ES2633495T3 - Bacteria que pertenece al género Lactobacillus - Google Patents

Abstract

Lactobacillus pentosus TUA4337L depositada con el número de registro NITE BP-1479, caracterizada porque la cepa tiene capacidad de proliferación en el tracto intestinal

Description

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DESCRIPCION

Bacteria que pertenece al genero Lactobacillus Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una bacteria que pertenece al genero Lactobacillus. Mas especfficamente, la presente invencion se refiere a una Lactobacillus pentosus novedosa.

Tecnica anterior

Algunas bacterias del acido lactico y bifidobacterias tienen excelentes actividades fisiologicas tales como una actividad que regula el intestino y actividad inmunoestimulante, y se han usado en diversas aplicaciones dependiendo de las propiedades de las especies bacterianas. Entre ellas, recientemente se han desarrollado estudios sobre los efectos de la dieta tomando estas bacterias, y se han realizado muchos informes.

Por ejemplo, la publicacion de patente 1 notifica que la cepa de Lactobacillus rhamnosus ATCC53103 degrada un lfpido (triacilglicerol) que es causante de obesidad, bloqueando de ese modo su absorcion en el cuerpo. Ademas, se ha sabido que L. brevis KB290, que es un tipo de bacteria del acido lactico vegetal, llega a los intestinos en un estado vivo, mostrando de ese modo excelentes tasas de viabilidad intestinal y capacidad de supervivencia en el tracto intestinal (sin embargo, el numero de bacterias excretadas es menor que el numero de bacterias ingeridas) (vease la publicacion no de patente 1). Ademas, la publicacion no de patente 2 ha notificado que la cepa de Lactobacillus acidophilus L-92 se recoge de las heces en una cantidad del 93% del numero de bacterias ingeridas, de modo que la cepa tiene una excelente capacidad de supervivencia en el tracto intestinal, y la publicacion no de patente 3 ha notificado que se examina la capacidad de supervivencia de L. gasseri SBT2055 en el tracto intestinal, y se administran 100 g de una leche fermentada que contiene de 1 x 106 a 5 x 106 ufc/g de las bacterias, y como resultado, se detectan las bacterias en las heces como maximo a 1 x 105 ufc/g mas o menos.

Por otro lado, en cuanto a las bifidobacterias, se ha notificado que la cepa de Bifidobacterium animalis subespecie

lactis GCL2505 no solo tiene capacidad de supervivencia en el tracto intestinal en la que la cepa llega a los

intestinos en un estado vivo tras la ingesta oral, sino que tambien muestra una capacidad de proliferacion notable dentro del tracto intestinal (vease la publicacion de patente 2). La publicacion no de patente 4 ha notificado que cuando se administra B. animalis ssp. lactis DN-173 010 a adultos, se detecta el 20% mas o menos de la DN-173 010 en las deposiciones, en relacion con el numero de bacterias ingeridas.

Referencias de la tecnica relacionada

Publicaciones de patente

Publicacion de patente 1: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 2011-206057

Publicacion de patente 2: Patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 2011-172506

Publicaciones no de patente

Publicacion no de patente 1: “Physiological Function of Lactic Acid Bacteria for Human Health”, 31 de agosto de 2007, CMC Publishing CO., LTD., 160-162

Publicacion no de patente 2: Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria, 2001, 12, “Isolation and characterization of a Lactobacillus acidophilus strain L92 that can survive in in human gastrointestinal tract”, 28-35

Publicacion no de patente 3: Microbiol. Immunol., 2006, 50, “Monitoring and survival of Lactobacillus gasseri SBT2055 in the human intestinal tract.”, 867-870

Publicacion no de patente 4; J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2008,14, “Survival of Bifidobacterium animalis DN-173 010 in the faecal microbiota after administration in lyophilized form or in fermented product - a randomized study in healthy adults”, 128-136

Sumario de la invencion

Problemas a resolver por la invencion

Convencionalmente, se examinan diversos probioticos para determinar la capacidad de supervivencia en el tracto intestinal tal como se describio anteriormente. Sin embargo, en cuanto a las bacterias del acido lactico, solo se ha notificado que el numero de bacterias que sobreviven en el tracto intestinal es del mismo nivel o inferior al numero de bacterias ingeridas, o no se mide el numero de bacterias que sobreviven en el tracto intestinal.

