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ES2607789T3 - Una proteína de fusión polipeptídica monocatenaria para uso en el tratamiento del dolor - Google Patents

Una proteína de fusión polipeptídica monocatenaria para uso en el tratamiento del dolor Download PDF

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ES2607789T3
ES2607789T3 ES07733065.2T ES07733065T ES2607789T3 ES 2607789 T3 ES2607789 T3 ES 2607789T3 ES 07733065 T ES07733065 T ES 07733065T ES 2607789 T3 ES2607789 T3 ES 2607789T3
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nociceptin
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English (en)
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Keith Foster
John Chaddock
Philip Marks
Patrick Stancombe
K. Roger Aoki
Joseph Francis
Lance Steward
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Ipsen Bioinnovation Ltd
Allergan Inc
Original Assignee
Ipsen Bioinnovation Ltd
Allergan Inc
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Abstract

Una proteína de fusión polipeptídica para su uso en la prevención o supresión de un estado doloroso específico en un individuo, en donde dicho estado doloroso se selecciona del grupo que consiste en: dolor neuropático, dolor inflamatorio, cefalalgia, dolor somático, dolor visceral y dolor referido, y en donde dicha proteína de fusión polipeptídica comprende: a. una proteasa no citotóxica, o un fragmento de la misma, proteasa o fragmento de proteasa que es capaz de dividir una proteína del aparato de fusión exocitósico de un aferente sensorial nociceptivo; en donde la proteasa no citotóxica comprende una cadena L de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA; b. un resto de guiado que es capaz de unirse a un sitio de unión en el aferente sensorial nociceptivo, sitio de unión que es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse en un endosoma en el aferente sensorial nociceptivo en donde el resto de guiado se selecciona del grupo que consiste en: un opioide, nociceptina; β-endorfina, endomorfina- 1, endomorfina-2, dinorfina, metencefalina, leu-encefalina, galanina y péptido PAR-2; c. un sitio de escisión de la proteasa en el que la proteína de fusión puede ser escindida por una proteasa, en donde el sitio de escisión de la proteasa está situado entre la proteasa no citotóxica o fragmento de la misma y el resto de guiado; y d. un dominio de translocación peptídico que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de proteasa desde el interior de un endosoma, a través de la membrana endosómica y al citosol del aferente sensorial nociceptivo; en donde el resto de guiado está situado entre el sitio de escisión de la proteasa y el dominio de translocación, y en donde el resto de guiado y el sitio de escisión de la proteasa están separados por cero residuos de aminoácidos.

Description

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DESCRIPCION
Una protema de fusion polipeptidica monocatenaria para uso en el tratamiento del dolor
La presente invencion se refiere al uso de protemas de fusion no citotoxicas para el tratamiento de tipos espedficos de dolor.
Las toxinas pueden dividirse en general en dos grupos segun el tipo de efecto que tienen en una celula diana. En mas detalle, el primer grupo de toxinas destruye sus celulas diana naturales, y por lo tanto se conocen como moleculas de toxinas citotoxicas. Este grupo de toxinas se ilustra entre otros por toxinas vegetales como ricina y abrina, y por toxinas bacterianas como toxina difterica y exotoxina A de Pseudomonas. Las toxinas citotoxicas han atrafdo gran interes en el diseno de "balas magicas" (p. ej., inmunoconjugados, que comprenden un componente de toxina citotoxica y un anticuerpo que se une a un marcador espedfico en una celula diana) para el tratamiento de trastornos y estados celulares como el cancer. Las toxinas citotoxicas normalmente destruyen sus celulas diana inhibiendo el proceso celular de la smtesis de protemas.
El segundo grupo de toxinas, que son conocidas como toxinas no citotoxicas, no destruyen (como confirma su nombre) sus celulas diana naturales. Las toxinas no citotoxicas han atrafdo mucho menos interes comercial que el que tienen sus contrapartes citotoxicas, y ejercen sus efectos en una celula diana inhibiendo procesos celulares distintos que la smtesis de protemas. Las toxinas no citotoxicas son producidas por diversas plantas, y por diversos microorganismos como Clostridium sp. y Neisseria sp.
Las neurotoxinas clostridiales son protemas que normalmente tienen una masa molecular del orden de 150 kDa. Son producidas por varias especies de bacterias, especialmente del genero Clostridium, de la forma mas importante C. tetani y varias cepas de C. botulinum, C. butyricum y C. argentinense. En la actualidad existen ocho clases diferentes de la neurotoxina clostridial, que son: toxina tetanica y neurotoxina botulfnica en sus serotipos A, B, C1, D, E, F y G, y todas comparten estructuras y modos de accion similares.
Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo importante de moleculas de toxinas no citotoxicas, y son sintetizadas por la bacteria hospedadora como polipeptidos individuales que son modificados post-traslacionalmente por un episodio de escision proteolftica para formar dos cadenas de polipeptidos unidas conjuntamente por un enlace de disulfuro. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa.
Las cadenas L poseen una funcion de proteasa (actividad de endopeptidasa dependiente de cinc) y muestran una alta especificidad de sustrato para protemas asociadas a vesmulas y/o membrana plasmatica implicadas en el proceso exocitosico. Las cadenas L de diferentes especies o serotipos clostridiales pueden hidrolizar enlaces peptfdicos diferentes pero espedficos en una de tres protemas de sustrato, que son sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25. Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.
Neisseria sp., muy especialmente de la especie N. gonorrhoeae, produce proteasas no citotoxicas similares funcionalmente. Un ejemplo de dicha proteasa es la proteasa de IgA(vease el documento WO-99/58.571).
En la tecnica se ha documentado bien que las moleculas de toxinas pueden ser redireccionadas a una celula que no es la celula diana natural de la toxina. Cuando se redirecciona de esta forma, la toxina modificada es capaz de unirse a una celula diana deseada y, despues de la translocacion subsiguiente en el citosol, es capaz de ejercer su efecto en la celula diana. Dicho redireccionamiento se consigue sustituyendo el resto de guiado (RG) natural de la toxina por un RG diferente. A este respecto, el RG se selecciona de manera que se unira a una celula diana deseada, y permitira el paso posterior de la toxina modificada a un endosoma dentro de la celula diana. La toxina modificada comprende tambien un dominio de translocacion para permitir la entrada de la proteasa no citotoxica en el citosol de la celula. El dominio de translocacion puede ser el dominio de translocacion natural de la toxina o puede ser un dominio de translocacion diferente obtenido de una protema microbiana con actividad de translocacion.
La sustitucion de RG mencionada anteriormente puede efectuarse mediante tecnicas convencionales de conjugacion qmmica, que son bien conocidas para un experto en la tecnica. A este respecto, se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press.
Sin embargo, a menudo la conjugacion qmmica es imprecisa. Por ejemplo, despues de la conjugacion, un RG puede unirse al resto del conjugado en mas de un punto de fijacion.
La conjugacion qmmica es tambien diffcil de controlar. Por ejemplo, un RG puede unirse al resto de la toxina modificada en un punto de fijacion en el componente de proteasa y/o en el componente de translocacion. Este hecho es problematico cuando se desea la fijacion a solo uno de dichos componentes (preferiblemente en un unico punto) para la eficacia terapeutica.
Asf, la conjugacion qmmica da como resultado una poblacion mixta de moleculas de toxinas modificadas, lo cual no es deseable.
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Como alternativa a la conjugacion qmmica, puede realizarse sustitucion de RG por preparacion recombinante de una unica protema de fusion polipeptidica (vease el documento WO-98/07.864). Esta tecnica se basa en el mecanismo bacteriano in vivo por el que se prepara la neurotoxina clostridial nativa (p. ej., holotoxina), y da como resultado una protema de fusion que tiene la siguiente disposicion estructural:
NH2 - [componente de proteasa] - [componente de translocacion] - [RG] - COOH
Segun WO-98/07.864, el RG se coloca hacia el extremo C de la protema de fusion. A continuacion se activa la protema de fusion por tratamiento con una proteasa, que se escinde en un punto entre el componente de proteasa y el componente de translocacion. Se produce asf una protema bicatenaria, que comprende el componente de proteasa como una cadena de polipeptido unico unida de forma covalente (por medio de un puente de disulfuro) a otra cadena de polipeptido unico que contiene el componente de translocacion mas RG. Mientras la metodologfa del documento WO-98/07.864 sigue (en terminos de disposicion estructural de la protema de fusion) el sistema de expresion natural de la holotoxina clostridial, los autores de la presente invencion han encontrado que este sistema puede dar como resultado la produccion de ciertas protemas de fusion que tienen una capacidad de union sustancialmente reducida para la celula diana en cuestion.
Este problema es relevante en particular en el contexto del tratamiento de tipos espedficos de dolor.
La presente descripcion aborda uno o mas de los problemas mencionados anteriormente proporcionando el uso de una molecula terapeutica para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de tipos particulares de dolor, en donde la molecula terapeutica es una protema de fusion polipeptfdica monocatenaria, que comprende:
a. una proteasa no citotoxica, o un fragmento de la misma, proteasa o fragmento de proteasa que es capaz de dividir una protema del aparato de fusion exocitosico en un aferente sensorial nociceptivo;
b. un resto de guiado que es capaz de unirse a un sitio de union en el aferente sensorial nociceptivo, sitio de union que es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse en un endosoma en el aferente sensorial nociceptivo;
c. un sitio de escision de la proteasa en el que la protema de fusion puede ser dividida por una proteasa, en donde el sitio de escision de la proteasa esta situado entre la proteasa no citotoxica o fragmento de la misma y el resto de guiado; y
d. un dominio de translocacion que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de proteasa desde el interior de un endosoma, a traves de la membrana endosomica y al citosol del aferente sensorial nociceptivo.
La presente invencion esta definida por las reivindicaciones.
Duggan et al. 2002, Journal of Biological Chemistry, 277(38):34846-34852 describen la inhibicion de la liberacion de neurotransmisores de ganglios de la rafz dorsal de ratas por un conjugado de un fragmento de endopeptidasa de toxina A de Clostridium botulinum y lectina de Erythrina cristagalli.
Los autores de la presente invencion han encontrado que el sistema de protemas de fusion del documento WO- 98/07.864 no es optimo para RG que requieren un dominio en el extremo N para la interaccion con un sitio de union en un aferente sensorial nociceptivo. Este problema es especialmente agudo con RG que requieren un residuo de aminoacidos en el extremo N espedfico o una secuencia espedfica de residuos de aminoacidos que incluyen el residuo de aminoacido en el extremo N para interaccion con un sitio de union en un aferente sensorial nociceptivo.
A diferencia del documento WO-98/07.864, la presente invencion emplea protemas de fusion no citotoxicas, en donde el componente RG de la fusion incluye el dominio de union relevante en un intradominio o una secuencia de aminoacidos situada hacia la parte media (p. ej., de la secuencia peptfdica lineal) del RG, o preferiblemente situada hacia el extremo N del RG, o mas preferiblemente en o cerca del extremo N. El dominio en el extremo N es capaz de unirse a un sitio de union en un aferente sensorial nociceptivo, y el RG tiene preferiblemente un requisito para una secuencia espedfica y definida de residuos de aminoacidos que estaran libres en su extremo N.
Los compuestos descritos en la presente memoria pueden usarse para tratar a un paciente que sufre uno o mas tipos de dolor cronico que incluyen dolor neuropatico, dolor inflamatorio, cefalalgia, dolor somatico, dolor visceral y dolor referido.
"Tratar”, como se usa en la presente memoria, significa tratar medicamente. Incluye, por ejemplo, la administracion de un compuesto de la invencion para prevenir el dolor o aliviar su intensidad.
El termino "dolor”, como se usa en la presente memoria, significa cualquier experiencia sensorial desagradable, asociada normalmente con un trastorno ffsico. El trastorno ffsico puede ser o no evidente para un clmico. El dolor es de dos tipos: cronico y agudo. Un "dolor agudo" es un dolor de corta duracion que tiene un inicio subito. Un tipo de dolor agudo es, por ejemplo, el dolor cutaneo que se siente en la piel u otros tejidos superficiales, como el causado por un corte o por una quemadura. Los nociceptores cutaneos terminan justo debajo de la piel, y debido a su alta concentracion de terminaciones nerviosas, producen un dolor localizado y bien definido de corta duracion. "Dolor cronico" es un dolor distinto de un dolor agudo. El dolor cronico incluye dolor neuropatico, dolor inflamatorio,
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cefalalgia, dolor somatico, dolor visceral y dolor referido.
I. Dolor neuropatico
Los compuestos de la invencion pueden usarse para tratar el dolor causado por o asociado a cualquiera de los siguientes estados dolorosos neuropaticos. "Dolor neuropatico" significa una entrada sensorial anomala, que da como resultado molestias, desde el sistema nervioso periferico, el sistema nervioso central, o ambos.
A. Smtomas de dolor neuropatico
Los smtomas de dolor neuropatico pueden implicar dolor espontaneo persistente, asf como alodinia (una respuesta dolorosa a un estfmulo que normalmente no es doloroso), hiperalgesia (una respuesta acentuada a un estfmulo doloroso que normalmente solo causa una ligera molestia, como un pinchazo) o hiperpatia (cuando una ligera molestia se convierte en un dolor intenso prolongado).
B. Causas de dolor neuropatico
El dolor neuropatico puede estar causado por cualquiera de lo siguiente.
1. Una agresion traumatica, como, por ejemplo, una lesion de compresion de los nervios (p. ej., aplastamiento de un nervio, elongacion de un nervio, pinzamiento de un nervio o una transeccion incompleta de un nervio); una lesion de la medula espinal (p. ej., hemiseccion de la medula espinal); amputacion de una extremidad; una contusion; una inflamacion (p. ej., una inflamacion de la medula espinal); o una intervencion quirurgica.
2. Un episodio isquemico que incluye, por ejemplo, un ataque fulminante y un ataque cardfaco.
3. Un agente infeccioso
4. Exposicion a un agente toxico, que incluye, por ejemplo, un farmaco, un alcohol, un metal pesado (p. ej., plomo, arsenico, mercurio), un agente industrial (p. ej., un disolvente, vapores de una cola) u oxido nitroso.
5. Una enfermedad, que incluye, por ejemplo, un trastorno inflamatorio, un tumor neoplasico, smdrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedad de Lymes, lepra, una enfermedad metabolica, un trastorno de los nervios perifericos, como el neuroma, una mononeuropatfa o una polineuropatfa.
C. Tipos de dolor neuropatico 1. Neuralgia.
Una neuralgia es un dolor que irradia a lo largo del curso de uno o mas nervios espedficos normalmente sin ningun cambio patologico demostrable en la estructura del nervio. Las causas de la neuralgia son diversas. Irritacion qrnmica, inflamacion, traumatismo (que incluye cirugfa), compresion por estructuras cercanas (por ejemplo, tumores) e infecciones pueden provocar neuralgia. En muchos casos, sin embargo, la causa es desconocida o inidentificable. La neuralgia es mas comun en ancianos, pero puede producirse en cualquier edad. Una neuralgia, incluye, sin limitacion, neuralgia del trigemino, neuralgia postherpetica, neuralgia postherpetica, neuralgia glosofarmgea, ciatica y dolor facial atfpico.
La neuralgia es un dolor en la distribucion de uno o varios nervios. Algunos ejemplos son neuralgia del trigemino, dolor facial atfpico y neuralgia postherpetica (causada por zona o herpes zoster). Los nervios afectados son responsables de la sensacion del tacto, la temperatura y la presion en la zona facial desde la mandfbula a la frente. El trastorno en general provoca episodios breves de dolor muy agudo, normalmente durante menos de dos minutos y solo en un lado de la cara. El dolor puede describirse de diversas formas como "punzante”, "lancinante”, "como un relampagueo”, "quemante” e incluso "pruntico". En la forma atfpica de NT, el dolor puede estar presente tambien como intenso o simplemente persistente y durar periodos extensos. El dolor asociado con NT se reconoce como uno de los dolores mas agudos que pueden experimentarse.
Estfmulos simples como comer, hablar, lavarse la cara, o cualquier tacto o sensacion ligeros pueden desencadenar un ataque (incluso la sensacion de una ligera brisa). Los ataques pueden aparecer en racimos o como un ataque aislado.
Los smtomas incluyen dolor agudo punzante o dolor quemante constante localizado en cualquier lugar, normalmente en o cerca de la superficie del cuerpo, en la misma posicion para cada episodio; dolor a lo largo del curso de un nervio espedfico; deterioro de la funcion de la parte afectada del cuerpo debido al dolor, o debilidad muscular debido a un dano simultaneo del nervio motor; aumento de la sensibilidad de la piel o entumecimiento de la zona cutanea afectada (sensacion similar a un anestesico local como una inyeccion de novocama); y cualquier tacto o presion se interpreta como dolor. El movimiento tambien puede ser doloroso.
La neuralgia del trigemino es la forma mas comun de neuralgia. Afecta al principal nervio sensorial de la cara, El nervio trigemino ("trigemino" significa literalmente "tres ongenes", en referencia a la division del nervio en 3 ramas).
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Este estado implica ataques repentinos y breves de dolor intenso en el lado de la cara, a lo largo de la zona inervada por el nervio trigemino en ese lado. Los ataques de dolor pueden ser suficientemente intensos para provocar una mueca facial, que clasicamente se refiere como tic doloroso (tic douloureux). En ocasiones, la causa de neuralgia del trigemino es un vaso sangumeo o un pequeno tumor que presiona el nervio. Trastornos como la esclerosis multiple (una enfermedad inflamatoria que afecta al encefalo y la medula espinal), ciertas formas de artritis y la diabetes (alto contenido de azucar en sangre) tambien pueden provocar neuralgia del trigemino, aunque no siempre se identifica la causa. En este estado, determinados movimientos como masticar, hablar, deglutir o tocar una zona de la cara pueden desencadenar un espasmo de dolor muy agudo.
Una neuralgia relacionada, aunque bastante infrecuente, afecta al nervio glosofarmgeo, que proporciona una sensacion en la garganta. Los smtomas de esta neuralgia son episodios breves y de tipo shock de dolor localizado en la garganta.
La neuralgia puede producirse despues de infecciones como el herpes zoster, que esta provocado por el virus de la varicela-zoster, un tipo de herpesvirus. Esta neuralgia produce un dolor quemante constante despues de que haya curado la erupcion del herpes zoster. El dolor empeora con el movimiento o el contacto con la zona afectada. No todos los casos con diagnostico de herpes zoster derivan en la experiencia de neuralgia postherpetica, que puede ser mas dolorosa que el herpes zoster. El dolor y la sensibilidad pueden persistir durante meses o incluso anos. El dolor aparece normalmente en forma de una sensibilidad intolerable ante cualquier tacto pero especialmente el tacto ligero. La neuralgia postherpetica no se limita a la cara; puede aparecer en cualquier lugar del cuerpo aunque normalmente tiene lugar en el lugar de la erupcion del herpes zoster.
La depresion no es infrecuente debido al dolor y al aislamiento social durante la enfermedad.
La neuralgia postherpetica puede ser debilitante mucho despues de que hayan desaparecido los signos de la infeccion original del herpes. Otras enfermedades infecciosas que pueden causar neuralgia son sffilis y enfermedad de Lyme.
La diabetes es otra causa comun de neuralgia. Este problema medico tan frecuente afecta a casi 1 de cada 20 estadounidenses durante la edad adulta. La diabetes dana las pequenas arterias que aportan circulacion a los nervios, lo que da como resultado un mal funcionamiento de las fibras nerviosas y en ocasiones la perdida del nervio. La diabetes puede producir casi cualquier neuralgia, lo que incluye neuralgia del trigemino, smdrome del tunel carpiano (dolor y entumecimiento de la mano y la muneca) y meralgia parestesica (entumecimiento y dolor en el muslo debido a una lesion en el nervio cutaneo femoral lateral). El control estricto del azucar en sangre puede prevenir danos diabeticos en los nervios y acelerar la recuperacion en pacientes que desarrollan neuralgia.
Otros estados medicos que pueden asociarse con neuralgias son insuficiencia renal cronica y porfiria, una enfermedad hereditaria en la que el organismo no puede deshacerse de ciertas sustancias producidas despues de la descomposicion normal de la sangre en el organismo. Algunos farmacos tambien pueden provocar este problema.
2. Desaferenciacion.
La desaferenciacion indica una perdida de la entrada sensorial de una parte del cuerpo, y puede estar causada por la interrupcion de fibras sensitivas perifericas o nervios del sistema nervioso central. Un smdrome de dolor por desaferenciacion incluye, sin limitacion, una lesion en el encefalo o la medula espinal, un dolor despues de un ataque fulminante, un dolor fantasma, una paraplejia, lesiones por avulsion del plexo braquial, radiculopatfas lumbares.
