ES2638331T3 - Antígenos derivados de la proteína 14-3-3 citrulinada y usos de estos en el diagnóstico de la artritis reumatoide - Google Patents

Abstract

Una proteína 14-3-3 eta citrulinada aislada o un fragmento de esta que son reconocidos de manera específica por autoanticuerpos anti-14-3-3 eta presentes en el suero de un paciente que padece de una afección artrítica; en donde la proteína 14-3-3 eta o fragmento de esta comprenden un residuo de citrulina en una posición seleccionada del grupo que consiste en la posición 4, la posición 12, la posición 19, la posición 42, la posición 61, la posición 86 y la posición 227 de la sec. con núm. de ident.: 5.

Description

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DESCRIPCION

Antigenos derivados de la protema 14-3-3 citrulinada y usos de estos en el diagnostico de la artritis reumatoide Campo de la invencion

La presente invencion se refiere, generalmente, a una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta que son reconocidos de manera espedfica por autoanticuerpos anti-14-3-3 eta. La invencion se refiere, ademas, a una composition y estuche que comprende tal protema o fragmento de esta, a un anticuerpo dirigido a una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta, y a un huesped no humano que produce tal anticuerpo. La invencion se refiere, ademas, a un metodo para diagnosticar y/o pronosticar una afeccion artritica con el uso de una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta.

Antecedentes de la invencion

Artritis, o artralgia se refiere, generalmente, a trastornos inflamatorios en las articulaciones del cuerpo, y suele acompanarse de dolor, hinchazon y rigidez. La artritis puede ser el resultado de cualquiera de varias causas que incluyen infecciones, trauma, trastornos degenerativos, trastornos metabolicos o alteraciones u otras etiologias desconocidas.

La Artritis Reumatoide (RA), por ejemplo, es un trastorno inflamatorio cronico de las membranas sinoviales, y es una de las enfermedades autoinmunologicas sistemicas mas comunes. El diagnostico de la RA depende principalmente de las manifestaciones clinicas, pero los resultados de laboratorio son utiles en el diagnostico diferencial y el manejo de la enfermedad. El diagnostico temprano de RA es importante tanto en el tratamiento como en el manejo de enfermedades. Kim yWeisman (2000) Arthritis. Rheum. 43:473-84.

El suero de los pacientes afectados contiene factores que pueden ser marcadores de la enfermedad, lo que permite el diagnostico temprano. Historicamente, el factor reumatoide (RF) ha sido por mucho tiempo uno de los principales indicadores serologicos de la RA. Ademas, los autoanticuerpos anti-queratina (AKA), conocidos tambien como autoanticuerpos anti-perinucleares, se detectan en el 40-55 % de pacientes con RA y en el 40-50 % de pacientes con RA diagnosticados clinicamente que fueron negativos al RF. Vincent y otros (1989) Ann. Rheum. Dis. 48:712-22; Corconnier y otros (1996) Br. J. Rheumatol. 35:620-4; Gabay y otros (1993) Ann. Rheum. Dis. 52:785-9. Generalmente, se considera que AKA es significativamente mas especifico que RF. Ademas, AKA puede preceder a la aparicion clinica de RA por meses o anos. La publication PCT num. 2010102412 titulada "Composiciones y Metodos para Caracterizar Afecciones Artriticas" tambien describe autoanticuerpos a proteinas 14-3-3 y metodos para usarlos para evaluar las afecciones artriticas tales como RA. Por ejemplo, la proteina 14-3-3 eta es normalmente una proteina intracelular y solo en el estado de la enfermedad se libera en el espacio extracelular. Como tal, la proteina 14-3-3 eta en suero y/o los anticuerpos a la misma tienen la misma utilidad diagnostica como marcadores que complementan otros indicadores serologicos en Ra temprana y establecida y se asocian con dano articular en RA y PsA.

Recientemente se determino que AKA reconoce un epitopo que contiene citrulina. von Venrooj (2000) Arthritis Res. 52:7859. La citrulinacion es una forma de una modification postraduccional (PTM) mediante la que las peptidilargininadeiminasas (PAD) catalizan la deiminacion del aminoacido arginina (R) a citrulina (C) lo que resulta en un cambio quimico que libera una portion basada en nitrogeno. La citrulinacion descontrolada parece ser un proceso activo en condiciones inflamatorias como RA por lo que un "insulto" resulta en 1) activation de PAD; 2) liberation de las enzimas PAD en el espacio sinovial; 3) citrulinacion de proteinas extracelulares como vimentina y filagrina; 4) una respuesta humoral inmunologica contra los antigenos citrulinados y 5) la perpetuation de la enfermedad. La detection de estos anticuerpos anti-proteinas citrulinadas puede ser util en el diagnostico temprano de la RA. Los anticuerpos IgG contra un peptido sintetico que contiene citrulina conocido como CCP (Peptido Citrulinado Ciclico) han probado ser mejores que la prueba de AKA o de Rf para diferenciar la RA de otras enfermedades autoinmunologicas, y la presencia de anticuerpo anti-CCP se produce independientemente de los niveles elevados de RF en pacientes con RA. Sin embargo, un porcentaje significativo de pacientes se encuentran o permanecen seronegativos para anti-CCP. En consecuencia, permanece una necesidad significativa en la tecnica de indicadores diagnosticos mejores y mas especificos de esta enfermedad.

Resumen de la invencion

Como se describe en la presente description, los sitios de citrulinacion de la proteina 14-3-3 eta humana se identifican in silico, in vitro, y mediante el uso de muestras clinicas. La forma citrulinada de la proteina 14-3-3 eta y/o los autoanticuerpos anti-14-3-3 especificos para estas modificaciones postraduccionales en comparacion con la forma nativa o no citrulinada de la proteina 14-3-3 eta pueden usarse para el diagnostico y el pronostico de la artritis reumatoide, incluso en pacientes negativos a anti-CCP. En particular, y como se describe en la presente descripcion por primera vez, la proteina 14-3-3 eta representa un nuevo objetivo de citrulinacion que se expresa diferencialmente en pacientes con RA negativos a anti-CCP

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frente a controles saludables, lo que indica que la detection de la protema citrulinada, y/o de los autoanticuerpos especficos a la protema 14-3-3 eta citrulinada puede mejorarsignificativamente el diagnostico de la RA.

En consecuencia, en el primer aspecto, la presente invention proporciona una proteina 14-3-3 eta citrulinada aislada o fragmento de esta que son reconocidos de manera especifica por autoanticuerpos anti-14-3-3 eta presentes en el suero de un paciente que padece de una afeccion artritica; en donde la proteina 14-3-3 eta o fragmento de esta comprende un residuo de citrulina en una position seleccionada del grupo que consiste en la position 4, la position 12, la position 19, la position 42, la posicion 61, la posicion 86 y la posicion 227 de la sec. con num. de ident.: 5.

En el segundo aspecto, la presente invencion proporciona una composition que comprende al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada de conformidad con el primer aspecto unida a un soporte solido.

En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona un estuche que comprende al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada de conformidad con el primer aspecto.

En un cuarto aspecto la invencion proporciona un metodo para diagnosticar una afeccion artritica en un sujeto que comprende poner en contacto una muestra biologica del sujeto con al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o un fragmento citrulinado de esta en una condition adecuada para la formation de al menos un complejo inmunologico entre la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta y autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta que pueden encontrarse en la muestra biologica; y detectar la presencia de complejos inmunologicos entre la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta y de autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta, en donde la presencia de dichos complejos inmunologicos es indicativa de una afeccion artritica en dicho sujeto.

En un quinto aspecto la invencion proporciona un anticuerpo dirigido a la proteina 14-3-3 citrulinada de conformidad con el primer aspecto, en donde dicho anticuerpo se une selectivamente a una posicion citrulinada seleccionada del grupo que consiste en la posicion 4, la posicion 12, la posicion 19, la posicion 42, la posicion 61, la posicion 86 y la posicion 227 de la sec. con num. de ident.: 5.

En un sexto aspecto, la invencion proporciona un huesped no humano que produce un anticuerpo de conformidad con el quinto aspecto.

En un septimo aspecto, la invencion proporciona un metodo para diagnosticar y/o pronosticar una afeccion artritica en un sujeto que comprende poner en contacto una muestra biologica del sujeto con al menos un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a una proteina 14-3-3 citrulinada humana o un fragmento de esta en una condicion adecuada para la formacion de al menos un complejo inmunologico entre el anticuerpo y las proteinas 14-3-3 citrulinadas que puede encontrarse en la muestra biologica; y detectar la presencia, grado y/o ubicacion de al menos un residuo de citrulina dentro de dicha proteina 14-3-3 citrulinada, en donde dicha presencia, grado y/o ubicacion de dicho al menos un residuo de citrulina es indicativo de una afeccion artritica en dicho sujeto o informativo de un pronostico para dicho sujeto.

La presente invencion se refiere al hallazgo de que la presencia/cantidad de autoanticuerpos dirigidos contra la forma citrulinada de la proteina 14-3-3 eta en una muestra biologica es indicativa de la existencia y/o estado de la afeccion artritica en el sujeto. En la presente description se proporcionan, ademas, los metodos para evaluar y/o caracterizar una afeccion artritica en un sujeto mamifero que comprenden detectar complejos inmunologicos circulantes con al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o un fragmento de esta en una muestra biologica de un sujeto.

La proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta comprende al menos un residuo de citrulina en al menos un sitio de citrulinacion, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en la posicion 4, la posicion 12, la posicion 19, la posicion 42, la posicion 61, la posicion 86 o la posicion 227 de la secuencia de la proteina 14-3-3 eta nativa, o combinaciones de estas. La proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta por lo tanto puede aislarse o, mas preferentemente, unirse a un soporte solido como se describe con mas detalle en la presente descripcion.

En consecuencia, en la presente descripcion se describen metodos para evaluar y/o caracterizar una afeccion artritica en un sujeto mamifero que comprende poner en contacto una muestra biologica del sujeto con al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta y detectar un autoanticuerpo contra la proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta, en donde la presencia/cantidad de un autoanticuerpo contra al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta es indicativa de la existencia y/o estado de la afeccion artritica en el sujeto. Ademas, en la presente descripcion se proporcionan metodos para evaluar y/o caracterizar una afeccion artritica en un sujeto mamifero que comprende detectar complejos inmunologicos circulantes entre un autoanticuerpo y al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada en una muestra biologica del sujeto, en donde la presencia/cantidad de los complejos inmunologicos existentes en la muestra es indicativa de la existencia y/o estado de la afeccion artritica en el sujeto.

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En una modalidad, el paso de detection incluye cuantificar/medir el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, la proteina 14-3-3 eta citrulinada o un fragmento de esta en la muestra biologica para la comparacion con una muestra de control. En consecuencia, los metodos actualmente reivindicados para evaluar una afeccion artritica en un sujeto pueden proporcionar determinaciones pronosticas asi como tambien diagnosticas.

En una modalidad, la muestra de control es una muestra normal, y la comparacion es indicativa de un diagnostico de artritis. En una modalidad, un aumento del nivel de autoanticuerpo contra, o complejos inmunologicos con, la proteina 14-3-3 eta citrulinada o un fragmento de esta en dicha muestra biologica en comparacion con una muestra de control normal (p. ej., de otro sujeto que no tiene una afeccion artritica) es un indicador diagnostico de una afeccion artritica en dicho sujeto.

En consecuencia, en algunas modalidades, la presencia de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 eta citrulinada o complejos inmunologicos de estos en la muestra biologica del sujeto y/o la presencia de un aumento del nivel de tales autoanticuerpos o complejos inmunologicos en la muestra biologica del sujeto en relation con un nivel de tales autoanticuerpos o complejos inmunologicos en una muestra de control normal (es decir, no artritica) proporciona un diagnostico de que el sujeto tiene una afeccion artritica.

En una modalidad, la muestra control es una muestra biologica previa del sujeto mamifero, y la comparacion es indicativa de progresion de la enfermedad y/o eficacia de un regimen terapeutico. En una modalidad, una disminucion del nivel de autoanticuerpos a la proteina 14-3-3 eta citrulinada o complejos inmunologicos circulantes de estos en dicha muestra en comparacion con la muestra previa (p. ej., una muestra biologica de linea base de dicho sujeto) es indicativo de la eficacia de un regimen terapeutico continuado. En otra modalidad, un aumento del nivel de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 eta citrulinada o complejos inmunologicos circulantes de estos en dicha muestra en comparacion con la muestra previa es indicativo de una perdida de una respuesta a un regimen terapeutico.

En consecuencia, en algunas modalidades, el nivel relativo de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, la proteina 14-3-3 eta citrulinada o un fragmento de esta detectado en la muestra biologica del sujeto en comparacion con el nivel de tales autoanticuerpos o complejos presentes en una muestra biologica de linea base del mismo sujeto proporciona una indication pronostica de la afeccion artritica, y/o una indication teranostica de la eficacia potencial de un regimen terapeutico propuesto.