Ademas, puesto que la absorcion de grasas tiene lugar principalmente en el intestino delgado, incluso si Bifidobacterium, que prolifera habitualmente en el intestino grueso, muestra capacidad de proliferacion en el tracto intestinal, el bloqueo de la absorcion de grasas no es suficiente. Ademas, se sabe que las bacterias del acido lactico

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actuan aguas arriba del intestino grueso, pero no se han realizado aun informes sobre las especies bacterianas que muestran capacidad de proliferacion en el tracto intestinal.

Un objeto de la presente invencion es proporcionar bacterias del acido lactico que muestran capacidad de proliferacion en el tracto intestinal.

Medios para solucionar los problemas

La presente invencion se refiere a una cepa de Lactobacillus pentosus TUA4337L (numero de registro: NITE BP- 1479), caracterizada porque la cepa tiene capacidad de proliferacion en el tracto intestinal.

Efectos de la invencion

Las bacterias del acido lactico de la presente invencion presentan excelentes efectos de proliferacion en el tracto intestinal. Ademas, cuando se ingieren las bacterias del acido lactico de la presente invencion, se presentan algunos excelentes efectos que potencian la actividad fisiologica de las celulas bacterianas, tal como que las bacterias del acido lactico sobreviven en el tracto intestinal y proliferan, continuando de ese modo los efectos de bloqueo de la absorcion de grasas, lo que a su vez da como resultado la obtencion de efectos altamente dieteticos.

Breve descripcion de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 es un grafico que muestra los resultados del examen en disoluciones intestinales artificiales.

[Figura 2] La figura 2 es un grafico que muestra la transicion de aumentos de peso, en el que las marcas “*”en la figura muestran que hay una diferencia significativa (p < 0,05) basandose en el grupo con dieta rica en grasas.

[Figura 3] La figura 3 es un grafico que muestra la cantidad de trigliceridos en sueros, en el que las marcas “*”en la figura muestran que hay una diferencia significativa (p < 0,05) basandose en el grupo con dieta rica en grasas.

Modos para llevar a cabo la invencion

Las bacterias del acido lactico de la presente invencion son una cepa de Lactobacillus pentosus TUA4337L, caracterizada porque la cepa tiene capacidad de proliferacion en el tracto intestinal. En este caso, la expresion “tiene capacidad de proliferacion en el tracto intestinal” o “proliferacion en el tracto intestinal” tal como se usa en el presente documento significa que la cepa, tras haber sobrevivido en el tracto intestinal, prolifera en el intestino delgado y/o el intestino grueso, y preferiblemente el intestino delgado, y el grado de capacidad de proliferacion puede evaluarse como “que es proliferativo” en un caso en el que el valor numerico es diez veces o mas la DO660 en la inoculacion cuando se cultiva la cepa en una disolucion intestinal artificial a 37°C durante 6 horas.

Los presentes inventores han examinado la capacidad de proliferacion de aproximadamente 480 tipos de bacterias del acido lactico, de las que son propietarios los presentes inventores, en disoluciones intestinales artificiales, y han administrado suspensiones de las bacterias que pertenecen a Lactobacillus pentosus seleccionadas a partir de las mismas a animales. Como resultado, los presentes inventores han descubierto que la cepa de Lactobacillus pentosus TUA4337L es significativamente mayor en el numero de bacterias excretadas que el numero de bacterias administradas. De ese modo, se ha perfeccionado la presente invencion.

La cepa de Lactobacillus pentosus TUA4337L esta depositada en el Deposito de Microorganismos de Patente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Agencia Administrativa Incorporada (2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu- shi, Chibaken, Japon) con la referencia de identificacion de NRIC 0883, con el numero de registro de NITE BP-1479 fechado con una fecha de deposito internacional de 10 de diciembre de 2012. La cepa de Lactobacillus pentosus TUA4337L se denomina a continuacion en el presente documento simplemente como cepa TUA4337L.

Las caracterfsticas bacteriologicas de la cepa TUA4337L se muestran en las tablas 1 y 2. La actividad de asimilacion de azucar de la tabla 2 es el resultado de mediciones usando un kit de identificacion de bacterias API 50CH (BIOMETRIEUX). En este caso, “+” significa un azucar asimilado, y “-” significa un azucar sin asimilar en la tabla 2.

