ES2613672T3

ES2613672T3 - Esponja de colágeno

Info

Publication number: ES2613672T3
Application number: ES15808663.7T
Authority: ES
Inventors: Cornel Imhof; Lothar Schloesser; Niklaus Stiefel; Martin Wüest
Original assignee: Geistlich Pharma AG
Current assignee: Geistlich Pharma AG
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2017-05-25
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: EP3055000A1; IL252909B; DK3055000T3; MX368544B; HUE031528T2; HK1221668A1; JP2017537764A; CN106999632B; IL252909A0; EP3055000B1; US9655997B2; PL3055000T3; BR112017011140B1; AU2015367710A1; AU2015367710B2; JP6328861B2; USRE48536E1; PT3055000T; CA2970849C; MX2017007810A

Abstract

Una esponja de colágeno químicamente reticulada resorbible elástica para promover el aumento de volumen de tejido blando en la región oral, que comprende 60-96 % (peso/peso) de colágeno y 4-40 % (peso/peso) de elastina, que muestra por porosimetría de intrusión de mercurio poros interconectados con una mediana del diámetro de poro entre 50 y 90 μm y al menos el 80 % de porosidad con un diámetro de poro superior a 10 μm, una temperatura de aparición de 45 a 57 ºC y una densidad en estado seco de 50 a 65 mg/cm3.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Esponja de colageno

La invencion se refiere a una nueva esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica para promover el aumento de volumen de tejido blando en la region oral, un proceso de preparacion de la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica y el uso de la misma como un implante en la cavidad bucal para el aumento de volumen de tejido blando.

El aumento de volumen de tejido blando se ha convertido en uno de los mayores retos en la cirugla dental y craneo- maxilofacial. Con el fin de mejorar tanto los resultados funcionales como esteticos por el aumento de volumen de tejido blando, injertos de tejido autogeno, tales como el injerto gingival libre (FGG) o el injerto de tejido conjuntivo subepitelial (SCTG), a pesar de sus inconvenientes, todavla se usan ampliamente para diversas indicaciones y son considerados el metodo de referencia (F. Cairo et al., 2008, J. Clin. Peryodontol. 35 (Suppl. 8), 314-319; R. Jung et al., 2004, Int. J. Peryodontics Restorative Dent. 24(6), 545-553 y D. Thoma, 2009, Clin. Oral Implants Res. 20 (suppl. 4), 146-165). Sin embargo, el procedimiento de recogida de tejido autogeno en un segundo sitio quirurgico normalmente en el paladar tiene inconvenientes para el paciente y limitaciones en cuanto a la calidad y cantidad de tejido que puede recuperarse.

Asl, es deseable un dispositivo regenerativo para promover el aumento de volumen de tejido blando en la region oral.

Las celulas gingivales del tejido conjuntivo oral se exponen a complejas fuerzas mecanicas durante la masticacion, tragado, movimiento de la lengua, habla, movimiento de los dientes y tratamiento ortodoncico. Especialmente durante la cicatrizacion tras procedimientos quirurgicos, pueden producirse fuerzas internas y externas, creando presion sobre el dispositivo regenerativo y el tejido recien formado.

Un dispositivo regenerativo tiene que cumplir ciertos criterios antes de ser usado en la cavidad bucal para el aumento de volumen de tejido blando: Debe ser biocompatible, resorbible in vivo, permitir el crecimiento hacia adentro gingival, mostrar un buen nivel de integracion de tejido tal como para permitir la curacion sin incidentes (sin excesiva inflamacion o dehiscencia) y ser capaz de resistir a las fuerzas mecanicas que actuan como un armazon que mantiene el volumen de tejido durante un tiempo suficiente durante el proceso de cicatrizacion despues de la implantacion, generalmente al menos aproximadamente 3 meses.

Ninguno de tales dispositivos regenerativos ha sido desvelado hasta la fecha en el estado de la tecnica.

H. Mathes et al. en "A Bioreactor Test System to mimic the Biological and Mechanical Environment of Oral Soft Tissues and to Evaluate Substitutes for Connective Tissue Gafts", 2010, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 107, No. 6, paginas 1029-39, desvelan que tales propiedades de un dispositivo regenerativo que consiste en una esponja de colageno podrlan lograrse por la rigidizacion del cuerpo de matriz reticulando las fibras de colageno con un grado que permitiera el equilibrio correcto entre la estabilidad mecanica (alto grado de reticulacion) y la curacion de tejido blando sin incidentes (bajo grado de reticulacion), pero son totalmente silenciosos sobre como preparar una esponja de colageno tal. Desvelan que tres prototipos diferentes de esponja de colageno que consisten en colageno porcino tipo I y III con un diametro de poro promedio de 92 pm y 93 % de porosidad y que se diferencian en su grado de reticulacion (prototipos proporcionados por Geistlich Pharma, Wolhusen, Suiza) mostraron despues del cultivo bajo estimulacion mecanica durante 14 dlas una retencion de volumen satisfactoria con una buena vitalidad de celulas de fibroblastos.

DS Thoma et al. en "Soft tissue volume augmentation by the use of collagen-based matrixes: a volumetric analysis", 2010, J. of Clin. Periodontology 37, 659-666, y "Soft tissue volume augmentation by the use of collagen-based matrixes in a dog mandible - a histological analysis", 2011, J. Clin. Periodontol.: 38:1063-1070, desvelan que uno de los prototipos de esponja de colageno citados en la publicacion anterior de H. Mathes et al. mostro despues de un periodo de 28 o 84 dlas de implementacion en un defecto cronico de la cresta de una mandlbula de perro la misma retencion de volumen que el metodo de referencia, SCTG (injerto de tejido conjuntivo subendoepitelial).

B. Hafemann et al. en Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 12 (2001) 437-446, desvelan el uso de la carbodiimida 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) junto con N-hidroxisuccinimida para aumentar la resistencia contra la degradacion enzimatica de una membrana xenogena que consiste en colageno nativo procesado y elastina de origen porcino que se indico que servla de molde para la formacion de una neo-dermis.

El estado de la tecnica no desvela ni sugiere cuales de las caracterlsticas de un prototipo de esponja de colageno qulmicamente reticulada tal, o de cualquier otro dispositivo de colageno regenerativo que cumpla los criterios expuestos anteriormente para un uso en la cavidad bucal para el aumento de volumen de tejido blando, o como puede producirse un dispositivo tal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El documento EP-1561480 desvela un dispositivo de colageno resorbible para su uso como un sustituto de la duramadre para hacer crecer tejido menlngeo, que comprende una hoja de colageno qulmicamente reticulado que tiene la mayorla de poros por debajo de 10 pm y un metodo de preparacion de ese dispositivo de colageno que comprende las etapas de mezclar el colageno con agua bajo condiciones tales que la mezcla contenga colageno sustancialmente solubilizado, liofilizar la mezcla en un dispositivo de colageno y reticular qulmicamente el dispositivo de colageno, usando como agente de reticulacion formaldehldo o gluteraldehldo. Un sustituto de la duramadre no se expone, al igual que un dispositivo regenerativo para promover el aumento de volumen de tejido blando en la region oral, durante la cicatrizacion a la presion creada por las complejas fuerzas mecanicas anteriormente mencionadas.

