ES2627154T3

ES2627154T3 - Métodos de seguimiento y análisis de perfiles de actividad metabólica, usos diagnósticos y terapéuticos de los mismos

Info

Publication number: ES2627154T3
Application number: ES12721945.9T
Authority: ES
Inventors: Reuven Tirosh; Fernando Patolsky; Hagit PERETZ-SOROKA
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 2011-04-06
Filing date: 2012-04-04
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2032-04-04
Also published as: CA2832031C; KR102010600B1; CN103518133A; BR112013025782A2; AU2012240953A1; US20140255972A1; US20130224789A1; AU2012240953B2; US9784731B2; US20180038849A1; JP2014512006A; EP2694962B1; BR112013025782B1; JP5990254B2; DK2694962T3; WO2012137207A1; US8728758B2; KR20140024871A; EP2694962A1; CA2832031A1

Abstract

Un método para medir una actividad metabólica (AM) de una célula, comprendiendo el método la medición de manera independiente en un entorno extracelular de la célula, los perfiles de acidificación dependientes del tiempo debido a la secreción de: (i) productos metabólicos solubles no volátiles; (ii) productos metabólicos solubles no volátiles y productos metabólicos solubles volátiles; y (iii) productos metabólicos solubles volátiles; en el que dicha medición del perfil de acidificación de dicho (i) se efectúa en una cámara expuesta al aire, y en el que dicha medición del perfil de acidificación de dicho (ii) se efectúa en una cámara sellada al aire, y en el que dicha medición del perfil de acidificación de dicho (iii) se realiza restando un perfil de acidificación de dicho (i) de un perfil de acidificación de dicho (ii), y además en el que al menos uno de dichos perfiles de acidificación dependientes del tiempo es indicativo de la actividad metabólica de la célula.

Description

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DESCRIPCION

Metodos de seguimiento y analisis de perfiles de actividad metabolica, usos diagnosticos y terapeuticos de los mismos

Campo y antecedentes de la invencion

La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a metodos de seguimiento y analisis de perfiles de actividad metabolica y usos diagnosticos de los mismos, o espedficamente se refiere al diagnostico del cancer por seguimiento de la actividad metabolica de muestras de sangre.

Un problema importante en el tratamiento de la enfermedad sigue siendo la deteccion precoz y la estadificacion. La deteccion precoz permite el tratamiento terapeutico desde la aparicion de la enfermedad que en muchos casos resulta en un tratamiento exitoso. La estadificacion de una enfermedad podna indicar acerca del protocolo apropiado de medicacion que puede ser decisivo para el tratamiento optimo. Por ejemplo, hoy dfa, millones de personas viven con cancer o han padecido cancer. El cancer es la segunda causa mas comun de muerte en Estados Unidos, solo superada por las enfermedades del corazon. El cancer representa casi 1 de cada 4 muertes en Estados Unidos. Cuanto antes se diagnostica y se trata un cancer, mejores seran las posibilidades de supervivencia.

Todos los metodos conocidos para la deteccion del cancer se centran en la identificacion de la mayona del tejido maligno y/o sus biomarcadores patologicos de cancer secretados a la circulacion. Sin embargo, estos metodos de diagnostico por desgracia solamente son eficaces en etapas relativamente avanzadas de la enfermedad.

El efecto Warburg es la observacion de que la mayona de las celulas cancerosas producen predominantemente energfa por una alta tasa de glicolisis seguido por la produccion de acido lactico en el citosol, en lugar de por una tasa relativamente baja de la glicolisis seguido por la oxidacion de piruvato en la mitocondria, como la mayona de las celulas normales [Kim JW, Dang CV (2006). “Cancer's molecular sweet tooth and the Warburg effect”. Cancer Res. 66 (18): 8927-30]. En segundo lugar, en 1920 Otto Warburg comprobo que las celulas del cancer19,20, en contraste con las celulas diferenciadas normales, principalmente dependen de la glicolisis aerobica en lugar de la fosforilacion oxidativa mitocondrial para generar ATP como combustible para la energfa necesaria para los procesos celulares. Este fenomeno historico se denomino “el efecto Warburg”21. Otto Warburg postula que este cambio en el metabolismo es la causa fundamental del cancer [Warburg O (1956). “On the origin of cancer cells”. Science 123 (3191): 309-14], una afirmacion ahora conocida como hipotesis de Warburg. Cerca de 50 anos mas tarde el efecto Warburg tambien se observo en linfocitos activados in vitro, vease por ejemplo, Maclver et al. 2008 J. Leukocyte Biology 84: 1-9; y DeBerardinis Cell Metabolism 7: 11-20. Se comprobo que el efecto Warburg tambien se produce en el sistema inmunologico, donde las celulas T activadas22,23 hiperinducen rapidamente la glicolisis, por ejemplo por la sobre-expresion de los transportadores de glucosa (GLUT)24.

El efecto Warburg tiene importantes aplicaciones medicas, puesto que la alta glucolisis aerobica por tumores malignos se utiliza clmicamente para diagnosticar y controlar la respuesta al tratamiento de canceres mediante la obtencion de imagenes de captacion de 2-18F-2-desoxiglucosa (fDg) (un sustrato radiactivo de la hexoquinasa modificada) con tomograffa de emision de positrones (PET). Vease tambien el documento WO2007/102146. Sin embargo, estos metodos son engorrosos y caros al requerir instalaciones de alta tecnologfa o biopsias de tejido in situ. Hynes et al. Analytical Biochemistry 390 (i): 21-28 ensena la medicion de la actividad metabolica de las celulas cancerosas, incluyendo carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, neuroblastoma.

Por lo tanto, se necesitan metodos no invasivos para el diagnostico precoz y simple.

Sumario de la invencion

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo para medir una actividad metabolica (AM) de una celula, comprendiendo el metodo medir de manera independiente en un entorno extracelular de la celula, los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(ii) productos metabolicos solubles no volatiles y productos metabolicos solubles volatiles;

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (i) se efectua en una camara expuesta al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (ii) se efectua en una camara sellada al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (iii) se realiza restando un perfil de acidificacion de dicho (i) de un perfil de acidificacion de dicho (ii), y ademas

en el que al menos uno de los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de la celula.

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De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo para diagnosticar una enfermedad asociada con una actividad metabolica modificada en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el metodo:

medir de manera independiente en un entorno extracelular de una celula los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo de dicho sujeto debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(ii) productos metabolicos solubles no volatiles y productos metabolicos solubles volatiles; y

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que al menos uno de los perfiles de acidificacion dependiente del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de la celula y mientras que un cambio en la actividad metabolica en comparacion con la de una muestra de celulas normales no afectadas examinadas en condiciones identicas es indicativo de una enfermedad asociada con la actividad metabolica modificada.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo para optimizar individualmente el tratamiento de la enfermedad, comprendiendo el metodo:

(a) poner en contacto una muestra biologica del sujeto que comprende una celula con al menos un medicamento;

(b) medir de manera independiente en un ambiente extracelular de la celula los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que al menos uno de los perfiles de acidificacion dependiente del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de la celula y mientras que un cambio en la actividad metabolica de las celulas hacia la de una muestra celular sana normal examinada en condiciones identicas es indicativo de una medicamento eficaz para la enfermedad.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo de seguimiento del tratamiento de la enfermedad en un sujeto, comprendiendo el metodo:

medir de manera independiente en un entorno extracelular de una celula de un sujeto tratado los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que al menos uno de los perfiles de acidificacion dependiente del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de la celula y mientras que un cambio en la actividad metabolica de las celulas hacia la de una muestra celular sana normal examinada en condiciones identicas es indicativo de un tratamiento eficaz de la enfermedad.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo de identificacion de un agente capaz de alterar una actividad metabolica de las celulas, comprendiendo el metodo:

(a) someter las celulas a un agente;

(b) medir la actividad metabolica de las celulas despues de (a) y opcionalmente antes de (a) de acuerdo con el metodo de la reivindicacion 1, en el que un cambio en los perfiles de acidificacion es indicativo de un agente capaz de alterar una actividad metabolica de las celulas.

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De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el medio extracelular comprende una solucion definida que tiene una capacidad tamponante calibrada.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el tampon comprende una solucion salina tamponada con fosfato.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la celula comprende un leucocito.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas comprenden una celula cancerosa.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas comprenden una celula mononuclear de sangre periferica (CMSP).

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la enfermedad comprende cancer.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la muestra biologica comprende una muestra de sangre.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cancer, infeccion patogena y una enfermedad autoinmune.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, los metabolitos no volatiles comprenden lactato.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, los metabolitos volatiles comprenden NH3 y CO2.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la medicion del perfil de acidificacion de (i) se efectua en camaras expuestas al aire.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la medicion del perfil de acidificacion de (ii) se realiza en camaras selladas al aire.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la medicion de los perfiles de acidificacion se efectua a una temperatura constante.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la temperatura constante comprende 37 °C.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo ademas comprende someter a la celula a un estimulante o inhibidor antes de, o simultaneamente con la medicion del perfil de acidificacion.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el estimulante o inhibidor comprende una celula.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el estimulante o inhibidor comprende un antfgeno libre de celulas.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la celula estimulante comprende linfocitos y la celula comprende un linfocito no singenico con respecto al linfocito.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la medicion de los perfiles de acidificacion se efectua en un escaner de placa de fluorescencia de multiples pocillos comercial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el filtrado de la serial a ruido de las medidas de fondo del ensayo de AM se lleva a cabo por analisis de agrupamiento de medios k.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las decisiones de diagnostico por las medidas de la actividad metabolica estan sujetas a al menos dos modelos de arboles de decision.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, los modelos de arboles de decision se seleccionan del grupo de C5, C&R Tree y CHAID.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas la separacion de la celula del entorno extracelular.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la separacion es mediante separacion Ficoll bajo centrifugacion.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y/o cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto en la tecnica a la que pertenece la invencion. Aunque en la practica o ensayo de realizaciones de la invencion se pueden utilizar metodos y materiales

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similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuacion se describen metodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecera la memoria descriptiva de patente, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.

Breve descripcion de los dibujos

Algunas realizaciones de la invencion se describen en el presente documento, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Ahora, con referencia espedfica a los dibujos en detalle, se hace hincapie en que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y para fines de discusion ilustrativa de las realizaciones de la invencion. En este sentido, la descripcion tomada junto con los dibujos hace evidente para los expertos en la tecnica como pueden ponerse en practica formas de realizacion de la invencion.

En los dibujos:

La FIG. 1 es una representacion esquematica de las diferencias entre la fosforilacion oxidativa, la glicolisis anaerobica, y la glicolisis aerobica (tambien conocido como “efecto Warburg”).

La FIG. 2 es un grafico que muestra los espectros de absorcion dependiente del pH del acido 8-hidroxipireno- 1,3,6-trisulfonico (HPTS).

Las Fig. 3A-D son graficos que muestran el pH y la calibracion de la acidez de la solucion de trabajo a 2 mM y solucion salina de tampon fosfato 10 mM, a HPTs 1 pM. ABIERTO: Los pasos de acidificacion se controlaron a 37 °C sin sello. CERRADO: Los pasos de acidificacion se controlaron a 37 °C despues de que se sello la placa de multiples pocillos.

eje X; la relacion: (intensidad de fluorescencia a Ex. 403 nm)/(intensidad de fluorescencia a Ex. 455 nm). eje Y de la derecha (triangulos): La cantidad acumulada de HCl (pmol/ml) tal como se obtiene mediante la adicion secuencial de HCl 1N.

eje Y de la izquierda (drculos): los valores de pH apropiados segun lo medido por el electrodo de vidrio de pH. Figuras 3A-B - Solucion de trabajo con solucion salina de tampon fosfato 2 mM. Figuras 3C-D - Solucion de trabajo con solucion salina de tampon fosfato 10 mM.

Las Fig. 4A-B son graficos que muestran curvas de calibracion a concentraciones HPTS de 1 pM y 10 pM en solucion salina de tampon fosfato 10 mM.

eje X: la relacion: (intensidad de fluorescencia a Ex. 455 nm)/(intensidad de fluorescencia a Ex. 403 nm) eje Y de la derecha (triangulos): La cantidad acumulada de HCl (pmol/ml) tal como se obtiene mediante la adicion secuencial de HCl 1N.

eje Y de la izquierda (drculos): los valores de pH apropiados segun lo medido por el electrodo de vidrio de pH. (Figura 4A) La concentracion final de HPTS es 1 pM. (Figura 4B) La concentracion final de HPTS es 10 pM.

Las Fig. 5A-D muestra el analisis de agrupamiento de medias k de los valores de la tasa de referencia HPTS. Las Figuras 5A-C - el punto del eje x sobre valores normalizados de la sonda recibidos de “ABIERTO”, y el punto del eje y sobre valores normalizados de la sonda recibida de mediciones “CERRADO”. Figura 5A - Examen de todos los valores de todos los donantes de prueba (N = 730 observaciones) antes del analisis de agrupamiento. Figura 5B- el analisis de agrupamiento de medias k de los datos de la sonda se indica en 26 grupos presentados con diferentes colores. Cinco grupos se encontraron pequenos (observaciones < 6) y por lo tanto se descartaron (valores atfpicos). Figuras 5C-D - se excluyeron 34 observaciones (4,66 %) de 730 observaciones (rojo). Las 696 observaciones restantes (95,34 %) (azul) se presentan en 21 grupos separados en (Figura 5B). A continuacion, se volvieron a calcular para cada donante los valores medios de los estados “ABIERTO” y los valores medios de los estados “CERRADO”.

Las Fig. 6A-C son perfiles de AM para el aumento de la concentracion de glucosa obtenido para donantes sanos tfpicos y donantes con cancer. eje x: Concentracion de glucosa (mM). eje y: tasa de actividad metabolica de CMSPh en unidades de picomol H+/pl/hora/CMSP 2500 para las figuras 6B-C y picomol H+/pl/hora para la Figura 6C. La cinetica de acidificacion se mide durante 1 hora de incubacion a 37 °C. Ciclo de estado “ABIERTO” de la placa de multiples pocillos durante 30 minutos. En este estado existe una ventilacion de gas de CO2 y NH3, de modo que solo la produccion de acido lactico (incluyendo otros acidos organicos no volatiles) contribuye a la acumulacion de acido equivalente en cada pocillo. Ciclo de estado “CERRADO” de la misma placa de multiples pocillos durante 30 minutos. En este estado hermeticamente sellado, el CO2 y el NH3 reaccionan en equilibrio con agua para formar iones de acido carbonico y de amonio. El nivel de acidez se produce tanto por los aniones de acido lactico como de acido carbonico alrededor de pH 7,3. El cation basico NH4 + se evalua en el presente documento para valorar el nivel de acidez. “CERRADO” - “ABIERTO” = CO2 + (-NH3)). (Figura 6A) Un registro de control del ensayo de AM incluyendo los HPTS sonda y glucosa, pero sin celulas. (Figura 6B) perfiles de AM de una mujer de 45 anos de edad que representa un donante sano tfpico (se obtienen perfiles similares para diferentes edades y sexo). (Figura 6C) perfiles de MA de una mujer de 37 anos con cancer de mama idc en fase

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2 y antes del tratamiento. Observense que pueden detectarse cambios inducidos por la AM entre las muestras sanas y enfermas ya en estado basal (muestra de control sin estimulantes).

Las Fig. 7A-D son graficos que muestran un caso de estudio de seguimiento de los perfiles de AM para aumentar la glucosa obtenida para una mujer de 65 anos de edad con cancer de mama comparado con un varon de 69 anos sano. Negro - “CERRADO”; Rojo - “ABIERTO”; Azul - “C-A” = “CERRADO” - “AbIERTO”. Las figuras 7A - perfiles de AM de celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) de un varon de 69 anos sano. Las figuras 7B-D3 muestran los perfiles de seguimiento de la AM de celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) de una mujer de 65 anos de edad con cancer de mama idc. Eje x: concentracion de glucosa (mM). Eje y: tasa de actividad metabolica de CMSP en unidades de picomol H+/jl/hora/CMSP 2500. (Figura 7B) El primer ensayo de AM del seguimiento de los pacientes, ya sospechoso por los resultados del ensayo de padecer cancer (tiempo = 0). (Figura 7C) Tiempo = + 10,5 meses- El segundo ensayo de AM justo despues de la mamograffa de rutina diagnosticada por los medicos de padecer cancer de mama idc en fase 3. (Figura 7D) Tiempo = + 14,5 meses - El sexto ensayo de AM se llevo a cabo despues de la extirpacion quirurgica del tumor de 2,2 x 2,4 cm en el pecho izquierdo y despues de 2 meses de 3 tratamientos de quimioterapia.