[Tabla 1]

Tabla 1

Morfologfa bacteriana

Bacillus

Tincion de Gram

Positiva

Movilidad

Ausente

Esporas

Ausentes

Esporas finales

Ausentes

Reaccion de catalasa

Negativa

Crecimiento a 15°C

O

Crecimiento a 40°C

O

5

10

15

20

25

30

35

Crecimiento aerobio

O

Crecimiento anaerobio

O

pH en el crecimiento

3,0 - 12,5

[Tabla 2]

Actividad de asimilacion de azucar

Actividad de asimilacion de azucar

Actividad de asimilacion de azucar

Glicerol

+ D-Manitol + D-Rafinosa +

Eritritol

- D-Sorbitol + Almidon -

D-Arabinosa

- Metil-aD- glucopiranosido + Glicogeno -

L-Arabinosa

+ N-Acetilglucosamina + Xilitol -

D-Ribosa

+ Amigdalina + Gentiobiosa +

D-Xilosa

+ Arbutina + D-Turanosa +

L-Xilosa

- Citrato ferrico-Asculina + D-Lixosa -

D-Adonitol

- Salicina + D-Tagatosa -

Metil-3D-xilopiranosido

- D-Celobiosa + D-Fucosa -

D-Galactosa

+ D-Maltosa + L-Fucosa -

D-Glucosa

+ D-Lactosa + D-Arabitol -

D-Fructosa

+ D-Melibiosa + L-Arabitol -

D-Manosa

+ D-Sacarosa + Gluconato +

L-Sorbosa

- D-Trehalosa + 2-Cetogluconato -

Dulcitol

- Inulina - 5-Cetogluconato -

Inositol

- D-Melecitosa -

Tal como se describe en detalle en los ejemplos expuestos a continuacion, la cepa TUA4337L tiene las caracterfsticas de aumentar el numero de bacterias excretadas en comparacion con el numero de bacterias ingeridas, en otras palabras, que tiene capacidad de proliferacion en el tracto intestinal. Ademas, en cuanto a la capacidad de proliferacion en el tracto intestinal, el numero de bacterias tras un cultivo de 6 horas en una disolucion intestinal artificial a 37°C es preferiblemente 10 veces o mas, mas preferiblemente 15 veces o mas, incluso mas preferiblemente 20 veces o mas, y todavfa incluso mas preferiblemente 25 veces o mas, del numero de bacterias al inicio del cultivo de las bacterias usadas como patron.

Ademas, la secuencia del gen recA (SEQ ID NO: 1) codificada a partir de ADN extrafdo de la cepa TUA4337L tiene el 99% de homologfa con la secuencia del gen recA de la cepa de Lactobacillus pentosus IG1. En este caso, la homologfa, tal como se usa en el presente documento, se muestra como un grado de similitud mediante puntuaciones que usan, por ejemplo, un programa de busqueda BLAST que usa el algoritmo desarrollado por Altschul et al. (The Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)).

El medio para cultivar la cepa TUA4337L no esta particularmente limitado, y el medio incluye medios que contienen fuentes de carbono, fuentes de nitrogeno, sales inorganicas, nutrientes organicos comunes y similares. Ademas, el cultivo puede realizarse con un medio de agar o un medio lfquido. La temperatura de cultivo es preferiblemente de desde 10° hasta 45°C, mas preferiblemente desde 15° hasta 42°C, incluso mas preferiblemente desde 28° hasta 38°C, e incluso mas preferiblemente desde 35° hasta 37°C, y un pH proliferativo es preferiblemente un pH de desde 3,0 hasta 12,5, y mas preferiblemente un pH de desde 3,5 hasta 12,0.

La cepa bacteriana de la presente invencion incluye las propias bacterias del acido lactico, incluyendo bacterias viables y bacterias muertas, y en diversas formas tales como inclusiones de bacterias del acido lactico y celulas procesadas de bacterias del acido lactico. Las bacterias viables pueden obtenerse a partir de inclusiones de bacterias del acido lactico tales como un medio de cultivo que contiene bacterias del acido lactico. Las bacterias muertas pueden obtenerse, por ejemplo, sometiendo bacterias viables a calentamiento, irradiacion con ultravioleta, tratamiento con formalina, un tratamiento con acido o similares. Las bacterias viables o bacterias muertas resultantes pueden producirse adicionalmente para dar celulas procesadas sometiendo las bacterias a molienda, trituracion, o similares. En este caso, las bacterias del acido lactico en cada una de las formas anteriores son preferiblemente bacterias viables desde el punto de vista de presentar de manera completa los efectos de proliferacion en el tracto intestinal, y las bacterias muertas pueden mezclarse con las mismas.