El documento US-2004-0265785 describe un proceso de produccion de una membrana de colageno-elastina que contiene al menos 20 % (peso/peso) de elastina, que comprende las etapas de primero eliminar qulmicamente las sustancias acompanantes hidrofobas de un material de colageno que contiene elastina de origen natural, luego eliminar qulmicamente sustancias no hidrofobas. El producto de colageno-elastina no esta qulmicamente reticulado.

Boekema B.K.L.H. et al., 2014, Journal of Material Sciences: Materials in Medicine, February 2014 25: 423-433, describen el efecto sobre la cicatrizacion del tamano de poro y la reticulacion sobre armazones de colageno-elastina usados como sustitutos dermicos. Los armazones qulmicamente reticulados de EDC-NHS desvelados contienen 1015 % de elastina, tienen un tamano de poro de 80 a 120 pm y una temperatura de desnaturalizacion de 64 a 69 °C (vease la Tabla 1, pagina 425). Se esterilizan por tratamiento con gas de oxido de etileno. Los autores llegan a la conclusion de que la reticulacion afecta negativamente la cicatrizacion en varios parametros importantes, en particular reduciendo la capacidad de fibroblastos para proliferar y sustituir el sustituto dermico por tejido nuevo. Un sustituto dermico no se expone, al igual que un dispositivo regenerativo para promover el aumento de volumen de tejido blando en la region oral, durante la cicatrizacion a la presion creada por las complejas fuerzas mecanicas anteriormente mencionadas.

El problema u objetivo de la invencion es encontrar un dispositivo de colageno regenerativo para promover el aumento de volumen de tejido blando en la region oral que sea biocompatible, resorbible in vivo, permita el crecimiento hacia adentro gingival, muestre un buen nivel de integracion de tejido tal como para permitir la curacion sin incidentes (sin excesiva inflamacion o dehiscencia) y sea capaz de resistir a las fuerzas mecanicas actuando como un armazon que mantiene el volumen de tejido durante un tiempo suficiente durante el proceso de cicatrizacion despues de la implantacion, generalmente al menos aproximadamente 3 meses.

El problema anterior se resuelve por la invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La invencion se refiere a una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica para promover el aumento de volumen de tejido blando en la region oral, que comprende 60-96 % (peso/peso) de colageno y 4-40 % (peso/peso) de elastina, que muestra por porosimetrla de intrusion de mercurio poros interconectados con una mediana del diametro de poro entre 50 y 90 pm y al menos el 80 % de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm, una temperatura de aparicion de 45 a 57 °C y una densidad en estado seco de 50 a 65 mg/cm3.

La esponja de colageno qulmicamente reticulada comprende 60-96 % (peso/peso) de colageno y 4-40 % (peso/peso) de elastina. El contenido de elastina se mide aqul por la determinacion de desmosina/isodesmosina segun una modificacion de un metodo conocido que implica la hidrolisis y RP-HPLC (vease, por ejemplo, Guida E. et al. 1990 Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosines in tissues in Journal of Chromatography o Rodriguqe P 2008 Quantification of Mouse Lung Elastin During Prenatal Development in The Open Respiratory Medicine Journal). Para determinar el contenido de desmosina/isodesmosina de la elastina seca, la elastina de la esponja se somete a procedimientos de aislamiento de elastina como se describe por Starcher and Galione 1976 Purification and Comparison of Elastin from Different Animal Species in Analytical Biochemistry.

Esa esponja se deriva adecuadamente de tejidos de origen natural que contienen tales proporciones de colageno y elastina. Ejemplos de tales tejidos incluyen membrana de peritoneo o de pericardio de mamlfero (por ejemplo, porcina o bovina), membrana de placenta, submucosa de intestino delgado (SIS) y dermis. Normalmente, el colageno es predominantemente colageno tipo I, colageno tipo III o una mezcla de los mismos. El colageno tambien puede incluir una proporcion de en particular colageno tipo II, tipo IV, tipo VI o tipo VIII, o cualquier combinacion de aquellos o cualquier tipo de colageno.

El termino "colageno" usado en la presente solicitud normalmente se refiere a aquella combinacion de 60-96 % (peso/peso) de colageno y 4-40 % (peso/peso) de elastina.

Preferentemente, la esponja de colageno qulmicamente reticulada comprende 70-90 % (peso/peso) de colageno y 10-30 % (peso/peso) de elastina.

Un ejemplo de un material de partida adecuado para preparar una esponja de colageno qulmicamente reticulada tal es una suspension de fibras de colageno de la membrana preparada a partir de peritoneo porcino o bovino por un proceso similar al descrito en "Ejemplo" del documento EP-B1-1676592 o a partir de la membrana Geistlich Bio-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Gide® (obtenible de Geistlich Pharma A.G., Suiza) preparada a partir de peritoneo porcino por un proceso muy similar y/o una suspension de fibras de colageno preparada a partir de dermis porcina por un proceso similar al descrito en el Ejemplo 7 del documento WO 2012/084214.

La esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica anterior promueve el aumento de tejido blando en la region oral promoviendo el crecimiento hacia adentro de celulas gingivales mientras que se mantiene el volumen despues de la carga y descarga de estreses mecanicos.

Para promover el crecimiento hacia adentro de celulas gingivales, la esponja de colageno qulmicamente reticulada debe tener una alta porosidad (fraccion de volumen de poros) en un intervalo de diametro apropiado para que los fibroblastos gingivales crezcan. Se ha encontrado que este crecimiento hacia adentro se promueve adecuadamente cuando la esponja muestra por porosimetrla de intrusion de mercurio poros interconectados con una mediana del diametro de poro entre 50 y 90 pm y al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 %, de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm. La esponja qulmicamente reticulada con una distribucion de poros tal se prepara adecuadamente por un proceso que comprende mezclar antes de la reticulacion en proporciones apropiadas una suspension de fibras de colageno de la membrana preparada a partir de peritoneo porcino o bovino como se desvelo en el parrafo previo y una suspension de fibras de colageno preparada a partir de dermis porcina como se desvelo en el parrafo previo.

El termino "elastico" significa aqul que la esponja de colageno qulmicamente reticulada es resistente a la presion, es decir, capaz de recuperar una gran parte de su volumen original despues de ser sometida a presion in vitro o in vivo.