Las Fig. 8A-D son graficos que muestran los perfiles de AM para aumentar la concentracion de PSA obtenido para donantes sanos tfpicos, paciente de cancer de mama y donante recuperado de cancer de mama.

Figura 8A - un registro de control del ensayo de AM incluyendo los HPTS sonda y PSA, pero sin celulas (Figuras 8B-D) Perfiles de AM de celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) de 3 donantes diferentes. Eje x: concentracion de PSA (jg/ml). Eje y: tasa de actividad metabolica de CMSP en unidades de picomol H+/|jl/hora/CMSP 2500 para las Figuras 9B-D y picomol H+/jl/hora para la Figura 8A. La cinetica de acidificacion se mide durante 1 hora de incubacion a 37 °C. Negro - “CeRrADO”; Rojo - “ABIERTO”; Azul “C-O” = “CERRADO” - “ABIERTO”. (Figura 8A) perfiles de AM de una mujer de 59 anos de edad, que representa un donante sano tfpico. (Figura 8B) perfiles de MA de una mujer de 37 anos con cancer de mama idc en fase 2 y antes de cualquier tratamiento. (Figura 8C) perfiles de AM de una mujer de 50 anos recuperada de cancer de mama 18 anos antes del ensayo de AM.

Las Fig. 9A-D muestra la construccion de modelos y la evaluacion de la clasificacion de los resultados de los ensayos de AM.

Las Figuras 9A-B - Primer grupo de donantes con edad por encima de 40 (n = 42). Las figuras 9C-D - Segundo grupo de donantes con edad entre 22 y 81 anos de edad. Figuras 9A, C - Las dos tablas presentan los mejores modelos con el mejor punto de corte de la mejor clasificacion. “O” se refiere al estado “ABIERTO”, “C” se refiere a estado “CERRaDo” y “C-O” se refiere al estado “CERRADO - ABIERTO”. TP se refiere a verdadero positivo, FN se refiere a falso negativo, TN se refiere a verdadero negativo y FP se refiere a falso positivo. Figuras 9B, D- dos graficas para la evaluacion y comparacion de los resultados de los modelos de las tablas de ganancia acumulada. El eje y muestra el porcentaje de donantes clasificados por los modelos de padecer cancer. Este es un porcentaje de los donantes totales (pacientes sanos y cancer). El eje x muestra el porcentaje de pacientes clasificados de padecer cancer, que es una fraccion de los 42 donantes totales para el primer grupo y 67 donantes totales para el segundo grupo. Se presentan los 4 mejores modelos que eran capaces de clasificar con gran precision tanto en donantes sanos como en pacientes con cancer. El cuarto modelo es un modelo de regresion logfstica de la familia de modelos de regresion. La lmea negra se refiere a la tasa de respuesta al azar (si se clasifican al azar X% de los donantes, se obtienen X% de pacientes con cancer). La lmea azul cielo se refiere al mejor modelo teorico. La lmea roja se refiere al modelo cHaID, la lmea verde se refiere a algoritmo C5, la lmea amarilla se refiere al modelo de arbol C & R y la lmea azul se refiere al modelo logfstico.

Las Fig. 10A-D presentan los resultados del modelo de evaluacion del ensayo de AM usando un conjunto de validacion del 30 % de los donantes. Las Figuras 10A-B - Primer grupo de donantes con edad por encima de 40 (n = 42). Figuras 10C, D - Segundo grupo de donantes con edad de 22 a 81 anos de edad. (a, c) Los datos como se describen en la figura 9 se dividieron al azar en dos grupos de “Formacion” y “Ensayo” utilizando el software Clementine v13.0. Figura 10A - el conjunto de validacion incluye el 70 % de los donantes para el primer grupo. Figura 10C - el conjunto de validacion incluye el 70 % de los donantes para el segundo grupo. Figuras 10A, C - Dos graficos para la evaluacion y comparacion del rendimiento de los modelos realizados por las ganancias de los graficos acumulados despues del reparto de datos al azar. El eje y muestra el porcentaje de donantes clasificados por los modelos de padecer cancer. Este es un porcentaje de los donantes totales (pacientes sanos y con cancer). El eje x muestra el porcentaje de pacientes clasificados de padecer cancer. El conjunto “Formacion” se utiliza para construir el modelo de minena de datos sobre el 70 % de los donantes. El 30 % restante de los donantes se utiliza mas tarde para evaluar el resultado de la clasificacion en el conjunto de “Ensayo” usando los modelos que se generaron en el conjunto de formacion (CHAID, Logistic, C5, C & R Tree). Como se describe en la figura 9, la lmea azul cielo se refiere al mejor modelo teorico, la lmea roja al modelo CHAID, la lmea verde al algoritmo C5, la lmea amarilla al modelo de arbol C & R, la lmea azul al modelo logfstico y la lmea de color negro se refiere al modelo aleatorio. Figuras 10B, D - Las dos tablas presentan el mejor modelo con el mejor punto de corte de la mejor clasificacion despues del reparto de datos aleatorios. “O” se refiere al estado “ABIERTO”, “C” se refiere a estado “CERRADO” y “C-O” se refiere al estado “CERRADO - ABIERTO”. TP se refiere a verdadero positivo, FN se refiere a falso negativo, TN se refiere a verdadero negativo y FP se refiere a falso positivo. En ambos grupos de donantes C5 fue el de mejor rendimiento en el conjunto de “Ensayo” mientras que en el conjunto de “Formacion” C&RT fue el que mejor se comporto.

La FIG. 11 representa una hipotesis de trabajo: perfiles de actividad metabolica de CMSPh como imagen especular del desarrollo de tumores. El desarrollo del cancer se considera que esta asociado con cambios en la funcion fisiologica del sistema inmunologico que podnan reflejarse en diferentes perfiles de actividad metabolica

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(AM) de las CMSPh. El eje y presenta los dos brazos de las vfas metabolicas, en concreto, la fosforilacion oxidativa frente a la glicolisis aerobia. El eje x presenta las etapas del desarrollo de tumores desde sano a metastasis del cancer. Las celulas quiescentes (Q) tienen una tasa basal dominante de la fosforilacion oxidativa. En etapas iniciales del desarrollo del tumor hay “expansion clonal” del subgrupo espedfico de tejido relevante Q (Qi) en celulas asesinas efectoras antitumorales (Eki), que en etapas posteriores probablemente se transforman en celulas alimentadoras efectoras del protumor (Efi). Al mismo tiempo, la tolerancia inmune y la anergia sucumben en la etapa de metastasis, donde ambos subgrupos espedficos de tejido se pueden agotar, incluyendo su respectivo subgrupo quiescente (Qi). Los presentes resultados revelan un cambio metabolico de la fosforilacion oxidativa dominante preferido por CMSPh de donantes sanos a la glicolisis aerobica dominante (“Efecto Warburg”) preferido por CMSPh de varios pacientes con cancer en las fases de desarrollo local del tumor (fases 1-3). El cambio hacia la glicolisis aerobica puede estar relacionada con un subgrupo dominante Efi y posiblemente tambien con el subgrupo Eki. La capacidad de deteccion precoz espedfica de tejido del cancer (etapa 0) se examinara por un protocolo de seguimiento. Se espera que se revele como una activacion metabolica mejorada/reducida bajo estimulacion por tejido - antfgenos espedficos, en comparacion con la obtenida para donantes sanos. En cancer en metastasis temprana (fase 4) se espera desplazamiento gradual hacia atras hacia la fosforilacion oxidativa dominante, produciendo una herramienta de diagnostico para el tratamiento adecuado. La descripcion esquematica anterior de los perfiles de actividad metabolica caractensticos se presenta con la lmea de rayas de color naranja que se relaciona con la diferencia de los resultados “cerrado - abierto” del ensayo de AM, que indican el cambio del efecto Warburg de las CMSPh.

La FIG. 12 es un diagrama de flujo del marco del protocolo y analisis del ensayo de AM. Las fases secuenciales A-E del marco del ensayo de AM encajan con las que se detallan en el Ejemplo 1 de la seccion de ejemplos que sigue.

Fig. 13A-I. Perfiles de AM para aumentar la concentracion de glucosa obtenida por un donante tfpico saludable, con cancer y con lupus autoinmune. Eje x: concentracion de glucosa (mM). Eje y: tasa de actividad metabolica de PBMC en unidades de picomol H+/|jl/hora/2500 celulas. La cinetica de acidificacion se mide durante 1 hora de incubacion a 37 °C.

Figuras 13A, D, G - “CERRADO”; 13B, E, H - “ABIERTO”; 13C, F, I - “C-O” = “CERRADO” - “ABIERTO”. Figuras 13A-C - Perfiles de AM representativos de un donante sano tfpico. Figuras 13D-F - Perfiles de AM representativos de un paciente tfpico con cancer. Figuras 13G-I - Perfiles de AM de un paciente con lupus sistemico (una enfermedad autoinmune).

Descripcion de las realizaciones espedficas de la invencion

Antes de explicar en detalle al menos una realizacion de la invencion, debe entenderse que la invencion no esta necesariamente limitada en su aplicacion a los detalles expuestos en la siguiente descripcion o ejemplificados por los Ejemplos. La invencion permite otras realizaciones o que se pueda poner en practica o llevarse a cabo de diversas maneras.

Hoy en dfa, urgentemente se requieren metodos de alto rendimiento para la deteccion precoz y la estadificacion de diversas enfermedades. Por ejemplo, cuanto antes se detecta y se trata un cancer, mejores seran las posibilidades de supervivencia. Ademas la identificacion de la fase de la enfermedad asegura el tratamiento adecuado.

Los presentes inventores se han dado cuenta de que, en contraste con los enfoques convencionales para la deteccion de enfermedades que analizan diferentes parametros in situ o marcadores circulatorios relevantes asociados con la enfermedad que permiten la deteccion de enfermedades en etapas relativamente tardfas, el sistema inmunologico podna reflejar el estado de enfermedad ya en el inicio de la enfermedad. Dado que el sistema inmunologico es responsable de combatir de forma natural el desarrollo de la enfermedad ya en las primeras etapas, sena beneficioso identificar los perfiles caractensticos de las respuestas inmunes relevantes. La variacion de dichos perfiles de actividad metabolica del sistema inmunologico junto con el desarrollo de la enfermedad tambien puede ser util para la estadificacion de la enfermedad. Por ejemplo, en homeostasis, la actividad del sistema inmunologico debe estar bien controlada; la hiperactividad se asocia con enfermedades autoinmunes, mientras que el desarrollo del cancer probablemente esta relacionado con la hipoactividad del sistema inmunologico. Estas rutas opuestas pueden estar indicadas por perfiles de AM generales y mas espedficos en respuesta a diversos nutrientes y estimulantes.

Asf, los presentes inventores han ideado un enfoque innovador, orientado clmicamente a la medicion cuantitativa de la actividad metabolica de poblaciones de celulas relevantes, como indicador de enfermedad. El ensayo mide la tasa de la actividad metabolica de microlitros de muestras celulares, mediante el seguimiento de la acidificacion extracelular usando una sonda de fluorescencia impermeable sensible al pH.

Como se ilustra en la seccion de ejemplos que sigue, utilizando el analisis de la actividad metabolica (AM), los presentes inventores han puesto de manifiesto un cambio significativo entre las diferentes vfas metabolicas

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controladas en CMSP obtenidas de pacientes con cancer y donantes sanos. Este cambio se puede adoptar como herramienta de diagnostico, para una diferenciacion clara entre los pacientes sanos y con cancer mediante la supervision de los cambios caractensticos en la actividad metabolica de CMSP (Figuras 6-10, 13). Estos hallazgos preliminares significativos se obtuvieron comparando los resultados del ensayo de AM en pocillos “abiertos” frente a pocillos “cerrados” (sellados al aire). Ambos registros permiten medir las acumulaciones de productos metabolicos solubles frente a volatiles (acido lactico frente a CO2 y NH3), diferenciando de esta manera entre tres vfas metabolicas - la fosforilacion oxidativa, la glicolisis anaerobica y la glicolisis aerobica, tal como se interpreta a continuacion.

Las celulas T no activas (celulas T naive), como la mayona de las celulas diferenciadas normales, dependen principalmente de la fosforilacion oxidativa mitocondrial para generar ATP eficientemente para la energfa necesaria para los procesos celulares, y el producto CO2 volatil. En ausencia de oxfgeno deben depender de una via metabolica mucho menos eficientes de produccion de ATP, asociada a la produccion de acido lactico, conocida como glicolisis anaerobica. En contraste, la mayona de las celulas cancerosas 18 se encuentra que dependen de la glicolisis aerobica, que es similar a la glicolisis anaerobica a pesar de la presencia de oxfgeno. Este fenomeno fue encontrado originalmente por Otto Warburg en relacion con las celulas cancerosas, y se denomino “efecto Warburg”. Los presentes inventores revelaron la presencia del “efecto Warburg” en CMSP frescas de pacientes con cancer. Sin estar ligado por la teona, la explicacion inmunometabolica del “efecto Warburg”, es decir, el cambio entre los linfocitos naive y activados en CMSP frescas de pacientes con cancer, puede estar relacionado con la necesidad de la funcion fisiologica agresiva y eficaz de las celulas T activadas en las proximidades de las celulas tumorales, en las que en las etapas tempranas antes de la angiogenesis es probable que sea deficiente en oxfgeno. Esta idea es coherente con el hecho de que las celulas tumorales inicialmente estan adaptadas a la deficiencia de oxfgeno a traves del “efecto Warburg”.

A la luz de las vfas metabolicas anteriores, los productos finales, el CO2 y el lactato contribuyen directamente a la acidificacion examinada por el ensayo de AM.

Ademas, otro producto final que se considera que desempena un papel importante en el ensayo de AM es el amomaco (NH3). Una de las fuentes primarias de energfa de la celula es el catabolismo de protemas, que es el proceso de descomposicion de protemas en aminoacidos. Los grupos amino se eliminan de los aminoacidos y se convierten en amoniaco. Otra fuente de produccion de NH3 celular es a traves de vfas metabolicas de las purinas y pirimidinas que constituyen los dos grupos de bases nitrogenadas. En el presente sistema de medicion, como en celulas vitales in vivo, deben mantener el citoplasma a un pH constante de aproximadamente 7,2 a 7,4 por la secrecion de productos metabolicos acidos y basicos, tales como el acido lactico, los acidos carbonicos y la base de amonio.

Estos hallazgos ya aseguran que mediante la comunicacion con el sistema inmunologico el analisis de AM orientado fisiologicamente podna tener implicaciones significativas para el desarrollo de nuevas formas para detectar, diagnosticar y tratar el cancer, asf como otras enfermedades.

Por lo tanto, segun un aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para medir una actividad metabolica (AM) de una celula. El metodo comprende medir de manera independiente (es decir, por separado) en un entorno extracelular de la celula, los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que al menos uno de los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo es indicativo de la via de la actividad metabolica de las celulas.

Tal como se usa en el presente documento “via de la actividad metabolica” se refiere a la contribucion relativa de la fosforilacion mitocondrial oxidativa, la glicolisis anaerobica, la glicolisis aerobica y la produccion de NH3 + para la produccion de energfa.

Los perfiles pueden tener una configuracion en pico o un comportamiento monotonico saturado. Un perfil en pico normalmente refleja la estimulacion mediada por receptor de la actividad metabolica que se espera que sea mas espedfica en comparacion con la respuesta dependiente de la concentracion de nutrientes. Esta ultima respuesta generalmente es un perfil monotonico saturado.

Tal como se usa en el presente documento “celula” se refiere a una celula procariota o eucariota para la que se puede medir la actividad metabolica anterior. La celula puede ser una celula de bacteria, levadura, planta, insecto o

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mairnfero. De acuerdo con una realizacion espedfica, la celula es una celula humana. Se apreciara que la celula puede referirse a una sola celula, pero tambien puede referirse a una pluralidad de celulas. Las celulas pueden ser celulas aisladas (que no tienen la organizacion del tejido) o celulas en un tejido o fragmento de tejido. De acuerdo con una realizacion espedfica, cuando las celulas son CMSP, el ensayo se realiza sobre 103-1010 celulas. De acuerdo con una realizacion espedfica el numero de celulas es de 106-107.

La celula puede ser una celula diferenciada, una celula no diferenciada o una celula desdiferenciada (por ejemplo, celulas madre).

De acuerdo con una realizacion espedfica, la celula es una celula del sistema inmunologico, que es un globulo blanco (es decir, un leucocito). Los ejemplos incluyen, un neutrofilo, un eosinofilo, un basofilo, un linfocito (celula T o celula B), un monocito, un macrofago y una celula dendntica.

De acuerdo con otra realizacion, la celula es una celula patogena o enferma de cualquier tejido, tal como una celula cancerosa. De acuerdo con las presentes ensenanzas que se proporcionan a continuacion se pueden detectar otras enfermedades y afecciones medicas.

