior. El preacondicionamiento reduce la expresion de los mediadores inflamatorios (por ejemplo, IL-1p e IL-6) en comparacion con lo que se observa en respuesta a la lesion cerebral. IL-10 es una citoquina antiinflamatoria y se ha mostrado que aumenta tras la administracion de un bloqueante del canal de Ca2+. El preacondicionamiento aumenta la produccion de IL-10 e IL-10 se asocia con la neuroproteccion. Un modo de esto puede ser neuroprotector reduciendo indirectamente IL-6 a traves de la reduccion de la produccion de TNF-a.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Animales. Se utilizaron 50 ratas adultas F344 macho (edad promedio = 3,4 ± 0,2 me.). Se mantuvieron las s en un ciclo de dfa noche de 14/10 h con acceso libre a alimento y agua.
Cirug^a. Se anestesiaron las ratas y se les monto un aparato estereotaxico. En condiciones asepticas, se hizo una incision en la piel de la cabeza y se retrajo a un lateral, y se nivelo la cabeza entre bregma y lambda. Se preparo cada rata con una canula guiada de acero inoxidable bilateral destinada al hipocampo dorsal (dhpc) utilizando coordenadas estereotaxicas (3,5 mm posterior, ± 2,6 mm lateral, 3,0 mm ventral) con respecto a bregma. Las canulas se aseguraron a los craneos con tornillos de acero inoxidable y epoxi. Un tapon de acero inoxidable permanecio en su lugar cuando las ratas no estaban recibiendo inyecciones para evitar que las canulas guiadas
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quedaran ocluidas.
Farmacos. Apoaecuorina (AQ; 0, 0,4, 1, y 4%, Quincy Bioscience) se prepararon en cero Ca2+-aCSF (fluido cerebroespinal artificial) al que se hada anadido DMSO al 6% para facilitar la captacion neuronal. Se administro a las ratas una infusion de aQ en un hemisferio y vedculo en el otro hemisferio, 1 h, 1 dfa, 2 d^as, 3 dfas, o 5 d^as antes de la decapitacion. Se administraron infusiones bilaterales (0,5 p l/lado) durante 60 s y las canulas de inyecciones permanecieron en su lugar durante 2 min mas para asegurar la difusion. Las canulas de infusion se cortaron para extenderse 0,5 mm mas alla de las canulas guiadas.
Privacion de oxigeno-glucosa. Se prepararon cortes coronales (400 pm) utilizando procedimientos convencionales. Tras 1 hora de recuperacion del corte en aCSF, se indujo la isquemia in vitro transfiriendo cortes a fructosa-CSF (glucosa sustituida con fructosa y a la que se hada burbujeado 95% N2 - 5% CO2 en vez de 95% O2 - 5% CO2) durante 5 min. Los cortes devolvieron despues al aCSF oxigenado que contema 0,2% de azul tripan durante 30 min de reperfusion. El azul tripan penetra facilmente en las celulas muertas y las tine de azul pero dejando las celulas vivas sin tenir. Los cortes se enjuagaron en aCSF oxigenado a temperatura ambiente dos veces, a continuacion se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% durante la noche en el refrigerador. A continuacion los cortes se crioprotegieron, se cortaron en un criostato (40 pm), y se montaron sobre portas recubiertos con gelatina.
Recuentos de celulas. Los cortes se examinaron con un microscopio Olympus (equipado con una camara digital) con un aumento de 10X y se tomaron fotograffas. Las neuronas tenidas con azul tripan en CA1 ( una seccion de aproximadamente 800 pm) se contaron por un experimentados enmascarado para las condiciones experimentales. Se llevaron a cabo los analisis estadfsticos utilizando Statview (v 5.0; SAS Institute, Inc., Cary, NC). Se utilizo un ANOVA para evaluar el efecto farmacologico. El asterisco indica p <0,05.
