ES2618380T3 - Novedosos anticuerpos con amplio poder neutralizante de VIH-1 - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo anti-VIH aislado o de origen no natural, en el que dicho anticuerpo tiene: (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos VRC-PG-04 definida en la Fig. 8A: **Fórmula** y (ii) una cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos VRC-PG-04 definida en la Fig. 8B: **Fórmula**
Description
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DESCRIPCION
Novedosos anticuerpos con amplio poder neutralizante de VIH-1.
Campo de la invencion
La presente solicitud se refiere a anticuerpos monoclonales neutralizantes humanos especfficos de VIH-1, tales como anticuerpos monoclonales con una amplia y potente actividad neutralizante especfficas de VIH-1 y a su fabricacion y uso. Un amplio poder neutralizante sugiere que los anticuerpos pueden neutralizar aislados de VlH-1 procedentes de diferentes individuos. Dichos anticuerpos son utiles en composiciones farmaceuticas para la prevencion y el tratamiento del VIH, y para el diagnostico y vigilancia de la infeccion por VIH y para el diseno de inmunogenos de vacunas de VIH.
Antecedentes de la invencion
El SIDA, o sfndrome de inmunodeficiencia adquirida, esta producido por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y se caracteriza por algunas caracterfsticas clfnicas que incluyen sfndromes consuntivos, degeneracion del sistema nervioso central e inmunosupresion profunda que da como resultado infecciones y neoplasias oportunistas. VIH es un miembro de la familia de los lentivirus de los retrovirus animales, que incluye el virus visna de ovejas y los virus de la inmunodeficiencia de bovinos, felinos, y simios (VIS). Dos tipos de VIH estrechamente relacionados, designados VIH-1 y VIH-2, se han identificado hasta el momento, de los que el VIH-1 es con mucho la causa mas comun de SIDA. Sin embargo, VIH-2, que difiere en la estructura genomica y la antigenicidad, produce un sfndrome clfnico similar.
Una partfcula de VIH infecciosa consiste en dos hebras identicas de ARN, cada una aproximadamente de 9,2 kb de longitud, empaquetadas en el interior de un nucleo de partfculas vfricas. Esta estructura nuclear esta rodeada por una envoltura de bicapa de fosfolfpidos derivada de la membrana de la celula hospedadora que incluye tambien las protefnas de membrana codificadas vfricamente (Abbas y col., Cellular and Molecular Immunology, 4a edicion, W.B. Saunders Company, 2000, p. 454). El genoma de VIH tiene la organizacion 5'-LTR-Gag-Pol-Env-LTR-3' caracterfstica de la familia de los retrovirus. Las repeticiones terminales largas (LTR) en cada extremo del genoma vfrico sirven como sitios de union para las protefnas reguladoras de la transcripcion procedentes del hospedador y regulan la integracion vfrica en el genoma del hospedador, la expresion genica vfrica, y la replicacion vfrica.
El genoma de VIH codifica varias protefnas estructurales. El gen gag codifica protefnas estructurales del nucleo de la nucleocapsida y la matriz. El gen pol codifica las enzimas transcriptasa inversa (TI), la integrasa (IN), y la proteasa (PR) vfrica requeridas para la replicacion vfrica. El gen tat codifica una protefna que se requiere para el alargamiento de los transcritos vfricos. El gen rev codifica una protefna que promueve la exportacion nuclear de los ARN vfricos cortados y pegados de manera incompleta o no cortados y pegados. El producto del gen vif aumenta la infectividad de las partfculas vfricas. El producto del gen vpr promueve la importacion nuclear del ADN vfrico y regula la detencion del ciclo celular en G2. Los genes vpu y nef codifican protefnas que regulan por defecto la expresion de los linfocitos CD4 en el hospedador y potencian la liberacion del virus de las celulas infectadas. El gen env codifica la glicoprotefna de la envoltura vfrica que se traduce como un precursor de 160 kilodalton (kDa) (gp160) y se escinde por una proteasa celular para dar como resultado la glicoprotefna de la envoltura externa de 120 kDa (gp120) y la glicoprotefna de la envoltura transmembrana de 41 kDa (gp41), que se requiere para la infeccion de las celulas (Abbas y col., Cellular and Molecular Immunology, 4a edicion, W.B. Saunders Company, 2000, pp. 454-456). gp140 es una forma modificada de la glicoprotefna Env, que contiene la porcion de la glicoprotefna de la envoltura externa de 120 kDa y la parte extracelular de la porcion gp41 de Env y tiene las caracterfsticas de gp120 y gp41. El gen nef se conserva entre los lentivirus de primates y es uno de los primeros genes vfricos que se transcribe tras la infeccion. In vitro, se han descrito algunas funciones, incluyendo la regulacion por defecto de CD4 y la expresion superficial de MHC de clase I, la senalizacion y la activacion alteradas de los linfocitos T, y la infectividad vfrica potenciada. El documento WO 2010/107939 A2 se refiere a anticuerpos neutralizantes de la inmunodeficiencia humana (VIH) y a su uso en el tratamiento, diagnostico y vigilancia de la infeccion por VIH.
La infeccion por VIH se inicia con gp120 sobre la union de la partfcula vfrica a los linfocitos CD4 y a las moleculas receptoras de quimioquinas (por ejemplo, CXCR4, CCR5) sobre la membrana celular de las celulas diana tales como linfocitos T CD4+, macrofagos y celulas dendrfticas. Los virus unidos se fusionan con la celula diana y transcriben de forma inversa el genoma de ARN. El ADN vfrico resultante se integra en el genoma celular, donde dirige la produccion de nuevo ADN vfrico, y por tanto protefnas vfricas y nuevos viriones. Estos viriones se desprenden de la membrana de la celula infectada y establecen infecciones productivas en otras celulas. Este procedimiento destruye tambien la celula originalmente infectada. El VIH puede tambien destruir celulas indirectamente debido a que el receptor CD4 de los linfocitos T sin infectar tiene una fuerte afinidad por gp 120 expresado sobre la superficie de las celulas infectadas. En este caso, las celulas sin infectar se unen mediante la interaccion con el receptor CD4-gp120, a las celulas infectadas y se fusionan para formar un sincitio, que no puede sobrevivir. La destruccion de linfocitos T CD4+, que son crfticos para la defensa inmunitaria, es la causa principal de la disfuncion inmunitaria progresiva que es la sena de identidad de la progresion de la enfermedad del SIDA. La perdida de linfocitos T CD4+ deteriora gravemente la capacidad del cuerpo para hacer frente a la mayorfa de invasores, pero tiene un impacto particularmente grave sobre las defensas contra los virus, hongos, parasitos y determinadas bacterias, incluyendo micobacterias.
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La investigacion sobre la glicoprotefna Env ha mostrado que el virus tiene muchos mecanismos protectores eficaces con pocas vulnerabilidades (Wyatt & Sodroski, Science, 19 de junio de 1998:280(5371):1884-8). Para la fusion con sus celulas diana, el VIH-1 utiliza un complejo Env trimerico que contiene subunidades gp120 y gp41 (Burton y col., Nat Immunol. marzo de 2004;5(3):233-6). La fusion potencial del complejo Env se estimula por la implicacion del receptor CD4 y un correceptor, normalmente CCR5 o CXCR4. Los anticuerpos neutralizantes parecen trabajar tanto uniendose al trfmero maduro sobre la superficie del virion y evitando los acontecimientos iniciales de implicacion del receptor, o uniendose tras la union del virion e inhibiendo el procedimiento de fusion (Parren & Burton, Adv Immunol. 2001; 77:195-262). En el ultimo caso, los anticuerpos neutralizantes pueden unirse a epftopos cuya exposicion esta potenciada o estimulada por la union del receptor. Sin embargo, dados los efectos antivfricos potenciales de los anticuerpos neutralizantes, no es inesperado que en VIH-1 hayan evolucionado multiples mecanismos para protegerle de la union de anticuerpos (Johnson & Desrosiers, Annu Rev Med. 2002:53:499-518).
La mayorfa de vacunas contra VIH-1 experimentales ensayadas en seres humanos y/o primates no humanos sugiere que una vacuna satisfactoria incorporara inmunogenos que estimulen anticuerpos con un amplio poder neutralizante (bNab) y una solida inmunidad mediada por celulas. La glicoprotefna de la envoltura de VIH-1 (Env) es la principal protefna vfrica implicada en la entrada del virus y es tambien la diana principal de los anticuerpos neutralizantes, pero debido a las estrategias inmunitarias de evasion y a la extrema variabilidad de la secuencia de las Env, la generacion de bNab ha sido una tarea desalentadora (Phogat S, Wyatt R. Curr Pharm Des. 2007; 13:213-27, Phogat S, y col. J Intern Med. 2007 262:26-43, Karlsson Hedestam GB, y col Nat Rev Microbiol. 2008 6:143-55).
La capacidad de estimular anticuerpos con una amplia y potente actividad neutralizante es un desaffo mayor en el desarrollo de una vacuna de VIH-1. Concretamente, VIH-1 ha hecho evolucionar una gama impresionante de estrategias para evadir la neutralizacion mediada por anticuerpos. Los bNAb se desarrollan con el tiempo en una proporcion de individuos infectados con VIH-1, y se han aislado un punado de anticuerpos monoclonales con amplio poder neutralizante a partir de donantes infectados con el clado B. Estos anticuerpos tienden a presentar menos amplitud y potencia contra los virus que no son del clado B, y reconocen epftopos sobre el virus que hasta el momento han fracasado en estimular respuestas con un amplio poder neutralizante cuando se incorporan en una gama diversa de inmunogenos.
De forma reciente, utilizando una seleccion sensible de sobrenadantes de microneutralizacion de alto rendimiento de IgG de aproximadamente 30.000 + linfocitos B con memoria procedentes de un donante africano infectado con el clado A de VIH-1, se identificaron dos nuevos anticuerpos, PG9 y PG16 con un amplio poder neutralizante que son anticuerpos con una amplia y excepcionalmente potente actividad neutralizante (Walker L, Phogat S, y col. Science, 2009; 326:285-9. Epub 3 de septiembre de 2009). Estos anticuerpos reconocen una nueva diana de vacuna conservada, todavfa accesible, (que consiste en elementos conservados sobre los bucles 2 y 3 variables) sobre el Env y muestran una union preferente al trfmero Env de VIH (modelo de los epftopos PG9 y 16 sobre el trfmero de VIH-1). Cuando se ensayan para la union, estos anticuerpos no muestran union a muchos trfmeros Env de VIH disenados empfricamente solubles (Env gp140) aunque imitan el extremo de Env de VIH-1 natural, sugiriendo que bien estos disenos de Env son incorrectos o se fijan en una forma no reconocida por PG9 y PG16.
Se han identificado tambien otros anticuerpos monoclonales con un amplio poder neutralizante que se unen al sitio de union a CD4 (Wu y col, Science 329; 856 (2010) y Zhou y col., Science, 13 de agosto de 2010; 329 (5993):811-7. Epub 8 de julio de 2010).
La cita o identificacion de cualquier documento en esta solicitud no es una admision de que dicho documento esta disponible como tecnica anterior a la presente invencion.
Sumario de la invencion
La presente invencion esta basada, en parte, en novedosos anticuerpos monoclonales identificados a partir de estructuras de la envoltura (Env) de VIH-1, en particular, las estructuras de Env con nucleos estabilizados resurgidos (RSC) que contienen glicoprotefnas antigenicamente resurgidas especfficas de un sitio de union estructuralmente conservado del receptor de CD4.
La invencion abarca anticuerpos que tienen una cadena pesada con tres CDR que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de VRC-PG-04 de la FIG. 8, y una cadena ligera con tres CDR que incluyen una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de VRC-PG-04 de la FIG. 8.
La invencion abarca ademas composiciones que pueden comprender los anticuerpos anti-VIH aislados o que no se producen naturalmente de la presente invencion. La solicitud se refiere tambien a moleculas de acido nucleico que pueden codificar los anticuerpos anti-VIH de la presente invencion, o uno de sus fragmentos, los vectores que pueden comprender las moleculas de acido nucleico que pueden codificar los anticuerpos anti-VIH de la presente invencion, o uno de sus fragmentos, y las celulas que pueden comprender vectores que pueden comprender las moleculas de acido nucleico que pueden codificar los anticuerpos anti-VIH de la presente invencion, o uno de sus fragmentos.
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La presente invencion se refiere tambien a los procedimientos para inmunizar o reducir el efecto de una infeccion por VIH o una enfermedad relacionada con VIH que puede comprender identificar un paciente que necesita dicho tratamiento, y administrar a dicho paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un anticuerpo de la presente invencion. El procedimiento puede comprender adicionalmente la administracion de un segundo agente terapeutico. El segundo agente terapeutico puede ser un agente antivfrico.
La presente invencion se refiere tambien a los procedimientos de inmunizar o reducir el efecto de una infeccion por VIH o una enfermedad relacionada con VIH que puede comprender identificar un paciente que necesita dicho tratamiento y administrar a dicho paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de: un primer anticuerpo de la presente invencion, o uno de sus fragmentos, especffico de un primer epftopo que se une a dicho primer anticuerpo y un segundo anticuerpo de la presente invencion, o uno de sus fragmentos, especffico para un segundo epftopo que se une a dicho segundo anticuerpo.
De acuerdo con ello, es un objeto de la invencion no abarcar en la invencion ningun producto anteriormente conocido, procedimiento de preparacion del producto, o procedimiento de uso del producto de tal manera que los solicitantes se reservan el derecho y por la presente declinan cualquier responsabilidad relacionada con cualquier producto, procedimiento, o procedimiento anteriormente conocido. Se destaca ademas que la invencion no pretende abarcar en el alcance de la invencion ningun producto, procedimiento, o preparacion del producto o procedimiento de utilizar el producto, que no cumpla con la descripcion escrita y los requisitos de habilitacion de la USPTO (Artfculo 112 de la Ley 35 del USC, primer parrafo) o la EPO (Artfculo 83 del CEP), de tal manera que los solicitantes se reservan el derecho y de esta manera declinan cualquier responsabilidad relacionada con cualquier producto, procedimiento de preparacion del producto, o procedimiento de utilizar el producto descritos anteriormente.
Se destaca que en esta divulgacion y, particularmente, en las reivindicaciones y/o parrafos, terminos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado atribuido en la Ley de Patentes de los EE.UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "incluyendo", y similares; y que terminos tales como "que consiste esencialmente de" y "consiste esencialmente de" tienen el significado que se les atribuye en la Ley de Patentes de los EE.UU., por ejemplo, permiten que los elementos no se enumeren explfcitamente, pero excluye elementos que se encuentran en la tecnica anterior o que influyen sobre una caracterfstica basica o novedosa de la invencion.
Estas y otras realizaciones se divulgan o son obvias y quedan abarcadas por, la siguiente Descripcion Detallada. Breve descripcion de los dibujos
La siguiente descripcion detallada, que se proporciona a modo de ejemplo, pero que no se pretende que limite la invencion unicamente a las realizaciones especfficas descritas, puede entenderse mejor junto con los dibujos acompanantes, en los que:
La Fig. 1 representa graficamente la competicion de protefnas que muestra que el suero 27-374 tiene anticuerpos con actividad neutralizante contra CD4bs.
La Fig. 2 representa graficamente una clasificacion de celulas unicas para los linfocitos B reactivos con RSC3.
La Fig. 3 representa graficamente la union a ELISA de VRC-PG-04 y VRC-PG-05 a algunas versiones mutantes de YU2 gp120 y a las protefnas nucleares estabilizadas resurgidas (RSC3) y a su mutante inactivado geneticamente ARSC3.
La Fig. 4 representa graficamente la union de VRC-PG-04 y VRC-PG-05 a protefnas basadas en YU2 gp120, HBX2 con el nucleo nuevo 8b y Du156 gp120 WT mediante ELISA.
La Fig. 5 representa graficamente un ensayo ELISA competitivo demostrando que VRC-PG-04 se dirige contra CD4bs.
La Fig. 6 representa graficamente un ensayo ELISA competitivo que demuestra que VRC-PG-04, pero no VRC-PG-05, compite en cruzado segun los ELISA de los anticuerpos CD4bs realizados con RSC3 en placas.
La Fig. 7 representa graficamente un ensayo ELISA usando el clado B AC10.29 gp1120 en placas y que VRC-PG-05 no bloquea en cruzado los mAb dirigidos contra CD4bs.
La Fig. 8 representa graficamente las alineaciones de secuencias de los anticuerpos VRC-PG.
La Fig. 9 representa graficamente las propiedades de union a antfgeno de PGV04. (A) Union de PGV04 a RSC3 (lmeas solidas) y ARSC3 (lmeas punteadas), y (B) JRFL gp120 como se determina mediante ELISA. Los antigenos se revistieron directamente sobre placas ELISA. La DO, densidad optica (absorbancia a 405 nm) de VRC01, VRC03, b12, y 2G12 se utilizaron como controles para la union a los antfgenos.
La Fig. 10 representa graficamente la cartograffa del epftopo de union PGV04. (A) Los ELISA competitivos de PGV04 con los mAb dirigidos contra CD4bs b12 y VRC01, CD4-lgG; (B) los mAb CD4i 17b y X5; y (C) la union a glicano de mAb 2G12 y la union al bucle V3 de mAb F425. JRFL gp120 se revistio sobre placas ELISA y se anadieron diluciones en serie de los mAb indicados en la parte superior de la grafica durante 30 min a TA. Los mAb biotinilados relacionados en la leyenda se anadieron a continuacion durante 1 h a TA a una concentracion CE50 constante. (D) Ensayo ELISA competitivo inverso con diluciones en serie por union a placas ELISA revestidas con JRFL gp120 unidas a PGV04 y a continuacion la adicion de una concentracion CE50 constante de los mAb biotinilados relacionados en la leyenda. Todos los experimentos se llevaron a cabo por duplicado, y los datos son un experimento representativo en el que se representa graficamente la SEM.
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La Fig. 11 representa graficamente la actividad de neutralizacion de PGV04 en un panel de 162 virus y en un panel de 97 virus. (A) Potencia de neutralizacion. Los recuadros estan codificados por colores como sigue: naranja, potencia media entre 0,2 y 2,0 pg/ml; y rojo, potencia media < 0,2 pg/ml. CRF07_BC, CRF08_BC, y los virus AC no se incluyeron en el analisis del clado, pero se hizo el recuento del numero total de virus neutralizados en el panel de 162 virus debido a que solo se ensayo un virus para cada uno de estos clados. Los virus de los clados D y E no se incluyeron en el analisis de los clados, pero se hizo el recuento del virus neutralizado en el panel de 97 virus debido a que solo se ensayaron 2 y 3 virus respectivamente para estos clados. (B) Intervalo de neutralizacion. Los recuadros se colorearon de la siguiente manera: naranja, 61-90 % de virus neutralizados; rojo, 91-100 % de virus neutralizados. Como en (A), CRF07_BC, CRF08_BC, los virus AC, D y E no se incluyeron en el analisis del clado, pero se hizo el recuento del numero total de virus neutralizados para el panel respectivo. (C) Dependencia de NT 50 serico sobre PGV04. Se llevo a cabo la correlacion de Spearman comparando la CI50 del mAb y la NT50 serica del donante para los 162 virus ensayados. Se calculo el coeficiente de correlacion de la ordenacion de Spearman como —0,71 y la correlacion fue significativa con un valor P < 0,0001. La CI50S y NT50S de los virus que no se neutralizan se introdujeron en el Ifmite del ensayo como 50 pg/ml para el mAb o 1O0 (1/dilucion) para el suero.
La Fig. 12 representa graficamente la induccion del sitio de union del correceptor sobre gp120 y los trfmeros expresados sobre la superficie celular. Se anadieron cantidades saturantes de los mAb relacionados en la leyenda tanto a JRFL como a placas ELISA revestidas con YU2 gp120. Tras 30 min de incubacion a TA, se anadio una curva de dilucion de productos biotinilados (A) 17bor(b)X5 biotinilado se anadio durante 1 h a TA. Se detecto la union con estreptavidina-AP y se leyo la absorbancia a 405 nm. Se midio la capacidad de PGV04 de inducir el sitio de union del correceptor sobre los trfmeros de la superficie celular (C). Se anadieron cantidades saturantes de los mAb relacionados en la leyenda a linfocitos 293T que expresaban la envoltura de VIH sobre su superficie durante 30 min. Se anadieron tanto mAb 2G12 17b como mAb 2G12 del control (D) biotinilados a las celulas. Se uso un mAb de estreptavidina conjugado con PE para la deteccion y se midio la union utilizando citometrfa de flujo.
La Fig. 13 representa graficamente la neutralizacion de MAb y la union a R-CSF gp120 que contiene sustituciones de alanina unicas. (A) neutralizacion con PGV04 de pseudovirus JR-CSF que contienen sustituciones de alanina unicas en la protefna gp120. Se midio la entrada en celulas TMZ-bl utilizando un luminometro en unidades relativas de luz (URL). Se calculo la potencia de neutralizacion con respecto a WT utilizando la siguiente ecuacion: (CI50_WT)/(CI50_mutante) * 100. (B) Se aislo la union de PGV04 a JR-CSF gp120 a partir de pseudovirus y que contienen sustituciones de alanina unicas. La numeracion de los aminoacidos se basa en la secuencia de VIH-1HXB2. Los recuadros estan codificados por colores como sigue: azul, 0-5 % de neutralizacion con respecto al tipo natural; verde, 6-40 % de neutralizacion con respecto al tipo natural; y amarillo, 250-1.000 % de neutralizacion con respecto al tipo natural.
La Fig. 14 representa graficamente la capacidad de PGV04 de unirse a Endo-H y BaL gp120 tratado con Endo-F. La union de mAb a (A) gp120 tratado de forma simulada o (B) Endo-H y gp120 tratados con Endo-F.
La Fig. 15 representa graficamente (A) la actividad de neutralizacion de los mAb contra un panel de 162 pseudovirus de clado cruzado. (B) Actividad de neutralizacion de los mAb contra un panel de 97 pseudovirus de clado cruzado.
La Fig. 16 representa graficamente el ensayo ELISA de polirreactividad. Se ensayo PGV04 para determinar la reactividad de ELISA frente a un panel de antfgenos. Se incluyeron tambien los mAb amplios b12 y 4E10 para comparacion.
La Fig. 17 representa graficamente la identificacion y caracterizacion de los mAb de los donantes infectados con VIH-1 74 y 0219. (A) Analisis de RSC3 de suero. Se analizaron doce sueros de la cohorte G del Protocolo JAVI (donantes 17-74) y un suero de la cohorte CHAVI 001 (donante 0219) para la reduccion de RSC3 en la neutralizacion del suero en cepas JR-FL, PVO.4, YU2 y ZA12.29 de VIH-1. Las barras azules muestran la reduccion media de suero en la CI50 de neutralizacion resultante de RSC3 frente a la competicion con ARSC3. Los sueros con mayor reduccion se analizaron adicionalmente en cepas Q168.a2, RW020.2, Du156.12 y ZM 109.4 de VIH-1. Las barras rojas muestran la reduccion media de los ocho virus. (B) Identificacion por citometrfa de flujo de linfocitos B IgG+ reactivos a RSC3 de los donantes 74 y 0219. Se indican la clasificacion y el porcentaje de linfocitos B IgG+ de interes (RSC3+ARSC3-), clasificando los linfocitos B individuales 40 y 26 de los donantes 74 y 0219 respectivamente. (C) Secuencias de protefnas de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los mAb VRC-PG04 y VRC-PG04b, aisladas del donante 74, y los mAb VRC-CH30-34 aislados del donante 0219. Las secuencias se alinearon con los presuntos genes antecesores de la lfnea germinal y se identificaron previamente los anticuerpos de amplio poder neutralizante VRC01, VRC02 y VRC03 de VIH-1. Las regiones marco (FR) y regiones determinates de la complementariedad (CDR) se basan en la nomenclatura de Kabat (E. A. Kabat, T. T. Wu, K. S. Gottesman, C. Foeller, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5a Edicion (1991)). (D) Dendogramas de neutralizacion. Se ensayaron VRC-PG04 y VRC-CH31 frente a pseudovirus Env geneticamente diversos que representan los clados principales de VIH-1. Los arboles de union cercanos presentan la distancia de las protefnas de las secuencias gp160 de los aislados 178 VIH-1 ensayados frente a VRC-PG04 y un subconjunto (80 aislados) ensayado frente a VRC-CH31. Una escala de barras denota una distancia del 1 % en la secuencia de aminoacidos. Se colorearon tres ramas mediante las potencias de neutralizacion de VRC-PG04 y VRC-CH31 frente a cada virus concreto.
La Fig. 18 representa graficamente la estructura de anticuerpos VRC-PG04 y VRC03 en el complejo con VIH-1 gp120. (A) Estructuras globales. Se representan graficamente el complejo del ligando para el anticuerpo Fabof de VRC-PG04 procedente del donante 74 y la glicoprotefna de la envoltura de VIH-1 gp120 procedente del aislado 93TH057 con las estructuras polipeptfdicas en la representacion en cinta en la imagen de la izquierda. El complejo de Fab VRC03 procedente del donante 45 se representa graficamente en la imagen de la derecha, con
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superficies de todos los restos de dominios variables entre VRC03 y VRC-PG04 coloreados de acuerdo con sus caracterfsticas qufmicas. (B y C) Cercanfa de interaccion. Se muestran las interacciones crfticas entre el bucle de union a CD4 de gp120 (purpura) y la region CDR H2 de los mAb con amplio poder neutralizante, VRC03 y VRC-PG04 (notificados aquf) y VRC01 (notificado anteriormente (T. Zhou y col., Structural basis for broad and potent neutralization of HIV-1 by antibody VRC01. Science, 329, 811-817 (2010))), representandose los enlaces de hidrogeno como lfneas punteadas. Las estructuras de resolucion de 1,9 y 2,1 A de VRC03 y VRC-PG04, respectivamente, fueron suficientes para definir el agua interfacial que se muestra en (C), que estaban poco claras en la estructura de 2,9 A de VRC01. La orientacion que se muestra en (C) esta girada ~180° alrededor del eje vertical con respecto a la orientacion que se muestra en (B).