Otras celulas que pueden analizarse de acuerdo con las presentes ensenanzas incluyen, pero no se limitan a, una celula embrionaria (por ejemplo, para la calificacion IVF), un globulo rojo, una plaqueta, una celula bacteriana infectada, una celula infectada por un hongo, y una celula infectada por un virus.

Por lo tanto, la celula puede referirse a una poblacion aislada de celulas que comprenden un subconjunto altamente purificado de celulas espedficas, es decir, una poblacion de celulas homogenea (por ejemplo, > 80 % de pureza), por ejemplo, celulas T, o una poblacion celular heterogenea que comprende varios tipos celulas inmunologicas tales como leucocitos de sangre periferica (PBL) o celulas mononucleares.

Las celulas pueden ser no cultivadas, celulas primarias cultivadas o celulas clonadas (por ejemplo, lmeas de celulas).

Las celulas pueden ser celulas adherentes o celulas en suspension.

De acuerdo con otras realizaciones, las celulas pueden estar modificadas o no modificadas geneticamente.

Tal como se usa en el presente documento “medir de manera independiente” se refiere a separar la medicion de los puntos (i), (ii) y posiblemente (iii). Aunque de acuerdo con una realizacion espedfica se apreciara que (iii) es el resultado de restar (i) de (ii). Estas mediciones separadas se pueden realizar en paralelo, simultaneamente, en muestras de celulas identicas aun no separadas, o secuencialmente en una sola muestra de celulas (como se describe en la seccion de ejemplos que sigue).

Por lo tanto, la medicion del perfil de acidificacion extracelular se lleva a cabo por la curva de acidificacion calibrada (Tabla 1).

La medicion de la actividad metabolica se lleva a cabo mediante el calculo de la acidificacion acumulada en relacion con los cambios del pH medidos por fluorescencia en el medio extracelular de las celulas (por ejemplo, pmol/pl/hora/2500 celulas) en el estado “abierto” y “cerrado”. Se apreciara que, de acuerdo con una realizacion espedfica, esta medicion se lleva a cabo solo en el entorno extracelular de la celula y no intracelularmente. La medicion del pH extracelular es ventajosa ya que en el entorno extracelular hay una acumulacion de acido persistente frente a unos cambios promedio relativamente pequenos en las respuestas intracelulares transitorias debido a la regulacion fisiologica homeostatica; no hay interferencia fisiologica de la sonda extracelular con los procesos intracelulares; hay una relacion comparativa alta de senal a ruido de la sonda fluorescente radiometrica extracelular; simplicidad de la preparacion del medio fluorescente (capacidad tamponante calibrada) frente a manipulaciones celulares; no hay fluorescencia de fondo en contraste con una fuga significativa en sondas intracelulares; las mediciones cineticas se realizan sin necesidad de procedimientos de permeabilizacion, permitiendo de este modo el analisis de celulas vivas, en tiempo real; hay un mmimo de problemas asociados con los efectos de inactivacion y oxidacion; y finalmente se permiten mediciones cineticas simultaneas de alto rendimiento sin los obstaculos anteriores.

Tal como se usa en el presente documento “un entorno extracelular” de la celula se refiere a un medio ambiente natural, por ejemplo, sangre o plasma, o un entorno artificial tal como un medio de cultivo.

De acuerdo con una realizacion espedfica, el ensayo de AM se efectua en una solucion definida (se conocen todos los componentes) que tiene una capacidad tamponante calibrada.

Se apreciara que la capacidad tamponante debe garantizar cambios menores en el pH fisiologico.

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De acuerdo con una realizacion espedfica, el tampon es un tampon fosfato (por ejemplo, tampon fosfato salino 1-10 mM o tampon fosfato 10 mM). Se apreciara que se requiere una baja concentracion de tampon para las mediciones de acidificacion a la baja concentracion celular. De acuerdo con una forma de realizacion se utiliza una solucion salina espedfica de tampon fosfato 10 mM para 2,5 x 106 celulas/ml.

Por lo tanto, la cinetica de la actividad metabolica se controla durante la incubacion por un proceso de acidificacion menor de una capacidad tamponante de HPTS calibrada por fluorescencia.

Las Figuras 3A-D y 4A-D describen la calibracion de la solucion de trabajo y la calibracion de la sonda, respectivamente.

De acuerdo con una realizacion espedfica, la medicion de los perfiles de acidificacion se realiza a una temperatura constante, por ejemplo, 20-40 °C o espedficamente, a la temperatura optima de crecimiento, digamos 37 °C para las celulas de mairnferos.

Como se ha descrito anteriormente en este documento, los perfiles de acidificacion extracelular son indicativos de la identidad de los diversos productos metabolicos secretados por la celula.

Como se muestra en Figuras 1, un tumor o tejido proliferativo (por ejemplo, celulas T activadas) utiliza preferentemente la glicolisis aerobica que se caracteriza principalmente por la secrecion de lactato al medio. En contraste, un tejido diferenciado empleara la fosforilacion oxidativa o la glicolisis anaerobica y por lo tanto secretara CO2 o lactato, dependiendo de la disponibilidad de oxfgeno, respectivamente.

De acuerdo con una realizacion espedfica, el perfil de acidificacion dependiente del tiempo debido a la secrecion de productos metabolicos solubles no volatiles, principalmente lactato, se lleva a cabo en una camara expuesta al aire. Bajo tales condiciones (“abierto”), existe una ventilacion de gas de CO2 y NH3, de modo que solo la produccion de lactato acido (incluyendo otros acidos organicos no volatiles) contribuye a la acumulacion de acido equivalente en cada pocillo.

De acuerdo con una realizacion espedfica, el perfil de acidificacion dependiente del tiempo debido a la secrecion de productos metabolicos solubles no volatiles y productos metabolicos solubles volatiles se efectua en una camara sellada al aire. En el estado hermeticamente sellado (“cerrado”), el CO2 y el NH3 reaccionan en equilibrio con el agua para formar acido carbonico e iones basicos de amonio. En este estado, sin embargo, el cation basico NH4 + titula el nivel de acidez producida tanto por los aniones de acido lactico como de acido carbonico alrededor de pH 7.

De acuerdo con una realizacion espedfica, la cinetica de acidificacion se mide en una secuencia de 30 minutos estados “abiertos” y “cerrados” al aire de la placa de multiples pocillos.

Por las tasas apropiadas (V), de la acidificacion (+) y valoracion basica (-), las tasas medidas totales de la acidificacion en estado abierto (Vabierto) y en estado cerrado (Vcerrado) se describen por las ecuaciones acopladas:

Vabierto = V (acido lactico).

Vcerrado = V(acido lactico) + V(acido carbonico) - V(base de amonio).

Usando esta configuracion, se calcula el perfil de acidificacion dependiente del tiempo debido a la secrecion de productos metabolicos solubles volatiles mediante la sustraccion de los perfiles de (ii) - (i).

La medicion de la cinetica de acidificacion extracelular se realiza utilizando una sonda impermeable a la membrana no toxica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, una sonda radiometrica de pH, una sonda de CO2, una sonda de NH3, una sonda de lactato y una combinacion de las mismas. De acuerdo con una realizacion espedfica se requiere la tecnica radiometrica para una alta sensibilidad en condiciones de pH tamponado.

Los ejemplos de sondas espedficas que se pueden utilizar de acuerdo con las presentes ensenanzas incluyen, pero no se limitan a, HPTS, CFDa y carboxi fluorescema. Dichas sondas estan disponibles en el mercado, tal como en Molecular Probes.

De acuerdo con una realizacion espedfica, la medicion de la acidificacion se efectua usando la sonda radiometrica de pH de acido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfonico (HPTS).

El HPTS es un indicador de pH impermeable a la membrana, rentable, no toxico, y altamente soluble en agua con un pKa de ~7,3 en tampones acuosos. El HPTS presenta un cambio de absorcion dependiente del pH, lo que permite mediciones radiometricas del pH en funcion de la relacion entre las intensidades de fluorescencia a 513 nm que se miden secuencialmente bajo excitacion a 455 nm y 403 nm. Este metodo es esencial para las presentes mediciones sensibles a pequenos cambios del pH en el intervalo fisiologico alrededor de pH 7.

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De acuerdo con una realizacion espedfica la sonda fluorescente esta unida a una nanopartmula, tal como nanosensores, a fin de ampliar el seguimiento optico espedfico radiometrica de diversos productos metabolicos: CO2, NH3, acido lactico etc. Las mediciones de fluorescencia intracelular son extremadamente utiles en la investigacion basica de los mecanismos fisiologicos de estimulacion, por ejemplo, para la movilizacion de calcio y la despolarizacion de la membrana. Sin embargo, bajo respuesta celular homeostatica, estas senales de estimulacion intracelulares se vuelven transitorias. Por lo tanto, se consideran mucho menos adecuadas para el seguimiento sensible de la estimulacion de PBL, en comparacion con la acidificacion extracelular acumulativa en curso que se registra en el ensayo de AM. Este seguimiento extracelular se puede facilitar mejor por la union de sondas opticas moleculares radiometricas a nanopartmulas. El seguimiento extracelular es biocompatible, se minimizan los efectos negativos comunes a las mediciones de sondas intracelulares, que senala la ventaja de los metodos extracelulares no solo en investigacion basica, sino tambien para diversas aplicaciones clmicas en diferentes tipos de celulas.

Los perfiles de acidificacion se presentan por la tasa de secrecion de equivalentes de H2O-H+, en unidades de picomol/jl/hora/2500 celulas (veanse Figuras 6-8, 13).

Como indicador de la actividad metabolica de la celula puede usarse cualquiera de los perfiles de acidificacion anteriores. Como alternativa, solo uno de los perfiles medidos es indicativo de la actividad metabolica de la celula.

Como se ha mencionado, la actividad metabolica de la celula se puede medir en celulas naive o celulas efectoras/activadas que han sido expuestas a diferentes concentraciones de un estimulante o un inhibidor.

Tal como se usa en el presente documento un “estimulante” o un “inhibidor” se refiere a una entidad que aumenta, reduce o modifica una ruta metabolica de una celula en respuesta al mismo.

Por ejemplo, si la celula es un linfocito, entonces el estimulante es un antfgeno que es reconocido por el TCR o BCR y da lugar a la expansion clonal o produccion de anticuerpos. Estimulantes o inhibidores espedficos se enumeran en la Tabla 1 a continuacion.

Tabla 1

Unidades: Concentracion Papel

jg/ml: 0,4-50 PHA-L es un potente mitogeno para los linfocitos H (PHA)

|jg/ml: 0,8-100 ConA es una lectina que se une a las glicoprotemas expresadas en la superficie de las celulas T, imitando de ese modo la activacion del receptor de la celula T que elude el requisito de senales co-estimuladoras. C (CONA)

ng/ml: 0,03-10 El miristato acetato de forbol (PMA) mimetiza el diacilglicerol y activa la protema quinasa C y por lo tanto, eventualmente, las celulas T. El PMA actua selectivamente sobre una subpoblacion de linfocitos T que tiene una alta afinidad por eritrocitos de oveja (SRBC) y es distinto del que responde a pHa. P (PMA)

ng/ml: 0,03-10 El lipopolisacarido (LPS) activa fuertemente los macrofagos, monocitos y celulas B. S(LPS)

jg/ml: 0,4-50 Linfocitos espedficos de la protema basica de mialina (MBP) (CD4, CD8, y celulas NK (CD56 + CD3-)) (26) M (MBP) (87- 99aa)

jg/ml: 0,08-1 Un antfgeno de tejido normal. Este peptido (H-Ala-Ala-Gly-lle-Gly- lle-Leu-Thr-Val-OH) es el epftopo inmunodominante reconocido por la mayona de linfocitos T citotoxicos (CTL) espedficos de melanoma. N (MelanA) (27-35aa)

jg/ml: 0,4-50 Un antfgeno espedfico de tejido de la prostata normal. Este peptido es reconocido por los linfocitos T citotoxicos (CTL). Se encuentra como marcador bioqmmico del cancer de prostata y cancer de mama. A (PSA) (146-154aa)

mM: 0,04-5 Se ha sabido durante muchos anos que linfocitos y macrofagos utilizan la glucosa a una tasa elevada, y hasta que se identifico la importancia del papel de la glutamina, la glucosa se considero el unico combustible utilizado para proporcionar energfa a las celulas del sistema inmunologico. G (glucosa)

mM: 0,03 -4 La glutamina se utiliza a altas tasas por celulas aisladas del sistema inmunologico. Es una fuente de energfa alternativa especialmente para celulas que tienen altas demandas de energfa. L (l- glutamina)

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: Inhibe la diana de mamffero de la via de rapamicina (mTOR) uniendo directamente el Complejo mTOR 1 (mTORCI). Un estudio reciente informa que la rapamicina podna ser R (rapamicina)

nM: o LO CD o' particularmente eficaz en el bloqueo de los linfocitos T y B activados. Otro estudio informa que promueve selectivamente la activacion y expansion de celulas T reguladoras altamente supresoras.

A continuacion se proporcionan otros ejemplos.

El estimulante o inhibidor puede ser una celula o un estimulante o un inhibidor asociado a celulas. Los ejemplos de celulas estimulantes incluyen, pero no se limitan a, leucocitos, celulas madre, plaquetas, globulos rojos de la sangre, bacterias y hongos. Un estimulante o inhibidor de celulas de este tipo puede referirse a una celula intacta o un fragmento de celula, por ejemplo, la membrana celular.

El uso de un estimulante de celulas espedficamente es ventajoso en reacciones de linfocitos mixtos (MLR) para su uso en aplicaciones de trasplante como para la prediccion del rechazo del injerto (compatibilidad de tejidos), prevenir o tratar la enfermedad injerto contra huesped o rechazo del injerto. En tal caso el estimulante es un linfocito que no es singenico con respecto a la celula.

Como alternativa, el estimulante o inhibidor puede estar libre de celulas tal como un antigeno libre de celulas (por ejemplo, antigeno soluble, virus, un fluido biologico celular). Los ejemplos espedficos de los estimulantes o inhibidores libres de celulas, incluyen, pero no se limitan a, metabolitos, nutrientes (por ejemplo, glucosa), mitogenos, peptidos, citoquinas, hormonas, vitaminas, farmacos, anticuerpos, neurotransmisores, antigenos espedficos de cancer y diversos antfgenos normales espedficos de tejidos asociados a enfermedades (TNA).

Los ejemplos espedficos de antfgenos restringidos por el MHC (peptidos) incluyen, pero no se limitan a CEA (antigeno carcinoembrionario), MUC-1, HER2, CD340, MAGE y prolactina (otros se listan en Renkvist et al. 2001 “A listing of human tumor antigens recognized by T cells”. Cancer Immunol. Immunotherapy 50:3-15.

El estimulante o inhibidor se pone en contacto con la celula a diversas concentraciones.

El estimulante o inhibidor se selecciona de acuerdo con la patologfa sospechada. Por ejemplo, en aplicaciones de fertilizacion in vitro se examina la AM en curso de las secreciones del embrion a su lfquido extracelular. Alternativa o adicionalmente, los perfiles de estimulacion de la AM de las PBL madre se examinan por estimulacion de las secreciones del embrion.

En los ensayos de deteccion, las celulas se ponen en contacto con una pluralidad de estimulantes o inhibidores, y los perfiles de acidificacion se supervisan de forma concomitante para cada reaccion de ese tipo.

Por lo tanto, el ensayo de AM, como se describe anteriormente se puede realizar en un numero limitado de muestras (por ejemplo, utilizando una placa de cultivo de tejido) o en una pluralidad de muestras, cribando la respuesta a una pluralidad de estimulantes/inhibidores o cribando una pluralidad de muestras de diferentes pacientes o una combinacion de los mismos. Se puede realizar el cribado de alto rendimiento usando una placa de multiples pocillos, un lector de placas de multiples pocillos (para la deteccion de la senal fluorescente), una camara cCd aplicando analisis de imagen o matrices de fibra optica.

De acuerdo con una forma de realizacion, los perfiles de acidificacion resultantes se registran y se almacenan en una base de datos tal como en un medio legible por ordenador a fin de permitir la manipulacion de datos y la construccion de modelos computacionales. Como se usa en este documento, “medio legible por ordenador” se refiere a cualquier medio que puede ser lefdo y con acceso directo con un ordenador. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, medios de almacenamiento magneticos, tales como disquetes, medios de almacenamiento de disco duro, y cinta magnetica; medios de almacenamiento optico tales como discos opticos o CD-ROM; medios de almacenamiento electricos tales como RAM y ROM; e hubridos de estas categonas tales como medios de almacenamiento magneto/opticos. La seleccion y el uso de los medios de almacenamiento adecuados se encuentran dentro de las capacidades de un experto en la tecnica.