3. Smdromes de dolor regional complejo (SDRC)
El SDRC es un smdrome de dolor cronico que procede de un dolor mantenido por via simpatica, y se presenta en dos formas. El SDRC 1 se usa actualmente como sustituto de la expresion "smdrome de distrofia simpatica refleja". Es un trastorno cronico de los nervios que aparece con la mayor frecuencia en los brazos o las piernas despues de una lesion menor o mayor. El SDRC 1 se asocia con dolor intenso; cambios en las unas, el hueso y la piel; y un aumento de la sensibilidad al tacto en la extremidad afectada. El SDRC 2 se usa como sustituto del termino causalgia, y procede de una lesion identificada en el nervio. Un SDRC, incluye, sin limitacion, un SDRC Tipo I (distrofia simpatica refleja) y un SDRC Tipo II (causalgia).
4. Neuropatfa.
Una neuropatfa es un cambio funcional o patologico en un nervio y se caracteriza clmicamente por anomalfas sensitivas o motoras de las neuronas.
La neuropatfa central es un cambio funcional o patologico en el sistema nervioso central.
La neuropatfa periferica es un cambio funcional o patologico en uno o mas nervios perifericos. Los nervios perifericos retransmiten informacion del sistema nervioso central (encefalo y medula espinal) a los musculos y otros organos y desde la piel, las articulaciones y otros organos de nuevo al encefalo. La neuropatfa periferica aparece
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cuando estos nervios no consiguen transportar informacion a y desde el encefalo y la medula espinal, lo que da como resultado dolor, perdida de sensacion o incapacidad de controlar los musculos. En algunos casos, la incapacidad de los nervios que controlan los vasos sangumeos, el intestino y otros organos da como resultado una presion arterial anomala, problemas de digestion y perdida de otros procesos corporales basicos. Los factores de riesgo de neuropatfa incluyen diabetes, consumo de alcohol abundante y exposicion a ciertos productos qmmicos y farmacos. Algunas personas tienen una predisposicion hereditaria a la neuropatfa. La presion prolongada en un nervio es otro riesgo de desarrollo de una lesion nerviosa. La lesion por presion puede estar causada por inmovilidad prolongada (por ejemplo, por una intervencion quirurgica larga o una enfermedad prolongada) o por la compresion de un nervio por escayolas, ferulas, corses, muletas u otros dispositivos. La polineuropatfa implica un proceso extenso que afecta normalmente a los dos lados del cuerpo por igual. Los smtomas dependen del tipo de nervio afectado. Los tres tipos principales de nervios son sensitivos, motores y autonomos. La neuropatfa puede afectar a cualquiera de ellos o a una combinacion de los tres tipos de nervios. Los smtomas dependen tambien de si el estado afecta a todo el cuerpo o solo a un nervio (por ejemplo, por una lesion). La causa de la polineuropatfa inflamatoria cronica es una respuesta inmunitaria anomala. Los antfgenos, los procesos inmunitarios y los factores desencadenantes espedficos son variables y en muchos casos se desconocen. Pueden producirse en asociacion con otros estados como VIH, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso, hepatitis activa cronica y anomalfas de las celulas sangumeas.
La neuropatfa periferica puede afectar a una funcion o implicar un cambio patologico en un unico nervio o grupo de nervios (mononeuropatfa) o afectar a una funcion o implicar un cambio patologico que afecta a multiples nervios (polineuropatfa).
Neuropatfas perifericas
Trastornos hereditarios
Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
Ataxia de Friedreich
Trastornos sistemicos o metabolicos
Diabetes (neuropatfa diabetica)
Deficiencias en la dieta (especialmente vitamina B-12)
Consumo excesivo de alcohol (neuropatfa alcoholica)
Uremia (por insuficiencia renal)
Cancer
Estados infecciosos o inflamatorios
SIDA
Hepatitis
fiebre por garrapatas de Colorado difteria
smdrome de Guillain-Barre
infeccion por VIH sin desarrollo de SIDA
lepra
Lyme
panarteritis nudosa artritis reumatoide sarcoidosis smdrome de Sjogren sffilis
lupus eritematoso sistemico
amiloide
Exposicion a compuestos toxicos
inhalacion de pegamento u otros compuestos toxicos
oxido nitroso
5 agentes industrials, especialmente disolventes metales pesados (plomo, arsenico, mercurio, etc.)
Neuropatfa secundaria a farmacos como nefropatia analgesica Causas diversas
isquemia (disminucion de ox^geno/disminuciOn del flujo sangumeo)
10 exposicion prolongada a bajas temperaturas
a. Polineuropatfa
La polineuropatfa es una neuropatfa periferica que implica la perdida de movimiento o sensacion en una zona provocada por dano o destruccion en multiples nervios perifericos. El dolor polineuropatico, incluye, sin limitacion, smdrome post-polio, smdrome posmastectoirna, neuropatfa diabetica, neuropatfa alcoholica, amiloide, toxinas, 15 SIDA, hipotiroidismo, uremia, deficiencias de vitaminas, dolor inducido por la quimioterapia, tratamiento con 2',3'- didesoxicitidina (ddC), smdrome de Guillain-Barre o enfermedad de Fabry.
b. Mononeuropatfa
La mononeuropatfa es una neuropatfa periferica que implica perdida de movimiento o sensacion en una zona provocada por dano o destruccion en un unico nervio o un grupo de nervios perifericos. La mononeuropatfa es 20 causada con la maxima frecuencia por un dano en una zona local derivado de una lesion o traumatismo, aunque en ocasiones los trastornos sistemicos pueden provocar un dano en un nervio aislado (por ejemplo, con mononeuritis multiples). Las causas habituales son traumatismo directo, presion prolongada en el nervio y compresion del nervio por tumefaccion o lesion cerca de estructuras corporales. El dano incluye destruccion de la vaina (cubierta) de mielina del nervio o de parte de la celula nerviosa (el axon). Este dano ralentiza o impide la conduccion de impulsos 25 a traves del nervio. La mononeuropatfa puede afectar a cualquier parte del cuerpo. El dolor mononeuropatico incluye, sin limitacion, disfuncion del nervio ciatico, disfuncion del nervio peroneo comun, disfuncion del nervio radial, disfuncion del nervio cubital, mononeuropatfa del VI craneal, mononeuropatfa del VII craneal, mononeuropatfa del III craneal (tipo compresion), mononeuropatfa del III craneal (tipo diabetico), disfuncion de un nervio axilar, smdrome del tunel carpiano, disfuncion del nervio femoral, disfuncion del nervio tibial, paralisis de Bell, smdrome del operculo 30 toracico, smdrome del tunel carpiano y paralisis del sexto nervio (abducente),
c. Neuropatfas perifericas generalizadas
Las neuropatfas perifericas generalizadas son simetricas y se debe normalmente a diversas enfermedades sistemicas y procesos morbidos que afectan al sistema nervioso periferico en su conjunto. Se subdividen en varias categonas:
35 i. Las axonopatfas distales con consecuencia de alguna desorganizacion toxica o metabolica de las neuronas. Pueden estar causadas por enfermedades metabolicas como diabetes, insuficiencia renal, smdromes de deficiencia como malnutricion y alcoholismo, o los efectos de toxinas o farmacos. La axonopatfa distal (tambien conocida como neuropatfa por degeneracion distal) es un tipo de neuropatfa periferica que se deriva de alguna desorganizacion toxica o metabolica de las neuronas del sistema nervioso periferico (SNP). Es la respuesta mas comun de los 40 nervios a alteraciones toxicas o metabolicas, y de este modo puede estar causada por enfermedades metabolicas como diabetes, insuficiencia renal, smdromes de deficiencia como malnutricion y alcoholismo, o los efectos de toxinas o farmacos. La causa mas comun de axonopatfa distal es la diabetes y la axonopatfa distal mas comun es la neuropatfa diabetica.
ii. Las mielinopatfas se deben a un ataque primario en la mielina que provoca una insuficiencia aguda de conduccion 45 de los impulsos. La causa mas comun es polineuropatfa desmielinizante inflamatoria aguda (PDIA; tambien conocida como smdrome de Guillain-Barre), aunque otras causas incluyen smdrome desmielinizante inflamatorio cronico (SDIC), trastornos metabolicos geneticos (p. ej., leucodistrofia) o toxinas. La mielinopatfa se debe a destruccion primaria de mielina o las celulas de Schwann mielinizantes, que sale del axon intacta, pero provoca una insuficiencia aguda de la conduccion de los impulsos. Esta desmielinizacion ralentiza o bloquea completamente la conduccion de 50 impulsos electricos a traves del nervio. La causa mas comun es la polineuropatfa desmielinizante inflamatoria aguda (PDIA, mas conocida como smdrome de Guillain-Barre), aunque otras causas incluyen polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica (SDIC), trastornos metabolicos geneticos (p. ej., leucodistrofia o enfermedad de
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Charcot-Marie-Tooth) o toxinas.
iii. Las neuronopatfas son el resultado de la destruccion de las neuronas del sistema nervioso periferico (SNP). Pueden estar causadas por enfermedades de la neurona motora, neuronopatfas sensitivas (p. ej., herpes zoster), toxinas o disfuncion autonoma. Las neurotoxinas pueden causar neuronopatfas, como el agente quimioterapeutico vincristina. La neuronopatfa es una disfuncion debida a danos en las neuronas del sistema nervioso periferico (SNP), que dan como resultado una neuropatfa periferica. Puede estar causada por enfermedades de la neurona motora, neuronopatfas sensitivas (p. ej., herpes zoster), sustancias toxicas o disfuncion autonoma. Una persona con neuronopatfa puede presentarse de diferentes formas, dependiendo de la causa, el modo en que afecta a las celulas nerviosas y el tipo de celula nerviosa que resulta mas afectado.
iv. Neuropatfas por pinzamiento focal (p. ej., smdrome del tunel carpiano).
II. Dolor inflamatorio
Los compuestos de la invencion pueden usarse para tratar el dolor causado por o asociado de otro modo con cualquiera de los siguientes estados inflamatorios
A. Trastorno artntico
Los trastornos artnticos incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide; artritis reumatoide juvenil; lupus eritematoso sistemico (LES); artritis gotosa; esclerodermia; artrosis; artritis psoriasica; espondilitis anquilosante; smdrome de Reiter (artritis reactiva); enfermedad de Still adulta; artritis por una infeccion vrnca; artritis por una infeccion bacteriana, como, por ejemplo, artritis gonococica y artritis bacteriana no gonococica (artritis septica); enfermedad de Lyme terciaria; artritis tuberculosa; y artritis por una infeccion fungica, como, por ejemplo, blastomicosis.
B. Enfermedades autoinmunitarias
Enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, smdrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes tipo I, lupus eritematoso sistemico, dermatomiositis, smdrome de Sjogren, lupus eritematoso, esclerosis multiple, miastenia grave, smdrome de Reiter y enfermedad de Graves.
C. Trastorno de los tejidos conjuntivos
Los trastornos de los tejidos conjuntivos incluyen, por ejemplo, espondiloartritis, dermatomiositis y fibromialgia.
D. Lesion
Una inflamacion causada por lesion que incluye, por ejemplo, aplastamiento, puncion, elongacion de un tejido o una articulacion, puede ocasionar dolor cronico inflamatorio.
E. Infeccion
Una inflamacion causada por infeccion que incluye, por ejemplo, tuberculosis o queratitis intersticial puede ocasionar dolor cronico inflamatorio.
F. Neuritis
La neuritis es un proceso inflamatorio que afecta a un nervio o un grupo de nervios. Los smtomas dependen de los nervios afectados, pero pueden incluir dolor, parestesias, paresia o hiperestesia (entumecimiento).
Los ejemplos incluyen:
a. Neuritis braquial
b. Neuropatfa retrobulbar, un proceso inflamatorio que afecta a la parte del nervio optico situada inmediatamente detras del globo ocular.
c. Neuropatfa optica, un proceso inflamatorio que afecta al nervio optico causante de una reduccion subita de la vision en el ojo afectado. La causa de la neuritis optica es desconocida. La inflamacion subita del nervio optico (el nervio que conecta el ojo y el encefalo) conduce a tumefaccion y destruccion de la vaina de mielina. La inflamacion puede ser, en ocasiones, consecuencia de una infeccion vrnca o puede estar causada por enfermedades autoinmunitarias como esclerosis multiple. Los factores de riesgo estan relacionados con las posibles causas.
d. Neuritis vestibular, una infeccion vmica que provoca un proceso inflamatorio que afecta al nervio vestibular.
G. Inflamacion articular
La inflamacion de la articulacion, como la causada por bursitis o tendinitis, por ejemplo, puede ocasionar dolor cronico inflamatorio.
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III. Cefalalgia
Los compuestos de la invencion pueden usarse para tratar el dolor causado por o asociado de otro modo con cualquiera de los siguientes estados de cefalea. Una cefalea (conocida medicamente como cefalalgia) es un estado de dolor leve o intenso en la cabeza; en ocasiones un dolor de cuello o de la parte superior de la espalda puede interpretarse tambien como una cefalea. Puede indicar una enfermedad subyacente local o sistemica o ser un trastorno de por sr
A. Cefalea muscular/miogenica
Las cefaleas musculares/miogenicas parecen implicar una tirantez o tension de los musculos de la cara y el cuello; pueden irradiar hacia la frente. La cefalea tensional es la forma mas comun de cefalea miogenica.
Una cefalea tensional es un estado que implica dolor o molestias en la cabeza, el cuero cabelludo o el cuello, asociadas normalmente con tirantez muscular en estas zonas. Las cefaleas tensionales se derivan de la contraccion de los musculos del cuello y el cuero cabelludo. Una causa de esta contraccion muscular es una respuesta al estres, depresion o ansiedad. Cualquier actividad que provoque que la cabeza deba mantenerse en una posicion dada durante un tiempo prolongado sin moverla puede ocasionar una cefalea. Dichas actividades incluyen el mecanografiado o el uso de ordenadores, trabajo fino con las manos y uso de un microscopio. Dormir en una habitacion fna o dormir con el cuello en una posicion anormal tambien puede desencadenar este tipo de cefalea. Una cefalea de tipo tensional incluye, sin limitacion, una cefalea tensional episodica y una cefalea tensional cronica.
B. Cefalea vascular
El tipo mas comun de cefalea vascular es la migrana. Otras clases de cefaleas vasculares incluyen cefaleas en racimos, que causan episodios repetidos de dolor intenso, y cefaleas resultantes de una alta presion arterial
1. Migrana
Una migrana es un trastorno heterogeneo que en general implica cefaleas recurrentes. Las migranas difieren de otras cefaleas porque se producen con otros smtomas, como, por ejemplo, nauseas, vomitos o sensibilidad a la luz. En la mayona de las personas, se siente un dolor palpitante solo en un lado de la cabeza. Las caractensticas clmicas como smtomas de tipo de aura, presencia de prodromos o smtomas asociados como vertigo, pueden observarse en subgrupos de pacientes con diferentes mecanismos fisiopatologicos y geneticos subyacentes. Una cefalea migranosa incluye, sin limitacion, migrana sin aura (migrana comun), migrana con aura (migrana clasica), migrana menstrual, migrana equivalente (cefalea acefalica), migrana complicada, migrana anomala y migrana tensional mixta.
2. Cefalea en racimos
Las cefaleas en racimos afectan a un lado de la cabeza (unilateral) y pueden asociarse con lagrimeo ocular y congestion nasal. Se producen en racimos que se suceden de forma repetida todos los dfas a la misma hora durante varias semanas y despues remiten.
D. Cefalea por alta presion arterial
E. Cefalea de traccion e inflamatoria
Las cefaleas de traccion e inflamatorias son normalmente smtomas de otros trastornos, que comprenden desde un ataque fulminante a una infeccion sinusal.
F. Cefalea hormonal
G. Cefalea de rebote
Las cefaleas de rebote, tambien conocidas como cefaleas por uso excesivo de medicacion, tienen lugar cuando se toma medicacion con demasiada frecuencia para aliviar la cefalea. Las cefaleas de rebote se producen frecuentemente a diario y pueden ser muy dolorosas.
H. Cefalea por sinusitis cronica
La sinusitis es una inflamacion, bacteriana, fungica, vmca, alergica o autoinmunitaria de los senos paranasales. La sinusitis cronica es una de las complicaciones mas habituales del resfriado comun. Los smtomas incluyen: congestion nasal; dolor facial; cefalea; fiebre; malestar general; secrecion espesa verde o amarilla; sensacion de 'plenitud' facial que empeora al encorvarse. En un numero reducido de casos, la sinusitis maxilar cronica tambien puede provocarse por la diseminacion de bacterias desde una infeccion dental. La sinusitis eosinofila hiperplasica cronica es una forma no infecciosa de sinusitis cronica.
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I. Cefalea organica
J. Cefaleas ictales
Las cefaleas ictales son cefaleas asociadas con actividad convulsiva.
IV. Dolor somatico
Los compuestos de la invencion pueden usarse para tratar el dolor causado por o asociado de otro modo con cualquiera de los siguientes estados dolorosos somaticos. El dolor somatico se origina en ligamentos, tendones, huesos, vasos sangumeos e incluso los propios nervios. Es detectado por nociceptores somaticos. La escasez de receptores del dolor en estas zonas produce un dolor sordo y mal localizado de mayor duracion que el dolor cutaneo; cuyos ejemplos incluyen esguinces y fracturas oseas. Entre los ejemplos adicionales se incluyen los siguientes.
A. Tension muscular excesiva
Una tension muscular excesiva puede estar causada, por ejemplo, por un esguince o una distension.
B. Trastornos por movimientos repetitivos
Los trastornos por movimientos repetitivos pueden proceder de un uso excesivo de manos, munecas, codos, hombros, cuello, espalda, caderas, rodillas, pies, piernas o tobillos.
C. Trastornos musculares
Los trastornos musculares que provocan dolor somatico incluyen, por ejemplo, polimiositis, dermatomiositis, lupus, fibromialgia, polimialgia reumatica y rabdomiolisis.
D. Mialgia
La mialgia es un dolor muscular y es un smtoma de muchas enfermedades y trastornos. La causa mas comun de mialgia es el uso excesivo o sobreestiramiento de un musculo o grupo de musculos. La mialgia sin antecedentes de traumatismo se debe a menudo a infecciones vmcas. Las mialgias de larga duracion pueden ser indicativas de una miopatfa metabolica, algunas deficiencias nutricionales o smdrome de fatiga cronica.
E. Infeccion
La infeccion puede ocasionar dolor somatico. Los ejemplos de dicha infeccion incluyen, por ejemplo, un absceso en el musculo, triquinosis, gripe, enfermedad de Lyme, malaria, fiebre de las Montanas Rocosas, gripe aviar, resfriado comun, neumorna adquirida en la comunidad, meningitis, viruela de los monos, smdrome respiratorio agudo grave, smdrome del choque toxico, triquinosis, fiebre tifoidea e infeccion del aparato respiratorio superior.
F. Farmacos
Los farmacos pueden ocasionar dolor somatico. Dichos farmacos incluyen, por ejemplo, cocama, una estatina para reducir el colesterol (como atorvastatina, simvastatina y lovastatina), y un inhibidor ACE para reducir la presion arterial (como enalapril y captopril)
V. Dolor visceral
Los compuestos de la invencion pueden usarse para tratar el dolor causado por o asociado de otro modo con cualquiera de los siguientes estados dolorosos viscerales. El dolor visceral se origina en las vfsceras u organos del cuerpo. Los nociceptores viscerales estan situados en los organos y las cavidades internas del cuerpo. La todavfa mayor escasez de nociceptores en estas zonas produce un dolor que es normalmente mas persistente y de mayor duracion que el dolor somatico. El dolor visceral es extremadamente diffcil de localizar, y varias lesiones en el tejido visceral muestran un dolor "referido", en donde la sensacion se localiza en una zona que no tiene ninguna relacion con el punto de la lesion. Entre los ejemplos de dolor visceral se incluyen los siguientes.
A. Dolor visceral funcional
El dolor visceral funcional incluye, por ejemplo, smdrome del intestino irritable y dolor abdominal funcional cronico (DAFC), estrenimiento funcional y dispepsia funcional, dolor toracico no cardfaco (DTNC) y dolor abdominal cronico.
B. Inflamacion gastrointestinal cronica
La inflamacion gastrointestinal cronica incluye, por ejemplo, gastritis, enfermedad inflamatoria intestinal, como, por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis microscopica, diverticulitis y gastroenteritis; cistitis intersticial; isquemia intestinal; colecistitis; apendicitis; reflujo gastroesofagico; ulcera, nefrolitiasis, infeccion de las vfas urinarias, pancreatitis y hernia.
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C. Dolor autoinmunitario
Dolor autoinmunitario incluye, por ejemplo, una sarcoidosis y una vasculitis.
D. Dolor visceral organico
El dolor visceral organico incluye, por ejemplo, dolor derivado de una lesion traumatica, inflamatoria o degenerativa del aparato digestivo o producida por un tumor que incide en la innervacion sensitiva.
E. Dolor visceral inducido por tratamientos
El dolor visceral inducido por tratamientos incluye, por ejemplo, un dolor relacionado con quimioterapia o dolor relacionado con radioterapia.
VI. Dolor referido
Los compuestos de la invencion pueden usarse para tratar el dolor causado por o asociado de otro modo con cualquiera de los siguientes estados dolorosos referidos.