Las bacterias del acido lactico anteriores incluyen, por ejemplo, bacterias viables, bacterias humedas, bacterias secas, y similares. Las inclusiones de bacterias del acido lactico anteriores incluyen, por ejemplo, suspensiones de bacterias del acido lactico, celulas cultivadas de bacterias del acido lactico (incluyendo celulas bacterianas, sobrenadante y componentes del medio), y medios cultivados que contienen bacterias del acido lactico (obtenidas retirando el contenido en solidos de las celulas de bacterias cultivadas). Ademas, las celulas de bacterias del acido lactico procesadas anteriores incluyen, por ejemplo, celulas molidas, celulas trituradas, celulas licuadas (extractos etc.), concentrados, celulas de tipo pasta, celulas secadas (celulas secadas por pulverizacion, celulas secadas por congelacion, celulas secadas a vacfo, celulas secadas en tambor, etc.), celulas diluidas, y similares.

Ejemplos

La presente invencion se describira especfficamente a continuacion en el presente documento mediante los ejemplos, sin pretender limitar el alcance de la presente invencion a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 <Examen usando la capacidad de proliferacion en disolucion intestinal artificial como indice>

5 Entre las bacterias del acido lactico de las que son propietarios los presentes inventores, se evaluo la capacidad de proliferacion en una disolucion intestinal artificial para aproximadamente 480 cepas que eran principalmente bacterias del acido lactico vegetales (incluyendo cepas JCM).

Concretamente, en primer lugar, se inoculo cada una de las bacterias del acido lactico a partir de una disolucion madre en glicerol en un medio MRS (Difco Laboratories) (10 ml) en una cantidad del 1% v/v cada una, y se 10 cultivaron las celulas bacterianas a 35°C durante de 16 a 17 horas. A continuacion, se midio la DO660 de cada medio de cultivo (absorbancia a 660 nm) con un espectrofotometro UV-1600 (Shimadzu Corporation), y se inoculo una disolucion de 100 pl preparada con el medio MRS, de modo que la DO660 de cada medio de cultivo serfa de 10, en una disolucion intestinal artificial (10 ml) de la composicion mostrada a continuacion en el presente documento. Despues de eso, se cultivaron las celulas bacterianas a 37°C durante 6 horas mientras se agitaba suavemente, y 15 entonces se midio la DO660 para obtener la cantidad de proliferacion (DO660 tras 6 horas/DO660 en la inoculacion). Los resultados representativos del examen se muestran en la tabla 3 y la figura 1.

<Disolucion intestinal artificial (pH 6,45)>

Medio MRS 9 ml

Disolucion de acido biliar al 10% p/v (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 ml

20 Pancreatina al 1% p/v (de porcino: SIGMA) 100 pl

En este caso, se usaron la disolucion de acido biliar y la disolucion de pancreatina, que se esterilizaron tratando la disolucion con un filtro de 0,22 pm (membrana de PVDF, fabricada por Millipore).

[Tabla 3]

Tabla 3

Genero, especie

Cepa DO660 tras 6 horas Cantidad de proliferacion (veces) (DO660 tras 6 horas/DO660 en la inoculacion)