En una modalidad, la muestra control es la misma muestra biologica del sujeto mamifero, y la comparacion es con el nivel relativo o cantidad de autoanticuerpos dirigidos a la proteina 14-3-3 eta nativa o no citrulinada, lo que puede ser indicativo tambien de la progresion de la enfermedad y/o la eficacia de un regimen terapeutico potencial como se describe en la presente description. En una modalidad, el aumento de los niveles de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 eta citrulinada o complejos inmunologicos circulantes de estos en dicha muestra en comparacion con los niveles de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 eta nativa o no citrulinada o complejos inmunologicos circulantes de estos en la misma muestra es indicativo del estadio y/o pronostico de la enfermedad, o sugiere intervenciones terapeuticas potenciales (p. ej. inhibidores que se dirigen directamente a las peptidilargininadeiminasas y similares).

En consecuencia, en algunas modalidades, el nivel relativo de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, la proteina 14-3-3 eta citrulinada o un fragmento de esta detectado en la muestra biologica del sujeto en comparacion con el nivel de autoanticuerpos o complejos a la forma nativa o no citrulinada en la(s) misma(s) muestra(s) biologica(s) o secuenciales(s) del sujeto proporciona una indicacion pronostica de la afeccion artritica, y/o una indicacion teranostica de la eficacia potencial de un regimen terapeutico propuesto.

En una modalidad, la muestra de control es un control artritico, y la comparacion es indicativa del pronostico de la enfermedad. En una modalidad, el nivel relativo de autoanticuerpos a la proteina 14-3-3 eta citrulinada o complejos inmunologicos de estos en comparacion con una muestra de control artritica (p. ej., de otro sujeto con una afeccion artritica bien definida) es un indicador pronostico de la artritis.

En consecuencia, en algunas modalidades, los sujetos con diferentes estados artriticos tienen diferencias detectables en niveles de autoanticuerpos a al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta, y/o complejos inmunologicos circulantes de tales, y estas diferencias son de una relevancia pronostica. En un ejemplo, en la presente descripcion se describen metodos que pueden usarse para determinar una etapa especifica de la enfermedad o el fenotipo histopatologico de una afeccion artritica basado en el nivel relativo de autoanticuerpo detectados en un sujeto en comparacion con los niveles determinados anteriormente que existen a lo largo del curso de la afeccion artritica, p. ej., antes del tratamiento, durante el tratamiento, despues del tratamiento, en otro paciente, etcetera. En otro ejemplo, los metodos descritos en la presente descripcion pueden usarse para clasificar una muestra biologica como que es de un sujeto con alto riesgo de

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manifestacion de una afeccion artritica basado en el nivel relativo de autoanticuerpos detectados en la muestra biologica en comparacion con una muestra de control, que puede, p. ej., almacenarse en una base de datos.

En otra modalidad, los metodos descritos en la presente descripcion pueden usarse para propositos teranosticos, p. ej., para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico propuesto basado en el nivel relativo de autoanticuerpos detectados en una muestra biologica del sujeto en comparacion con una muestra de control, p. ej., de una segunda muestra biologica de un segundo sujeto que se trato exitosamente con el regimen terapeutico propuesto.

En consecuencia, en algunas modalidades, el nivel relativo de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta en la muestra biologica del primer sujeto es en comparacion con el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, la proteina 14-3-3 eta citrulinada en muestras biologicas de sujetos cuyas capacidades para responder a un tratamiento se conocen, en donde tal comparacion determina la respuesta potencial del primer sujeto al tratamiento. La determinacion de la sensibilidad del sujeto a un regimen terapeutico puede usarse entonces para informar los metodos de tratamiento de un sujeto con una afeccion artritica. Por ejemplo, en la presente descripcion se describen metodos para tratar a un sujeto con una afeccion artritica que comprenden medir el nivel de autoanticuerpo contra la proteina 14-3-3 eta citrulinada en una muestra biologica del sujeto (p. ej., mediante la medicion del nivel de formacion del complejo inmunologico autoanticuerpo/proteina 14-3-3 eta citrulinada), que correlaciona el nivel de autoanticuerpo contra o complejo inmunologico con la proteina 14-3-3 eta citrulinada con la sensibilidad del sujeto a un regimen terapeutico, y proporcionar el regimen terapeutico al sujeto. En una modalidad, la invencion proporciona los metodos para controlar el tratamiento de una afeccion artritica, que comprenden determinar el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta en muestras de pacientes y controlar el nivel de autoanticuerpos/complejos inmunologicos que implican proteina 143-3 eta citrulinada en un paciente que se somete a tratamiento.

En otra modalidad, en la presente descripcion se proporcionan metodos para determinar y/o diferenciar los subtipos de artritis en un paciente. En esta modalidad, el nivel relativo de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta en la muestra biologica del primer sujeto es en comparacion con el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, la proteina 14-3-3 eta citrulinada en muestras biologicas de uno u otros sujetos cuyos subtipo de artritis se conoce y/o se establece anteriormente, en donde tal comparacion determina el subtipo de artritis para el primer sujeto.

La determinacion de que los niveles de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-33 citrulinada o fragmento de esta en la muestra biologica del primer sujeto son similares a los niveles de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta en la muestra biologica de otro sujeto cuyo subtipo de artritis se conoce y/o se establece anteriormente puede indicar que el primer sujeto tiene el mismo subtipo de artritis que el otro sujeto. Por ejemplo, niveles similares de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta en la muestra biologica del primer sujeto y en la muestra biologica de otro sujeto conocido por tener artritis inflamatoria, p. ej., artritis reumatoide, pueden determinar que el primer sujeto tambien tiene artritis inflamatoria, p. ej., artritis reumatoide.

Ademas, la determinacion de que los niveles de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta en la muestra biologica del primer sujeto son diferentes a los niveles de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta en la muestra biologica de otro sujeto cuyo subtipo de artritis se conoce y/o se establece anteriormente puede indicar que el primer sujeto tiene un subtipo de artritis diferente que el del otro sujeto. Por ejemplo, niveles diferentes de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta en la muestra biologica del primer sujeto y en la muestra biologica de otro sujeto conocido por tener artritis no inflamatoria, p. ej., osteoartritis, pueden determinar que el primer sujeto tiene una artritis inflamatoria, p. ej., artritis reumatoide.

En una modalidad, el paso de deteccion comprende una tecnica basada en inmunologia, p. ej., inmunoprecipitacion, ELISA, analisis por membrana de Western, inmunohistoquimica, inmunofluorescencia, inmunoensayos tipo "sandwich", ensayos inmunoradiometricos, reacciones de precipitacion por difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos in situ, reacciones de precipitacion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion de complemento, ensayos de proteina A, ensayos de inmunoelectroforesis, analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), radioinmunoensayo, y similares.

Detectar y/o medir autoanticuerpos contra una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta de conformidad con los metodos descritos en la presente descripcion puede realizarse, por lo tanto, mediante la observation de la formacion de un complejo inmunologico entre el autoanticuerpo y la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta en una muestra, o la determinacion alternativa de la presencia de un complejo autoanticuerpo/ proteina 14-3-3 citrulinada existente en una

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muestra. En una modalidad, la formacion puede detectarse por medio de protema(s) 14-3-3 citrulinada(s) marcada(s) detectablemente o fragmento(s) de esta(s). En otra modalidad, el complejo puede detectarse mediante la formacion de un segundo complejo inmunologico entre el complejo autoanticuerpo/ protema 14-3-3 citrulinada y un anticuerpo secundario marcado detectablemente que se une a inmunoglobulina, p. ej., el esqueleto de inmunoglobulina del autoanticuerpo.

En una modalidad, los metodos implican detectar autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada o complejos inmunologicos circulantes de estos en la sangre, liquido sinovial, plasma, suero, o tejido (p. ej. articulacion sinovial, tejido de articulacion danado, etcetera) de un paciente. En una modalidad, la detection se realiza mediante inmunoprecipitacion de autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada de la sangre, liquido sinovial, plasma, suero o tejido mediante el uso de proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta. En una modalidad, la deteccion implica el uso de un ELISA. En una modalidad, la deteccion implica el analisis de membrana de Western de una muestra que comprende liquido sinovial, plasma, o suero de un paciente. En una modalidad, la deteccion implica el uso de radioinmunoensayo. En una modalidad, la deteccion implica el uso de una prueba de tira. En una modalidad, la deteccion implica el uso de una prueba en el punto de cuidado. En una modalidad, la deteccion de autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada o complejos circulantes de estos se combina con la deteccion de otro marcadorde artritis (p. ej., MMP, anti-CCP, anti-RF y/o CRP).

Ademas, en la presente description se proporcionan estuches que comprenden al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta, en donde la proteina o fragmento de esta comprende un residuo de citrulina en una position seleccionada del grupo que consiste en la posicion 4, la posicion 12, la posicion 19, la posicion 42, la posicion 61, la posicion 86 y la posicion 227 de la sec. con num. de ident.: 5.En una modalidad, la proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta puede incluir una proteina 14-3-3 citrulinada marcada detectablemente o fragmento de esta, que puede ademas inmovilizarse en un soporte solido. La proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta puede comprender un epitopo compartido entre una pluralidad de isoformas de la proteina 14-3-3, o puede comprender un unico epitopo para una o un conjunto de isoformas de la proteina 14-3-3 citrulinada. En una modalidad, la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta comprende un epitopo de proteina 14-3-3 eta citrulinada compartido por al menos alguna otra isoforma de la proteina 14-3-3 citrulinada, p. ej., la proteina 14-3-3 gamma. En otra modalidad, el epitopo de proteina 14-3-3 eta citrulinada es unico para la proteina 14-3-3 eta.

En otro aspecto, en la presente descripcion se proporciona un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a una proteina 143-3 citrulinada humana o un fragmento citrulinado de esta, en donde el anticuerpo se une selectivamente a una posicion citrulinada seleccionada del grupo que consiste en la posicion 4, la posicion 12, la posicion 19, la posicion 42, la posicion 61, la posicion 86 y la posicion 227 de la sec. con num. de ident.: 5. En una modalidad preferida, el anticuerpo aislado compite por la union a una proteina 14-3-3 eta citrulinada con autoanticuerpos anti-14-3-3 eta especificos para la proteina 14-3-3 eta citrulinada pero no con autoanticuerpos anti-14-3-3 eta especificos para la forma nativa o no citrulinada de la proteina 14-3-3 eta.

En una modalidad, el anticuerpo es capaz de unirse selectivamente a dicha proteina 14-3-3 eta citrulinada o a un fragmento citrulinado de esta, sobre la proteina 14-3-3 eta nativa o fragmento 14-3-3 eta nativo de esta, respectivamente. En una modalidad preferida, el anticuerpo es capaz de unirse selectivamente a la proteina 14-3-3 eta citrulinada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las sec. con nums. de ident.: 16-22 sobre una proteina 14-3-3 eta nativa que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las sec. con nums. de ident.:9-15, respectivamente. En una modalidad, un anticuerpo proporcionado en la presente descripcion se une selectivamente a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 16, pero no una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.:9. En una modalidad, un anticuerpo proporcionado en la presente descripcion se une selectivamente a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 17, pero no una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 10. En una modalidad, un anticuerpo proporcionado en la presente descripcion se une selectivamente a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 18, pero no una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 11. En una modalidad, un anticuerpo proporcionado en la presente descripcion se une selectivamente a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 19, pero no una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 12. En una modalidad, un anticuerpo proporcionado en la presente descripcion se une selectivamente a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 20, pero no a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 13. En una modalidad, un anticuerpo proporcionado en la presente descripcion se une selectivamente a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.:21, pero no a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 14. En una modalidad, un anticuerpo proporcionado en la presente descripcion se une selectivamente a una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 22, pero no una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 15. En otra modalidad, el anticuerpo es capaz de unirse selectivamente a la proteina gamma 14-3-3 citrulinada sobre la proteina gamma 14-3-3 nativa.

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En otra modalidad, la presente invencion se refiere al hallazgo de que el grado de citrulinacion de las proteinas 14-3-3 eta individuales, y/o la identificacion de residuos de citrulina en sitios particulares dentro de la proteina, p. ej. en cualquiera o mas de las posiciones 4, 12, 19, 42, 61, 86 y 227 de la sec. con num. de ident.: 5, es tambien indicativo de la existencia y/o estado de la afeccion artritica en el sujeto. Ademas, en la presente descripcion se proporcionan metodos para evaluar y/o caracterizar una afeccion artritica en un sujeto mamifero que comprende detectar el grado y/o las posiciones especificas de citrulinacion de al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada o un fragmento de esta en una muestra biologica de un sujeto mediante el uso de los anticuerpos selectivos mencionados anteriormente.

En consecuencia, en la presente descripcion se describen los metodos para evaluar y/o caracterizar una afeccion artritica en un sujeto mamifero que comprende poner en contacto una muestra biologica del sujeto con uno o mas anticuerpos capaces de unirse selectivamente a una proteina 14-3-3 eta citrulinada humana o un fragmento citrulinado de esta y detectar la proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta, en donde la presencia, grado y/o ubicacion de la citrulinacion dentro de dicha proteina 14-3-3 eta o fragmento de esta es indicativa de la existencia y/o estado de la afeccion artritica en el sujeto, en comparacion con un resultado clinico definido estandar.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra un grafico de barras que representa la respuesta de un autoanticuerpo especifica a la citrulinacion de la proteina 14-3-3 eta en pacientes con artritis reumatoide (RA) negativos a anti-CCP y positivos a anti-CCP como se midio por la reactividad del autoanticuerpo dirigido tanto a la forma recombinante no citrulinada como a la citrulinada del antigeno 143-3 eta. Los autoanticuerpos contra proteina 14-3-3 eta se unen, preferentemente, a la forma citrulinada del antigeno 14-3-3 eta tanto en pacientes negativos como positivos a anti-CCP.