La Fig. 19 representa graficamente la evolucion centrada en los anticuerpos de tipo VRC01. (A) Convergencia de anticuerpos. Las porciones gp120 de los complejos de ligandos con VRC01, VRC03 y VRC-PG04 se superpusieron para determinar la desviacion de Ca promedio por resto de anticuerpo, y se calculo la interaccion hidrofobica por resto (A'G) (E. Krissinel, K. Henrick, Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. J Mol Biol 372,774-797 (2007)). Se encontro que estas dos cantidades estaban correlacionadas (valor P = 0,0427), con restos de anticuerpos que contenfan fuertes interacciones hidrofobas (por ejemplo, en las posiciones 53 y 55 en la cadena pesada, y 91 y 97 en la cadena ligera, numeracion relativa a VRC-PG04) que presentaban una elevada conservacion estructural. Esta correlacion se visualizo en VRC-PG04 en la imagen izquierda, donde el espesor de la cinta es proporcional a la desviacion de Ca por resto correspondiente y la superficie del paratopo esta coloreada de acuerdo con la hidrofobicidad, de blanco (bajo) a rojo (alto); de forma notable, los parches superficiales de color rojo corresponden a cintas delgadas. (B) Convergencia de epftopos. La superficie de gp120 de VIH-1 implicada en la union con CD4 contiene regiones conformacionalmente invariantes (por ejemplo, asociadas con el dominio externo) y regiones conformacionalmente variables (por ejemplo, asociadas con la hoja del acoplamiento). Los solicitantes habfan teorizado anteriormente que el contacto con el dominio externo conformacionalmente invariante para CD4 representa un sitio de vulnerabilidad (T. Zhou y col., Structural basis for broad and potent neutralization of HIV-1 by antibody VRC01. Science, 329, 811-817 (2010)). Los solicitantes analizaron la precision del reconocimiento del ligando por el sitio de union a CD4 (eje vertical) frente a la amplitud de neutralizacion de la CI80 (eje horizontal) y a la correlacion significativa observada (R2 =0,6, valor P=0,040). (C) Divergencias en la secuencia y convergencias en el reconocimiento. El desarrollo de anticuerpos analogos a VRC01 implica una cadena pesada derivada del alelo IGHV1-2*02 y una cadena ligera seleccionada derivada de los alelos Vk. La imagen mas a la izquierda representa graficamente un modelo representativo de cinta de un anticuerpo de una presunta lfnea germinal. La hipermutacion somatica durante el procedimiento de maduracion por afinidad conduce a una divergencia en la secuencia, dando como resultado ademas el reconocimiento convergente de epftopos similares. La interseccion de las superficies del epftopo reconocidas por VRC01, VRC03 y VRC-PG04 (imagen mas a la derecha), desvela una similitud remarcable en el sitio de la vulnerabilidad. La divergencia primaria de esta interseccion procedente del sitio de vulnerabilidad teorizado se produce en la region de VIH-1 gp120 reconocida por la cadena ligera de los anticuerpos analogos a VRC01. Aunque los epftopos separados en gp120 muestran diferencias en la superficie de reconocimiento, estas implican principalmente la region de la lamina de acoplamiento, que es probable que adopte una conformacion diferente en el extremo vfrico funcional antes de vincularse con CD4.
La Fig. 20 representa graficamente la secuenciacion en profundidad de las cadenas pesada y ligera de los donantes 45 y 74. (A) Complementacion de la cadena pesada y la cadena ligera. Los perfiles de neutralizacion de VRC01 y VRC03 (donante 45), VRC-PG04 (donante 74), y VRCCH31 (donante 0219) y sus permutas quimericas de la cadena pesada y la cadena ligera se representan graficamente con los dendogramas de neutralizacion de 20 aislados. En la tabla S13 se proporcionan las neutralizaciones explfcitas de las CI50. (B) Repertorio de secuencias de la cadena pesada procedentes del donante 45 (muestra 2008) y el donante 74 (muestra 2008). Se representaron graficamente las secuencias de la cadena pesada como funcion de la identidad de secuencia con la cadena pesada de VRC01 (izquierda), VRC03 (intermedio) y VRC-PG04 (derecha) y de la divergencia de secuencias de los presuntos alelos genomicos Vh: las graficas de las hileras superiores muestran las secuencias del presunto origen alelico IGHV1-2*02; las graficas de las hileras inferiores muestran las secuencias de otros orfgenes alelicos. La codificacion por colores indica el numero de secuencias. (C) Repertorio de secuencias de la cadena ligera expresadas procedentes del donante 45 (muestra 2001). Se representaron graficamente las secuencias de la cadena ligera como funcion de la identidad de secuencias con las cadenas ligeras VRC01 (izquierda) y VRC03 (derecha), y de la divergencia de secuencias de los presuntos alelos del gen V genomicos. Las secuencias con deleciones en el resto 2 en la region CDR LI (que se observa en VRC01 y VRC03) se muestran como puntos negros. Dos secuencias de cadena ligera, con un 92,0 % de identidad con VRC01 (secuencia ID 181371) y con un 90,3 % de identidad con VRC03 (secuencia ID 223454) se resaltan con triangulos rojos. (D) Evaluacion funcional de las secuencias de cadena ligera identificadas mediante la secuenciacion en profundidad. Se representan graficamente los perfiles de neutralizacion de la secuencia 181371 reconstituida con la cadena pesada VRC01 (denominada gVRC-L1d45) y de la secuencia 223454 reconstituida con la cadena pesada VRC03 (denominada gVRC-L2da5) con los dendogramas de neutralizacion de 20 aislados; en la tabla S22 se proporcionan las neutralizaciones explfcitas de las CI50S. (E) Evaluacion funcional de las secuencias de cadena pesada identificadas mediante la secuenciacion en profundidad. Las secuencias de cadena pesada de los donantes 45 y 74 se sintetizaron y expresaron tanto con la cadena ligera VRC01 o VRC03 (para el donante 45) o la cadena ligera VRC-PG04 (para el donante 74) y se evaluaron para la neutralizacion. Las secuencias con actividad neutralizante se muestran como estrellas rojas y se marcaron. gVRC-H(n)d74 se refiere a las cadenas pesadas con neutralizacion confirmada cuando se reconstituyen con la cadena ligera de VRC-PG04, con controles. Los solicitantes evaluaron
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tambien secuencias derivadas de 454 para la compatibilidad estructural con VRC01, VRC03, y las estructuras cristalinas del complejo VRC-PG04 gp120 utilizando un algoritmo de formacion de hebra que evaluo la compatibilidad estructural utilizando el potencial estadfstico DFIRE (H. Zhou, Y. Zhou, Distance-scaled, finite ideal-gas reference state improves structure-derived potentials of mean force for structure selection and stability prediction. Protein Sci 11,2714-2726 (2002)). Ninguna de las diez secuencias con puntuaciones DFIRE optimas, ni aquellas con una elevada divergencia en la lfnea germinal de origen genomico no de IGHV1-2*02 presento neutralizacion cuando se reconstituyo con la cadena ligera de VRC01 (Fig. 4E). De esta manera, la similitud de la secuencia, el origen de IGHV1-2*02, y la divergencia se correlacionan todos con el potencial de neutralizacion, pero otros factores tales como la compatibilidad estructural prevista fracasaron en identificar los anticuerpos analogos a VRC01.
La Fig. 21, que representa graficamente las similitudes de maduracion de los anticuerpos analogos a VRC01 en diferentes donantes que se desvelaron mediante el analisis filogenetico cruzado de los donantes. (A) Arboles con una probabilidad maxima de secuencias de cadenas pesadas del origen de IGHV1-2*02 procedentes del donante 45 (izquierda) y el donante 74 (derecha). El subconjunto de secuencias que se muestra se selecciono basandose en la divergencia de lfneas germinales como se describe en SOM. El arbol del donante 45 se basa en el presunto antecesor no mutado revertido de la cadena pesada de VRC01, e incluye tambien secuencias con actividad neutralizante especfficas procedentes del donante 74 y 0219 (se muestran en rojo). De manera similar, el arbol del donante 74 se basa en el presunto antecesor no mutado revertido de la cadena pesada de VRC-PG04, y las secuencias del donante 45 y del donante 0219 se incluyeron en el analisis filogenetico de donantes cruzados. Se muestran las barras que representan 0,1 cambios por sitio de nucleotido. Los recuadros muestran las asignaciones de la cadena J para todas las secuencias del subarbol neutralizante identificado por un arbol de uniones proximas iterativo como se describe en SOM. (B) Intermedios de maduracion filogeneticamente inferidos. Se muestran representaciones de la estructura en cinta para VIH-1 gp120 (rojo) y los dominios variables de la cadena pesada (verde). Los intermedios crfticos inferidos del arbol filogenetico en (A) se marcaron con Id45, Ild45, Illd45, Id74 e Ild74. Se proporciona el numero de mutaciones del gen Vh (por ejemplo, para las 23 mutaciones asociadas con la primera intermediacion del donante 45, "W 23"), y la localizacion de estos se destaco en la representacion superficial y se colored de acuerdo con su qufmica.
La Fig. 22 representa graficamente un analisis del conjunto completo de anticuerpos de la cadena pesada del donante 74 y la identificacion de las cadenas pesadas con actividad neutralizante de VIH-1. El analisis de rejilla de identidad/divergencia, el analisis filogenetico de donantes cruzados, y el analisis de CDR H3 se acoplaron a la caracterizacion funcional de las secuencias de cadena pesada seleccionadas. Esto proporciona un medio para identificar novedosas cadenas pesadas con actividad neutralizante de VIH-1. (A) Analisis de rejilla de identidad/divergencia. Se muestra la localizacion de 63 cadenas pesadas de IGHV1-2*02 sintetizadas procedentes del donante 74, incluyendo secuencias neutralizantes (estrellas rojas) y secuencias no neutralizantes (estrellas negras). (B) Analisis filogenetico de donantes cruzados y analisis de linajes CDR H3. Un arbol de probabilidad maxima de las 70 secuencias de cadena pesada sintetizadas (incluyendo 7 secuencias no IGHV1-2*02) se baso en el presunto antecesor no mutado revertido de VRC-PG04. Se muestran los anticuerpos VRC-PG y VRC-CH identificados mediante sonda en texto rojo junto con las 24 secuencias de cadena pesada identificadas genomicamente, gVRC-H(1-24)d74, que se encontraron que neutralizaban VIH-1 cuando se reconstituyeron con la cadena ligera de VRC-PG04. Se especifican las localizaciones de la rejilla y las clases CDR H3 para secuencias neutralizantes y no neutralizantes. En cada clase CDR H3, todas las secuencias con CDR H3 identicas estan resaltadas en naranja en las rejillas mas a la derecha (mostrandose el numero de secuencias totales correspondientes a cada clase CDR H3). (C) Niveles de expresion de las cadenas pesadas seleccionadas reconstituidas con la cadena ligera de VRC-PG04 frente a la amplitud de neutralizacion. (D) Potencia de neutralizacion de los anticuerpos previstos por la filogenia de los donantes cruzados reconstituidos de siete aislados de VIH-1. (E) Analisis de CDR H3 de 74 donantes de secuencias de cadena pesada. Para cada una de las 110.386 secuencias derivadas del alelo IGHV1-2*02, Como se muestra, se determino la CDR H3 y se determino por colores su porcentaje de identidad con el de la cadena pesada de VRC-PG04, y se represento graficamente. Las secuencias con una elevada identidad de CDR H3 con VRC-PG04 residen en regiones con una elevada identidad global de la secuencia de la cadena pesada, incluso para las secuencias con una baja divergencia de IGHV1-2*02.
Descripcion detallada
La presente divulgacion proporciona un novedoso procedimiento para aislar novedosos anticuerpos monoclonales con una amplia y potente actividad neutralizante contra VIH. En particular, la investigacion comenzo con un estudio clfnico patrocinado por IAVI denominado Protocolo G, una busqueda global de nuevos anticuerpos con amplio poder neutralizante contra VIH. Se recogieron muestras de sangre de mas de 1.800 personas positivas para VIH en todo el mundo. El procedimiento implica la seleccion de un donante de PBMC con un tftulo de anticuerpos de elevada neutralizacion en el plasma. Se seleccionaron linfocitos B por su actividad de neutralizacion antes del rescate de anticuerpos. Un procedimiento que prevefa de forma mas fiable si se desarrollaba una muestra dada que contenfa anticuerpos con un amplio poder neutralizante y se puntuaron las muestras en terminos de cuantos tipos de VIH neutralizaban, y el 10 % de la parte superior se separo para un estudio adicional. Se obtuvieron novedosos anticuerpos neutralizantes enfatizando la neutralizacion como la seleccion inicial (vease, por ejemplo, Walker L, Phogat S, y col. Science, 2009; 326:285-9. Epub 3 de septiembre de 2009).
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En una realizacion ventajosa, el rescate recombinante de los anticuerpos monoclonales implica el uso de una clasificacion de linfocitos B espedfica de antfgenos como se describe por Wu y col (Science 329; 856 (2010)). Para aislar mAb dirigidos contra CD4bs, los solicitantes utilizaron un procedimiento de clasificacion de linfocitos B con memoria espedficos de antigenos recientemente descrito (Scheid y col., Nature 458, 636 (2009)), junto con la PCR de una unica celula, para amplificar los genes de la cadena pesada y la cadena ligera de IgG a procedentes del ADNc de linfocitos B individuales (Scheid y col., Nature 458, 636 (2009), Wrammert y col., Nature 453, 667 (2008)). RSC3 y ARSC3 se expresaron con una secuencia de aminoacidos etiquetada que permitfa el marcado de la biotina (Wu y col., Science 329; 856 (2010)). Las dos protemas se distinguinan de esta manera mediante analisis FACS tras el marcado con estreptavidina (SA) conjugada con los fluorocromos aloficocianina (SA-APC) o ficoeritrina (SA-PE), respectivamente. Se incubaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con RSC3 SA-APC y ARSC3 SA-PE, y los linfocitos B con memoria espedficos de antfgenos individuales se clasificaron en los pocillos de una placa de microvaloracion despues de seleccionar los linfocitos B (CD19+, CD20+, IgG+) que se unen a la sonda RSC3, pero no a la sonda ARSC3. Los linfocitos B con memoria espedficos de RSC3 se clasificaron, y los genes de la cadena pesada y la cadena ligera correspondientes a partir de 12 celulas se amplificaron. Tras clonarse en los vectores de expresion de IgG1 que se reconstituyeron con las regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera, se expresaron los mAb de IgG completa.
En otra realizacion, el rescate recombinante de los anticuerpos monoclonales implica el uso de un sistema de cultivo de linfocitos B como se describe en Weitcamp J-H y col., J. Immunol. 171:4680-4688 (2003). Se puede emplear tambien cualquier otro procedimiento de rescate de clones de linfocitos B individuales conocido en la tecnica tal como la inmortalizacion de linfocitos B mediante VEB (Traggiai E., y col., Nat. Med. 10(8):871-875 (2004)), electrofusion (Buchacher, A., y col., 1994. AIDS Res. Hum. Retroviruses 10:359-369), e hibridoma de linfocitos B (Karpas A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1799-1804 (2001).
En algunas realizaciones, se rescataron anticuerpos monoclonales a partir de cultivos de linfocitos B utilizando la RT-PCR espedfica de genes de cadena variable, y se seleccionaron transfectantes con combinaciones de clones de la cadena H y la cadena L de nuevo para la neutralizacion y las actividades de union a un antfgeno de VIH. Se seleccionaron mAb con propiedades de neutralizacion para caracterizacion adicional.
Los anticuerpos de la presente invencion que se identificaron de acuerdo con estos procedimientos se divulgan por Wu y col, Science 329; 856 (2010). Estos anticuerpos se aislaron a partir de una muestra humana obtenida a traves del Protocolo G de IAVI, y estos anticuerpos que neutralizan VIH in vitro se denominan VCR-PG-04.
La invencion se basa en novedosos anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos que neutralizan la infeccion por VIH. En algunas realizaciones, estos anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos tienen concretamente una alta potencia para neutralizar la infeccion por VIH in vitro a traves de multiples clados. Dichos anticuerpos son deseables; ya que solo se requieren bajas concentraciones a fin de neutralizar una cantidad dada de virus. Esto facilita unos mayores niveles de proteccion a la vez que se administran bajas cantidades de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales humanos que secretan dichos anticuerpos se incluyen tambien en el alcance de la invencion.
La invencion se refiere tambien a diversos procedimientos y usos que implican los anticuerpos de la invencion y los epftopos a los cuales se pueden unir.
La invencion proporciona novedosos anticuerpos monoclonales o recombinantes que tienen concretamente una alta potencia en la neutralizacion de VIH. La invencion proporciona tambien fragmentos de estos anticuerpos recombinantes o monoclonales, particularmente fragmentos que retienen la actividad de union a antfgeno de estos anticuerpos, que retienen, por ejemplo, al menos una region determinante de la complementariedad (CDR) espedfica de protemas VIH. En esta memoria descriptiva, por "alta potencia en la neutralizacion de VIH" se entiende que una molecula de anticuerpo de la invencion neutraliza VIH en un ensayo normalizado a una concentracion menor que los anticuerpos conocidos en la tecnica.
La molecula de anticuerpo de la presente invencion puede tener concentraciones de menos de aproximadamente 1 pg/ml, entre aproximadamente 1-10 pg/ml o mas de aproximadamente 10 pg/ml para conseguir un 50 % u 80 % de neutralizacion. En una realizacion ilustrativa, la molecula de anticuerpo de la presente invencion puede tener las concentraciones de la Tabla 4 que representan la concentracion del anticuerpo monoclonal requerida para conseguir una neutralizacion del 50 % (Tabla 4A) u 80 % (Tabla 4B).
En otra realizacion, la molecula de anticuerpo de la presente invencion puede neutralizar una concentracion de 0,16 pg/ml o inferior (es decir, 0,15, 0,125, 0,1, 0,075, 0,05, 0,025, 0,02, 0,016, 0,015, 0,0125, 0,01, 0,0075, 0,005, 0,004 o inferior), preferentemente 0,016 pg/ml o inferior (una concentracion de anticuerpos de 10-8 M o inferior, preferentemente 10-9 M o inferior, preferentemente 10-10 M o inferior, es decir, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M o inferior). Esto significa que solo se requieren concentraciones muy bajas de anticuerpo para una neutralizacion del 50 % de un aislado clmico de VIH in vitro. La potencia puede medirse utilizando un ensayo de neutralizacion normalizado como se describe en la tecnica.
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Los anticuerpos de la invencion son capaces de neutralizar el VIH. Se pueden producir anticuerpos monoclonales mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, como se describe por R. Kennet y col. en "Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines; Progress and Applications". Plenum Press (Nueva York), 1984. Los materiales y procedimientos adicionales se basan en procedimientos conocidos, por ejemplo, tal como se describe en J. Virol. 67:6642-6647, 1993.
Estos anticuerpos se pueden usar como agentes profilacticos o terapeuticos tras la formulacion adecuada, o como una herramienta diagnostica.
Un "anticuerpo con actividad neutralizante" es aquel que puede neutralizar la capacidad de este patogeno para iniciar y/o perpetuar una infeccion en un hospedador y/o en celulas diana in vitro. La invencion proporciona un anticuerpo humano monoclonal neutralizante, en el que el anticuerpo reconoce un antfgeno procedente de VIH.
Preferentemente, un anticuerpo de acuerdo con la invencion es un novedoso anticuerpo monoclonal denominado en el presente documento VRC-PG-04. Estos anticuerpos se aislaron inicialmente de muestras humanas obtenidas segun el Protocolo G de IAVI. Estos anticuerpos han mostrado neutralizar VIH in vitro.
Las CDR de las cadenas pesadas del anticuerpo se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, respectivamente. De manera similar, Las CDR de las cadenas ligeras del anticuerpo se denominan CDRL1, CDRL2 y CDRL3, respectivamente. La posicion de los aminoacidos CDR se define de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT como: CDR1-IMGT posiciones 27 a 38, CDR2-IMGT posiciones 56 a 65 y CDR3-IMGT posiciones 105 a 117. (Lefranc, M P. y col. 2003 IMGt unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-Iike domains. DevComp Immunol. 27(1):55-77; Lefranc, M P. 1997. Unique database numbering system for immunogenetic analysis. Immunology Today, 18:509; Lefranc, M P. 1999. The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-Iike domains. The Immunologist, 7:132-136).
Las secuencias de aminoacidos de las regiones CDR3 de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos se muestran en la FIG. 8.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo con actividad neutralizante puede inhibir la entrada del virus VIH-1 con un fndice de neutralizacion >1,5 o >2,0. Los anticuerpos con amplia y potente actividad neutralizante pueden neutralizar mas de aproximadamente el 50 % de virus VIH-1 (de diversos clados y diferentes cepas en un clado) en un ensayo de neutralizacion.
Se conocen en la tecnica ensayos para seleccionar anticuerpos con actividad neutralizante. Se ha descrito anteriormente un enfoque de ensayo de neutralizacion (Binley JM, y col., (2004). Comprehensive Cross-Clade Neutralization Analysis of a Panel of Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Monoclonal Antibodies. J. Virol. 78: 13232-13252). Pueden generarse virus pseudotipados transfectando simultaneamente celulas con al menos dos plasmidos que codifican el ADN de Env soluble de la presente invencion y el resto del genoma del VIH por separado. En el vector que codifica el genoma de VIH, el gen Env puede estar sustituido por el gen de la luciferasa. Los sobrenadantes transfectantes que contienen el virus pseudotipado pueden incubarse simultaneamente durante la noche con sobrenadantes de los linfocitos B derivados de la activacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) primaria de un donante infectado. Se pueden anadir a la mezcla celulas transfectadas de manera estable y que expresan CD4 mas los correceptores de CCR5 y CXCR4 e incubarse durante 3 dfas a 37 °C. Las celulas infectadas se pueden cuantificar mediante luminometrfa.
El fndice de neutralizacion puede expresarse como la relacion de unidades de luminiscencia relativas normalizadas (ULR) de la cepa vfrica de ensayo a la de un virus del control derivado del mismo sobrenadante del cultivo de linfocitos B. Los valores de corte utilizados para distinguir exitos de neutralizacion pueden determinarse mediante el fndice de neutralizacion de un gran numero de "pocillos control negativos" que contienen sobrenadantes de cultivos de linfocitos B derivados de donantes sanos. Dicho procedimiento era satisfactorio para el aislamiento y caracterizacion de PG9 y PG16.
El procedimiento de la patente de Estados Unidos n.° 7.386.232 se puede usar tambien para seleccionar anticuerpos con un amplio poder neutralizante. Puede construirse una protefna de fusion envoltura-enzima uniendo una enzima al final del extremo C de una protefna de la envoltura. Las partfculas vfricas que comprenden la protefna de fusion y la glicoprotefna de la envoltura natural y/o soluble pueden generarse y utilizarse para infectar celulas diana en el suero de un paciente. Las actividades enzimaticas medidas en dichas celulas infectadas son medidas de la union y la entrada del virus a las celulas diana que estan mediadas por la protefna de la envoltura vfrica natural. Los ejemplos de enzimas que se pueden usar para generar la protefna de fusion incluyen, pero no de forma limitativa, luciferasa, fosfatasa alcalina bacteriana o placentaria, p-galactosidasa, y protefnas fluorescentes tales como protefna fluorescente verde o toxinas. El ensayo, por lo general, puede llevarse a cabo en una placa de 96 pocillos. Las actividades enzimaticas disminuidas en presencia del suero indican que existen anticuerpos con actividad neutralizante en el suero.
En una realizacion ventajosa, se aislaron VRC-PG-04 y VRC-PG-05 utilizando la clasificacion de linfocitos B especffica de antfgenos y la amplificacion mediante la PCR de los genes de la cadena pesada y ligera como se describe en Wu y col (Science 329; 856 (2010)). Se utilizaron sondas de protefnas especfficas de epftopos (RSC3) y mutantes inactivados geneticamente (delta RSC3) como se describe en Wu y col (Science 329; 856 (2010)).
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En otra realizacion, para aislar los mAb dirigidos a CD4bs, se prefiere un procedimiento de clasificacion de linfocitos B con memoria especfficos de antfgenos (Wu y col (Science 329; 856 (2010))), junto con la PCR de una unica celula, para amplificar los genes de la cadena pesada y la cadena ligera de IgG procedentes del ADNc de linfocitos B individuales (J. F. Scheid y col., Broad diversity of neutralizing antibodies isolated from memory B cells in HIV-infected individuals. Nature 458, 636 (2009) y J. Wrammert y col., Nature 453, 667 (2008)). Las sondas de Env mutante se expresan con una secuencia de aminoacidos etiquetada que permite el marcado de la biotina para distinguirla mediante el analisis FACS tras marcar con estreptavidina (SA) conjugada a los fluorocromos aloficocianina (SA-APC) o ficoeritrina (SA-PE), respectivamente. Se incubaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) procedentes de un donante y se incubaron con las sondas de Env mutante marcadas, y se clasificaron linfocitos B con memoria especfficos de antfgenos individuales en los pocillos de una placa de microvaloracion despues de seleccionar los linfocitos B (CD19+, CD20+, IgG+) que se unen a la sonda de referencia. Se clasificaron los linfocitos B con memoria especfficos de sonda de referencia y se amplificaron los genes de la cadena pesada y la cadena ligera correspondientes. Tras clonarse en los vectores de expresion de IgG1 que reconstituyen las regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera, se expresaron los mAb de IgG completa.
La etapa de clonacion para separar clones de individuales de la mezcla de celulas positivas puede llevarse a cabo utilizando una dilucion limitante, micromanipulacion, una deposicion de celulas individuales mediante clasificacion celular u otro procedimiento conocido en la tecnica. Preferentemente, la clonacion se lleva a cabo utilizando dilucion limitante.
Los clones de linfocitos B inmortalizados de la invencion se pueden usar de diversas maneras, por ejemplo, como fuente de anticuerpos monoclonales, como fuente de acido nucleico (ADN o ARNm) que codifica un anticuerpo monoclonal de interes, para la investigacion, etc.
Los epftopos reconocidos por estos anticuerpos pueden tener numerosos usos. Los epftopos y mimotopos en forma purificada o sistemica se pueden usar para aumentar la respuesta inmunitaria (es decir, como una vacuna, o para la produccion de anticuerpos para otros usos) o para seleccionar el suero de un paciente para los anticuerpos que inmunorreaccionan con los epftopos o mimotopos. Preferentemente, dicho epftopo o mimotopo, o antfgeno que comprende dicho epftopo o mimotopo se usa como una vacuna para suscitar una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos de la invencion se pueden usar tambien en un procedimiento para vigilar la calidad de las vacunas, en particular para controlar que el antfgeno de una vacuna contiene el epftopo inmunogeno correcto en la conformacion correcta.
Los epftopos pueden ser tambien utiles en la seleccion de ligandos que se unen a los mencionados epftopos. Dichos ligandos bloquean preferentemente los epftopos y de esta manera evitan la infeccion.
Los compuestos que tienen una estructura qufmica seleccionada segun la invencion, en los que dichos compuestos son aglutinantes de anticuerpos con actividad neutralizante, forman un aspecto adicional de la invencion; y, dichos compuestos pueden utilizarse en procedimientos de tratamientos medicos, tales como para el diagnostico, prevencion o tratamiento de VIH o para estimular anticuerpos para el diagnostico de VIH, incluyendo el uso en vacunas. Adicionalmente, dichos compuestos pueden utilizarse en la preparacion de medicamentos para los mencionados tratamientos o la prevencion, o en composiciones para fines diagnosticos. Los compuestos pueden emplearse solos o en combinacion con otros tratamientos, vacunas o preventivos; y, los compuestos pueden usarse en la preparacion de medicamentos combinados para dichos tratamiento o prevencion, o en kits que contienen el compuesto y el otro tratamiento o preventivo.