Lactobacillus pentosus

TUA4337L (presente invencion) 2,93 29,3

JCM1558

0,73 7,3

1

1,55 15

2

1,79 17,9

3

1,54 15,4

4

1,90 19,0

5

1,68 16,8

6

1,93 19,3

7

1,60 16,0

8

1,60 16,0

9

1,78 17,8

10

0,78 7,8

11

1,68 16,8

12

1,42 14,2

13

1,37 13,7

14

0,96 9,6

15

1,46 14,6

Lactobacillus plantarum

JCM1149 1,53 15,3

16

1,63 16,3

17

1,70 17,0

18

1,42 14,2

19

1,59 15,9

Lactobacillus brevis

JCM1059 0,68 6,8

20

1,18 11,8

21

0,63 6,3

22

0,58 5,8

5

10

15

20

25

30

23 0,61 6,1

24

0,65 6,5

Lactobacillus casei

JCM1134 0,14 1,4

25

0,94 9,4

26

0,10 1,0

27

0,12 1,2

28

0,12 1,2

29

0,11 1,1

30

0,13 1,3

Lactobacillus fermentum

JCM1173 0,27 2,7

31

0,45 4,5

32

0,45 4,5

33

0,69 6,9

34

0,93 9,3

Lactobacillus acidophilus JCM1132

0,19 1,9

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM1012

0,06 0,6

Lactobacillus gasseri JCM1131

0,08 0,8

Lactobacillus helveticus JCM1120

0,07 0,7

Lactobacillus rhamnosus JCM1136

0,17 1,7

Como resultado, puede observarse que la cantidad de proliferacion es mas probable que sea alta en Lactobacillus pentosus y Lactobacillus plantarum, entre las que la cepa de Lactobacillus pentosus TUA4337L tiene una cantidad de proliferacion especialmente alta y una excelente capacidad de proliferacion en el tracto intestinal.

Ejemplo 2 <Evaluacion de la capacidad de proliferacion in vivo en el tracto intestinal>

A ratones sometidos a una dieta rica en grasas a voluntad se les administro la cepa TUA4337L preparada tal como sigue, y se cuantifico el numero de bacterias excretadas. Concretamente, a ratones C57BL/6J (de 10 semanas de edad, machos) se les administro una unica dosis con aproximadamente 1,0 x 109 celulas de bacterias del acido lactico (correspondiente a 250 pl de suspension celular bacteriana) a las 10 de la manana (n=5), usando la muestra de administracion preparada tal como sigue.

<Preparacion de muestras de administracion (muestras que contienen bacterias viables)>

[1] inocular la cepa TUA4337L a partir de una disolucion madre en glicerol en un medio MRS (30 ml) en una cantidad del 1% v/v;

[2] cultivar las celulas bacterianas (35°C, 20 horas);

[3] centrifugar el medio de cultivo (8.000 rpm, 5 min) para retirar el sobrenadante, y suspender en 30 ml de PBS(-);

[4] centrifugar la suspension de [3] (8.000 rpm, 5 min) para retirar el sobrenadante, y resuspender en 5 ml de PBS(-);

[5] contar el numero de bacterias con un microscopio; y

[6] dispensar una disolucion que contiene 20.000.000.000 celulas a un tubo de centrifugacion de 15 ml, centrifugar (8.000 rpm, 5 min) la disolucion para retirar el sobrenadante, y despues de eso suspender en 5 ml de un alimento lfquido (dieta rica en grasas de 60 kcal %FAT: dieta de investigacion) para preparar una suspension celular bacteriana (el alimento lfquido se preparo con PBS(-)).

Despues de eso, se recogieron todas las deposiciones de partes de dos dfas en 4 momentos divididos (la tarde del dfa que empezo la prueba, la manana y la tarde del dfa siguiente, y la manana del dfa despues del ultimo dfa), se cuantifico el numero de bacterias para todas las deposiciones mediante el siguiente metodo, y se calculo la tasa de aumento de la cepa TUA4337L en el intestino en cada uno de los ratones (el numero de bacterias para todas las deposiciones/el numero de bacterias administradas). Los resultados se muestran en la tabla 4.

<Metodo para medir el numero de bacterias segun PCR en tiempo real>

[1] anadir 1 ml de PBS(-) a 100 mg de deposiciones (en base de peso humedo), y luego desbaratar las deposiciones con una espatula;

[2] recoger una porcion de 100 mg de las deposiciones en un tubo Eppendorf (marca registrada), centrifugar (15.000 rpm, 5 min) las deposiciones para retirar el sobrenadante, y suspender la precipitacion en 1 ml de PBS(-) (repitiendose los procedimientos de centrifugar y suspender dos veces);

[3] retirar el sobrenadante de la suspension de [2], y despues de eso extraer el ADN de la suspension con un kit (QIAamp ADN Stool Mini Kit: QIAGEN)

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(llevandose a cabo la rotura celular repitiendo los procedimientos tres veces de anadir 300 mg de perlas de vidrio (de 150 a 212 pm: SIGMA), 300 pl de fenol/cloroformo/ alcohol isoamflico (25:24:1) y 900 pl de tampon ASL (reactivos en el kit) a las deposiciones, centrifugar la mezcla con MULTI-BEADS SHOCKER MB-200 (YaSuI KIKAI) a 3.000 rpm durante 1 minuto y dejar reposar en hielo durante 1 minuto); y