El dolor referido se produce por un dolor localizado en una zona separada del lugar de estimulacion del dolor. A menudo, el dolor referido aparece cuando se comprime o se dana un nervio en o cerca de su origen. En esta circunstancia, la sensacion de dolor se percibira en general en el territorio que inerva el nervio, aun cuando el dano tenga su origen en otro lugar. Un ejemplo comun se produce en una hernia de disco intervertebral, en donde la rafz nerviosa que nace en la medula espinal es comprimida por el material del disco adyacente. Aunque el dolor pueda proceder del disco danado en sf, el dolor se sentira tambien en la region inervada por el nervio comprimido (por ejemplo, el muslo, la rodilla o el pie). Al aliviar la presion en la rafz nerviosa puede mejorarse el dolor referido, siempre que no se haya producido un dano permanente en el nervio. La isquemia miocardica (la perdida de flujo sangumeo en una parte del tejido del musculo cardfaco) es posiblemente el ejemplo mas conocido de dolor referido; la sensacion puede producirse en la parte superior del torax como una sensacion de constriccion, o en forma de dolor en el hombro, el brazo o incluso la mano del lado izquierdo.
El componente de proteasa no citotoxica de la presente invencion es una proteasa no citotoxica o un fragmento de la misma, en donde la proteasa o fragmento de proteasa es capaz de dividir enlaces peptfdicos diferentes pero espedficos en una de tres protemas de sustrato, es decir, sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25, del aparato de fusion exocitosico en un aferente sensorial nociceptivo. Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora. El componente de proteasa no citotoxica de la presente invencion es una proteasa de IgA de Neisseria o un fragmento de la misma o una cadena L de neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma. Un componente de proteasa no citotoxica preferido especialmente es la cadena L de la neurotoxina botulmica (BoNT) o un fragmento de la misma.
El componente de translocacion de la presente invencion permite la translocacion de la proteasa no citotoxica (o un fragmento de la misma) en la celula diana de manera que la expresion funcional de la actividad de proteasa tenga lugar en el citosol de la celula diana. El componente de translocacion es capaz preferiblemente de formar poros permeables a iones en membranas lipfdicas en estados de bajo pH. Se ha descubierto que es preferible usar solo aquellas partes de la molecula de protema capaces de formacion de poros en la membrana endosomica. El componente de translocacion puede obtenerse de una fuente de protemas microbianas, en particular de una fuente de protemas bacterianas o vmcas. Asf, en una realizacion, el componente de translocacion es un dominio de translocacion de una enzima, como una toxina bacteriana o una protema vmca. El componente de translocacion de la presente invencion es preferiblemente una cadena H de neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma. Lo mas preferiblemente es el dominio Hn (o un componente funcional del mismo), en donde Hn significa una porcion o fragmento de la cadena H de una neurotoxina clostridial equivalente aproximadamente a la mitad del extremo amino de la cadena H, o el dominio correspondiente a ese fragmento en la cadena H intacta.
El componente RG de la presente invencion es responsable de la union de la protema de fusion de la presente invencion a un sitio de union en una celula diana. Asf, el componente RG es simplemente un ligando a traves del cual una protema de fusion de la presente invencion se une a una celula diana seleccionada.
En el contexto de la presente invencion, la celula diana es un aferente sensorial nociceptivo, preferiblemente un aferente nociceptivo primario (p. ej., una fibra A tal como una fibra A8 o una fibra C). Asf, las protemas de fusion de la presente invencion son capaces de inhibir la liberacion de neurotransmisores o neuromoduladores [p. ej. glutamato, sustancia P, peptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y/o un neuropeptido Y] de poblaciones discretas de neuronas de aferentes sensoriales nociceptivos. En uso, las protemas de fusion reducen o impiden la transmision de senales aferentes sensitivas (p. ej., neurotransmisores o neuromoduladores) de las fibras perifericas a las fibras del dolor centrales, y por lo tanto tienen aplicacion como moleculas terapeuticas para el tratamiento del dolor, en particular el dolor cronico.
Resulta rutinario confirmar que un RG se une a un aferente sensorial nociceptivo. Por ejemplo, puede emplearse un sencillo experimento de desplazamiento radiactivo en el que el tejido o las celulas representativos del aferente
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sensorial nociceptivo (por ejemplo, GRD) se exponen a un ligando marcado (p. ej., con tritio) en presencia de un exceso de ligando no marcado. En dicho experimento, pueden evaluarse las proporciones relativas de union inespedfica y espedfica, lo que permite as^ la confirmacion de que el ligando se une a la celula diana del aferente sensorial nociceptivo. Opcionalmente, el ensayo puede incluir uno o mas antagonistas de union, y el ensayo puede comprender ademas la observacion de una perdida de union a ligando. Pueden encontrarse ejemplos de este tipo de experimento en Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pag. 303-311, en Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.
Las protemas de fusion de la presente invencion muestran en general una afinidad de union reducida (en la region de hasta 100 veces) para celulas diana de aferentes sensoriales nociceptivos cuando se compara con los RG 'libres' correspondientes. Sin embargo, a pesar de esta observacion, las protemas de fusion de la presente invencion muestran sorprendentemente buena eficacia. Esto puede atribuirse a dos caractensticas principales. En primer lugar, el componente de proteasa no citotoxica es catalttico y, asf, el efecto terapeutico de pocas de estas moleculas se amplifica rapidamente. En segundo lugar, los receptores presentes en los aferentes sensoriales nociceptivos solo necesitan actuar como una pasarela de entrada del agente terapeutico, y no deben estimularse necesariamente hasta un nivel requerido para alcanzar una respuesta farmacologica mediada por el ligando-receptor. Por consiguiente, las protemas de fusion de la presente invencion pueden administrarse en una dosis que es mucho menor que la que se empleana para otros tipos de moleculas analgesicas como AINE, morfina y gabapentina. Las ultimas moleculas se administran normalmente en cantidades altas de microgramos a miligramos (incluso hasta centenares de miligramos), mientras que las protemas de fusion de la presente invencion pueden administrarse a dosis muy inferiores, normalmente al menos 10 veces menores, y mas normalmente 100 veces menores.
El RG comprende preferiblemente un maximo de 50 residuos de aminoacidos, mas preferiblemente un maximo de 40 residuos de aminoacidos, preferiblemente en particular un maximo de 30 residuos de aminoacidos, y lo mas preferiblemente un maximo de 20 residuos de aminoacidos.
Los opioides representan un grupo preferido de RG de la presente invencion. Dentro de esta familia de peptidos se incluyen las encefalinas (met y leu), las endomorfinas 1 y 2, la p-endorfina y la dinorfina. Los peptidos opioides se usan frecuentemente en la clfnica para modificar la actividad para los nociceptores, y otras celulas implicadas en la respuesta al dolor. Como se ilustra en la Escalera Analgesica de tres escalones de la Organizacion Mundial de la Salud, los opioides tienen puntos de entrada en el tratamiento farmacologico de cancer cronico y dolor no canceroso en las tres fases, lo que subraya su importancia para el tratamiento del dolor. La referencia a los opioides comprende los fragmentos, variantes y derivados de los mismos, que conservan la capacidad de unirse a los aferentes sensoriales nociceptivos.
El RG de la invencion puede ser tambien una molecula que actua como un "agonista" en uno o mas de los receptores presentes en un aferente sensorial nociceptivo, mas en particular en un aferente nociceptivo primario. Convencionalmente, un agonista se ha considerado cualquier molecula que puede aumentar o disminuir las actividades dentro de una celula, es decir, cualquier molecula que simplemente provoca una alteracion de la actividad celular. Por ejemplo, el significado convencional de un agonista incluina una sustancia qmmica capaz de combinarse con un receptor en una celula e iniciar una reaccion o actividad, o un farmaco que induce una respuesta activa por activacion de receptores, ya sea la respuesta un aumento o una disminucion en la actividad celular.
Sin embargo, para los fines de la presente invencion, un agonista se define mas espedficamente como una molecula que es capaz de estimular el proceso de fusion exocitosico en una celula diana, en donde el proceso es susceptible de inhibicion por una proteasa (o un fragmento de la misma) capaz de dividir una protema del aparato de fusion exocitosico en dicha celula diana.
Por consiguiente, la definicion especial de agonista de la presente invencion excluina muchas moleculas que convencionalmente se consideranan agonistas. Por ejemplo, el factor de crecimiento nervioso (NGF) es un agonista en lo que respecta a su capacidad de promover la diferenciacion neuronal por medio de la union a un receptor TrkA. Sin embargo, NGF no es un agonista cuando se evalua segun los criterios anteriores dado que no es un inductor principal de fusion exocitosica. Ademas, el proceso que estimula NGF (p. ej., diferenciacion celular) no es susceptible de inhibicion por la actividad de proteasa de una molecula de toxina no citotoxica.
Las propiedades de agonista de un RG que se une a un receptor en un aferente nociceptivo pueden confirmarse usando los metodos descritos en el Ejemplo 10.
En una realizacion preferida de la invencion, la diana para el RG es el receptor ORL1. Este receptor es un miembro de la clase de receptores acoplados a la protema G, y tiene una estructura de siete dominios transmembrana. Las propiedades del receptor ORL1 se exponen en detalle en Mogil & Pasternak (2001), Pharmacological Reviews, Vol. 53, No. 3, paginas 381-415.
En una realizacion, el RG es una molecula que se une (preferiblemente que se une espedficamente) al receptor ORL1. Mas preferiblemente, el RG es un "agonista" del receptor ORL1. El termino "agonista" en este contexto se define como antes.
Las propiedades de agonista de un RG que se une a un receptor ORL1 pueden confirmarse usando los metodos
descritos en el Ejemplo 10. Estos metodos se basan en experimentos anteriores [vease Inoue et al. 1998 [Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 10949-10953]), que confirman que el agonista natural del receptor ORL1, nociceptina, provoca la induccion de liberacion de la sustancia P de las neuronas aferentes primarias nociceptivas. Esta afirmacion se sustenta en el hecho de que:
5 - las respuestas inducidas por la nociceptina son suprimidas por los antagonistas del receptor NK1 espedfico (el
receptor de la sustancia P); y
- el tratamiento previo de las celulas con capsaicina (que agota la sustancia P en las neuronas aferentes primarias de pequeno diametro) atenua las respuestas inducidas por la nociceptina.
De forma similar, Inoue et al. confirman que una inyeccion intraplantar de neurotoxina botulmica tipo A suprime las 10 respuestas inducidas por la nociceptina. Dado que se sabe que BoNT inhibe la liberacion de sustancia P de las neuronas aferentes primarias (Welch et al., 2000, Toxicon, 38, 245-258), esto confirma el vinculo entre la interaccion nociceptina-ORL1 y la liberacion posterior de sustancia P.
Asf, puede decirse que un RG tiene actividad de agonista en el receptor ORL1 si el RG provoca una induccion en la liberacion de sustancia P desde una neurona aferente sensorial nociceptiva (vease el Ejemplo 10).
15 En una realizacion preferida especialmente de la invencion, el RG es nociceptina, el ligando natural para el receptor ORL1. La nociceptina se dirige al receptor ORL1 con alta afinidad. Los ejemplos de otros RG preferidos incluyen:
Codigo
Secuencia Ref. SEQ ID No.
Nociceptina 1-17
FGGFTGARKSARKLANQ [1] 37,38
Nociceptina 1-11
FGGFTGARKSA [1] 39,40
Nociceptina [Y10]1-11
FGGFTGARKYA [1] 41,42
Nociceptina [Y11]1-11
FGGFTGARKSY [1] 43,44
Nociceptina [Y14]1-17
FGGFTGARKSARKYANQ [1] 45,46
Nociceptina 1-13
FGGFTGARKSARK [2] 47,48
Nociceptina [R14K15] 1-17 (tambien conocida en la presente memoria descriptiva como "variante" de nociceptina)
FGGFTGARKSARKRKNQ [3,4] 49,50
Agonista peptfdico
Agonistas peptfdicos segun estrategia de bibliotecas combinatorias [5]
[1] Mogil & Pasternak, 2001, Pharmacol. Rev., 53, 381-415 [2] Maile et al., 2003, Neurosci. Lett., 350, 190-192 [3] Rizzi et al., 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 300, 57-63 [4] Okada et al., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493-498 [5] Dooley et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther. 283(2), 735-41.
La "variante" de RG identificada antes muestra una afinidad de union especialmente buena (cuando se compara con la nociceptina natural) para aferentes sensoriales nociceptivos. Esto resulta sorprendente ya que las modificaciones 20 de aminoacidos se producen en una posicion alejada del extremo N del RG. Por otra parte, las modificaciones estan casi en el extremo C del RG, que a su vez se fija a una secuencia polipeptfdica grande (p. ej., el dominio de translocacion). En terminos generales, una protema de fusion que contiene un RG mostrara una reduccion de aproximadamente 100 veces en la capacidad de union con respecto al RG en sf. La "variante" de RG antes mencionada muestra de por sf un aumento de aproximadamente 3 a 10 veces en la capacidad de union para un 25 aferente sensorial nociceptivo (p. ej., a traves del receptor ORL1) con respecto a la nociceptina natural. Asf, podna esperarse que una fusion que contiene una "variante" de RG mostrara una reduccion de aproximadamente 10 veces en la capacidad de union para un aferente sensorial nociceptivo (p. ej., a traves del receptor ORL1) con respecto a la nociceptina 'libre'. Sin embargo, los autores de la presente invencion han demostrado que dichas protemas de fusion que contienen la "variante" de RG muestran una capacidad de union que (de forma muy sorprendente) refleja 30 estrechamente la de la nociceptina 'libre'; vease la Figura 14.
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En el contexto de la presente invencion, el termino opioide o un agonista del receptor ORL1 (como nociceptina, o cualquiera de los peptidos enumerados en la tabla anterior) comprende moleculas que tienen al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, mas preferiblemente al menos el 90%, y lo mas preferiblemente al menos el 95% de homologfa con dicho opioide o agonista. Los homologos del agonista conservan las propiedades del agonista de nociceptina en el receptor ORL1, que pueden probarse mediante los metodos proporcionados en el Ejemplo 10. De forma similar, un homologo de opioide conserva sustancialmente la funcion de union del opioide con el que muestra una alta homologfa.
La invencion comprende tambien fragmentos, variantes y derivados de uno cualquiera de los RG descritos anteriormente. Estos fragmentos, variantes y derivados conservan sustancialmente las propiedades que se adscriben a dichos RG.
Ademas de las clases de RG opioides y no opioides mencionadas anteriormente, existe una diversidad de otros polipeptidos adecuados para el guiado de las protemas de fusion de la presente invencion a aferentes sensoriales nociceptivos (p. ej., a nociceptores). A este respecto, se hace referencia en particular a la galanina y los derivados de galanina. Los receptores de galanina se encuentran de forma presinaptica y postsinaptica en los GRD (Liu & Hokfelt, (2002), Trends Pharm. Sci., 23(10), 468-74), y su expresion se potencia durante los estados de dolor neuropatico. Los receptores activados por proteinasa (PAR) forman tambien un grupo preferido de RG de la presente invencion, mas en particular pAR-2. Se sabe que los agonistas de PAR-2 inducen/provocan inflamacion aguda, en parte a traves de un mecanismo neurogenico. PAR2 se expresa mediante neuronas aferentes raqmdeas primarias, y los agonistas de PAR2 estimulan la liberacion de sustancia P (SP) y peptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) en los tejidos perifericos
Un conjunto preferido especialmente de RG de la presente invencion incluye:
Ligando
Referencia
Nociceptina
Guerrini, et al., (1997) J. Med. Chem., 40, pag. 1789-1793
P-endorfina
Blanc, et al., (1983) J. Biol. Chem., 258(13), pag. 8277-8284
Endomorfina-1; Endomorfina-2
Zadina, et al., (1997). Nature, 386, pag. 499-502
Dinorfina
Fields & Basbaum (2002) Capttulo 11, En The Textbook of Pain, Wall & Melzack eds.
Met-encefalina
Fields & Basbaum (2002) Capttulo 11, En The Textbook of Pain, Wall & Melzack eds.
Leu-encefalina
Fields & Basbaum (2002) Capttulo 11, En The Textbook of Pain, Wall & Melzack eds.
Galanina
Xu et al., (2000) Neuropeptides, 34 (3&4), 137-147
Peptido PAR-2
Vergnolle et al., (2001) Nat. Med., 7(7), 821-826
El sitio de escision de la proteasa de la presente invencion permite la escision (preferiblemente escision controlada) de la protema de fusion en una posicion entre el componente de proteasa no citotoxica y el componente de RG. Esta reaccion de escision es la que convierte la protema de fusion desde un polipeptido monocatenario en un polipeptido bicatenario con enlaces de disulfuro.
Segun una realizacion preferida de la presente invencion, el RG se une por medio de un dominio o secuencia de aminoacidos que esta situado lejos del extremo C del RG. Por ejemplo, el dominio de union relevante puede incluir un intradominio o una secuencia de aminoacidos situada hacia la parte central (p. ej., de la secuencia peptfdica lineal) del RG. Preferiblemente, el dominio de union relevante esta situado hacia el extremo N del Rg, mas preferiblemente en o cerca del extremo N.
En una realizacion, la fusion de polipeptido monocatenario puede incluir mas de un sitio de escision proteolftica. Sin embargo, cuando existen dos o mas de estos sitios, son diferentes, con lo que impiden sustancialmente la aparicion de multiples episodios de escision en presencia de una proteasa individual. En otra realizacion, se prefiere que la fusion del polipeptido monocatenario tenga un unico sitio de escision de la proteasa.
La o las secuencias de escision de la proteasa pueden introducirse (y/o eliminarse cualquier secuencia de escision inherente) en el nivel de ADN por medios convencionales, por ejemplo por mutagenia dirigida al sitio. El rastreo para confirmar la presencia de secuencias de escision puede realizarse manualmente o con la ayuda de un programa informatico (p. ej., el programa MapDraw de DNASTAR, Inc.).
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Si bien puede emplearse cualquier sitio de escision de la proteasa, se prefieren los siguientes:
Enterocinasa (DDDDK|)
Factor Xa (IEGR4/IDGR4)
TEV (virus del grabado del tabaco) (ENLYFQ^G)
Trombina (LVPR^GS)
PreScission (LEVLFQ^GP).
La expresion sitio de escision de la proteasa comprende tambien una interna, que es una secuencia de autoescision. La reaccion de autoempalme puede controlarse, por ejemplo, modificando la concentracion de agente reductor presente.
En uso, el sitio de escision de la proteasa se escinde y la region en el extremo N (preferiblemente el extremo N) del RG queda expuesta. El polipeptido resultante tiene un RG con un dominio en el extremo N o un intradominio que esta libre sustancialmente del resto de la protema de fusion. Esta disposicion asegura que el componente en el extremo N (o intradominio) del RG puede interaccionar directamente con un sitio de union en una celula diana.
En una realizacion preferida, el RG y el sitio de escision de la proteasa estan separados en la protema de fusion por cero residuos de aminoacidos. Asf, despues de la escision del sitio de escision de la proteasa, se proporciona una fusion con un RG que tiene un dominio en el extremo N que esta libre sustancialmente del resto de la fusion. Esta disposicion asegura que el componente en el extremo N del resto de guiado puede interaccionar directamente con un sitio de union en una celula diana.
Una ventaja asociada con la etapa de activacion mencionada anteriormente es que el RG solo se hace susceptible de degradacion en el extremo N una vez que se ha producido la escision proteolftica de la protema de fusion. Ademas, la seleccion de un sitio de escision de la proteasa espedfico permite la activacion selectiva de la fusion de polipeptidos en una conformacion bicatenaria.
La construccion de la fusion polipeptfdica monocatenaria de la presente invencion situa el sitio de escision de la proteasa entre el RG y el componente de la proteasa no citotoxica.
En la fusion monocatenaria, el RG esta situado entre el sitio de escision de la proteasa y el componente de translocacion. Se asegura asf que el RG este fijado al dominio de translocacion (p. ej., como sucede con la holotoxina clostridial nativa), aunque en el caso de la presente invencion el orden de los dos componentes se invierte con respecto a la holotoxina nativa. Una ventaja adicional con esta disposicion es que el RG esta situado en una region de bucle expuesta de la protema de fusion, que tiene efectos estructurales mmimos en la conformacion de la protema de fusion. A este respecto, dicho bucle se refiere de forma diversa como grupo enlazador, bucle de activacion, grupo enlazador inter-dominio, o simplemente bucle expuesto en superficie (Schiavo et al. 2000, Phys. Rev., 80, 717-766; Turton et al., 2002, Trends Biochem. Sci., 27, 552-558).
En una realizacion, en el polipeptido monocatenario, el componente de proteasa no citotoxica y el componente de translocacion estan enlazados conjuntamente por un enlace de disulfuro. Asf, despues de la escision del sitio de escision de la proteasa, el polipeptido asume una conformacion bicatenaria, en donde la proteasa y los componentes de translocacion se mantienen enlazados conjuntamente por el enlace de disulfuro. Para este fin, se prefiere que la proteasa y los componentes de translocacion esten separados entre sf en la protema de fusion monocatenaria por un maximo de 100 residuos de aminoacidos, mas preferiblemente un maximo de 80 residuos de aminoacidos, preferiblemente en particular por un maximo de 60 residuos de aminoacidos, y lo mas preferiblemente por un maximo de 50 residuos de aminoacidos.