Los terminos "protefna", peptido, "polipeptido", y "secuencia de aminoacidos" se usan de manera indistinta en el presente documento para referirse a polfmeros de restos de aminoacidos de cualquier longitud. El polfmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados o analogos de aminoacidos, y puede interrumpirse por restos qufmicos diferentes de los aminoacidos. Los terminos abarcan tambien un polfmero de aminoacidos que se ha modificado naturalmente o mediante intervencion; por ejemplo, formacion de enlaces disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con una marca o componente bioactivo.
Como se usa en el presente documento, los terminos "antfgeno" o "inmunogeno" se usan de manera indistinta para referirse a una sustancia, normalmente una protefna, que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto. El termino se refiere tambien a protefnas que son inmunologicamente activas en el sentido que una vez administradas a un sujeto (tanto de forma directa como administrando al sujeto una secuencia o vector de nucleotidos que codifica la protefna) es capaz de evocar una respuesta inmunitaria del tipo humoral y/o celular dirigida contra la protefna.
El termino "anticuerpo" incluye moleculas intactas, asf como sus fragmentos, tales como Fab, F(ab')2, Fv y scFv que son capaces de unirse al epftopo determinante. Estos fragmentos de anticuerpos retienen alguna capacidad de unirse selectivamente con su antfgeno o receptor e incluyen, por ejemplo:
(i) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de union a antfgeno monovalente de una molecula de anticuerpo puede producirse mediante digestion del anticuerpo completo con la enzima papafna para dar como resultado una cadena ligera intacta y una porcion de una cadena pesada;
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(ii) Fab', el fragmento de una molecula de anticuerpo se puede obtener tratando el anticuerpo completo con pepsina, seguido por reduccion, para dar como resultado una cadena ligera intacta y una porcion de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molecula de anticuerpo;
(iii) F(ab')2, el fragmento del anticuerpo puede obtenerse tratando el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin la subsiguiente reduccion; F(ab')2 es un dfmero de dos fragmentos Fab' unidos entre si por dos enlaces disulfuro;
(iv) scFv, que incluye un fragmento disenado mediante ingenierfa genetica que contiene la region variable de una cadena pesada y una cadena ligera como una molecula de una unica cadena fusionada.
Se conocen en la tecnica los procedimientos generales de preparacion de estos fragmentos. (Vease, por ejemplo, Flarlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988).
Un "anticuerpo con actividad neutralizante" puede inhibir la entrada del virus VIH-1, por ejemplo, SF162 y/o JRCSF con un fndice de neutralizacion >1,5 o >2,0. Los anticuerpos con amplia y potente actividad neutralizante pueden neutralizar mas de aproximadamente el 50 % de virus VlH-1 (de diversos clados y diferentes cepas en un clado) en un ensayo de neutralizacion. La concentracion inhibidora del anticuerpo monoclonal puede ser menor de aproximadamente 25 mg/ml para neutralizar aproximadamente el 50 % de entrada del virus en el ensayo de neutralizacion.
Un "anticuerpo aislado" o "anticuerpo de origen no natural" es aquel que se ha separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrfan interferir con los usos diagnosticos o terapeuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteinaceos o no proteinaceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purifica: (1) hasta mas de un 95 % en peso de anticuerpo segun se determina mediante el procedimiento de Lowry, y lo mas preferente mas de un 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos en el extremo N o la secuencia interna de aminoacidos mediante el uso de un secuenciador de copa rotatoria; o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomasie o, preferentemente, tincion de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de celulas recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estara presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.
El termino "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos salvo por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy especfficos, dirigiendose contra un unico sitio antigenico. Ademas, en contraste con las preparaciones de anticuerpos monoclonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epftopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antfgeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos por que pueden sintetizarse sin estar contaminados por otros anticuerpos. No debe considerarse que el modificador "monoclonal" se prepare requiriendo la produccion del anticuerpo mediante cualquier procedimiento concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales utiles en la presente invencion pueden prepararse mediante la metodologfa del hibridoma descrita en primer lugar por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o se pueden preparar utilizando procedimientos de ADN recombinante en celulas bacterianas, animales o vegetales eucariotas (vease, por ejemplo, patente de Estados Unidos N.° 4.816.567). Se pueden aislar tambien "anticuerpos monoclonales" de bibliotecas de anticuerpos contra fagos utilizando las tecnicas descritas en Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una pocion de un anticuerpo intacto, preferentemente la region de union a antfgeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (vease la patente de EE.UU. N.° 5.641.870; Zapata y col., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moleculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecfficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Debe entenderse que las protefnas, incluyendo los anticuerpos de la invencion, pueden diferir de las secuencias exactas ilustradas y descritas en el presente documento. De esta manera, la invencion contempla deleciones, adiciones y sustituciones de las secuencias que se muestran, siempre que las secuencias funciones de acuerdo con los procedimientos de la invencion. En este sentido, las sustituciones particularmente preferidas seran generalmente de tipo conservativo, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar en una familia de aminoacidos. Por ejemplo, los aminoacidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) acidos-aspartato y glutamato; (2) basicos-lisina, arginina, histidina; (3) no polares-alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares no cargados-glicina, asparagina, glutamina, cistefna, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, y tirosina se clasifican algunas veces como aminoacidos aromaticos. Es razonablemente previsible que una sustitucion aislada o de origen no natural, de leucina con isoleucina o valina, o viceversa; de un aspartato con un glutamato o viceversa; de una treonina con una serina o viceversa; o una sustitucion conservativa similar de un aminoacido con un aminoacido estructuralmente relacionado, no tenga un efecto importante sobre la actividad biologica. Las protefnas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos que las secuencias ilustradas y descritas, pero que poseen sustituciones de aminoacidos poco importantes que no alteran sustancialmente la inmunogenicidad de la protefna
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estan, por lo tanto, comprendidas en el alcance de la invencion.
Como se usa en el presente documento, los terminos "secuencias de nucleotidos" y "secuencias de acidos nucleicos" se refieren a secuencias de acido desoxirribonucleico (ADN) o de acido ribonucleico (ARN), incluidos, sin limitacion, ARN mensajero (ARNm), hfbridos de ADN/ARN, o acidos nucleicos sinteticos. El acido nucleico puede ser monocatenario, o parcial o completamente bicatenario (duplete). Los acidos nucleicos duplete pueden ser homoduplete o heteroduplete.
Como se usa en el presente documento, el termino "transgen" puede utilizarse para referirse a secuencias de nucleotidos "recombinantes" que se pueden derivar de cualquiera de las secuencias de nucleotidos que codifican las protefnas de la presente invencion. El termino "recombinante" significa una secuencia de nucleotidos que ha sido manipulada "por el hombre" y que no se produce en la naturaleza, o que esta unida a otra secuencia de nucleotidos o que se encuentra en una disposicion diferente en la naturaleza. Se entiende que manipulada "por el hombre" significa manipulada por algunos medios artificiales, incluyendo mediante el uso de maquinas, optimizacion de codones, enzimas de restriccion, etc.
Por ejemplo, las secuencias de nucleotidos pueden estar mutadas de tal manera que la actividad de las protefnas codificadas in vivo queda suprimida. Las secuencias de nucleotidos pueden estar optimizadas segun el codon, por ejemplo, los codones pueden optimizarse para uso humano. En las realizaciones preferidas, las secuencias de nucleotidos estan mutadas para suprimir la funcion normal in vivo de las protefnas codificadas, y optimizadas para el codon de uso humano. Por ejemplo, cada uno de Gag, Pol, Env, Nef, RT, y las secuencias Int de la invencion pueden estar alteradas de esta manera.
Con respecto a la optimizacion segun el codon, las moleculas de acidos nucleicos tienen una secuencia de nucleotidos que codifica los antfgenos de la invencion y que se puede disenar para emplear codones que se usan en los genes del sujeto en el que se va a producir el antfgeno. Muchos virus, incluyendo VIH y otros lentivirus, utilizan un gran numero de codones raros y, alterando estos codones para que correspondan a los codones comunmente utilizados en el sujeto deseado, se puede conseguir la expresion potenciada de los antfgenos. Los codones utilizados son codones "humanizados", es decir, los codones son aquellos que aparecen frecuentemente en genes humanos muy expresados (Andre y col., J. Virol. 72:1497-1503,1998) en vez de aquellos codones que se usan frecuentemente por el VIH. Dicha utilizacion del codon proporciona una expresion eficaz de las protefnas de VIH transgenicas en celulas humanas. Se puede usar cualquier procedimiento adecuado de optimizacion segun el codon. Dichos procedimientos, y la seleccion de dichos procedimientos, son bien conocidos der los expertos en la materia. Ademas, existen algunas empresas que optimizaran los codones de las secuencias, tales como Geneart (geneart.com). De esta manera, las secuencias de nucleotidos pueden optimizarse facilmente segun los codones.
La divulgacion abarca ademas secuencias de nucleotidos que codifican variantes y derivados funcionales y/o antigenicamente equivalentes de los antfgenos de la invencion y sus fragmentos funcionalmente equivalentes. Estas variantes, derivados, y fragmentos funcionalmente equivalentes presentan la capacidad de retener la actividad antigenica. Por ejemplo, cambios en una secuencia de ADN que no cambian la secuencia de aminoacidos codificada, asf como aquellos que dan como resultado sustituciones conservativas de restos de aminoacidos, una o unas pocas deleciones o adiciones, y sustituciones de restos de aminoacidos por analogos de aminoacidos son aquellas que no influyen significativamente sobre las propiedades del polipeptido codificado. Las sustituciones de aminoacidos conservativas son glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; acido aspartico/acido glutamico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptofano. En una realizacion, las variantes tienen al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al
menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al
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menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homologfa o identidad con el antfgeno,
epftopo, inmunogeno, peptido o polipeptido de interes.
Para los fines de la presente divulgacion, la identidad u homologfa de la secuencia se determina comparando las secuencias cuando se alinean con el fin de maximizar el solapamiento y la identidad minimizando a la vez los vacfos de secuencia. En particular, la identidad de la secuencia puede determinarse utilizando cualquiera de numerosos algoritmos. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de dos secuencias es el algoritmo de Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268, modificado segun Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993:90: 5873-5877.
Otro ejemplo de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de secuencias es el algoritmo de Myers & Miller, CABIOS 1988;4: 11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (version 2.0) que es parte del paquete del programa informatico de alineacion de secuencias gCg. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoacidos, se puede utilizar una tabla de restos PAM120 en peso, una penalizacion por longitud de hueco de 12, y una penalizacion por hueco de 4. Otro algoritmo util adicional para identificar regiones de similitud de secuencias local es el algoritmo FASTA que se describe en Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448.
Ventajoso para el uso de acuerdo con la presente invencion es el programa informatico WLT-BLAST (Washington
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University BLAST) version 2.0. Se pueden descargar programas WLT-BLAST version 2.0 ejecutables para varias plataformas UNlX de
ftp://blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa se basa en la version 1.4 de WLT-BLAST, que a su vez se basa en el dominio publico NCBI-BLAST version 1.4 (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266:460-480; Altschul y col., Journal of Molecular Biology 1990; 215:403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877).
ftp://blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa se basa en la version 1.4 de WLT-BLAST, que a su vez se basa en el dominio publico NCBI-BLAST version 1.4 (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266:460-480; Altschul y col., Journal of Molecular Biology 1990; 215:403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877).
Las diversas secuencias de nucleotidos recombinantes y anticuerpos de la invencion se preparan utilizando ADN recombinante normalizado y tecnicas de clonacion. Dichas tecnicas son bien conocidas de los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edicion (Sambrook y col. 1989).
Las secuencias de nucleotidos pueden insertarse en "vectores". El termino "vector" es ampliamente usado y entendido por los expertos en la materia, y como se utiliza en el presente documento, el termino "vector" se usa de forma coherente con su significado por los expertos en la materia. Por ejemplo, el termino "vector" se usa comunmente por los expertos en la materia para referirse a un vehfculo que permite o facilita la transferencia de moleculas de acido nucleico de un entorno a otro o que permite o facilita la manipulacion de una molecula de acido nucleico.
Cualquier vector que permita la expresion de los anticuerpos de la presente invencion puede utilizarse de acuerdo con la presente invencion. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invencion pueden utilizarse in vitro (tal como utilizando sistemas de expresion exentos de celulas) y/o en celulas cultivadas que crecen in vitro a fin de producir los anticuerpos anti-VIH codificados, que se pueden usar a continuacion en diversas aplicaciones tales como en la produccion de vacunas proteinaceas. Para dichas aplicaciones, se puede usar cualquier vector que permita la expresion de los anticuerpos in vitro y/o en celulas cultivadas.
Para las aplicaciones donde se desea que los anticuerpos se expresen in vivo, por ejemplo, cuando los transgenes se usan en ADN o en vacunas que contienen ADN, se puede usar cualquier vector que permita la expresion de los anticuerpos de la presente invencion y sea seguro para el uso in vivo. En las realizaciones preferidas los vectores utilizados son seguros para el uso en seres humanos, mamfferos y/o animales de laboratorio.
Para los anticuerpos de la presente invencion que se van a expresar, la secuencia codificante de la protefna debe "unirse operativamente" a secuencias control reguladoras o de acido nucleico que dirigen la transcripcion y la traduccion de la protefna. Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia de codificacion y una secuencia control de acido nucleico o promotor estan "unidas operativamente" cuando estan unidas covalentemente de tal manera que colocan la expresion o la transcripcion y/o la traduccion de la secuencia de codificacion bajo la influencia o el control de la secuencia control de acido nucleico. La "secuencia control de acido nucleico" puede ser cualquier elemento de acido nucleico, tales como, aunque no de forma limitativa a promotores, potenciadores, IRES, intrones, y otros elementos descritos en el presente documento que dirigen la expresion de una secuencia de acido nucleico o secuencia de codificacion que esta unida operativamente al anterior. El termino "promotor" se usara en el presente documento para referirse a un grupo de modulos de control de la transcripcion que se agruparan alrededor del sitio de inicio de la ARN polimerasa I y que cuando se unen operativamente a las secuencias codificantes de la protefna de la invencion conducen a la expresion de la protefna codificada. La expresion de los transgenes de la presente invencion puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible, que inicia la transcripcion solo cuando se expone a algun estfmulo externo concreto, tal como, sin limitacion, antibioticos tales como tetraciclina, hormonas tales como ecdisona, o metales pesados. El promotor puede ser tambien especffico de un tipo de celula, tejido u organo concreto. Se conocen en la tecnica muchos promotores y potenciadores adecuados, y cualquiera de dichos promotores o potenciadores adecuados se puede utilizar para la expresion de los transgenes de la invencion. Por ejemplo, los promotores y/o potenciadores adecuados se pueden seleccionar de la Base de datos de promotores eucariotas (EPDB).
Los vectores utilizados de acuerdo con la presente invencion deben seleccionarse tfpicamente de tal manera que contengan una region reguladora genica adecuada, tal como un promotor o potenciador, de tal manera que se pueden expresar los anticuerpos de la invencion.
Por ejemplo, cuando el objetivo es expresar los anticuerpos de la invencion in vitro, o en celulas cultivadas, o en cualquier sistema procariota o eucariota a fin de producir la(s) protefna(s) codificadas por este anticuerpo, entonces se puede usar cualquier vector adecuado dependiendo de la aplicacion. Por ejemplo, se pueden utilizar plasmidos, vectores vfricos, vectores bacterianos, vectores protozoarios, vectores de insectos, vectores de expresion de baculovirus, vectores de levaduras, vectores de celulas de mamfferos, y similares. Los tecnicos expertos pueden seleccionar los vectores adecuados teniendo en consideracion las caracterfsticas del vector y los requisitos para expresar los anticuerpos en las circunstancias identificadas.
En una realizacion ventajosa, se pueden utilizar vectores de expresion IgG1 para reconstituir regiones constantes de la cadena pesada y ligera si se clonan los genes de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos de la presente invencion.
Cuando el objetivo es expresar los anticuerpos de la invencion in vivo en un sujeto, por ejemplo, para generar una respuesta inmunitaria contra un antfgeno de VIH-1 y/o una inmunidad protectora contra VIH-1, deben seleccionarse vectores de expresion que sean adecuados para la expresion en este sujeto, y que sean seguros para el uso in vivo.
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Por ejemplo, en algunas realizaciones puede desearse expresar los anticuerpos de la invencion en un animal de laboratorio, tal como para el ensayo preclmico de las composiciones inmunogenicas de VIH-1 y las vacunas de la invencion. En otras realizaciones, sera deseable expresar los anticuerpos de la invencion en sujetos humanos, tales como en ensayos clmicos y para el uso clmico real de las composiciones inmunogenicas y la vacuna de la invencion. Se pueden emplear cualesquiera vectores que sean adecuados para dichos usos, y estara comprendido en las capacidades del tecnico experto seleccionar un vector adecuado. En algunas realizaciones puede preferirse que los vectores utilizados para esto en aplicaciones in vivo esten atenuados en el vector de la amplificacion en el sujeto. Por ejemplo, si se utilizan vectores plasmidos, preferentemente careceran de un origen de replicacion que actue en el sujeto para potenciar la seguridad para el uso in vivo en el sujeto. Si se utilizan vectores vmcos, preferentemente estan atenuados o tienen una replicacion defectiva en el sujeto, de nuevo, con el fin de potenciar la seguridad para el uso in vivo en el sujeto.
En realizaciones preferidas de la presente invencion se usan vectores vmcos. Los vectores de expresion vmcos son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, virus tales como adenovirus, virus adenoasociados (VAA), alfavirus, herpesvirus, retrovirus y poxvirus, incluyendo los virus de la viruela aviar, poxvirus atenuados, virus vaccinia, y, particularmente, el virus vaccinia Ankara modificado (MVA; n.° de registro de ATCC VR-1566). Dichos virus, cuando se usan como vectores de expresion no son patogenos de forma innata en los sujetos seleccionados tales como seres humanos o se han modificado para volverlos no patogenos en los sujetos seleccionados. Por ejemplo, son bien conocidos los adenovirus y alfavirus defectivos para la replicacion y se pueden usar como vectores de administracion de genes.
Las secuencias y vectores de nucleotidos se pueden administrar a celulas, por ejemplo, si el objetivo es expresar los antfgenos de VIH-1 en celulas a fin de producir y aislar las protemas expresadas, tal como a partir de celulas que crecen en el cultivo. Para expresar los anticuerpos en celulas se puede usar cualquier procedimiento de transfeccion, transformacion o de administracion genica adecuados. Dichos procedimientos son bien conocidas de los expertos en la tecnica, y un experto en la tecnica sena capaz de seleccionar con facilidad un procedimiento adecuado dependiendo de la naturaleza de las secuencias de nucleotidos, vectores, y tipos de celulas utilizados. Por ejemplo, se puede usar la transfeccion, transformacion, microinyeccion, infeccion, electroporacion, lipofeccion, o administracion mediada por liposomas. La expresion de los anticuerpos podna llevarse a cabo en cualquier tipo adecuado de celulas hospedadoras, tales como celulas bacterianas, levaduras, celulas de insecto, y celulas de mairnfero. Los anticuerpos de la invencion pueden expresarse tambien utilizando sistemas que incluyen transcripcion/traduccion in vitro. Todos los procedimientos mencionados son bien conocidos de los expertos en la materia, y un experto en la tecnica sena capaz de seleccionar con facilidad un procedimiento adecuado dependiendo de la naturaleza de las secuencias de nucleotidos, vectores, y tipos de celulas utilizados.
Las secuencias de nucleotidos o anticuerpos de la invencion se administran in vivo, por ejemplo, cuando el objetivo es producir una respuesta inmunogena en un sujeto. Un "sujeto" en el contexto de la presente invencion puede ser cualquier animal. Por ejemplo, en algunas realizaciones puede desearse expresar los transgenes en un animal de laboratorio, tal como para el ensayo preclmico de las composiciones inmunogenicas de VIH-1 y las vacunas de la invencion. En otras realizaciones, sera deseable expresar los anticuerpos de la invencion en sujetos humanos, tales como en ensayos clmicos y para el uso clmico real de las composiciones inmunogenicas y la vacuna de la invencion. En realizaciones preferidas el sujeto es un ser humano, por ejemplo, un ser humano que esta infectado con, o esta en riesgo de infeccion con, VIH-1.
El termino "composicion farmaceutica" se usa en el presente documento para definir una composicion solida o ftquida en una forma, concentracion y nivel de pureza adecuados para su administracion a un paciente (por ejemplo, un paciente humano) que, tras cuya administracion, puede estimular los cambios fisiologicos deseados. Los terminos "composicion inmunogena" y "composicion inmunologica" y "composicion inmunogena o inmunologica" abarcan cualquier composicion que estimule una respuesta inmunitaria contra el patogeno dirigido, VIH. Terminos tales como "composicion de vacunacion" y "vacuna" y "composicion de vacuna" abarcan cualquier composicion que induzca una respuesta inmunitaria protectora contra el patogeno dirigido o que proteja eficazmente contra el patogeno; por ejemplo, tras la administracion o inyeccion, estimula una respuesta inmunitaria protectora contra el patogeno diana o proporciona una proteccion eficaz contra el patogeno. De acuerdo con ello, una composicion inmunogena o inmunologica induce una respuesta inmunitaria que puede, pero no es necesario, que sea una respuesta inmunitaria protectora. Se puede usar una composicion inmunogena o inmunologica en el tratamiento de individuos infectados con el patogeno, por ejemplo, para estimular una respuesta inmunitaria contra el patogeno, tal como estimular anticuerpos contra el patogeno. De esta manera, una composicion inmunogena o inmunologica puede ser una composicion farmaceutica. Ademas, cuando el texto habla de "inmunogeno, antfgeno o epftopo", un inmunogeno puede ser un antfgeno o epftopo de un antfgeno. Una composicion diagnostica es una composicion que contiene un compuesto o anticuerpo, por ejemplo, un compuesto o anticuerpo marcado, que se usa para detectar la presencia en una muestra, tal como una muestra biologica, por ejemplo, sangre, semen, fluido vaginal, etc., de un anticuerpo que se une al compuesto o a un inmunogeno, antfgeno o epftopo que se une al anticuerpo; por ejemplo, un anticuerpo anti-VIH o un inmunogeno, antfgeno o epftopo de VIH.
Para dichas aplicaciones in vivo, las secuencias de nucleotidos, anticuerpos de la invencion se administran preferentemente como un componente de una composicion inmunogena que comprende las secuencias de nucleotidos y/o los antfgenos de la invencion en premezcla con un transportador farmaceuticamente aceptable. Las
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composiciones inmunogenicas de la invencion son utiles para estimular una respuesta inmunitaria contra VIH-1 y se pueden usar como uno o mas componentes de una vacuna profilactica o terapeutica contra VIH-1 para la prevencion, el alivio o el tratamiento del SIDA. Los acidos nucleicos y vectores son particularmente utiles para proporcionar vacunas geneticas, es decir, vacunas para administrar los acidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invencion a un sujeto, tal como un ser humano, de tal manera que los anticuerpos se expresan a continuacion en el sujeto para estimular una respuesta inmunitaria.
La presente divulgacion se refiere tambien a los procedimientos para inmunizar o reducir el efecto de una infeccion por VIH o una enfermedad relacionada con VIH que puede comprender identificar un paciente que necesita dicho tratamiento, y administrar a dicho paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un anticuerpo de la presente invencion. El procedimiento puede comprender adicionalmente la administracion de un segundo agente terapeutico. El segundo agente terapeutico puede ser un agente antivfrico. El agente antivfrico puede ser Abacavir, Aciclovir, Adefovir, Amantadina, Amprenavir, Ampligen, Aplaviroc, Arbidol, Atazanavir, Atripla, Boceprevir, Cidofovir, Combivir, Darunavir, Delavirdina, Didanosina, Docosanol, Edoxudina, Efavirenz, Emtricitabina, Enfuvirtida, Entecavir, Inhibidores de la entrada, Famciclovir, Fomivirsen, Fosamprenavir, Foscarnet, Fosfonet, Inhibidores de la fusion, Ganciclovir, lbacitabina, Imunovir, Idoxuridina, Imiquimod, Indinavir, lnosina, Inhibidores de la integrasa, Interferon (por ejemplo, de tipo I, Il o III), Lamivudina, Lopinavir, Lovirida, Maraviroc, Moroxidina, Metisazona, Nelfinavir, Nevirapina, Nexavir, Analogos de nucleosidos, Oseltamivir (Tamiflu), Peginterferon alfa-2a, Penciclovir, Peramivir, Pleconaril, Podofilotoxina, Inhibidores de la proteasa, Raltegravir, Inhibidores de la transcriptasa inversa, Ribavirina, Rimantadina, Ritonavir, Piramidina, Saquinavir, Estavudina, Tenofovir, Tenofovir disoproxilo, Tipranavir, Trifluridina, Trizivir, Tromantadina, Truvada, Valaciclovir (Valtrex), Valganciclovir, Vicriviroc, Vidarabina, Viramidina, Vicriviroc, Zalcitabina, Zanamivir (ReIenza) o Zidovudina o una de sus combinaciones.
La presente divulgacion se refiere tambien a los procedimientos de inmunizar o reducir el efecto de una infeccion por VIH o una enfermedad relacionada con VIH que puede comprender identificar un paciente que necesita dicho tratamiento y administrar a dicho paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de: un primer anticuerpo de la presente invencion, o uno de sus fragmentos, especffico de un primer epftopo que se une a dicho primer anticuerpo y un segundo anticuerpo de la presente invencion, o uno de sus fragmentos, especffico para un segundo epftopo que se une a dicho segundo anticuerpo. En una realizacion, el primer anticuerpo puede ser vRC-PG-04. En otra realizacion, el segundo anticuerpo puede ser VRC-PG-04. En otra realizacion adicional, el segundo anticuerpo puede ser VRC01, VRC02, VRC03, VRCCH30, VRCCH31, VRCCH32, VRCCH33 o VRCCH34.
Los expertos en la materia saben identificar a un paciente que necesita tratamiento para una infeccion por VIH o una enfermedad relacionada con VIH. Un paciente que necesita el tratamiento para una infeccion por VIH o una enfermedad relacionada con VIH puede identificarse tambien detectando el VIH. En particular, puede detectarse el VIH mediante una prueba de VIH tal como un anticuerpo (por ejemplo, ELISA o transferencia western) para VIH y/o una prueba de acido nucleico (por ejemplo, RT-PCR). En general, la infeccion por VIH-1 se asocia con una disminucion progresiva del recuento de linfocitos T CD4+ y un aumento en el nivel de VIH en sangre. La etapa de infeccion puede determinarse midiendo el recuento de linfocitos T CD4+ y la carga vfrica.