[4] cuantificar las bacterias del acido lactico en el contenido del tracto intestinal segun PCR en tiempo real en las condiciones mostradas a continuacion en el presente documento:

((Condiciones para la PCR en tiempo real))

(1) Se mezclan diez microlitros de SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio), 0,8 pl de cada cebador (10 pM), 0,4 pl de tinte de referencia ROX II, 6 pl de agua esteril y 2 pl de una disolucion de ADN, para preparar una mezcla de reaccion lfquida para PCR. Como cebadores, se usan los siguientes cebadores que detectan especfficamente ADNr 16S de Lactobacillus pentosus y Lactobacillus plantarum (siendo las secuencias de ADNr 1 6s de Lactobacillus pentosus y Lactobacillus plantarum el 100% identicas).

Cebador 1: 5'-GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT-3' (SEQ ID NO: 2)

Cebador 2: 5'-CGGACCATGCGGTCCAA-3' (SEQ ID NO: 3)

(2) Se realiza la PCR con el sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems), que comprende, posteriormente a un tratamiento a 95°C durante 30 segundos, llevar a cabo un total de 60 ciclos de reacciones, en los que un ciclo consiste en 95°C durante 5 segundos y 60°C durante 34 segundos. El numero de copias por un gramo del contenido del tracto intestinal se obtiene a partir de la intensidad de fluorescencia obtenida, la cantidad total de contenido del tracto intestinal y la cantidad de dilucion.

(3) Por separado, se obtiene el numero de copias de ADNr 16S por celula, y se convierte el numero de copias en el numero de bacterias. En este caso, se confirma en los ratones a los que no se administraron las bacterias del acido lactico que no se detectan ni Lactobacillus pentosus ni Lactobacillus plantarum segun la PCR en tiempo real anterior.

[Tabla 4]

Tabla 4

Individuo n.°

Numero de bacterias de TUA4337L Tasa aumentada (numero de bacterias por deposiciones

en las deposiciones (celulas)

totales/numero de bacterias administradas)

1

3,6 x 109 3,6

2

1,9 x 109 1,9

3

2,6 x 109 2,6

4

1,6 x 109 1,6

5

1,4 x 109 1,4

Media

2,2 x 109 2,2

Como resultado, pudo observarse que el numero de bacterias en la excrecion de la cepa de Lactobacillus pentosus TUA4337L es mayor que el numero de bacterias ingeridas. A partir de estos hallazgos se sugirio que la cepa de Lactobacillus pentosus pasaba a traves del estomago en un estado viable, proliferaba en el tracto intestinal y se excretaba.

Ejemplo 3 <Efectos del bloqueo del aumento de peso>

Se agruparon ratones C57BL/6J (de 8 semanas de edad, machos) en cuatro grupos de un grupo con dieta comun, un grupo con dieta rica en grasas, un grupo con dieta rica en grasas + bacterias viables y un grupo con dieta rica en grasas + bacterias muertas (n = 10 cada uno), y a cada uno de los grupos se les proporcionaron de manera continua las dietas tal como se muestra en la siguiente tabla 5 durante 32 dfas, y se midieron diariamente los pesos corporales y se calculo una media. La transicion en la media se muestra en la figura 2. En este caso, se realizaron comparaciones entre grupos usando una prueba de la t con un nivel significativo de 0,05.

Concretamente, en cuanto a la dieta, a cada grupo de la tabla 5 se le proporciono cada alimento solido a voluntad. Al grupo con dieta rica en grasas + bacterias viables se le administro una muestra de administracion preparada de la misma manera que en el ejemplo 2. Al grupo con dieta rica en grasas + bacterias muertas se le administro una muestra de administracion preparada tal como sigue de modo que las bacterias del acido lactico estuvieran contenidas en una cantidad de aproximadamente 1.000.000.000 celulas por dfa. Por otro lado, al grupo con dieta comun se le administraron 250 pl de PBS(-) que no contenfa las bacterias del acido lactico, y al grupo con dieta rica en grasas se le administraron 250 pl de un alimento lfquido que no contenfa las bacterias del acido lactico.