Como se usa en este documento, “registro” se refiere a un proceso de almacenar informacion en un medio legible por ordenador.

La robustez y exactitud de la metodologfa actual sugiere su uso en numerosas aplicaciones clfnicas.

Asf, segun un aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para diagnosticar una enfermedad asociada con una actividad metabolica modificada en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el metodo:

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(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(iii) productos metabolicos solubles volatiles en los que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (i) se efectua en una camara expuesta al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (ii) se efectua en una camara sellada al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (iii) se realiza restando un perfil de acidificacion de dicho (i) de un perfil de acidificacion de dicho (ii), y ademas

El sujeto puede ser un animal sano o un sujeto humano sometido a un chequeo rutinario. Como alternativa, el sujeto puede estar en riesgo de tener una enfermedad asociada con una actividad metabolica modificada tal como cancer (por ejemplo, un sujeto predispuesto geneticamente, un sujeto con historial medico y/o familiares con cancer, un sujeto que ha sido expuesto a agentes carcinogenos, riesgo laboral, peligro ambiental) y/o un sujeto que muestra signos clmicos sospechosos de cancer [por ejemplo, sangre en las heces o melena, dolor inexplicable, sudoracion, fiebre inexplicada, perdida inexplicada de peso hasta anorexia, cambios en los habitos intestinales (estrenimiento y/o diarrea), tenesmo (sensacion de defecacion incompleta, para cancer rectal espedficamente), anemia y/o debilidad general].

Tal como se usa en el presente documento “una enfermedad asociada con una actividad metabolica modificada” se refiere a una enfermedad que se caracteriza por una poblacion celular que ha experimentado un cambio en la actividad metabolica en comparacion con una poblacion de celulas identicas tomada de una poblacion normal sana (no afectada con la enfermedad). Esa poblacion de celulas que ha experimentado un cambio en la actividad metabolica, puede ser una poblacion de celulas patogenas (es decir, celulas causantes de enfermedades, por ejemplo, celulas cancerosas) o una poblacion de celulas no patogenas (por ejemplo, celulas que combaten la enfermedad, por ejemplo, celulas inmunologicas tales como en el caso de tumor solido). Por ejemplo, como se describe anteriormente, en oncologfa, la mayona de las celulas cancerosas predominantemente y algunas poblaciones del sistema inmunologico que se someten a expansion clonal producen energfa por una alta tasa de glicolisis seguido por la produccion de acido lactico en el citosol, en lugar de por una tasa relativamente baja de glicolisis seguido de la oxidacion de piruvato en la mitocondria, como la mayona de las celulas normales (vease Figura 1).

Muestras biologicas celulares que pueden utilizarse de acuerdo con las presentes ensenanzas incluyen, pero no estan limitadas a, sangre (por ejemplo, leucocitos de sangre periferica, celulas mononucleares de sangre periferica, sangre completa, sangre del cordon umbilical), una biopsia de tejido solido, lfquido cefalorraqrndeo, orina, fluidos linfaticos y diversas secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lfquido sinovial, lfquido amniotico y vellosidades corionicas.

Las biopsias incluyen, pero no se limitan a, biopsias quirurgicas, incluyendo biopsia incisional o excisional, aspirados con aguja fina y similares, resecciones completas o fluidos corporales. Los metodos de recuperacion de la biopsia son bien conocidos en la tecnica.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “diagnosis” o “diagnostico” se refiere a determinar la presencia o ausencia de una patologfa (por ejemplo, una enfermedad, trastorno, condicion o smdrome), la clasificacion de una patologfa o un smtoma, la determinacion de la severidad de la patologfa, el seguimiento de la progresion de la patologfa, la prevision de un resultado de una patologfa y/o perspectivas de recuperacion y cribado de un sujeto para una enfermedad espedfica.

De acuerdo con las presentes ensenanzas los perfiles de acidificacion de una muestra normal sana (no afectada) de composicion de celulas identicas se determinan en condiciones identicas a las que fueron utilizadas para hacer el seguimiento de las celulas del sujeto.

Una vez se obtienen los perfiles de acidificacion (por ejemplo, con o sin estimulante/inhibidor), se registra(n) el perfil(es). Un desplazamiento (es decir, un cambio) en la actividad metabolica entre las celulas del sujeto y las del control (normal, no afectado), como se pone en evidencia a partir de los perfiles de acidificacion obtenidos en condiciones identicas, es indicativo de una enfermedad asociada con los perfiles de actividad metabolica modificada.

Los resultados del ensayo de la actividad metabolica pueden estar sujetos a los modelos de arboles de decision que clasifican los resultados y ayudan en el diagnostico final. De acuerdo con una realizacion preferida, se combinan al menos dos modelos (veanse las Figuras 9 y 10). Ejemplos de dichos modelos incluyen, pero no se limitan a, CHAID, C5 y C & R Tree. Ademas se puede aplicar el modelo logfstico.

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Los ejemplos de condiciones medicas que pueden ser diagnosticadas y tratadas (como se describe adicionalmente a continuacion) de acuerdo con las presentes ensenanzas incluyen, pero no se limitan a, cancer, infeccion por patogenos y enfermedades autoinmunes. Mas adelante se proporcionan ejemplos espedficos.

Enfermedades inflamatorias - incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias cronicas y las enfermedades inflamatorias agudas.

Enfermedades inflamatorias asociadas con la hipersensibilidad

Los ejemplos de hipersensibilidad incluyen, pero no se limitan a, hipersensibilidad de tipo I, hipersensibilidad de tipo II, hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad mediada por anticuerpos, hipersensibilidad mediada por complejos inmunes, hipersensibilidad mediada por linfocitos T y DTH.

Hipersensibilidad de tipo I o inmediata, tal como el asma.

La hipersensibilidad de tipo II hipersensibilidad incluye, pero no se limitan a, enfermedades reumatoides, enfermedades autoinmunes reumatoide, artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 jul; 15 (3): 791), espondilitis, espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189), enfermedades sistemicas, enfermedades autoinmunes sistemicas, lupus eritematoso sistemico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (1-2): 49), esclerosis, esclerosis sistemica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol 1999 mar; 6 (2): 156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 jun; 169: 107), enfermedades glandulares, enfermedades autoinmunes glandulares, enfermedades autoinmunes pancreaticas, diabetes, diabetes tipo I (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 oct; 34 Suppl: S125), enfermedades de la tiroides, enfermedades autoinmunes de la tiroides, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 jun; 29 (2): 339), tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontanea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol. 15 de dic de 2000; 165 (12): 7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho, 1999 Agos; 57 (8): 1810), mixedema, mixedema idiopatico (Mitsuma T. Nippon Rinsho, 1999 Agos; 57 (8): 1759); enfermedades reproductivas autoinmunes, enfermedades ovaricas, autoinmunidad ovarica (Garza KM et al., J Reprod Immunol 1998 feb; 37 (2): 87), infertilidad anti-esperma autoinmune (Diekman AB et al., Am J Reprod Immunol 2000 mar; 43 (3): 134), perdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl. 2: S107-9), enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neurologicas, enfermedades neurologicas autoinmunes, esclerosis multiple (Cross AH et al., J Neuroimmunol 2001 ene 1; 112 (1-2): 1), enfermedad de Alzheimer (Oron l. et al., J. Neural Transm Suppl 1997; 49: 77), miastenia gravis (Infante AJ y Kraig E., Int Rev Immunol 1999; 18 (12): 83), neuropaftas motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci 2000 mayo; 7 (3): 191), smdrome de Guillain-Barre, neuropaftas y neuropaftas autoinmunes (Kusunoki S. Am J Med Sci 2000 abr; 319 (4): 234), enfermedades miastenicas, smdrome miastenico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci 2000 abr; 319 (4): 204), enfermedades neurologicas paraneoplasicas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelosa paraneoplasica, smdrome del hombre ngido no paraneoplasico, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa progresiva, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrofica, corea de Sydeham, smdrome de Gilles de la Tourette, poliendocrinopatfas, poliendocrinopatfas autoinmunes (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (Pans) 2000); neuropaftas, neuropaftas disinmunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50: 419); neuromiotoma, neuromiotoma adquirida, artrogriposis multiple congenita (Vincent A. et al., Ann NY Acad Sci 13 de mayo de 1998; 841: 482), enfermedades cardiovasculares, enfermedades cardiovasculares autoinmunes, aterosclerosis (Matsuura E. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2: S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus 1998; 7 Suppl. 2: S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl. 2: S107-9), granulomatosis, granulomatosis de Wegener, arteritis, arteritis de Takayasu y smdrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 25 de agosto de 2000; 112 (15-16): 660); enfermedad autoinmune anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000; 26 (2): 157); vasculitis, vasculitis necrotizante de vasos pequenos, poliangitis microscopica, smdrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis, glomerulonefritis necrotizante focal pauci- inmune, glomerulonefritis semilunar (Noel LH Ann Med Interne (Pans) mayo de 2000; 151 (3): 178); smdrome antifosfolipfdico (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4): 171); insuficiencia cardfaca, anticuerpos p- adrenoceptores de tipo agonista en insuficiencia cardfaca (Wallukat G. et al., Am J Cardiol 17 jun 1999; 83 (12A): 75H), purpura trombocitopenica (Moccia F. Ann Ital Med Int 1999 abr-jun; 14 (2): 114); anemia hemolftica, anemia hemolftica autoinmune (Efremov DG et al., Leuk Lymphoma 1998 ene; 28 (3-4): 285), enfermedades gastrointestinales, enfermedades autoinmunes del tracto gastrointestinal, enfermedades intestinales, enfermedad intestinal inflamatoria cronica (Garda Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol 2000 ene; 23 (1): 16), enfermedad ceftaca (Landau YE y Shoenfeld Y. Harefuah 16 ene 2000; 138 (2): 122), enfermedades autoinmunes de la musculatura, miositis, miositis autoinmune, smdrome de Sjogren (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 sep; 123 (1): 92); enfermedad autoinmune del musculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 jun; 53 (5-6): 234), enfermedades hepaticas, enfermedades autoinmunes hepaticas, hepatitis autoinmune (Manns MP. J Hepatol 2000 agos; 33 (2): 326) y cirrosis biliar primaria (Strassburg CP et al., Eur J Gastroenterol Hepatol 1999 jun; 11 (6): 595).

La hipersensibilidad de tipo IV o mediada por celulas T, incluye, pero no se limita a, enfermedades reumatoides, artritis reumatoide (Tisch R, McDevitt HO Proc Natl Acad Sci EE. UU. 18 ene 1994; 91 (2): 437), enfermedades sistemicas, enfermedades autoinmunes sistemicas, lupus eritematoso sistemico (Datta SK, Lupus 1998; 7 (9): 591), enfermedades glandulares, enfermedades glandulares autoinmunes, enfermedades pancreaticas, enfermedades autoinmunes pancreaticas, diabetes de tipo 1 (Castano L. y Eisenbarth GS Ann Rev. Immunol 8:

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647); enfermedades de la tiroides, enfermedades autoinmunes de la tiroides, enfermedad de Graves (Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 mar; 92 (1): 77); enfermedades ovaricas (Garza KM et al., J Reprod Immunol 1998 feb; 37 (2): 87), prostatitis, prostatitis autoinmune (Alexander RB et al., Urology 1997 dic; 50 (6): 893), smdrome poliglandular, smdrome poliglandular autoinmune, smdrome poliglandular autoinmune de tipo I (Hara T. et al., Blood 1991 mar 1; 77 (5): 1127), enfermedades neurologicas, enfermedades neurologicas autoinmunes, esclerosis multiple, neuritis, neuritis optica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 mayo; 57 (5): 544), miastenia gravis (Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 dic; 20 (12): 2563), smdrome del hombre ngido (Hiemstra SA. et al., Proc Natl Acad Sci USA 27 mar 2001; 98 (7): 3988), enfermedades cardiovasculares, autoinmunidad cardfaca en la enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 oct 15; 98 (8): 1709), purpura trombocitopenica autoinmune (Semple JW et al., Blood 15 mayo 1996; 87 (10): 4245), autoinmunidad anti-linfocitos T ayudantes (Caporossi Ap et al., Viral Immunol 1998; 11 (1): 9), anemia hemolttica (Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 mar; 74 (3): (139), enfermedades hepaticas, enfermedades autoinmunes hepaticas, hepatitis, hepatitis activa cronica. Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 mar; 54 (3): 382), cirrosis biliar, cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) nov 1996; 91 (5): 551), enfermedades nefnticas, enfermedades nefnticas autoinmunes, nefritis, nefritis intersticial (Kelly CJ J Am Soc Nephrol 1990 agos; 1 (2): 140), enfermedades del tejido conectivo, enfermedades del ofdo, enfermedades autoinmunes del tejido conectivo, enfermedad autoinmune del ofdo (Yoo TJ et al., Cell Immunol agos 1994; 157 (1): 249), enfermedad del ofdo interno (Gloddek B. et al., Ann NY Acad Sci. 29 dic 1997; 830: 266), enfermedades de la piel, enfermedades cutaneas, enfermedades dermicas, enfermedades bullosas de la piel, penfigo vulgar, penfigoide bulloso y penfigo foliaceo.

Los ejemplos de hipersensibilidad de tipo retardado incluyen, pero no se limitan a, dermatitis de contacto y erupcion medicamentosa.

Ejemplos de tipos de linfocitos T que median hipersensibilidad incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T ayudantes y linfocitos T citotoxicos.

Ejemplos de hipersensibilidad mediada por linfocitos T ayudantes incluyen, pero no se limitan a, hipersensibilidad mediada por linfocitos Th1 e hipersensibilidad mediada por linfocitos Th2.

Enfermedades autoinmunes

Incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatoides, enfermedades glandulares, enfermedades gastrointestinales, enfermedades cutaneas, enfermedades hepaticas, enfermedades neurologicas, enfermedades musculares, enfermedades nefnticas, enfermedades relacionadas con la reproduccion, enfermedades del tejido conectivo y enfermedades sistemicas.

Ejemplos de enfermedades cardiovasculares autoinmunes incluyen, pero no se limitan a aterosclerosis (Matsuura E. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2: S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus 1998; 7 Suppl. 2: S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl. 2: S107-9), granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, smdrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr, 25 de agosto de 2000; 112 (15-16): 660), enfermedad autoinmune anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000; 26 (2): 157), vasculitis necrotizante de vasos pequenos, poliangitis microscopica, smdrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrotizante focal pauciinmune y semilunar (Noel LH. Ann Med Interne (Pans) mayo 2000; 151 (3): 178), smdrome antifosfolfpidos (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4): 171), insuficiencia cardfaca inducida por anticuerpos (Wallukat G. et al., Am J Cardiol 1999 jun 17; 83 (12A): 75H), purpura trombocitopenica (Moccia F. Ann Ital Med Int 1999 abr-jun; 14 (2): 114; Semple JW. et al., Blood 15 de mayo de 1996; 87 (10): (4245), anemia hemolftica autoinmune. Efremov DG et al., Leuk Lymphoma 1998 ene; 28 (3-4): 285; Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 mar; 74 (3): 139), autoinmunidad cardfaca en la enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 oct 15; 98 (8): 1709) y autoinmunidad anti- linfocitos T ayudantes (Caporossi AP et al., Viral Immunol 1998; 11 (1): 9).

Ejemplos de enfermedades autoinmunes reumatoides incluyen, pero no se limitan a artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 jul; 15 (3): 791; Tisch R, McDevitt HO Proc Natl Acad Sci units SA 18 ene 1994; 91 (2): 437) y espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189).

Ejemplos de enfermedades glandulares autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedad pancreatica, diabetes tipo I, enfermedad de la tiroides, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontanea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopatico, autoinmunidad ovarica, infertilidad anti-esperma autoinmune, prostatitis autoinmune I y smdrome poliglandular autoinmune de tipo I. Las enfermedades incluyen, pero no se limitan a enfermedades autoinmunes del pancreas, diabetes tipo 1 (Castano l. y Eisenbarth GS.; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 oct; 34 Supl: S125), enfermedades autoinmunes de la tiroides, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 jun; 29 (2): 339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 mar; 92 (1): 77), tiroiditis autoinmune espontanea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 15 dic 2000; 165 (12): 7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 agos; 57 (8): 1810), mixedema idiopatico (Mitsuma T. Nippon Rinsho 1999 agos; 57 (8): 1759), autoinmunidad ovarica (Garza KM et al., J Reprod Immunol 1998 feb; 37 (2): 87),

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infertilidad anti-esperma autoinmune (Diekman AB et al., Am J Reprod Immunol. 2000 mar; 43 (3): 134), prostatitis autoimmune (Alexander RB et al., Urology 1997 dic; 50 (6): 893) y smdrome poliglandular autoinmune de tipo I (Hara T. et al., Blood, 1 mar 1991; 77 (5): 1127).

Ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedades intestinales inflamatorias cronicas (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol 2000 ene; 23 (1): 16), enfermedad celfaca (Landau YE y Shoenfeld Y. Harefuah 16 Enero 2000; 138 (2): 122), colitis, ileitis y enfermedad de Crohn.

Ejemplos de enfermedades cutaneas autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedades ampollosas autoinmunes de la piel, tales como, pero que no se limitan a, penfigo vulgar, penfigoide ampollar y penfigo foliaceo.

Ejemplos de enfermedades hepaticas autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, hepatitis, hepatitis activa cronica autoinmune (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 mar; 54 (3): 382), cirrosis biliar primaria (Jones DE Clin Sci (Colch) 1996 nov; 91 (5): 551; Strassburg Cp et al., Eur J Gastroenterol Hepatol 1999 jun; 11 (6): 595) y hepatitis autoinmune (Manns MP J Hepatol 2000 agos; 33 (2): 326).

Los ejemplos de enfermedades neurologicas autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, esclerosis multiple (Cross AH et al., J Neuroimmunol 1 ene 2001; 112 (1-2): 1), enfermedad de Alzheimer (Oron l. et al., J. Neural Transm Suppl 1997; 49: 77), miastenia gravis (Infante AJ y Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2): 83; Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 dic; 20 (12): 2563), neuropatfas, neuropatias motoras (Kornberg AJ J Clin Neurosci, 2000 mayo; 7 (3): 191); smdrome y neuropatias autoinmunes de Guillain-Barre (Kusunoki S. Am J Med Sci 2000 abr; 319 (4): 234), miastenia, smdrome miastenico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci 2000 abr; 319 (4): 204); enfermedades neurologicas paraneoplasicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplasica y smdrome del hombre ngido (Hiemstra hS et al., Proc Natl Acad Sci units SA 27 mar 2001; 98 (7): 3988); smdrome no paraneoplasico del hombre ngido, atrofias progresivas del cerebelo, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrofica, corea de Sydeham, smdrome de Gilles de la Tourette y poliendocrinopatias autoinmunes (Antoine JC y Honnorat J. Rev Neurol (Pans) 2000 ene; 156 (1): 23); neuropatfas disinmunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50: 419); neuromiotoma adquirida, artrogriposis multiple congenita (Vincent A. et al., Ann NY Acad Sci, 13 mayo 1998, 841: 482), neuritis, neuritis optica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry mayo 1994; 57 (5): 544) y enfermedades neurodegenerativas.

Ejemplos de enfermedades musculares autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, miositis, miositis autoinmune y smdrome de Sjogren primario (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 sep; 123 (1): 92) y enfermedad autoinmune del musculo liso (Zauli. D. et al., Biomed Pharmacother 1999 jun; 53 (5-6): 234).

Ejemplos de enfermedades autoinmunes nefnticas incluyen, pero no se limitan a, nefritis y nefritis intersticial autoinmune (Kelly CJ J Am Soc Nephrol 1990 agos; 1 (2): 140).

Ejemplos de enfermedades autoinmunes relacionadas con la reproduccion incluyen, pero no se limitan a, perdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl. 2: S107-9).

Ejemplos de enfermedades autoinmunes del tejido conectivo incluyen, pero no se limitan a, enfermedades del ofdo, enfermedades autoinmunes del ofdo (Yoo tJ et al., Cell Immunol 1994 agos; 157 (1): 249) y enfermedades autoinmunes del ofdo interno (Gloddek B. et al., Ann NY Acad Sci 29 dic 1997; 830: 266).

Ejemplos de enfermedades sistemicas autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso sistemico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (1-2): 49) y esclerosis sistemica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn. Lab Immunol 1999 mar; 6 (2): 156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 jun; 169: 107).

Enfermedades infecciosas

Ejemplos de enfermedades infecciosas incluyen, pero no se limitan a, enfermedades infecciosas cronicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades vmcas, enfermedades bacterianas, enfermedades por protozoos, enfermedades parasitarias, enfermedades fungicas, enfermedades por micoplasma y enfermedades prionicas.

Enfermedades por rechazo de injertos

Los ejemplos de enfermedades asociadas con el trasplante de un injerto incluyen, pero no se limitan a, rechazo de injerto, rechazo de injerto cronico, rechazo de injerto subagudo, rechazo de injerto Imperagudo, rechazo de injerto agudo y enfermedad de injerto contra huesped.

Enfermedades alergicas

Ejemplos de enfermedades alergicas incluyen, pero no se limitan a, asma, urticaria, alergia al polen, alergia al acaro del polvo, alergia al veneno, alergia a cosmeticos, alergia al latex, alergia qmmica, alergia a medicamentos, alergia a

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picaduras de insectos, alergia a caspa animal, alergia a plantas, alergia a la hiedra venenosa y alergia a los alimentos.

De acuerdo con una realizacion espedfica, la enfermedad es el cancer.

Enfermedades cancerosas

Ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos particulares de enfermedades cancerosas, incluyen pero no se limitan a: leucemia mieloide tal como la leucemia mielogena cronica, leucemia mielogena aguda con maduracion, leucemia promielocftica aguda, leucemia no linfocftica aguda con un aumento de los basofilos, leucemia monodtica aguda, leucemia mielomonodtica aguda con eosinofilia; linfoma maligno, tal como de Birkitt no-Hodgkin; leucemia linfocftica, como la leucemia aguda linfoblastica, leucemia linfocftica cronica; enfermedades mieloproliferativas, tales como tumores solidos de meningioma benignos, tumores mixtos de glandula salival, adenomas de colon; adenocarcinomas, tales como el cancer de pulmon de celulas pequenas, de rinon, utero, prostata, vejiga, ovario, colon, sarcomas, liposarcoma, mixoide, sarcoma sinovial, rabdomiosarcoma (alveolar), condrosarcoma mixoide extraesqueletico, tumor de Ewing; otros incluyen disgerminoma testicular y ovarico, retinoblastoma, tumor de Wilms, neuroblastoma, melanoma maligno, mesotelioma, mama, piel, pancreas, cuello del utero, prostata y ovario.

Por lo tanto, las presentes ensenanzas pueden usarse en la deteccion de enfermedades. A continuacion se presenta una realizacion no limitante que se refiere a la deteccion precoz del cancer.

Las presentes ensenanzas proporcionan un enfoque basado en el sistema inmunologico como herramienta de diagnostico no invasiva para la deteccion precoz y la estadificacion del cancer. Los enfoques de diagnostico convencionales se centran principalmente en la patologfa de los tejidos malignos y en antfgenos y genes espedficos del cancer. Por el contrario, las presentes ensenanzas se centran en respuestas normales frente a respuestas anormales del sistema inmunologico como herramienta disponible naturalmente para la deteccion precoz y la estadificacion del cancer (asf como de otras enfermedades). Por lo tanto, las presentes ensenanzas proporcionan un ensayo de sangre fisiologica funcional de alto rendimiento mediante la medicion de perfiles de estimulacion de la actividad metabolica de PBL (MASP) del sistema inmunologico en respuesta a un amplio espectro de estimulantes/inhibidores a diferentes concentraciones (metabolitos, nutrientes, mitogenos, peptidos naturales y sinteticos, citoquinas, hormonas, vitaminas, farmacos, anticuerpos, neurotransmisores, antfgenos espedficos de cancer y diversos antfgenos normales espedficos de tejidos (TNA) asociados a la enfermedad). Se anticipan efectos relativamente pequenos por puntos de vista convencionales de respuestas inmunologicas, incluso en la “expansion clonal” de subpoblaciones efectoras de PBL. Sin embargo, en terminos de “biologfa de sistemas”, se puede amplificar una respuesta de un subgrupo menor mediante la estimulacion de toda la red. Se sugiere que el sistema inmunologico combate el cancer por su funcion regular al detectar altos niveles anormales de TNA. La actividad metabolica de PBL tambien se puede utilizar para el diagnostico de las fases avanzadas del desarrollo del cancer. En la etapa de tumor local, la respuesta de muerte eficaz del sistema inmunologico ya esta limitada, siendo incapaz de destruir el tejido tumoral, aunque se observan linfocitos espedficos infiltrantes de tumor (TIL). Sin embargo, en esta etapa dichos linfocitos T circulantes todavfa podnan ser responsables de la muerte de celulas cancerosas circulantes separadas. El cambio de un tumor local a una fase metastasica apunta a un fallo espedfico completo del sistema inmunologico, y esta transicion se puede medir por cambios caractensticos en los perfiles de estimulacion de la AM.

El diagnostico de la enfermedad realizado de acuerdo con las presentes ensenanzas va seguido por la justificacion de los resultados del cribado utilizando metodos de criterios de referencia. Una vez establecido el diagnostico, ya sea basandose en las presentes ensenanzas o justificandolo con metodos del criterio de referencia oro, el sujeto es informado del diagnostico y tratado segun sea necesario.

Se apreciara que las presentes ensenanzas tienen una variedad de aplicaciones relativas a la optimizacion individual del tratamiento de la enfermedad, el seguimiento del tratamiento de la enfermedad en un sujeto, la determinacion de un tratamiento para un sujeto y la identificacion de un agente capaz de tratar una enfermedad asociada con la actividad metabolica anormal.

De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para optimizar individualmente el tratamiento de la enfermedad, comprendiendo el metodo:

(b) medir de manera independiente en un ambiente extracelular de la celula los perfiles de acidificacion

dependientes del tiempo debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(iii) productos metabolicos solubles volatiles en los que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (i)

se efectua en una camara expuesta al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (ii)

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se efectua en una camara sellada al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (iii) se realiza restando un perfil de acidificacion de dicho (i) de un perfil de acidificacion de dicho (ii), y ademas en el que al menos uno de los perfiles de acidificacion dependiente del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de la celula y mientras que un cambio en la actividad metabolica de la celula hacia la de una muestra celular sana normal examinada en condiciones identicas es indicativo de un medicamento eficaz para la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento “optimizar el tratamiento individualmente” se refiere a un metodo ex vivo de adaptacion del regimen de tratamiento (por ejemplo, el tipo de medicamento, la dosis).

Tal como se usa en el presente documento un “medicamento” se refiere a una formulacion de una medicina, farmaco medicinal o medicacion, como se utiliza en el presente documento de forma intercambiable. Ejemplos de medicamentos, incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia, antibioticos, antiparasitarios, antivirales y similares.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “poner en contacto” se refiere a llevar el medicamento a las proximidades de una celula en condiciones tales que el medicamento entre en contacto con la membrana celular y si es necesario se internalice en ella. Asf, por ejemplo, el contacto debe efectuarse bajo condiciones de tampon, a una temperatura y un tiempo suficientes para permitir que el medicamento afecte al fenotipo celular (por ejemplo, efecto citotoxico o citostatico). El contacto se efectua in vitro o ex vivo. La puesta en contacto puede efectuarse en un recipiente que tambien es capaz de detectar el producto de la reaccion enzimatica (es decir, en una celda electroqmmica), de manera que se detecta la senal electrica en lmea. Tales recipientes se describen adicionalmente en este documento a continuacion. Como alternativa, la puesta en contacto puede efectuarse en un recipiente separado donde se lleva a cabo la deteccion de tal manera que es posible retirar continuamente muestras en puntos de tiempo particulares y poner tales muestras dentro de las celulas electroqmmicas. Por lo tanto, la puesta en contacto puede efectuarse en un tubo de ensayo, matraz, cultivo de tejidos, chip, matriz, placa, microplaca, capilar, o similar. Las celulas se pueden poner en una placa de vibracion despues de la adicion del sustrato para la mezcla completa y continua de los contenidos de las celulas.

De acuerdo con una realizacion espedfica, “un cambio en la actividad metabolica de la celula hacia la de una muestra celular sana normal examinada en condiciones identicas” se refiere a al menos un 10 % de desplazamiento local o global (a lo largo del perfil) preferentemente hacia una identidad del 100 % a la muestra de celulas de control normales sanas.

Un cambio mas alla de un umbral predeterminado tal como sera determinado por el experto en la materia es indicativo de un tratamiento eficaz.

Del mismo modo, se proporciona un metodo de seguimiento del tratamiento de la enfermedad en un sujeto, comprendiendo el metodo:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que al menos uno de los perfiles de acidificacion dependiente del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de la celula y mientras que un cambio en la actividad metabolica de las celulas hacia la de una muestra celular sana normal examinada en condiciones identicas es indicativo de un tratamiento eficaz de la enfermedad. Por ejemplo, se sugiere que en la fase metastasica el perfil de AM podna retroceder proximo al perfil normal.

Del mismo modo, se proporciona un metodo de identificacion de un agente capaz de alterar una actividad metabolica de las celulas, comprendiendo el metodo:

(a) someter las celulas a un agente;

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “agente” se refiere a una composicion de ensayo que comprende un agente biologico o un agente qrnmico

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Ejemplos de agentes biologicos que se pueden analizar como posibles moduladores de la actividad metabolica de acuerdo con el metodo de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, acidos nucleicos, por ejemplo, polinucleotidos, ribozimas, ARNsi y moleculas antisentido (incluyendo, sin limitacion, ARN, ADN, hubridos de ARN/ADN, acidos nucleicos peptidicos, y analogos de polinucleotidos que tienen alterada la estructuras de cadena principal u otras modificaciones qmmicas); protemas, polipeptidos (por ejemplo, peptidos), hidratos de carbono, ifpidos y farmacos candidatos a “molecula pequena”. Las “moleculas pequenas” pueden ser, por ejemplo, compuestos de origen natural (por ejemplo, compuestos derivados de extractos de plantas, caldos microbianos, y similares) o compuestos organicos u organometalicos sinteticos que tienen pesos moleculares de menos de aproximadamente 10.000 Dalton, preferentemente menos de aproximadamente 5000 Dalton, y lo mas preferentemente menos de aproximadamente 1500 Dalton.

Segun una realizacion preferida de este aspecto de la presente invencion los agentes son anti-cancengenos, agentes anti-virales o antibioticos.

Ejemplos de las condiciones que se pueden analizar como posibles agentes anti-cancengenos de acuerdo con el metodo de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, exposicion a la radiacion (como por ejemplo, radiacion gamma, radiacion UV, radiacion X).

Se apreciara que el desplazamiento, como se usa en el presente documento, tambien puede ser un nivel diferente (por ejemplo, nivel superior) de AM en el mismo perfil; un cambio en el estado basal, y/o un cambio en la concentracion del agente que induce el maximo efecto de AM.

Una vez se ha identificado un agente capaz de alterar una actividad metabolica de las celulas de acuerdo con las ensenanzas anteriores, la invencion comprende ademas la smtesis del agente o su purificacion a partir de una fuente natural.

Como se usa en el presente documento el termino “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.

Los terminos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “incluyendo pero no limitado a”.

El termino “que consiste en” significa “que incluye y limitado a”.

El termino “que consiste esencialmente en” significa que la composicion, metodo o estructura pueden incluir ingredientes, pasos y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, pasos y/o partes adicionales no alteran materialmente las caractensticas basicas y novedosas de la composicion, metodo o estructura reivindicada por la invencion.

Como se usa en el presente documento, la forma singular “un”, “una” y “el/la” incluyen las referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el termino “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, diversas realizaciones de esta invencion pueden presentarse en formato de intervalo. Debe entenderse que la descripcion en formato de intervalo es meramente en aras de la conveniencia y la brevedad, y no debe interpretarse como una limitacion inflexible sobre el alcance de la invencion. En consecuencia, la descripcion de un intervalo debe considerarse que desvela espedficamente todos los posibles subintervalos, asf como valores numericos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripcion de un intervalo tal como de 1 a 6 se debe considerar que tienen subintervalos descritos espedficamente tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., asf como numeros individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Siempre que en el presente documento se indique un intervalo numerico, se entiende que incluye cualquier numeral citado (fraccionado o integral) dentro del intervalo indicado. Las frases “que oscila/oscila entre” un primer numero indicado y un segundo numero indicado y “que oscila/oscila entre” un primer numero indicado “y” un segundo numero indicado se usa en este documento de forma intercambiable y se entiende que incluyen el primer y segundo numeros indicados y todos los numeros fraccionarios e integrales entre los mismos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “metodo” se refiere a las maneras, medios, tecnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada incluyendo, pero no limitados a, aquellas maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos, o facilmente desarrollados a partir de maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las artes qmmicas, farmacologicas, biologicas, bioqmmicas y medicas.