En una realizacion, el componente de proteasa no citotoxica forma un enlace de disulfuro con el componente de translocacion de la protema de fusion. Por ejemplo, el residuo de aminoacidos del componente de proteasa que forma el enlace de disulfuro esta situado en los ultimos 20, preferiblemente en los ultimos 10 residuos de aminoacidos en el extremo C del componente de proteasa. De forma similar, el residuo de aminoacidos en el componente de translocacion que forma la segunda parte del enlace de disulfuro puede estar situado en los primeros 20, preferiblemente en los primeros 10 residuos de aminoacidos en el extremo N del componente de translocacion.
Alternativamente, en el polipeptido monocatenario, el componente de proteasa no citotoxica y el RG pueden estar enlazados conjuntamente por un enlace de disulfuro. A este respecto, el residuo de aminoacidos del RG que forma el enlace de disulfuro esta situado preferiblemente lejos del extremo N del RG, mas preferiblemente hacia el extremo C del RG.
En una realizacion, el componente de proteasa no citotoxica forma un enlace de disulfuro con el componente RG de la protema de fusion. A este respecto, el residuo de aminoacidos del componente de proteasa que forma el enlace de disulfuro esta situado preferiblemente en los ultimos 20, mas preferiblemente en los ultimos 10 residuos de
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aminoacidos del extremo C del componente de proteasa. De forma similar, el residuo de aminoacidos en el componente RG que forma la segunda parte del enlace de disulfuro esta situado preferiblemente en los ultimos 20, mas preferiblemente en los ultimos 10 residuos de aminoacidos en el extremo C del RG.
Las disposiciones de enlaces de disulfuro anteriores tienen la ventaja de que la proteasa y los componentes de translocacion estan dispuestos de manera similar a la de la neurotoxina clostridial nativa. A modo de comparacion, en referencia a la secuencia de aminoacidos primaria para neurotoxina clostridial nativa, los residuos de aminoacidos de cistema respectivos estan separados por entre 8 y 27 residuos de aminoacidos, tomado de Popoff, MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features clostridial neurotoxins, Capftulo 9, en The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. Ed. Alouf & Freer:
Serotipo'
Secuencia Longitud 'nativa' entre C-C
BoNT/A1
CVRGIITSKTKS—LDKGYNKALNDLC 23
BoNT/A2
CVRGIIPFKTKS—LDEGYNKALNDLC 23
BoNT/B
CKSVKAPC----IC 8
BoNT/C
CHKAIDGRS---------LYNKTLDC 15
BoNT/D
CLRLTK NSRDDSTC 12
BoNT/E
CKN-IVSVK---------GIRT—SIC 13
BoNT/F
CKS-VIPRK--------GTKAPP-RLC 15
BoNT/G
CKPVMYKNT--------GKSE—QC 13
TeNT
CKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC 27
1 Informacion solo de cepas proteoltticas
La protema de fusion puede comprender una o mas marcas de purificacion, que estan situadas en el extremo N en el componente de proteasa y/o en el extremo C en el componente de translocacion.
Si bien puede emplearse cualquier marca de purificacion, se prefieren las siguientes:
Marca His (p. ej., 6 x histidina), preferiblemente como una marca en el extremo C y/o en el extremo N
Marca MBP (protema de union a maltosa), preferiblemente como una marca en el extremo N
Marca GST (glutation-S-transferasa), preferiblemente como una marca en el extremo N
Marca His-MBP, preferiblemente como una marca en el extremo N
Marca GST-MBP, preferiblemente como una marca en el extremo N
Marca tiorredoxina, preferiblemente como una marca en el extremo N
Marca CBD (dominio de union de quitina), preferiblemente como una marca en el extremo N.
Segun una realizacion adicional de la presente invencion, en la protema de fusion puede incluirse una o mas moleculas separadoras de peptidos. Por ejemplo, puede emplearse un separador de peptidos entre una marca de purificacion y el resto de la molecula de la protema de molecula (p. ej., entre una marca de purificacion en el extremo N y un componente de proteasa de la presente invencion; y/o entre una marca de purificacion en el extremo C y un componente de translocacion de la presente invencion). Tambien puede emplearse un separador de peptidos entre el RG y los componentes de translocacion de la presente invencion.
Puede emplearse una variedad de diferentes moleculas separadoras en cualquiera de las protemas de fusion de la presente invencion. Los ejemplos de dichas moleculas separadoras incluyen los ilustrados en las Figuras 28 y 29. En la presente memoria se hace mencion en concreto a GSl5, GS20, GS25 y Hx27; veanse Figuras 28 y 29.
Los autores de la presente invencion han descubierto inesperadamente que las protemas de fusion (p. ej., CPNv/A) de la presente invencion pueden mostrar una actividad de union mejorada para aferentes sensoriales nociceptivos cuando el tamano del separador se selecciona de manera que (en uso) el extremo C del RG y el extremo N del componente de translocacion estan separados entre sf por 40-105 angstroms, preferiblemente por 50-100 angstroms, y mas preferiblemente por 50-90 angstroms. En otra realizacion, los separadores preferidos tienen una
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secuencia de aminoacidos de 11-29 residuos de aminoacidos, preferiblemente 15-27 residuos de aminoacidos, y mas preferiblemente 20-27 residuos de aminoacidos. Los separadores adecuados pueden identificarse y obtenerse de forma rutinaria segun Crasto, C.J. y Feng, J.A. (2000) Mayo, 13(5), pag. 309-312; vease tambien
http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente descripcion, se proporciona una secuencia de ADN que codifica el polipeptido monocatenario antes mencionado. En un aspecto preferido de la presente descripcion, la secuencia de aDn se prepara como parte de un vector de ADN, en donde el vector comprende un promotor y un terminador.
En una descripcion preferida, el vector tiene un promotor seleccionado de:
Promotor
Agente de induccion Estado de induccion tipico
Tac (hubrido)
IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)
AraBAD
L-arabinosa 0,2% (0,002-0,4%)
Operador T7-lac
IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)
La construccion de ADN de la presente descripcion se disena preferiblemente in silico, y despues se sintetiza mediante tecnicas convencionales de smtesis de ADN.
La informacion de la secuencia de ADN mencionada antes se modifica opcionalmente para preferencia codonica segun el ultimo sistema de expresion de celulas huesped (p. ej., E. coli) que se vaya a emplear.
La estructura principal de ADN se rastrea preferiblemente en busca de alguna secuencia de acidos nucleicos inherente, que cuando se transcriba y se traduzca produzca una secuencia de aminoacidos correspondiente al sitio de escision de la proteasa codificado por la segunda secuencia de codificacion peptfdica. Este rastreo puede realizarse manualmente o con la ayuda de programa informatico (p. ej., el programa MapDraw de DNASTAR, Inc.).
Segun una descripcion adicional de la presente memoria descriptiva, se proporciona un metodo de preparacion de un agente no citotoxico, que comprende:
a. la puesta en contacto de una protema de fusion polipeptfdica monocatenaria de la descripcion con una proteasa capaz de dividir el sitio de escision de la proteasa;
b. la escision del sitio de escision de la proteasa y la formacion asf de una protema de fusion bicatenaria.
Este aspecto proporciona un polipeptido bicatenario, que en general emula la estructura de la holotoxina clostridial. En mas detalle, el polipeptido bicatenario resultante tiene normalmente una estructura en donde:
a. la primera cadena comprende la proteasa no citotoxica o un fragmento de la misma, donde la proteasa o fragmento de proteasa es capaz de dividir una protema del aparato de fusion exocitosico de un aferente sensorial nociceptivo;
b. la segunda cadena comprende el RG y el dominio de translocacion que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de proteasa desde el interior de un endosoma a traves de la membrana endosomica y al citosol del aferente sensorial nociceptivo; y
las cadenas primera y segunda estan ligadas entre sf por enlaces disulfuro.
En uso, el polipeptido monocatenario o bicatenario de la invencion trata, previene o mejora el dolor.
En uso, se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido monocatenario o bicatenario de la invencion a un paciente.
La presente descripcion contempla un amplio intervalo de estados dolorosos, en particular estados dolorosos cronicos. Los estados preferidos incluyen dolor canceroso y no canceroso, dolor inflamatorio y dolor neuropatico. Las fusiones opioides de la presente solicitud estan adaptadas especialmente a abordar el dolor inflamatorio, aunque pueden ser menos adecuadas para abordar el dolor neuropatico. Las fusiones de galanina son mas adecuadas para abordar el dolor neuropatico.
En uso, los polipeptidos de la presente invencion se emplean normalmente en forma de una composicion farmaceutica en asociacion con un soporte, diluyente y/o excipiente farmaceutico, aunque la forma exacta de la composicion puede adaptarse al modo de administracion. La administracion es preferiblemente a un mairnfero, mas preferiblemente a un ser humano.
Los polipeptidos pueden emplearse, por ejemplo, en forma de una solucion esteril para administracion intraarticular o
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administracion intracraneal. Se prefiere la inyeccion raqmdea (p. ej., epidural o intratecal).
Los intervalos de dosificacion para la administracion de los polipeptidos de la presente invencion son los que producen el efecto terapeutico deseado. Se observara que el intervalo de dosificacion requerido depende de la naturaleza exacta de los componentes, la via de administracion, la naturaleza de la formulacion, la edad del paciente, la naturaleza, extension o gravedad del estado del paciente, las contraindicaciones, si existen, y el criterio del medico a cargo.
Las dosis diarias adecuadas estan en el intervalo de 0,0001-1 mg/kg, preferiblemente 0,0001-0,5 mg/kg, mas preferiblemente 0,002-0,5 mg/kg, y preferiblemente en particular 0,004-0,5 mg/kg. La dosis unitaria puede variar de menos de 1 microgramo a 30 mg, aunque normalmente estara en la region de 0,01 a 1 mg por dosis, que puede administrarse diariamente o preferiblemente con menos frecuencia, por ejemplo cada semana o cada seis meses.
Un regimen de dosificacion preferido especialmente se basa en 2,5 ng de protema de fusion (p. ej., CPNv/A) como dosis 1X. A este respecto, las dosis preferidas estan en el intervalo 1X-100X (p. ej., 2,5-250 ng). Este intervalo de dosificacion es significativamente menor (p. ej., al menos 10 veces, normalmente 100 veces menor) que el que se empleana con otros tipos de moleculas analgesicas como AINE, morfina y gabapentina. Por otra parte, la diferencia mencionada anteriormente se magnifica considerablemente cuando se realiza la misma comparacion sobre una base molar; esto se debe a que las protemas de fusion de la presente invencion tienen un Pm considerablemente mayor que la terapeutica convencional de moleculas 'pequenas'.
Sin embargo, deben esperarse amplias variaciones en la dosis requerida dependiendo de la naturaleza exacta de los componentes, y de las distintas eficacias de las diversas vfas de administracion.
Las variaciones en estos niveles de dosis pueden ajustarse usando rutinas empmcas estandarizadas para su optimizacion, tal como se entiende en la tecnica.
Las composiciones adecuadas para inyeccion pueden estar en forma de soluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos en seco que se disuelven o se suspenden en un vetnculo adecuado antes de su uso.
La forma de dosis unitaria lfquida se prepara normalmente usando un vetnculo esteril sin pirogenos. Los ingredientes activos, que dependen del vetnculo y la concentracion usados, pueden disolverse o suspenderse en el vetnculo.
En la preparacion de soluciones administrables, los polipeptidos pueden disolverse en un vetnculo, haciendose la solucion isotonica en caso necesario por adicion de cloruro de sodio y esterilizada por filtracion a traves de un filtro esteril usando tecnicas asepticas antes del llenado en viales o ampollas esteriles adecuados y sellado. Alternativamente, si la estabilidad de la solucion es adecuada, la solucion en sus recipientes sellados puede esterilizarse mediante autoclave.
Ventajosamente pueden disolverse en el vetnculo aditivos como agentes de tampon, solubilizantes, de estabilizacion, conservantes o bactericidas, de suspension o emulsionantes.
Los polvos secos que se disuelven o se suspenden en un vetnculo adecuado antes de uso pueden prepararse por llenado de sustancia farmacologica preesterilizada y otros ingredientes en un recipiente esteril usando tecnica aseptica en una zona esteril.
Alternativamente los polipeptidos y otros ingredientes pueden disolverse en un vetnculo acuoso, la solucion se esteriliza por filtracion y se distribuye en recipientes adecuados usando tecnica aseptica en una zona esteril. A continuacion se liofiliza el producto y se sellan los recipientes de forma aseptica.
Las suspensiones parenterales, adecuadas para inyeccion intramuscular, subcutanea o intradermica, se preparan sustancialmente de la misma manera, con la salvedad de que los componentes esteriles se suspenden en el vetnculo esteril, en lugar de disolverse y la esterilizacion no puede realizarse por filtracion. Los componentes pueden aislarse en estado esteril o alternativamente pueden esterilizarse despues de aislamiento, por ejemplo. por irradiacion gamma.
Ventajosamente, se incluye un agente de suspension, por ejemplo polivinilpirrolidona, en la o las composiciones para facilitar una distribucion uniforme de los componentes.
Seccion de definiciones
Resto de guiado (RG) significa cualquier estructura qmmica asociada con un agente que interacciona funcionalmente con un sitio de union para provocar la asociacion ffsica entre el agente y la superficie de una celula diana. En el contexto de la presente invencion, la celula diana es un aferente sensorial nociceptivo. El termino RG comprende cualquier molecula (p. ej., una molecula de ocurrencia natural, o una variante modificada qmmica/ffsicamente de la misma) que es capaz de unirse a un sitio de union en la celula diana, donde ese sitio de union es capaz de internalizacion (p. ej., formacion de endosoma), tambien referida como endocitosis mediada por receptores. El RG puede poseer una funcion de translocacion de la membrana endosomica, en cuyo caso no es necesario que el rG y los dominios de componentes de translocacion esten presentes en un agente de la presente
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invencion.
El RG de la presente invenciOn se une (preferiblemente se une espedficamente) a un aferente sensorial nociceptivo (p. ej., un aferente nociceptivo primario). A este respecto, se une espedficamente significa que el RG se une a un aferente sensorial nociceptivo (p. ej., un aferente nociceptivo primario) con mayor afinidad de la que se une a otras neuronas como aferentes no nociceptivos, y/o a neuronas motoras (p. ej., la diana natural para la neurotoxina clostridial holotoxina). La expresiOn "que se une espedficamente" tambien puede significar que un RG dado se une a un receptor dado, por ejemplo el receptor ORLi, con una afinidad de uniOn (Ka) de 106 M-1 o mas, preferiblemente 107 M-1 o mas, mas preferiblemente 108 M-1 o mas, y lo mas preferiblemente, 109 M-1 o mas.
Para los fines de la presente invenciOn, un agonista se define como una molecula que es capaz de estimular el proceso de fusion exocitOsico en una celula diana, donde ese proceso es susceptible de inhibiciOn por una proteasa (o un fragmento de la misma) capaz de dividir una protema del aparato de fusiOn exocitOsico en dicha celula diana.
Por consiguiente, la definiciOn concreta de agonista de la presente invenciOn excluina muchas moleculas que convencionalmente se consideranan agonistas.
Por ejemplo, el factor de crecimiento nervioso (NGF) es un agonista en lo que respecta de su capacidad para promover la diferenciaciOn neuronal por medio de la uniOn a un receptor TrkA. Sin embargo, NGF no es un agonista cuando se evalua segun los criterios anteriores dado que no es un inductor principal de la fusiOn exocitOsica. Ademas, el proceso que estimula NGF (p. ej., diferenciaciOn celular) no es susceptible de inhibiciOn por la actividad de proteasa de una molecula de toxina no citotOxica.
El termino "fragmento", cuando se usa en relaciOn con una protema, significa un peptido que tiene al menos treinta y cinco, preferiblemente al menos veinticinco, mas preferiblemente al menos veinte, y lo mas preferiblemente al menos diez residuos de aminoacidos de la protema en cuestiOn.
El termino "variante", cuando se usa en relaciOn con una protema, significa un peptido o fragmento peptfdico de la protema que contiene uno o mas analogos de un aminoacido (p. ej., un aminoacido no natural) o un enlace sustituido.
El termino "derivado", cuando se usa en relaciOn con una protema, significa una protema que comprende la protema en cuestiOn y una secuencia peptfdica adicional. La secuencia peptfdica adicional preferiblemente no debe interferir con el plegamiento basico y asf con la estructura conformacional de la protema original. Dos o mas peptidos (o fragmentos, o variantes) pueden unirse entre sf para formar un derivado. Alternativamente, un peptido (o fragmento, o variante) puede unirse con una molecula no relacionada (p. ej., un segundo peptido no relacionado). Los derivados pueden sintetizarse qmmicamente, pero normalmente se prepararan por metodos de acidos nucleicos recombinantes. Pueden incluirse componentes adicionales como componentes de lfpidos, y/o polisacaridos, y/o policetidos.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, la referencia al "receptor ORL1" comprende todos los miembros de la familia de receptores ORL1. Los miembros de la familia de receptores ORL1 tienen normalmente una estructura de siete dominios transmembrana y se acoplan con protemas G de las familias Gi y Go. En el Ejemplo 12 se ofrece un metodo para determinar la actividad de estimulaciOn de la protema G de los ligandos del receptor ORL1. En el Ejemplo 11 se ofrece un metodo para medir la reducciOn en los niveles celulares de cAMP despues de la activaciOn de ORL1. Una caractenstica adicional de los miembros de la familia de receptores ORL1 es que normalmente son capaces de unirse a la nociceptina (el ligando natural de ORL1). A modo de ejemplo, todas las variantes alternativas de empalme del receptor ORL1, son miembros de la familia de los receptores ORL1.
El termino no citotOxico significa que la molecula de proteasa en cuestiOn no destruira la celula diana a la que ha sido redireccionada.
La proteasa de la presente descripciOn comprende todas las proteasas no citotOxicas de ocurrencia natural que son capaces de dividir una o mas protemas del aparato de fusiOn exocitOsico en celulas eucariOticas.
La proteasa de la presente descripciOn es preferiblemente una proteasa bacteriana (o un fragmento de la misma). Mas preferiblemente la proteasa bacteriana se selecciona de los generos Clostridium o Neisseria (p. ej., una cadena L clostridial o una proteasa de IgA de Neisseria preferiblemente de N. gonorrhoea).
La presente invenciOn tambien comprende proteasas no citotOxicas modificadas, que incluyen secuencias de aminoacidos que no existen en la naturaleza y/o residuos de aminoacidos sinteticos, siempre que las proteasas modificadas sigan mostrando la actividad de proteasa antes mencionada.
La proteasa de la presente invenciOn muestra preferiblemente una actividad de serina o metaloproteasa (p. ej., actividad de endopeptidasa). La proteasa es preferiblemente espedfica para una protema SNARE (p. ej., SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP o sintaxina).
Se hace menciOn en particular a los dominios de proteasa de neurotoxinas, por ejemplo los dominios de proteasa de
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neurotoxinas bacterianas. Asf, la presente invencion comprende el uso de dominios de neurotoxinas, que estan presentes en la naturaleza, asf como versiones preparadas de forma recombinante de dichas neurotoxinas de ocurrencia natural.
Las neurotoxinas de ejemplo son producidas por clostridia, y el termino neurotoxina clostridial comprende neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT) y por C. botulinum (BoNT) serotipos A-G, asf como las neurotoxinas de tipo BoNT estrechamente relacionadas producidas por C. baratii y C. butyricum. Las abreviaturas mencionadas anteriormente se usan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, la nomenclatura BoNT/A denota la fuente de neurotoxina como BoNT (serotipo A). Se aplica la nomenclatura correspondiente a otros serotipos de BoNT.
El termino fragmento de cadena L significa un componente de la cadena L de una neurotoxina, fragmento que muestra una actividad de metaloproteasa y es capaz de escindir proteolfticamente una protema asociada con vesmulas y/o membranas plasmaticas implicada en la exocitosis celular.
Un dominio de translocacion es una molecula que permite la translocacion de una proteasa (o un fragmento de la misma) en una celula diana de manera que tiene lugar una expresion funcional de actividad de proteasa en el citosol de la celula diana. El hecho de si alguna molecula (p. ej., una protema o peptido) posee la funcion de translocacion requerida de la presente invencion puede confirmarse por cualquiera de una serie de ensayos convencionales.
Por ejemplo, Shone C. (1987) describe un ensayo in vitro que emplea liposomas, que se someten a provocacion con una molecula de ensayo. La presencia de la funcion de translocacion requerida se confirma por la liberacion desde los liposomas de K+ y/o NAD marcada, que puede ser facilmente objeto de seguimiento [vease Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pag. 175-180].