La figura 2 es una representation grafica que representa la respuesta del autoanticuerpo especifica a la citrulinacion de la proteina 14-3-3 eta en treinta controles saludables negativos a anti-CCP (•) en comparacion con treinta pacientes con artritis reumatoide (RA) negativos a anti-CCP (▲). El eje y (anti-cit-14-3-3 n) representa la respuesta del autoanticuerpo hacia la forma citrulinada del antigeno 14-3-3 eta para cada sujeto individual.

Descripcion detallada

"14-3-3" y "proteina 14-3-3" se usan indistintamente y se refieren a al menos un miembro de la familia 14-3-3. Una proteina 14-3-3 es un miembro de una familia de moleculas reguladoras intracelulares conservadas que se expresan de forma ubicua en eucariotas. Las proteinas 14-3-3 tienen la capacidad de unirse a una multitud de proteinas de serialization funcionalmente diversas, que incluyen cinasas, fosfatasas, y receptores de transmembrana. De hecho, se han informado mas de 100 proteinas de senalizacion como ligandos de 14-3-3. Las proteinas 14-3-3 pueden considerarse miembros evolucionados de la superfamilia de Repeticiones Tetratricopeptidicas. Estas tienen, generalmente, 9 o 10 alfa helices, y usualmente forman interacciones homo y/o hetero dimero a lo largo de sus helices aminoterminales. Estas proteinas contienen un numero de dominios conocidos, que incluyen regiones para interaction de cationes divalentes, fosforilacion y acetilacion, y escision proteolitica, entre otros.

Existen siete isoformas codificadas geneticamente distintas de las proteinas 14-3-3 que se conocen por expresarse en mamiferos, con cada isoforma que comprende entre 242-255 aminoacidos. Las siete isoformas de la proteina 14-3-3 se designan como 14-3-3 a/p (alfa/beta), 14-3-3 5/£ (delta/zeta), 14-3-3 £ (epsilon), 14-3-3 y (gamma), 14-3-3 n (eta), 14-3-3 t/0 (tau/theta), and 14-3-3 a (sigma/estratifina). Las proteinas 14-3-3 tienen un alto grado de similitud de secuencia, y son conocidas por experimentar procesamiento postraduccional, p. ej., fosforilacion, citrulinacion, etcetera Ver, p. ej., Megidish y otros (1998) J. Biol. Chem. 2'I3 : 21834-45. Por consiguiente, los autoanticuerpos anti-14-3-3 pueden unirse especificamente a y/o reconocer mas de una isoforma de la proteina 14-3-3, o pueden unirse especificamente y/o reconocer solo una isoforma (p. ej., 14-3-3 eta).

La citrulinacion es una forma de una modification postraduccional (PTM) por la que las peptidilargininadeiminasas (PAD) catalizan la deiminacion del aminoacido arginina (R) a citrulina (C) lo que resulta en un cambio quimico que libera una portion basada en nitrogeno. En consecuencia, los terminos "proteina 14-3-3 citrulinada" y "peptido 14-3-3 citrulinado" son indistintos y se refieren a una proteina que tiene una secuencia de aminoacidos que es identica a la secuencia de aminoacidos de una proteina 14-3-3 nativa (p. ej., una proteina 14-3-3 que no se ha modificado postraduccionalmente) pero por la sustitucion de al menos un residuo de arginina en la secuencia nativa con un residuo de citrulina en la secuencia citrulinada.

"Sustituido por" o "reemplazado por" incluye modificado en, p. ej., un residuo de arginina que se sustituye o se reemplaza por un residuo de citrulina puede significar tambien un residuo de arginina modificado en un residuo de citrulina, p. ej.,

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mediante la incubacion con PAD. La citrulinacion por PAD comienza principalmente en el NH2-terminal de la protema, pero excepcionalmente puede comenzar desde el COOh terminal de la protema. En el caso de que varios residuos de arginina se reemplacen por residuos de citrulina, esto significa que para dichos varios residuos de arginina cada unico residuo de arginina se reemplaza por un unico residuo de citrulina.

Las peptidilargininadeiminasas (PAD), referidas tambien como deiminasas de protema-arginina, son una familia de enzimas de modification postraduccional que convierten residuos de arginina en peptidos a residuos de citrulina en presencia de iones de calcio.

"Citrulina" y "Cit" se refiere al acido 2-amino-5-(carbamoilamino)pentanoico y es un alfa-aminoacido con formula: H2NC(O)NH(CH2)3CH(NH2)CO2H.

Los terminos "peptido" y "protema" son equivalentes como se usa en la presente description y se refieren a una molecula que comprende una secuencia de aminoacidos de entre 2 y 200 aminoacidos, conectados por enlaces peptidicos. Los peptidos pueden contener cualquiera de los 20 aminoacidos convencionales o versiones modificadas de estos y cualquiera de los aminoacidos de origen no natural incorporado mediante sintesis quimica de peptidos o mediante modificacion quimica o enzimatica. Los peptidos pueden usarse como antigenos y pueden comprender uno o mas epitopos.

El termino "derivado" "variante" y "fragmento" como se usa en la presente descripcion con referencia a una proteina se refiere a moleculas que comprenden al menos la portion activa de dicha proteina, p. ej., comprende al menos el epitopo y/o el residuo de citrulina de dicha proteina, uno o ambos de los cuales se encuentran unidos especificamente por autoanticuerpos anti-14-3-3.

El termino "epitopo" se refiere a una o varias porciones (que pueden definir un epitopo conformacional) de una proteina antigenica que es reconocida y unida especificamente por un anticuerpo o porcion de este (Fab', Fab2', etcetera) o por un receptor presentado en la superficie celular de linfocitos de celulas B o T, y que es capaz, mediante dicha union, de inducir una respuesta inmunologica. Los epitopos son caracteristicas quimicas presentes generalmente en la superficie de moleculas y son accesibles a la interaction con un anticuerpo. Las caracteristicas quimicas tipicas son aminoacidos y porciones de azucares, que tienen caracteristicas estructurales tridimensionales asi como tambien propiedades quimicas que incluyen carga, hidrofilicidad, y lipofilicidad. Los epitopos conformacionales se distinguen de los epitopos no conformacionales por la perdida de reactividad con un anticuerpo despues de un cambio en los elementos espaciales de la molecula sin ningun cambio en la estructura quimica subyacente.

Un experto en la tecnica reconocera que los autoanticuerpos reconocen fragmentos del antigeno. En consecuencia, como se usa en la presente descripcion, "fragmento de esta" y "epitopo" se usan indistintamente y se refieren, generalmente, a un determinante de 14-3-3 que es capaz de unirse a un anticuerpo, p. ej., un autoanticuerpo. En consecuencia, el termino "epitopo" cuando se usa en referencia a proteinas 14-3-3 o isomeros especificos se refiere, generalmente, a un fragmento de la proteina, que incluye una proteina 14-3-3 citrulinada, que es capaz de unirse a un anticuerpo, p. ej., un autoanticuerpo.

En la presente descripcion se describen epitopos de proteina 14-3-3 citrulinada que comprenden al menos un residuo de citrulina y que son reconocidos por autoanticuerpos en un paciente diagnosticado con artritis, particularmente artritis reumatoide, metodos de uso de tales epitopos para evaluar y/o caracterizar una afeccion artritica en un sujeto, y estuches que comprenden tales epitopos. Un epitopo puede comprender 3 o mas aminoacidos en una conformation espacial que es unica para el epitopo. Generalmente, un epitopo consiste en al menos 6 de tales aminoacidos, y mas usualmente, al menos 8-10 de tales aminoacidos. Los metodos para determinar los aminoacidos que conforman un epitopo incluyen cristalografia por rayos x, resonancia magnetica nuclear bidimensional, y mapeo de epitopos.

"Anticuerpo" se refiere a una composition que comprende una proteina que se une especificamente a un antigeno correspondiente y tiene una estructura comun, general de inmunoglobulinas. El termino anticuerpo cubre especificamente anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, dimeros, multimeros, anticuerpos multiespecificos (p. ej., anticuerpos biespecificos), y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biologica deseada. Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quimericos, o derivados de otras especies. Tipicamente, un anticuerpo comprendera al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras interconectadas mediante enlaces disulfuro, que cuando se combinan forman un dominio de union que interactua con un antigeno. Cada cadena pesada consiste en una region variable de cadena pesada (VH) y una region constante de cadena pesada (CH). La region constante de cadena pesada consiste en tres dominios, CHI, CH2 y CH3, y pueden ser del isotipo mu, delta, gamma, alfa o epsilon. De manera similar, la cadena ligera consiste en una region variable de cadena ligera (VL) y una region constante de cadena ligera (CL). La region constante de cadena ligera consiste en un dominio, CL, que puede ser del isotipo kappa o lambda. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son mas conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada

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VH y VL consisten en tres CDR y cuatro FR, distribuidos desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la union de la inmunoglobulina a los tejidos o factores huesped, que incluyen varias celulas del sistema inmunologico (p. ej., celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clasico del complemento. La region constante de cadena pesada media la union de la inmunoglobulina al tejido huesped o factores huesped, particularmente a traves de receptores tales como los receptores Fc (p. ej., FcyRI, FcyRII, FcyRlll, etcetera). Como se usa en la presente description, anticuerpo incluye, ademas, una portion de union a antigeno de una inmunoglobulina que mantiene la capacidad de union al antigeno. Estos incluyen, como ejemplos, F(ab), un fragmento monovalente de los dominios del anticuerpo VL CL y VH CH; y fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra. El termino anticuerpo se refiere, ademas, a fragmentos Fv recombinantes de cadena unica (scFv) y moleculas biespecificas tales como, p. ej., diacuerpos, triacuerpos, y tetracuerpos (ver, p. ej., la patente de los Estados Unidos num. 5,844,094).

"Antigeno" debe interpretarse ampliamente y se refiere a cualquier molecula, composition, o particula que puede unirse especificamente a un anticuerpo. Un antigeno puede tener uno o mas epitopos que interactuan con el anticuerpo, aunque no necesariamente induce la production de este anticuerpo.

Los "autoanticuerpos" son anticuerpos endogenos que se unen especificamente a antigenos propios, es decir, un componente de tejido normal. Un autoanticuerpo se produce en respuesta a un antigeno de origen natural del mismo cuerpo que produce el autoanticuerpo. En consecuencia, los terminos"autoanticuerpos contra 14-3-3" y "autoanticuerpos a 14-3-3 " se usan indistintamente y se refieren a anticuerpos endogenos producidos por un sujeto mamifero que se une especificamente a una proteina 14-3-3, que puede citrulinarse, o un fragmento de esta de dicho huesped.

"Union inmunologica" y "formation de un complejo inmunologico" se usan indistintamente y como se usa en este contexto, se refieren generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre un anticuerpo, p. ej., un autoanticuerpo, y un antigeno para el que el anticuerpo es especifico. La fuerza, o la afinidad de las interacciones de uniones inmunologicas pueden expresarse en terminos de la constante de disociacion (Kd) de la interaction, en donde una menor Kd representa una mayor afinidad. Las propiedades de las uniones inmunologicas pueden cuantificarse mediante el uso de metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, ver Davies y otros (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473. Se dice que un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno de este, "se une especificamente," "se une inmunologicamente," y/o es "reactivo inmunologicamente" si reacciona a un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, un ensayo de ELISA) con el ligando, y no reacciona detectablemente con ligandos no relacionados bajo condiciones similares.

La frase "se une especificamente (o selectivamente)" a un anticuerpo, cuando se refiere a una proteina o peptido, se refiere a una reaction de union que es determinante de la presencia de la proteina en una poblacion heterogenea de proteinas y de otros compuestos biologicos. El termino "dirigido contra" una proteina o peptido, cuando se refiere a un anticuerpo, se refiere tambien a la reaccion de union especifica que es determinante de la presencia de la proteina por dicho anticuerpo en una poblacion heterogenea de proteinas y de otros compuestos biologicos. Por lo tanto, bajo las condiciones de inmunoensayos designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteina particular al menos dos veces el fondo y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteinas presentes en la muestra. La union especifica a un anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteina particular. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales presentados al marcador "X" de especies especificas tales como rata, raton, o ser humano pueden seleccionarse para obtener solo aquellos anticuerpos policlonales que son inmunoreactivos especificamente con el marcador "X" y no con otras proteinas, excepto para las variantes polimorficas y alelos del marcador "X". Esta selection puede lograrse restando los anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con moleculas del marcador "X" de otras especies. Una variedad de formatos de inmunoensayos pueden usarse para seleccionar anticuerpos especificamente inmunoreactivos con una proteina particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase solida se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos especificamente inmunoreactivos con una proteina (ver, p. ej., Harlow &Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripcion de formatos y condiciones de inmunoensayos que pueden usarse para determinar inmunoreactividad especifica). Tipicamente, una reaccion especifica o selectiva sera al menos dos veces la senal de fondo o ruido y mas tipicamente mas de 10 a 100 veces el fondo.