Para mantener el volumen en la region oral, la esponja qulmicamente reticulada resorbible elastica debe ser capaz resistir a las complejas fuerzas mecanicas inducidas por la masticacion, movimiento de la lengua, habla y movimiento de los dientes que actuan como un armazon que mantiene el volumen de tejido durante un tiempo suficiente durante el proceso de curacion despues de la implantacion, generalmente aproximadamente 3 meses. Se ha encontrado que este comportamiento elastico in vivo del implante se obtiene cuando, en una prueba mecanica in vitro de compresion clclica a una temperatura de 37 °C de la esponja de colageno humedecida por una solucion salina de tampon fosfato (PBS) disenada para imitar los llquidos corporales, la retencion de espesor con respecto al espesor inicial es al menos del 70 %, preferentemente al menos del 80 %, mas preferentemente al menos del 85 %, o la retencion de histeresis con respecto a la primera carga es inferior al 55 %, preferentemente inferior al 45 %, despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa.

Se ha encontrado que la retencion de espesor in vitro anterior de al menos el 70 % y la retencion de histeresis inferior al 55% combinadas con la curacion in vivo sin excesiva inflamacion o dehiscencia se obtiene cuando la esponja muestra una temperatura de aparicion de 45 a 57 °C y una densidad en estado seco de 50 a 65 mg/cm3.

La temperatura de aparicion se mide por DSC en la esponja de colageno humedecida con una solucion de tampon segun la norma de la Farmacopea estadounidense: Ph. Eur. 2.2.34, USP <891> (composicion de tampon para 1 litro de agua: 8 g de cloruro sodico, 0,2 g de fosfato de potasio, 1,15 g de fosfato de sodio y 0,2 g de cloruro de potasio; temperatura inicial 15 °C, temperatura final 90 °C, velocidad de calentamiento 5 °C/min). Este parametro refleja el grado de reticulacion de la esponja. La temperatura de aparicion esta estrechamente asociada a la resistencia in vitro de la esponja a compresion clclica (retencion de espesor o retencion de histeresis en la prueba mecanica de compresion clclica), resiliencia in vivo (mantenimiento del volumen de tejido durante un tiempo suficiente durante el proceso de curacion despues de la implantacion) y buena integracion en los tejidos circundantes (sin excesiva inflamacion o dehiscencia).

La resistencia in vitro requerida a la compresion clclica y la resiliencia in vivo combinadas con la curacion in vivo sin excesiva inflamacion o dehiscencia pueden obtenerse cuando la temperatura de aparicion es de 45 a 57 °C, preferentemente de 46 a 53 °C. Cuando la temperatura de aparicion esta por debajo de 46 °C, la resistencia in vitro a la compresion clclica y la resiliencia in vivo pueden ser no suficientes. Cuando la temperatura de aparicion es superior a 57 °C, hay un riesgo sustancial de acontecimientos adversos tales como excesiva inflamacion y/o dehiscencia que aparecen despues de la implantacion.

La densidad en estado seco, medida pesando y midiendo el volumen de la esponja de colageno despues de una amplia liofilizacion (como se describe en detalle mas adelante), es otro parametro esencial o crltico para alcanzar la resistencia in vitro requerida a la compresion clclica y la resiliencia in vivo combinadas con la curacion in vivo sin excesiva inflamacion o dehiscencia. Aquellas caracterlsticas pueden obtenerse cuando la densidad en estado seco es de 50 a 65, preferentemente de 50 a 60 mg/cm3. Cuando la densidad en estado seco esta por debajo de 50 mg/cm3, la resistencia in vitro a la compresion clclica y la resiliencia in vivo pueden no ser suficientes. Cuando la densidad en estado seco es superior a 65 mg/cm3, hay un riesgo de acontecimientos adversos tales como excesiva inflamacion y/o dehiscencia que aparecen despues de la implantacion.

El termino "resorbible" significa aqul que la esponja de colageno qulmicamente reticulada es capaz de ser resorbida in vivo, en particular mediante la accion de colagenasas y elastasas. Una resorbibilidad in vivo controlada de la esponja de colageno qulmicamente reticulada es esencial para curar sin excesiva inflamacion o dehiscencia. La

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

prueba de degradacion enzimatica usando colagenasa de Clostridium histolyticum descrita en detalle mas adelante da una prediccion excelente de la resorbibilidad in vivo.

En esa prueba, para todas las muestras de la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica esteril segun la invencion que mostraron in vivo una interesante retencion de volumen y curacion sin acontecimientos adversos tales como excesiva inflamacion o dehiscencia, el colageno se degrado completamente en 3 a 5 horas.

La esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica anterior se prepara adecuadamente a partir de tejidos de origen natural por un proceso que comprende liofilizacion y reticulacion qulmica. Tejidos apropiados de origen natural incluyen membranas de peritoneo o pericardio porcino o bovino, membrana de placenta porcina o bovina y SIS o dermis porcina o bovina. Preferentemente, los tejidos de origen natural incluyen membrana de peritoneo porcino o bovino y dermis porcina. El proceso anterior que comprende liofilizacion y reticulacion qulmica va generalmente seguido de una etapa de esterilizacion, que es adecuadamente esterilizacion por irradiacion y o irradiacion con rayos X.

La reticulacion qulmica puede realizarse usando cualquier agente de reticulacion farmaceuticamente aceptable capaz de dar a la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica la retencion de espesor requerida con respecto al espesor inicial o retencion de histeresis con respecto a la primera carga en la prueba de compresion clclica. Agentes de reticulacion adecuados tales incluyen gluteraldehldo, formaldehldo, acetaldehldo, 1,4-butano diglicidil eter (BDDGE), N-sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato, diisocianato de hexametileno (HMDC), cinamida, difenilfosforilazida, genipina, EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) y una mezcla de EDC y NHS (N-hidroxisuccinimida). Pequenas cantidades o trazas del agente de reticulacion sin reaccionar o productos de reaccion directa tlpicos del mismo pueden normalmente detectarse en la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica.

Preferentemente, la reticulacion qulmica se realiza usando un agente de reticulacion seleccionado de gluteraldehldo, EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) y una mezcla de EDC y NHS (N-hidroxisuccinimida). Prototipos interesantes de esponjas de colageno qulmicamente reticuladas resorbibles elasticas segun la invencion han sido de hecho preparadas usando cada uno de aquellos agentes de reticulacion.

Se han preparado mas de 1000 prototipos diferentes de esponjas de colageno usando como agente de reticulacion EDC o una mezcla de EDC y NHS y probado en diversas pruebas in vitro y/o pruebas en animales in vivo, en particular en ratones, ratas, conejos y perros. Preferentemente, la reticulacion qulmica se realiza usando uno de aquellos dos agentes de reticulacion.