Se debe apreciar que ciertas caractensticas de la invencion, que para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, tambien pueden proporcionarse en combinacion en una unica realizacion. A la inversa, diversas caractensticas de la invencion, que por brevedad, se describen en el contexto de una unica realizacion,

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tambien pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinacion adecuada o como sea adecuado en cualquier otra forma de realizacion descrita de la invencion. Ciertas caractensticas que se describen en el contexto de diversas realizaciones no han de considerarse caractensticas esenciales de estas formas de realizacion, a menos que la realizacion sea inviable sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invencion como se han delineado en el presente documento anteriormente y como se reivindica en la seccion de reivindicaciones a continuacion encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invencion de una manera no limitante.

En general, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invencion incluyen tecnicas moleculares, bioqmmicas, microbiologicas y de ADN recombinante. Tales tecnicas se explican a fondo en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumenes I-III Ausubel, RM, ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 14, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologfas como se establecen en las patentes de Estados Unidos n.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumenes I-III Cellis, JE, ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumenes I-III Coligan JE, ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a Edicion), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, WH Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliograffa de patentes y cienfffica, vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic); “Transcription and Translation” Hames, B. D., y Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento, se cree que los procedimientos son bien conocidos en la tecnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.

Ejemplo 1

Procedimientos experimentales

A. Requisitos de los donantes de sangre y extraccion de sangre por expertos medicos

Las muestras de sangre se recogieron en Vacutubes de 9 ml con EDTA (Greiner Bio-One 455036). El estudio fue aprobado por las juntas de revision institucional en el Centro Medico Sheba (Ramat Gan Israel) y el Ministerio de Salud de Israel, (Numero de aprobacion de Helsinki 7780-10-SMC).

B. Recoleccion de informacion demografica y clmica del donante

Para la proteccion de la confidencialidad, todas las muestras de sangre recogidas se marcaron y codificaron inmediatamente para su utilizacion en los registros de base de datos y analisis de diagnostico.

Los resultados del ensayo de AM se recogieron de 42 donantes sanos y 25 pacientes de cancer de 22 a 81 anos de edad (Tabla 2). Los donantes sanos son una poblacion mixta que incluye casos tratados de presion arterial alta, niveles altos de colesterol, gripe leve e inflamacion.

Tabla 2 - Caractensticas clmicas de los pacientes con cancer: ac - adencocarcinoma, idc - carcinoma ductal invasivo, gej - union gastroesofagica, NSCLC - Carcinoma de pulmon de celulas no pequenas

Fase tumoral: Tipo de tumor Genero Edad Numero de pacientes

1: idc de mama Mujer 53
1

1: idc de mama Mujer 64 2

2: idc de mama Hombre 63 3

2: idc de mama Mujer 37 4

2: idc de mama Mujer 61 5

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Fase tumoral: Tipo de tumor Genero Edad Numero de pacientes

2: idc de mama Muier 38 6

2: idc de mama Muier 65 7

3: idc de mama Mujer 32 8

3: idc de mama Mujer 42 9

3: ac de NSCLC Hombre 46 10

4: ac de NSCLC Hombre 61 11

4: ac de NSCLC Mujer 60 12

4: ac de NSCLC Hombre 81 13

4: ac de colon Mujer 70 14

4: Colon Mujer 49 15

2: ac de colon Mujer 56 16

2: ac de recto Mujer 52 17

4: ac de recto Hombre 74 18

3: ac gastrico Hombre 47 19

4: gej gastrico Hombre 64 20

3: Pancreas Mujer 57 21

4: Pancreas Hombre 58 22

4: Prostata Hombre 77 23

1: Tiroides Mujer 54 24

2: Cervix Mujer 35 25

C. Transporte de las muestras de sangre

Se toman medidas para mantener la viabilidad de las celulas sangumeas en condiciones termicas (refrigeracion termoelectrico (hasta 10 °C -18 °C) y agitando suavemente hasta la separacion de las CMSP.

Di. Separacion de celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP)

Celulas mononucleares de sangre periferica frescas (CMSP) se aislaron por Ficoll-Paque (UNI-SEP Novamed) y centrifugacion en gradiente. El sedimento se resuspendio en solucion de trabajo (ST) (PBS con calcio y magnesio), incluyendo la sonda fluorescente (HPTS) a una concentracion final de 5 x 106 celulas/ml.

D2. Mediciones paralelas de alto rendimiento del ensayo de AM

Cada pocillo en una placa negra de 384 pocillos no adherente y de bajo volumen (Greiner Bio-One) se cargo con 10 |jl de la solucion de CMSP y 10 jl de solucion de trabajo, ademas de HPTS que incluye uno de los diez reactivos en 8 concentraciones crecientes. Por lo tanto la concentracion final de la sonda en cada pocillo fue de 1 jM, y la concentracion final de la CMSP fue 2,5 x 106 celulas/ml en solucion de trabajo fisiologico 20 jl que contiene tampon fosfato 10 mM aproximadamente a pH 7,3. Teniendo en cuenta la concentracion media de CMSP en la sangre periferica de adultos se selecciono una concentracion de trabajo de 2,5 x 106 celulas/ml. Se considera esta concentracion de CMSP para asegurar dos aspectos: en primer lugar, para obtener una relacion razonable de senal a ruido debido a la acumulacion del producto durante al menos 1 hora, y segundo, para permitir la interaccion intercelular. El mismo protocolo de carga de 10 jl se llevo a cabo al menos por triplicado, primero en las muestras de CMSP y a continuacion en los reactivos, a fin de obtener con precision el volumen final de 20 jl en la concentracion requerida en cada pocillo. Ademas, en cada ensayo se incluyeron dos tipos de controles: uno que incluye solamente la sonda (1 jM), sin celulas y sin los estimulantes en 8 pocillos; el otro que incluye solo celulas sin estimulante, el estado basal, en 8 pocillos. El proceso de acidificacion se controlo cada 5 min durante 1 hora de incubacion a 37 °C con un escaner de fluorescencia comercial (TECAN Infinite M200). En primer lugar, el escaner controla el proceso de acidificacion sin sellar (modo “ABIERTO”) durante 30 min (6 ciclos) y a continuacion, para evitar la ventilacion de CO2 y NH3 de cada pocillo, la placa de multiples pocillos se sello hermeticamente (ThermalSeal RT™, (modo “CERRADO”) EXCEL Scientific, Inc.). A continuacion, el proceso de acidificacion se controlo de nuevo durante 30 min (6 ciclos). Con el fin de aumentar la relacion de senal a ruido, las intensidades de fluorescencia a 513 nm se midieron secuencialmente bajo excitacion a 455 nm y 403 nm por pocillo.

D3. Tipo, espectro y preparacion de los reactivos

En cada ensayo, los perfiles de actividad metabolica de las CMSP se controlaron en el estado basal y bajo la influencia de los siguientes diez reactivos diluidos en solucion de trabajo en 8 concentraciones diferentes: PHA, CONA, PMA, LPS, MBP (28), MelanA, PSA (29), glucosa (24), L-glutamina y rapamicina (Strauss L, Czystowska M, Szajnik M, Mandapathil M, y Whiteside TL (2009) Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One 4(6):e5994). La seleccion de reactivos se realizo por su relacion con el sistema inmunologico (Tabla 1, mas arriba, nota, las concentraciones no estan limitadas a las de la tabla, concentracion = 0 a dosis no toxica).

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Se debe mencionar que otros reactivos estan bajo calibracion, por ejemplo: (hormonas tales como el estradiol, antigenos espedficos de cancer tales como el antigeno carcinoembrionario (CEA), citocinas y quimiocinas tales como IL-2, vitaminas, hormonas, farmacos, anticuerpos del sistema inmunologico, neurotransmisores, diferentes peptidos del cancer y virus espedficos o sus fragmentos tales como papilomavirus humano (HPV) (datos no mostrados).

D4. Medicion radiometrica de la sonda fluorescente sensible al pH y calibracion de la acidez de la ST La sonda utilizada en este ensayo es acido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfonico (HPTS).

Con el fin de cuantificar la sensibilidad de la sonda, se diluyo una solucion madre de HPTS en agua hasta una concentracion de 100 pM y a continuacion a una concentracion final de 1 pM y 10 pM. La calibracion de la acidez de la ST se realizo para dos concentraciones de tampon: la ST (tampon fosfato 10 mM) y la ST diluida 5 veces por solucion salina (tampon fosfato 2 mM) (Figuras 3A-D, Figuras 4A-B).

La curva de calibracion final usada en el ensayo de AM se realizo por medio de mediciones del electrodo de vidrio del pH de valoracion secuencial de la ST (que contiene 2 pM de HPTS). Las mediciones del pH y las mediciones de la fluorescencia de las muestras tituladas se llevan a cabo a 37 °C. Las muestras se cargan en una placa de multiples pocillos y las intensidades de fluorescencia bajo EX403 nm y EX455 nm se miden a 513 nm utilizando el escaner de fluorescencia.

Para los estados “abierto” y “cerrado”, se construye una curva de calibracion polinomica (Figuras 3C-D), que permite medir los valores de pH y equivalentes de acidificacion acumulados en funcion de la relacion entre las intensidades de fluorescencia medidas a 513 nm, bajo excitaciones a 403 nm y 455 nm, respectivamente.

Las ecuaciones obtenidas se utilizaron para el analisis de cada nuevo donante (Tabla 3, a continuacion).

TABLA 3 - Ecuaciones obtenidas a partir de las curvas de calibracion finales:

X = intensidad de fluorescencia a Ex. 403 nm/intensidad de fluorescencia a Ex. 455 nm

: ph HCI ( pMol/ml)

Abierto: Y = 0,011X4 - 0,136X3 + 0,641X2 - 1,528X + 8,266 Y = 0,006X4 +'0,129X3 - 0,982X2 + 3,971X - 2,276

Cerrado: Y = 0,013X4 - 0,164X3 + 0,747X2 - 1,723X + 8,415 Y = -0,006X4 + 0,131X3 - 1,011X2 + 4,168X -2,581

E. Analisis de datos

La computacion, el analisis y la minena de datos (Nisbet R, IV JE, & Miner G (2009) Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications) se realizaron usando el siguiente paquete estadfstico; Excel 2007, OriginPro 8, SAS Edicion 9.2, el cliente de iBm PASW Modular 13.0 (formalmente llamada Clementine, parte de SPSS). Los resultados en las Figuras 6A-C-8A-D, 13 se expresan como medias ± error tfpico de la media. La significacion estadfstica entre los pacientes sanos y con cancer para los modelos variantes se calculo usando chi-cuadrado. Los resultados se consideraron estadfsticamente diferentes cuando p <0,05.

Analisis de los datos del donante (que se resumen en diagrama de flujo del marco de pruebas de AM - Figura 12) Preparacion de datos

Etapa 0: Procesamiento y normalizacion de los datos del donante

Los datos en bruto de cada registro (donante) se procesaron para dar los resultados en terminos de la velocidad de acidificacion de la actividad metabolica en unidades de pmoles H+/pl/hora/2500 CMSP.

Pre-procesamiento - Etapa 1a: Analisis de la sonda y la normalizacion de los datos del donante

Con el fin de mejorar la relacion de senal a ruido, el analisis de la sonda se realizo mediante la realizacion del analisis de agrupamiento de medias k de todas las observaciones (n = 730) recogidas de todos los donantes (Figuras 5A-D). Estos resultados procesados se normalizaron restando los valores de los donantes de los valores medios de HPTS despues de la eliminacion de los valores atfpicos de la sonda (no se eliminaron mas del 5 % de los resultados).

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Pre-procesamiento - Etapa 1b: Valores atipicos excluidos en los datos del donante

La normalizacion de los valores “CERRADO” y “ABIERTO” por los valores medios de “ABIERTO” y “CERRADO” para cada combinacion de donante, dosis y estimulante. Las observaciones con puntuacion estandar > | 1,7 | se descartaron (1,77 % de los resultados).

Preparacion de datos - Etapa 1c: Representacion de los resultados de la actividad metabolica de los donantes

Despues de eliminar los valores atipicos en cada donante, se calcularon por separado los valores medios de “ABIERTO” y “CERRADO” para cada donante basado en el promedio de los resultados al menos por triplicado para cada dosis y cada reactivo por donante. Estos resultados se usan mas tarde como representacion de la actividad metabolica de los donantes para cada reactivo y dosis. Los resultados se representan en graficos 2D y graficos 3D y se actualizaran automaticamente con cada donante.

Busqueda del modelo de clasificacion - Etapa 2: Algoritmo de mineria de datos

Dado que la mayoria de los pacientes con cancer estudiados teman mas de 39 anos y con el fin de minimizar tanto como sea posible el efecto de la edad, se sometieron a ensayo y se analizaron dos cohortes de donantes de sangre, incluyendo hombres y mujeres. La primera cohorte incluye donantes con una edad por encima de 40 (n = 42 (21 donantes sanos y 21 pacientes con cancer)) y la segunda cohorte incluye el conjunto completo de los donantes (n = 67 (42 donantes sanos y 25 pacientes con cancer)) de 22 -81 anos de edad. Para la clasificacion de la etapa de 3 resultada en un conjunto de algoritmos de una familia de induccion de arboles/regla de decision (C5, CART, CHAID, REGLA DE ASOCIACION) y se utilizo el modelo lineal log (Regresion logfstica). Se utilizaron metodos de analisis exploratorios para investigar conexiones ocultas y no ocultas en los datos.

Evaluacion del modelo - Etapa 3: Construccion y clasificacion del modelo

Para la clasificacion de los donantes en pacientes sanos y con cancer, se utilizo un conjunto de la familia de diez modelos diferentes, incluyendo mineria de datos, aprendizaje automatico y modelos estadfsticos aplicando el software de SAS 9.3 y Clementine (v13.0). Con el fin de evaluar y comparar el rendimiento de los modelos, se decidio utilizar el metodo grafico que se basa en las tablas de ganancia acumulada producido por el software Clementine (v13.0) (Figuras 9A-D).

Modelos predictivos - Etapa 4: Evaluacion utilizando un conjunto de validacion del 30 % de los donantes de sangre

Datos como se describe en la etapa 3 se repartieron al azar en dos grupos de “Formacion” y “Ensayo” utilizando el software Clementine (v13.0). El “conjunto de formacion” se utiliza para construir el modelo de mineria de datos e incluye el 70 % de los donantes. El 30 % restante de los donantes se utilizara para evaluar el resultado de la clasificacion en el conjunto de “Ensayo” utilizando los modelos que se han generado en el conjunto de Formacion (Figuras 10A-D).

Todo el proceso de analisis de datos se resume en el Diagrama de flujo del protocolo de ensayo de AM y marco de analisis (Figura 12).

Ejemplo 2

Diseno y caracteristicas del ensayo de AM

Celulas mononucleares de sangre periferica frescas (CMSPh) se aislaron por Ficoll-Paque y centrifugacion en gradiente de 42 donantes sanos y 25 pacientes con cancer (Tabla 2, mas arriba). Para cada muestra de sangre, una placa de 384 pocillos se cargo con 20 pl que contema solucion de trabajo fisiologico a tampon 10 mM alrededor de pH 7,3, las CMSPh a una concentracion final de ~2,5 x 106 celulas/ml, sonda de pH 1 pM (HPTS), y uno de los diez reactivos estimulantes en ocho concentraciones crecientes (Tabla 3, mas arriba). El ensayo de AM se lleva a cabo utilizando un escaner de fluorescencia comercial. Los perfiles cineticos de acidez extracelular se midieron en estados al aire libre (“ABIERTO”) o cerrados hermeticamente (“CERRADO”). Ambos registros permiten medir las acumulaciones en tiempo real de productos metabolicos 'solubles' frente a 'volatiles' (acido lactico frente a CO2 y NH3), diferenciando de esta manera entre la fosforilacion oxidativa, la glicolisis anaerobica y la glicolisis aerobica (“efecto Warburg”) (Vander Heiden MG, Cantley LC, & Thompson CB (2009) Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science 324(5930):1029-1033). Los perfiles de la tasa de AM se calcularon y se examinaron para el diagnostico del cancer por analisis dinamico en lmea, incluyendo las herramientas de mineria de datos (Figura 12).