Se proporciona un ejemplo adicional en Blaustein R. (1987), que describe un sencillo ensayo in vitro que emplea membranas de bicapa de fosfolfpidos plana. Las membranas se someten a provocacion con una molecula de ensayo y la funcion de translocacion requerida se confirma por un aumento en la conductancia a traves de dichas membranas [vease Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pag. 115-120].
La metodologfa adicional para permitir la evaluacion de la fusion de membrana y asf la identificacion de dominios de translocacion adecuados para su uso en la presente invencion se proporciona en Methods in Enzymology Vol 220 y 221, Membrane Fusion Techniques, Partes A y B, Academic Press 1993.
El dominio de translocacion es capaz preferiblemente de formacion de poros permeables a iones en membranas lipfdicas en estados de bajo pH. Preferiblemente se ha determinado el uso de solo aquellas porciones de la molecula de protema capaces de formacion de poros en la membrana endosomica.
El dominio de translocacion puede obtenerse de una fuente de protemas microbianas, en particular de una fuente de protemas bacterianas o vmcas. Por ello, en una realizacion, el dominio de translocacion es un dominio de translocacion de una enzima, como una toxina bacteriana o una protema vmca.
Esta bien documentado que algunos dominios de toxina bacteriana moleculas son capaces de formar dichos poros. Se sabe tambien que algunos dominios de translocacion de protemas de fusion de membrana expresadas de forma vmca son capaces de formar dichos poros. Tales dominios pueden emplearse en la presente invencion.
El dominio de translocacion puede ser de origen clostridial, es decir, el dominio Hn (o un componente funcional del mismo). Hn significa una porcion o fragmento de la cadena H de una neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente a la mitad en el extremo amino de la cadena H, o el dominio correspondiente a ese fragmento en la cadena H intacta. Se prefiere que la cadena H carezca sustancialmente de la funcion de union natural del componente He de la cadena H. A este respecto, la funcion He puede eliminarse por delecion de la secuencia de aminoacidos He (en el nivel de smtesis de ADN o despues de la smtesis por tratamiento con nucleasas o proteasas). Alternativamente, la funcion He puede inactivarse mediante tratamiento qmmico o biologico. Asf, la cadena H es preferiblemente incapaz de unirse al sitio de union en una celula diana a la que se une una neurotoxina clostridial nativa (p. ej., holotoxina).
En una realizacion, el dominio de translocacion es un dominio Hn (o un fragmento del mismo) de una neurotoxina clostridial. Entre los ejemplos de dominios de translocacion clostridiales se incluyen:
Neurotoxina botulmica tipo A - residuos de aminoacidos (449-871)
Neurotoxina botulmica tipo B - residuos de aminoacidos (441-858)
Neurotoxina botulmica tipo C - residuos de aminoacidos (442-866)
Neurotoxina botulmica tipo D - residuos de aminoacidos (446-862)
Neurotoxina botulmica tipo E - residuos de aminoacidos (423-845)
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Neurotoxina botulmica tipo F - residuos de aminoacidos (440-864)
Neurotoxina botulmica tipo G - residuos de aminoacidos (442-863)
Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacidos (458-879)
Para detalles adicionales acerca de la base genetica de produccion de toxinas en Clostridium botulinum y C. tetani, se remite a Henderson et al. (1997) en The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press.
El termino Hn comprende porciones de neurotoxina Hn de ocurrencia natural, y porciones de Hn modificadas que tienen secuencias de aminoacidos que no estan presentes en la naturaleza y/o residuos de aminoacidos sinteticos, siempre que las porciones de Hn modificadas sigan demostrando la funcion de translocacion antes mencionada.
Alternativamente, el dominio de translocacion puede tener un origen no clostridial (vease Tabla 4). Los ejemplos de offgenes de dominios de translocacion no clostridiales incluyen, pero no se limitan a, el dominio de translocacion de toxina difterica [O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; y London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pag. 25-51], el dominio de translocacion de exotoxina de Pseudomonas tipo A [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], los dominios de translocacion de toxina del antrax [Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442], una variedad de peptidos fusogenos o hidrofobos de funcion de translocacion [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; y Wagner et al. (1992) PNAS, 89, pag. 7934-7938] y peptidos anfffilos [Murata et al. (1992) Biochem., 31, pag. 19861992]. El dominio de translocacion puede reflejar el dominio de translocacion presente en una protema de ocurrencia natural, o puede incluir variaciones de aminoacidos siempre que las variaciones no destruyan la capacidad de translocacion del dominio de translocacion.
Los ejemplos particulares de dominios de translocacion vfficos adecuados para su uso en la presente invencion incluyen ciertos dominios de translocacion de protemas de fusion de membrana expresadas de forma vmca. Por ejemplo, Wagner et al. (1992) y Murata et al. (1992) describen la funcion de translocacion (p. ej., fusion de membrana y vesiculacion) de una serie de peptidos fusogenos y anfffilos derivados de la region en el extremo N de la hemaglutinina del virus de la gripe. Otras protemas de fusion de membrana expresadas de forma vmca que, segun se sabe, tienen la actividad de translocacion deseada son un dominio de translocacion de un peptido fusogeno del virus del bosque de Semliki (VBS), un dominio de translocacion de glucoprotema G del virus de estomatitis vesicular (VEV), un dominio de translocacion de protema F del virus SER y un dominio de translocacion de la glucoprotema de la envoltura de espumavirus. Las protemas Aspike codificadas de forma vmca tienen una aplicacion especial en el contexto de la presente invencion, por ejemplo, la protema E1 de VBS y la protema G de la protema G de VEV.
El uso de los dominios de translocacion enumerados en la Tabla (mostrada a continuacion) incluye el uso de variantes de secuencia de los mismos. Una variante puede comprender una o mas sustituciones de acidos nucleicos y/o deleciones o inserciones de acidos nucleicos conservadores, con la salvedad de que la variante posea la funcion de translocacion requerida. Una variante puede comprender tambien una o mas sustituciones de aminoacidos y/o deleciones o inserciones de aminoacidos, siempre que la variante posea la funcion de translocacion requerida.
Fuente de dominios de translocacion
Residuos de aminoacidos Referencias
Toxina difterica
194-380 Silverman et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524-22532 London E., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51
Exotoxina de dominio II de pseudomonas
405-613 Prior et al., 1992, Biochemistry 31, 3555-3559 Kihara & Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538
Hemaglutinina del virus de la gripe
GLFGAIAGFIENGWE GMIDGWYG, y variantes de la misma Plank et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924 Wagner et al., 1992, PNAS, 89, 7934-7938 Murata et al., 1992, Biochemistry 31, 1986-1992
Protema fusogena del virus del bosque de Semliki
Dominio de translocacion Kielian et al., 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872
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Glucoprotema G del virus de estomatitis vesicular
118-139 Yao et al., 2003, Virology 310(2), 319-332
Protema F del virus SER
Dominio de translocacion Seth et al., 2003, J Virol 77(11) 6520-6527
Glucoprotema de envoltura de espumavirus
Dominio de translocacion Picard-Maureau et al., 2003, J Virol. 77(8), 4722-4730
Figuras
Figura 1 Purificacion de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A
Figura 2 Purificacion de una protema de fusion de nociceptina-LC/A-HN/A
Figura 3 Purificacion de una protema de fusion de LC/C-nociceptina-HN/C
Figura 4 Purificacion de una protema de fusion de LC/A-met encefalina-HN/A
Figura 5 Comparacion de la eficacia de union de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A y una protema de fusion de nociceptina-LC/A-HN/A
Figura 6 Actividad catalttica in vitro de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A Figura 7 Purificacion de una protema de fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A
Figura 8 Comparacion de la eficacia de union de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A y una protema de fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A
Figura 9 Familia de protemas de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A expresadas/purificadas con producto o productos de longitud de separacion variable
Figura 10 Inhibicion de liberacion de SP y escision de SNAP-25 por CPN-A
Figura 11 Inhibicion de liberacion de SP y escision de SNAP-25 durante periodos de tiempo extensos despues de exposicion de GRD a CPN-A
Figura 12 Escision de SNAP-25 por CPNv-A
Figura 13 Escision de SNAP-25 durante periodos de tiempo extensos despues de exposicion de GRD a CPNv-A
Figura 14 Desplazamiento mediado por fusion de CPNv-A de union a [3H]-nociceptina
Figura 15 Producto CPNv(Ek)-A expresado/purificado
Figura 16 Escision de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A
Figura 17 Producto CPNv-C expresado/purificado
Figura 18 Escision de sintaxina por CPNv-C
Figura 19 Eficacia de CPN-A en el modelo de alodinia mecanica inducida por capsaicina aguda
Figura 20 Eficacia de CPN-A en el modelo de neuropatfa diabetica periferica (dolor neuropatico) inducida por estreptozotocina (STZ)
Figura 21 Eficacia de CPNv-A en el modelo de alodinia mecanica inducida por capsaicina aguda
Figura 22 Producto LC/A-CPLE-Hn/A expresado/purificado
Figura 23 Producto LC/A-CPBE-Hn/A expresado/purificado
Figura 24 Producto CPOP-A expresado/purificado
Figura 25 Producto CPOPv-A expresado/purificado
Figura 26 Escision de SNAP-25 in vitro en un modelo celular de GRD
Figura 27 CPNv-A-FXa-HT expresado/purificado (marca His eliminable)
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Figura 28 Eficacia in vitro de protemas de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A con longitud evaluado por ensayo de competicion de ligandos
Figura 29 Eficacia in vitro de protemas de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A con longitud evaluado por escision in vitro de SNAP-25
A continuacion se describen las Figuras en mas detalle.
Figura 1 - Purificacion de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A
de separador variable, de separador variable,
Usando la metodologfa indicada en el Ejemplo 9, se purifico una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A de celulas BL21 de E. coli. Brevemente, los productos solubles obtenidos despues de desorganizacion celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad con carga de rnquel. Se eluyeron las protemas ligadas con imidazol 100 mM, se trataron con Factor Xa para activar la protema de fusion y eliminar la marca de protema de union a maltosa (MBP), a continuacion se volvieron a aplicar a una segunda captura de afinidad con carga de rnquel. Se evaluaron las muestras del procedimiento de purificacion SDS-PAGE (Panel A) y transferencia Western (Panel B). Los antisueros de antinociceptina (obtenidos de Abcam) se usaron como anticuerpo primario para transferencia Western. El material final purificado en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las pistas marcadas como [-] y [+] respectivamente.
Figura 2 - Purificacion de una protema de fusion de nociceptina-LC/A-HN/A
Usando la metodologfa indicada en el Ejemplo 9, se purifico una protema de fusion de nociceptina-LC/A-HN/A de celulas BL21 de E. coli. Brevemente, los productos solubles obtenidos despues de desorganizacion celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad con carga de rnquel. Se eluyeron las protemas ligadas con imidazol 100 mM, se trataron con Factor Xa para activar la protema de fusion y eliminar la marca de protema de union a maltosa (MBP), a continuacion se volvieron a aplicar a una segunda captura de afinidad con carga de rnquel. Se evaluaron las muestras del procedimiento de purificacion SDS-PAGE (Panel A) y transferencia Western (Panel B). Los antisueros de antinociceptina (obtenidos de Abcam) se usaron como anticuerpo primario para transferencia Western. El material final purificado en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las pistas marcadas como [-] y [+] respectivamente.
Figura 3 - Purificacion de una protema de fusion de LC/C-nociceptina-HN/C
Usando la metodologfa indicada en el Ejemplo 9, se purifico una protema de fusion de LC/C-nociceptina-HN/C de celulas BL21 de E. coli. Brevemente, los productos solubles obtenidos despues de desorganizacion celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad con carga de rnquel. Se eluyeron las protemas ligadas con imidazol 100 mM, se trataron con Factor Xa para activar la protema de fusion y eliminar la marca de protema de union a maltosa (MBP), a continuacion se volvieron a aplicar a una segunda captura de afinidad con carga de rnquel. Se evaluaron las muestras del procedimiento de purificacion SDS-PAGE (Panel A) y transferencia Western (Panel B). Los antisueros de antinociceptina (obtenidos de Abcam) se usaron como anticuerpo primario para transferencia Western. El material final purificado en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las pistas marcadas como [-] y [+] respectivamente.
Figura 4 - Purificacion de una protema de fusion de LC/A-met encefalina-HNA
Usando la metodologfa indicada en el Ejemplo 9, se purifico una protema de fusion de LC/A-met encefalina-HN/A de celulas BL21 de E. coli. Brevemente, los productos solubles obtenidos despues de desorganizacion celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad con carga de rnquel. Se eluyeron las protemas ligadas con imidazol 100 mM, se trataron con Factor Xa para activar la protema de fusion y eliminar la marca de protema de union a maltosa (MBP), a continuacion se volvieron a aplicar a una segunda captura de afinidad con carga de rnquel. Se evaluaron las muestras del procedimiento de purificacion SDS-PAGE. El material final purificado en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las pistas marcadas como [-] y [+] respectivamente.
Figura 5 - Comparacion de la eficacia de union de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A y una protema de fusion de nociceptina-LC/A-HN/A
Se evaluo la capacidad de las fusiones de nociceptina de unirse al receptor ORL1 usando un sencillo ensayo basado en la competencia. Los cultivos primarios de ganglios de las rames dorsales (GRD) se expusieron a concentraciones variables de material de ensayo en presencia de [3H]-nociceptina 1 nM. Se evaluo la reduccion en la union espedfica del ligando radiomarcado por recuento por centello, y se represento graficamente en comparacion con la eficacia de ligando no marcado (nociceptina Tocris). Esta claro que la fusion de LC/A-nociceptina-HN/A es muy superior a la fusion de nociceptina-LC/A-HN/A en la interaccion con el receptor ORL1.
Figura 6 - Actividad catalttica in vitro de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A
Se determino la actividad de la endopeptidasa in vitro de la protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A purificada esencialmente como se describe en Chaddock et al. 2002, Prot. Express Purif. 25, 219-228. Brevemente, se expuso
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el peptido SNAP-25 inmovilizado en una placa ELISA a concentraciones variables de protema de fusion durante 1 hora a 37°C. Despues de una serie de lavados, se cuantifico la cantidad de peptido SNAP-25 escindido por reactividad con un antisuero espedfico.
Figura 7 - Purificacion de una protema de fusion de LC/A-variante de nociceptina-HNA
Usando la metodologfa indicada en el Ejemplo 9, se purifico una protema de fusion de LC/A-variante de nociceptina- Hn/A de celulas BL21 de E. coli. Brevemente, los productos solubles obtenidos despues de desorganizacion celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad con carga de mquel. Se eluyeron las protemas ligadas con imidazol 100 mM, se trataron con Factor Xa para activar la protema de fusion y eliminar la marca de protema de union a maltosa (MBP), a continuacion se volvieron a aplicar a una segunda captura de afinidad con carga de mquel. Se evaluaron las muestras del procedimiento de purificacion SDS-PAGE. El material final purificado en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las pistas marcadas como [-] y [+] respectivamente.
Figura 8 - Comparacion de la eficacia de union de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A y una protema de fusion de LC/A-variante de nociceptina-HNA
Se evaluo la capacidad de las fusiones de nociceptina de unirse al receptor ORL1 usando un sencillo ensayo basado en la competencia. Los cultivos primarios de ganglios de las rames dorsales (GRD) se expusieron a concentraciones variables de material de ensayo en presencia de [3H]-nociceptina 1 nM. Se evaluo la reduccion en la union espedfica del ligando radiomarcado por recuento por centello, y se represento graficamente en comparacion con la eficacia de ligando no marcado (nociceptina Tocris). Esta claro que la fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A (CPNv-LHA) es superior a la fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A (CPN-LHA) en la interaccion con el receptor ORL1.
Figura 9 - Familia de protemas de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A expresadas/purificadas con producto o productos de longitud de separacion variable
Usando la metodologfa indicada en el Ejemplo 9, se purifican variantes de la fusion de LC/A-CPN-Hn/A que consisten en GS10, GS30 y HX27 de pasta celular de E. coli. Las muestras de la purificacion de LC/A-CPN(GS10)- Hn/A, LC/A CPN(GS15)-Hn/A, LC/A-CPN(GS25)-Hn/A, LC/A-CPN(GS30)-Hn/A y LC/A-CPN(HX27)-Hn/A se evaluaron por SDS-PAGE antes de tincion con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificacion de una especie bicatenaria unida por enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPBE-A. Panel superior: M = marcadores de masa molecular de referencia; S = fraccion soluble de protemas de E. coli total; FT = protemas que no se unen a la columna de Sefarosa cargada con Ni2+; FUSION = protema de fusion eluida por la adicion de imidazol. Panel inferior: Pista 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Pista 2 = fraccion soluble de protemas de E. coli total; Pista 3 = material purificado despues de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 4 = material tratado con Factor Xa antes de la captura final en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 5 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (5 |il); Pista 6 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (10 |il); Pista 7 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (20 |il); Pista 8 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (5 |il); Pista 9 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (10 |il); Pista 10 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (20 |il).
Figura 10 - Inhibicion de liberacion de SP y escision de SNAP-25 por CPN-A
Brevemente, se expusieron cultivos primarios de ganglios de las rafces dorsales (GRD) a concentraciones variables de CPN-A durante 24 horas. Las protemas celulares se separaron por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una evaluacion de la escision de SNAP-25. El porcentaje de SNAP-25 escindido se calculo por analisis densitometrico y se represento graficamente con respecto a la concentracion de fusion (lmea discontinua). El material se recupero tambien para un analisis de contenido de sustancia P usando un kit EIA espedfico. La inhibicion de liberacion de sustancia P se ilustra por la lmea continua. La concentracion de fusion requerida para alcanzar el 50% de escision maxima de SNAP-25 se estima en 6,30 ± 2,48 nM.
Figura 11 - Inhibicion de liberacion de SP y escision de SNAP-25 durante periodos de tiempo extensos despues de exposicion de GRD a CPN-A
Se expusieron cultivos primarios de ganglios de las rames dorsales (GRD) a concentraciones variables de CPN-A durante 24 horas. Se uso neurotoxina botulmica (BoNT/A) como control. Despues de esta exposicion inicial, se elimino el material extracelular por lavado, y se incubaron las celulas a 37°C durante periodos de tiempo variables. En instantes de tiempo espedficos, las protemas celulares se separaron por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una evaluacion de la escision de SNAP-25. El porcentaje de SNAP-25 escindido se calculo por analisis densitometrico y se ilustra por las lmeas discontinuas. El material se recupero tambien para un analisis de contenido de sustancia P usando un kit EIA espedfico. La inhibicion de liberacion de sustancia P se ilustra por las lmeas continuas.
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Figura 12 - Escision de SNAP-25 por CPNv-A
Se expusieron cultivos primarios de ganglios de las rames dorsales (GRD) a concentraciones variables de CPNv-A durante 24 horas. Las protemas celulares se separaron por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una evaluacion de la escision de SNAP-25. El porcentaje de SNAP-25 escindido se calculo por analisis densitometrico. La concentracion de fusion requerida para alcanzar el 50% de escision maxima de SNAP-25 se estima en 1,38 ± 0,36 nM.
Figura 13 - Escision de SNAP-25 durante periodos de tiempo extensos despues de exposicion de GRD a CPNv-A
Se expusieron cultivos primarios de ganglios de las rafces dorsales (GRD) a concentraciones variables de CPNv-A durante 24 horas. Se uso CPN-A como control. Despues de esta exposicion inicial, se elimino el material extracelular por lavado, y se incubaron las celulas a 37°C durante periodos de tiempo variables. En instantes de tiempo espedficos, las protemas celulares se separaron por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una evaluacion de la escision de SNAP-25. El porcentaje de SNAP-25 escindido se calculo por analisis densitometrico.
Figura 14 - Desplazamiento mediado por fusion de CPNv-A de union a [3H]-nociceptina
La capacidad de las fusiones de nociceptina de unirse al receptor ORL1 se evaluo usando un sencillo ensayo basado en la competencia. Los cultivos primarios de ganglios de las rafces dorsales (GRD) se expusieron a concentraciones variables de material de ensayo en presencia de [3H]-nociceptina 1 nM. Se evaluo la reduccion en la union espedfica del ligando radiomarcado por recuento por centello, y se represento graficamente en comparacion con la eficacia de ligando no marcado (nociceptina Tocris). Esta claro que la fusion de LC/A-nociceptina variante-HN/A (marcada como CPNv-LHnA) es superior a la fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (marcada como CPNLHnA) en la interaccion con el receptor ORL1.
Figura 15 - Producto CPNv(Ek)-A expresado/purificado
Las protemas se sometieron a SDS-PAGE antes de tincion con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificacion de una especie bicatenaria unida por enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPNv(Ek)- A. Pista 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Pista 2 = fraccion soluble de protemas de E. coli total; Pista 3 = material purificado despues de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 4 = material final purificado despues de activacion con enterocinasa (5 |il); Pista 5 = material final purificado despues de activacion con enterocinasa (10 |il); Pista 6 = material final purificado despues de activacion con enterocinasa (20 |il); Pista 7 = material final purificado despues de activacion con enterocinasa + DTT (5 |il); Pista 8 = material final purificado despues de activacion con enterocinasa + DTT (10 |il); Pista 9 = material final purificado despues de activacion con enterocinasa + DTT (20 |il).