Las composiciones de la invencion pueden ser suspensiones inyectables, soluciones, pulverizaciones, polvos liofilizados, jarabes, elfxires y similares. Se puede usar cualquier forma adecuada de composicion. Para preparar dicha composicion, un acido nucleico o vector de la invencion, que tiene al grado deseado de pureza, se mezcla con uno o mas transportadores y/o excipientes farmaceuticamente aceptables. Los transportadores y excipientes deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la composicion. Los transportadores, excipientes, o estabilizantes aceptables no son toxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no de forma limitativa, agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, o sus combinaciones, tampones tales como fosfato, citrato, y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butflico o bencflico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); protefnas, tales como albumina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de protefna-Zn); y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEENTM, PLLTRONICSTM o polietilenglicol (PEG).
Una composicion inmunogena o inmunologica puede formularse tambien en forma de una emulsion de aceite en agua. La emulsion de aceite en agua puede estar basada, por ejemplo, en un aceite de parafina ligero lfquido (tipo Farmacopea Europea); aceite isoprenoide tal como escualeno, escualeno, EICOSANETM o tetratetracontano; aceite resultante de la oligomerizacion de alqueno(s), por ejemplo, isobuteno o deceno; esteres de acidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, tal como aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; esteres de idos grasos o alcoholes ramificados, por ejemplo, esteres de acido isoestearico. El aceite se usa ventajosamente en combinacion con emulsionantes para formar la emulsion. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no ionicos, tales como esteres de sorbitan, manida
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(por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol, propilenglicol, y acido oleico, isoestearico, ricinoleico, o hidroxiestearico, que se etoxilan opcionalmente, y copolfmeros en bloque de polioxipropilenpolioxietileno, tales como productos Pluronic®, por ejemplo, L121. El adyuvante puede ser una mezcla de emulsionante(s), agente formador de micelas, y un aceite tal como el que esta comercialmente disponible con el nombre Provax® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA).
Las composiciones inmunogenicas de la invencion pueden contener sustancias adicionales, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes, o adyuvantes para potenciar la eficacia de las vacunas (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion, Mack Publishing Company, (ed.) 1980).
Se pueden incluir tambien adyuvantes. Los adyuvantes incluyen, pero no de forma limitativa, sales minerales (por ejemplo, AIK(SO4)2, AINa(SO4)2, AINH(SO4)2, sflice, alum, AI(OH)3, Ca3(PO3)2, caolm, o carbon), polinucleotidos con o sin complejos de inmunoestimulacion (ISCOM) (por ejemplo, oligonucleotidos CpG, tales como los descritos en Chuang, T.H. y col, (2002) J. Leuk. Biol. 71(3): 538-44; Ahmad-Nejad, P. y col (2002) Eur. J. Immunol. 32(7): 1958-68; acidos poli IC o poli AU, poliarginina con o sin CpG (conocido tambien en la tecnica como IC31; vease Schellack, C. y col (2003) Proceedings of the 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology; Lingnau, K. y col (2002) Vaccine 20(29-30): 3498-508), JuvaVaxTM (patente de Estados Unidos n.° 6.693.086), determinadas sustancias naturales (por ejemplo, cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias que se encuentra en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, o miembros del genero Brucella), flagelina (ligando del receptor 5 de tipo Toll; vease McSorley, SJ. y col (2002) J. Immunol. 169(7): 3914-9), saponinas tales como QS21, qS17, y QS7 (Patentes de EE.UU. con numeros 5.057.540; 5.650.398; 6.524.584; 6.645.495), monofosforil lfpido A, en particular, monofosforil lfpido A 3-de-O-acilado (3D-MPL), imiquimod (conocido tambien en la tecnica como IQM y comercialmente disponible como Aldara®; Patentes de EE.UU. con numeros 4.689.338; 5.238.944; Zuber, A.K. y col (2004) 22(13-14): 1791-8), y el inhibidor CMPD167 de CCR5 (vease Veazey, R.S. y col (2003) J. Exp. Med. 198: 1551-1562).
Se usan habitualmente hidroxido o fosfato de aluminio (alum) en solucion al 0,05 a 0,1 % en solucion salina tamponada. Otros adyuvantes que se pueden usar, especialmente con vacunas de ADN, son la toxina del colera, especialmente los CTA1-DD/ISCOM (vease Mowat, A.M. y col (2001) J. Immunol. 167(6): 3398-405), polifosfazenos (Allcock, H.R. (1998) App. Organometallic Chem. 12(10-11): 659-666; Payne, L.G. y col (1995) Pharm. Biotechnol. 6: 473-93), citoquinas tales como, pero no de forma limitativa, IL-2, IL-4, GM-CSF, iL-12, IL-15 IGF-1, IFN-a, IFN-p, e IFN-y (Boyer y col., (2002) J. Liposome Res. 121:137-142; documento WO 01/095919; protemas inmunorreguladoras tales como CD40L (ADX40; veanse, por ejemplo, documento WO 03/063899), y el CD1, un ligando de los linfocitos citolfticos naturales (conocido tambien como CRONY o a-galactosil ceramida; vease Green, T.D. y col, (2003) J. Virol. 77(3): 2046-2055), protemas de fusion inmunoestimuladoras tales como IL-2 fusionada al fragmento Fc de las inmunoglobulinas (Barouch y col., Science 290:486-492, 2000) y las moleculas coestimuladoras B7.1 y B7.2 (Boyer), todas las cuales se pueden administrar tanto como protemas como en la forma de ADN, sobre los mismos vectores de expresion que los que codifican los antfgenos de la invencion o en vectores de expresion diferentes.
En una realizacion ventajosa, los adyuvantes pueden ser lecitina que se combina con un polfmero acnlico (Adjuplex-LAP), lecitina revestida con gotmulas de aceite en una emulsion de aceite en agua (Adjuplex-LE) o lecitina y un polfmero acnlico en una emulsion de aceite en agua (Adjuplex-LAO) (Advanced BioAdjuvants (ABA)).
Las composiciones inmunogenicas pueden disenarse para introducir los acidos nucleicos o los vectores de expresion hasta un sitio de accion deseado y liberarse en este a una velocidad adecuada y controlable. Se conocen en la tecnica procedimientos para preparar formulaciones de liberacion controlada. Por ejemplo, pueden producirse preparaciones de liberacion controlada mediante el uso de polfmeros para complejar o absorber el inmunogeno y/o la composicion inmunogena. Puede prepararse una formulacion de liberacion controlada utilizando macromoleculas adecuadas (por ejemplo, poliesteres, poliaminoacidos, polivinilo, pirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o sulfato de protamina) conocidos por proporcionar las caractensticas de liberacion controlada o el perfil de liberacion deseados. Otro posible procedimiento para controlar la duracion de la accion mediante una preparacion de liberacion controlada es incorporar los principios activos en partmulas de un material polimerico tal como, por ejemplo, poliesteres, poliaminoacidos, hidrogeles, acido polilactico, acido poliglicolico, copolfmeros de estos acidos, o copolfmeros de etileno acetato de vinilo. Como alternativa, en vez de incorporar estos principios activos en partmulas polimericas, es posible atrapar estos materiales en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcapsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administracion de farmaco en forma coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Se divulgan dichas tecnicas en New Trends and Developments in Vaccines, Voller y col. (eds.), University Park Press, Baltimore, Md., 1978 and Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion.
Las dosificaciones adecuadas de los acidos nucleicos y los vectores de expresion de la invencion en la composicion inmunogena de la invencion pueden determinarse facilmente por los expertos en la materia. Por ejemplo, la dosificacion de los anticuerpos puede variar dependiendo de la ruta de administracion y del tamano del sujeto. Las dosis adecuadas pueden determinarse por una persona normalmente experta en la materia, midiendo, por ejemplo, la respuesta inmunitaria de un sujeto, tal como un animal de laboratorio, usando tecnicas inmunologicas convencionales, y ajustando las dosificaciones segun sea adecuado. Dichas tecnicas para medir la respuesta inmunitaria del sujeto
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incluyen, pero no de manera limitativa, ensayos de liberacion de cromo, ensayos de union a tetrameros, ensayos ELISPOT de IFN-y, ensayos ELISPOT de IL-2, ensayos de citoquinas intracelulares, y otros ensayos de deteccion inmunologica, por ejemplo, como se detalla en el texto "Antibodies: A Laboratory Manual" by Ed Harlow and David Lane.
Cuando se proporcionan profilacticamente, las composiciones inmunogenicas de la invencion se administran idealmente a un sujeto antes de la infeccion por VIH, o de las evidencias de infeccion por VIH, o antes de cualquier sfntoma debido a SIDA, especialmente en sujetos de alto riesgo. La administracion profilactica de las composiciones inmunogenicas puede servir para proporcionar inmunidad protectora a un sujeto frente a la infeccion por VIH-1 o para prevenir o atenuar la progresion del SIDA en un sujeto ya infectado con VIH-1. Cuando se proporciona terapeuticamente, las composiciones inmunogenicas pueden servir para aliviar y tratar los sfntomas del SIDA y se usan de forma ventajosa tan pronto como sea posible despues de la infeccion, preferentemente antes de la aparicion de cualquier sfntoma de SIDA, pero tambien pueden utilizarse a (o despues) del inicio de los sfntomas de la enfermedad.
Las composiciones inmunogenicas pueden administrarse usando cualquier procedimiento de administracion adecuado, incluyendo, pero no de forma limitativa, la administracion intramuscular, intravenosa, intradermica, mucosal, y topica. Dichas tecnicas son bien conocidas de los expertos en la materia. Ejemplos mas especfficos de procedimientos de administracion son la inyeccion intramuscular, inyeccion intradermica, e inyeccion subcutanea. Sin embargo, la necesidad de administracion no se limita a los procedimientos de inyeccion. Adicionalmente, se ha conseguido la administracion de ADN a tejido animal mediante liposomas cationicos (Watanabe y col., (1994) Mol. Reprod. Dev. 38:268-274; y documento Wo 96/20013), inyeccion directa de ADN puro a tejido muscular animal (Robinson y col., (1993) Vaccine 11:957-960; Hoffman y col., (1994) Vaccine 12:1529-1533; Xiang y col., (1994) Virology 199:132-140; Webster y col., (1994) Vaccine 12: 1495-1498; Davis y col., (1994) Vaccine 12: 1503-1509; y Davis y col., (1993) Hum. Mol. Gen. 2: 1847-1851), o la inyeccion intradermica de ADN utilizando tecnologfa de "pistola genica" (Johnston y col., (1994) Meth. Cell Biol. 43:353-365). Como alternativa, las rutas de administracion pueden ser oral, intranasal o mediante cualquier otra ruta adecuada. La administracion se puede llevar a cabo mediante una superficie mucosal tal como la anal, vaginal o la mucosa oral.
Los calendarios de inmunizacion (o regfmenes) son bien conocidos para los animales (incluyendo seres humanos) y se pueden determinar facilmente para el sujeto y la composicion inmunogena concretos. De este modo, los inmunogenos pueden administrarse una o mas veces al sujeto. Preferentemente, existe un intervalo de tiempo ajustado entre administraciones diferentes de la composicion inmunogena. Aunque este intervalo varfa para cada sujeto, normalmente oscila de 10 dfas a varias semanas, y es a menudo de 2, 4, 6 u 8 semanas. Para seres humanos, el intervalo es normalmente de 2 a 6 semanas. El regimen de inmunizacion tiene normalmente de 1 a 6 administraciones de la composicion inmunogena, pero puede tener incluso solamente una o dos o cuatro. Los procedimientos de inducir una respuesta inmunitaria pueden incluir tambien la administracion de un adyuvante con los inmunogenos. En algunos casos, una inmunizacion de refuerzo anual, bianual u otro intervalo largo (5-10 anos) puede suplementar el protocolo de inmunizacion inicial.
Los presentes procedimientos incluyen tambien una variedad de regfmenes de estfmulo-refuerzo, por ejemplo, regfmenes de estfmulo-refuerzo con ADN de Adenovirus. En estos procedimientos, una o mas inmunizaciones de estfmulo van seguidas por una o mas inmunizaciones de refuerzo. La composicion inmunogena real puede ser igual o diferente para cada inmunizacion y el tipo de composicion inmunogena (por ejemplo, conteniendo protefnas o vectores de expresion), puede variarse tambien la ruta, y la formulacion de los inmunogenos. Por ejemplo, si se usa un vector de expresion para las etapas de estfmulo y refuerzo, puede ser de un tipo tanto igual como diferente (por ejemplo, ADN o un vector de expresion bacteriana o vfrica). Un regimen de estfmulo-refuerzo util proporciona dos inmunizaciones de estfmulo, con una separacion de cuatro semanas, seguido por dos inmunizaciones de refuerzo a las 4 y 8 semanas despues de la ultima inmunizacion de estfmulo. Debe ser tambien facilmente evidente para un experto en la tecnica que existen algunas permutaciones y combinaciones que estan incluidas usando el ADN, vectores de expresion bacterianos y vfricos de la invencion para proporcionar los regfmenes de estfmulo y cebado.
Una realizacion especffica proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria contra VIH en un sujeto administrando una composicion inmunogena de la invencion, que comprende preferentemente un vector de adenovirus que contiene ADN que codifica uno o mas de los anticuerpos de la invencion, una o mas veces a un sujeto en el que los epftopos se expresan en nivel suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto. Dichas inmunizaciones pueden repetirse multiples veces a intervalos de tiempo de al menos 2, 4 o 6 semanas (o mas) de acuerdo con un regimen de inmunizacion deseado.
Las composiciones inmunogenicas de la invencion pueden administrarse solas, o se pueden administrar simultaneamente, o administrarse secuencialmente, con otros inmunogenos de VIH y/o composiciones inmunogenicas de VIH, por ejemplo, con "otras" composiciones inmunologicas, antigenicas o de vacuna o terapeuticas proporcionando de esta forma composiciones multivalentes o un "coctel" o combinacion de la invencion y los procedimientos de emplearlos. De nuevo, se pueden determinar los ingredientes y la manera (secuencial o administracion simultanea) de administracion, asf como las dosificaciones teniendo en consideracion dichos factores como la edad, sexo, peso, especie y dolencia del sujeto concreto, y la via de administracion.
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Las composiciones inmunogenicas de la invencion pueden administrarse solas, o se pueden administrar simultaneamente, o administrarse secuencialmente, con otros agentes terapeuticos, proporcionando por tanto composiciones multivalentes o un "coctel" o combinacion de la invencion y los procedimientos para emplearlos. El agente terapeutico puede ser un agente antivfrico. Los agentes antivfricos utiles incluyen, pero no de forma limitativa, analogos de nucleosidos, tales como zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, Idoxuridina, trifluridina, y ribavirina, asf como asfoscarnet, amantadina; rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, y los interferones alfa. De nuevo, se pueden determinar los ingredientes y la manera de administracion (secuencial o administracion simultanea), asf como las dosificaciones teniendo en consideracion dichos factores como la edad, sexo, peso, especie y dolencia del sujeto concreto, y la via de administracion.
Cuando se usan en combinacion, los otros inmunogenos de VIH se pueden administrar al mismo tiempo o en momentos diferentes como parte de un regimen de inmunizacion global, por ejemplo, como parte de un regimen de estfmulo-refuerzo u otro protocolo de inmunizacion. En una realizacion ventajosa, el otro inmunogeno de VIH es env, preferentemente el trfmero env de VIH.
Se conocen en la tecnica muchos otros inmunogenos de VIH, Uno de dichos inmunogenos preferido es HIVA (descrito en el documento WO 01/47955), que puede administrarse como protefna, sobre un plasmido (por ejemplo, pTHr.HIVA) o en un vector vfrico (por ejemplo, MVA.HIVA). Otro de dichos inmunogenos de VIH es RENTA (descrito en el documento PCT/LTS2004/037699), que se puede administrar tambien como protefna, sobre un plasmido (por ejemplo, pTHr.RENTA) o en un vector vfrico (por ejemplo, MVA.RENTA).
Por ejemplo, un procedimiento de inducir una respuesta inmunitaria contra VIH en un sujeto humano comprende administrar al menos una dosis de estfmulo de un inmunogeno de VIH y al menos una dosis de refuerzo de un inmunogeno de VIH, en el que el inmunogeno en cada dosis puede ser igual o diferente, con la condicion de que al menos uno de los inmunogenos es un epftopo de la presente invencion, un acido nucleico que codifica un epftopo de la invencion o un vector de expresion, preferentemente un vector VSV, que codifica un epftopo de la invencion, y en el que los inmunogenos se administran en una cantidad o se expresan a un nivel suficiente para inducir una respuesta inmunitaria especffica de VIH en el sujeto. La respuesta inmunitaria especffica de VIH puede incluir una respuesta inmunitaria de los linfocitos T especffica de VIH o una respuesta inmunitaria de los linfocitos B especffica de VIH. Dichas inmunizaciones pueden llevarse a cabo a intervalos, preferentemente de al menos 2-6 o mas semanas.
La invencion se describira ahora adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Uso de RSC3 y sondas mutantes de RSC3 para aislar dos nuevos anticuerpos monoclonales neutralizantes a partir de donantes de PBMC siguiendo el Protocolo G de IAVI
El analisis del suero del Protocolo G y PBMC se llevo a cabo como sigue. Un conjunto de 12 sueros con amplio poder neutralizante se analizo en primer lugar mediante ELISA de nucleos estabilizados resurgidos (RSC3) para encontrar evidencias de anticuerpos dirigidos contra el sitio de union a CDA4 (CD4bs). Se analizaron adicionalmente los sueros positivos en un ensayo de neutralizacion por competicion utilizando RSC3 para bloquear la neutralizacion del suero. Esto demostro que los sueros tienen anticuerpos con actividad neutralizante (NAbs) para el CD4bs. Cuatro de doce sueros (4/12) tuvieron evidencias de neutralizacion dirigida contra CD4bs; se selecciono uno para el aislamiento de mAb (el codigo de VRC era IAVIn°2, que corresponde a la muestra n°27-374 de IAVI).
Se llevo a cabo el procedimiento de aislamiento de anticuerpos monoclonales como sigue. El procedimiento utilizado fue esencialmente el mismo que se describe en Wu y col, Science 329; 856 (2010). Se incubaron las PBMC con RSC3 y ARSC3 para encontrar linfocitos B reactivos con RSC3 y sin ARSC3; Los linfocitos B individuals se clasificaron en placas de 96 pocillos. Los genes de la region variable de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se amplificaron mediante la PCR y se clonaron en vectores de expresion (uno para la pesada y uno para la ligera) y se expreso IgG completa.
La Fig. 1 representa graficamente la competicion de protefnas que muestra que el suero 27-374 tiene anticuerpos con actividad neutralizante contra CD4bs. Se muestra sobre el eje x la neutralizacion del suero de 27-374 por IAVI frente a un panel de virus. Las barras muestran el % de reduccion en la neutralizacion para cada virus cuando se anade la protema RSC3 como un competidor. El ARSC3 es un mutante inactivado geneticamente. Los datos muestran que ~ 50 % de neutralizacion del suero contra cada virus podrfa bloquearse por RSC3 -indicando la presencia de anticuerpos con actividad neutralizante dirigidos contra CD4bs.
La Fig. 2 representa graficamente una clasificacion de celulas unicas para los linfocitos B reactivos con RSC3, en particular un perfil de clasificacion de las PBMC del donante: 27-374. Esquema para aislar los linfocitos B especfficos que produjeron VRC-PG-04 y VRC-PG-05. Se incubaron las PBMC del donante con la forma natural de la protefna cloak-2a y la protefna mutante A371. La protema RSC3 es muy especffica para los anticuerpos contra el sitio de union de CD4; el mutante no se une a dichos anticuerpos. Ambas protefnas se marcan con biotina y, a continuacion, se marcan con diferentes fluorocromos de color. Se llevo a cabo la citometrfa de flujo para aislar linfocitos B con memoria y para identificar adicionalmente linfocitos B que se unen a RSC3, y no al mutante A 371 (0,075 % de linfocitos B con memoria). Estos linfocitos B se depositaron como una unica celula por pocillo, en placas de 96 pocillos.
5
10
15
20
25
30
35
La Fig. 3 representa graficamente el ELISA de la union de VRC-PG-04 y VRC-PG-05 a algunas versiones mutantes de YU2 gp120 y a las protefnas del nucleo estabilizado resurgido (RSC3) y su mutante inactivado geneticamente, ARSC3. Los datos de ELISA mostraron que VRC-PG04 se une bien a togp120 y a RSC3, con union reducida a los mutantes CD4bs inactivados geneticamente de dichas dos protefnas. Por lo tanto, se dirige probablemente al CD4bs de gp120. VRC-PG-05 se une mejor a RSC3 que a gp120, de esta manera, su epftopo parece ser distinto de VRC-PG-04.
La Fig. 4 representa graficamente la union de VRC-PG-04 y VRC-PG-05 a protefnas basadas en YU2 gp120, el nuevo nucleo FIXB2 8b y Du156 gp120 WT mediante ELISA. VRC-PG-05 se une bien al nuevo nucleo FIXb2 (grafica de la derecha) indicando que este epftopo se encuentra en el nucleo de gp 120, pero es diferente del mismo. VRC-PG-04 que se une fuertemente al clado C Du156 gp120 mientras que VRC-PG-05 se une solo debilmente.
La Fig. 5 representa graficamente el ELISA de competicion demostrando que VRC-PG-04 se dirige contra CD4bs. Los datos son los ELISA de competicion tanto de YU2 gp120 (graficas de la izquierda) como de FlxB2 gp120 (graficas de la derecha). Las graficas de la parte superior muestran la union de CD4-lg en presencia de algunas mAb de IgG diferentes. Las graficas de la parte inferior muestran la union de 17b en presencia de otros mAb. Se incluyen los mAb de VRC01 y VRC03 previamente publicados (Wu y col, Science 329; 856 (2010)). VRC-PG-04 compite en cruzado con CD4-lg y con VRC01 -mostrando que esta probablemente dirigido a los CD4bs de gp120. Las graficas de la parte inferior muestran que VRC-PG-04 no potencia la union de 17b respecto a YU2 gp120, aunque esto potencia suavemente la union de 17b a HxB2 gp120.
La Fig. 6 representa graficamente un ensayo ELISA competitivo que demuestra que VRC-PG-04, pero no VRC-PG-05, compite en cruzado segun los ELISA de los anticuerpos CD4bs realizados con RSC3 en placas. ELISA de competicion con la protefna RSC3 en placa. La grafica de la parte superior muestra que VRC-PG-04 se bloquea en cruzado por otros mAb dirigidos a CD4bs. Por el contrario, VRC-PG-05 no se bloquea en cruzado por los mAb dirigidos al CD4bs, indicando que se dirige contra un epftopo diferente sobre la protefna nuclear de gp120. Se incluyeron los mAb VRC01, VRC02 y VRC03 anteriormente publicados (Wu y col, Science 329; 856 (2010)) para comparacion.
La Fig. 7 representa graficamente un ensayo ELISA usando el clado B AC10.29gp1120 en placas y que VRC-PG-05 no bloquea en cruzado los mAb dirigidos contra CD4bs. ELISA de competicion con la cepa AC10.29 gp120 sobre placa. La grafica de la parte superior muestra que CD4-Ig se bloquea en cruzado por sf misma, pero no por VRC-PG-05. La grafica de la parte inferior muestra que VRC-PG-05 se bloquea por sf mismo, pero no por cualquiera de los otros mAb ensayados. De esta manera, VRC-PG-05 se une a un epftopo unico sobre gp120. Se incluyeron los mAb VRC01, VRC02 y VRC03 anteriormente publicados (Wu y col, Science 329; 856 (2010)) para comparacion.
La Tabla 1 representa graficamente un analisis de la familia de genes de VRC-PG-04 y VRC-PG-05 en comparacion con los mAb b12. VRC01, VRC02 y VRC03 de VIH-1. Se incluyeron los mAb VRC01, VRC02 y VRC03 anteriormente publicados (Wu y col, Science 329; 856 (2010)) para comparacion. La tabla muestra la lfnea germinal V inferida, los genes D y J de la cadena pesada y los genes V y J de la cadena ligera kappa. VRC-PG-04 y VRC-PG-05 estan fuertemente mutados a partir de la lfnea germinal.
Tabla 1: Analisis del repertorio y mutaciones de los mAb de VRC.
- (Cadena pesada)
- IGHV IGHD IGHJ longitud de CDR3 (aminoacidos) frecuencia de la mutacion VH (nucleotidos)
- VRC01
- 1-02*02 3-16*01 (o *02) 1*01 14 91/288 (32 %)
- VRC02
- 1-02*02 3-16*01 (o *02) 1*01 14 92/288 (32 %)
- familia 1-02*02 IIGHD3 de VRC03 1*01 16 85/288 (30 %)
- b12
- 1-03*01 3-10*02 6*03 20 39/288 (13 %)
- VRC-PG-04
- 1-02*02 2-8*02 2*01 16 84/288(29 %)
- VRC-PG-05
- 3-7*01 3-3*01 3*02 19 27/288 (9 %)
(continuacion)
Cadena ligera
- IGKV IGKJ longitud de CDR3 (aminoacidos) frecuencia de la mutacion VL (nucleotidos)
- VRC01
- 3-11*01 2*01 5 45/264 (17 %)
- VRC02
- 13-11-01 2*01 5 49/264(19 %)
- VRC03
- 3-20*01 2*01 5 53/267 (20 %)
- b12
- 3-20*01 2*01 9 35/267 (13 %)
- VRC-PG-04
- 3-20*01 5*01 5 51/267(11 %)
- IVRC-PG-05
- 4-1*01 2*03 8 21/297 (7 %)
La Fig. 8 representa graficamente las alineaciones de secuencias de VRC-PG-04 y VRC-PG-05 en comparacion son su secuencia de la lmea germinal inferida. Se incluyeron los mAb VRC01, VRC02 y VRC03 anteriormente publicados 5 (Wu y col, Science 329; 856 (2010)) para comparacion.
Ejemplos 2: Aislamiento de VRC-PG-04
Se aislo un novedoso anticuerpo monoclonal, VRC-PG-04, a partir de un donante de VIH+ utilizando una sonda de glicoprotema gp120 estabilizada antigenicamente resurgida que era espedfica del sitio de union a CD4. VRC-PG-04 compitio con CD4-lgG para la union a gp120, demostrando que VRC-PG-04 se dirige contra CD4bs. Este anticuerpo 10 es potente y con amplio poder neutralizante, teniendo una CI50 promedio de 0,172 pg/ml y siendo capaz de neutralizar una amplia gama de entradas de pseudovirus en celulas TZM-bl, incluyendo el pseudovirus del clado A - 87 % (n=24), B - 96 % (n=26), y C - 79 % (n=34).