Transferencias Western. Se administro a las ratas una inyeccion bilateral de AQ al 4% y se extrajeron los cerebros en uno de los siguientes puntos temporales: 1 hora, 1 dfa, 2 dfas, o 3 dfas. Los cerebros se congelaron rapidamente y se almacenaron a -80 °C. El dhpc y el hipocampo ventral (vhpc) se diseccionaron y se homogeneizaron por separado. Se centrifugaron las muestras y se retiro y midio el sobrenadante utilizando un kit de ensayo de protemas Bradford (Bio-Rad). Las muestras de protemas se normalizaron y se cargaron para SDS-PAGE (10%). Se transfirieron las protemas sobre membranas de PVDF utilizando un aparato de transferencia semiseco (Bio-Rad). A continuacion se incubaron las membranas en tampon de bloqueo (2 horas), anticuerpo primario (durante la noche a 4 °C: 1:5000 de antiecuorina de raton [Chemicon] o 1:1000 de anticuerpo de conejo dirigido contra p-actina [Cell Signaling Technology]) y anticuerpo secundario (90 min: 1:5000 anticuerpo de cabra dirigido contra anticuerpo de raton [Santa Cruz Biotechnology] o 1:5000 de anticuerpo de cabra dirigido contra anticuerpos de conejo [Millipore]). A continuacion se lavaron las membranas, se introdujeron en una solucion quimioluminiscente (Santa Cruz Biotechnology), y se expusieron a una pelmula de autorradiograffa (Hyperfilm MP). Se tomaron imagenes y se llevo a cabo la densitometna utilizando el software NIH Image J. Se considero positiva una banda si el valor de la densidad optica de la banda (menos el fondo para cada banda) era mayor de 2 desviaciones estandar por encima del promedio de las bandas de vhpc.
PCR. Para la RT-PCR, se administro a las ratas una infusion de AQ al 4% en un hemisferio y vedculo en el otro hemisferio. Una hora, 1 dfa o 2 dfas despues de la infusion, se retiraron los hipocampos y se colocaron inmediatamente en Trizol. Se homogeneizo el tejido utilizando una aguja y una jeringuilla de calibre 25, y se congelaron las muestras y se almacenaron a -80 °C hasta el aislamiento del ARN. Se aislo el ARN utilizando el protocolo del mini kit Qiagen RNeasy. El ARN aislado se disolvio en 50 pl de ARNasa exenta de H2O. Se calculo la pureza del ARN basandose en la relacion de absorbancia a 260 y 280 nm, y una lectura de absorbancia entre 1,8 y 2,1 se considero ARN puro. Se llevo a cabo la transcripcion inversa para producir ADNc utilizando el Kit RT2 HT First Stand de Qiagen. Los cebadores de IL-10 y la actina p se adquirieron de Qiagen y se utilizaron de acuerdo con el Ensayo del cebador de la RT2 qPCR de Qiagen. Se midio la amplificacion del ADNc mediante la fluorescencia de SYBR verde (tincion no espedfica del ADN). Las muestras se analizaron por triplicado en placas de 96 pocillos utilizando el sistema y el software de la PCR StepOne en tiempo real. La expresion genica de la protema p-actina constitutiva sirvio como valor inicial de cuantificacion para la expresion de la citoquina. Se analizaron los cambios en la expresion genica utilizando el procedimiento de Pfaffl. Se calculo la eficacia del cebador basandose en dos muestras seleccionadas aleatoriamente para cada una de la p-actina e IL-10.
Sumario
Tal como se muestra en la Figura 1, las citoquinas antiinflamatorias aumentaron tras la infusion de apoaecuorina. En particular, el ARNm de IL-10 se elevo tan pronto como 1 hora despues de la infusion. No se detectaron cambios entre grupos en la expresion de la p-actina. A la vista de la relacion bien conocida entre el nivel creciente de citoquinas antiinflamatorias y reduccion de la inflamacion, se puede concluir que apoaecuorina es un agente util para reducir la inflamacion en un sistema de modelo animal medicamente relevante, uno que es relevante e inmediatamente aplicable al escenario humano.
Ejemplo 2: Apoaecuorina protege a las neuronas de la isquemia y altera los niveles del ARNm de citoquinas en el hipocampo de rata.
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En referencia a la Fig. 2A, los inventores demostraron que una inyeccion intrahipocampica de apoaecuorina (AQ, el componente CaBP de aecuorina) protege significativamente las neuronas del hipocampo de la muerte celular isquemica. Se observaron en primer lugar los efectos neuroprotectores de AQ a las 24 horas y aguantaron hasta 48 horas (Fig. 2B y 2C). De manera interesante, el analisis de la transferencia western sugirio que los niveles de protema AQ disminuyeron drasticamente durante este periodo de tiempo (Fig. 2D). Aunque los efectos neuroprotectores de aQ fueron mas fuertes a las 48 horas, el nivel relativamente bajo de la protema AQ presente en este momento sugiere que otros factores pueden jugar un papel en la capacidad de AQ de proteger neuronas de la muerte celular isquemica.