Figura 16 - Escision de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A
Se expusieron cultivos primarios de ganglios de las rafces dorsales (GRD) a concentraciones variables de CPNv(Ek)-A durante 24 horas. Las protemas celulares se separaron por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una evaluacion de la escision de SNAP-25. El porcentaje de SNAP-25 escindido se calculo por analisis densitometrico. Se uso CPNv-A preparado como en el Ejemplo 9 con fines de comparacion. Se ilustra el porcentaje escision de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A (marcado como En activado) y CPNv-A (marcado como Xa activado).
Figura 17 - Producto CPNv-C expresado/purificado
Las protemas se sometieron a SDS-PAGE antes de tincion con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificacion de una especie bicatenaria unida por enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPNv-C. Pista 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Pista 2 = fraccion soluble de protemas de E. coli total; Pista 3 = material purificado despues de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 4 = material tratado con Factor Xa antes de la captura final en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 5 = material purificado despues de segunda captura en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 6 = material final purificado; Pista 7 = material final purificado + DTT; Pista 8 = marcadores de masa molecular de referencia.
Figura 18 - Escision de sintaxina por CPNv-C
Se expusieron cultivos primarios de ganglios de las rafces dorsales (GRD) a concentraciones variables de CPNv-C durante 24 horas. Las protemas celulares se separaron por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-sintaxina para facilitar una evaluacion de escision de sintaxina. El porcentaje de sintaxina escindida se calculo por analisis densitometrico. La concentracion de fusion requerida para alcanzar el 50% de escision de sintaxina maxima se estima en 3,13 ± 1,96 nM.
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Figura 19 - Eficacia de CPN-A en el modelo de alodinia mecanica inducida por capsaicina aguda
Se evaluo la capacidad de una fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inhibir la alodinia mecanica inducida por capsaicina despues de inyeccion intraplantar subcutanea en la pata trasera de una rata. Se evaluo en los animales la frecuencia de retirada de la pata (%FRP) en respuesta a una serie de estfmulos de filamento de Von Frey de 10 g (10 estimulos x 3 ensayos) antes de la inclusion en el estudio (Pretratamiento); despues de tratamiento intraplantar subcutaneo con CPN/A pero antes de capsaicina (Pre-CAP); y posteriormente a la inyeccion de provocacion de capsaicina de CPN/A (media de respuestas a 15' y 30'; CAP). La provocacion con capsaicina se consiguio por inyeccion de 10 |iL de una solucion al 0,3%. Se prepararon diluciones de la muestra en BSA/suero salino al 0,5%.
Figura 20 - Eficacia de CPN-A en el modelo de neuropatfa diabetica periferica (dolor neuropatico) inducida por estreptozotocina (STZ)
Se tratan ratas Sprague-Dawley macho (250-300 g) con 65 mg/kg de STZ en tampon de citrato (I.V.) y se miden la glucosa y los lfpidos en sangre semanalmente para definir el buen funcionamiento del modelo. Se mide el umbral de retirada de la pata (URP) en respuesta a una serie de estfmulos de filamento de Von Frey durante un periodo de tiempo. Se dice que se establece la alodinia cuando el URP en dos fechas de ensayo consecutivas (separadas por 1 semana) mide menos de 6 g en la escala. En este punto, se aleatoriza a las ratas en un grupo de suero salino (control de eficacia negativo), un grupo de gabapentina (control de eficacia positivo) o un grupo de ensayo (CPN/A). Se inyectan materiales de ensayo (20-25 |il) por via subcutanea como una unica inyeccion (excepto gabapentina) y se mide el URP 1 dfa despues del tratamiento y posteriormente de forma periodica durante un periodo de 2 semanas. La gabapentina (30 mg/kg i.p. @ 3 ml/kg de volumen de inyeccion) se inyecta diariamente, 2 horas antes del inicio del ensayo de URP.
Figura 21 - Eficacia de CPNv-A en el modelo de alodinia mecanica inducida por capsaicina aguda
Se evaluo la capacidad de una fusion de LC/A-variante de nociceptina-HNA (CPNv/A) para inhibir la alodinia mecanica inducida por capsaicina despues de inyeccion intraplantar subcutanea en la pata trasera de una rata. Se evaluo en los animales la frecuencia de retirada de la pata (%FRP) en respuesta a una serie de estfmulos de filamento de Von Frey de 10 g (10 estfmulos x 3 ensayos) antes de la inclusion en el estudio (Pretratamiento), despues de tratamiento intraplantar subcutaneo con CPNv/A pero antes de capsaicina (Pre-CAP) y posteriormente a la inyeccion de provocacion de capsaicina de CPNv/A (media de respuestas a 15' y 30'; CAP). La provocacion con capsaicina se consiguio por inyeccion de 10 |iL de una solucion al 0,3%. Se prepararon diluciones de la muestra en BSA/suero salino al 0,5%. Estos datos se expresan como un diferencial de frecuencia de retirada de la pata normalizado, en el que la diferencia entre la respuesta maxima (post-capsaicina) y la respuesta de base (pre- capsaicina) se expresa en forma de porcentaje. Con este analisis, puede verse que CPNv/A es mas potente que CPN/A dado que se requiere una dosis menor de CPNv/A para alcanzar un efecto analgesico similar al observado con CPN/A.
Figura 22 - Producto LC/A-CPLE-Hn/A expresado/purificado
Las protemas se sometieron a SDS-PAGE antes de tincion con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificacion de una especie bicatenaria unida por enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPLE-A. Pista 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Pista 2 = fraccion soluble de protemas de E. coli total; Pista 3 = material purificado despues de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 4 = material tratado con Factor Xa antes de la captura final en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 5 = material purificado despues de segunda captura en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 6 = material final purificado; Pista 7 = material final purificado + DTT.
Figura 23 - Producto LC/A-CPBE-Hn/A expresado/purificado
Las protemas se sometieron a SDS-PAGE antes de tincion con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificacion de una especie bicatenaria unida por enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPBE-A. Pista 1 = fraccion soluble de protemas de E. coli total; Pista 2 = material purificado despues de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 3 = material tratado con Factor Xa antes de la captura final en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 4 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (5 |il); Pista 5 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (10 |il); Pista 6 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (20 |il); Pista 7 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (5 |il); Pista 8 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (10 |il); Pista 9 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (20 |il); Pista 10 = marcadores de masa molecular de referencia.
Figura 24 - Producto CPOP-A expresado/purificado
Las protemas se sometieron a SDS-PAGE antes de tincion con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificacion de una especie bicatenaria unida por enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPOP-A. Pista 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Pista 2 = material purificado despues de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 3 = material tratado con Factor Xa antes de la captura final en Sefarosa cargada
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con Ni2+; Pista 4 = material purificado despues de segunda captura en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 5 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (5 |il); Pista 6 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (10 |il); Pista 7 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (20 |il); Pista 8 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (5 |il); Pista 9 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (10 |il); Pista 10 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (20 |il).
Figura 25 - Producto CPOPv-A expresado/purificado
Las protemas se sometieron a SDS-PAGE antes de tincion con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificacion de una especie bicatenaria unida por enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPOPv-A. Pista 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Pista 2 = fraccion soluble de protemas de E. coli total; Pista 3 = material purificado despues de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 4 = material tratado con Factor Xa antes de la captura final en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 5 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (5 |il); Pista 6 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (10 |il); Pista 7 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa (20 |il); Pista 8 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (5 |il); Pista 9 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (10 |il); Pista 10 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + DTT (20 |il).
Figura 26 - Escision in vitro de SNAP-25 en un modelo celular de GRD
Se expusieron cultivos primarios de ganglios de las rafces dorsales (GRD) a concentraciones variables de CPOPv-A durante 24 horas. Las protemas celulares se separaron por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una evaluacion de la escision de SNAP-25. El porcentaje de SNAP-25 escindido se calculo por analisis densitometrico.
Figura 27 - CPNv-A-FXa-HT expresado/purificado (marca His eliminable)
Las protemas se sometieron a SDS-PAGE antes de tincion con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificacion de una especie bicatenaria unida por enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPNv-A- FXa-HT. Pista 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Pista 2 = fraccion soluble de protemas de E. coli total; Pista 3 = material tratado con Factor Xa antes de la captura final en Sefarosa cargada con Ni2+; Pista 4 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa; Pista 5 = material final purificado despues de activacion con Factor Xa + dTt.
Figura 28 - Eficacia in vitro de protemas de fusion de LC/A-nociceptina-HNA con longitud de separador variable, evaluada por ensayo de competicion de ligandos
Se evaluo la capacidad de las fusiones de LC/A-nociceptina-HN/A de longitud de separador variable de unirse al receptor ORL1 usando un sencillo ensayo basado en la competencia. Los cultivos primarios de ganglios de las rames dorsales (GRD) se expusieron a concentraciones variables de material de ensayo en presencia de [3H]-nociceptina 1 nM. Se evaluo la reduccion en la union espedfica del ligando radiomarcado por recuento por centello, y se represento graficamente en comparacion con la eficacia de ligando no marcado (nociceptina Tocris). El panel superior ilustra las caractensticas de desplazamiento de los separadores GS0, GS20, GS30 y Hx27, mientras que el panel inferior ilustra el desplazamiento alcanzado por las protemas de fusion separadas GS10, GS15 y GS25. Se concluye que los separadores GS0 y GS30 son ineficaces, y el GS10 es poco eficaz, en el desplazamiento de nociceptina del receptor ORL1.
Figura 29 - Eficacia in vitro de protemas de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A con longitud de separador variable, evaluada por escision in vitro de SNAP-25
Se expusieron cultivos primarios de ganglios de las rames dorsales (GRD) a concentraciones variables de CPN-A (de longitud de separador variable) durante 24 horas. Las protemas celulares se separaron por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una evaluacion de la escision de SNAP-25. El porcentaje de SNAP-25 escindido se calculo por analisis densitometrico. Las caractensticas de union poco eficaces de la protema de fusion separada GS10 (vease Figura 28) se reflejan en las mayores concentraciones de fusion requeridas para alcanzar la escision de SNAP-25 intracelular. Las protemas de fusion separadas GS0 y GS30 fueron completamente ineficaces (datos no mostrados). Las protemas de fusion separadas GS15, 20 y 25 fueron eficaces de forma similar.
SEQ ID NO
SEQ ID1 Secuencia de ADN de LC/A SEQ ID2 Secuencia de ADN de Hn/A SEQ ID3 Secuencia de ADN de LC/B
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15
20
25
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SEQ ID4 Secuencia de ADN de Hn/B
SEQ ID5 Secuencia de ADN de LC/C
SEQ ID6 Secuencia de ADN de Hn/C
SEQ ID7 Secuencia de ADN del grupo enlazador CPN-A
SEQ ID8 Secuencia de ADN del grupo enlazador A
SEQ ID9 Secuencia de ADN de la insercion de nociceptina de presentacion en el extremo N
SEQ ID10 Secuencia de ADN del grupo enlazador CPN-C
SEQ ID11 Secuencia de ADN del grupo enlazador CPBE-A
SEQ ID12 Secuencia de ADN del grupo enlazador CPNvar-A
SEQ ID13 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPN-Hn/A
SEQ ID14 Secuencia de protemas de fusion de LC/A-CPN-Hn/A
SEQ ID15 Secuencia de ADN de fusion de N-LC/A-Hn/A
SEQ ID16 Secuencia de protemas de fusion de N-LC/A-Hn/A
SEQ ID17 Secuencia de ADN de fusion de LC/C-CPN-Hn/C
SEQ ID18 Secuencia de protemas de fusion de LC/C-CPN-Hn/C
SEQ ID19 Secuencia de ADN de fusion de LC/C-CPN-Hn/C (grupo enlazador A)
SEQ ID20 Secuencia de protemas de fusion de LC/C-CPN-Hn/C (grupo enlazador A)
SEQ ID21 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPME-Hn/A SEQ ID22 Secuencia de protemas de fusion de LC/A-CPME-Hn/A SEQ ID23 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPBE-Hn/A SEQ ID24 Secuencia de protemas de fusion de LC/A-CPBE-Hn/A SEQ ID25 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPNv-Hn/A SEQ ID26 Secuencia de protemas de fusion de LC/A-CPNv-Hn/A SEQ ID27 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPN[1-11]-Hn/A SEQ ID28 Secuencia de protemas de fusion de LC/A-CPN[1-11]-Hn/A SEQ ID29 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPN[[Y10]1-11]-Hn/A SEQ ID30 Secuencia de protemas de fusion de LC/A-CPN[[Y10]1-11]-Hn/A SEQ ID31 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPN[[Y11]1-11]-Hn/A SEQ ID32 Secuencia de protemas de fusion de LC/A-CPN[[Y11]1-11]-Hn/A SEQ ID33 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPN[[Y14]1-17]-Hn/A SEQ ID34 Secuencia de protemas de fusion de LC/A-CPN[[Y14]1-17]-Hn/A SEQ ID35 Secuencia de ADN de fusion de LC/A-CPN[1-13]-Hn/A SEQ ID36 Secuencia de protemas de fusion de LC/A- CPN[1-13]-Hn/A SEQ ID37 Secuencia de ADN de CPN[1-17]
SEQ ID38 Secuencia de protemas de CPN[1-17]
SEQ ID39 Secuencia de ADN de CPN[1-11]
SEQ ID40 Secuencia de protemas de CPN[1-11]
5
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20
25
30
35
SEQ
ID41 Secuencia de
SEQ
ID42 Secuencia de
SEQ
ID43 Secuencia de
SEQ
ID44 Secuencia de
SEQ
ID45 Secuencia de
SEQ
ID46 Secuencia de
SEQ
ID47 Secuencia de
SEQ
ID48 Secuencia de
SEQ
ID49 Secuencia de
SEQ
ID50 Secuencia de
SEQ
ID51 Secuencia de
SEQ
ID52 Secuencia de
SEQ
ID53 Secuencia de
SEQ
ID54 Secuencia de
SEQ
ID55 Secuencia de
SEQ
ID56 Secuencia de
SEQ
ID57 Secuencia de
SEQ
ID58 Secuencia de
SEQ
ID59 Secuencia de
SEQ
ID60 Secuencia de
SEQ
ID61 Secuencia de
SEQ
ID62 Secuencia de
SEQ
ID63 Secuencia de
SEQ
ID64 Secuencia de
SEQ
ID65 Secuencia de
SEQ
ID66 Secuencia de
SEQ
ID67 Secuencia de
SEQ
ID68 Secuencia de
SEQ
ID69 Secuencia de
SEQ
ID70 Secuencia de
SEQ
ID71 Secuencia de
SEQ
ID72 Secuencia de
SEQ
ID73 Secuencia de
SEQ
ID74 Secuencia de
SEQ
ID75 Secuencia de
SEQ
ID76 Secuencia de
SEQ
ID77 Secuencia de
ADN de CPN[[Y10]1-11] protemas de CPN[[Y10]1-11]
ADN de CPN[[Y11]1-11] protemas de CPN[[Y11]1-11]
ADN de CPN[[Y14]1-17] protemas de CPN[[Y14]1-17]
ADN de CPN[1-13] protemas de CPN[1-13]
ADN de CPNv (tambien conocida como N[[R14K15]1-17])
protemas de CPNv (tambien conocida como N[[R14K15]1-17])
ADN de fusion de nociceptina-separador-LC/A-HN/A
protemas de fusion de nociceptina-separador-LC/A-HN/A
ADN de grupo enlazador CPN-A GS10
ADN de grupo enlazador CPN-A GS15
ADN de grupo enlazador CPN-A GS25
ADN de grupo enlazador CPN-A GS30
ADN de grupo enlazador CPN-A HX27
ADN de fusion de LC/A-CPN(GS15)-Hn/A
protemas de fusion de LC/A-CPN(GS15)-Hn/A
ADN de fusion de LC/A-CPN(GS25)-HN/A
protemas de fusion de LC/A-CPN(GS25)-Hn/A
ADN del grupo enlazador activable de CPNvar-A Enterocinasa
ADN de fusion de LC/A-CPNv(Ek)-HN/A
protemas de fusion de LC/A-CPNv(Ek)-HNA
ADN del grupo enlazador CPNvar-A
ADN de fusion de LC/C-CPNv-Hn/C (acc. A)
protemas de fusion de LC/C-CPNv-Hn/C (acc. A)
ADN de fusion de LC/A-CPLE-HN/A protemas de fusion de LC/A-CPLE-Hn/A ADN de fusion de LC/A-CPOP-Hn/A protemas de fusion de LC/A-CPOP-Hn/A ADN de fusion de LC/A-CPOPv-Hn/A protemas de fusion de LC/A-CPOPv-Hn/A ADN de la proteasa de IgA ADN de fusion de IgA-CPNv-HN/A protemas de fusion de IgA-CPNv-HN/A ADN de FXa-HT
SEQ ID78 Secuencia de ADN de CPNv-A-FXa-HT SEQ ID79 Secuencia de protemas de fusion de CPNv-A-FXa-HT SEQ ID80 Secuencia de ADN del dominio de translocacion DR SEQ ID81 Secuencia de ADN de CPLE-DT-A 5 SEQ ID82 Secuencia de protemas de fusion de CPLE-DT-A SEQ ID83 Secuencia de ADN de TeNT LC SEQ ID84 Secuencia de ADN de CPNv-TENT LC SEQ ID85 Secuencia de protemas de fusion de CPNV-TeNT LC SEQ ID86 Secuencia de ADN de grupo enlazador CPNvar-C 10 SEQ ID87 Secuencia de ADN de fusion de LC/C-CPNv-Hn/C (acc. C)
SEQ ID88 Secuencia de protemas de fusion de LC/C-CPNv-Hn/C (acc. C)
Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparacion de clones de la estructura principal de LC/A y Hn/A
El siguiente procedimiento crea los fragmentos LC y Hn para su uso como estructura principal de componentes para 15 expresion de fusion multidominio. Este ejemplo se basa en la preparacion de un clon basado en serotipo A (SEQ ID1 y SEQ ID2), aunque los procedimientos y metodos son igualmente aplicables a los otros serotipos ilustrados por el listado de secuencias para el serotipo B (SEQ ID3 y SEQ ID4) y el serotipo C (SEQ ID5 y SEQ lD6)].
Preparacion de vectores de clonacion y de expresion
pCR 4 (Invitrogen) es el vector de clonacion estandar escogido, seleccionado debido a la ausencia de secuencias de 20 restriccion en el vector y los sitios de cebadores de secuenciacion adyacentes para una facil confirmacion de la construccion. El vector de expresion se basa en el vector de expresion de pMAL (NEB), que tiene las secuencias de restriccion deseadas en el sitio de clonacion multiple en la orientacion correcta para la insercion de la construccion (BamHI-SalI-PstI-HindIII). Se ha eliminado un fragmento del vector de expresion para crear un plasmido no movilizable y se ha introducido una variedad de diferentes marcas de fusion para aumentar las opciones de 25 purificacion.
Preparacion de la insercion de proteasa (p. ej., LC/A)
La LC/A (SEQ ID1) se crea mediante una de dos formas:
La secuencia de ADN se disena por traduccion inversa de secuencias de aminoacidos de LC/A [obtenidos de fuentes de bases de datos de disposicion libre como GenBank (n° de entrada P10845) o Swissprot (lugar de entrada 30 BXA1_CLOBO) usando una de entre una variedad de herramientas de programa de traduccion inversa (por ejemplo, traduccion inversa de E. coli EditSeq best (DNASTAR Inc.) o herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. Las secuencias de reconocimiento BamHI/Sall se incorporan en los extremos 5' y 3' respectivamente de la secuencia, que mantiene el marco de lectura correcto. La secuencia de ADN es rastreada (usando un programa como MapDraw, DNASTAR Inc.) para secuencias de escision de enzimas de restriccion incorporadas durante la traduccion 35 inversa. Cualquier secuencia de escision que se encuentre en comun con las requeridas por el sistema de clonacion se elimina manualmente de la secuencia de codificacion propuesta que asegura que el uso de codones de E. coli comun se mantiene. El uso de codones de E. coli se evalua por referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el contenido de %GC y la proporcion del uso de codones se evaluan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). 40 Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el marco de lectura abierta (ORF) de LC/A es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
El metodo alternativo consiste en usar amplificacion de PCR a partir de una secuencia de ADN existente con las secuencias de enzimas de restriccion BamHI y SalI incorporadas en los cebadores de PCR 5' y 3' respectivamente. Los cebadores de oligonucleotidos complementarios son sintetizados qmmicamente por un proveedor (por ejemplo, 45 MWG o Sigma-Genosys), de manera que cada par tiene la capacidad de hibridarse con las cadenas opuestas (extremos 3' que apuntan cada uno "hacia" el otro) flanqueando la extension de ADN diana de Clostridium, un oligonucleotido para cada una de las dos cadenas de ADN. Para generar un producto de PCR se mezcla el par de cebadores de oligonucleotidos cortos espedficos para la secuencia de ADN de Clostridium con el molde de ADN de Clostridium y otros componentes de reaccion y se coloco en una maquina (la 'maquina de PCR') que puede cambiar 50 la temperatura de incubacion del tubo de reaccion automaticamente, con un ciclo entre aproximadamente 94°C (para
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desnaturalizacion), 55°C (para reasociacion de oligonucleotidos), y 72°C (para smtesis). Otros reactivos requeridos para la amplificacion de un producto de PCR incluyen una ADN polimerasa (como Taq o Pfu polimerasa), construyendo cada uno de los cuatro bloques dNTP de nucleotido de ADN en cantidades equimolares (50-200 |iM) y un tampon apropiado para la enzima optimizada para concentracion de Mg2+ (0,5-5 mM).