"Diagnostico" significa identificar la presencia o naturaleza de una afeccion patologica en un sujeto basado en la presencia o ausencia de uno o mas autoanticuerpos para la(s) proteina(s) 14-3-3 citrulinada(s) descrita(s) en la presente descripcion. El metodo de diagnostico hace la correlation entre la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra la(s) proteina(s) 14-3-3 citrulinada(s) y la ocurrencia de una enfermedad especifica, p. ej., artritis reumatoide, o un grupo de enfermedades (p. ej. afecciones artriticas).

"Pronostico" significa determinar la progresion o resultado potencial de un proceso de afeccion patologica y/o de enfermedades en un sujeto, con o sin tratamiento, basado en la presencia/ausencia y/o cantidad de uno o mas anticuerpos

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a la(s) protema(s) 14-3-3 citrulinada(s) descrita(s) en la presente description. El metodo de pronostico hace la correlation entre la presencia y/o cantidad de autoanticuerpos dirigidos contra la(s) protema(s) 14-3-3 citrulinada(s) y la progresion y/o resultado probable de la afeccion artr^tica.

"Teranostico" significa determinar la reaction potencial y/o probable para un protocolo de tratamiento propuesto para un proceso de afeccion patologica y/o de enfermedades en un sujeto, basado en la presencia/ausencia y/o cantidad de uno o mas anticuerpos para la(s) proteina(s) 14-3-3 citrulinada(s) descrita(s) en la presente descripcion, y adaptar un tratamiento apropiado para el sujeto basado en los resultados. El metodo teranostico hace la correlacion entre la presencia y/o cantidad de autoanticuerpos dirigidos contra la(s) proteina(s) 14-3-3 citrulinada(s) y la eficacia probable de las diferentes opciones de tratamiento en la afeccion artritica en el sujeto.

"Sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a, excepto cuando se indica, mamiferos tales como seres humanos y primates no humanos, asi como tambien conejos, ratas, ratones, carneros, cerdos, y otras especies de mamiferos.

"Afeccion artritica," "artritis," y "artralgia" se usan indistintamente, y generalmente se refieren a, excepto cuando se indique, un trastorno inflamatorio de las articulaciones del cuerpo. El dolor, la hinchazon, la rigidez, y la dificultad de movimiento se asocian frecuentemente con afecciones artriticas. La artritis consiste en mas de 100 afecciones diferentes. Estas pueden ser cualquiera desde formas relativamente suaves hasta formas sistemicas incapacitantes, ver, p. ej.,
www.arthritis.ca/types%20of%20arthritis/default.asp?s=1. Una afeccion artritica puede ser el resultado de cualquiera de varias causas, que incluyen infeccion, trauma, trastornos degenerativos, trastornos o alteraciones metabolicas, u otras etiologias desconocidas.

Una afeccion artritica puede describirse mas especificamente de conformidad con el subtipo, por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD), artritis inducida por cristales, artritis reactiva, espondilartropatia, osteoartritis, sarcoidosis, reumatismo palindromico, artritis postraumatica, artritis relacionada con malignidad, artritis septica, artritis de Lyme, osteoartritis, artritis bacteriana, infecciosa, etcetera. La artritis puede acompanar, ademas, otros trastornos identificados, que incluyen gota, espondilitis alquilosante, lupus eritematoso sistemico, enfermedad inflamatoria del intestino, soriasis, etcetera. La afeccion artritica bien definida se refiere al conocimiento con respecto al tipo de artritis y su etapa, p. ej., aparicion, remision, recaida, etcetera.

Proteinas 14-3-3 citrulinadas

Las secuencias de aminoacidos de las proteinas 14-3-3 nativas se exponen en la Tabla 1. En algunas modalidades, una proteina 14-3-3 es identica a las secuencias de la proteina 14-3-3 nativa proporcionada en la Tabla 1. La proteina 14-3-3 tambien puede ser sustancialmente homologa a la secuencia de la proteina 14-3-3 nativa proporcionada en la Tabla 1 y conserva la actividad funcional de la proteina 14-3-3, p. ej., la union especifica a un autoanticuerpo anti-14-3-3, pero difiere en la secuencia de aminoacidos debido a la variation alelica natural o mutagenesis.

Tabla 1: proteinas 14-3-3.

Proteina 14-3-3

Num. de acceso a NCBI Sec. con num. de ident.:

14-3-3 a/p

NP_003395.1 1

14-3-3 5/£

NP_001129171.1 2

14-3-3 £

NP_006752.1 3

14-3-3 y

NP_036611.2 4

14-3-3 n

NP_003396.1 $

14-3-3 T/0

NP_006817.1 6

14-3-3 a

NP_006133.1 7

Como se usa en la presente descripcion, la frase "proteina 14-3-3 eta" se refiere a una proteina que comprende la sec. con num. de ident.: 5 asi como tambien una proteina sustancialmente homologa a esta, p. ej., una proteina que tiene al menos 75 %, aun mas preferentemente 80 % a 90 %, incluso mas preferentemente 90 %-95 %, de nuevo mas preferentemente 95

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%, y con mayor preferencia al menos 98 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la sec. con num. de ident.: 5. La secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 5 se proporciona a continuation.

MGDREQLLQR ARLAEQAERY DDMASAMKAV TELNEPLSNE DRNLLSVAYK NVVGARRSSW RVISSIEQKT MADGNEKKLE KVKAYREKIE KELETVCNDV LSLLDKFLIK NCNDFQYESK VFYLKMKGDY YRYLAEVASG EKKNSVVEAS EAAYKEAFEI SKEQMQPTHP IRLGLALNFS VFYYEIQNAP EQACLLAKQA FDDAIAELDT LNEDSYKDST LIMQLLRDNL TLWTSDQQDE EAGEGN

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos secuencias de polinucleotidos, las secuencias se alinean para propositos de comparacion optima (p. ej., pueden introducirse interrupciones en una o en ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o de polinucleotidos para el alineamiento optimo y las secuencias no homologas no pueden tenerse en cuenta para propositos de comparacion). En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propositos de comparacion es de al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, mas preferentemente al menos 50 %, aun mas preferentemente al menos 60 %, y aun mas preferentemente al menos 70 %, 80 % o 90 % de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoacidos o de nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o en las posiciones de nucleotidos correspondientes se comparan despues. Cuando una position en la primera secuencia se encuentra ocupada por el mismo residuo de aminoacidos o de nucleotidos que la position correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion (como se usa en la presente description la "identidad" de aminoacidos o de polinucleotidos es equivalente a la "homologia" de aminoacidos o de polinucleotidos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para un alineamiento optimo de las dos secuencias.

La comparacion de las secuencias y la determination del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden lograrse mediante el uso de un algoritmo matematico. En una modalidad preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se determina mediante el uso del algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de programa informatico GCG (disponible en
http://www.gcg.com), mediante el uso ya sea de una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de interruption de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Aun en otra modalidad preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos se determina mediante el uso del programa gAp en el paquete de programa informatico GCG (disponible en
http://www.gcg.com), mediante el uso de una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de interrupcion de 40, 50, 60, 70, o 80 y un peso del longitud de 1,2, 3, 4, 5, o 6. En otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos o de nucleotidos se determina mediante el uso del algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM 120, una penalization de longitud de interrupcion de 12 y una penalization de interrupcion de 4.

Las secuencias de proteina de la presente invention pueden usarse adicionalmente como una “secuencia de consulta” para realizar una busqueda contra bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de familia o secuencias relacionadas. Tales busquedas pueden realizarse mediante el uso de los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) deAltschul, y otros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de nucleotidos en BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuacion=100, longitud de palabra=12 para obtener las secuencias de nucleotidos homologas a las moleculas de polinucleotido de la invencion. Las busquedas de proteinas en BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuacion=50, longitud de palabra=3 para obtener las secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de proteina 14-3-3 de la invencion. Para obtener los alineamientos interrumpidos para propositos de comparacion, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe enAltschul y otros, (1997) Polynucleotides Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parametros predeterminados de los programas respectivos (p. ej., XBLAST y NBLAST), p. ej., en
www.ncbi.nim.nih.gov.

La incubation de una proteina 14-3-3, fragmento, o fusion de esta con una peptidilargininadeiminasa de conformidad con los metodos bien conocidos resulta en una proteina 14-3-3 citrulinada, fragmento o fusion de esta. Tal proteina 14-3-3 citrulinada, fragmento o fusion de esta puede usarse como un inmunogeno, para producir anticuerpos anti-14-3-3, purificar anticuerpos anti-14-3-3, y en ensayos diagnosticos, pronosticos y teranosticos como se describe en la presente descripcion.

De acuerdo con la presente invencion, los sitios de citrulinacion de la proteina 14-3-3 eta humana identificados in silico, in vitro y mediante el uso de muestras clinicas se proporcionan en la Tabla 2.

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Tabla 2

Posicion AA

Secuencia AA Peptido arginilado Peptido citrulinado

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1 -12 MGD[R]EQLLQRAR (sec. con num. de ident.:9) MGD[Cit]EQLLQRAR (sec. con num. de ident.:16)

12

4 -18 REQLLQRA[R]LAEQAE (sec. con num. de ident.: 10) REQLLQRA(Cit]LAEQAE (sec. con num. de ident.:17)

19

CD CNJ i CNJ RLAEQAE[R]YDDMASA (sec. con num. de ident.: 11) RLAEQAE[CitlYDDMASA (sec. con num. de ident.:18)

42

29 -45 KAVTELNEPLSNEDrRINLL (sec. con num. de ident.: 12) KAVTELNEPLSNEDrCitlNLL (sec. con num. de ident.:19)

61

50 -69 KNWGARRSSWrRIVISSIEQK (sec. con num. de ident.:13) KNWGARRSSWrCitlVISSIEQK (sec. con num. de ident.:20)

86

77 -89 KKLEKVKAY[R]EKI (sec. con num. de ident.: 14) KKLEKVKAY[CitlEKI (sec. con num. de ident.: 21)

227

217-235 KDSTLIMQLL[R]DNLTL WTS (SEO ID NO: 15 KDSTLIMQLL[Cit]DNLTL WTS (SEO ID NO:22)

Las protemas citrulinadas de la invencion pueden comprender un residuo de citrulina en al menos una de las posiciones de amino acidos enumerados en la Tabla 2. En una modalidad, un fragmento de la protema 14-3-3 eta citrulinada de conformidad con la presente invencion comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las sec. con nums. de ident.: 16-22.

Como se muestra en la Tabla 3, varios si no todos los siete sitios citrulinados enumerados en la Tabla 2 se conservan tambien en otras isoformas de 14-3-3. En consecuencia, en la medida que estos sitios de citrulinacion se conservan en otras isoformas de 14-3-3, estos sitios pueden usarse tambien para determinarel estado de citrulinacion de estas otras isoformas de 14-3-3 mediante el uso de metodosy materiales descritos en la presente descripcion.

Tabla 3

Sitio de aminoacidos en Eta

Eta Gamma Alfa/beta Epsilon Sigma Theta Zeta

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Varios aspectos de la invencion pertenecen a protemas 14-3-3 eta citrulinadas aisladas, y porciones biologicamente activas de estas, p. ej., fragmentos adecuados para el uso como antigenos para autoanticuerpos anti-14-3-3 citrulinada, como se describe en la presente descripcion. Las protemas 14-3-3 citrulinadas, que incluyen fragmentos de estas, pueden aislarse de

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la proteina 14-3-3 natural, recombinante o sintetica (que incluye fragmentos de esta, respectivamente), mediante la accion de la peptidilargininadeiminasa, p. ej., mediante la incubacion de la protema 14-3-3 nativa o fragmentos de esta, respectivamente, con peptidilargininadeiminasas de conformidad con los metodos bien conocidos. Alternativamente, las protemas 14-3-3 eta citrulinadas pueden aislarse mediante sintesis de peptidos de conformidad con metodos bien conocidos, p. ej., mediante la incorporacion directa de residuos de citrulina en el peptido sintetizado.

Las proteinas 14-3-3 pueden aislarse a partir de celulas o fuentes de tejidos mediante un esquema de purificacion apropiado mediante el uso de tecnicas estandar de purificacion de proteinas. En otra modalidad, las proteinas 14-3-3 se producen mediante tecnicas de ADN recombinante.

Preferentemente, una proteina 14-3-3 o fragmento de esta de la invencion se produce mediante tecnicas estandar de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para la proteina 14-3-3 o fragmento de esta se ligan en el marco de un vector de expresion de acuerdo con tecnicas convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de terminales de extremos romos o de extremos escalonados para ligacion, digestion con enzimas de restriccion para proporcionar terminales apropiados, el relleno de extremos cohesivos segun sea apropiado, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la union no deseada, y la ligacion enzimatica. Alternativamente, la amplification por PCR de los fragmentos genicos puede llevare a cabo mediante el uso de iniciadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos genicos consecutivos que pueden hibridarse y reamplificarse posteriormente para generar una secuencia genica c (ver, p. ej., CurrentProtocols In Molecular Biology, ediciones Ausubel y otros John Wiley&Sons: 1992).

Ademas, muchos vectores de expresion se encuentran comercialmente disponibles que ya codifican una portion, p. ej., una portion detectable. Un polinucleotido que codifica una proteina 14-3-3 o fragmento de esta puede clonarse en un vector de expresion tal de manera que una porcion, p. ej., una porcion detectable, se une en marco a la proteina 14-3-3 o fragmento.