Una posibilidad es que la administracion de AQ conduzca a un cambio de los niveles de las citoquinas antiinflamatorias. La interleuquina-10 (IL-10), una citoquina antiinflamatoria, ha demostrado anteriormente la capacidad de proteger neuronas de la hipoxia in vitro. Para ensayar la hipotesis de que la expresion de la citoquina puede jugar un papel en los efectos neuroprotectores de AQ, se midieron los niveles del ARNm de la citoquina en diferentes puntos temporales tras una unica administracion intrahipocampica de AQ. Doce ratas F344 machos se sometieron a canulacion bilateralmente en el hipocampo dorsal. Tras la recuperacion, se inyecto AQ al 4% unilateralmente (vehmulo en el otro lado, compensado) y despues de 1, 24 o 48 h, se extrajeron los cerebros y se diseccionaron los hipocampos, se colocaron en hielo seco, y se homogeneizaron. Se aislo el ARN utilizando el del mini kit RNeasy de Qiagen. Se llevo a cabo la transcripcion inversa utilizando el Kit-96 RT2 HT First Strand de Qiagen y se utilizo la qPCR para cuantificar IL-10 y la p-actina. Como se muestra en la Fig. 3A, la IL-10 aumento significativamente en las hemiesferas tratadas con Aq a 1 hora (t(14) = 5,30, p < 0,05), pero no a las 24 o 48 horas (p > 0,05) despues de la inyeccion. El tratamiento con AQ no afecta a los niveles del ARNm de la p-actina (Fig. 3B).
Se realizaron analisis adicionales de la matriz PCR con matrices RT2 Profiler de Qiagen para citoquinas y quimioquinas en un intento de evaluar si se activaban otras citoquinas y quimioquinas en estos puntos temporales (Fig. 3C). En la Fig. 4 se representan graficamente los resultados ilustrativos que sugieren que multiples niveles del ARNm de citoquinas y quimioquinas antiinflamatorias cambian de una manera dependiente del tiempo tras la administracion de AQ.
La Fig. 5 representa graficamente un esquema que muestra la interaccion de los genes de respuestas inmunitarias examinados por los inventores. Por consiguiente, los inventores analizaron los genes evaluados por su funcion, y la Figura 6 representa graficas que muestran (A) el cambio en los genes de respuestas inflamatorias agudas tras la inyeccion de AQ; (B) el cambio en los activadores de linfocitos T/B tras la inyeccion de AQ; (C) el cambio en los genes de la angiogenesis/proliferadores celular tras la inyeccion de AQ; (D) el modelo de cambio en los genes atractores de macrofagos tras la inyeccion de AQ; (E) el cambio en los genes mediadores del calcio tras la inyeccion de AQ; y (F) los genes agrupados por el cambio de funcion con la inyeccion de AQ. La Tabla 1 presenta estos datos en forma tabular. En su conjunto, estos resultados sugieren que AQ es neuroprotectora y que esta neuroproteccion implica un mecanismo neuroinmunomodulador.
Sumario
Los datos presentados en este ejemplo demuestran que los efectos neuroprotectores de apoaecuorina son dependientes del tiempo. Una inyeccion de AQ en el area CA1 del hipocampo dorsal disminuye significativamente la muerte celular cuando se administra 24 y 48, pero no 1 hora antes de la lesion isquemica. De manera interesante, AQ muestra una relacion inversa entre la disponibilidad y la eficacia.
Los datos presentes demuestran ademas que los efectos neuroprotectores de apoaecuorina pueden implicar un mecanismo neuroinmunomodulador. La activacion de IL-10 posterior a la inyeccion sugiere que el sistema inmunitario juega un papel en su efecto protector. La activacion dependiente del tiempo de otras citoquinas y quimioquinas apoya esta hipotesis.