La esponja de colageno resorbible elastica de la invencion ha sido probada en particular en:

- un estudio en animales que implica la medicion del aumento de volumen de mucosa por implantacion en defectos cronicos de mandlbulas de perros en comparacion con el metodo de referencia SCTG (injerto de tejido conjuntivo subepitelial), y

- un estudio cllnico para investigar su rendimiento y seguridad en los procedimientos de aumento de tejido para obtener espesor de mucosa alrededor de implantes dentales en la cavidad bucal en comparacion con el metodo de referencia para el aumento de volumen de tejido blando SCTG (injerto de tejido conjuntivo subepitelial).

En ambos de aquellos estudios, la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica de la invencion mostro despues de la implantacion de 3 meses una integracion excelente en los tejidos circundantes sin excesiva inflamacion o dehiscencia, la misma seguridad y la misma retencion de volumen de tejido blando (es decir, no estadlsticamente diferentes) que SCTG.

La esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica anterior puede prepararse por un proceso que comprende las etapas de:

(a) Someter una membrana de peritoneo o pericardio porcino o bovino a un tratamiento basico en una solucion de hidroxido sodico a un pH superior a 12, un tratamiento acido en una solucion de clorhldrico de pH de 1 a 3, un tratamiento deshidratante con un disolvente organico soluble en agua y un tratamiento desengrasante con un disolvente organico,

moler la membrana seca obtenida con un molino de corte, tamizar a traves de un tamiz de 0,5-2 mm y suspender el polvo obtenido en una solucion acuosa acidificada de pH de 2,5 a 3,5, tal como para obtener una suspension de fibras de colageno,

(b) Someter dermis bovina o porcina picada a un tratamiento deshidratante con un disolvente organico soluble en agua, un tratamiento desengrasante con un disolvente organico, un tratamiento basico en una base inorganica fuerte a un pH superior a 12, un tratamiento acido en un acido inorganico fuerte a un pH de 0 a 1, aclarar con agua y suspender las fibras de colageno, liofilizar, limpiar las fibras de colageno secadas con un disolvente organico y picar las fibras secadas limpias en una solucion acidificada de pH de 3 a 4, tal como para obtener una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

suspension de fibras de colageno,

(c) Mezclar 3,5 a 4,5 partes de la suspension de fibras de colageno obtenida en (a) con 0,5 a 1,5 partes de la suspension de fibras de colageno obtenida en (b), tal como para obtener una suspension resultante,

(d) Liofilizar la suspension resultante obtenida en (c) y reticular el producto liofilizado en una solucion que contiene un agente de reticulacion, lavar con agua y liofilizar, y

(e) Opcionalmente esterilizar el producto liofilizado obtenido en (d) por irradiacion y o irradiacion por rayos X.

La etapa (a) puede realizarse similarmente al proceso descrito en "Ejemplo" del documento EP-B1-1676592 sometiendo las membranas peritoneales de terneros jovenes o cerdos jovenes a lavado con agua, un tratamiento basico con solucion al 2 % de hidroxido sodico, lavado con agua, un tratamiento acido en una solucion al 0,5 % de clorhldrico, lavado con agua hasta que se obtiene un pH de 3,5, encogimiento del material con 7 % de solucion salina, lavado con agua, deshidratacion con acetona y desengrasado con n-hexano, molienda de la membrana seca obtenida con un molino de corte, tamizado a traves de un tamiz de 0,5-2 mm y suspension del polvo obtenido en una solucion acuosa acidificada de pH de 2,5 a 3,5, tal como para obtener una suspension de fibras de colageno de peritoneo porcino o bovino.

La etapa (a) se realiza convenientemente moliendo la membrana esteril Geistlich Bio-Gide® (obtenible de Geistlich Pharma A.G., Suiza) con un molino de corte, tamizando a traves de un tamiz de 0,5-2 mm y suspendiendo el polvo obtenido en una solucion acuosa acidificada de pH de 2,5 a 3,5, tal como para obtener una suspension de fibras de colageno de peritoneo porcino.

Preferentemente, el polvo obtenido despues de moler con un molino de corte se tamiza a traves de un tamiz de 0,51 mm.

La etapa (b) puede realizarse similarmente al proceso desvelado en el Ejemplo 7 del documento WO 2012/084214 sometiendo la piel porcina picada a un tratamiento deshidratante con un disolvente organico soluble en agua tal como un alcohol o una cetona, un tratamiento desengrasante con un disolvente organico tal como dicloroetano o cloruro de metileno, un tratamiento basico en una base inorganica fuerte a un pH superior a 12 durante un periodo de 6 a 24 horas, un tratamiento acido en un acido inorganico fuerte a un pH de 0 a 1 durante un periodo de 1 a 12 horas, aclarando con agua y suspendiendo las fibras de colageno en presencia de un regulador del hinchamiento, liofilizando, limpiando las fibras de colageno secadas con diferentes disolventes organicos tales como alcoholes, eteres, cetonas e hidrocarburos clorados y picando en un molino coloidal las fibra secadas limpias en una solucion acidificada de pH de 3 a 4, tal como para obtener una suspension de fibras de colageno de dermis porcina.

El % (peso/peso) de colageno en la suspension de fibras de colageno preparada en la etapa (a) y el % (peso/peso) de colageno en la suspension de fibras de colageno preparada en la etapa (b) desempenan una funcion en establecer la densidad en estado seco de la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica. De hecho, la ultima depende principalmente, por una parte, del % (peso/peso) de colageno de la suspension resultante de fibras de colageno obtenida en la etapa (c) mezclando 1,5 a 4,5 partes de la suspension de fibras de colageno obtenida en (a) con 0,5 a 1,5 partes de la suspension de fibras de colageno obtenida en (b) y, por otra parte, de las condiciones de la reaccion de reticulacion en la etapa (d).

Para lograr para la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica la densidad requerida en estado seco de 50 a 65 mg/cm3, la suspension de fibras de colageno preparada en la etapa (a) contiene generalmente del 2,0 al 4,5, preferentemente 2,5 al 3,75 % (peso/peso) de colageno y la suspension de fibras de colageno preparada en la etapa (b) contiene generalmente del 3,0 al 7,0, preferentemente 4,0 al 6,0 % (peso/peso) de colageno.

La etapa (c) comprende mezclar 3,5 a 4,5 partes en peso de la suspension de fibras de colageno obtenida en (a) con 0,5 a 1,5 partes en peso de la suspension de fibras de colageno obtenida en (b), tal como para obtener una suspension resultante.

Esta etapa de mezcla de proporciones apropiadas de dos suspensiones diferentes de fibras de colageno procedentes de diferentes tejidos porcinos o bovinos y que han sido sometidas a diferentes tratamientos que incluyen diferentes procedimientos de picado (usando un molino de corte para la etapa (a) y un molino coloidal para la etapa (b)) dando partlculas de fibra de colageno de diferentes tamanos, es un metodo conveniente para obtener la distribucion de porosidad deseada o el espectro de la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica, concretamente poros interconectados con una mediana del diametro de poro entre 50 y 90 pm y al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 %, de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm como se ha determinado por porosimetrla de intrusion de mercurio.