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Ejemplo 3

Medicion del pH extracelular por fluorescencia radiometrica y calibracion de la acidez

La sonda de pH molecular radiometrica no toxica impermeable a la membrana utilizada en el presente ensayo de AM es el acido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfonico (HPTs) (Hakonen A & Hulth S (2008) A high-precision ratiometric fluorosensor for pH: implementing time-dependent non-linear calibration protocols for drift compensation. Anal Chim Acta 606(1):63-71; Han J & Burgess K (Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev 110(5):2709-2728) with a pKa of ~7.3 in aqueous physiological buffers. Es bien conocido por su baja toxicidad, a partir de mediciones del pH intracelular en muchos tipos de celulas, incluso con incubacion durante la noche a 2 mM (Overly CC, Lee KD, Berthiaume E, & Hollenbeck PJ (1995) Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A 92(8):3156-3160). EN este caso, el HPTS es bastante utilizado para mediciones de pH extracelulares, a una baja concentracion de 1 jM, que ademas asegura su no toxicidad. Se construyeron curvas de calibracion polinomicas para los estados “ABlERTO” y “CERRADO”, (Figuras 3A-D), lo que permite medir los valores de pH y equivalentes de acidificacion acumulados como una funcion de la relacion entre las intensidades de fluorescencia medidas a 513 nm, bajo excitaciones a 403 nm y 455 nm, respectivamente. Las curvas de calibracion de acidificacion se obtuvieron para la solucion de trabajo (ST) y para la ST diluida 5 veces con solucion salina (tampon fosfato 10 mM y 2 mM, respectivamente) (Figuras 3A- D). Como era de esperar, esta Figura verifica que la capacidad del tampon 10 mM permite aproximadamente cinco veces los valores de acidificacion en comparacion con la de la capacidad del tampon 2 mM, dentro del mismo rango de cambios de pH. Estos resultados indican acerca de la sensibilidad adecuada a la acidificacion dentro del intervalo de pH fisiologico de 6,5 a 7,5. Otros resultados indican que el metodo de medicion es independiente de la concentracion de la sonda fluorescente entre 1-10 pM. El sistema es lo suficientemente sensible para proporcionar una alta relacion de senal a ruido cuando la concentracion final extracelular de HPTS es de solo 1 jM (Figuras 4A- B).

Las ecuaciones obtenidas a partir de las curvas de calibracion final (Figuras 3A-D, Tabla 4) se utilizaron para el analisis cuantitativo de cambios medidos significativas en registros de actividad metabolica de CMSP de los 67 donantes (42 sanos y 25 pacientes con cancer).

Ejemplo 4

Mejora de senal a ruido por analisis de agrupamiento de medios k dinamicos del fondo de HPTS

Con el objetivo de la evaluacion clmica dinamica de los resultados del ensayo de AM, se desarrollo un metodo fiable que compara cualquier ensayo de AM para cada donante con ensayos anteriores con respecto a los valores de la tasa de referencia de la senal de HPTS (n = 730 observaciones). Con esta coleccion de datos es posible mejorar la relacion de senal a ruido del ensayo de AM mediante el filtrado de resultados de referencia excepcionales. Para ese fin se aplico el analisis de agrupamiento de medios k (Nisbet R, IV JE, & Miner G (2009) Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications) por la acumulacion de valores de la tasa normalizada de la sonda HPTS. En cada ensayo se examinaron al menos ocho pocillos de control, que contienen HPTS 1 jM en la solucion de trabajo, sin celulas y sin estimulantes. Cada valor se normalizo teniendo en cuenta las observaciones acumuladas usando una puntuacion estandar. La Figura 5A presenta la distribucion de las puntuaciones estandar para valores de tasa “ABIERTA” y “CERRADA” de todos los ensayos de AM. Por analisis de agrupamiento de medios k se obtuvieron 26 grupos (Figura 5B), donde cada observacion pertenece al grupo con la media mas cercana. Los resultados reportados en la Figura 5D evaluan el funcionamiento estable de la sonda. De todos los resultados de referencia de HPTS (n = 730) solo 5 grupos (4,66 %) fueron descartados. Los 21 grupos restantes (95,34 %) fueron finalmente considerados para componer el intervalo de referencia normal. Los valores medios de los estados “ABlERTO” y los valores medios “CERRADOS” se volvieron a calcular para cada donante. El analisis de agrupamiento de medios k nos permite extraer de la sonda la senal de la tasa de fondo a partir de los datos celulares y de este modo obtener los valores de la tasa real de los resultados del ensayo de AM en curso.

Ejemplo 5

Perfiles de AM de muestras de control: (i) a concentraciones crecientes de reactivos en ausencia de celulas; (ii) con celulas pero sin reactivos

(i) Los experimentos de control en ausencia de celulas verificaron que los perfiles de acidificacion obtenidos en presencia de celulas de hecho miden la tasa de actividad metabolica celular. Por lo tanto, no se obtuvo acidificacion bajo el mismo protocolo aplicado en presencia de la sonda, tampon y cada reactivo al aumentar la concentracion, pero sin celulas (por ejemplo, glucosa (Figura 6A) y PSA (Figura 8A)), en comparacion con cambios claros de la acidificacion en muestras con celulas. Se obtuvieron los mismos resultados de control para todos los reactivos. (ii) Se midio un nivel basal de acidificacion en presencia de celulas en ausencia de cualquier reactivo, incluido la glucosa. Generalmente, este nivel basal aumento con el aumento de las concentraciones de glucosa, verificando aspectos claros de la actividad metabolica celular (Figuras 6B-C). Ademas, los perfiles de AM en estado basal ya revelaron la tendencia general de un cambio de diagnostico de la fosforilacion oxidativa

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dominante preferido por las CMSPh naive del 69 % de los donantes sanos, a la glicolisis aerobica dominante (“efecto Warburg”) preferido por CMSPh activadas del 60 % de diversos pacientes de cancer. Estos resultados hacen hincapie en el potencial del ensayo de AM como herramienta de diagnostico ya en estado basal, que es el escenario mas cercano al estado in vivo. Sin embargo, el estado basal por sf solo no es suficiente para una diferenciacion clara entre los pacientes sanos y con cancer (Chi-cuadrado, p = 0,45). Con la minena de datos actual de todos los perfiles del ensayo de AM en respuesta a la red de los reactivos (Figuras 10A-D), se puede senalar significativamente al 95,24 % de los donantes sanos y al 88 % de los pacientes con cancer (edad > 4 Chi-cuadrado, p <0,0001) y al 90,48 % de los donantes sanos y el 95,24 % de los pacientes con cancer (22< edad > 81, Chi-cuadrado, p <0,0001).

Ejemplo 6

Comparacion de los perfiles de AM a concentracion creciente de glucosa, obtenidos para donantes sanos y pacientes tfpicos de cancer de mama

En primer lugar, los perfiles de AM de donantes sanos (Figuras 6B, 7A) son sorprendentemente similares, a pesar de la diferencia significativa en la edad (45 (Figura 6B) frente a 69 (Figura 7A)) y el genero. En segundo lugar, los resultados en la Figura 6A-C revelan diferencias significativas en los perfiles de AM entre dos donantes que representan un donante tfpico sano y una paciente de cancer de mama in situ (en fase 2, y antes de cualquier tratamiento). Ademas, en experimentos preliminares donde se aplico el ensayo de AM en pocos casos de enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas adicionales no relacionados con el cancer, ya se pusieron de manifiesto diferentes perfiles de actividad metabolica en comparacion con los obtenidos para individuos sanos y pacientes de cancer (datos no mostrados). Estas diferencias senalan a 3 indices de diagnostico clmico de cancer (Figuras 4A-C). fndice 1: tasa de AM “ABlERTA” > tasa de AM “CERRADA” en estado basal (celulas en la solucion de trabajo sin reactivo). fndice 2: Tasa de AM “ABlERTA” > tasa de AM “CERRADA” para todas las concentraciones de glucosa. fndice de 3: Tasa de AM “ABlERTA” del cancer > tasa de AM “ABlERTA” de individuos sanos y tasa de AM “CERRADA” de pacientes de cancer > tasa de AM “CERRADA” de individuos sanos. Por lo tanto, los valores mas altos de la fosforilacion oxidativa se obtienen en CMSP frescas de muestras sanas en comparacion con los valores mas altos de la glicolisis aerobica en CMSP frescas de muestras de cancer. Como se ha mencionado en la introduccion (Vander Heiden MG, Cantley LC, & Thompson CB (2009) Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science 324(5930):1029-1033.; Fox CJ, Hammerman PS, & Thompson CB (2005) Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol 5(11):844-852; Michalek Rd & Rathmell JC (The metabolic life and times of a T-cell. Immunol Rev 236:190-202), estos resultados indican presumiblemente el desarrollo in vivo del “Efecto Warburg” en CMSPh activadas de pacientes con cancer. Observaciones mas detalladas sobre los resultados del ensayo de AM obtenidos para pacientes con cancer (Figura 6C y Figuras 7B-D) revelan que en el estado “CERRADO” el mdice de acidificacion total es menor que en el estado “ABIERTO”. Estos resultados indican un producto basico volatil que es responsable de la valoracion parcial de la acidez debido al acido lactico y el CO2. Esta valoracion podna ser fisiologicamente necesaria tras el cambio metabolico a la produccion de acido lactico no volatil. Este papel esta relacionado con el amomaco (NH3), que es uno de los productos primarios del catabolismo de las protemas y las vfas metabolicas de las purinas y pirimidinas. En el sistema de medicion actual, como in vivo, las celulas vitales deben mantener el citoplasma a un pH constante de aproximadamente 7,2 a 7,4 por secrecion metabolica simultanea tanto los productos acidos como basicos, como se describe a continuacion.

C02 + H20 HX'Xl H + + HC(l

NH3 + H20 NH4 + OH~

Se debe mencionar que en los analisis de 3 indices, se encontraron diferentes combinaciones en diferentes fases de varios tipos de cancer (por ejemplo, colon, mama, pulmon, y pancreas) (Tabla 2, mas arriba). Por lo tanto, por estas variaciones se cree que el examen de una coleccion de datos suficiente y el seguimiento de los donantes individuales proporcionara perfiles de diagnostico fiables y mas informativos, como se demuestra en el siguiente caso de estudio (Figuras 7A-D).

Ejemplo 7

Caso de estudio de seguimiento de los perfiles de AM, a concentracion creciente de glucosa, que se obtiene para una mujer de 65 anos de edad con cancer de mama

Con respecto a las mediciones del ensayo de AM preliminar, se debe mencionar que por el presente ensayo fueron diagnosticados un caso de cancer de tiroides y uno de cancer de mama antes que los medicos. El caso del cancer de mama fue seguido a lo largo de dos anos como evidencia de la capacidad informativa sensible del ensayo de AM en comparacion con la clasificacion tfpica de la estadificacion y los tratamientos. Este es el primer informe de un estudio de seguimiento de 2 anos de un donante femenino, clmicamente diagnosticado de cancer de mama un ano despues de que el ensayo de AM hubiera revelado un estado de cancer. A modo de comparacion, se presentan los perfiles de AM de un hombre sano tfpico de 69 anos de edad (Figura 7A). Perfiles de AM del paciente con cancer en

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el momento cero, el paciente diagnosticado clmicamente con cancer de mama un ano despues del ensayo de AM habfa revelado un estado de cancer (es decir,) (Figura 7B). Los tres indices de diagnostico del cancer indican un cambio de la fosforilacion oxidativa observada en los perfiles sanos (Figura 7A) a glicolisis aerobica observada en los perfiles del caso de cancer (Figuras 7B). En concreto, los valores positivos para “CERRADO-ABIERTO” de perfiles sanos (Figura 7A) y los valores negativos para “CERRADO-ABIERTO” obtenidos para los perfiles de cancer (Figura 7B). El siguiente ensayo de AM obtenido para este caso de estudio se llevo a cabo 10,5 meses mas tarde (Figura 7C), justo despues del diagnostico de una mamograffa de rutina de idc de mama en fase 2. Cabe destacar que en ese momento la paciente no reporto smtomas fisiologicos o palpables.

A partir de ese momento, se llevo a cabo un ensayo de seguimiento de la AM cada 3 semanas. Un mes mas tarde, se llevo a cabo la extirpacion quirurgica del tumor. Otro mes mas tarde se le dio un tratamiento de quimioterapia cada 3 semanas. Cada ensayo de AM se llevo a cabo unos 20 dfas despues de cada tratamiento, y 2 dfas antes del siguiente tratamiento. El ultimo ensayo de AM presentado en este documento (Figura 7D) se llevo a cabo despues del tercer tratamiento de quimioterapia, es decir, aproximadamente 2 meses despues de comenzar el protocolo de quimioterapia (tiempo = (+) 14,5 meses). Debe tenerse en cuenta que de acuerdo con los tres indices del ensayo de Am, este ultimo ensayo ya revela perfiles de AM (Figura 7D) caractensticos del donante sano (Figura 7A). Obviamente el ensayo de Am verifica una tendencia positiva junto con el tratamiento en curso. Con estos resultados, sera importante utilizar el ensayo de AM en un procedimiento de seguimiento con el fin de revelar el comportamiento de la tendencia del perfil de ensayo de AM en comparacion con la evaluacion clmica durante y mucho antes de la finalizacion del tratamiento con quimioterapia. Este programa de seguimiento se pone a disposicion con el ensayo de AM orientado clmicamente que es simple, no invasivo y barato.

Ejemplo 8

Comparacion de los perfiles de AM, a concentraciones crecientes de PSA, obtenidos para individuos sanos tfpicos, pacientes con cancer de mama y donante recuperado de cancer de mama

Hasta ahora los perfiles de AM se examinaron bajo concentraciones crecientes de glucosa que se encuentra claramente como herramienta clmica no espedfica general para el diagnostico de cancer. Con el fin de obtener una clasificacion mas espedfica del cancer, el ensayo de AM explora simultaneamente diversos reactivos (Tabla 3), tales como los antfgenos normales espedficos de tejido (por ejemplo, PSA, MelanA).

El antfgeno prostatico espedfico (PSA) es una protema normal producida por las celulas de la glandula prostatica. El PSA es un antfgeno normal espedfico de tejido asociado al cancer. Este peptido es reconocido por los linfocitos T citotoxicos (CTL). El aumento de nivel en sangre periferica humana de este peptido se utiliza clmicamente como marcador bioqmmico de diagnostico del cancer de prostata para hombres (Greene KL, et al. (2009) Prostate specific antigen best practice statement: 2009 update. J Urol 182(5):2232-2241). Sin embargo, se liberan bajos niveles de PSA en la circulacion femenina y hasta la fecha el ensayo clmica de PSA en sangre no se utiliza como factor de diagnostico para mujeres. Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que el PSA no es espedfico de la prostata, sino que esta presente en algunos tejidos femeninos regulados por hormonas, principalmente el de mama y sus secreciones (Black MH & Diamandis Ep (2000) The diagnostic and prognostic utility of prostate-specific antigen for diseases of the breast. Breast Cancer Res Treat 59(1):1-14; Black MH, et al. (2000) Serum total and free prostate-specific antigen for breast cancer diagnosis in women. Clin Cancer Res 6(2):467-473). En mujeres, el PSA se encuentra en la eyaculacion femenina a una concentracion aproximadamente igual a la encontrada en el semen masculino (Wimpissinger F, Stifter K, mueca W, Y Stackl W (2007) The female prostate revisited: perineal ultrasound and biochemical studies of female ejaculate. J Sex Med 4(5):1388-1393; discussion 1393). En las Figuras 8A-D se presentan tres perfiles de AM, una mujer sana tfpica (Figura 8B), una mujer con cancer de mama idc en fase 2 y antes del tratamiento (Figura 8C), y una mujer recuperada del cancer de mama en fase 2 hace 18 anos (Figura 8D). Se observa que los estimulantes espedficos de tejido, por ejemplo el PSA, inducen picos marcados a concentraciones optimas en los perfiles del ensayo de AM de pacientes con cancer (Figuras 8A-D). Tales perfiles se consideran que reflejan la estimulacion mediada por el receptor espedfico de la enfermedad y por lo tanto permitira detectar tumores espedficos (por ejemplo, de mama por PSA, melanoma por la estimulacion MelanA). Los resultados ponen de manifiesto varias cuestiones importantes. En primer lugar, el perfil de AM de mujeres sanas indica un mayor nivel de fosforilacion oxidativa como ya se ha indicado anteriormente para los perfiles de AM de la glucosa (Figuras 6A-C y Figuras 7A-D). Segundo, la Figura 8C apunta a una respuesta de las CMSP al PSA por una mujer con cancer de mama idc en fase 2, antes de cualquier tratamiento. Este perfil expresa la alta tasa de actividad metabolica en el estado “ABIERTO”, ya desde el estado basal. Estos perfiles indican un alto nivel de glicolisis aerobia, un fenomeno que es similar a las celulas T activadas tal como se obtiene para los perfiles de AM de la glucosa de pacientes con cancer. Otro perfil unico del ensayo de AM fue puesto de manifiesto por una mujer de 50 anos recuperada de cancer de mama hace 18 anos (Figura 8D). Este perfil para la estimulacion PSA se comporta mas como el de donante sano (Figura 8B). Ademas, revela una mayor tasa de AM en el estado “cerrado” que indica una via de fosforilacion oxidativa dominante a concentraciones crecientes de PSA mas que el perfil caractenstico del donante sano (Figura 8B). Este perfil tal vez esta relacionado con un aumento de la poblacion de celulas de memoria contra el cancer de mama. Esta relacion es consistente con la observacion de que tras la eliminacion de patogenos, las celulas efectoras que sobreviven se diferencian en celulas de memoria de larga vida y vuelven a un estado

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metabolico oxidativo (Michalek RD & Rathmell JC (The metabolic life and times of a T-cell. Immunol Rev 236:190202).