Puede usarse una secuencia senal para facilitar la secretion y el aislamiento de la proteina secretada u otras proteinas de interes. Las secuencias senal se caracterizan, tipicamente, por un nucleo de aminoacidos hidrofobos que se escinden, generalmente, de la proteina madura durante la secrecion en uno o mas de los eventos de escision. Tales peptidos senal contienen sitios de procesamiento que permiten la escision de la secuencia senal de las proteinas maduras a medida que pasan a traves de la via secretora. Por lo tanto, la invencion pertenece a los polipeptidos descritos que tienen una secuencia senal, asi como tambien a polipeptidos de los que se ha escindido proteoliticamente la secuencia senal (es decir, los productos de escision). En una modalidad, una secuencia de polinucleotidos que codifica una secuencia senal puede unirse operativamente en una vector de expresion a una proteina de interes, tal como una proteina que no se secreta ordinariamente o de cualquier otra manera es dificil de aislar. La secuencia senal dirige la secrecion de la proteina, tal como de un huesped eucariota en el que el vector de expresion se transforma, y la secuencia senal se escinde posteriormente o simultaneamente. La proteina puede entonces purificarse facilmente a partir del medio extracelular mediante los metodos reconocidos en la tecnica.

Alternativamente, la secuencia senal puede unirse a la proteina 14-3-3 nativa o citrulinada, fragmento, o fusion de esta, mediante el uso de una secuencia que facilita la purificacion, tal como con un dominio GST.

Anticuerpos a la proteina 14-3-3 citrulinada y fragmentos de esta

En otras modalidades, la invencion proporciona anticuerpos, es decir, anticuerpos intactos y fragmentos de union a antigenos de estos, que se unen especificamente a una proteina 14-3-3 eta citrulinada de la invencion o fragmento de esta, preferentemente una proteina 14-3-3 eta de mamifero (p. ej., ser humano), que puede ser util para diagnosticar, controlar y/o tratar la RA.

Las moleculas de anticuerpos a la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmentos citrulinados de estas, pueden producirse mediante metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante la generation de hibridomas de acuerdo con los metodos conocidos. Los hibridomas formados de esta manera se tamizan despues mediante el uso de metodos estandar, tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), para identificar uno o mas hibridomas que producen un anticuerpo que se une especificamente a los polipeptidos de la presente invencion. Por ejemplo, una proteina 14-3-3 citrulinada o un fragmento citrulinado de esta de la invencion puede usarse, ademas, para inmunizar huespedes no humanos, p. ej., burro, carnero, oveja, cobaya, hamster, conejo, rata y raton, para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan con la proteina 14-3-3 citrulinada o un fragmento citrulinado de esta pero no con la proteina 14-3-3 nativa o fragmento nativo de esta. Los inmunogenos peptidicos pueden contener, ademas, un residuo de cisteina en el carboxilo terminal, y pueden conjugarse a un hapteno tal como hemocianina de lapa (KLH). Pueden generarse inmunogenos peptidicos adicionales mediante el reemplazo de residuos de tirosina con residuos de tirosina sulfatados. Los metodos para sintetizar tales peptidos se conocen bien en la tecnica. Un polipeptido en toda su extension de la presente invencion puede usarse como el inmunogeno, o,

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alternativamente, pueden usarse fragmentos peptidicos antigenicos de polipeptidos. Un peptido antigenico de un polipeptido de la presente invention comprende al menos 7 residuos continuos de aminoacidos y abarca un epitopo de manera que un anticuerpo presentado al peptido forma un complejo inmunologico espetifico. Preferentemente, el peptido antigenico comprende al menos 10 residuos de aminoacidos, mas preferentemente al menos 15 residuos de aminoacidos, aun mas preferentemente al menos 20 residuos de aminoacidos, y con mayor preferencia al menos 30 residuos de aminoacidos.

Los anticuerpos monoclonales pueden generarse mediante otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica de la tecnologia de ADN recombinante. Como una alternativa para preparar hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, puede identificarse y aislarse un anticuerpo monoclonal de la presente invencion mediante el tamizaje de una biblioteca de inmunoglobulinas combinatorias recombinantes (p. ej., una biblioteca de anticuerpos de presentation en fago) con un polipeptido relacionado con la presente invencion (p. ej., proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento citrulinado de esta) para de esta manera aislar los miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen a los polipeptidos relacionados con la presente invencion (p. ej., proteina 14-3-3 citrulinada o un fragmento citrulinado de esta). Las tecnicas y estuches comercialmente disponibles para generar y tamizar bibliotecas de presentacion en fago son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Ademas, los ejemplos de metodos y reactivos particularmente adecuados para el uso en la generation y el tamizaje de bibliotecas de presentacion en fago pueden encontrarse en la literatura. Por ejemplo, el metodo de "presentacion de anticuerpos combinatorios" se conoce bien y se desarrollo para identificar y aislar fragmentos de anticuerpos que tienen una especificidad particular al antigeno, y puede utilizarse para producir anticuerpos monoclonales. Despues de inmunizar un animal con un inmunogeno como se describio anteriormente, se clona el repertorio de anticuerpos del conjunto resultante de celulas B. Los metodos se conocen, generalmente, para obtener la secuencia de ADN de las regiones variables de una variada poblacion de moleculas de inmunoglobulinas mediante el uso de una mezcla de iniciadores de oligomeros y PCR. Por ejemplo, pueden usarse los iniciadores de oligonucleotidos mixtos que corresponden a las secuencias lider 5' (peptido senal) y/o a las secuencias del marco de lectura 1 (FR1), asi como tambien los iniciadores para una region constante 3' conservada, para la amplification por PCR de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un numero de anticuerpos murinos; una estrategia similar se ha usado tambien para amplificar las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras humanas de anticuerpos humanos.

Los sueros y anticuerpos policlonales pueden producirse mediante la inmunizacion de un sujeto adecuado con un polipeptido de la presente invencion. El titulo de anticuerpos del sujeto inmunizado puede controlarse en el tiempo mediante tecnicas estandar, tales como ELISA mediante el uso de proteina inmovilizada. Si se desea, las moleculas de anticuerpo dirigidas contra un polipeptido de la presente invencion pueden aislarse del sujeto o medios de cultivo y purificarse adicionalmente mediante tecnicas bien conocidas, tales como cromatografia por proteina A, para obtener una fraction de IgG.

Pueden producirse fragmentos de anticuerpos a los polipeptidos de la presente invencion mediante la escision de los anticuerpos de acuerdo con los metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab').sub.2 inmunologicamente activos pueden generarse mediante el tratamiento de los anticuerpos con una enzima tal como pepsina.

Ademas, pueden producirse anticuerpos quimericos, humanizados, y de cadena unica a los polipeptidos de la presente invencion, que comprenden ambas porciones humana y no humana, mediante el uso de tecnicas estandar de ADN recombinante y/o una biblioteca de inmunoglobulinas combinatorias recombinantes. Estos anticuerpos humanizados pueden producirse tambien mediante el uso de ratones transgenicos que no son capaces de expresar genes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas endogenas, pero que pueden expresar genes de las cadenas pesada y ligera humanas. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos monoclonales (mAb) humanos dirigidos contra, p. ej., una proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta, mediante el uso de ratones transgenicos que portan los genes de inmunoglobulina humana en vez de los genes de inmunoglobulina murina. Los esplenocitos de estos ratones transgenicos inmunizados con el antigeno de interes pueden usarse despues para producir hibridomas que secreten mAb humanos con afinidades especificas para epitopos de una proteina humana.

Los anticuerpos quimericos, que incluyen cadenas de inmunoglobulinas quimericas, pueden producirse mediante tecnicas de ADN recombinante conocidas en la tecnica. Por ejemplo, un gen que codifica la region constante Fc de una molecula de un anticuerpo monoclonal murino (o de otras especies) se digiere con enzimas de restriccion para eliminar la region que codifica la Fc murina, y se sustituye la portion equivalente de un gen que codifica una region constante Fc humana.

Un anticuerpo o una cadena de inmunoglobulina pueden humanizarse mediante metodos conocidos en la tecnica. Los anticuerpos humanizados, que incluyen las cadenas de inmunoglobulinas humanizadas, pueden generarse mediante el reemplazo de secuencias de la region variable Fv que no estan implicadas directamente en la union al antigeno con secuencias equivalentes de las regiones variables Fv humanas. Los metodos generales para generar anticuerpos humanizados se proporcionan por Morrison (1985) Science 229: 1202-07; Oi y otros (1986) BioTechniques 4:214; Queen y otros, patente de los Estados Unidos nums. 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762. Estos metodos incluyen aislar, manipular, y

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expresar las secuencias de acidos nucleicos que codifican todo o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulinas de al menos una de una cadena pesada o ligera. Las fuentes de tales secuencias de acidos nucleicos son bien conocidas por los expertos en la tecnica y, por ejemplo, pueden obtenerse a partir de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un objetivo predeterminado. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o fragmento de este, puede clonarse despues en un vector de expresion apropiado.

Las moleculas de anticuerpos o inmunoglobulinas humanizadas o injertadas con CDR pueden producirse mediante el injerto de CDR o sustitucion de CDR, en donde pueden reemplazarse uno, dos, o todos los CDR de una cadena de inmunoglobulina. Ver, p. ej., la patente de los Estados Unidos num. 5,225,539; Jones y otros (1986) Nature 321 :552- 25; Verhoeyan y otros (1988) Science 239: 1534; Beidler y otros (1988)J. Immunol. 141 :4053-60; Winter, la patente de los Estados Unidos num. 5,225,539. Winter describe un metodo de injerto de CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invention (solicitud de patente del Reino Unido GB 2188638 A;Winter, la patente de los Estados Unidos num. 5,225,539). Todas las CDR de un anticuerpo humano particular puede reemplazarse con al menos una porcion de una CDR no humana, o solo alguna de las CDR pueden reemplazarse con las CDR no humanas. Solo es necesario reemplazar el numero de las CDR requeridas para la union del anticuerpo humanizado a un antigeno predeterminado.

Los anticuerpos humanos pueden producirse, ademas, mediante el uso de animales no humanos transgenicos que se modifican para producir anticuerpos completamente humanos en lugar de los anticuerpos endogenos del animal en respuesta al desafio por un antigeno. Ver, p. ej., publication PCT WO 94/02602. Los genes endogenos que codifican las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas en el huesped no humano han sido incapacitados, y los loci activos que codifican las inmunoglobulinas de cadenas pesada y ligera humanas se insertan en el genoma del huesped. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, mediante el uso de cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humanos requeridos. Un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas se obtiene entonces como progenie mediante el cruce de animales transgenicos intermedios que contienen menos que el complemento completo de las modificaciones. La modalidad preferida de un animal no humano tal es un raton, y se denomina el XENOMOUSE™ como se describe en las publicaciones PCT WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce celulas B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente a partir del animal despues de la inmunizacion con un inmunogeno de interes, como, por ejemplo, una preparation de un anticuerpo policlonal, o alternativamente a partir de celulas B inmortalizadas derivadas del animal, tales como hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales. Ademas, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse adicionalmente para obtener analogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moleculas Fv de cadena unica.

Los anticuerpos monoclonales, quimericos y humanizados que se han modificado mediante, p. ej., deletion, adicion, o sustitucion de otras porciones del anticuerpo, p. ej., la region constante, se encuentran dentro del alcance de la invencion. Como ejemplos no limitantes, un anticuerpo puede modificarse mediante la delecion de la region constante, mediante el reemplazo de la region constante con otra region constante, p. ej., una region constante destinada a aumentar la vida media, la estabilidad, o la afinidad del anticuerpo, o una region constante de otras especies o clases de anticuerpos, y mediante la modification de uno o mas aminoacidos en la region constante para alterar, por ejemplo, el numero de sitios de glicosilacion, la funcion celular efectora, la union al receptor de Fc (FcR), la fijacion del complemento, etcetera.

Los metodos para alterar una region constante de anticuerpos se conocen en la tecnica. Los anticuerpos con funcion alterada, p. ej., afinidad alterada para un ligando efector, tal como FcR en una celula, o el componente CI del complemento, pueden producirse mediante el reemplazo de al menos un residuo de aminoacido en la portion constante del anticuerpo con un residuo diferente (ver, p. ej., EP 388,151 A1, la patente de los Estados Unidos num. 5,624,821 y la patente de los Estados Unidos num. 5,648,260. Tipos similares de alteraciones a la inmunoglobulina murina (o de otras especies) pueden aplicarse para reducir o eliminar estas funciones, y se conocen en la tecnica.

Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una region Fc de un anticuerpo (p. ej., una IgG, tal como una IgG humana) para un FcR (p. ej., R1 gamma de Fc), o para la union a Clq mediante el reemplazo del(de los) residuo(s) con un(os) residuo(s) que tiene(n) una funcionalidad apropiada en su cadena lateral, o mediante la introduction de un grupo funcional cargado, tal como glutamato o aspartato, o un residuo aromatico no polar tal como fenilalanina, tirosina, triptofano o alanina (ver, p. ej., la patente de los Estados Unidos num. 5,624,821).