La suspension resultante generalmente contiene 3,0 al 6,5 % (peso/peso), preferentemente 3,5 al 6,0 % (peso/peso) de colageno.

La etapa (d) comprende liofilizar la suspension resultante obtenida en (c), reticular el producto liofilizado en una solucion que contiene un agente de reticulacion, lavar con agua y liofilizar.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La liofilizacion antes y despues de la etapa de reticulacion se realiza generalmente a una temperatura inferior a - 10 °C.

El agente de reticulacion se selecciona adecuadamente del grupo que consiste en gluteraldehldo, EDC (1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida) y una mezcla de EDC y NHS (N-hidroxisuccinimida). Tambien pueden usarse otros agentes de reticulacion conocidos para la reticulacion de colageno tales como formaldehldo, acetaldehldo, 1,4- butano diglicidil eter (BDDGE), N-sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato, diisocianato de hexametileno (HMDC), cinamida, difenilfosforilazida o genipina.

Cuando el agente de reticulacion es gluteraldehldo, la esponja obtenida despues de la liofilizacion se reticula adecuadamente qulmicamente en una solucion de tampon fosfato de pH 7,0 a 7,5 que contiene 0,01 al 0,10 %, preferentemente 0,04 al 0,06 % de gluteraldehldo. La esponja qulmicamente reticulada puede lavarse sucesivamente con agua, solucion 1-3 M de NaCl, solucion 0,05-0,15 M de Na2HPO4 y agua, antes de liofilizarse.

Cuando el agente de reticulacion es EDC, la esponja obtenida despues de la liofilizacion se somete primero adecuadamente a un tratamiento deshidrotermico a una temperatura superior a 110 °C, luego se reticula qulmicamente en una solucion de tampon que contiene MES 0,05-0,15 M (acido 2-(N-morfolino)-etanosulfonico) o acido acetico 0,05-0,15 M y 2-20 % (peso/peso) de un alcohol seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, n-propanol, isopropanol y butanol, con 0,03-0,80, preferentemente 0,2-0,4 g de EDC por g de colageno, durante un periodo de 1 a 8 horas. La relacion (peso/peso) de colageno con respecto al medio de reaccion (la solucion de tampon anterior) es generalmente de 1/10 a 1/100, preferentemente de 1/20 a 1/50. Cuando el alcohol es etanol, esta adecuadamente presente al 3-7 % (peso/peso) en la solucion de tampon. La esponja de colageno qulmicamente reticulada puede lavarse primero con solucion 0,05-0,15 M de Na2HPO4, una solucion 0,5-3 M de NaCl, luego con agua antes de ser liofilizada.

Cuando el agente de reticulacion es una mezcla de EDC y NHS, la esponja obtenida despues de la liofilizacion se reticula adecuadamente qulmicamente en una solucion de tampon que contiene MES 0,1-0,3 M (acido 2-(N- morfolino)-etanosulfonico) o acido acetico 0,1-0,3 M y 10-70 % (peso/peso) de alcohol seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, n-propanol, isopropanol y butanol, con 0,01-0,60, preferentemente 0,05-0,2 g de EDC y 0,01-0,6, preferentemente 0,05-0,2 g de NHS, por g de colageno, durante un periodo de 1 a 8 horas. La relacion molar de EDC con respecto a NHS es generalmente de 4 a 0,5, preferentemente de 2 a 1. La relacion (peso/peso) de colageno con respecto al medio de reaccion (la solucion de tampon anterior) es generalmente de 1/10 a 1/100, preferentemente de 1/20 a 1/50. Cuando el alcohol es etanol, esta adecuadamente presente al 40-60 % (peso/peso) en la solucion de tampon. La esponja de colageno qulmicamente reticulada puede lavarse primero con solucion 0,05-0,15 M de Na2HPO4, luego con agua antes de ser liofilizada.

Para cada mezcla de suspensiones de fibras de colageno obtenidas en (c) el experto estara en una posicion basada en la ensenanza de la presente solicitud, usando solo conocimiento general comun de la materia y experimentacion rutinaria, para encontrar el agente de reticulacion y condiciones de reticulacion tales como para obtener una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica segun la invencion que tenga la temperatura de aparicion especificada y densidad en estado seco.

Asl, lo siguiente ha sido, por ejemplo, encontrado por experimentacion rutinaria para las suspensiones de colageno que contienen 3,0 al 6,5 % (peso/peso) de colageno:

- Cuando el agente de reticulacion es EDC:

- la temperatura de aparicion aumenta, para un aumento de la concentracion de EDC en la solucion de tampon, la relacion de EDC con respecto a colageno, la relacion (peso/peso) del medio de reaccion con respecto al colageno o el % de alcohol en la solucion de tampon.

- la densidad en estado seco disminuye (mas encogimiento de colageno) para un aumento del % de alcohol en la solucion de tampon.

- Cuando el agente de reticulacion es una mezcla EDC y NHS:

- la temperatura de aparicion aumenta, para un aumento en la concentracion de agente de reticulacion en la solucion de tampon, la relacion (peso/peso) de agente de reticulacion (EDC + NHS) con respecto a colageno, la relacion de EDC con respecto NHS, la relacion (peso/peso) de medio de reaccion con respecto a colageno o el % de alcohol en la solucion de tampon.

La esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica liofilizada obtenida al final de la etapa (d) generalmente se sometera a la etapa (e) de esterilizacion por irradiacion y o irradiacion de rayos X. Esa etapa puede no ser necesaria si la mezcla de suspensiones de colageno obtenidas en la etapa (c) ya es aseptica y la etapa (d) se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

realiza bajo condiciones asepticas.

La prueba de compresion clclica in vitro y la prueba de degradation enzimatica usando colagenasa de Clostridium histolyticum, que se describen en detalle mas adelante, son muy utiles en predecir el comportamiento in vivo de la esponja qulmicamente reticulada despues de la implantation en la cavidad bucal, en particular su capacidad de mantener el volumen y la curacion sin acontecimientos adversos tales como excesiva inflamacion o dehiscencia.

La invention tambien se refiere al proceso anterior para preparar la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica.

La invencion tambien se refiere a la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica anterior para su uso como un implante para la cavidad bucal, el uso de esa esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica para preparar un implante para la cavidad bucal y un metodo de aumento de volumen de tejido blando en la region oral, en particular fomentando el crecimiento hacia adentro de celulas gingivales mientras que se mantiene el volumen bajo estreses mecanicos, que comprende implantar en la cavidad bucal la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica anterior.

Los siguientes metodos experimentales, pruebas y ejemplos ilustran la invencion sin limitar su alcance.