Ejemplo 9

Construccion del modelo y evaluacion de la clasificacion para los resultados del ensayo de AM por herramientas de minena de datos

Se obtienen los perfiles de AM multiple que incluyen un gran numero de valores de tasa de AM para cada donante. Con el fin de desarrollar un analisis clmico dinamico que se actualice con cada nuevo donante, y para extraer patrones de esta gran base de datos, se ha desarrollado un programa informatico utilizando herramientas de minena de datos, que combina los metodos estadfsticos y de inteligencia artificial con la gestion de base de datos (Nisbet R, IV JE, & Miner G (2009) Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications). Se analizaron dos cohortes seleccionadas de los resultados del ensayo de AM, tanto para hombres como para mujeres. Dado que la mayona de los pacientes con cancer estudiados teman mas de 39 anos, y con el fin de minimizar tanto como sea posible el efecto de la edad, este analisis se centro en un subgrupo de 42 donantes con una edad por encima de 40 (21 donantes sanos y 21 pacientes de cancer). En la segunda cohorte se utilizo la serie completa de donantes de 22-81 anos de edad (n = 67, 42 donantes sanos y 25 pacientes con cancer). Para la clasificacion de los donantes en personas sanas y con cancer, se utiliza un conjunto de la familia de diez modelos diferentes, incluyendo minena de datos, aprendizaje automatico y modelizacion estadfstica, aplicando el software SAS 9.3 y Clementine (v13.0). De estos diez modelos, solo cuatro fueron capaces de clasificar con la precision mas alta tanto donantes sanos como pacientes con cancer. De los cuatro modelos, tres eran de la familia del arbol de decisiones (CHAID, C5, C&RT) y uno del modelo lineal log (regresion logfstica). Los cuatro se presentan en las Figuras 9A-D. Los modelos de arbol de decisiones son considerados como los mejores clasificadores, ya que estos modelos no asumen ninguna distribucion ni ninguna hipotesis. El cuarto modelo que no funciona tan bien como los otros es la regresion logfstica. Este tipo de modelo es el mas adecuado cuando los datos de entrada se comportan exactamente como los supuestos del modelo, como las suposiciones acerca de la distribucion y de la independencia. Con el fin de minimizar en la medida de lo posible el sobreajuste el modelo de regresion logfstica se corrio utilizando el metodo de seleccion hacia adelante, lo que nos permitio ordenar las variables por importancia y minimizar en lo posible el numero de variables seleccionadas. Puesto que cada modelo muestra diferentes variables/caractensticas como una funcion de diferentes antfgenos, cada uno a diferentes concentraciones, puede ser posible combinar las predicciones presentes como una funcion de mas de un modelo. Al examinar la influencia de los reactivos generales a diferentes concentraciones sobre la exactitud de los modelos, el numero maximo de variables que fueron seleccionadas no fue superior a cinco (Figuras 9A, 9C), que se recomienda cuando el tamano de la muestra no es suficiente para minimizar tanto como sea posible el sobreajuste. Con estos resultados iniciales fue posible ordenar los diez reactivos como predictores por su frecuencia de aparicion en los diversos modelos (Figuras 9A, 9C). Actualmente es posible determinar con precision la glucosa, MBP, rapamicina, PSA y PMA como elementos fundamentales en el ensayo de AM y en relacion con el sistema inmunologico (TABLA 3). La relevancia inmunologica de los otros cinco reactivos (Tabla 3) todavfa se pone de manifiesto por la eleccion de los modelos ocasionales. Con el fin de evaluar y comparar el rendimiento de los modelos, los presentes inventores decidieron utilizar el metodo grafico que se basa en las tablas de ganancia acumulativa producidas por el software Clementine (v13.0). El grafico de ganancia (Figuras 9B, D) contiene dos curvas incorporadas, la curva aleatoria (lmea negra) y el mejor ajuste de la curva (lmea azul cielo). Todos los modelos se situan entre estas dos curvas. En este metodo, una mayor area entre una curva dada y la curva aleatorio (curva negra) indica acerca de un modelo mejor. Los resultados del modelado y la clasificacion de los donantes de sangre apuntan a modelos con un rendimiento similar al mejor modelo (Figuras 9A-D).

Ejemplo 10

Resultados del modelo de evaluacion del ensayo de AM utilizando un conjunto de validacion del 30 % de los donantes de sangre

A continuacion se describe un proceso de particion que permite combinar y comparar modelos a fin de obtener mas confianza en la precision de los resultados del ensayo de AM, para evaluar el nivel de robustez de los modelos, y para reducir al mmimo el sobreajuste debido a la muestra de pequeno tamano (n = 67 donaciones de muestras de sangre). Los datos como se describe en las Figuras 9A-D se repartieron al azar en dos grupos de “Formacion” y “Ensayo” usando el software Clementine v13.0 9 (Figuras 10A-D). El conjunto de validacion incluye el 70% de los donantes para ambas cohortes. La primera cohorte incluye 42 donantes con una edad por encima de 40 anos (Figuras 10A-B) y la segunda cohorte incluye un conjunto completo de los donantes (n = 67) de 22-81 anos de edad (Figuras 1C-D). El primer 70% de los donantes se describen en el “conjunto de Formacion”. El “conjunto de Formacion” se utiliza para construir el modelo de minena de datos como se describe en las Figuras 9A-D. El 30 % restante de los donantes (“conjunto de Ensayo”) permite evaluar el resultado de la clasificacion en el “conjunto de Ensayo” usando los modelos que se generaron en el “conjunto de Formacion” (CHAID, Logistic, C5, C & R Tree) (Figuras 10A-C). Los conjuntos de “Formacion” y “Ensayo” permiten evaluar los resultados del modelo con mayor confianza y eliminar tanto como sea posible el desaffo de sobreajuste. En ambas cohortes se comprobo que el modelo c5 dio resultados mas robustos donde la curva del conjunto de “Ensayo” era similar al conjunto de

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“Formacion” (Figuras 10B, D). El modelo C5 fue el de mejor rendimiento en el conjunto de “Ensayo” mientras que en el conjunto de “Formacion” C&RT fue el que mejor se comporto. Por estos resultados, es posible determinar con precision la glucosa, MBP, PMA, PHA, CONA y L-glutamina como elementos fundamentals en el ensayo de AM y en relacion con el sistema inmunologico (TABLA 3). Al igual que en los mejores modelos en las Figuras 9A-D, estos resultados (Figuras 10A-D) apoyan los resultados de las Figuras 9A-D.

En el presente documento se presenta un enfoque fisiologico para el diagnostico del cancer, apoyandose en los resultados experimentales preliminares de los perfiles de actividad metabolica obtenidos para CMSph de pacientes sanos y con cancer. Mediante este enfoque los presentes inventores han disenado un metodo optico sencillo de alto rendimiento, de corta duracion y rentable del ensayo de AM usando CMSPh frescas extrafdas de muestras de sangre de 10-20 ml. Se pusieron de manifiesto diferencias notables de los patrones de AM de las huellas digitales de CMSPh por el examen preliminar de los dos grupos clmicos, 42 individuos sanos y 25 pacientes con cancer. Mientras que los perfiles de AM de CMSPh de los 42 donantes sanos indican una via de la fosforilacion oxidativa preferida similar, las CMSPh de los pacientes de cancer 25 tienen un amplio espectro de perfiles de AM, prefiriendo la glicolisis aerobica en correlacion con la estadificacion y el tratamiento. Uno de los casos de cancer de tiroides y uno de los canceres de mama fue diagnosticado por el ensayo de AM antes que los medicos. Este caso de cancer de mama fue seguido por el ensayo de AM a lo largo de dos anos como evidencia de la capacidad informativa sensible del ensayo de AM con respecto a la clasificacion tfpica de la estadificacion y los tratamientos.

Los resultados presentados en este documento alientan a una mayor exploracion de la actividad metabolica de CMSPh como imagen especular del desarrollo de tumores (Figuras 9A-D). Los resultados preliminares reflejan claramente caractensticas comunes, asf como espedficas, de las vfas metabolicas de CMSPh bajo evasion inducida por el cancer del sistema inmunologico durante el desarrollo patologico de diferentes tumores.

Un mdice diagnostico del cancer espedfico de tejido puede ser proporcionado por los perfiles del ensayo de AM en las etapas tempranas y tardfas de desarrollo local del tumor por aumento (o disminucion) de las tasas de AM con respecto a las observadas para donantes sanos. Deben buscarse ciertas concentraciones optimas de antfgenos espedficos de tejido para los perfiles del ensayo de AM. Se esperan tales perfiles diagnosticos espedficos de tejido tambien en las fases tempranas del desarrollo del tumor, cuando se preve una respuesta inmune antitumoral agresiva inicial. Por este metodo, se puede postular que en estado sano, el sistema inmunologico se encarga de la deteccion precoz en curso y de la erradicacion eficaz de celulas cancerosas en el contexto de su funcion normal, mediante el examen de todos los tejidos del cuerpo. Por lo tanto, se propone que el sistema inmunologico detecta y elimina celulas cancerosas por su excesiva expresion de antfgenos normales espedficos de tejido. Por lo tanto, en la homeostasis, un nivel equilibrado de respuesta inmune efectiva debe estar bien controlado, a fin de evitar una disminucion de la funcion citolftica efectiva, o dicha actividad agresiva contra celulas propias normales que en su lugar podna precipitar enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, desafortunadamente, se sabe que en etapas avanzadas del cancer el sistema inmunologico se suprime, o incluso se educa para apoyar el desarrollo del cancer por los linfocitos infiltrantes de tumores, que pueden ser una parte de las CMSPh circulantes. En esta vision, ademas se preve que en la fase metastasica letal del cancer los perfiles del ensayo de AM de CMSPh podnan cambiar de nuevo para reflejar un estado aparentemente sano debido a la tolerancia de la inmunidad espedfica de tejido y anergia, a diferencia de en la inflamacion cronica. Este estado saludable aparente puede estar expuesto por el agotamiento de la estimulacion del antfgeno espedfico de tejido relevante.

Ejemplo 11

Perfiles de actividad metabolica de CMSP para aumentar la concentracion de glucosa obtenidos para individuos sanos tfpicos, donantes con cancer y con lupus autoinmune

En homeostasis, la actividad del sistema inmunologico debe estar bien controlada; la hiperactividad se asocia a enfermedades autoinmunes, mientras que el desarrollo del cancer relacionado esta probablemente con la hipoactividad del sistema inmunologico.

Se obtuvieron perfiles de AM significativamente diferentes para aumentar la concentracion de glucosa obtenida para individuos sanos tfpicos, donantes con cancer y con lupus autoinmune (Figura 13).

Aunque la invencion se ha descrito junto con realizaciones espedficas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones seran obvias para los expertos en la tecnica. En consecuencia, se pretende abarcar todas estas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del esprntu y el alcance amplio de las reivindicaciones adjuntas.

Ademas, la cita o identificacion de cualquier referencia en esta solicitud no se interpretara como una admision de que tal referencia esta disponible como tecnica anterior a la presente invencion. En la medida en que se utilicen tttulos de las secciones, no deben interpretarse como necesariamente limitantes.

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Referencias

(a lo largo de la solicitud se enumeran otras referencias)

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para medir una actividad metabolica (AM) de una celula, comprendiendo el metodo la medicion de manera independiente en un entorno extracelular de la celula, los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(ii) productos metabolicos solubles no volatiles y productos metabolicos solubles volatiles; y

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (i) se efectua en una camara expuesta al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (ii) se efectua en una camara sellada al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (iii) se realiza restando un perfil de acidificacion de dicho (i) de un perfil de acidificacion de dicho (ii), y ademas en el que al menos uno de dichos perfiles de acidificacion dependientes del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de la celula.
2. Un metodo ex vivo para diagnosticar una enfermedad asociada con una actividad metabolica modificada en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el metodo:

medir de manera independiente en un entorno extracelular de una celula los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo de dicho sujeto debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(ii) productos metabolicos solubles no volatiles y productos metabolicos solubles volatiles; y

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (i) se efectua en una camara expuesta al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (ii) se efectua en una camara sellada al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (iii) se realiza restando un perfil de acidificacion de dicho (i) de un perfil de acidificacion de dicho (ii), y ademas

en el que al menos uno de dichos perfiles de acidificacion dependientes del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de dicha celula y mientras que un cambio en dicha actividad metabolica en comparacion con la de una muestra de celulas normales no afectadas examinadas en condiciones identicas es indicativo de una enfermedad asociada con la actividad metabolica modificada.
3. Un metodo ex vivo de optimizacion del tratamiento de la enfermedad, comprendiendo el metodo:

(a) poner en contacto una muestra biologica del sujeto que comprende una celula con al menos un medicamento;

(b) medir de manera independiente en un entorno extracelular de dicha celula los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(ii) productos metabolicos solubles no volatiles y productos metabolicos solubles volatiles; y

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (i) se efectua en una camara expuesta al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (ii) se efectua en una camara sellada al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (iii) se realiza restando un perfil de acidificacion de dicho (i) de un perfil de acidificacion de dicho (ii), y ademas en el que al menos uno de dichos perfiles de acidificacion dependientes del tiempo es indicativo de la actividad metabolica de dicha celula y mientras que un cambio en dicha actividad metabolica de dichas celulas hacia la de una muestra celular sana normal examinada en condiciones identicas es indicativo de un medicamento eficaz para dicha enfermedad.
4. Un metodo ex vivo de seguimiento del tratamiento de la enfermedad en un sujeto, comprendiendo el metodo:

medir de manera independiente en un entorno extracelular de una celula de un sujeto tratado los perfiles de acidificacion dependientes del tiempo debido a la secrecion de:

(i) productos metabolicos solubles no volatiles;

(ii) productos metabolicos solubles no volatiles y productos metabolicos solubles volatiles; y

(iii) productos metabolicos solubles volatiles;

en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (i) se efectua en una camara expuesta al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (ii) se efectua en una camara sellada al aire, y en el que dicha medicion del perfil de acidificacion de dicho (iii) se realiza restando un perfil de acidificacion de dicho (i) de un perfil de acidificacion de dicho (ii), y ademas en el que al menos uno de dichos perfiles de acidificacion dependientes del

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tiempo es indicativo de la actividad metabolica de dicha celula y mientras que un metabolica de dichas celulas hacia la de una muestra celular sana normal examinada indicativo de un tratamiento eficaz de dicha enfermedad.
5. Un metodo ex vivo para identificar un agente capaz de alterar una actividad comprendiendo el metodo:

(a) someter las celulas a un agente;

(b) medir la actividad metabolica de las celulas despues de (a) y opcionalmente antes de (a) de acuerdo con el metodo de la reivindicacion 1, en el que un cambio en dichos perfiles de acidificacion es indicativo de un agente capaz de alterar una actividad metabolica de las celulas.
6. El metodo de la reivindicacion 1-5, en el que dicho entorno extracelular comprende una solucion definida que tiene una capacidad tamponante calibrada y, opcionalmente, en el que dicho tampon comprende una solucion salina tamponada con fosfato.
7. El metodo de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha celula comprende una celula inmunologica no patogena y, opcionalmente, en el que dicha celula inmunologica no patogena es un leucocito, opcionalmente una celula mononuclear de sangre periferica y, opcionalmente, un linfocito.
8. El metodo de las reivindicaciones 1-5, en el que dichas celulas comprenden una celula cancerosa.
9. El metodo de las reivindicaciones 2-4, en el que dicha enfermedad comprende cancer.
10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicha muestra biologica comprende una muestra de sangre.
11. Los metodos de la reivindicacion 1-5, caracterizados por que dichos metabolitos no volatiles comprenden lactato.
12. Los metodos de la reivindicacion 1-5, caracterizados porque dichos metabolitos volatiles comprenden NH3 y CO2.
13. Los metodos de las reivindicaciones 1-5, que ademas comprenden someter dicha celula a un estimulante o inhibidor antes de, o simultaneamente con, la medicion de dicho perfil de acidificacion.
14. Los metodos de las reivindicaciones 1-13, que comprenden ademas la separacion de dicha celula a partir de dicho entorno extracelular y, opcionalmente, en los que dicha separacion es mediante separacion con Ficoll bajo centrifugacion.

cambio en dicha actividad en condiciones identicas es

metabolica de las celulas,