5

10

15

20

25

30

35

40

[Tabla 5]

Tabla 5

Grupo

Dieta

Dieta solida

Bacterias del acido lactico administradas

Grupo con dieta comun

10 kcal %FAT -

Grupo con dieta rica en grasas

60 kcal %FAT -

Grupo con dieta rica en grasas + bacterias viables

60 kcal %FAT Bacterias viables de TUA4337L

Grupo con dieta rica en grasas + bacterias muertas

60 kcal %FAT Bacterias muertas de TUA4337L

* 10 kcal %FAT (dieta de investigacion) 60 kcal %FAT (dieta de investigacion)

<Preparacion de muestras de administracion (muestras que contienen bacterias muertas)>

[1] inocular la cepa TUA4337L en una cantidad del 1% v/v a partir de una disolucion madre en glicerol en un medio MRS (30 ml);

[2] cultivar las celulas bacterianas (35°C durante 20 horas);

[3] centrifugar el medio de cultivo (8.000 rpm, 5 min) para retirar el sobrenadante, y despues de eso suspender en 30 ml de PBS(-);

[4] centrifugar la suspension de [3] (8.000 rpm, 5 min) para retirar el sobrenadante, y despues de eso resuspender en 5 ml de PBS(-);

[5] contar el numero de bacterias con un microscopio;

[6] dispensar una disolucion que contiene 20.000.000.000 celulas a un tubo de centrifugacion de 15 ml, centrifugar la disolucion (8.000 rpm, 5 min) para retirar el sobrenadante, despues de eso anadir 5 ml de un fluido gastrico adicional (NaCl 125 mM, KCl 7 mM, pH 1,0) a la misma, agitar la mezcla y dejar reposar durante 60 minutos; y

[7] centrifugar la disolucion de [6] (8.000 rpm, 5 min) para retirar el sobrenadante, y despues de eso suspender en 5 ml de un alimento lfquido (60 kcal %FAT) para preparar una suspension celular bacteriana.

Como resultado, el grupo al que se le administraron bacterias viables de TUA4337L mostro un efecto significativo de bloqueo del aumento de peso, en comparacion con el control (el grupo con dieta rica en grasas). Ademas, la administracion de bacterias viables fue mas eficaz que la administracion de bacterias muertas. Se considera que la cepa de Lactobacillus pentosus TUA4337L prolifero en el tracto intestinal, influyendo de ese modo de manera eficaz en el huesped.

Ejemplo 4 <Efectos del bloqueo de la absorcion de grasas>

Se siguio proporcionando a cada uno de los constituyentes del grupo del grupo con dieta comun, el grupo con dieta rica en grasas y el grupo con dieta rica en grasas + bacterias viables en el ejemplo 3 (n = 12 cada uno) el mismo contenido de dietas que en el ejemplo 3 durante 2 semanas. Despues de eso, se dejo en ayunas a los grupos durante la noche, y se les administro un aceite de oliva (nacalai tesque) (5 ml/kg), y se diseccionaron adicionalmente tras 3 horas para recoger sueros de la vena cava. Se midieron los trigliceridos (TG) en los sueros con un dispositivo Triglyceride E-Test Wako (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.). Los resultados se muestran en la figura 3. En este caso, se realizaron comparaciones entre grupos mediante un juicio de diferencia significativa mediante una prueba de la t con un nivel significativo de 0,05.

Como resultado, se encontro que el grupo con dieta rica en grasas mostraba una clara probabilidad de aumentar los TG en sangre en comparacion con el grupo con dieta comun. Por tanto, se considera que si se continua ingiriendo una dieta rica en grasas, el cuerpo absorberfa mas facilmente una grasa. Ademas, se encontro que el grupo al que se administraron bacterias viables de TUA4337L habfa bloqueado el aumento de TG en sangre, en comparacion con el control (grupo con dieta rica en grasas). Por tanto, se considera que uno de los mecanismos de los efectos de bloqueo de los aumentos de peso es el bloqueo de la absorcion de grasas, que era eficaz incluso un dfa despues de la administracion de las bacterias viables de TUA4337L, de modo que se considera que presentan efectos de manera continua.

Aplicabilidad industrial

Puesto que las bacterias del acido lactico de la presente invencion tienen capacidad de proliferacion en el tracto intestinal, cuando se ingieren en el cuerpo, las bacterias del acido lactico sobreviven en el tracto intestinal y

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Lactobacillus pentosus TUA4337L depositada con el numero de registro NITE BP-1479, caracterizada porque la cepa tiene capacidad de proliferacion en el tracto intestinal.