El producto de amplificacion se clona en pCR 4 usando clonacion TOPO TA para productos de PCR Taq o clonacion Zero Blunt TOPO para productos de PCR Pfu (los dos kits disponibles comercialmente en Invitrogen). El clon resultante es comprobado por secuenciacion. A continuacion se elimina cualquier secuencia de restriccion adicional que no es compatible con el sistema de clonacion usando mutagenesis dirigida al sitio [por ejemplo, usando Quickchange (Stratagene Inc.)].
Preparacion de la insercion de translocacion (p. ej., Hn)
El Hn/A (SEQ ID2) se crea mediante una de dos formas posibles:
La secuencia de ADN se disena por traduccion inversa de las secuencias de aminoacidos de Hn/A [obtenidas de fuentes de bases de datos de disposicion libre como GenBank (n° de entrada P10845) o Swissprot (lugar de entrada BXA1_CLOBO)] usando una de entre una variedad de herramientas de programa de traduccion inversa [por ejemplo traduccion inversa de E. coli EditSeq best (DNASTAR Inc.), o herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. Una secuencia de restriccion de PstI anadida al extremo N y XbaI-codon de detencion-HindIII al extremo C asegura que el marco de lectura correcto se mantiene. La secuencia de ADN se rastrea (usando un programa como MapDraw, DNASTAR Inc.) para secuencias de escision de enzimas de restriccion incorporadas durante la traduccion inversa. Cualquier secuencia que se encuentre comun a las requeridas por el sistema de clonacion es eliminada manualmente de la secuencia de codificacion propuesta que asegura que el uso de codones de E. coli comun se mantiene. El uso de codones de E. coli se evalua por referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el contenido de %GC y la proporcion del uso de codones se evalua por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
El metodo alternativo consiste en usar amplificacion de PCR de una secuencia de ADN existente con las secuencias de enzimas de restriccion PstI y XbaI-codon de detencion-HindIII incorporadas en los cebadores de PCR 5' y 3' respectivamente. La amplificacion de PCR se realiza como se describe antes. El producto de PCR se inserta en el vector pCR 4 y se verifica por secuenciacion. A continuacion se elimina cualquier secuencia de restriccion adicional que no es compatible con el sistema de clonacion usando mutagenesis dirigida al sitio [por ejemplo usando Quickchange (Stratagene Inc.)].
Ejemplo 2 - Preparacion de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (la nociceptina esta en el extremo N de la cadena Hn)
Preparacion de la insercion grupo enlazador-nociceptina-separador
El grupo enlazador de LC-Hn puede disenarse desde el principio, usando la informacion de secuencias existente para el grupo enlazador como molde. Por ejemplo, el grupo enlazador del serotipo A (en este caso definido como region polipeptfdica interdominio que existe entre las cistemas del puente de disulfuro entre LC y Hn) tiene una longitud de 23 aminoacidos y tiene la secuencia VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL. Dentro de esta secuencia, se entiende que la activacion proteolftica en la naturaleza conduce a un dominio Hn que tiene un extremo N de la secuencia ALNDL. Esta informacion de secuencia esta disponible libremente en fuentes de bases de datos disponibles como GenBank (n° de entrada P10845) o Swissprot (lugar de entrada BXA1_CLOBO). En este grupo enlazador se incorpora un sitio de Factor Xa, nociceptina y separador; y usando una de entre una variedad de herramientas de programa de traduccion inversa [por ejemplo traduccion inversa de E. coli EditSeq best (DNASTAR Inc.), o herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], se determina la secuencia de ADN que codifica la region grupo enlazador-ligando-separador. A continuacion se incorporan los sitios de restriccion en la secuencia de ADN y puede disponerse como BamHI-SalI-grupo enlazador-sitio de proteasa-nociceptina-WfreI-separador-Spel-PstI-XbaI- codon de detencion-HindIII (SEQ ID7). Es importante asegurar que el marco de lectura correcto se mantiene para el separador, la nociceptina y las secuencias de restriccion y que la secuencia XbaI no esta precedida por las bases, TC, lo que dana como resultado la metilacion DAM. La secuencia de ADN se rastrea en busca de incorporacion de secuencias de restriccion, y cualquier secuencia adicional se elimina manualmente de la secuencia restante que asegura que el uso de codones de E. coli comun se mantiene. El uso de codones de E. coli se evalua por referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el contenido de %GC y la proporcion del uso de codones se evaluan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Preparacion de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A
Con el fin de crear la construccion LC-grupo enlazador-nociceptina-separador-HN (SEQ ID13), el vector pCR 4 que codifica el grupo enlazador (SEQ ID7) se escinde con enzimas de restriccion BamHI + SalI. Este vector escindido
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sirve a continuacion como el vector receptor para insercion y ligacion de ADN LC/A (SEQ ID1) escindido con BamHI + SalI. A continuacion se escinde el ADN del plasmido resultante con enzimas de restriccion PstI + Xbal y sirve como el vector receptor para la insercion y ligacion del ADN de Hn/A (SEQ ID2) escindido con PstI + Xbal. La construccion final contiene el ORF de LC-grupo enlazador-nociceptina-separador-HN (SEQ ID13) para transferencia en vectores de expresion para que la expresion de como resultado una protema de fusion de la secuencia ilustrada en SEQ ID14.
Ejemplo 3 - Preparacion de una protema de fusion de nociceptina-LC/A-HN/A (la nociceptina esta en el extremo N de LC-cadena)
La estructura principal de LC/A-Hn/A se construye como se describe en el Ejemplo 2 usando el grupo enlazador de serotipo A sintetizado con la adicion de un sitio del Factor Xa para la activacion, dispuesto como BamHI-SalI-grupo enlazador-sitio de proteasa-grupo enlazador-PstI-XbaI-codon de detencion-H/ndIII (SEQ ID8). La estructura principal de LC/A-Hn/A y la insercion de nociceptina de presentacion en el extremo N sintetizada (SEQ ID9) se escinden con enzimas de restriccion BamHI + H/ndIII, se purifican con gel y se ligan entre sf para crear una nociceptina-separador- LC-grupo enlazador-HN. A continuacion se corta el ORF (SEQ ID15) usando enzimas de restriccion Aval + XbaI para su transferencia en vectores de expresion para que la expresion de como resultado una protema de fusion de la secuencia ilustrada en SEQ ID16.
Ejemplo 4 - Preparacion de una protema de fusion de LC/C-nociceptina-HN/C
Siguiendo los metodos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/C (SEQ ID5)y Hn/C (SEQ ID6) se crean y se insertan en el grupo enlazador del serotipo C dispuesto como BamHI-SalI-grupo enlazador-sitio de proteasa-nociceptina-WfreI- separador-SpeI-PstI-XbaI-codon de detencion-H/ndIII (SEQ ID10). La construccion final contiene el ORF de LC- grupo enlazador-nociceptina-separador-HN (SEQ ID17) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID18.
Ejemplo 5 - Preparacion de una protema de fusion de LC/C-nociceptina-HN/C con una secuencia de activacion de serotipo A
Siguiendo los metodos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/C (SEQ ID5)y Hn/C (SEQ ID6) se crean y se insertan en el grupo enlazador de serotipo A dispuesto como BamHI-SalI-grupo enlazador-sitio de proteasa-nociceptina-WfreI- separador-SpeI-PstI-XbaI-codon de detencion-H/ndIII (SEQ ID7). La construccion final contiene el ORF de LC-grupo enlazador-nociceptina-separador-HN (SEQ ID19) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID20.
Ejemplo 6 - Preparacion de una protema de fusion de LC/A-met encefalina-HN/A
Debido al pequeno tamano, de cinco aminoacidos, del ligando de met-encefalina LC/A-met encefalina-HN/A fusion se crea por mutagenesis dirigida al sitio [por ejemplo usando Quickchange (Stratagene Inc.)] usando la fusion de LC/A- nociceptina-HN/A (SEQ ID13) como molde. Se disenan oligonucleotidos que codifican el peptido YGGFM met- encefalina, que asegura que el uso estandar de codones de E. col/ se mantiene y no se incorporan sitios de restriccion adicionales, flanqueados por secuencias complementarias a la region del grupo enlazador de la fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID13) a cualquier lado de la seccion de nociceptina. El producto de SDM se verifica por secuenciacion y la construccion final que contiene el ORF de LC-grupo enlazador-met encefalina-separador-HN (SEQ ID21) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID22.
Ejemplo 7 - Preparacion de una protema de fusion de LC/A-p endorfina-HN/A
Siguiendo los metodos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/A (SEQ ID1) y Hn/A (SEQ ID2) se crean y se insertan en el grupo enlazador de p endorfina del serotipo A dispuesto como BamHI-SalI-grupo enlazador-sitio de proteasa- p endorfina-WfreI-separador-SpeI-PstI-XbaI-codon de detencion-H/ndIII (SEQ ID11). La construccion final contiene el ORF de LC-grupo enlazador-p endorfina-separador-HN (SEQ ID23) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID24.
Ejemplo 8 - Preparacion de una protema de fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A
Siguiendo los metodos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/A (SEQ ID1) y Hn/A (SEQ ID2) se crean y se insertan en el grupo enlazador de variante de nociceptina del serotipo A dispuesto como BamHI-SalI-grupo enlazador-sitio de proteasa-variante de nociceptina-WfreI-separador-SpeI-PstI-XbaI-codon de detencion-H/ndIII (SEQ ID12). La construccion final contiene el ORF de LC-grupo enlazador-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID25) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID26.
Ejemplo 9 - Metodo de purificacion para la protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A
Tubo Defrost falcon que contiene 25 ml de HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM y aproximadamente 10 g de pasta de celulas BL21 de E. col/. Se lleva la pasta celular descongelada hasta 80 ml con hEpES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM y se somete a sonicacion en hielo 30 segundos sf, 30 segundos no durante 10 ciclos a una potencia de 22
micrometros que asegura que la muestra se mantiene fna. Se centrifugan las celulas lisadas a 18 000 rpm y 4°C durante 30 minutos. Se carga el sobrenadante en una carga de NiSO4 0,1 M Columna de quelacion (es suficiente una columna de 20-30 ml) equilibrada con HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM. Usando un gradiente escalonado de imidazol 10 y 40 mM, se lava la protema ligada inespedfica y se eluye la protema de fusion con imidazol 100 mM. 5 Se dializa la protema de fusion eluida frente a 5 L de HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM a 4°C durante toda la noche y se mide la DO de la protema de fusion dializada. Se anade 1 unidad de factor Xa por 100 |ig de protema de fusion se incuba a 25°C en estatico durante toda la noche. Se carga en una carga de NiSO4 0,1 M. Columna de quelacion (es suficiente una columna de 20-30 ml) equilibrada con HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM. Se lava la columna a la lmea de referencia con HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM. Usando un gradiente escalonado de 10 imidazol 10 y 40 mM, se lava la protema ligada inespedfica y se eluye la protema de fusion con imidazol 100 mM. Se dializa la protema de fusion eluida frente a 5 L de HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM a 4°C durante toda la noche y se concentra la fusion a aproximadamente 2 mg/ml, se divide la muestra en partes almuotas y se congela a - 20°C. Se somete a ensayo la protema purificada usando DO, BCA, analisis de pureza y evaluaciones SNAP-25.
Ejemplo 10 - Confirmacion de actividad agonista de RG por medida de la liberacion de sustancia P a partir de 15 cultivos neuronales celulares
Materiales
El valor EIA de la sustancia P se obtiene de R&D Systems, RU.
Metodos
Los cultivos neuronales primarios de GRDe se establecen como se describe anteriormente (Duggan et al., 2002). La 20 liberacion de sustancia P desde los cultivos se evalua por EIA, esencialmente como se describe anteriormente (Duggan et al., 2002). El RG de interes se anade a los cultivos neuronales (establecidos durante al menos 2 semanas antes del tratamiento); los cultivos de control se realizan en paralelo por adicion de vehmulo en lugar de RG. La liberacion estimulada (KCI 100 mM) y basal, junto con contenido de lisado celular total, de sustancia P se obtienen para los cultivos de control y tratados con RG. La inmunorreactividad de la sustancia P se mide usando Kits 25 de Inmunoensayo de Enzimas de la Sustancia P (Cayman Chemical Company, USA o R&D Systems, RU) segun las instrucciones del fabricante.
La cantidad de Sustancia P liberada por las celulas neuronales en presencia del RG de interes se compara con la liberacion obtenida en presencia y ausencia de KCI 100 mM. La estimulacion de liberacion de Sustancia P por el RG de interes por encima de la liberacion basal establece que el RG de interes es un "ligando de agonista" como se 30 define en la presente memoria descriptiva. Si se desea la estimulacion de la liberacion de Sustancia P por el RG de interes puede compararse con la curva de liberacion de Sustancia P estandar producida usando ligando del receptor de ORL-1 natural, la nociceptina (Tocris).
Ejemplo 11 - Confirmacion de activacion de receptor ORL1 mediante medida de la produccion de cAMP estimulada por forskolina
35 La confirmacion de que un RG dado esta actuando por medio del receptor ORL1 se proporciona mediante el ensayo siguiente, en la que se evalua la capacidad de RG para inhibir la produccion de cAMP estimulada por forskolina.
Materiales
[3H]adenina y [14C]cAMP se obtienen de GE Healthcare Metodos
40 El ensayo se realiza esencialmente como han descrito anteriormente Meunier et al. [Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like receptor ORL1. Nature 377: 532-535, 1995] en celulas de CHO transfectadas intactas sembradas en placas de plastico de 24 pocillos.
Se anade a las celulas [3H]adenina (1,0 uni) en 0,4 ml de medio de cultivo. Las celulas se mantienen a 37°C durante 2 h para permitir que la adenina se incorpore en la reserva de ATP intracelular. Despues de 2 h, las celulas se lavan 45 una vez con tampon de incubacion que contiene: NaCl 130 mM, KCI 4,8 mM, KH2PO4 1,2 mM, CaCl2 1,3 mM, MgSO4 1,2 mM, glucosa 10 mM, 1 mg/ml de suero de albumina bovino y HEPES 25 |iM pH 7,4, y se sustituyen por tampon que contiene forskolina (10 mM) e isobutilmetilxantina (50 mM) con o sin el RG de interes. Despues de 10 min, se aspira el medio y se sustituye por 0,5 ml de HCl 0,2 M. Aproximadamente 1.000 cpm de [14C]cAMP se anade a cada pocillo y se usa como un patron interno. A continuacion se transfiere el contenido de los pocillos a columnas 50 de 0,65 g de polvo de alumina seco. Las columnas se eluyen con 4 ml de HCl 5 mM, 0,5 ml de acetato de amonio 0,1 M, despues dos mililitros adicionales de acetato de amonio. El eluato final se recoge en viales de centelleo y se cuentan los valores de 14C y tritio. Se corrigen las cantidades recogidas para recuperacion de [14C]cAMP. Los RG que son agonistas en el receptor ORL1 provocan una reduccion en el nivel de cAMP producido en respuesta a forskolina.
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Ejemplo 12 - Confirmacion de la activacion del receptor ORL1 usando un ensayo funcional de union a GTPyS
La confirmacion que un RG dado actua por medio del receptor ORL1 se proporciona tambien mediante el ensayo siguiente, un ensayo funcional de union a GTPyS.
Materiales
[35S]GTPyS se obtiene de GE Healthcare
Las perlas recubiertas por aglutinina de germen de trigo (SPA) se obtienen de GE Healthcare Metodos
Este ensayo se realiza esencialmente como se describe en Traynor y Nahorski [Modulation by m-opioid agonists of guanosine-5-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47: 848-854, 1995].
Se raspan las celulas de las placas de cultivo de tejidos en HEPES 20 mM, acido etilendiaminotetraacetico 1 nM, y despues se centrifuga a 500 x g durante 10 min. Las celulas se vuelven a suspender en este tampon y se homogeneiza con un homogeneizador Polytron.
Se centrifuga el producto de homogeneizacion a 27.000 x g durante 15 min, y se vuelve a suspender el sedimento en tampon A, que contiene: HEPES 20 mM, MgCh 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4. Se vuelve a centrifugar la suspension a 20,000 x g y se suspende una vez mas en tampon A. Para el ensayo de union, se incuban membranas (8-15 |ig de protema) con [35S]GTP S (50 pM), GDP (10 |iM), con y sin el RG de interes, en un volumen total de 1,0 ml, durante 60 min a 25°C. Las muestras se filtran en filtros de fibra de vidrio y se cuentan como se describe para los ensayos de union.
Ejemplo 13 - Preparacion de una protema de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (la nociceptina esta en el extremo N de la cadena Hn)
La insercion del grupo enlazador-nociceptina-separador se prepara como se describe en el Ejemplo 2.
Preparacion de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A
Con el fin de crear la construccion LC-grupo enlazador-nociceptina-separador-HN (SEQ ID13), el vector pCR 4 que codifica el grupo enlazador (SEQ ID7) se escinde con las enzimas de restriccion BamHI + Sail. Este vector escindido sirve a continuacion como receptor de insercion y ligacion de ADN de LC/A (SEQ ID1) tambien escindido con BamHI + Sail. El ADN del plasmido resultante se escinde a continuacion con enzimas de restriccion BamHI + Hindlll y el fragmento de LC/grupo enlazador A insertado en el vector escindido de forma similar que contiene un unico sitio de clonacion multiple para BamHI, Sail, Psfl e HindIII como el vector pMAL (NEB). A continuacion se escinde el ADN de Hn/A (SEQ ID2) con enzimas de restriccion PstI + HindIII y se inserta en la construccion escindida de forma similar pMALLC/grupo enlazador A. La construccion final contiene el ORF de LC-grupo enlazador-nociceptina-separador-HN (SEQ ID13) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID14.
Ejemplo 14 - Preparacion de una protema de fusion de nociceptina-LC/A-HN/A (nociceptina esta en el extremo N de la cadena LC)
Con el fin de crear la construccion nociceptina-separador-LC/A-HN/A, un grupo enlazador de serotipo A con la adicion de un sitio de Factor Xa para su activacion, dispuesto como BamHI-SaiI-grupo enlazador-sitio de proteasa- grupo enlazador-PstI-XbaI-codon de detencion-HindIII (SEQ ID8) se sintetiza como se describe en el Ejemplo 13. El vector pCR 4 que codifica el grupo enlazador se escinde con enzimas de restriccion BamHI + SaiI. Este vector escindido sirve entonces como receptor para insercion y ligacion de ADN de LC/A (SEQ ID1) tambien escindido con BamHI + SaiI. El ADN de plasmido resultante se escinde a continuacion con enzimas de restriccion BamHI + HindIII y el fragmento de LC/grupo enlazador A insertado en un vector escindido de forma similar que contiene la insercion de nociceptina de presentacion en el extremo N sintetizada (SEQ ID9). Esta construccion se escinde a continuacion con Avai + HindIII y se inserta en un vector de expresion como el plasmido pMAL (NEB). El ADN de Hn/A (SEQ ID2) se escinde a continuacion con enzimas de restriccion PstI + HindIII y se inserta en la construccion escindida de forma similar como pMAL-nociceptina-LC/grupo enlazador A. La construccion final contiene el ORF de nociceptina- separador-LC/A-HN/A (SEQ ID51) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID52.
Ejemplo 15 - Preparacion y purificacion de una protema de fusion de la familia LC/A-nociceptina-HN/A con longitud de separador variable
Usando la misma estrategia que se emplea en el Ejemplo 2, se preparo un intervalo de grupos enlazadores de ADN que codificaban nociceptina y contenido de separacion variable. Usando una de entre una variedad de herramientas de programa de traduccion inversa [por ejemplo traduccion inversa de E. coii EditSeq best (DNASTAR Inc.), o herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], se determina la secuencia de ADN que codifica la region de grupo enlazador-ligando-separador.