Prueba para la determination de la densidad de la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica en estado seco

Se introdujeron muestras de esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica en tubos de plastico tarados que se secan en un liofilizador durante al menos 2 horas a una temperatura de 20 °C y una presion por debajo de 0,5 mbar. Se pesaron los tubos con muestras secadas y se calcularon los pesos netos de las muestras en estado seco. Se midieron la longitud, anchura y altura de las muestras de esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica usando un pie de rey electrico, aplicando presion de contacto suficiente de forma que las muestras se fijaran sin apretar (es decir, fijadas para resistir la fuerza producida por su peso, pero aptas para moverse cuando la fuerza se aumenta aproximadamente 10 veces). Se calcularon los volumenes de las muestras en estado seco.

Entonces se calculo la densidad de la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica en estado seco (peso con respecto al volumen) para cada muestra.

Prueba de compresion clclica

Se midieron el % de espesor inicial y la histeresis con respecto a la primera carga despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa usando una maquina de compresion mecanica, concretamente la maquina de compresion de material Z2.5 fabricada por Zwick Roell, usando el programa Test Expert II.

Las mediciones se realizaron sumergidas en PBS a 37 °C sobre muestras de esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica esteril que se hablan incubado durante 2 horas a 37 °C en una solution de PBS de pH 7,4 (preparada disolviendo 80,0 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 17,7 g de Na2HPO4 y 2,4 g de KH2PO4 en 1000 ml de agua, diluyendo diez veces la solucion en agua y ajustando el pH con HCl a 7,4).

Las muestras se sometieron a un total de 49 ciclos de carga entre 0,5 y 12,1 kPa a una tasa de deformation del 33 % de la altura inicial por min, empezando el analisis a una pre-presion de 0,25 kPa.

Se uso la altura inicial a 0,5 kPa de presion para calcular la retention de altura inicial despues de 49 ciclos de carga y descarga. La "histeresis respecto a la primera carga" es el porcentaje de trabajo que se disipo durante la descarga usando el trabajo (W1, carga en Nm) entre 0,5 y 12,1 kPa de la primera carga y el trabajo del 49° ciclo de descarga (W49, descarga en Nm) segun la ecuacion XY:

Ec XY Histeresis con respecto a la primera c arg a" [%] =

100* (Wu

■W )

49, desc arg a*

W

1, c arg a

El programa Test Expert o Excel calcula el % de retencion de espesor inicial y el % de retencion de histeresis inicial despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa.

La Figura 1 muestra el resultado tlpico de una prueba de compresion clclica.

Para muestras de la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica segun la invencion que in vivo mostraron una interesante retencion de volumen y curacion sin excesiva inflamacion o dehiscencia:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

- la altura o retencion de espesor con respecto a la altura inicial fue al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente al menos el 85 %, despues de 49 ciclos de compresion a 12,1 kPa, y

- la retencion de histeresis con respecto a la primera carga despues de 49 ciclos de compresion a 12,1 kPa fue inferior al 55 %, preferentemente inferior al 45 %.

Prueba de degradation enzimatica usando colagenasa de Clostridium histolyticum

En el cuerpo humano, los colagenos son degradados por metaloproteinasa de matriz de tejido humano (MMP), catepsinas y putativamente por algunas serina proteinasas. Las mejor estudiadas son las MMP, donde las colagenasas (en particular MmP-1, MMP-8, MMP-13 y MMP-18) son las enzimas mas importantes para la degradacion directa de colageno (Lauer-Fields et al. 2002 Matrix metalloproteinases and collagen catabolism in Biopolymers - Peptide Science Section and Song et al. 2006 Matrix metalloproteinase dependent and independent collagen degradation in Frontiers in Bioscience).

La capacidad de la colagenasa para degradar tejidos y membranas de colageno depende de la flexibilidad del sustrato y el tipo de colageno, sitios activos de MMP y exositios de MMP. Las colagenasas se alinean en el colageno de helice triple, lo desenrollan y posteriormente lo escinden (Song et al. 2006, vease anteriormente).

Con vistas a vencer las diferencias en la degradacion entre los diferentes tipos de colageno, la degradacion por colagenasa de colageno se evalua frecuentemente usando colagenasa de Clostridium histolyticum que tiene una alta velocidad catalltica (Kadler et al. 2007 Collagen at a glance en J Cell Sci). Generalmente, un producto de colageno natural se degrada mas rapido que un producto de colageno qulmicamente reticulado.

En esta prueba, los productos de colageno (muestras de esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica segun la invention se incubaron a 37 °C con 50 unidades/ml de Clostridium histolyticum (definiendose una unidad como peptidos que se liberan de colageno del tendon de Aquiles bovino equivalentes en color de ninhidrina a 1,0 micromol de leucina en 5 horas a pH 7,4 a 37 °C en presencia de iones calcio) en un tampon Tris que contiene calcio y la degradacion de matriz de colageno se midio visualmente y con el "ensayo DC Protein" de Bio-Rad Laboratories (Hercules, EE.UU., N.° de pedido 500-0116) usando colageno de tipo I como material de referencia. La concentration de colageno se determino usando un espectrometro de placas de micropocillos (Infinite M200, disponible de Tecan).

Para muestras de la esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica segun la invencion que in vivo mostraron curacion sin excesiva inflamacion o dehiscencia, el colageno se degrado completamente (sin fibra de colageno detectable por inspection visual) en el plazo de 3 a 5 horas.

Ejemplo 1 Preparation de una suspension de fibras de colageno derivada de peritoneo porcino

Las membranas peritoneales de cerdos jovenes se liberaron completamente de carne y grasa por medios mecanicos, se lavaron bajo agua corriente y se trataron con solution al 2 % de NaOH durante 12 horas. Las membranas se lavaron entonces bajo agua corriente y se acidificaron con 0,5 % de HCl. Despues de haberse acidificado el material a traves de su espesor entero (aproximadamente 15 min), el material se lavo hasta que se obtuvo un pH de 3,5. El material se encogio entonces con 7 % de solucion salina, se neutralizo con solucion al 1 % de NaHCO3 y se lavo bajo agua corriente. Entonces, el material se deshidrato con acetona y se desengraso con n- hexano.

El material se seco usando etanol-eter y se molio con un molino de corte (por ejemplo, Pulverisette 25 de Fritsch: vease www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette-25 o SM300 de Retsch:
www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/schneidmuehlen.htlm) que incluye un tamiz trapezoidal de 0,5 a 1,0 mm.

Se prepararon una suspension al 4 % (peso/peso) de fibras de colageno y una suspension al 6 % (peso/peso) de fibras de colageno suspendiendo cantidades adecuadas del polvo secado en agua y ajustando el pH a 2,6 con acido clorhldrico 10 mM.