Para caracterizar adicionalmente el Ab, se llevaron a cabo ensayos de neutralizacion de la entrada utilizando un panel de mutantes de alanina individuales JRCSF gp120 incorporado en pseudovirus. Los solicitantes descubrieron que la 15 neutralizacion de la entrada por VRC-PG-04 se inactivaba geneticamente (definida por tener menos del 10 % de potencia de neutralizacion en comparacion con el tipo natural) mediante una unica mutacion en el aa D279 (vease el diagrama de potencia de neutralizacion). Los solicitantes determinaron a continuacion que restos eran importantes para la union de Ab a gp120. Los solicitantes descubrieron que la union de VRC-PG-04 a diversas glicoprotemas gp120 aisladas de pseudovirus que transportaban el mutante JRSCF gp120s disminuyo drasticamente como se midio 20 mediante ELISA. En particular, estos restos se encontraron en el tallo V1/V2 (N197), C2 (N276, D279, N280), C3 (1371), y C4 (T450, r456). En la seleccion preliminar de los solicitantes, parecen ser menos los restos implicados en la inactivacion genetica de la union (definida por tener menos de un 10 % de afinidad aparente con gp120 en comparacion con el tipo natural) de VRC-PG-04 a gp120 cuando se compara con el numero de restos implicados en la inactivacion genetica de la union a gap120 de b12 o CD4 (vease la Tabla 2, diagrama de union).
Tabla 2; tabla de union
- Afinidad aparente
- Dominio
- Mutante pub b 12 pub CD4 2G12 VRC- PG-04
- ES7A 7 114 53
- M95A 75 59 41
- Cl
- K97A 134 50 98
- E102A 63 47 50
- W112A 2 67 76
- D113A 1 9 169 70
- V120A 79
- K121A 4 3 130
- Cl
- L122A 27 62 96
- (tallo V1/V2)
- T123A 233 42 113
- L125A 383 23 93
- Afinidad aparente ----------------1
- Dominio
- Mutants pub bl2 pub CD4 2G12 VRC- PG-04
- V127A 62 26 22
- M1S6A 72
- N1G0K 390
- T162A 83
- 1165A 20 57 139
- R166A 52 44 97
- D1G7A 97
- KlG&A 34
- K171A 118 26 78
- E172A 143 93 74
- V2
- F176A 2 19 400 104
- Y177A 87
- L179A 133
- D180A 1 31 52
- V182A 54
- 1134 A 0,6 27 27
- D185A 6 62 55
- T190A 21 1B7 42
- K194S 22
- N197 A 25 3 318 10
- C2
- T19&A 0,1 42 49
- ftailo V1A/2)
- S199A 123 4 78
- T202A 220 62 53
- K207A 2 5 100 31
- F210A 77 37 35
- I213A 20 31 114 28
- R252A 17 47 111
- S256A 13 47 108 37
- T257A 28 21 133 51
- C2
- N262A 6 5 17
- R273A 0,9 40 78
- N27&A 225 27 169 1
- D279A 27 33 0
- N2SQA 75 44 0
- K2S2A 32 78 23
- T2&3A 55 S3 as
- Dominio
- Mutant pub b!2 PU b CD4 2G12 PGV04
- N295A 34
- T297S 115
- V3 (base)
- P299A 115
- N301A 43
- M302A 40
- (V3 ftallo)
- R304A 38
- K305A 51
- S306A 93
- Afi n id ad a pa rente
- Dominio
- Mutante pub bl2 pub CD4 2G12 VRC- PG-04
- I307A 73
- H308A 50
- I309A 78
- V3 (tip)
- P313A 30
- R315A 73
- F317A 92
- Y318A 43
- T319A 53
- T320A 29
- E322A 22
- V3 (base)
- D325A 52___
- N332A 68
- Q337A 33 122 155
- K343A 3 187 58
- R35CA 6 43 133 43
- S365A 534 23 1300 21
- G366A 9 1 22
- G367A 1 2 16
- 036BA 15 1 12
- C3
- P369A 129 117 70
- E370A 0.2 4 133 23
- I371A 23 7 114 9
- V372A 4 52 23
- M373A 13 so 48
- Y3S4A 2 40 114 49
- N336A 11 26 21 66
- T388A 8 19 50
- V4
- N392Q 69
- W395A 18 23 18
- R419A 25 50
- 14 20A 70
- K421A 7 44 107
- Q422A 51
- 14 23A 101
- 14 24A 104
- N425A 30 11 32
- M426A 0.2 0.2 133
- W427A 21 9 38
- V430A 530 2 31
- K432A 7.5 50 38
- Dominio
- Mutante Dub bl2 pub CD4 2G12 PGV04
- Y435A 123
- C4
- 14 39A 2 10 133 43
- T450A 7 16 108 8
- T455A 500 1 58
- Afinidad aparente
- Dominio
- Mutante pub bi2 pub CD4 2G12 VRC- PG-04
- R456A 6 S3 8
- D457A 5 2
- G45SA 300 2
- G459A 54 37 61
- N4G1A 4 160 285
- E4G2A 21 32 178
- S463A 50 53 324
- V5
- I4G7A 63 3
- R469A 1.4 8
- P470A 1.3 13 100
- G471A 37 89 137
- G472A 22 2 100
- G473A 993 2
- D474A 91 22
- CS
- M475A 130 64
- R476A 25 40 133 81
- 0477A 2 187 44
- W479A 1.3 19 40 95
- R480A 37 73
- Delta VI 35 44 133
- V1-V3
- Delta Vl/2 30 12 114
- Delta V3 30 41
Afinidad aparente respecto a WT (afinidad aparente para WT/atinidad aparente para el mutante)* 100
Nota: grafico adaptadode Pantophlety col., 2003,
Tabla 3: tabla de potencia de neutralizacion. Los mAb VRC01 y VRC03 anteriormente publicados (Wu y col.. Science 329; 856 (2010)) se han incluido como comparacion.
- Potencia de neutralizacion con respecto a WT (%)
- . dominio ■ qp12Q
- mutation CD4 bl2 VRC01 VRC03 VRCPG4M
- Cl
- E87A 46 29 63 106 118
- M95A
- 17 48 56 79 107
- K57A
- 184 117 62 108 130
- EL02A
- (50 S3 98 112 146
- Will A
- 100 119 7ft 111 118
- C1 [tallo V1/V2)
- v i m 161 80 60 101 84
- SC121A
- 2ft 30 24 m 78
- LL22A
- 474 % 66 51 106
- Till A
- 121
- LI 25 A
- 7532 1549 222 29 89
- N156A
- 2345 68 30 454
- NI60K
- 99 173 296 173 176
- V2
- T162A 318 107 190 21 177
- 1165 A
- 4)4 41 42 10 61
- Potenciade neutralization con respecto a WT (%)
- dominio qp120
- mutacion CD4 M2 VKCOl VRC03 VRC-PG-Q4
- k 166A n 41 42 31 51
- ES167A
- 7tJ2 121 99 23 81
- K168A
- 106 80 50 50 67
- K171A
- 52 58 60 132 149
- E172A
- 259 55 161 34 59
- ___nm___I. .. "iLK^.....
- 2416 89 1 135
- T.179A
- ]52(, 19 13 25 88
- VIS2A
- f 28 45 60 76 68
- mm.
- 806 172 129 94 155
- DLB5A
- 96 4 34 88 120
- T1WA
- 8 165 119 120 82
- C2 ft a 11 o V1A/2)
- K1945 1502 4100 1538 906 236
- T198A
- 218 5 40 22 95
- S199A
- 2903 5973 724 145 707
- T202A
- 3831 569 30 3 61
- C2
- F3IDA 845 384 163 62 101
- I213A
- 102 178 174 186 185
- K252A
- 21 98 68 _ND 86
- S256A
- 112 83 73 136 152
- T257A
- 5 107 253 86 148
- N262A
- 63 443 223 12 105
- R273A
- 132 E09 48 72 120
- X276A
- 29 134 34! 536 18
- D279A
- 2 92 3 0.5 0,4
- K282A
- 5 78 363 99 81
- T233A
- 5 717 346 99 225
- V3 (base)
- NSE95A 46 85 56 97 97
- T297S
- 17 47 50 137 179
- P299A
- >K««l 4S83 80 0-50 115
- N301A
- 8165 1396 239 22 507
- V3 (taSfo),
- X302A 28 75 43 no 120
- K3I&4A
- 4477 125 32 0.5 43
- K305A
- >10000 3466 70 0„5 54
- dominio qp120
- mutante CD4 M2 VRC01 VRC03 PGV04
- V3 [punta)
- 5305 A 246 94 76 7 130
- E307A
- 7399 119 ! 20
- H30SA
- 505 76 66 4 99
- I309A
- >1W(W 3493 82 1 31
- P313A
- 3 13 130 55 111
- BJ3L5A
- 303 67 45 14 92
- F317A
- 4709 116 1 37
- yatssa
- 4846 109 L 27
- T319A
- 316 54 56 34 102
- T32QA
- >10000 1240: 56 2 64
- V3 ;6as<;i
- E322A 291 76 110 26 83
- Potenciade neutralizacion con respecto a WT (%)
- dominio qp120
- mutacion c:d4 bl2 vRcun vk<:t>3 VRC-PO-04
- (.1325 A 444 154 53 26 112
- N332A
- 1 IS 143 119 73 120
- C3
- 03 37 A 20 50 43 53 172
- K343A
- 34 65 45 92 117
- R350A
- 21 70 60 38 106
- S365A
- 32 70 E14 85 155
- P369A
- 26 30 n 86 113
- V.172A
- 12 12 74 20 125
- M3 73A
- M 124 90 20 135
- Y3K4A
- 69
- N386A
- 50 392 212 79 120
- T38SA
- 110 48' 196 15 160
- V4
- N392Q 24 03 44 62 73
- W395A
- 95
- 04
- |<419A .796 30 120 17 111
- I420A
- lvJl5 544 16 1 21
- K42 \ A
- 1457 64 I 68
- 047 2 A
- 5369 657 47 14 98
- [423 A
- 3412 19 1 24
- I424A
- 2301 26 1 142
- N425A
- 98 61 34 140
- V430A
- 4336 36 L 765
- K432A
- 01 55 30 101
- Y435A
- 3407 2034 31 1 73
- I439A
- 2S54 656 162 1508 339
- T450A
- 31 126 84 115 135
- T455A
- 22 27 79 Ml 142
- R456A
- 55 106 63 1 259
- G450A
- 722 69 149 1 239
- VS
- N46! A 91 90 363 496 321
- E462A
- 38 49 46 106 116
- S463A
- 54 109 536 296 461
- f 1471A
- 10 70 25 96 92
- C5
- D474A Jl 109 32 8 102
- M47SA
- 61 59 68 55 140
- R476A
- 6 129 200 26 141
- D477A
- 10 158 68 10 107
- W4?9A
- 70 5fJH 160 51 138
- R4SO.A
- 53 150 200 51 ____112____
azul - 1-10% verde =1140% amarillo = 250-10 000% rojc > 10 000%____
Ejemplo 3: Datos de neutralizacion de VRC-PG-04 y VRC-PG-05
Se llevo a cabo la neutralizacion con Env-pseudovirus utilizando celulas diana TZM-bl. Los valores de la Tabla 4 representan la concentracion de mAb requerida para conseguir un 50 % (Tabla 4A) o un 80 % (Tabla 4B) de neutralizacion.
5 Todos los anticuerpos monoclonales ensayados son IgG. CD4-Ig es una construccion IgG-CD4 quimerica 5 bivalente. VRC01, VRC02, y VRC03, b12, PG9 y PG16 se han publicado previamente y se muestran para comparacion.
Nota: Los calculos de amplitud y potencia excluyeron los virus Tercio 1 de los clados B y C. Se calculo la potencia usando virus que tienen un valor de CI50 o CI80 en el intervalo ensayado.
- VRCOl VRC02 VRC03 VfiC-PG- 04 VRC-PG- 05 bi2 CD44fl PG9 PG16
- SC422661.3 0,076 0,084 0,036 0,033 12,6 0.fii 5,19 0,375 19,1
- PVO.4 0,216 0,166 0,329 0,235 >50 >50 20,1 8,7 12,0
- TR0.11 0,207 0,203 0,055 0,131 >50 >50 >50 >50 0,136
- AC10.0.29 2,2 2,46 >50 i?„g 0,017 1.3 10,7 0J012 0,007
- RHPM259.7 0,060 0,033 1,13 0,036 9.6 0.12 1,09 10 0,334
- THR04t56.13 2,25 3,43 >50 >50 >50 1.21 0,509 1 3,2 0,498
- RE=J04541.67 0,062 0,056 0,059 OjOl 9 1,64 5.92 1,22 0,001 0,094
- TRJ04551 ,18 0,083 0,115 0.343 0,069 >Sp >50 22,1 \M 2.7
- WITO41&0.33 0,148 0,' 1 5 >50 0,080 >5p 8.54 2,17 0,005 0,002
- CAAN5342.A2 0,B?4 0,699 6,32 1,13 0,005 >50 >50 14,4 25,0
- BLOI-DG >50 >50 >50 >50 >50 14650 0,190 >50 >50
- BR07.DG 1,24 OjMS 3,36 0,789 >50 0,098 0,046 >50 >50
- HT593.1 0,334 0,542 0,235 0,177 0,389 0,117 0,323 0,214 0,056
- R2 0,196 0^42 0,035 0,291 >50 1,170 0.016 >50 >50
- SG1168.01 0.J276 0,453 >50 0.509 >50 >50 13-4 >50 >50
- QK0516.01 0,336 0,470 0,187 0,115 >50 0,300 1,33 >50 >50
- 5763 0„166 0£75 0,392 0,042 >50 0,240 0,756 0,031 D.OO&
- 3988 0,220 0,243 2/16 0,295 9,70 0.37S 49,4 0,01 S 0,005
- Tercio 2 Clado C
- Dul23,6 10,2 16,1 >50 >50 >50 1.|S2 0,142 0,047 0,016
- Du151,2
- a.fe 4,83 34.3 0 059 0,128 3,79 1,36 Gpl2 0.J004
- (n=34J
- Dul56.12 0,C89 0,091 >50 0.034 7,56 0,658 14,5 0,035 PIBp
- VRCOT VRC02 VRC03 VRC-PG- 04 VRC- PQ- OS M2 CD4-|q PG9 PG16
- ZM109.32 ",091 0,086 >50 0,055 0,151 >50 7,69 Q099 30
- ZM135.Sa 0,374 0,533 >50 >50 >50 >50 13,7 >50 >50
- ZU146.7 3,393 0,396 1,04 0,409 >50 ia 4,21 0,32
- ZM176.66 0,055 0,036 0,033 0 140 >50 >50 0)212 0,0^1 0,002
- ZM181.6 1.12 0,574 >50 11-6 >50 >50 4,9 0,005 0,00-
- soia.is 0,033 0,071 0,083 0,0=7 1E(8 139 9,86 0,031 0,034
- 203.4 3,tss 2,193 1,77 0,030 >50 0,701 7,.3 0,084 0,012
- 289.4 0,052 0,749 0,342 0,390 >60 >50 0,459 0,510 0,083
- TZA125.17 5-50 >50 >50 >50 >50 >50 0,: 25 0,1 i5 0,0i2
- TZBD.C2 0,100 0,074 1,27 0 067 4,1 >50 0,895 0,211 S»3
- Clado D
- UG024.2 0,156 0,103 >50 0.196 >50 >50 0,000 3,23 >50
- 57128 >50 >50 >50 >50 >50 0,169 0,J 12 0,1 36 0,076
- TH966.9 0,334 3^38 >50 0,068 4,00 >50 0,397 0,020 0,003
- CladoE
- TH976.17 0,037 0,112 >60 0,046 7.48 >50 o,ags >50 >50
- MC2138 0,348 0,450 >50 0,219 0,046 >50 0,297 0,189 0,020
- No VIH
- SIVmac261.30 >50 >50 >50 >50 >60 >50 0)496 >50 >50
- lutuLV
- >50 >50 >50 >50 >60 >50 >50 >50 >50
- total n=89 02®9 192%) 81/89 (91%) 49/89 (55%) 77/89 (87%) 44/89 (49%) 47/89 (59%) 82/89 02%) . 74/89 (83%) 72/89 (81%)
- Amplitud
- Clado A ■ 24 £4/24 1100%) 24/£4 (100%) 13/24 (54%) 23/24 (96%) 14/24 (56%) 12/24 (60%) £1/24 (88%) £4/24 (100%) 24/24 (100%)
- Clado B = 26
- 25/26 (05%) 24/26 (02%) £0/26 (77%) 23/26 (36%) 12/26 (46%) 10/26 (73%) £4/26 (92%) 15/26 (58%) 16(26 (62%)
- Clado C= 94 29/34 (85%) 29'34 (85%) 16/34 27/34 (79%) 15/34 (44%) ' 5/34 (44%) 32-r34 (94%) 31/34 (91%) 23/94 (85%)
- VRC01 VRC02 VRCQ3 VRC-PG-04 VRC-PG-05 b12 CD4-lg PG9 PG16
- Potencia*
- mediana de CI50 D;2D3 0,168 0;389 0:125 8765 0,701 2;170 D;053 0,014
- media geometrica de CI50
- 0,243 0.218 0:617 0,172 3;576 1,105 1652 0;034 0,034
Tabla4B: Valores de CleD (|jg/ml)
- VRCOI VRC02 VRC03 VRC- PG-04 VRC- PG-05 jjl2 GtM-k) PG9 PG16
- HXB2 0,11 1 0,143 0,165 0,113 >50 0,016 0,010 >50 >50
- IVIN .3 0,062 0,071 0,073 >50 >50 0,007 0,01 a >50 >50
- Tereio 1 Clado B
- SF162 0,£67 0,367 0,097 0,127 >50 0,270 0,539 >50 >50
- ADA
- 1,49 1,25 OP 5 0,700 47 5 0,656 0,209 5.IS Q060
- (n=7)
- BaL.01 0,214 0,176 >50 0,252 1.46 0,32 0,113 1,06 >50
- BaL.26 0,176 0,151 >50 jjjj 1.61 0,155 0.145 0,112 >50
- SS1196.1 0,503 0,411 0.096 0,540 >50 4,02 2,66 0,005 0.170
- Tereio 1 Clado C
- VIW965.26 0,167 0,173 >50 0,096 193 6,9 0,356 >50 >50
- RW02Q.2 0,663 0,492 >50 0,561 >50 3^.5 46,1 0.250 0,385
- UG037.S 0,313 0,263 >50 0,230 >50 >50 0,721 0,074 C,03i
- Clado A (n=24)
- DJ263.S 0,553 0,424 >50 >50 >50 >50 0,557 2,G2 >50
- KEH2013.11
- 2,3 1,9 1,25 3. £2 >50 >50 15,9 0,033 0,011
- Q259.W6 0,543 0,434 0,f7S 0,037 2i .5 >50 2,83 >50 >50
- VRC01 VRCC2 VRC03
- YU2 0,372 0,359 0,115
- 89.6 2,32 1,46 0,589
- 6101.10 0.315 0,384 0,184
- 7165 >50 >50 >50
- 6535 2)74 3,76 £4
- GH0692.42 4,83 4,18 2,05
- SC422661.8 0,265 0,267 0,105
- PV0.4 Ug 1,03 1,68
- TRO.11 0,832 0,876 0,342
- AC 10.0.29 6s45 6,95 >50
- RHPA4269.7 0,186 0,243 6,58
- THR04156.18 23 21,7 >60
- REJ04541.67 0,251 0,24 0,196
- TRJ 04551.50 0,207 0,284 0,098
- WLT04160.33 Q, 41 2 0,35 >50
- CAAN5342.A2 2,77 3,13 47,6
- BL01.DG >50 >50 >50
- BR07.DG 5,15 4,21 12,8
- HT593.1 1,77 3,86 0,741
- R2 0,931 1,21 0,126
- BG 1168.01 1,52 1,97 >50
- VRC- PG-04
- VRC- PG-05 bi2 CP4-fcj PG9 PG16
- 0,240
- >50 7,79 0,314 13,4 1,27
- 0,221
- >50 0,56 0,752 >50 >50
- 0,24?
- 29,1 >50 5^.33 >50 >50
- >50
- >50
- >50
- 33 >50 12,4
- 4,2
- >50 19,1 16,3 5,04 >50
- 4^41
- >50 2,67 2,63 >50 >50
- 0,147
- >50 1,69 >50 >50 >50
- 1,44
- >50 >50 >50 >50 >50
- 0,744
- >50 >50 >50 >50 >50
- >50
- 0,065 14,2 >50 0,073 0,023
- 0,134
- 32,2 0,39 13,9 >50 3,49
- >50
- >50
- 4,64 2,5 >50 50
- 0,050
- 28,4 >50 11,5 0,01 0,030
- 0,183
- >50 >50 >50 17,7 >50
- 1,19
- >50 41,4 13,2 0,009 ojooe
- 5 £3
- 0,012 >50 >50 >50 >50
- >50
- >50
- >50
- 0,625
- >50
- >50
- 5,5
- >50 0.898 0,211 >50 >50
- 0 790
- 1,510 1,73 4,51 2,09 2,53
- 1..490
- >50 9,30 0,063 >50 >50
- 2,01
- >50 >50 >50 >50 >50
- VRC01 VRC02 VRC03 u < 6 O 1 VRC- PG-05 t>12 CD4-lg PG9 PG16
- ZM215.S 0,52/ 0/24 >50 (£298 >50 >50 >50 0,43/ >50
- ZM1Q6.9 1.02 a&54 >50 0,564 >50 >50 >50 3,56 >50
- ZM55.28a 1.2 1,03 >50 1,92 >50 >50 >50 >50 >50
- ZM53.21 3.59 4,01 19,9 4,28 £327 >50 7.43 £07- 0,009
- ZM55.4-3 1.5 1,6 >50 1£3 >50 >50 17.2 41,2 14,5
- ZM106.10 1,37 0,883 0,452 0.421 >50 >50 >50 1,29 2,55
- ZM109.32 0,422 0,324 >50 0,190 0,528 >50 >50 0,727 >50
- ZM135.8a 2,05 £43 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50
- ZM146.7 1,23 1j39 4,48 3,27 >50 >60 >50 1t69 15,4
- ZM176.66 <^25S 0,154 0,15 16 >50 >50 35,4 £036 0,006
- ZM181.6 6,49 3,73 >60 >50 >50 >60 31,6 £013 0,054
- S018.1S 0,178 0j19 £324 0,173 >50 >50 >50 £106 £057
- 286.4 0,839 0,888 18,4 0,836 >50 2,69 39,1 0,390 £043
- 283.4 4 2,55 1,21 1,2 >50 >50 2,05 >50 22,5
- TZA125,17 >50 >50 >50 >50 >50 >50 39,5 0,666 £263
- TZBD.02 0,328 0,225 22,1 0,246 48,6 >50 5,74 1,08 £101
- Clado D
- UG024.2 0,674 0,619 >50 0,783 >50 >50 £025 >50 >50
- 57128
- >50 >50 >50 >60 >50 1,72 0,855 0,634 38,3
- TH966.8 1,43 1,16 >50 0,437 >50 >50 3,17 0,089 0,015
- Clado E
- TH976.17 0,488 0,593 >50 0,148 >50 >50 40,3 >50 >50
- M02138 1,57 1,99 >50 1.21 0,157 >50 2,78 < iO 0,553
- PG16
- >50 >50 CO 20/24 (83%) 11/26 (42%) CO 3 5 CO in o cf CM O
- PG9
- >50 >50 64/89 (72%) 23/24 (96%) 10/26 (38%) 28/34 (82%) CM CD cf 0,256
- CD4-lg
- 3,95 >50 56/89 (63%) 15/24 (63%) 20/34 (59%) 6,715 5,177
- CM s
- >50 >50 35/89 (39%) 9/24 (38%) 17/26 (65%) co s Si 3,720 in in CO
- VRC- PG-05
- >50 >50 22/89 (25%) CO CM 7/26 (27%) 8/34 (24%) i 2.934
- VRC- PG-04
- >50 >50 71/89 (80%) § ™ CM 21 8? oJ 10 CM® 23/34 (68%) 0,433 0,576
- VRC03
- >50 >50 39/89 (44%) 8/24 (33%) 20/26 (77%) 11/34 (32%) GO CO oo cf 1,118
- CM o o CL' >
- >50 >50 78/89 (88%) 24/24 (100%) 24/26 (92%) 26/34 (76%) m CO cq. o 0,739
- VRC01
- >50 >50 79/89 (89%) 24/24 (100%) 24/26 (92%) 27/34 (79%) 0,832 CM CO <** o
- SIVmac251.30 MuLV total n=89 cladoA n=24 clado B n=26 clado C n=34 Mediana CI50 Media geometricaCI50
- O ♦ 03
- > 3 O
- X Q. C <D
- O E O
- Z < CL
Ejemplo 4: Neutralization patente y amplia por un anticuerpo monoclonal dirigido al sitio de union a CD4 de un donante de VIH-1 infectado con un virus recombinante ID del clado A1/D
5 Se han aislado algunos anticuerpos monoclonales con actividad neutralizante (NAb) de una amplitud y potencia sin precedentes, incluyendo PG9/16 y VRC01, de donantes positivos de VIH-1. En este ejemplo, Los solicitantes caracterizan PGV04 (conocido tambien como VRC-PG04), un nuevo NAb que tiene una potencia y amplitud que rivaliza con PG9/16 y VRC01. Se aislo PGV04 mediante clasificacion individual de linfocitos B con memoria utilizando un nucleo resurgido de gp120 (RSC3) como cebo. El anticuerpo compitio con CD4, b12 y VRC01 por la union a gp120,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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confirmando que se dirige al sitio de union a CD4 (CD4bs). Cuando se selecciono sobre un gran panel de virus, se distinguio PGV04 por en su perfil neutralizante de CD4, b12 y VRC01 de VIH-1. A diferencia de VRC01, PGV04 no potencia la union de 17b o X5 a sus epftopos en la region del correceptor sobre el monomero gp120, y ninguno de los anticuerpos monoclonales CD4bs (mAb) fue capaz de inducir el sitio del correceptor sobre el trfmero funcional. Cuando se determino la capacidad de PGV04 de neutralizar el pseudovirus que contiene sustituciones unicas de alanina, se desvelaron las diferencias en la dependencia de restos entre PGV04 y otros mAb de CD4bs. En particular, se descubrio encontro que D279A, I420A e I423A suprimfan la neutralizacion de PGV04. Los restos descubiertos como importantes en la neutralizacion de PGV04 tenfan efectos variables sobre la capacidad del anticuerpo de unirse al monomero gp120 que contiene las mismas sustituciones. Los solicitantes concluyen que los CD4bs NAb con capacidad amplia y potente tienen diferencias sutiles en la manera que reconocen y acceden a los CD4bs en el extremo vfrico.