Tabla 1
ID del gen ID del gen % de % de % de Funcion del gen
completo cambio cambio en cambio en en 1 h 24 h 48 h
C3 Componente 3 206,56 393,22 1011,11 Implicadoen la inmunidad innata, la activacion
del de C3 es necesaria para la activacion del
complemento sistema del complemento
Ccl3 Ligando 3 de la 2006,69 885,31 115,28 Implicado en la respuesta inflamatoria aguda;
quimioquina alistamiento de leucocitos polimorfonucleares
(motivo C - C)
(continuacion)
- ID del gen
- ID del gen completo % de cambio en 1 h % de cambio en 24 h % de cambio en 48 h Funcion del gen
- Ccl4
- Ligando 4 de la quimioquina (motivo C - C) 3388,75 619,76 168,29 Quimioatractor de linfocitos NK y monocitos
- Cxell
- Ligando 1 de la quimioquina (motivo C- X-C) 1936,23 177,36 55,18 Atractor de neutrofilos; implicado en la angiogenesis, inflamacion, cicatrizacion de la herida; posible
- Cxcl10
- Ligando 10 de la quimioquina (motivo C- X-C) 959,44 627,21 845,14 Secretado en respuesta a IFNG; quimioatractor para monocitos macrofagos, Adhesion de linfocitos T, celulas NK, celulas dendriticas, angiogenesis, actividad antitumoral
- Cxcl11
- Ligando 11 de la quimioquina (motivo C- X-C) 446,86 1521,84 384,18 Interactua con CXCL3 y CXCL9 como quimioatractor de linfocitos T
- Cxcl9
- Ligando 9 de la quimioquina (motivo C- X-C) 126,58 2645,95 1346,84 Quimioatractor de linfocitos T
- Cxcr3
- Receptor 3 de la quimioquina (motivo C- X-C) 117,13 3551,38 1165,82 Regula el trafico de leucocitos; activa la integrina. Cambios citoesqueleticos, migracion quimiotactica; la union de CXCL9.10, y 11 a CXCR3activa el aumento en el calcio intracelular
- Ifng
- Interferon gamma amino 232,35 372,74 386,50 Activacion, crecimiento, y diferenciacion de linfocitos T y B, macrofagos, y linfocitos NK; regula en exceso la expresion de MHC, Diferenciacion de Thl
- Illa
- Interleuquina 1 alfa 3662,58 123,42 124,76 Produccion de fiebre, septicemia e inflamacion
- Illb
- Interleuquina 1 beta 3245,62 893,77 142,61 Produccion de proliferacion, diferenciacion, y apoptosis celular
- MIf5
- Familia de la interleuquina 1, miembro 5 (delta) 137,88 318,11 425,69 Inhibe especificamente NF-kB; forma un "cluster de genes de la citoquina" en el cromosoma 2
- II2rb
- Receptor de la interleuquina 2, beta 173,50 1191,53 670,27 Estimula el crecimiento y la diferenciacion de linfocitos T, linfocitos B, y linfocitos NK
- Tnf
- Factor de necrosis tumoral 2315,29 463,93 77,50 Mediador de la respuesta inflamatoria e inmunitaria; regula el crecimiento y la diferenciacion de celulas; promueve la
angiogenesis; imprime el metabolismo lipogenetico
5
10
15
20
25
30
35
40
45
(continuacion)
- ID del gen
- ID del gen completo % de cambio en 1 h % de % de cambio en cambio en 24 h 48 h Funcion del gen
- Cd40lg
- Ligando de CD40 161,81 1791,23 714,76 Expresado en linfocitos T; miembro de la superfamilia TNF: activa las celulas presentadoras de antfgenos
- Xcr1
- Receptor 1 de 48,96 319,40 881,35 Aumenta el calcio intracelular
la quimioquina (motivo C)
Otras realizaciones y usos de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica desde la consideracion de la memoria descriptiva y la practica de la invencion desvelada en el presente documento. Todas las referencias citadas en el presente documento por cualquier motivo, incluyendo todas las citas de revistas y patentes y solicitudes de patentes de Estados Unidos y extranjeras, se incorporan de forma espedfica y completa en el presente documento por referencia. Se entiende que la presente invencion no esta limitada a los reactivos, formulaciones, condiciones de reaccion espedficos, etc., ilustrados y descritos en el presente documento, sino que abarca dichas formas modificadas de los mismos como se encuentran en el ambito de las siguientes reivindicaciones.
REFERENCIAS
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Claims (5)
- REIVINDICACIONES1. Apoaecuorina para su uso en el preacondicionamiento de neuronas para reducir lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral en un sujeto, administrando la apoaecuorina al sujeto mediante inyeccion en el area CA1 del hipocampo dorsal 48 horas antes de que se produzca la isquemia cerebral.5 2. Apoaecuorina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la apoaecuorina se administra medianteinyeccion.
- 3. Apoaecuorina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que la inyeccion es una inyeccion intrahipocampica.
- 4. Apoaecuorina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el sujeto es un ser humano.10 5. Apoaecuorina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la reduccion de las lesiones neuronalesdura al menos 48 horas desde el momento de la administracion de la apoaecuorina.
- 6. Una composicion para su uso en el preacondicionamiento de neuronas en un sujeto para reducir las lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral, administrando la composicion al sujeto mediante inyeccion en el area CA1 del hipocampo dorsal 48 horas antes de que se produzca la isquemia cerebral, que comprende:15 (a) una dosificacion terapeuticamente eficaz de apoaecuorina para preacondicionar neuronas en un sujeto parareducir las lesiones neuronales debidas a isquemia cerebral, y (b) un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
- 7. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que la composicion se formula como una dosificacion inyectable.20
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