Ejemplo 2 Preparacion de una suspension de fibras de colageno derivada de una membrana Geistlich Bio-Gide® esteril

Se seco una membrana Geistlich Bio-Gide® (disponible de Geistlich Pharma AG, CH-6110, Suiza) y se molio con un molino de corte que inclula un tamiz trapezoidal de 0,5 a 1,0 mm. Se prepararon una suspension al 4 % (peso/peso) de colageno de fibras de colageno y una suspension al 6 % (peso/peso) de colageno de fibras de colageno suspendiendo cantidades adecuadas del polvo secado en agua y ajustando el pH a 2,6 con acido clorhldrico 10 mM.

Ejemplo 3 Preparacion de una suspension de fibras de colageno derivada de dermis de cerdo.

Se picaron pellejos porcinos en una picadora de carne a trozos de 1 a 20 mm. El agua se elimino usando un disolvente soluble en agua tal como un alcohol o una cetona. Las fibras de colageno se desengrasaron usando un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

hidrocarburo clorado tal como dicloroetano o cloruro de metileno o un hidrocarburo no clorado tal como hexano o tolueno. Despues de eliminar el disolvente, el colageno se trato con una base inorganica fuerte a un pH superior a 12 durante un periodo de 6 a 24 horas y se trato con un acido inorganico fuerte a un pH de 0 a 1 durante un periodo de 1 a 12 horas. El exceso de acido se elimino aclarando con agua y la suspension se homogeneizo por molienda con coloides dando una suspension homogenea del 0,5 al 2 % de fibras de colageno en presencia de un regulador del hinchamiento tal como una sal inorganica. La suspension se seco por liofilizacion y las fibras de colageno secas se limpiaron sucesivamente con diferentes disolventes organicos tales como alcoholes, eteres, cetonas e hidrocarburos clorados, siendo entonces los disolventes evaporados a vaclo dando un residuo de disolvente inferior al 1 % (peso/peso).

Se prepararon una suspension al 2,5 % (peso/peso) de colageno de fibras de colageno y una suspension al 3,75 % (peso/peso) de colageno de fibras de colageno picando finamente por molienda con coloides cantidades adecuadas de las fibras limpias y secas obtenidas anteriormente con agua a un pH de 3,4.

Ejemplo 4 Preparacion de una esponja de colageno resorbible elastica qulmicamente reticulada con EDC.

Se mezclaron 4 partes de la suspension al 4 % (peso/peso) de colageno de fibras de colageno obtenida en el Ejemplo 1 o Ejemplo 2 con 1 parte de la suspension al 2,5 % (peso/peso) de colageno de fibras de colageno obtenida en el Ejemplo 3 y se vertio en moldes de 8 X 25 X 25 mm. La suspension al 3,7 % de fibras de colageno resultante se seco por liofilizacion a -45 °C.

Las esponjas de colageno secadas se trataron entonces deshidrotermicamente a 120 °C durante 24 horas a presion reducida (inferior a 200 mbar).

Las esponjas de colageno se reticularon entonces qulmicamente en una solucion de tampon que contenla MES 0,1 M (acido 2-(N-morfolino)-etanosulfonico) y 5 % de etanol a un pH de 5,5 con 0,3 g de EDC (1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida) por g de colageno, bajo agitacion a temperatura ambiente durante un periodo de 120 min.

Las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas se lavaron primero con solucion 0,10 M de Na2HPO4, solucion 1 M de NaCl, solucion 2 M de NaCl, luego con agua y se liofilizaron a -45 °C.

Las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas secadas se esterilizaron por gamma a 30 kGy. La temperatura de aparicion y la densidad en estado seco medidas de las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas fueron 47 °C y 64 mg/cm3, respectivamente.

Despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa en PBS a 37 °C, las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas mostraron una retencion del 87 % de su espesor inicial y 41 % de la histeresis inicial.

La porosimetrla de intrusion de mercurio mostro para las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas una mediana del diametro de poro de 88 pm y 95 % de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm.

La prueba de degradacion enzimatica usando colagenasa de Clostridium histolyticum mostro una degradacion completa de colageno en el plazo de 3,25 horas.

Ejemplo 5 Preparacion de una esponja de colageno resorbible elastica qulmicamente reticulada con una mezcla de EDC y NHS.

Se mezclaron cuatro partes de la suspension al 6 % (peso/peso) de fibras de colageno obtenida en el Ejemplo 1 o Ejemplo 2 con una parte de la suspension al 3,75 % (peso/peso) de fibras de colageno obtenida en el Ejemplo 3 y se vertio en moldes de una altura de 6 mm. La suspension al 5,55 % (peso/peso) de colageno de fibras de colageno resultante se seco por liofilizacion a -10 °C. Estas esponjas se reticularon qulmicamente en una solucion que contenla MES 0,2 M (acido 2-(N-morfolino)-etanosulfonico) y 50 % peso/peso de etanol a un pH de 5,5 con 0,1 g de EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) por gramo de colageno y 0,1 g de NHS (N-hidroxisuccinimida) por gramo de colageno, bajo agitacion a temperatura ambiente durante un periodo de 120 min. Las esponjas qulmicamente reticuladas se lavaron primero con solucion 0,1 M de Na2HPO4, solucion 1 M de NaCl, solucion 2 M de NaCl, luego con agua y se liofilizaron a -10°C.

Las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas secadas se esterilizaron por irradiacion y a 26 kGy.

La temperatura de aparicion y la densidad en estado seco medidas de las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas fueron 52 °C y 59 mg/cm3, respectivamente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa en PBS a 37 °C, las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas mostraron una retencion del 90 % de su espesor inicial y 38 % de la histeresis con respecto a la primera carga.

La porosimetrla de intrusion de mercurio mostro para las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas una mediana del diametro de poro de 69,1 pm y 93,1 % de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm.

La prueba de degradacion enzimatica usando colagenasa de Clostridium histolyticum mostro una degradacion de colageno completa en el plazo de 3,5 horas.

Ejemplo 6 Preparacion de una esponja de colageno resorbible elastica qulmicamente reticulada con una mezcla de EDC y NHS (sin una etapa de esterilizacion)

Se mezclaron cuatro partes de la suspension al 6 % (peso/peso) de fibras de colageno obtenida en el Ejemplo 2 con una parte de la suspension al 3,75 % (peso/peso) de fibras de colageno obtenida en el Ejemplo 3 y se vertio en moldes de una altura de 6 mm. La suspension al 5,55 % (peso/peso) de colageno resultante de fibras de colageno se seco por liofilizacion a -10°C.

Estas esponjas se reticularon qulmicamente en una solucion que contenla MES 0,2 M (acido 2-(N-morfolino)- etanosulfonico) y 50 % en peso/peso de etanol a un pH de 5,5 con 0,01 g de EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida) por gramo de colageno y 0,01 g de NHS (N-hidroxisuccinimida) por gramo de colageno, bajo agitacion a temperatura ambiente durante un periodo de 120 min. Las esponjas qulmicamente reticuladas se lavaron primero con solucion 0,1 M de Na2HPO4, solucion 1 M de NaCl, solucion 2 M de NaCl, luego con agua y se liofilizaron a - 10 °C.