Un estudio (Protocolo G) que selecciono 1.800 donantes de VIH-1 infectados con virus de diferentes clados desvelo que una fraccion significativa de donantes desarrollo respuestas sericas con una actividad neutralizante amplia y potente de acuerdo con los estudios de varios laboratorios (Doria-Rose y col.; Gnanakaran y col.; Doria-Rose y col. 2009; Gray y col. 2009; Sather y col. 2009; Simek y col. 2009). El 1 % superior de donantes del Protocolo G que presento las respuestas neutralizantes sericas mas amplias y potentes se designaron "neutralizadores de elite". Los solicitantes habfan cartografiado previamente las especificidades del suero en 19 donantes del Protocolo G que se clasificaron en el 5 % de donantes superiores seleccionados y se encontro que la amplia capacidad de neutralizacion en suero de la mayorfa de los donantes estaba asociada con un unico numero o un pequeno numero de especificidades (Walker y col. 2010). El aislamiento y la caracterizacion de anticuerpos con una amplia y potente actividad neutralizante procedentes de donantes del Protocolo G es de maxima prioridad ya que los epftopos dirigidos por estos anticuerpos facilitaran el diseno inmunogeno.
Existen actualmente cuatro regiones conocidas en el extremo vfrico que son diana de potentes anticuerpos con amplio poder neutralizante (bNAb). El primero es una region conservada sobre el receptor de entrada primario del virus, CD4bs. Esta region se reconoce por los bNAb b12, HJ16, y los recientemente aislados bNAb, VRC01 y VRC03 (Corti y col.; Burton y col. 1991; Wu y col. 2010). Los bNAb 2F5 humanos 4E10 y Z13e1 reconocen la region externa proximal de la membrana (MPER) sobre la protefna gp41, otra region conservada localizada en el tallo del extremo vfrico. Se cree que esta region es importante en la fusion vfrica (Ofek y col. 2004; Cardoso y col. 2005; Nelson y col. 2007). El tercer epftopo esta compuesto de una agrupacion de glicanos con alto contenido en manosa en el extremo reconocido por 2G12, el unico bNAb anti-VIH-1 que se une solamente a glicanos (Trkola y col. 1995; Sanders y col. 2002; Scanlan y col. 2002; Calarese y col. 2003). Por ultimo, PG9 y PG16 reconocen unas regiones conservadas de los bucles V1/V2 y V3 en gp120 (Walker y col. 2009).
La CD4bs es de particular interes como una region conservada cuya accesibilidad, al menos a CD4, debe mantenerse. El primer bNAb potente en esta region, b12, se aislo de una biblioteca de expresion de fagos utilizando ARN procedente de linfocitos de medula osea de un individuo seropositivo para VIH-1 (supuesto clado B) (Barbas y col. 1992). El bNAb neutraliza el 35 % de un panel de 162 virus de clados cruzados con una mediana de IC50 de aproximadamente 3 mg/ml en un ensayo de pseudovirus (Walker y col. 2009). Sin embargo, b12 interactua unicamente con gp120 a traves de su cadena pesada (Zhou y col. 2007), y la incapacidad de aislar bNAb dirigidos contra CD4bs adicionales conduce a dudas de si dichos Ab podrfan estimularse a traves de la inmunizacion. Se consiguio un avance cuando un bNAb, HJ16, se aislo mediante inmortalizacion de linfocitos B con memoria a partir de un donante infectado con un clado C y que muestra una amplitud similar a la de b12 (Corti y col.). De forma mas reciente y mas significativa, los mAb VRC01 y VRC03 se aislaron de un donante infectado con un clado B (Wu y col. 2010). VRC01 neutralizo el 91 % de un panel de 190 pseudovirus, haciendo de este, junto con PG9 y PG16, los mAB de VIH-1 con capacidad mas amplia y potente hasta la fecha.
En el presente Ejemplo, los solicitantes caracterizaron PGV04, un novedoso CD4bs mAb humano que se origina a partir de un neutralizador de elite. El anticuerpo se aislo de linfocitos B con memoria individuales en celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) utilizando la protefna RSC3 como cebo (Wu y col 2011). La protefna RSC3 tiene la estructura antigenica de los CD4bs preservada con un 30 % de restos expuestos en superficie sustituidos con homologos del virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS) y otros restos que difieren de la secuencia de VIH-1. Los solicitantes confirmaron que OGV04 es un mAb dirigido contra CD4bs con capacidades de neutralizacion amplias y potentes que se corresponden con las de PG9 y VRC01. Ademas, la actividad neutralizante de PGV04 resume en ultima instancia el perfil de neutralizacion del correspondiente suero del donante. PGV04 se distinguio de CD4, VRC01 y b12 en su capacidad de neutralizar el pseudovirus JR-CSF que contiene sustituciones de alanina individuales. Ademas, a diferencia de VRC01, PGV04 no potencia la union de los Ab inducidos por CD4 (CD4i), 17b o X5, a sus epftopos localizados simultaneamente en el sitio de union del correceptor en el gp120 monomerico, y ninguno de los bNAb dirigidos contra CD4bs indujo el sitio CD4i sobre trfmeros funcionales. Los solicitantes concluyen a partir de estos hallazgos que la region de gp120 que compone los CD4bs es capaz de inducir mAb con amplia y potente actividad neutralizante con huellas variables que se traducen en diferencias en sus perfiles neutralizantes.
Anticuerpos y antfgenos. Los siguientes Ab y reactivos se recibieron del IAVI Neutralizing Antibody Consortium: 2G12 (Polymun Scientific, Viena, Austria), X5 y 17b (Strategic Biosolutions), CD4 soluble, CD4lgG, F425 (proporcionado por Lisa Cavacini, Beth Israel Deaconess Medical Center), JR-CSF gp120 y BaL gp120 (proporcionado por Guillaume Stewart-Jones, MRC Human Immunology Unlit, Oxford), JR-FL gp120 (Progenies, Tarrytown, NY) y
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YU2 gp120s (proporcionado por Robert Dorns, University of Pennsylvania). Richard Wyatt proporciono amablemente las protemas RSC3 y ARSC3 (Scripps, La Jolla, CA).
Donante. El donante a partir del cual se aislo PGV04 se selecciono del estudio patrocinado por IAVI, Protocolo G (Simeky col. 2009). El alistamiento del Protocolo G se definio como un varon o una mujer de al menos 18 anos de edad con infeccion por VIH documentada durante al menos tres anos, asintomatico clfnicamente en el momento del alistamiento, y que no recibe actualmente tratamiento antirretrovfrico. Se utilizaron algoritmos de seleccion analftica de alto rendimiento para seleccionar individuos para la generacion de mAb, y este voluntario se identifico como un neutralizador de elite basandose en la amplia y potente actividad neutralizante del suero frente a un panel de pseudovirus de clados cruzados.
ELISA de union. Las protemas RSC3 y ARSC3 se diluyeron en PBS y se revistieron a 2,0 mg/ml y JR-FL gp120 se diluyo en PBS y se revistio a 5,0 mg/ml, 50 ml/pocillo en placas de ELlSA de poliestireno de 96 pocillos Costar (3690) durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron 4x con PBS que contenfa tween al 0,05 %, y se bloquearon con BSA al 3 % en PBS durante 1 h a 37 °C. Despues, se anadieron diluciones en serie 5 veces de los mAb, en BSA al 1 % en PBS, a una concentracion de partida de 10,0 mg/ml. Se incubaron las placas durante 1 h a 37 °C y a continuacion se lavaron 4x antes de que el mAb secundario, anticuerpo de cabra dirigido contra IgG Fc humana conjugada con fosfatasa alcalina (Jackson) se anadiera con una dilucion 1:1000 durante 1 h a 37 °C. Los pocillos se lavaron y se detecto la senal anadiendo un comprimido de 5,0 mg de sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma) en 5 ml de tampon de tincion de fosfatasa alcalina (pH 9,8) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se leyo la densidad optica a 405 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices).
Para la union de PGV04 a gp120 aislado del pseudovirus JR-CSF, se recogio pseudovirus 3 dfas despues de la transfeccion, los sobrenadantes se centrifugaron a 300xg durante 5 minutos y se efectuo la lisis de los virus con NP-40 al 1,0 % a TA durante 30 minutos. Se revistieron las placas ELISA durante la noche a 4 °C con Ab D7324 dirigido contra gpl20 (International Enzymes, Inc.) a una concentracion de 5,0 mg/ml en PBS. Se lavaron las placas 4x y se anadio el virus lisado a 50 ml/pocillo y se incubo durante 2 h a 37 °C. Se lavaron las placas 4x y se bloquearon con BSA al 3 % en PBS durante 1 h a TA. Se anadieron PGV04 y 2G12 en diluciones en serie de 5 veces comenzando a
10.0 mg/ml. Se lavaron las placas 4x, y se anadio anticuerpo de cabra dirigido contra IgG F(ab')2 conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce) a una dilucion 1:1000. El resto del experimento se llevo a cabo como se indico anteriormente.
Para los ELISA de competicion, se revistieron las placas con 5,0 mg/ml de JR-FL gp120 en PBS, 50 ml/pocillo durante la noche a 4 °C. Se lavaron las placas 4x, se bloquearon con 100 ml/pocillo de BSA al 3 % durante 1 h a TA. Despues, se anadieron diluciones en serie 5 veces de un Ab competidor (50 ml/pocillo) a partir de 10,0-80,0 mg/ml dependiendo del mAb. Se incubaron las placas durante 30 minutos a TA y 50 ml del mAb competidor biotinilado se anadieron a continuacion a la solucion del pocillo a una concentracion final eficaz del 50 % (CE50). La CE50 se define como la concentracion a la cual el 50 % del mAb se une a la protefna. Se incubo la placa durante 1 h a TA y se lavo 4x. Se anadio estreptavidina-AP, 50 ml/pocillo, a una dilucion 1:1000 durante 1 h a Ta. Se lavaron las placas 4x y se detecto la senal utilizando comprimidos de sustrato de fosfatasa alcalina diluidos en tampon de tincion de fosfatasa como anteriormente.
Induccion del sitio de union del correceptor sobre gp120. Se revistieron placas ELISA, 50 ml/pocillo, durante la noche a 4 °C con 5,0 mg/ml de JR-FL o protefna YU2 gp120 diluida en PBS. Se lavaron las placas 4x, y se bloquearon con BSA al 3 % durante 1 h a TA. Tras eliminar la solucion de bloqueo, 10,0 mg/ml de PGV04, CD4lgG, b12, 2G12, VRC01 o VRC03 se anadieron durante 30 minutos a TA. A continuacion, se anadieron diluciones en serie 5 veces de X5 o 17b biotinilado (50 ml/pocillo), comenzando a 50,0 mg/ml y 100,0 mg/ml respectivamente. Se lavo la placa 4x y se anadieron 50 ml/pocillo de estreptavidina conjugada con AP a 1:1000 durante 1 h. Se lavo la placa y se desarrollo como anteriormente.
Citometrfa de flujo. Se anadieron cantidades saturantes de PGV04, b12, 2G12, sCD4, VRC01, VRC03 o 17b a
20.0 mg/ml, se sembraron 50 ml/pocillo de celulas 293T transfectadas con JR-FL en placas con fondo de V de 96 pocillos (Cellstar), y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C en un mezclador de placas. A continuacion, se anadio una dilucion en serie de 5 veces de 17b biotinilado comenzando a 20,0 mg/ml, 50 ml/pocillo, a cada pocillo que contenfa el mAb competidor durante 1 h a 4 °C en un mezclador de placas. Se lavo la placa 2x y se tino con una dilucion 1.200 de NeutrAvidin conjugado con R-ficoeritrina (PE) (Invitrogen). Se analizo la union usando citometrfa de flujo, y se generaron las curvas de union representando graficamente la intensidad de la fluorescencia promedio de union a antfgeno como una funcion de la concentracion de anticuerpos. Se uso un FACSCalibur (BD Biosciences) para el analisis de la citometrfa de flujo y el programa informatico FlowJo para la interpretacion de datos.
Ensayos de neutralizacion. Se llevaron a cabo ensayos de neutralizacion mediante mAb y sueros de pacientes por Monogram Biosciences como se ha descrito anteriormente utilizando un unico ciclo de replicacion del pseudovirus y midiendo la entrada en celulas U87 que expresaban tanto CCR5 como CXCR4 mediante la actividad de la luciferasa (Richman y col. 2003). En resumen, se produjeron pseudovirus mediante transfeccion simultanea de celulas HEK293 con un plasmido subgenomico, pHIV-1lucAu3, que incorpora un gen indicador de la luciferasa de luciernaga y un segundo plasmido, pCXAS que expresa bibliotecas o clones de VIH-1 Env. Tras la transfeccion, se recogio el pseudovirus 3 dfas despues y se uso para infectar celulas U87. Se produjo la lisis de las celulas 48 horas despues de
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la infeccion y se leyo la actividad luciferasa en un luminometro. Se describe completamente en otra parte de este documento la generacion de pseudovirus que incorporan sustituciones unicas de alanina en VIH-1 JR-CSF (Pantophlet y col. 2003). Se midio la actividad de neutralizacion de PGV04 frente al pseudovirus VIH-1 JR-CSF que contenfa sustituciones unicas de alanina en la protefna Env utilizando un ensayo TZM-bl como se describe (Li y col. 2005).
Estadfstica. Se llevaron a cabo analisis estadfsticos con Prism 5.0 for Mac (GraphPad, La Jolla, Ca).
Caracterizacion de PGV04 como un mAb dirigido contra CD4bs. Se aislo PGV04 a partir de los PBMC de un donante africano infectado con el clado A (Wu y col 2011). En resumen, se clasificaron linfocitos B con memoria especfficos de antfgenos empleando el RSC3 gp120 para la seleccion especffica de los mAb que se dirigen al CD4bs. El ARSC3 gp120, en el que un aminoacido en la posicion 371 se elimino a fin de suprimir la union de b12, se uso como un control negativo en la clasificacion. Como era de esperar, la union de PGV04 al RSC3gp120 fue fuerte y equivalente a la de VRC01, mostrando ambos mAb una drastica disminucion de la union a ARSC3, consistente con su identificacion como mAb dirigido contra CD4bs (FIG. 9A). Similar a VRC01, PGV04 se une tambien con elevada afinidad a JRFL gp120 (FIG. 9B).
Los solicitantes llevaron a cabo a continuacion varios ELISA de competicion para verificar que PGV04 se dirigfa contra el CD4bs. Diluciones en serie de los mAb b12, CD4-lgG, VRC01, 17b, X5, 2G12, o F425 se reunieron a placas ELISA revestidas con JRFL gp120 seguido por la adicion de una concentracion CE50 constante de mAb competidores biotinilados relacionados en la leyenda de cada grafica (Figs. 10A-D). PGV04 compitio con b12, CD4-lgG y VRC01 para la union a JRFL gp120 confirmando que PGV04 se dirige a CD4bs (FIG. 10A). PGV04 y b12 presentaron alguna competicion parcial con los mAb CD4i, 17b y X5 (FIG. 10B). Sin embargo, PGV04 no compite con 2G12 o el mAb dirigido al bucle V3, F425/b4e8 (FIG. 10C). Experimentos de competicion llevados a cabo de forma inversa, en los que diluciones en serie de PGV04 se unieron a placas revestidas de gp120 y las concentraciones de CE50 de los mAb competidores se anadieron posteriormente, proporcionaron resultados similares a los esperados para las interacciones de union reversibles (Fig. 10D).
Amplitud y potencia de la neutralizacion por PGV04. Para determinar la amplitud y la potencia de neutralizacion por PGV04, se ensayo un panel multiclado de 162 pseudovirus en un ensayo de neutralizacion utilizando celulas U87 que expresaban tanto CCR5 como CXCR4 como la lfnea de celulas diana (FIGS. 11A-B). PGV04 neutralizo 142 virus del panel de 162-virus con una CI50 < 50 mg/ml y PG9 neutralizo 122 virus (FIG. 15A; Fig. 11A). La mediana de CI50 de los virus neutralizados a una CI50 < 50 mg/ml era comparable para PGV04 (0,20 mg/ml) y PG9 (0,27 mg/ml), indicando que PGV04 y PG9 tienen similar potencia. PGV04 neutralizo un 88 % de los virus en el panel mientras que PG9 neutralizo un 75 % de los virus en el panel, y esta diferencia es estadfsticamente significativa (test exacto de Fisher, valor P = 0.0063) indicando que PGV04 es un mAb mas amplio que PG9 (Fig. 11B). A resaltar, hubo 7 aislados vfricos que fueron incapaces de neutralizar ambos mAb, pero se sabe que estos aislados estan neutralizados por uno de los otros NAb existentes: PG16, b12, 4E10, 2G12 y 2F5 (Walker y col. 2009).
A continuacion, Los solicitantes comprobaron la amplitud y potencia de PGV04, PG9 y VRC01 sobre un segundo panel de 97 pseudovirus que uso celulas TZM-bl como la lfnea de celulas diana (FIGS. 11A-B y la FIG. 16). Los resultados para los dos paneles de virus fueron similares, aunque en el ultimo panel, la mediana de CI50 de los virus que se neutralizaron a < 50 mg/ml fue menor para PG9 que para VRC01 y PGV04, y esta diferencia era estadfsticamente significativa (test de Mann-Whitney, valor P < 0,0001 y valor P = 0,0137 respectivamente) indicando que PG9 (0,06 mg/ml) es mas potente en este panel que VRC01 (0,17 mg/ml) y PGV04 (0,12 mg/ml). pG9 neutralizo un 82 % de los virus del panel, PGV04 neutralizo un 87 % y VRC01 neutralizo un 93 % de virus del panel de 97. La diferencia entre PG9 y VRC01 era estadfsticamente significativa (Test exacto de Fisher, valor P 0,0479), indicando que VRC01 es un anticuerpo mas amplio que PG9.
La mediana de CI50 de los virus neutralizados con una CI50 < 50 mg/ml fue ligeramente menor para PGV04 (0,12 mg/ml) que VRC01 (0,17 mg/ml, test de Mann-Whitney, valor P = 0,0324) desvelando que PGV04 es marginalmente mas potente que VRC01 en este panel. PGV04 fue ligeramente menos amplio en este panel que VRC01 (87 % de 97 virus frente a 93 %) pero esta diferencia no era estadfsticamente significativa.
Los solicitantes investigaron a continuacion la amplitud y potencia de PGV04 en comparacion con el suero donante a partir del cual se aislo PGV04. La CI50 de PGV04 estaba muy correlacionada con el 50 % de los tftulos de neutralizacion (TN50) del suero donante (test de Mann-Whitney, valor P < 0,0001). Sin embargo, hubo determinados casos donde PGV04 no neutralizo el virus que el suero donante era capaz de neutralizar (5 de 162 virus o 3 % de los virus) (FIG. 15). En estos casos, los Ab distintos de PGV04 parecen ser responsables de la actividad neutralizante del suero. Sorprendentemente, en unos pocos casos, PGV04 neutralizo un aislado concreto con una CI50 < 1 mg/ml mientras que el suero donante no neutraliza este mismo aislado (7 de 162 o 4 % de los virus) Los motivos para esta ultima observacion estan poco claros.
Induccion del sitio de union del correceptor sobre gp120 monomerico. Se ha mostrado anteriormente que CD4 soluble (sCD4) potencia la afinidad de union del mAb, 17b, togp120 (Zhang y col. 1999; Zhang y col. 2001). De manera interesante, a diferencia de b12, VRC01 ha mostrado tambien potenciar la union de 17b, aunque no en la misma extension que CD4-lgG (Wu y col. 2010). Los solicitantes se interesaron en determinar si la union de PGV04 a gp120
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potenciarfa de forma similar la union de los mAb CD4i. Tal como se muestra en la Fig. 11B, los solicitantes no detectaron mejora en la union del mAb CD4i en presencia de PGV04. Como alternativa a este experimento, los solicitantes anadieron cantidades saturantes de PGV04, CD4-lgG, b12,2G12, VRC01, VRC03 o no mAb a los pocillos revestidos con gp120 monomerico y a continuacion anadieron cantidades de valoracion tanto a 17b como a X5 biotinilado (FIGS. 12A-B). De nuevo, PGV04 no potencia la union de 17b o X5 tanto a JRFL como a YU2 gp120, aunque, CD4-IgG y VRC01 potenciaron la union de ambos mAb CD4i. De manera interesante, consistente con los datos anteriormente publicados, b12 disminuyo la union de 17b y X5 sugiriendo que compite parcialmente con los mAb CD4i (Moore y Sodroski 1996).
Induccion del sitio de union del correceptor sobre trfmeros funcionales. Los solicitantes investigaron a continuacion si PGV04 podrfa permitir que 17b se uniera al trfmero funcional. Se transfectaron simultaneamente celulas 293T con el ADN de JRFL Env y pSG3, un plasmido que contiene la estructura de VIH-1. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, los mAb, b12, 2G12, PGV04, sCD4, VRC01, VRC03 o 17b se unieron previamente a concentraciones saturantes con los trfmeros de Env expresados en la superficie. A continuacion, se valoro 17b sobre el complejo unido previamente, y se detecto la union usando citometrfa de flujo. Cuando sCD4 unido a gp120 en el contexto de la superficie celular expreso Env, creo un entorno estructural que permitio la union de 17b (Fig. 12C). Sin embargo, ningun otro mAb permitio niveles detectables de 17b al unirse al trfmero funcional. Como control, diluciones en serie de 2g12 biotinilado produjeron curvas de union identicas con cada uno de los mAb unidos previamente, demostrando que ninguno de los mAb dirigidos contra CD4bs indujo un grado significativo de desprendimiento de gp120 de los trfmeros de la superficie celular (Fig. 12D). Estos resultados sugieren que existen restricciones estructurales en el trfmero funcional que evitan la exposicion del sitio del correceptor sobre gp120 tras la union de los mAb dirigidos contra CD4bs que no existen en el monomero gp120.
Neutralizacion de PGV04 de pseudovirus JR-CSF que contienen sustituciones de alanina unicas. Para cartografiar el epftopo de PGV04, los solicitantes llevaron a cabo ensayos de neutralizacion con pseudovirus JR-CSF que contienen sustituciones de alanina unicas en la protefna gp120. Las sustituciones en D279,1420 e I423 comprometieron mucho la neutralizacion de PGV04, disminuyendo la potencia de neutralizacion a 1 %, 3 % y 5 % de la del tipo natural respectivamente (Fig. 13A). D279A comprometio tambien mucho la potencia de neutralizacion de CD4 y VRC01, pero tuvo un efecto limitado sobre la actividad de b12. l420A e I423A disminuyeron igualmente la potencia de neutralizacion de VRC01, aunque no en la misma extension que para PGV04. Ademas, estas dos sustituciones tuvieron el efecto opuesto sobre b12 y CD4-lgG, aumentando la potencia de neutralizacion de ambos mAb. De manera interesante, las isoleucinas que se encuentran en las posiciones 420 y 423 estan muy conservadas entre los virus VIH-1 existentes en la base de datos de Los Alamos, encontrandose a una frecuencia de 0,97 y 0,88 respectivamente. El acido aspartico que se encuentra en la posicion 279 esta menos conservado y se encuentra a una frecuencia de 0,45, encontrandose la asparagina en esta posicion a una frecuencia de 0,51.
Otras sustituciones de alanina suprimen tambien la neutralizacion de PGV04, pero no en la misma extension que los tres restos mencionados anteriormente. N276A disminuyo la potencia de neutralizacion de PGV04 a 13 % la del tipo natural. De forma notable, se ha determinado previamente que la N-acetil-glucosamina procedente del glicano unido a N en este resto es parte del epftopo VRC01 mediante la resolucion de la estructura cristalina de VRC01 unido a gp120 (Zhou y col.). Sorprendentemente, la eliminacion de este glicano dio como resultado un aumento de 4 veces en la potencia de neutralizacion de VRC01 no teniendo a la vez impacto sobre la neutralizacion de CD4-lgG o b12. Adicionalmente, I307A, I309A, F317A, e Y318A disminuyeron la neutralizacion de PGV04 a 9-36 % del tipo natural. Estos restos se encuentran en la punta del bucle V3 y lo mas probable es que sean importantes en el mantenimiento de la estructura local. De manera interesante, estos restos han mostrado ser importantes en el mantenimiento de la interaccion entre gp120 y gp41 (Xiang y col.), y las sustituciones de alanina en estas posiciones han mostrado dar como resultado una sensibilidad global a la neutralizacion del suero (Walker y col. 2010). A diferencia de PGV04 y (VRC01), estas sustituciones aumentaron la neutralizacion de b12 y CD4.
Union de PGV04 a sustituciones de alanina unicas que contienen JR-CSF gp120. Para cartografiar adicionalmente el epftopo de PGV04, Los solicitantes evaluaron la actividad de union de PGV04 a un panel de protefnas gp120 que contenfan sustituciones de alanina unicas que se capturaron a partir de pseudovirus JR-CSF lisados. Las variantes D279A (0 %), N280A (1 %), D457A (4 %), y R469A (3 %) gp 120 mostraron una importante disminucion en la union de PGV04 con respecto a gp120 de tipo natural, sugiriendo que los restos implicados son parte del epftopo de PGV04 (FIG. 13B). El resultado para D279Agp120 es coherente con los datos de neutralizacion descubiertos para la variante D279A del virus en la Fig. 13A. Adicionalmente, se anadieron tres restos potenciales a la cartograffa del epftopo PGV04 que no se ensayarfan en los experimentos de neutralizacion debido a que los valores de infectividad de la variante del virus correspondiente estaban por debajo del nivel de deteccion del ensayo. Una de las sustituciones, R469A, se encuentra en el bucle V5 y disminuye tambien la union de 2G12. Por lo tanto, esta sustitucion perturba mas probablemente la estructura de gp120 y no es parte directa del epftopo de PGV04. La sustitucion de D457A habfa mostrado previamente disminuir la union por debajo del 10 % del tipo natural para b12 y CD4 (Pantophlet y col. 2003) y D368A que disminuye la union de PGV04 a 12 %, ha mostrado previamente ser parte de los epftopos de CD4, b12 y VRC01, pero no al de HJ16 (Corti y col.; Zhou y col.; Walker y col. 2010).
Union de PGV04 a BaL gp120 deglicosilado. En los estudios de barrido de alanina de los solicitantes, Los solicitantes encuentran determinados glicanos unidos a N afectados por la union y la neutralizacion de PGV04. Por lo tanto, los solicitantes determinaron si la eliminacion de glicanos por Endo H, Endo F1, Endo F2, y Endo F3 procedentes
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de la protefna BaL gp120, producidos en celulas 293T, afectarfan la union de PGV04. PGV04 y los otros mAb dirigidos contra CD4bs, b12, VRC01, VRC03 y b6, retuvieron niveles similares de union a las formas simuladas y deglicosiladas de la protefna sugiriendo que los mAb dirigidos contra CD4bs en general no tienen una fuerte dependencia sobre los glicanos para la union de gp120 (Figs. 14A-B).