Metodos diagnosticos, pronosticos y terapeuticos, y control del tratamiento

La invencion como se describe en la presente description proporciona metodos para diagnosticar una afeccion artritica que implica autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada. La presencia o ausencia de una artritis reumatoide, o pronostico del paciente, puede determinarse mediante (a) poner en contacto una muestra biologica obtenida a partir de un

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sujeto mamifero con al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta; (b) detectar en la muestra el nivel de autoanticuerpos que se unen especficamente a la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta; y (c) comparar el nivel en tales anticuerpos con un control apropiado, p. ej., el nivel de proteina 14-3-3 nativa o no citrulinada.

Los metodos comprenden usar al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta para detectar autoanticuerpos contra la proteina. Existen una variedad de formatos de ensayos conocidos por los expertos en la tecnica para el uso de una proteina para detectar anticuerpos en una muestra. Ver, p. ej.,Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Como ejemplos no limitantes, la detection de autoanticuerpos contra 14-3-3 citrulinada puede realizarse mediante el uso de metodos o ensayos bien conocidos, p. ej. inmunoprecipitacion, ELISA, analisis por membrana de Western, inmunohistoquimica, inmunofluorescencia, inmunoensayos tipo "sandwich", ensayos inmunoradiometrico, reacciones de precipitation por difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos in situ, reacciones de precipitation, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion del complemento, ensayos con proteina A, ensayos de inmunoelectroforesis, analisis de clasificacion de celulas activadas porfluorescencia, un test en tira, una prueba en punto de cuidado, y similares. El experto en la tecnica reconocera que estos metodos pueden usarse, ademas, para medir el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, proteinas 14-3-3 citrulinadas en la muestra biologica.

En algunas modalidades, se utiliza un ensayo de deteccion automatizado. Los metodos para la automatization de inmunoensayos incluyen los descritos en las patentes de los Estados Unidos nums. 5,885,530,4,981,785,6, 159,750, y 5,358,691. En algunas modalidades, tambien se automatiza el analisis y la presentation de los resultados. Por ejemplo, en algunas modalidades, se utiliza el programa informatico que genera un pronostico basado en la presencia o ausencia de una serie de proteinas que corresponden a afecciones artriticas, que incluye las proteinas 14-3-3 citrulinadas.

En una modalidad, el ensayo implica el uso de al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o un fragmento de esta inmovilizada sobre un soporte solido para unirse a autoanticuerpos de captura que se unen especificamente a la(s) proteina(s) 14-3-3 citrulinada(s) del resto de la muestra. Los autoanticuerpos unidos pueden detectarse despues mediante el uso de un reactivo de deteccion que contiene un grupo reportero y se une especificamente al complejo anticuerpo/proteina. Tales reactivos de deteccion pueden comprender, por ejemplo, un agente de union que se une especificamente al autoanticuerpo tal como un anticuerpo anti-humano.

El soporte solido puede ser cualquier material conocido por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el soporte solido puede ser un pocillo de prueba en una placa de microtitulacion o una nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, latex o un material plastico tal como poliestireno o polivinilcloruro. El soporte puede ser, ademas, una particula magnetica o un sensor de fibra optica, tal como los descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos num. 5,359,681. La proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta puede inmovilizarse en el soporte solido mediante el uso de una variedad de tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, que se describen ampliamente en la patente y la literatura cientifica. En el contexto de la presente invention, el termino "inmovilizacion" se refiere tanto a la asociacion no covalente, tal como adsorcion como a la union covalente (que puede ser un enlace directo entre el anticuerpo y los grupos funcionales en el soporte o puede ser un enlace a traves de un agente de entrecruzamiento). Se prefiere la inmovilizacion por adsorcion a un pocillo en una placa de microtitulacion o a una membrana. En tales casos, la adsorcion puede lograrse mediante el contacto del anticuerpo, en un amortiguador adecuado, con el soporte solido durante una cantidad adecuada de tiempo. El tiempo de contacto varia con la temperatura, pero se encuentra, tipicamente, entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 dia. En una modalidad, se usa una placa de microtitulacion revestida con estreptavidina junto con una proteina 14-3-3 citrulinadabiotinilada o fragmento de esta.

La union covalente de la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta a un soporte solido puede lograrse, generalmente, mediante una primera reaction del soporte con un reactivo bifuncional que reaccionara tanto con el soporte y con la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta. El autoanticuerpo de captura puede detectarse despues mediante el uso de la tecnica tipo "sandwich" cuando el ligando marcado para el autoanticuerpo se expone a la fase solida lavada. Alternativamente, los formatos competitivos se basan en la introduction previa de un anticuerpo marcado a la muestra de manera que las formas marcadas y no marcadas compiten por la union a la fase solida. Tales tecnicas de ensayo se conocen bien y se describen bien tanto en la patente como en la literatura cientifica. Ver, p. ej., las patentes de los Estados Unidos nums.

3,791,932; 3,817,837; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; y 4,098,876. Los metodos de ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) se describen con detalle en las patentes de los Estados Unidos nums. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,879,262; y 4,034,074. Los ensayos ELISA detectan muy bajos titulos de autoanticuerpos.

Los autoanticuerpos pueden detectarse tambien mediante radioinmunoensayo en fase solida (RIA). La fase solida se expone a la muestra de suero en presencia de anticuerpos marcados radioactivamente que compiten por la union al ligando inmovilizado. En este ensayo, la cantidad de radiomarcador unido a la fase solida se relaciona inversamente con la cantidad

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de autoanticuerpos presentes inicialmente en la muestra de suero. Despues de la separation de la fase solida, el radiomarcador unido de forma no especifica se elimina mediante lavado, y se determina la cantidad de radiomarcador unido a la fase solida. La cantidad de radiomarcador unido se encuentra, a su vez, relacionado con la cantidad de autoanticuerpos presentes inicialmente en la muestra.

En una modalidad, el ensayo se realiza en un formato de prueba en flujo a traves o en tiras, en donde la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta se inmoviliza en una membrana, tal como nitrocelulosa. En la prueba en flujo a traves, los autoanticuerpos a las proteinas 14-3-3 citrulinadas dentro de la muestra se une a la proteina 14-3-3 citrulinada inmovilizada o fragmento de esta cuando la muestra se pone en contacto con la membrana. Un segundo agente de union, marcado se une entonces al complejo inmunologico cuando una solution que contiene el segundo agente de union se pone en contacto con la membrana. La detection del segundo agente de union puede realizarse entonces como se describio anteriormente. En el formato de prueba en tiras, un extremo de la membrana en la que se encuentra unida la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta se sumerge en una solucion que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana hacia la region que contiene el segundo agente de union, p. ej., a los autoanticuerpos, y al area de la proteina 14-3-3 citrulinada inmovilizada o fragmento de esta. La concentration del segundo agente de union en el area de la proteina 14-3-3 citrulinada inmovilizada o fragmento de esta indica la presencia de una afeccion artritica, o el pronostico del paciente, etcetera. Tipicamente, la concentracion del segundo agente de union en este sitio genera un patron, tal como una linea, que puede leerse visualmente. La ausencia de tal patron indica un resultado negativo. En general, la cantidad de agente de union inmovilizado sobre la membrana se selecciona para generar un patron visualmente discernible cuando la muestra biologica contiene un nivel del autoanticuerpo que seria suficiente para generar una senal positiva en el ensayo, en el formato discutido anteriormente. Los agentes de union preferidos para el uso en tales ensayos son las proteinas 14-3-3 citrulinadas y fragmentos de estas. Tales pruebas pueden realizarse, tipicamente, con una cantidad muy pequena de muestra biologica y en el punto de cuidado, que pueden ser, ademas, cuantificables.

Ademas de detectar la presencia de autoanticuerpos en una muestra, pueden usarse muchos metodos para medir cuantitativamente los niveles de los autoanticuerpos. En algunos metodos, el antigeno reacciona con el autoanticuerpo en una fase liquida, y los autoanticuerpos se miden cuantitativamente mediante una tecnica de inmunoprecipitacion. Por ejemplo, una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta (es decir, isomero en toda su extension o fragmentos antigenicos) puede marcarse detectablemente (p. ej., con un isotopo o una enzima). Los polipeptidos pueden marcarse durante la sintesis (p. ej., mediante la adicion de 35S-metionina a un sistema de traduction in vitro o sistema de expresion celular) o despues de la sintesis. El antigeno detectable se anade directamente a una muestra biologica liquida (p. ej., un suero) para formar complejos inmunologicos. Los complejos inmunologicos pueden precipitarse con polietilenglicol. Los complejos inmunologicos pueden aislarse tambien con un anticuerpo secundario (p. ej., inmunoglobulina anti-humana de carnero) u otro tipo de moleculas de union (p. ej., proteina A o proteina G) que se une a un soporte solido (p. ej., perlas de agarosa o sefarosa). Los inmunoprecipitados se lavan varias veces despues de separarse de la muestra liquida y se examinan para la intensidad del marcador detectable (p. ej., radioactividad). Cualquier autoanticuerpo presente en la muestra puede, por lo tanto, detectarse y cuantificarse. Opcionalmente, un polipeptido no marcado puede anadirse, ademas, para competir con el polipeptido marcado por la union a autoanticuerpos.

Los metodos de diagnostico de la presente invention se dirigen, ademas, para detectar en un sujeto complejos inmunologicos circulantes formados entre las proteinas 14-3-3 citrulinadas y un autoanticuerpo. Los metodos discutidos anteriormente pueden modificarse facilmente para la deteccion de tales complejos inmunologicos. Por ejemplo, una molecula de union inmovilizada (p. ej., proteina A o proteina G unida a una perla) puede anadirse a una muestra biologica liquida. Despues de la separacion de la fase liquida, los complejos inmunologicos capturados por las moleculas de union pueden analizarse con SDS-PAGE y probarse con varios anticuerpos contra las proteinas 14-3-3 citrulinadas. Los antigenos capturados pueden someterse tambien a analisis directo de secuencia de aminoacidos. Por lo tanto, puede revelarse la identidad de los complejos inmunologicos. Un numero de ensayos se practican rutinariamente para detectar complejos inmunologicos circulantes en un sujeto, p. ej., como se describe en Tomimori-Yamashita y otros, LeprRev, 70(3):261-71, 1999 (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima basado en anticuerpos); Krapf y otros, J ClinLabImmunol, 21(4): 183-7, 1986 (ensayo inmunoabsorbente ligado a fluorescencia); Kazeem y otros, East AfirMed J, 67(6):396-403, 1990 (inmunonefelometria laser); y Rodrick y otros, J ClinLabImmunol, 7(3): 193-8, 1982 (ensayo de filtro de fibra de vidrio con proteina A, PA-GFF, y ensayo de solubilization en polietilenglicol).

Para mejorar la sensibilidad clinica, pueden evaluarse multiples marcadores dentro de una muestra dada. En particular, pueden analizarse uno o mas de otros marcadores de la artritis, o indicadores pronosticos, etcetera., en conjunto con autoanticuerpos a proteina 14-3-3 citrulinada. Estos otros marcadores pueden ser proteinas o acidos nucleicos. En una modalidad preferida, uno o mas de los otros marcadores son proteinas MMP o acidos nucleicos u otros factores que se usan comunmente como indicadores de artritis, p. ej., anti-CCP, anti-RF, CRP, SAA, IL-6, SIOO, osteopontina, RF, MMP-1, MMP- 3, acido hialuronico, sCD14, marcadores de la angiogenesis y productos del metabolismo oseo, cartilaginoso o sinovial (p.

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ej. ,CTX-1 y CTX - II), etcetera. Los metodos para aislar y evaluar acidos nucleicos basado en las secuencias de referencia se conocen bien en la tecnica, ya que son metodos para detectar proteinas de interes dentro de una muestra de paciente.

Un experto en la tecnica reconocera que cada uno de estos ensayos bien conocidos puede emplearse para detectar complejos inmunologicos circulantes en una muestra biologica en los metodos de la presente invencion. De manera similar, cada uno de estos ensayos bien conocidos pueden emplearse mediante el uso de anticuerpos a la proteina 14-3-3 citrulinada (y fragmentos de esta) descritos en esta invencion para controlar el estado de la citrulinacion de una proteina 143-3 en una muestra biologica, p. ej., para determinar cuanta cantidad de la proteina 14-3-3 se citrulina y /o cuales y cuantos sitios de la proteina 14-3-3 se citrulinan, como parte de un procedimiento de pruebas clinicas, p. ej., en ensayos diagnosticos, pronosticos y teranosticos como se describe en la presente descripcion. Un experto en la tecnica reconocera facilmente como adaptar cada uno de los formatos de ensayo, ensayos diagnosticos, pronosticos y teranosticos, y estuches para usar los anticuerpos a la proteina 14-3-3 citrulinada como se describe en la presente descripcion para determinar el estado de la citrulinacion de la proteina 14-3-3 en una muestra biologica.

Los ensayos de combination pueden hacerse simultaneamente o secuencialmente. La selection de marcadores puede basarse en los experimentos de rutina para determinar las combinaciones que resultan en una sensibilidad optima.

La invencion proporciona metodos para diagnosticar y/o pronosticar afecciones artriticas. En general, las afecciones artriticas pueden detectarse en un paciente basado en la presencia de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 citrulinada en el liquido sinovial, articulation sinovial, sangre, plasma, o suero de un paciente. En otras palabras, los autoanticuerpos a la proteina 14-3-3 citrulinada pueden usarse como un marcador para indicar afecciones artriticas.