La temperatura de aparicion y la densidad en estado seco medidas de las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas fueron 57 °C y 57 mg/cm3, respectivamente.

Despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa en PBS a 37 °C, las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas mostraron una retencion del 80 % de su espesor inicial.

La porosimetrla de intrusion de mercurio mostro para las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas una mediana del diametro de poro de 71,0 pm y 94,0 % de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm.

Ejemplo 7 Preparacion de una esponja de colageno resorbible elastica qulmicamente reticulada con glutaraldehldo.

Se mezclaron cuatro partes de la suspension de fibras de colageno obtenida en el Ejemplo 1 con una parte de la suspension de fibras de colageno obtenida en el Ejemplo 3 y se vertio en moldes de una altura de 6 mm. La suspension de colageno se seco por liofilizacion a menos 45 °C. Estas esponjas se reticularon qulmicamente en un tampon fosfato de sodio (pH 7,0 - 7,5) que contenla 0,05 % (peso/peso) de glutaraldehldo a 10 °C durante 60 min. Las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas se lavaron sucesivamente con agua, solucion 2 M de NaCl y solucion 0,1 M de Na2HPO4. Despues del aclarado final con agua, las esponjas se liofilizaron a -45 °C.

Las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas se esterilizaron por irradiacion y a 25 kGy.

La temperatura de aparicion y la densidad en estado seco medidas de las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas fueron respectivamente 51 °C y 52 mg/cm3.

Despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa a 37 °C, las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas en pBs mostraron una retencion del 74 % de su espesor inicial y 48 % de histeresis con respecto a la primera carga.

La porosimetrla de intrusion de mercurio mostro para las esponjas de colageno qulmicamente reticuladas esterilizadas una mediana del diametro de poro de 63,7 pm y 92,7 % de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm.

La prueba de degradacion enzimatica usando colagenasa de Clostridium histolyticum mostro una degradacion de colageno completa en el plazo de 4,5 horas.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica para promover el aumento de volumen de tejido blando en la region oral, que comprende 60-96 % (peso/peso) de colageno y 4-40 % (peso/peso) de elastina, que muestra por porosimetrla de intrusion de mercurio poros interconectados con una mediana del diametro de poro entre 50 y 90 pm y al menos el 80 % de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm, una temperatura de aparicion de 45 a 57 °C y una densidad en estado seco de 50 a 65 mg/cm3.
2. Una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica segun la reivindicacion 1, que muestra una temperatura de aparicion de 46 a 53 °C.
3. Una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica segun la reivindicacion 1 o 2, que muestra una densidad en estado seco de 50 a 60 mg/cm3.
4. Una esponja qulmicamente reticulada resorbible elastica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende 70-90 % (peso/peso) de colageno y 10-30 % (peso/peso) de elastina.
5. Una esponja qulmicamente reticulada resorbible elastica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que muestra al menos 90 % de porosidad con un diametro de poro superior a 10 pm.
6. Una esponja qulmicamente reticulada resorbible elastica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se obtuvo usando un agente de reticulacion seleccionado del grupo que consiste en gluteraldehldo, EDC (1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida) y una mezcla de EDC y NHS (N-hidroxisuccinimida).
7. Una esponja qulmicamente reticulada de colageno resorbible elastica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se derivo de tejidos de origen natural por un proceso que comprende liofilizacion y reticulacion qulmica, opcionalmente seguido de esterilizacion por y o esterilizacion por rayos X.
8. Una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica de la reivindicacion 6 o 7, en la que los tejidos de origen natural incluyen membranas de peritoneo o pericardio porcino o bovino, membrana de placenta porcina o bovina, o SIS o dermis porcina o bovina.
9. Una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que humedecida por una solucion de PBS retiene al menos el 70 % de espesor inicial despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa.
10. Una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que humedecida por una solucion de PBS retiene menos del 55 % de histeresis con respecto a la primera carga despues de 49 ciclos de compresion a una presion de 12,1 kPa.
11. Una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que muestra despues de la implantacion en la region oral, la misma retencion de volumen que SCTG (injerto de tejido conjuntivo subepitelial).
12. Un proceso de preparacion de una esponja de colageno qulmicamente reticulada resorbible elastica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende las siguientes etapas:

(a) Someter una membrana de peritoneo o pericardio porcino o bovino a un tratamiento basico en una solucion de hidroxido sodico a un pH superior a 12, un tratamiento acido en una solucion de clorhldrico de pH de 1 a 3, un tratamiento deshidratante con un disolvente organico soluble en agua y un tratamiento desengrasante con un disolvente organico, moler la membrana seca obtenida con un molino de corte, tamizar a traves de un tamiz de 0,5-2 mm y suspender el polvo obtenido en una solucion acuosa acidificada de pH de 2,5 a 3,5, tal como para obtener una suspension de fibras de colageno,

(b) Someter dermis bovina o porcina picada a un tratamiento deshidratante con un disolvente organico soluble en agua, un tratamiento desengrasante con un disolvente organico, un tratamiento basico en una base inorganica fuerte a un pH superior a 12, un tratamiento acido en un acido inorganico fuerte a un pH de 0 a 1, aclarar con agua y suspender las fibras de colageno, liofilizar, limpiar las fibras de colageno secadas con un disolvente organico y picar las fibras secadas limpias en una solucion acidificada de pH de 3 a 4, tal como para obtener una suspension de fibras de colageno,

(c) Mezclar 3,5 a 4,5 partes de la suspension de fibras de colageno obtenida en (a) con 0,5 a 1,5 partes de la suspension de fibras de colageno obtenida en (b), tal como para obtener una suspension resultante,

(d) Liofilizar la suspension resultante obtenida en (c) y reticular el producto liofilizado en una solucion que contiene un agente de reticulacion, lavar con agua y liofilizar, y

(e) Opcionalmente esterilizar el producto liofilizado obtenido en (e) por irradiacion y o irradiacion de rayos X.
13. Un proceso segun la reivindicacion 12, en el que el agente de reticulacion esta seleccionado del grupo que consiste en gluteraldehido, EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) y una mezcla de EDC y NHS (N- hidroxisuccinimida).

5 14. Un proceso segun la reivindicacion 12 o 13, en el que la suspension de fibras de colageno preparada en la etapa

(a) contiene 2,5 al 3,75 % (peso/peso) de colageno y la suspension de fibras de colageno preparada en la etapa (b) contiene del 4,0 al 6,0 % (peso/peso) de colageno.
15. Una esponja de colageno quimicamente reticulada resorbible elastica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 10 a 11 para su uso como un implante en la cavidad bucal.