En este ejemplo, los solicitantes caracterizaron PGV04, un nuevo mAb con amplia y potente actividad neutralizante de VIH-1 dirigido contra CD4bs. PGV04 correspondio a la amplitud y potencia de PG9 y VRC01, dos potentes bNAb dirigidos contra VIH-1 anteriormente descritos. Se determino la neutralizacion de PG9 y PGV04 sobre dos paneles de pseudovirus diferentes. Para un panel de 162 pseudovirus en celulas U87, PGV04 y PG9 tenfan una potencia comprable, teniendo PGV04 mayor amplitud. Para un panel de 97 pseudovirus diferentes en celulas TZM-bl, se obtuvo finalmente un resultado ligeramente diferente. PG9 era mas potente que PGV04, y PG9 tenia una amplitud similar que PGV04. PG9 neutralizo los virus en el ultimo panel con mayor potencia que los virus en el panel de 162 virus, aunque, PGV04 parecio tener similar potencia de neutralizacion sobre ambos paneles. Esto puede ser debido a los aislados seleccionados en ambos paneles y/o a la lfnea de celulas diana utilizada, U87 frente a celulas TZM-bl. PGV04 tenia mayor amplitud que PG9 en ambos paneles, aunque esta diferencia era estadfsticamente significativa solo en el panel de 162 virus.
En su conjunto, PG9/16, VRC01 y PGV04 neutralizaron mas del 70 % de los virus en circulacion con una potencia 10 veces mayor que los bNAb anti-VIH-1 anteriormente definidos, b12, 2G12, 2F5, y 4E10. De manera interesante, el virus del donante de PGV04 se subtipo como clado A1/D recombinante que difiere de los donantes asociados con los otros bNAb dirigidos contra CD4bs, VRC01 (clado B), HJ16 (clado C) y b12 (supuesto clado B). Por lo tanto, parece que la estimulacion de mAb dirigidos contra CD4bs con capacidad ampliamente neutralizante no es dependiente del clado del aislado infectante. A resaltar, el virus del donante de PGV04 no parece ser ninguna forma recombinante en circulacion conocida (CRF) relacionada en las bases de datos de VIH de Los Alamos.
Los resultados de los solicitantes muestran significativas diferencias entre los bNAb dirigidos contra CD4bs en su modo de reconocimiento de la region CD4bs. Por ejemplo, CD4-lgG y VRC01 potencian la exposicion al sitio de union del correceptor sobre el gp120 monomerico, mientras que PGV04 y b12 no lo hacen. Ademas, VRC01, b12 y PGV04, a diferencia de CD4, no inducen el sitio del correceptor sobre trfmeros funcionales. Estas observaciones sugieren que existen diferencias entre la presentacion los CD4bs en gp120 recombinante frente a gp120 en el contexto del trfmero funcional. Estas observaciones tambien destacan diferencias en el reconocimiento de VRC01 y PGV04 de los CD4bs, como se expone sobre el gp120 monomerico.
En los estudios de barrido de alanina de los solicitantes, algunas sustituciones de alanina influyeron sobre los mAB dirigidos contra CD4bs de forma diferente, ilustrando de nuevo que PGV04, VRC01, b12 y CD4-lgG reconocen los CD4bs de maneras algo diferentes. Por ejemplo, D279A, I420A e I423A disminuyeron mucho la neutralizacion de PGV04, pero variaron en sus efectos sobre VRC01, CD4-lgG y b12. La sustitucion de D279A disminuyo la neutralizacion por VRC01 y CD4-IgG, pero no tuvo gran efecto sobre b12. Las sustituciones de I420A e I423A disminuyeron la neutralizacion de VRC01, pero aumentaron la neutralizacion de CD4-lgG y b12. Ademas, determinadas sustituciones en el bucle V3 disminuyeron la neutralizacion por PGV04 y VRC01, pero aumentaron la neutralizacion por CD4 y b12. De forma importante, la naturaleza muy conservada de los restos importantes para el reconocimiento de PGV04 explica analogamente como PGV04 es capaz de conseguir una amplia neutralizacion. De hecho, sera interesante determinar que restos son importantes para el escape natural de PGV04.
Los resultados de este Ejemplo tienen implicaciones para el diseno de la vacuna. Considerando que una coleccion de anticuerpos con una amplia y potente actividad neutralizante dirigidos contra CD4bs se han aislado de donantes infectados de manera natural, y que se ha detectado actividad neutralizante de CD4bs en algunos sueros ampliamente neutralizantes (Li y col. 2007; Binley y col. 2008; Gray y col. 2009; Li y col., 2009; Sather y col. 2009), parece que esta region puede ser una diana de vacuna particularmente prometedora. Tambien, los datos de los solicitantes muestran que diferentes bNAb dirigidos contra CD4bs pueden dirigirse a epftopos ligeramente diferentes, que pueden tener implicaciones para el diseno de inmunogenos que se centran en la respuesta inmune sobre los CD4bs.
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Ejemplo 5: Evolucion centrada de anticuerpos con actividad neutralizante de VIH-1 desvelada por las estructuras cristalinas y la secuenciacion en profundidad
El anticuerpo VRC01 es una inmunoglobulina humana que neutraliza ~90 % de aislados de VIH-1. Para comprender como se desarrollan dichos anticuerpos con amplia capacidad neutralizante, los solicitantes utilizaron la cristalograffa de rayos X y la pirosecuenciacion 454 para caracterizar anticuerpos analogos a VRC01 adicionales a partir de individuos infectados con VIH. Las estructuras cristalinas desvelaron un modo convergente de union para diversos anticuerpos al mismo epftopo del sitio de union a CD4. El analisis genomico funcional de las cadenas pesada y ligera expresadas desvelo rutas comunes de maduracion de la cadena pesada del anticuerpo, confinadas al linaje IGHV1-2*02, implicando docenas de cambios somaticos, y capaces de emparejarse con diferentes cadenas ligeras. La amplia capacidad inmunizante de VIH-1 asociada con anticuerpos analogos a VRC01 implica de esta manera la evolucion de los anticuerpos a un estado muy madurado por afinidad requerido para reconocer una estructura vinca invariante, con linajes definidos a partir de miles de secuencias que proporcionan mapas de ruta geneticos de su desarrollo.
El VIH-1 presenta extraordinaria diversidad genetica y ha evolucionado multiples mecanismos de resistencia para evadir la respuesta inmunitaria humoral (1-3). A pesar de estos obstaculos, un 10-25 %de individuos infectados con
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VIH-1 desarrolla anticuerpos con actividad neutralizante reactivos en cruzado despues de algunos anos de infeccion (4-9). La estimulacion de dichos anticuerpos formana la base para una vacuna de VIH-1 eficaz, y un esfuerzo intenso se ha centrado en identificar anticuerpos responsables y delinear sus caractensticas. Se ha aislado una variedad de anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen una gama de epftopos sobre el extremo del virus VIH-1 funcional, que esta compuesto por tres glicoprotemas de la envoltura exterior de gp120 muy glicosiladas y tres moleculas gp41 transmembrana. Algunos anticuerpos con actividad ampliamente neutralizante se dirigen contra la region externa proxima a la membrana de gp41 (10-11), pero la mayona reconoce gp120. Estos incluyen los anticuerpos que prefieren estructuras cuaternarias PG9, PG16, y CH01-04 (12-13), los anticuerpos reactivos a glicano 2G12 y PGT121-144 (14-15), y los anticuerpos b12, HJ16, y VRC01-03, que se dirigen contra la region de VIH-1 gp120 implicada en el contacto inicial con el receptor CD4 (16-19).
Una caractenstica inusual de todos estos anticuerpos con amplio poder neutralizante reactivos a gp120 es un alto nivel de mutacion somatica. Los anticuerpos acumulan normalmente 5-15 % de cambios en la secuencia de aminoacidos del dominio variable durante el procedimiento de maduracion por afinidad (20), pero para estos anticuerpos con actividad neutralizante reactivos a gp120, el grado de mutacion somatica de la cadena pesada esta marcadamente aumentado, variando desde el 19 % para los anticuerpos que prefieren la estructura cuaternaria (12), al 31 % para el anticuerpo 2G12 (21-22), y al 40-46 % para los anticuerpos dirigidos contra el sitio de union a CD4, hJ 16 (17), VRC01, VRC02, y VRC03 (18).
En el caso de VRC01, el anticuerpo maduro acumula aproximadamente 70 cambios totales en la secuencia de aminoacidos durante el procedimiento de maduracion. El VRC01 maduro puede neutralizar ~90 % de los aislados de VIH-1 con una media geometrica de CI50 de 0,3 pg/ml (18), y los estudios estructurales muestran que consigue esta neutralizacion reconociendo precisamente el sitio inicial de union a CD4 sobre VIH-1 gp120 (19). En contraste, el antecesor de la lmea germinal no mutado previsto de VRC01 tienen una debil afinidad por las cepas usuales de gp120 (~mM) (19). Ademas, con solo tres anticuerpos analogos a VRC01 identificados en un unico individuo (donante 45), resulta poco claro si el -modo de reconocimiento de VRC01, el origen genetico, y la ruta de maduracion por afinidad representan caractensticas generales de la respuesta de los linfocitos B al sitio de union a CD4 de VIH-1 gp120. Aqrn, los solicitantes exploran como neutralizar ampliamente la inmunidad de VIH-1 asociada con el desarrollo de anticuerpos analogos de VRC01, con un analisis de docenas de neutralizadores procedentes de donantes adicionales para responder a preguntas generales y para trazar rutas de maduracion por afinidad con miles de secuencias de anticuerpos analogas a VRC01.
Aislamiento de anticuerpos con actividad neutralizante de los donantes 74 y 0219 con una sonda del sitio de union a CD4. Los solicitantes utilizaron anteriormente un resurgido guiado por estructura para alterar las superficies antigenicas de VIH-1 gp120 preservando a la vez el sitio inicial de union al receptor de CD4 (18). Con la sonda del nucleo 3 resurgido estabilizado (RSC3), se alteraron aproximadamente un 30 % de los restos en superficie del nucleo de gp120 y la conformacion se estabilizo mediante la adicion de enlaces disulfuro interdominio y mutaciones puntuales que rellenaban la cavidad (18). Los solicitantes utilizaron RSC3 y una version mutante que contema una unica deleccion de aminoacido en el bucle de union a CD4 (ARSC3) para interrogar un panel de 12 sueros con un amplio poder neutralizante derivados de la cohorte G del protocolo IAVI de individuos infectados con VIH-1 (6, 23) (Fig. 17a). Una sustancial fraccion de neutralizacion de tres sueros se bloqueo espedficamente por RSC3 en comparacion con ARSC3, indicando la presencia de anticuerpos con actividad neutralizante dirigidos al sitio de union a CD4. Los ensayos de competicion para la neutralizacion de RSC3 confirmaron tambien la presencia de anticuerpos dirigidos al sitio de union a CD4 en el suero de 0219 caracterizado anteriormente, identificado en la cohorte CHaVi 001 (8) (FIG. 17A). Se utilizaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) procedentes del donante 74 del protocolo G (infectado con A/D recombinante) y del donante 0219 de CHAVI (infectado con el clado A) para la clasificacion de linfocitos B espedficos de antfgenos y el aislamiento de anticuerpos. Para el donante 74 y el 0219, respectivamente, se identificaron un total de 0,13 % y 0,15 % linfocitos B IgG+ (FIG. 17B). Los genes de la inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera procedentes de linfocitos B individuales se amplificaron y clonaron en vectores de expresion de IgG1 que reconstituyeron la IgG completa (18, 24). Con respecto al donante 74, dos anticuerpos somaticamente relacionados denominados VRC-PG04 y VRC-PG04b demostraron una fuerte union a algunas versiones de gp120 y a RSC3, pero >100 veces menos de union a ARSC3. Con respecto al donante 0219, cinco anticuerpos somaticamente relacionados denominados VRC-CH30, 31, 32, 33 y 34 presentaron un modelo de reactividad similar al de RSC3/ARSC3. El analisis de las secuencias de estos dos conjuntos de clones de anticuerpos (Fig. 17C) desvelo que se originaron del mismo precursor variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina inferida (IGVH) del alelo del gen IGHV1-2*02. A pesar de esta similitud en el origen del gen V de la cadena pesada, las dos secuencias de clones se originaron de diferentes genes del segmento J de la cadena pesada y conteman cadenas ligeras diferentes. Las cadenas ligeras de VRC-PG04 y las variantes somaticas de 04b se originaron a partir del alelo IGkV3 mientras que las variantes somaticas de VRC-CH30-34 se derivaron de un alelo IGkV1. A resaltar, los siete anticuerpos estaban madurados con una alta afinidad: VRC-PG04 y 04b presentaron una frecuencia de mutacion genica Vh del 30 % con respecto al alelo IGHV1-2*02 de la lmea germinal, un nivel de maduracion por afinidad similar al previamente observado con VRC01-03; los anticuerpos VRC-CH30-34 estaban tambien madurados con una alta afinidad, con una frecuencia de mutacion VH del 23-25 %.
Para definir las reactividades de estos nuevos anticuerpos sobre gp120, Los solicitantes llevaron a cabo los ELISA de competicion con un panel de mAB bien caracterizado. La union en cada uno de los anticuerpos se sometio a competicion por VRC01-03 por otros anticuerpos dirigidos contra el sitio de union a CD4 y por CD4-lg, pero no por los
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anticuerpos conocidos que se unen a gp120 en otros sitios. A pesar de las similitudes en la reactividad de gp120 y el origen genomico de Vh, las similitudes de secuencias de las regiones de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera no tienen en cuenta facilmente su modo de reconocimiento de gp120. Finalmente, la evaluacion de la neutralizacion de VRC-PG04 y VRC-CH31 sobre un panel de pseudovirus Env desvelo su capacidad para neutralizar potentemente una mayorfa de aislados diversos de VIH-1 (FlG. 17D).
Definicion estructural del reconocimiento de gp120 por anticuerpos identificados RSC3 de diferentes donantes; una convergencia notable. Para definir el modo de reconocimiento de gp120 empleado por el donante 74 derivado de VRC-PG04, los solicitantes cristalizaron su fragmento de union a antfgeno (Fab) en un complejo con un nucleo de gp120 procedente del clado A/E recombinante 93TH057 que se habfa cristalizado previamente con VRC01 (19). Se recogieron los datos de difraccion a una resolucion de 2,1 A a partir de cristales ortorrombicos, y la estructura se resolvio mediante sustitucion molecular y se refino hasta un valor R cristalografico de 19,0 % (Fig. 18A). La estructura de VRC-PG04 en complejo con HlV-1 gp120 mostro una sorprendente similitud con el complejo con VRC01 anteriormente determinado, a pesar de los diferentes orfgenes del donante y solo un 50 % de identidad de aminoacidos en la region variable de la cadena pesada (Fig. 18). Cuando se superpusieron los gp120, las posiciones de la cadena pesada resultante de VRC-PG04 y VRC01 difirieron en el promedio de las desviaciones cuadraticas (rmsd) de 2,1 A en atomos de Ca, con una alineacion incluso mas precisa de la region determinante de la complementariedad de la segunda cadena pesada (CDR H2) (1,5 A rmsd). Las interacciones crfticas tales como el puente salino de Asp368gp12o con Arg71vRC01 se mantuvieron en VRC-PG04 (Fig. 18B).
Los solicitantes cristalizaron tambien el complejo gp120-Fab del mAb VRC03 derivado del donante 45, cuyo aislamiento y la caracterizacion se habfan descrito anteriormente (18). VRC03 y VRC-PG04 comparten solo un 51 % de identidad de la secuencia de protefnas variable de la cadena pesada, y la cadena pesada de VRC03 contiene una insercion inusual en la region 3 del marco (18). Se recogieron los datos de difraccion a una resolucion de 1,9 A a partir de cristales ortorrombicos, y la estructura se resolvio mediante sustitucion molecular y se refino hasta un valor R cristalografico de 18,7 % (Fig. 18). VRC03 mostro tambien el reconocimiento de gp120 que fue sorprendentemente similar a los de VRC-PG04 y VRC01, con restos de interfaz similares y rmsds por parejas en atomos de Ca de 2,4 y 1,9 A, respectivamente. En particular, las superficies interactivas con gp120 de CDR H2 y CDR L3 mostraron un reconocimiento similar (Ca-rmds por parejas de estas regiones de los anticuerpos variaron de 0.5-1.4 A tras la superposicion de gp120).
En general, el repertorio de posibles productos de la inmunoglobulina es muy grande y se esperaba que se produjeran modos muy similares de reconocimiento de anticuerpos de forma infrecuente (25). Para evaluar como era de atfpica la convergencia del anticuerpo analogo a VRC01, los solicitantes analizaron otras familias de anticuerpos especfficos de VIH-1 que comparten orfgenes comunes de genes IGVH (26-29), incluyendo los anticuerpos inducidos por CD4, 17b, 412d y X5, todos los cuales derivan de un alelo IGHV1-69 comun. El analisis del reconocimiento de gp120 por estos anticuerpos indico una sustancial variacion, con una diferencia angular en la orientacion de la cadena pesada entre 17b, 412d y X5 de mas de 90°, o aproximadamente 10 veces mayor que entre los anticuerpos analogos a VRC01. Asimismo, Se puede seleccionar la sonda RSC3 para un modo concreto de reconocimiento, de esta manera, los solicitantes analizaron otros anticuerpos dirigidos contra el sitio de union a CD4 que se unen fuertemente a la sonda RSC3, incluyendo los anticuerpos b12 y b13 (16, 30); estos otros anticuerpos reactivos a RSC3 mostraron tambien diferencias drasticas en la orientacion de la cadena pesada con respecto a los anticuerpos analogos a VRC01.
La convergencia notable en el reconocimiento observada con VRC01, VRC03, y VRC-PG04 sugirio un modo comun de reconocimiento de VIH-1 gp120, conservado entre donantes infectados con un clado B (donante 45) o un clado A/D (donante 74) de una cepa de VIH-1. La precision requerida para este modo de reconocimiento surge probablemente como consecuencia de los multiples mecanismos de evasion inmunitaria que protegen el sitio de union a CD4 sobre VIH-1 gp120 (30). Los solicitantes analizaron las propiedades superficiales del paratopo y encontraron que la energfa promedio de las interacciones hidrofobas (AG) del anticuerpo estaban correlacionadas con la convergencia en el reconocimiento del anticuerpo (P=0,0427) (Fig. 19A) (31). De esta manera, aunque se requiere un enlace de H preciso para este modo de reconocimiento (Fig. 18C), la convergencia en la estructura parece optimizar regiones con interacciones hidrofobas. Otra importante caracterfstica de este modo de reconocimiento es su capacidad de centrarse precisamente sobre el sitio inicial de union al receptor de CD4 (19, 32). De hecho, la amplitud de la neutralizacion de VIH-1 entre ligandos del sitio de union a CD4 estaba correlacionada con el direccionamiento sobre este sitio (P=0,0405) (Fig. 19B).
Esta convergencia en el reconocimiento del epftopo se acompano por una divergencia en la identidad de la secuencia del anticuerpo (Figs. 17C y 19C). Los diez anticuerpos aislados por la union de RSC3 utilizan la lfnea germinal IGH V1-2*02 y acumulan 70-90 cambios de nucleotidos. A pesar de esta similitud en el epftopo reconocido por estos anticuerpos maduros, solo dos restos de la lfnea germinal del alelo IGHV1-2*02 maduran en los mismos aminoacidos (FIG. 17C). Ambos de estos cambios se producen en un contacto hidrofobo en la region de la CDR H2 crftica (56: Gly ^ Ala y 57: Thr ^ Val). Las cadenas ligeras de los anticuerpos donantes 45 y 74 surgen de cualquier IGVk3-11*01 o IGVk3-20*01, mientras que las cadenas ligeras de los anticuerpos donantes 0219 se derivan de IGVkI-33*01. Para estas cadenas ligeras, ningun cambio madurativo es identico. A pesar de esta diversidad en la maduracion, la comparacion de los paratopos VRC01, VRC03, y VRC-PG04 muestra que muchos de estos cambios son de caracter qufmico conservado (FIG. 19C); se preservo, por ejemplo, un parche hidrofobo en la CDR L3. Estas observaciones sugieren que cambios de aminoacidos divergentes entre anticuerpos analogos a VRC01 dan como resultado, sin
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embargo, un reconocimiento convergente cuando se gufan mediante maduracion por afinidad.
Complementacion funcional de las cadenas pesada y ligera entre anticuerpos analogos a VRC01.
Aunque la identificacion y la clasificacion de linfocitos B especfficos de antfgenos con sondas resurgidas han dado como resultado el aislamiento de algunos anticuerpos con amplia capacidad neutralizante, el analisis genomico de bibliotecas de ADNc de linfocitos B proporciona miles de secuencias para el analisis. Estas secuencias especifican el 'antibodioma', el repertorio de secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo expresado en cada individuo. Los procedimientos de secuenciacion de alto rendimiento proporcionan secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera, pero no retienen informacion acerca de los emparejamientos. Para los anticuerpos analogos a VRC01, la convergencia estructural desvelada por el analisis cristalografico indico una solucion potencial: las diferentes cadenas pesadas y ligeras deberfan conseguir la complementacion funcional con esta familia de anticuerpos.
Quimeras de la cadena pesada y la cadena ligera de VRC01, VRC03, VRC-PG04 y VRC-CH31 se produjeron mediante transfeccion transitoria y se ensayaron para la neutralizacion del VIH-1. Las cadenas ligeras VRC01 (donante 45) y VRC-PG04 (donante 74) fueron funcionalmente compatibles con las cadenas pesadas de VRC01, VRC03 y VRC-PG04, aunque la cadena ligera de VRC03 solamente fue compatible con la cadena pesada de VRC03 (Fig. 20A). De manera similar, a pesar de ~50 % de diferencias en la identidad de la secuencia, las cadenas pesada y ligera de VRC-CH31 (donante 0219) fueron capaces de complementar funcionalmente la mayorfa de los otros anticuerpos (Fig. 20A).
Identificacion de anticuerpos analogos a VRC01 mediante secuenciacion en profundidad de los donantes 45 y
74. Para estudiar el repertorio de anticuerpos en estos individuos, los solicitantes llevaron a cabo la secuenciacion en profundidad del ADN procedente de la PBMC del donante 45 (33). Como las regiones variables de las cadenas pesada y ligera tienen aproximadamente 400 nucleotidos de longitud, se utilizaron 454 procedimientos de pirosecuenciacion, que permitieron leer longitudes de 500 nucleotidos, para la secuenciacion en profundidad. Los solicitantes evaluaron en primer lugar las secuencias de la cadena pesada de una muestra de una muestra de PBMC de 2008 procedente del donante 45, el mismo punto temporal a partir del cual se aislaron anticuerpos VRC01, VRC02, y VRC03 mediante el sondeo de RSC3 de la poblacion de linfocitos B con memoria (18). Se utilizo el ARNm de 5 millones de PBMC como el molde para la PCR para amplificar preferentemente los genes de la IgG e IgM de la familia IGHV1. La pirosecuenciacion de 454 proporciono 221.104 secuencias de las cuales 33.386 codificaban los dominios variables de la cadena pesada que abarcaron la region V(D)J completa (Apendice 1). Para clasificar la informacion de la secuencia de la cadena pesada del donante 45, los solicitantes seleccionaron caracterfsticas concretas de las cadenas pesadas de VRC01 y VRC03 como filtros: (i) identidad de la secuencia, (ii) origen del alelo del gen IGVH, y (iii) divergencia de la secuencia de la lfnea germinal del gen IGVH como resultado de la maduracion por afinidad (Fig. 20B). Especfficamente, los solicitantes dividieron las secuencias por el origen alelico IGHV1-2*02 (4.597 secuencias) y origen no de IGHV1-2*02 (28.789 secuencias), y analizaron la divergencia de los genes de la lfnea germinal inferida, y la identidad de la secuencia con los anticuerpos VRC01 y VRC03 del molde (Fig. 20B). De manera interesante, no se encontro una identidad de secuencias mayor del 75 % con la cadena pesada de VRC01 o VRC02 (Fig. 20B), aunque se encontraron mas de 109 secuencias de mas de un 90 % de identidad de la secuencia con VRC03 y todas eran de origen IGHV1-2*02. Estas secuencias de la cadena pesada formaron una agrupacion bien segregada sobre una grafica de contorno (Fig. 20B, panel intermedio superior). Los solicitantes evaluaron a continuacion la funcion biologica de dos secuencias de cadena pesada seleccionadas aleatoriamente procedentes de esta agrupacion. Se prepararon anticuerpos quimericos emparejando cada una de las dos secuencias de la cadena pesada con la cadena ligera de VRC03. En ambos casos, se observo una potente neutralizacion, con una neutralizacion similar al anticuerpo VRC03 original (FIG. 20E) (34).
Se llevo a cabo un analisis similar por secuenciacion en profundidad de la cadena pesada con las PBMC del donante 74 procedente del mismo punto temporal de 2008 a partir del cual se aislaron VRC-PG04 y VRC-PG04B. En el analisis inicial, a pesar de obtener 263.764 secuencias, de las cuales 85.851 abarcaron las regiones V(D)J completas de la cadena pesada y 93.112 fueron unicas, no se encontraron secuencias que tuvieran mas de un 75 % de identidad de nucleotidos con VRC-PG04. Como el numero de ARNm de cadenas pesadas unicas presente en la muestra de PBMC era probablemente mucho mas grande que el numero de secuencias unicas obtenido en el analisis inicial, los solicitantes repitieron la secuenciacion en profundidad de esta muestra con un numero aumentado de lecturas de la pirosecuenciacion de 454 y con protocolos que optimizaron la longitud de la lectura. En este analisis, se descubrio que 110.386 secuencias de origen IGHV1-2*02 y 606.047 secuencias de origen no de IGHV1-2*02 abarcaban la region V(D)J de la cadena pesada, un aumento de 10 veces en la profundidad de la secuenciacion. Entre estas secuencias, 4.920 presentaron mas de un 75 % de identidad de nucleotidos con VRC-PG04 (Fig. 20B). Las secuencias de la cadena pesada del origen alelico IGHV1-2*02 se segregaron en varias agrupaciones, una a una divergencia de ~25 % y una identidad de ~85 con la cadena pesada de VRC-PG04, y varias a una divergencia del 25-35 % y una identidad del 65 %, 85 %, y 95 % con VRC-PG04 (FIG. 20B, panel superior derecho). Para evaluar la funcion biologica de estas numerosas secuencias de la cadena pesada identificadas mediante el procedimiento 454, Los solicitantes seleccionaron 56 secuencias representativas procedentes del cuadrante definido por una alta divergencia (16-38 %) y una elevada similitud de secuencias (60-100 %) con VRC-PG04. Las 56 secuencias se sintetizaron y expresaron con la cadena ligera de VRC-PG04). De forma notable, muchos de estos anticuerpos presentaron una potente neutralizacion de VIH-1 (35), confirmando que eran cadenas pesadas funcionales analogas a VRC-PG04 (FIG. 20E).