En una modalidad preferida, la invencion proporciona metodos para diagnosticar artritis reumatoide. En general, la artritis reumatoide puede detectarse en un paciente basado en la presencia de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 citrulinada en el liquido sinovial, articulacion sinovial, sangre, plasma, o suero de un paciente. En otras palabras, los autoanticuerpos a proteina 14-3-3 citrulinada pueden usarse como un marcador para indicar artritis reumatoide. En una modalidad particularmente preferida, la proteina 14-3-3 citrulinada es 14-3-3 eta.

Ademas, la presencia de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 citrulinada, o los niveles relativos de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 citrulinada, como se determina mediante el uso de una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta puede ser un indicador pronostico de artritis reumatoide en etapa temprana, antes de su progreso a una forma debilitante. Una ventaja del pronostico o diagnostico temprano es la implementation mas temprana de un regimen de tratamiento.

Para determinar la presencia o ausencia de artritis reumatoide en un sujeto, el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, proteina 14-3-3 citrulinada en una muestra biologica del sujeto puede compararse, generalmente, a un nivel de autoanticuerpos/complejos inmunologicos que corresponden a un control normal. En una modalidad preferida, el control normal se establece a partir del nivel medio promedio de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, la proteina 14-3-3 citrulinada en muestras de pacientes sin artritis reumatoide. En una modalidad alternativa, el valor control normal puede determinarse mediante el uso de una Curva Operativa del Receptor, ver por ejemplo, el metodo de Sackett y otros, ClinicalEpidemiology: A Basic ScienceforClinical Medicine, Little Brown y Co., 1985, paginas 106-7. Brevemente, en esta modalidad, el valor control puede determinarse a partir de un grafico de pares de tasas de verdaderos positivos (es decir, sensibilidad) y tasas de falsos positivos (especificidad del 100 %) que corresponden a cada valor de corte posible para el resultado de la prueba de diagnostico. El valor control en el grafico que es el mas cercano a la esquina superior izquierda (es decir, el valor que encierra el area mas grande) proporciona el valor mas exacto, y una muestra que genera una serial que es superior al valor determinado por este metodo puede considerarse positiva. Alternativamente, el valor control puede desplazarse hacia la izquierda a lo largo del grafico, para minimizar la tasa de falsos positivos, o hacia la derecha, para minimizar la tasa de falsos negativos. En general, una muestra que genera una serial que es superior al valor control determinado por este metodo se considera positiva para la artritis.

En una modalidad, la invencion proporciona metodos para diferenciar entre subtipos de artritis. En una modalidad, los metodos implican determinar el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 143-3 citrulinada o fragmento de esta. En una modalidad preferida, el nivel de autoanticuerpos/complejos inmunologicos a la proteina 14-3-3 citrulinada en el paciente se compara con el de muestras de sujetos cuyo subtipo de artritis se conoce y o se establece previamente.

En una modalidad, la invencion proporciona metodos para determinar el potencial de respuesta de un paciente al tratamiento dirigido contra la artritis reumatoide. En una modalidad, los metodos implican determinar el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta en una muestra de paciente. En una modalidad preferida, el nivel de autoanticuerpos a/complejos inmunologicos con la proteina 14-3-3 citrulinada en la muestra del paciente es en comparacion con el de las muestras de los sujetos cuya

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capacidad para responder al tratamiento se conoce. Un nivel relativamente alto de autoanticuerpos a/complejos inmunologicos con protema 14-3-3 citrulinada en una primera muestra de paciente en comparacion con una muestra de un sujeto no inflamatorio y/o una muestra de otro paciente inflamatorio puede indicar que el primer paciente es un candidato preferido para un tratamiento bien conocido, p. ej., terapia con farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad (DMARD) tales como anti-TNF, metotrexato, minociclina, hidroxicloroquina, sulfasalazina, azatriprina, anti-IL-1, anti-IL-6r y similares. Por el contrario, un nivel relativamente bajo de autoanticuerpos/complejos inmunologicos a proteina 14-3-3 citrulinada en una primera muestra de paciente en comparacion con una muestra de otro paciente inflamatorio puede indicar que el primer paciente no es un candidato preferido para un tratamiento bien conocido, especialmente si el nivel se encuentra mas proximo al de una muestra de un sujeto no inflamatorio.

Los regimenes de tratamiento para diversos tipos de artritis son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un paciente diagnosticado con artritis reumatoide puede prescribirse con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) inicialmente, para aliviar el malestar y reducir la inflamacion. Otros regimenes de tratamiento pueden incluir, por ejemplo, medicamentos antiinflamatorios esteroideos (SAID, por ejemplo Cortisol, prednisona), inhibidores especificos de la ciclooxigenasa 2 (CSI), glucocorticoides, y/o farmacos antirreumaticos estandar modificadores de la enfermedad (DMARD) tales como, p. ej., agentes neutralizantes anti-TNF-alfa (p. ej., ciclosporina, azatioprina, ciclofosfamida), antibioticos, antimalaricos y farmacos citotoxicos (p. ej., metotrexato, sulfasalazina, leflunomida). Los regimenes de tratamiento tambien pueden incluir ventajosamente aquellos que se dirigen directamente a las proteinas 14-3-3 citrulinadas, ver, p. ej., PCT/CA2008/002154. Los detalles de la dosificacion o ejemplos de farmacos particulares seran conocidos por los expertos en la tecnica, y pueden encontrarse en, por ejemplo Harrison'sPrinciples of Internal Medicine 15ta edicion. bRaUNWALD y otros ediciones. McGraw-Hill o "ThePharmacologicalbasis of therapeutics", 10ma edicion. 5 HARDMAN HG., LIMBIRD LE. editores. McGraw-Hill, New York, y en "ClinicalOncology", 3ra edicion. Churchill Livingstone/ ElsevierPress, 2004. ABELOFF, MD. editor.

En una modalidad, la invention proporciona metodos para controlar el tratamiento de la artritis reumatoide. En una modalidad, los metodos implican determinar el nivel de autoanticuerpos contra, o complejos inmunologicos con, al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta en muestras de pacientes y controlar el nivel de autoanticuerpos a/complejos inmunologicos con la proteina 14-3-3 citrulinada en un paciente que experimenta un tratamiento.

La presencia de niveles relativos de autoanticuerpos a/complejos inmunologicos con la proteina 14-3-3 citrulinada puede correlacionar con la presencia o niveles relativos de otras proteinas que se conoce que se asocian con afecciones artriticas en pacientes. Los ejemplos no limitantes de proteinas bien conocidas por asociarse con una afeccion artritica incluyen citocinas inflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral, y metaloproteinasas de matriz (MMP), tales como MMP-1 o MMP-3, etcetera. Se han identificado al menos 25 MMP diferentes. La detection de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 citrulinada en conjunto con la deteccion de al menos una citocina inflamatoria y/o MMP en una muestra de paciente puede usarse para diagnosticar artritis. Ademas, la presencia o niveles relativos de autoanticuerpos/complejos inmunologicos a proteina 14-3-3 en conjunto con al menos una MMP y/o al menos una citocina inflamatoria en una muestra de paciente puede usarse como un indicador pronostico de artritis en etapa temprana, antes de que la artritis progrese a una forma debilitante.

La invencion proporciona estuches para evaluar una afeccion artritica, y en particular, la artritis reumatoide. Tales estuches comprenden, tipicamente, dos o mas componentes necesarios para realizar un ensayo diagnostico, pronostico y/o teranostico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes, instrucciones y/o equipamiento. Por ejemplo, un recipiente dentro de un estuche puede contener una o mas proteina(s) 14-3-3 citrulinada(s) o fragmento(s) de esta(s). Tales estuches tambien pueden contener un reactivo de deteccion como se describio anteriormente que contiene un grupo reportero adecuado para la deteccion directa o indirecta de la union del anticuerpo.

En consecuencia, la invencion proporciona estuches para detectar la presencia de autoanticuerpos a/complejos inmunologicos con proteina 14-3-3 citrulinada y opcionalmente otros marcadores, p. ej., las MMP, en una muestra de paciente, el estuche que es util para proporcionar un diagnostico o pronostico resulta adecuado para diagnosticar o diferenciar varias afecciones artriticas, y mas preferentemente, artritis reumatoide. Las indicaciones adicionales en las que puede estar implicada la presencia de proteinas 14-3-3 citrulinadas y/o autoanticuerpos tambien incluyen, por ejemplo, trastornos cardiovasculares y/o neurodegenerativos. En un estuche de la invencion, la proteina 14-3-3 eta citrulinada o fragmento de esta opcionalmente puede marcarse detectablemente, p. ej., con un marcador radioactivo, un marcador luminiscente, un marcador fluorescente, una enzima, etcetera. Los metodos para marcar detectablemente proteinas se conocen bien en la tecnica. Tal estuche puede incluir, ademas, reactivos de deteccion especificos para otros marcadores de artritis, por ejemplo, anti-CCP, anti-RF, CrP, SAA, IL-6, S1OO, osteopontina, RF, MMP-I, MMP-3, acido hialuronico, sCD14, marcadores de angiogenesis y productos del metabolismo oseo, cartilaginoso o sinovial (p. ej., CTX -1 y CTX - II), etcetera. El estuche puede incluir, ademas, reactivos secundarios necesarios para la deteccion de autoanticuerpos a proteina 14-3-3 citrulinada inmunologicamente, tales como anticuerpos secundarios marcados (p. ej., anticuerpos anti-humanos), reactivos

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cromogenicos o fluorogenicos, agentes de polimerizacion y similares. Las instrucciones para usar el estuche con propositos de diagnostico o de pronostico, que incluyen estandares de comparacion apropiados para cuantificar y/o evaluar el nivel de tales autoanticuerpos en el contexto de un estado de enfermedad particular, tambien pueden proporcionarse ventajosamente en forma impresa y/o registradas en medios adecuados.

Ejemplos

A medida que la proteina 14-3-3r| se libera en el espacio sinovial en RA donde las enzimas PAD estan presentes, se investigo si la proteina 14-3-3r| es un objetivo de citrulinacion que puede usarse en el diagnostico de RA, y en caso afirmativo, si la proteina 14-3-3r| citrulinada o fragmentos podrian usarse para identificar pacientes con RA negativos a anti- CCP. La identification de los sitios de citrulinacion en la proteina 14-3 -3r| implico un proceso de tres (3) etapas 1) prediction in silico, 2) determination in vitro y 3) validation o identificacion con muestras clinicas.

Ejemplo 1: Identificacion in silico de sitios de citrulinacion

Se identificaron porciones de arginina (R) que representan sitios de citrulinacion putativos basado en 1) la localization de la "R" en relation con la configuration de proteina 3d nativa; 2) la accesibilidad de "R" a la enzima PAD y 3) la secuencia que flanquea "R". Se identificaron cinco (5) sitios de citrulinacion putativos que corresponden a "R": 4, 12, 19, 61 y 227.

Ejemplo 2: Determinacion in vitro de sitios de citrulinacion

Se realizo la citrulinacion/n vitro mediante la que se coincubo la proteina 14-3-3 eta humana recombinante ya sea con PAD2 o con PAD4 humana recombinante ya que se ha informado que estas dos isoformas son las dos mas relevantes en la RA.

Brevemente, PAD2 (MQ16.201) y PAD4 (MQ16.203) se obtuvieron de ModiQuest Research. Las enzimas se diluyeron adicionalmente en 1O0 |jl de amortiguador PAD (Tris HCl 0.1 M, pH 7.4, CaCl2 10 mM con DTT 5 mM, PMSF 1 mM, 10 |jg/ml de aprotonina, 10 jg/ml de leupeptina y 10 jg/ml de pepstatina) lo que lleva las concentraciones primarias de PAD2 a 80 mU/jl y de PAD4 a 82.5 mU/jl.

Se incubaron diez (10) jg de la proteina 14-3-3 eta recombinante en toda su extension ya sea con PAD2 (8mU) como con PAD4 (8.2mU). La mezcla de reaction se ajusto a IOO|jI con amortiguador PAD y se incubo a 37 °C durante 2h. Despues de la incubation, la reaccion se termino mediante la adicion de 25 jl de amortiguador Lammelli 4X. Las proteinas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se corto la banda que corresponde a la proteina 14-3-3 eta. Las bandas cortadas se eluyeron del gel, se sometieron a tripsinizacion y despues se analizaron mediante el uso de Espectrometria de Masas por Transformada de Fourier para identificar sitios deiminados como fue descrito por otros autores. Los resultados rindieron cuatro sitios de citrulinacion putativos con PAD2 y 3 con PAD4 cuyos resultados se describen en la Tabla 4.