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Los solicitantes llevaron a cabo a continuacion un analisis similar de la cadena ligera del anticuerpo. Como VRC01-03 y VRC-PG04 derivan de los alelos IGkV3, los solicitantes usaron cebadores disenados para amplificar la familia de genes IGkV3. Los solicitantes seleccionaron un donante 45 en el punto temporal del 2001 para maximizar la probabilidad de obtener secuencias de la cadena ligera capaces de complementacion funcional (36). Se determinaron un total de 305.475 secuencias de las cuales 87.658 secuencias abarcaban la region V-J de la cadena ligera (Apendice 4). Para clasificar las secuencias de la cadena ligera del donante 45 en subconjuntos utiles, los solicitantes seleccionaron de nuevo caracterfsticas biologicamente especfficas: Una delecion de 2 aminoacidos distintivos en CDR L1 y maduracion por alta afinidad (17 % y 19 % para VRC01 y VRC-PG04, respectivamente). Se identificaron dos de dichas secuencias con ~90 % de identidad de la secuencia con las cadenas ligeras VRC01 y VRC03, respectivamente (Fig. 20C). Los solicitantes evaluaron la funcion biologica de estas dos cadenas ligeras tras la sfntesis y expresion en combinacion con las cadenas pesadas de VRC01, VRC03, y VRC-PG04. Cuando se emparejaron con su respectiva cadena pesada natural correspondiente para producir una IgG completa, Ambos anticuerpos quimericos presentaron actividades de neutralizacion similares a las del anticuerpo natural (Fig. 20D).
Similitudes de maduracion de anticuerpos analogos a VRC01 en diferentes donantes desveladas por herramientas filogeneticas. La convergencia estructural en el reconocimiento de gp120 y la complementacion funcional entre anticuerpos analogos a VRCOI de diferentes donantes sugirio similitudes en sus procedimientos de maduracion. De esta forma, los solicitantes utilizaron herramientas filogeneticas bien establecidas para evaluar la relacion evolutiva entre secuencias derivadas del gen de la misma lfnea germinal precursora (36). Los solicitantes teorizaron que, si se anadfan las secuencias analogas a VRC01 conocidas de un donante al analisis de secuencias de otro donante, el analisis 'filogenetico de donantes cruzados' resultante puede desvelar similitudes en las rutas de maduracion de los anticuerpos. Especfficamente, con dicho analisis, podrfa esperarse que las secuencias exogenas se interpusieran entre las ramas del dendograma que contienen anticuerpos analogos a VRC01 procedentes del conjunto completo de anticuerpos del donante original. Los solicitantes llevaron a cabo el analisis con cadenas pesadas, ya que todos los anticuerpos analogos a VRC01 identificados con sonda derivaban del alelo IGHV1-2*02 de la misma cadena pesada. Los solicitantes anadieron VRC-PG04 y 4b derivados del donante 74 y las secuencias de la cadena pesada de VRC-CH30-32 derivadas de 0219 con las secuencias de la cadena pesada del donante 45 del origen genomico IGHV1-2*02 y construyeron un arbol enraizado en el antecesor de la lfnea germinal no mutada de la VRC01 prevista (18). Este analisis desvelo que las secuencias con elevada identidad con VRC03 se agrupaban en un subarbol con un nodo comun que era tambien el progenitor de las secuencias de la cadena pesada analoga a VRC01 del donante 74 y el donante 0219 (Fig. 21 A, izquierda). Se mostro que dos secuencias del donante 45 seleccionadas al azar procedentes del subarbol derivado de este nodo comun neutralizaban VIH-1, mientras que 11 secuencias de la cadena pesada del exterior de este nodo no lo neutralizan (P < 0,0001).
Los solicitantes evaluaron tambien las secuencias de la cadena pesada IGHV1-2*02 derivadas del donante 74 incluyendo anticuerpos analogos a VRC01 identificados mediante sonda procedentes del donante 45 y del donante 0219 en el analisis filogenetico de donantes cruzados. En el arbol enraizado en el antecesor de la lfnea germinal no mutada de VRC-PG04 prevista, se segregaron 5.047 secuencias comprendidas en el subarbol identificado con el donante 45 y el donante 0219 (Fig. 21A, derecha). Este subarbol incluyo el VRC-PG04 real y las secuencias de la cadena pesada 04b, 4.693 de secuencias con una identidad >85 % con VRC-PG04, y algunos cientos de secuencias con identidades tan bajas con 68 % con VRC-PG04. Para ensayar la actividad funcional de las secuencias de la cadena pesada identificadas por este analisis, Los solicitantes evaluaron en primer lugar la localizacion en el arbol de las 56 secuencias de la cadena pesada que se identificaron y se expresaron a partir de la rejilla de identidad/divergencia anteriormente descrita (Fig. 22A). A estas 56 secuencias, los solicitantes anadieron 7 secuencias adicionales procedentes de arbol del donante 74 y 7 secuencias no de IGHV1-2*02 para potenciar la cubierta de las secuencias segregadas por el donante cruzado (Fig. 22B). Estas 70 secuencias se sintetizaron y expresaron con la cadena ligera de VRC-PG04 (Fig. 22C). Entre estas 70 secuencias de cadena pesada sintetizadas, 25 no se expresaron. De los restantes 45 anticuerpos reconstituidos, 24 fueron capaces de neutralizar VIH-1 (Fig. 22B). De forma notable, todas las secuencias con actividad neutralizante se segregaron en el subarbol identificado por los anticuerpos analogos a VRC01 del donante 45 y el donante 0219 anadidos exogenamente (valor P=0,0067) (Fig. 22D).
Los solicitantes aplicaron tambien este procedimiento de segregacion de donantes cruzados a las cadenas ligeras del conjunto completo de anticuerpos del donante 45. Las cadenas ligeras de los donantes 74 y 0219 no se segregan con las cadenas ligeras analogas a VRC01 conocidas procedentes del donante 45, probablemente porque estas tres cadenas ligeras no surgen de las mismas secuencias inferidas de la lfnea germinal. Esta diferencia puede reflejar tambien las disimilitudes en la maduracion focalizada de las dos cadenas (vease la Fig. 19A): en la cadena pesada, la maduracion focalizada se produce en la region CDR H2 (abarcada unicamente en el gen Vh de IGHV1-2*02 a partir del cual derivan todas las cadenas pesadas analogas a VRCOI) y, en la cadena ligera, las presiones de seleccion se producen en la region CDR L3 (que es un producto de diferentes tipos de recombinacion V-J).
Analisis del linaje CDR H3. Las 37 secuencias de la cadena pesada que se segregaron en el subarbol con capacidad neutralizante de VRC01 y se expresaron cuando se reconstituyeron con la cadena ligera de VRC-PG04 se pudieron agrupar en 9 clases de CDR h3 (Fig. 22B), conteniendo las secuencias en cada clase no mas de 5 diferencias de nucleotidos en CDR H3 de otras secuencias en la misma clase. Un analisis detallado de la vinculacion entre los orfgenes de la recombinacion V(D)J de estas clases sugirio que 8 de las 9 clases surgen por acontecimientos de recombinacion diferentes; dos de las clases (7 y 8) difirieron principalmente en una unica insercion/delecion de tres
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restos, Arg-Tyr-Ser, y pueden haber surgido de un unico acontecimiento de recombinacion V(D)J. Tres de estas clases (CDR H3-1,2, y 9) se representaban solamente por anticuerpos sin actividad neutralizante, tres por un unico anticuerpo con actividad neutralizante (CDR H3-4, 5 y 6 del estudio), y tres por mezclas de anticuerpos con actividad neutralizante y sin actividad neutralizante (CDR H3-3, 7 y 8) (38). Aunque no resulto claro si las secuencias de cadena pesada sin actividad neutralizante carecfan verdaderamente de funcion de neutralizacion o si este fenotipo era debido a incompatibilidades en el emparejamiento de cadenas ligeras, los solicitantes seleccionaron analizar las clases CDR H3 solo para aquellas en las que se habfa confirmado la neutralizacion.
Los solicitantes analizaron ademas las secuencias de la cadena pesada IGHV1-2*02 del donante 74 para proporcionar una vision general de la diversidad de CDR H3 con respecto a la identidad y divergencia de la secuencia (Fig. 22E) y para identificar aquellas con secuencias CDR H3 identicas a las CDR H3 en cada una de las clases con actividad neutralizante. Este analisis identifico cuatro linajes clonales (CDR H3-clases 3, 6, 7 y 8 del estudio), con secuencias que se extendfan al 15 % o menos de maduracion por afinidad. La clase 7 de CDR H3 inclufa los anticuerpos identificados con sonda, VRC-PG04 y 04b (FIG. 22B). En cada caso, una acumulacion estacionaria de cambios en las regiones marco y CDR condujo a una creciente actividad de neutralizacion (39), y cambios en las posiciones 48, 52, 58, 69, 74, 82 y 94 en el gen V, entre otros, parecieron seleccionarse en varios linajes. En su conjunto, mas de 1.500 secuencias unicas se pudieron clasificar en estos cuatro linajes de CDR H3. Aunque estos linajes de CDR H3 se infirieron a partir de un unico punto temporal, proporcionan igualmente una vision de las rutas de maduracion especfficas por las cuales las cadenas pesadas de anticuerpos analogos a VRCOI evolucionan a partir de un anticuerpo recombinante no mutado inicial hasta un anticuerpo con amplia capacidad neutralizante.
Analisis de la cadena J y complejidades de maduracion. Entre las secuencias analogas a VRC01 de la cadena pesada identificador en donantes 45 y 74, se observo una significativa desviacion de la utilizacion de la cadena J (Fig. 21 A): en el donante 45, aproximadamente el 87 % de las secuencias segregadas por donantes cruzados utilizan el alelo IGHJ1*01, y en el donante 74, un 99 % de las secuencias segregadas utilizan el alelo IGHJ2*01. Esta utilizacion preferente de la cadena J pesada no parece ser un requerimiento para la especificidad de la union; de hecho, el uso del alelo J1 en VRC01, el alelo J2 en VRC-PG04, y el alelo J4 en VRC-CFI31 proporciona ejemplos de la compatibilidad funcional de al menos tres alelos IGFIJ diferentes en los anticuerpos analogos a VRC01. Ademas del uso preferente de la cadena J, podrfan inferirse otras complejidades del procedimiento de maduracion a partir de similitudes en los genes de la cadena pesada madura y diferencias en la secuencia CDR H3. En ausencia de informacion sobre el emparejamiento natural de las cadenas pesada y ligera, los procedimientos de maduracion de anticuerpos sobre los que subyacen estas complejidades son diffciles de inferir. Sin embargo, los datos de secuenciacion en profundidad, con miles de intermedios de maduracion definidos por CDR H3, que proporcionan suficiente informacion para sugerir que el procedimiento de maduracion puede implicar la revision de la cadena pesada u otros mecanismos de diversificacion de linfocitos B (40, 41).
Genomica de anticuerpos, inmunidad de VIH-1 e implicaciones de la vacuna. La maduracion por afinidad que se centra en desarrollar un anticuerpo en un sitio conservado de vulnerabilidad de VIH-1 proporciona un mecanismo para conseguir un amplio reconocimiento de VIH-1 gp120. Dicha evolucion focalizada puede ser comun a anticuerpos con un amplio poder neutralizante que tienen exito en superar la evasion inmunitaria que protege VIH-1 gp120 del reconocimiento humoral; las multiples capas de evasion pueden limitar o focalizar el desarrollo de anticuerpos nascentes a rutas concretas durante la maduracion.
El enfoque genomico basado en estructura descrito proporciona herramientas para comprender la maduracion del anticuerpo. Los solicitantes muestran como se puede utilizar la secuenciacion en profundidad para determinar el repertorio de familias especfficas de secuencias de la cadena pesada y ligera en individuos infectado con VIH-1. Estos antibodiomas parciales se pueden interrogar posteriormente segun propiedades inusuales de la secuencia, o en la maduracion, para identificar anticuerpos para caracterizacion funcional. Los solicitantes demuestran tres medios de cribar una gran base de datos de secuencias de anticuerpos: 1) por identidad con una secuencia de un mAb conocido y por divergencia de una presunta lfnea germinal (analisis de rejilla de identidad/divergencia), 2) por el analisis filogenetico de donantes cruzados de las relaciones de las rutas de maduracion, y 3) por el analisis del linaje CDR H3. Estos tres medios de cribado se pueden aplicar de forma iterativa o combinada (Fig. 22). Un aspecto importante de los analisis de los solicitantes era la caracterizacion funcional de las secuencias seleccionadas conseguido a traves de la expresion y la reconstitucion con cadenas pesadas o ligeras analogas a VRC01, aunque son posibles otros medios de emparejamiento tales como mediante el analisis de frecuencias (42). Aunque se ha evaluado la neutralizacion en menos de 100 anticuerpos reconstituidos, los miles de secuencias de cadenas pesadas y cadenas ligeras identificadas proporcionan un gran conjunto de datos para el analisis, que debe potenciar la comprension de los solicitantes de las caracterfsticas crfticas de los anticuerpos analogos a VRC01. Por ejemplo, la correlacion de la variacion de la secuencia en posiciones concretas con la neutralizacion debe proporcionar una vision de la diversidad permitida y de los elementos requeridos de neutralizacion de esta familia de anticuerpos.
La secuenciacion en profundidad y las metodologfas bioinformaticas estructurales presentadas aquf facilitan el analisis del antibodioma. Esta tecnologfa genomica permite la interrogacion de las respuestas del anticuerpo procedente de donantes infectados, individuos sin infectar, o incluso receptores de vacunas y tiene diversas implicaciones. Por ejemplo, un analisis enraizado genomico del conjunto completo de anticuerpos VRC01 con herramientas filogeneticas normalizadas puede desvelar la ruta general de maduracion de los linfocitos B para la produccion de anticuerpos analogos a VRC01. De hecho, el analisis filogenetico de donantes cruzados (Fig. 21B) sugiere que los intermedios de
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maduracion comunes con 20-30 cambios de maduracion por afinidad procedentes del precursor genomico IGHV1-2*02 se encuentran en diferentes individuos. Estos intermedios proporcionan anticuerpos analogos a VRC01 con amplia capacidad neutralizante, que tienen aproximadamente 70-90 cambios procedentes de precursor IGHV1-2*02 (Fig. 21B). Si los gp120 modificados con afinidad por los intermedios de maduracion representados por los nodos del arbol se estimularan la fabricacion de estos intermedios, entonces el analisis presentado aquf podrfa ayudar a guar la activacion inducida por la vacuna de anticuerpos analogos a VRC01. La secuenciacion profunda no solo proporciona un procedimiento para identificar dichos intermedios, sino tambien un medio para facilitar su deteccion. En su conjunto, la aplicacion de las tecnologfas genomicas al analisis de anticuerpos facilita a la vez una retroalimentacion muy sensible y una oportunidad sin precedentes para comprender la respuesta del antibodioma a la infeccion y la vacunacion.
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33. El ARNm se extrajo de 20 millones de PBMC, se transcribio de forma inversa con el oligo (dT)12-18, y un cuarto del ADNc resultante (equivalente a la transcripcion de 5 millones de PBMC) se uso como molde de PCR para amplificar preferentemente la familia del gen IGHV1 a partir de celulas que expresaban tanto IgG como IgM. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se analizaron mediante pirosecuenciacion de 454.
34. Los solicitantes evaluaron tambien secuencias derivadas de 454 para la compatibilidad estructural con VRC01, VRC03, y las estructuras cristalinas del complejo VRC-PG04 gp120 utilizando un algoritmo de formacion de hebra que evaluo la compatibilidad estructural utilizando el potencial estadfstico DFIRE (43). Ninguna de las diez secuencias con puntuaciones DFIRE optimas, ni aquellas con una elevada divergencia en la lfnea germinal de origen genomico no de IGHV1-2*02 presento neutralizacion cuando se reconstituyo con la cadena ligera de VRC01 (Fig. 20E). De esta manera, la similitud de la secuencia, el origen de IGHV1-2*02, y la divergencia se correlacionan todos con el potencial de neutralizacion, pero otros factores tales como la compatibilidad estructural prevista fracasaron en identificar los anticuerpos analogos a VRC01.
35. Seis de los anticuerpos reconstituidos muestran un valor medio de la CI50 de ~0,1 pg/ml, un nivel de potencia similar al observado con los anticuerpos originales VRC-PG04 identificados mediante sonda.
36. VRC03L no se complementa bien con otras cadenas pesadas; 2) VRC03 H se encontro rapidamente entre las secuencias del donante 45 2008; 3) VRC01 y VRC02 H no se encontraron entre las secuencias del donante 45 2008; 4) VRC01-03 se aislaron de la poblacion de linfocitos B con memoria. Los resultados 1-4 sugieren que VRC03 procede de VRC01; Los solicitantes seleccionaron, por tanto, un punto temporal anterior a 2008 para maximizar la probabilidad de obtener cadenas ligeras que permitieran la complementacion funcional con cadenas pesadas VRC01 conocidas.
37. Aunque el analisis filogenetico se usa frecuentemente para estudiar la evolucion de una familia de secuencias y para comprender las relaciones entre secuencias antecesoras y sus descendientes, los solicitantes apreciaron que existen varios aspectos unicos de la evolucion de anticuerpos. Debido a la naturaleza de la actividad de la citidina desaminasa (AID) inducida por activacion, los anticuerpos acumulan mutaciones en los puntos calientes (CDR) y, por tanto, no se producen de manera aleatoria en todo el genoma del anticuerpo. Tambien, el procedimiento de recombinacion de VDJ introduce inserciones y deleciones de nucleotidos que alteran la secuencia de la lfnea germinal de ADN. El objetivo de los inventores en el presente documento era elucidar la ontogenia de las secuencias de anticuerpos recombinadas para identificar secuencias intermedias relacionadas con los anticuerpos con actividad neutralizante maduros. Por tanto, los solicitantes usaron algoritmos establecidos de maxima probabilidad filogenetica para analizar los datos de la secuencia del anticuerpo y para construir arboles enraizados en secuencias de anticuerpos derivados de un antecesor comun (es decir, misma lfnea germinal VH).
38. Algunas de las secuencias de la cadena pesada sin actividad neutralizante mostradas en la distribucion de CDR H3 de la Fig. 22 son probablemente el resultado del cambio de molde de la PCR. La unica cadena pesada representada graficamente en el grafico de contornos de las clases 1 de CDR H3 contiene un unico CDR H3, pero con un gen V que presenta una elevada similitud con las secuencias de la clase 3. La misma observacion se realiza para las dos secuencias del grafico de contornos de la clase 2. Tambien, la secuencia fuertemente divergente (y externa) del grafico de distribucion de la clase 9 de CDR H3 contiene el mismo CDR H3 que las otras 9 secuencias de la clase 140, pero con un gen V que se acerca mucho a las secuencias encontradas en la clase 8. Como solamente unas pocas de mas de 1.500 secuencias unicas identificadas mediante el analisis de CDR H3 mostraron genes V similares, y todas ellas aparecen como doblemente externas, el cambio de molde puede suceder, pero es raro. Esta rareza tambien se sugiere por el analisis de 606.047 no de IGHV1-2*02 del donante 74 para secuencias de CDR H3 identificadas en la Fig. 22B, que localiza menos de 100 secuencias, de las que la mayorfa corresponde a la agrupacion probablemente asignada de forma incorrecta a la secuencia no de IGHV1-2*02 del donante 45 de la Fig. 20, como se describe en la notl (44).
39. Una acumulacion similar de mutaciones somaticas se mostro (45) con los anticuerpos de amplio poder neutralizante PG9 y PG16 que se correlaciona con un aumento en la amplitud de la neutralizacion y en la potencia.
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44. El pico a una divergencia de ~25 % de iGhV1-2*02 y una identidad del 88 % tambien se observo en la grafica de secuencias para las secuencias no de origen IGHV1-2*02. Los analisis de donante cruzado y CDR H3 muestran
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que estas secuencias no derivadas de IGHV1-2*02 se segregan de los anticuerpos de tipo VRC01 en los dendogramas y tienen CDR H3 que son identicas a los anticuerpos de tipo VRC01 confirmados, lo que indica que las secuencias no incluidas en la agrupacion IGHV1--2*02 esten probablemente incorrectamente asignadas y sean realmente de origen IGHV1-2*02.
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La financiacion de este ejemplo fue proporcionada por el Intramural Research Program del Vaccine Research Center, National Institute of Allergy and Infectious Diseases y el National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, y mediante bebas de la International AIDS Vaccine Initiative's Neutralizing Antibody Consortium y del Centerfor HIV AIDS Vaccine Immunology, Beca AI 5U19 Al 067854-06, del National Institutes from Health. El uso del sector 22 (Southeast Region Collaborative Access team) del Advanced Photon Source recibio financiacion del US Department of Energy, Basic Energy Sciences, Office of Science, mediante el contrato numero W-31-109-Eng-38. Los factores de estructura y la coordinacion de los anticuerpos VRC03 y VRC-PG04 en su complejo con VIH-1 gp120 se depositaron en el Protein Data Bank con los codigos de registro 3SE8 y 3SE9, respectivamente. Los solicitantes tambien han depositado los datos de secuenciacion profunda de los donantes 45 y 74 usados en este Ejemplo en la NCBI Short Reads Archives (SFtA) con el numero de registro SRP006992, las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos identificados mediante sonda VRC-PG04 and VRC-PG04b (numeros de registro GenBank JN159464-JN159467), VRC-CH30, VRC-CH31 y VRC-CH32 (JN159434 -JN159439), y VRC-CH33 y VRC-CH34 (JN159470 -159473), asf como las secuencias de los neutralizadores identificados genomicamente: 24 cadenas pesadas del donante 74, 2008 (JN159440 - JN159463), 2 cadenas pesadas del donante 45, 2008 (JN159474 - JN159475), 2 cadenas ligeras del donante 45, 2001 (JN159468 - JN159469), y 1.561 secuencias unicas asociadas con las distribuciones de CDR H3 con actividad neutralizante con al menos un miembro de baja divergencia (JN157873-JN159433).
Habiendo descrito de esta forma las realizaciones preferidas detalladas de la presente invencion, se entendera que la invencion definida por los parrafos anteriores no esta limitada a los detalles concretos definidos en la descripcion anterior.
Claims (9)
- 5101520251. Un anticuerpo anti-VIH aislado o de origen no natural, en el que dicho anticuerpo tiene:(i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos VRC-PG-04 definida en la Fig. 8A:---------FR1----------------------------CDR1-------------------FR2-----------CDR2------------------qvqlvqsgsgvkkpgasvrvscwtsedifertelihwvrqapgqglewigwvktvtgavnfgspdfrqr---------------FR3-------------------------CDR3--------------FR4----VSLTR......DRDLFTAIIMDIRGLTQGDTATYFCARQKFYTGGQGWYFD LWGRGTLIWSSy(ii) una cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos VRC-PG-04 definida en la Fig. 8B:--------FR1---------------_CDR1----------FR2------CDR2-----EIVLTQSPGTLSLSPGETASLSCTAASYGH...MTWYQKKPGQPPKLLIFATSKRASGI-----------FR3-----------------CDFG------FR4---PDRFSGSQFGKQYTLTITRMEPEDFARYYCQQ LEFFGQGTR..LEIR
- 2. Un procedimiento in vitro para el seguimiento de la calidad de las vacunas anti-VIH, que comprende el uso del anticuerpo de la reivindicacion 1, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, para determinar que un antfgeno de la vacuna anti-VIH contiene un epftopo en una conformacion para desencadenar una respuesta inmunitaria.
- 3. Una composicion diagnostica que comprende un anticuerpo marcado de la reivindicacion 1, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, para detectar la presencia de un VIH inmunogeno en una muestra.
- 4. La composicion de la reivindicacion 3, en la que la muestra es una muestra biologica.
- 5. La composicion de la reivindicacion 4, en la que la muestra biologica es sangre, semen o fluido vaginal.
- 6. Una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo de la reivindicacion 1, para su uso en un procedimiento para inmunizar o reducir el efecto de una infeccion por VIH o una enfermedad relacionada con el VIH en un paciente que necesita dicho tratamiento.
- 7. El anticuerpo para su uso en el procedimiento de la reivindicacion 6, que comprende ademas administrar un segundo agente terapeutico.
- 8. El anticuerpo para su uso en el procedimiento de la reivindicacion 7, en el que el segundo agente terapeutico es un agente antivfrico.
- 9. Una cantidad terapeuticamente eficaz de:un primer anticuerpo como se define en la reivindicacion 1, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, especffico de un primer epftopo, y un segundo anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:- el anticuerpo VRC01 que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos definida en la Fig. 8A:------FR1------------------CDR1------------FR2-------CDR2------------QVQLVQSGGQMKKPGE SMRISCRASGYEF.IDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNY.ARPLQGR-------------FR3--------------------------CDR3-------------FR4----VTMTR......DVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNW DFEHWGRGTPVIVSSy una cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos definida en la Fig. 8B:51015--------------FR1----------------------------_CDR1------------------FR2-----------CDR2---------EIVLTQSPGTLSLSPGETAIISCRTSQYGS ..LAWYQQRPGQAPRLVIYSGSTRAAGI----------------------PR 3--------------------------------CDR3--------------------FR4PDRFSGSRWGPDYNLTISNLESGDFGVYYCQQ YEFFGQGTKVQVDIKo- el anticuerpo VRC02 que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos definida en la Fig. 8A:-----FR1-----------------CDR1-----------FR2------CDR2-----------QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCQASGYEF.IDCTLNWVRIAPGRRPEWMGWLKPRGGAVNY.ARPLQGR------------FR3-------------------------CDR3------------FR4---VTMTR......DVYSDTAFLELRSLTADDTAVYYCTRGKNCDYNW DFE HWGRGTPVTVSSy una cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos definida en la Fig. 8B:--------FR1---------------_CDR1----------FR2------CDR2-----EIVLTQSPGTLSLSPGETAIISCRTSQYGS ..LAWYQQRPGQAPRLVIYSGSTRAAGI------------FR3-----------------CDR3 ----FR4 - -PDRFSGSRWGPDYNLTIRNLE SGDFGLYYCQQ YE FFGQGTKVQVDIKo- el anticuerpo VRC03 que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos definida en la Fig. 8A:---------FR1------------------------------CDR1-------------------FR2-----------CDR2-------------------QVQLVQSGAVIKTPGSSVKISCRASGYNF.RDYSIHWVRLIPDKGFEWIGWIKPLWGAVSY.ARQLQGR---------------------FR3--------------------------------------------CDR3---------------------FR4------VSMTRQLSQDPDDPDWGVAYMEFSGLTPADTAEYFCVRRGSCDYCGDFPWQ YWGQGTWWSSy una cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos definida en la Fig. 8B:--------------FR1------------------------------_CDR1___;--------------FR2-----------CDR2---------EIVLTQSPG ILSLSPGETATLFCKASQGGNA..MTWYQKRRGQVPRLLIYDTSRRASGV----------------------FR3--------------------------------CDR3 --------FR4 —PDRFVGSGSGTDFFLTINKLDREDFAVYYCQQ FE FFGLGSE. .LEVHo un fragmento de union a antfgeno del mismo, especffico de un segundo epftopo para su uso en un procedimiento para inmunizar o reducir el efecto de una infeccion por VIH o una enfermedad relacionada con el VIH en un paciente que necesita dicho tratamiento.
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