Tabla 4: Sitios de citrulinacion para la proteina 14-3-3r| como se determino in vitro

Sitio

Secuencia No PAD PAD2 PAD4

Position 4

mgdReqllq No Si Si

Position 19

qaeRyddma No Si Si

Posicion 42

dRnllsvayk No Si Si

Posicion 61

sswRvissie No Si No

Ejemplo 3: Detection de anticuerpos dirigidos a proteina 14-3-3 eta citrulinada mediante el uso de muestras clinicas

La citrulinacionin vitro se realizo como se describe en el Ejemplo 2, y se recubrieron placas de 96 pocillos ya sea con la forma citrulinada o con la no citrulinada de la proteina 14-3-3 eta recombinante. La respuesta del autoanticuerpo humano dirigido tanto a las formas nativas o citrulinadas de la proteina 14-3-3 eta en pacientes positivos y negativos a anti-CCP se cuantifico mediante el uso de un anticuerpo anti-humano. Para evaluar si estos nuevos autoanticuerpos son detectables en pacientes con RA negativos a anti-CCP y se expresan diferencialmente en comparacion con controles sanos, se midio la reactividad tanto para la proteina 14-3 -3 eta no citrulinada y citrulinada en 30 pacientes con RA negativos a anti-CCP y 30 controles sanos negativos a anti-CCP confirmados. Se evaluaron los niveles medios y medianos de autoanticuerpos expresados en unidades (U) y se usaron las pruebas t y las pruebas U de Mann-Whitney correspondientes para determinar diferencias dentro y entre grupos. Se genero el area bajo la curva ROC (AUC) para los estimados de la utilidad diagnostica y para determinar las tasas de verosimilitud (LR) de varios valores de corte de anti-14-3-3 eta citrulinada.

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La Figura 1 muestra que, en comparacion con la proteina 14-3-3 eta no citrulinada, se observo una reactividad superior a 25X a la proteina 14-3-3 eta citrulinada en 2 de los 3 pacientes con RA positivos a anti-CCP, lo que revela por primera vez la expresion de autoanticuerpos a la forma citrulinada de la proteina 14-3-3 eta en la RA. Dentro del grupo con RA negativo a anti-CCP, se observo una reactividad significativamente superior a la proteina 14-3-3 eta citrulinada en comparacion con la proteina 14-3-3 eta nativa (1943U frente a 395U, p=0.01). No se observaron diferencias significativas en la reactividad dentro del grupo sano. La Figura 2 muestra que la expresion de anticuerpos anti-proteina 14-3-3 eta citrulinada fue significativamente superior en pacientes con RA negativos a anti-CCP con medias (SD) y medianas (min-max) de 1943U (3045U) y 306U (68-8982U) en comparacion con 155U (122U) y 100U (45-564U) para controles sanos, p<0.002. La ROC (AUC) correspondiente para la expresion diferencial de anticuerpos anti-14-3-3 eta citrulinada en pacientes con RA negativos a anti-CCP en comparacion con controles sanos fue 0.79 (CI del 95 %: 0.68-0.91; p<0.0001). A un nivel de corte de 320U, la especificidad y la sensibilidad fueron del 90 % y del 50 % lo que proporciona un LR positivo de 5 que aumenta a 14 a 439U con una especificidad correspondiente del 97 % y sensibilidad del 47 %.

Sano N-58 Pacientes con RA CCP-ve N=30

media (SD)

155U (122U) 1943U (3045U)

mediana (min-max)

100U (45-564U) 306U (68.S982U)

AUC

0.79

CI del 95 %

0.68-0.91

Valor de p

<0.0001

Nivel de corte

439U

LR

14

Especificidad

97%

Sensibilidad

47%

Ejemplo 4: Identification de sitios de citrulinacion mediante el uso de muestras clinicas

La proteina 14-3-3 eta se inmunoprecipita a partir de muestras clinicas positivas para la proteina 14-3-3 eta y la proteina inmunoprecipitada se resuelve mediante SDS-PAGE y se corta la banda correspondiente a la proteina 14-3-3 eta. Las bandas cortadas se eluyen del gel, se tripsinizan y se analizan despues mediante Espectrometria de Masas por Transformada de Fourier para identificar sitios deiminados en la proteina.

Selection de sitios de citrulinacion clinicamente relevantes de la proteina 14-3-3 eta

Para identificar los sitios de citrulinacion mas relevantes de la proteina 14-3-3 eta, se usan peptidos que portan una portion arginilada o citrulinada para tamizar y seleccionar los sitios de citrulinacion mas relevantes en la proteina 14-3-3 eta que pueden usarse para distinguir tanto la forma no citrulinada de la proteina asi como tambien diferenciar entre los individuos sanos o los afectados con una artritis.

La comparacion de los niveles de expresion de la proteina 14-3-3 eta en muestras clinicas mediante el uso de dos enfoques distintos, medicion mediante MRM/LC-MS y ELISA, ilustra que las diferencias en la expresion pueden atribuirse a la citrulinacion ya que la deiminacion de arginina que rinde citrulina da lugar a una perdida de escision ya que la tripsina no escinde cuando la proteina se citrulina, ver la Tabla 5. Especificamente en las muestras 1 - 6 son detectables niveles altos de la proteina 14-3-3 eta mediante ELISA pero parecen tener niveles insignificantes cuando se miden mediante espectrometria de masas en comparacion con las muestras 7-12. Con espectrometria de masas las muestras se tripsinizan y se cuantifican los niveles de la proteina 14-3-3 eta mediante la medicion de una intensidad de pico como resultado de una masa peptidica especifica, cuyo peptido es "AV TEL EPLS ED" que se encuentra junto a Arg-42 que se ha descrito aqui como un sitio de citrulinacion. Los anticuerpos especificos a citrulinacion a Arg-42 se examinaran mediante ELISA en las muestras 1 -12 para verificar que Arg-42 es un sitio de citrulinacion clinicamente relevante.

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Tabla 5

ID de la muestra

Espectrometria de masas ELISA

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0 297.8

2

0 23.85

3

0 33.11

4

139 1078.1

5

0 65.85

6

0 18.7

7

5679 64.47

8

1283 29.07

9

9791 7.9

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14278 47.7

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1602 3.2

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2451 31.3

Ejemplo 5: Diagnostico, pronostico y/o control del tratamiento

Detection de autoanticuerpos a la proteina 14-3-3 eta citrulinada en una muestra clmica

Los datos presentados en la figura 1 demuestran que la deteccion de autoanticuerpos a la forma citrulinada de la proteina 14-3-3 eta en toda su extension es util en la identification de pacientes que son negativos a anti-CCP lo que complementa, por lo tanto, la prueba anti-CCP en el diagnostics de pacientes con RA seronegativos. La expresion diferencial en RA frente a individuos sanos presentada en la figura 2 demuestra que los autoanticuerpos anti-14-3-3 eta citrulinada son superiores en pacientes con RA y probablemente seran altamente especficos para la RA. Tambien se utilizaran fragmentos de 14-3-3 eta citrulinada, que abarcan cada uno de los diferentes sitios citrulinados para detectar autoanticuerpos para cada uno de los diferentes sitios. Tal deteccion de autoanticuerpos especficos de sitio es probable que sea como o mas especifica para RA que la proteina 14-3-3 eta citrulinada en toda su extension.

Determination del estado de citrulinacion de una proteina 14-3-3 en una muestra clinica

Si un paciente mide positivo para autoanticuerpos a la proteina 14-3-3 eta citrulinada, se evaluara el estado de citrulinacion de la proteina mediante el uso de anticuerpos monoclonales presentados contra la proteina 14-3-3 eta citrulinada en toda su extension o fragmentos citrulinados de esta para evaluar dos parametros:

1) ^Cuanto de la proteina se citrulina?

2) ^Que sitios en la proteina se citrulinan y/o cuantos sitios se citrulinan?

Los titulos de los autoanticuerpos contra proteina 14-3-3 eta citrulinada se examinaran por si mismos y en relation con los niveles de proteina serica 14-3-3 eta asi como tambien el estado de citrulinacion de la proteina. La tabla 5 a continuation define los posibles resultados.

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Tabla 5

niveles de autoanticuerpos anti- 14-3-3 eta citrulinada

niveles de proteina 14-3-3 eta Pronostico

Superior

Superior

Malo

Inferior Bueno

Inferior

Superior Malo

Inferior Bueno o la proteina 14-3-3 eta no es importante para el proceso de la enfermedad

Para la respuesta y control de la terapia, niveles altos de autoanticuerpos anti-14-3-3 eta citrulinada pueden implicar el uso de ciertas terapias sobre otras. Ademas, se espera que un % superior de la proteina que se citrulina correlacione con una carga de la enfermedad mas significativa. Tambien se espera que diferentes sitios de citrulinacion puedan impartir una actividad biologica diferente sobre la proteina y, por lo tanto, se asocien con diferentes resultados clinicos. Esta informacion puede usarse entonces para ayudar a determinar el tipo de terapia que seria mejor para un paciente en particular y para controlar la respuesta a la terapia.

Por ejemplo, titulos altos y/o un estado de citrulinacion alto serian utiles para el tratamiento mediante el uso de inhibidores de celulas B como rituximab o inhibidores que se dirigen directamente a las peptidilargininadeiminasa. Tambien puede ser util controlar los resultados mediante la medicion de los niveles antes y despues del tratamiento. Por ejemplo, si los niveles disminuyen, entonces el paciente puede estar recibiendo un beneficio del farmaco, es decir, responder a la terapia mientras que si los niveles permanecen inalterados o aumentan, entonces puede ser necesario aumentar la dosis terapeutica o puede ser necesario cambiar la clase de terapia.

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Listado de secuencias

<110>AugurexLifeSciences Corp.

Marotta, Anthony

<120> Antigenos derivados de la protema 14-3-3 citrulinada y usos de estos en el diagnostico de la artritis reumatoide

<130> 177073/PCT

<150> US61/550,046 <151> 2011-21-10

<160> 22

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (18)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

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   45

   50

   55

   60

   Reivindicaciones

   1. Una proteina 14-3-3 eta citrulinada aislada o un fragmento de esta que son reconocidos de manera especifica por autoanticuerpos anti-14-3-3 eta presentes en el suero de un paciente que padece de una afeccion artritica; en donde la proteina 14-3-3 eta o fragmento de esta comprenden un residuo de citrulina en una posicion seleccionada del grupo que consiste en la posicion 4, la posicion 12, la posicion 19, la posicion 42, la posicion 61, la posicion 86 y la posicion 227 de la sec. con num. de ident.: 5.
2. 2. La proteina de conformidad con la reivindicacion 1 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secs. con nums. de ident.: 16-22.
3. 3. La proteina de conformidad con la reivindicacion 1, en donde dicha afeccion artritica es artritis reumatoide.
4. 4. Una composicion que comprende al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3 unida a un soporte solido.
5. 5. Un estuche que comprende al menos una proteina 14-3-3 eta citrulinada de conformidad con la reivindicacion 1.
6. 6. Un metodo para diagnosticar una afeccion artritica en un sujeto que comprende poner en contacto una muestra biologica del sujeto con al menos una proteina 14-3-3 citrulinada o un fragmento citrulinado de esta en una condicion adecuada para la formacion de al menos un complejo inmunologico entre la proteina 14-3-3 citrulinada o un fragmento de esta y los autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta que pueden estar presentes en la muestra biologica; y detectar la presencia de los complejos inmunologicos entre la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta y los autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta, en donde dicha presencia de dichos complejos inmunologicos es indicativa de una afeccion artritica en dicho sujeto.
7. 7. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde dicha etapa de deteccion comprende ademas medir la cantidad de autoanticuerpos contra la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta.
8. 8. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde la proteina 14-3-3 citrulinada es 14-3-3 eta citrulinada.
9. 9. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde la proteina 14-3-3 citrulinada es un fragmento de 14-3-3 eta citrulinada.
10. 10. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta se marca de manera detectable con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un marcador radioactivo, un marcador luminiscente y un marcador fluorescente, y una enzima.
11. 11. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde la proteina 14-3-3 citrulinada o fragmento de esta se une a un soporte solido.
12. 12. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde los autoanticuerpos se detectan mediante un ensayo ELISA.
13. 13. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde dicha deteccion se produce mediante quimioluminiscencia.
14. 14. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde dicha afeccion artritica es artritis reumatoide.
15. 15. Un anticuerpo dirigido a la proteina 14-3-3 citrulinada de conformidad con la reivindicacion 1, en donde dicho

    anticuerpo se une selectivamente a una posicion citrulinada seleccionada del grupo que consiste en la posicion 4, la posicion 12, la posicion 19, la posicion 42, la posicion 61, la posicion 86 y la posicion 227 de la sec. con num. de ident.: 5.
16. 16. Un huesped no humano que produce un anticuerpo de conformidad con la reivindicacion 15.
17. 17. El huesped de conformidad con la reivindicacion 16, en donde el huesped es una linea celular de hibridoma.
18. 18. Un metodo para diagnosticar y/o pronosticar una afeccion artritica en un sujeto que comprende poner en contacto

    una muestra biologica del sujeto con al menos un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a una proteina 14-3-3

    humana citrulinada o un fragmento de esta en una condicion adecuada para la formacion de al menos un complejo inmunologico entre el anticuerpo y las proteinas 14-3-3 citrulinadas que pueden estar presentes en la muestra biologica; y detectar la presencia, el grado y/o la localizacion de al menos un residuo de citrulina dentro de dicha protema 14-3-3 citrulinada, en donde dicha presencia, grado y/o localizacion de dicho al menos un residuo de 5 citrulina es indicativo de una afeccion artritica en dicho sujeto o informativo de un pronostico para dicho sujeto.

    anti-cit-14-3-3

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    Sano

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    Figura 2