A continuacion se incorporan los sitios de restriccion en la secuencia de ADN y pueden disponerse como BamHI- Sa/I-grupo enlazador-sitio de proteasa -nociceptina-WfreI-separador-SpeI-PstI-XbaI-codon de detencion-H/ndIII (SEQ ID53 a SEQ ID57). Es importante asegurar que el marco de lectura correcto se mantiene para el separador, la nociceptina y las secuencias de restriccion y que la secuencia de XbaI no esta antecedida por las bases, RG que 5 dana como resultado la metilacion DAM. La secuencia de ADN se rastrea en cuanto a la incorporacion de secuencias de restriccion y se elimina cualquier secuencia adicional manualmente de la secuencia restante que asegura que el uso de codones de E. co// comunes se mantiene. El uso de codones de E. co// se evalua por referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el contenido de %GC y la proporcion del uso de codones se evaluan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, 10 GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Los separadores que se crearon inclman:
Tabla 1
Codigo
Secuencia de protemas del grupo enlazador SEQ ID del ADN del grupo enlazador
GS10
ALAGGGGSALVLQ 53
GS15
ALAGGGGSGGGGSALVLQ 54
GS25
ALAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQ 55
GS30
ALAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQ 56
HX27
ALAAEAAAKEAAAKEAAAKAGGGGSALVLQ 57
15 A modo de ejemplo, con el fin de crear la construccion de fusion de LC/A-CPN(GS15)-Hn/A (SEQ ID58), el vector pCR 4 que codifica el grupo enlazador (SEQ ID54) se escinde con enzimas de restriccion BamHI + Sa/I. Este vector escindido actua a continuacion como vector receptor para insercion y ligacion de ADN de LC/A (SEQ ID1) tambien escindido con BamHI + Sa/I. El ADN de plasmido resultante se escinde a continuacion con enzimas de restriccion BamHI + H/ndIII y el fragmento LC/grupo enlazador A insertado en un vector escindido de forma similar que contiene 20 un unico sitio de clonacion multiple para BamHI, Sa/I, PstI e H/ndIII como el vector pMAL (NEB). El ADN de Hn/A (SEQ ID2) se escinde a continuacion con enzimas de restriccion PstI + H/ndIII y se inserta en la construccion de pMAL-LC/grupo enlazador A escindida de forma similar. La construccion final contiene el ORF de LC/A-CPN(GS15)- Hn/A (SEQ ID58) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID59.
Como ejemplo adicional, para crear la construccion de fusion de LC/A-CPN(GS25)-Hn/A (SEQ ID60), el vector pCR 25 4 que codifica el grupo enlazador (SEQ ID55) se escinde con enzimas de restriccion BamHI + Sa/I. Este vector
escindido sirve a continuacion como vector receptor para la insercion y ligacion de ADN de LC/A (SEQ ID1) escindido con BamHI + Sa/I. El ADN de plasmido resultante se escinde a continuacion con enzimas de restriccion BamHI + H/ndIII y el fragmento LC/grupo enlazador A insertado en un vector escindido de forma similar que contiene un unico sitio de clonacion multiple para BamHI, Sa/I, PstI e H/ndIII como el vector pMAL (NEB). El ADN de Hn/A 30 (SEQ ID2) se escinde a continuacion con enzimas de restriccion PstI + H/ndIII y se inserta en la construccion pMAL- LC/grupo enlazador A escindida de forma similar. La construccion final contiene el ORF de LC/A-CPN(GS25)-Hn/A (SEQ ID60) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID61.
Las variantes de la fusion de LC/A-CPN-Hn/A que consiste en GS10, GS30 y HX27 se crean de forma similar. Usando la metodologfa de purificacion descrita en el Ejemplo 9, la protema de fusion se purifica a partir de pasta 35 celular de E. co//. La figura 9 ilustra el producto purificado obtenido en el caso de LC/A-CPN(GS10)-Hn/A, LC/A- CPN(GS15)-Hn/A. LC/A-CPN(GS25)-Hn/A, LC/ACPN(GS30)-Hn/A y LC/A-CPN(HX27)-Hn/A.
Ejemplo 16 - Evaluacion de la eficacia /n v/tro de una fusion de LC/A-nociceptina-HN/A
La protema de fusion se preparo segun los Ejemplos 2 y 9 se evaluo en el modelo de GRDe de celulas neuronales.
Los ensayos para la inhibicion de la liberacion de sustancia P y la escision de SNAP-25 se ha comunicado 40 anteriormente (Duggan et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 34846-34852). Brevemente, se recogen ganglios de las rames dorsales neuronas de ratas Sprague-Dawley fetales de 15 dfas y celulas disociadas sembradas en placas de 24 pocillos recubiertas con Matrigel a una densidad de 1 x 106 celulas/pocillo. Un dfa despues de la siembra se tratan las celulas con citosina p-D-arabinofuranosido 10 pM durante 48 h. Las celulas se mantienen en medio esencial mmimo de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 5%, L-glutamina 5 mM, D- 45 glucosa al 0,6%, suplemento B27 al 2% y 100 ng/ml de factor de crecimiento nervioso de factor murino 2.5S. Los cultivos se mantienen durante 2 semanas a 37°C en aire al 95%/CO2 al 5% antes de la adicion de materiales de ensayo.
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La liberacion de Sustancia P a partir de GRDe se evalua por ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas. Brevemente, las celulas GRDe se lavan dos veces con solucion salina equilibrada baja en potasio (BSS: KCl 5 mM, NaCI 137 mM, MgCh 1,2 mM, glucosa 5 mM, KH2PO4 0,44 mM, HEPES 2o mM, pH 7,4, CaCl2 2 mM). Las muestras basales se obtienen incubando cada pocillo durante 5 min con 1 ml de BSS baja en potasio. Despues de la eliminacion de este tampon, se estimula a las celulas para que liberen por incubacion 1 ml de tampon rico en potasio (BSS como antes con modificacion para incluir KCI 100 mM equilibrado isotonicamente con NaCl) durante 5 min. Se retiran todas las muestras en tubos en hielo antes del ensayo de sustancia P. Se preparan lisados celulares totales por adicion de 250 |il de acido acetico 2 M/acido trifluoroacetico al 0,1% para lisar las celulas, evaporacion centnfuga y resuspension en 500 |il de tampon de ensayo. Se evaluan el contenido de sustancia P en las muestras diluidas. Se mide la inmunorreactividad de sustancia P usando Kits de Inmunoensayo Enzimatico de Sustancia P (Cayman Chemical Company o R&D Systems) segun las instrucciones del fabricante. La sustancia P se expresa en pg/ml con respecto a la curva estandar de sustancia P realizada en paralelo.
Se realizo SDS-PAGE y analisis de transferencia Western usando protocolos estandar (Novex). Se resolvieron las protemas SNAP-25 en un gel de Tris/glicina poliacrilamida 12% (Novex) y posteriormente se transfirio a membrana de nitrocelulosa. Se sondearon las membranas con un anticuerpo monoclonal (SMI-81) que reconoce SNAP-25 escindido e intacto. La union espedfica se visualizo usando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y un sistema de deteccion quimioluminiscente. La escision de SNAP-25 se cuantifico mediante densitometna de barrido (Molecular Dynamics Personal SI, programa de analisis de datos ImageQuant). El porcentaje de escision de SNAP-25 se calculo segun la formula: (SnAp-25 escindido/(SNAP-25 escindido+intacto))x100.
Despues de la exposicion de las neuronas GRDe a una fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (denominada CPN-A), se observa la inhibicion de la liberacion de sustancia P y la escision de SNAP-25 (Figura 10). Despues de 24 h de exposicion a la fusion, se consigue el 50% de la escision maxima de SNAP-25 por una concentracion de fusion de 6,3 ± 2,5 nM.
El efecto de la fusion se evalua tambien en puntos temporales definidos despues de una exposicion de 16 h de GRDe a CPN-A. La Figura 11 ilustra la duracion de accion prolongada de la protema de fusion CPN-A, observandose todavfa actividad mensurable 28 dfas despues de la exposicion.
Ejemplo 17 - Evaluacion de la eficacia in vitro de una fusion de LC/A-variante de nociceptina Hn/A
La protema de fusion preparada segun los Ejemplos 8 y 9 se evaluo en el modo de celulas neuronales GRDe usando el metodo descrito en el Ejemplo 16.
Despues de la exposicion de neuronas GRDe a una fusion de LC/A-variante de nociceptina-HNA (denominada CPNv-A), se observa la inhibicion de la liberacion de sustancia P y la escision de SNAP-25. Despues de 24 h de exposicion a la fusion, se consigue el 50% de escision maxima de SNAP-25 por una concentracion de fusion de 1,4 ± 0,4 nM (Figura 12).
El efecto de la fusion se evalua tambien en puntos temporales definidos despues de 16 h de exposicion de GRDe a CPN-A. La Figura 13 ilustra la duracion de accion prolongada de la protema de fusion de CpN-A, observandose todavfa actividad mensurable 24 dfas despues de la exposicion.
Tambien se evalua la capacidad de union de la protema de fusion de CPNv-A en comparacion con la fusion de CPN- A. La Figura 14 ilustra los resultados de un experimento de competencia para determinar la eficacia de union en el receptor ORL-1. Se demuestra que CPNv-A desplaza la [3H]-nociceptina, lo que confirma que el acceso al receptor es posible con el ligando en el formato de presentacion central.
Ejemplo 18 - Preparacion de una protema de fusion de LC/A-variante de nociceptina-HNA que se activa por tratamiento con Enterocinasa
Siguiendo los metodos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/A (SEQ ID1) y Hn/A (SEQ ID2) se crean y se insertan en el grupo enlazador de variante de nociceptina de serotipo A dispuesto como BamHI-Sa/l-grupo enlazador-enterocinasa sitio de proteasa-variante de nociceptina-Wfrel-separador-Spel-Pstl-Xbal-codon de detencion-H/ndIII (SEQ ID62). La construccion final contiene las secuencias de ORF de LC-grupo enlazador-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID63) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID64. La protema de fusion se denomina CpNv(Ek)-A. La Figura 15 ilustra la purificacion de CPNv(Ek)-A a partir de E. co/i siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 9 pero usando Enterocinasa para la activacion a 0,00064 |ig por 100 |ig de protema de fusion.
Ejemplo 19 - Evaluacion de la eficacia in vitro de una fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A que ha sido activada por tratamiento con enterocinasa
La CPNv(Ek)-A preparada en el Ejemplo 18 se obtiene en una forma purificada y se aplica al modelo celular GRDe para evaluar la escision de SNAP-25 (usando la metodologfa del Ejemplo 16). La Figura 16 ilustra la escision de SNAP-25 despues de la exposicion durante 24 h de GRDe a CPNv(Ek)-A. Se observa que la eficacia de la escision es similar a la conseguida con el material escindido por Factor Xa, segun se registra en el Ejemplo 17.
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Ejemplo 20 - Preparacion de una protema de fusion de LC/C-variante de nociceptina-HN/C con un grupo enlazador de activacion de Factor Xa obtenido del serotipo A
Siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 4, LC/C (SEQ ID5) y Hn/C (SEQ ID6) se crean y se insertan en el grupo enlazador de variante de nociceptina de serotipo A dispuesto como BamHI-Sa/I-grupo enlazador-variante de nociceptina-Wfrel-separador-Spel-Pstl-XbaI-codon de detencion-H/ndIII (SEQ ID65). La construccion final contiene las secuencias de ORF de LC-grupo enlazador-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID66) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID67. La protema de fusion se denomina CPNv-C (acc. A). La Figura 17 ilustra la purificacion de CPNv-C (acc. A) a partir de E. co// siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 9.
Ejemplo 21 - Evaluacion de la eficacia /n v/tro de una protema de fusion de LC/C-variante de nociceptina-HN/C
Siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 9, la CPNv-C (acc. A) preparada en el Ejemplo 20 se obtiene en una forma purificada y se aplica al modelo celular GRDe para evaluar la escision de SNAP-25 (usando la metodologfa del Ejemplo 16). Despues de una exposicion durante 24 h a la fusion, se obtiene un 50% de escision de sintaxina maxima mediante una concentracion de fusion de 3,1 ± 2,0 nM. La Figura 18 ilustra la escision de sintaxina despues de la exposicion durante 24 h de GRDe a CPNv-C (acc. A).
Ejemplo 22 - Evaluacion de la eficacia /n v/vo de una fusion de LC/A-nociceptina-HN/A
Se evalua la capacidad de una fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inhibir una alodinia mecanica aguda inducida por la capsaicina despues de inyeccion intraplantar subcutanea en la pata trasera de una rata. En los animales de ensayo se evalua la frecuencia de retirada de la pata (%FRP) en respuesta a una serie de estfmulos de filamento de Von Frey de 10 g (10 estfmulos x 3 ensayos) antes de la inclusion en el estudio, despues de tratamiento subcutaneo con CPN/A pero antes de capsaicina, y tras provocacion con capsaicina despues de inyeccion de CPN/A (media de respuestas a 15' y 30'). La provocacion con capsaicina se consigue por inyeccion de 10 pL de una solucion al 0,3%. Se preparan diluciones de muestra en BSA/suero salino al 0,5%. La Figura 19 ilustra la reversion de la alodinia mecanica que se consigue por pre-tratamiento de los animales con un intervalo de concentraciones de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A.
Se evalua la capacidad de una fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inhibir la alodinia mecanica (tactil) inducida por estreptozotocina (STZ) en ratas. La alodinia mecanica inducida por STZ en ratas se consigue por inyeccion de estreptozotocina (i.p. o i.v.) que produce la destruccion de las celulas p pancreaticas lo que conduce a la perdida de produccion de insulina, con estres metabolico concomitante (hiperglucemia e hiperlipidemia). De este modo, la STZ induce diabetes tipo I. Ademas, el tratamiento con STZ conduce al desarrollo progresivo de neuropatfa, que sirve como modelo de dolor cronico con hiperalgesia y alodinia que puede reflejar signos observados en personas diabeticas (neuropatfa diabetica periferica).
Se tratan ratas Sprague-Dawley macho (250-300 g) con 65 mg/kg de STZ en tampon de citrato (I.V.) y se mide la glucosa y los lfpidos en sangre semanalmente para definir el buen funcionamiento del modelo. Se mide el umbral de retirada de la pata (URP) en respuesta a una serie de estfmulos de filamento de Von Frey durante un periodo de tiempo. Se dice que se establece la alodinia cuando el URP en dos fechas de ensayo consecutivas (separadas por 1 semana) mide menos de 6 g en la escala. En este punto, se aleatoriza a las ratas en un grupo de suero salino (control de eficacia negativo), un grupo de gabapentina (control de eficacia positivo) o un grupo de ensayo (CPN/A). Se inyectan materiales de ensayo (20-25 pl) por via subcutanea como una unica inyeccion (excepto gabapentina) y se mide el URP 1 dfa despues del tratamiento y despues periodicamente durante un periodo de 2 semanas. Diariamente se inyecta gabapentina (30 mg/kg i.p. @ 3 ml/kg de volumen de inyeccion), 2 horas antes del inicio del ensayo de URP. La Figura 20 ilustra la reversion de la alodinia conseguida por pre-tratamiento de los animales con 750 ng de CPN/A. Los datos se obtuvieron durante un periodo de 2 semanas despues de una unica inyeccion de CPN/A
Ejemplo 23 - Evaluacion de la eficacia /n v/vo de una fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A
Se evalua la capacidad de una fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A (CPNv/A) para inhibir la alodinia mecanica inducida por capsaicina despues de inyeccion intraplantar subcutanea en la pata trasera de una rata. En los animales de ensayo se evalua la frecuencia de retirada de la pata (%FRP) en respuesta a una serie de estfmulos de filamento de Von Frey de 10 g (10 estfmulos x 3 ensayos) antes de la inclusion en el estudio (Pretratamiento); despues de tratamiento intraplantar subcutaneo con CPNv/A pero antes de capsaicina (Pre-CAP); y posteriormente a la inyeccion de provocacion de capsaicina de CPNv/A (media de respuestas a 15' y 30'; CAP). La provocacion con capsaicina se consigue por inyeccion de 10 pL de una solucion al 0,3%. Se preparan diluciones de muestra en BSA/suero salino al 0,5%.
La Figura 21 ilustra la reversion de alodinia que se consigue por pre-tratamiento de los animales con un intervalo de concentraciones de fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A en comparacion con la reversion conseguida con la adicion de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A. Estos datos se expresan como un diferencial de frecuencia de retirada de la pata normalizado, en el que la diferencia entre la respuesta maxima (post-capsaicina) y la respuesta de base (pre-capsaicina) se expresa en forma de porcentaje. Con este analisis, puede verse que CPNv/A es mas potente
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que CPN/A dado que se requiere una dosis menor de CPNv/A para alcanzar un efecto analgesico similar al observado con CPN/A.
Ejemplo 24 - Preparacion de una protema de fusion de LC/A-leu encefalina-HNA
Debido al pequeno tamano de cinco aminoacidos del ligando de leu-encefalina la fusion de LC/A-leu encefalina-HN/A se crea por mutagenesis dirigida al sitio [por ejemplo usando Quickchange (Stratagene Inc.)] usando la fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID13) como molde. Se disenan oligonucleotidos que codifican el peptido de leu- encefalina YGGFL, que asegura que el uso estandar de codones de E. coli se mantiene y no se incorporan sitios de restriccion adicionales, flanqueados por secuencias complementarias a la region del grupo enlazador de fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID13) a los dos lados de la seccion de nociceptina. El producto SDM se verifica por secuenciacion y la construccion final que contiene el ORF de LC-grupo enlazador-leu encefalina-separador-HN (SEQ ID68) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID69. La protema de fusion se denomina CPLEA. La Figura 22 ilustra la purificacion de CPLE-A a partir de E. coli siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 9.
Ejemplo 25 - Expresion y purificacion de una protema de fusion de LC/A-beta-endorfina-HN/A
Siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 9, y con la protema de fusion de LC/A-beta-endorfina-HN/A (denominada CPBE-A) creada en el Ejemplo 7, la CpBE-A se purifica a partir de E. coli. La Figura 23 ilustra la protema purificada analizada por SDS-PAGE.
Ejemplo 26 - Preparacion de una protema de fusion de LC/A-mutante de nociceptina-HN/A
Debido a la modificacion de un unico aminoacido necesaria para mutar la secuencia de nociceptina en la posicion 1 de una Phe a una Tyr, se crea la fusion de LC/A-mutante de nociceptina-HN/A por mutagenesis dirigida al sitio [por ejemplo usando Quickchange (Stratagene Inc.)] usando la fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID13) como molde. Los oligonucleotidos se disenan codificando tirosina en la posicion 1 de la secuencia de nociceptina, que asegura que el uso estandar de codones de E. coli se mantiene y no se incorporan sitios de restriccion adicionales, flanqueados por secuencias complementarias a la region del grupo enlazador de la fusion de LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID13) a los dos lados de la seccion de nociceptina. El producto SDM se verifica por secuenciacion y la construccion final que contiene el ORF de la fusion de LC/A-mutante de nociceptina-separador-HN/A (SEQ ID70) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID71. La protema de fusion se denomina CPOP-A. La Figura 24 ilustra la purificacion de CPOP-A a partir de E. coli siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 9.
Ejemplo 27 - Preparacion y evaluacion de una protema de fusion de LC/A-variante de mutante de nociceptina-HN/A
Debido a la modificacion de un unico aminoacido necesaria para mutar la secuencia de nociceptina en la posicion 1 de una Phe a una Tyr, se crea la fusion de LC/A-variante de mutante de nociceptina-HN/A por mutagenesis dirigida al sitio [por ejemplo usando Quickchange (Stratagene Inc.)] usando la fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A (SEQ ID25) como molde. Los oligonucleotidos se disenan codificando tirosina en la posicion 1 de la secuencia de nociceptina, que asegura que el uso estandar de codones de E. coli se mantiene y no se incorporan sitios de restriccion adicionales, flanqueados por secuencias complementarias a la region del grupo enlazador de la fusion de LC/A-variante de nociceptina-HN/A (SEQ ID25) a los dos lados de la seccion de nociceptina. El producto SDM se verifica por secuenciacion y la construccion final que contiene el ORF de la fusion de LC/A-mutante de nociceptina- separador-HN/A (SEQ ID72) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID73. La protema de fusion se denomina CPOPv-A. La Figura 25 ilustra la purificacion de CPOPv-A a partir de E. coli siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 9.
Usando la metodologfa descrita en el Ejemplo 16, se evalua la capacidad de CPOPv-A de escindir SNAP-25 en el modelo celular GRDe. La Figura 26 ilustra que CPOPv-A es capaz de escindir SNAP-25 en el modelo GRDe, para conseguir la escision del 50% de SNAP-25 maxima despues de la exposicion de las celulas a fusion aproximadamente 5,9 nM durante 24 h.
Ejemplo 28 - Preparacion de una proteasa de la protema de fusion de IgA-variante de nociceptina-HN/A
La proteasa de las secuencias de aminoacidos de IgA se obtuvo de fuentes de bases de datos de disposicion libre como GenBank (n° de entrada P09790). La informacion relativa a la estructura de la proteasa de N. gonorrhoeae del gen IgA esta disponible en la bibliograffa (Pohlner et al., Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae Ig protease, Nature, 1987, 325(6103), 458-62). Usando la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon), se determino la secuencia de ADN que codifica la proteasa de IgA modificada para expresion de E. coli. Se incorporo una secuencia de reconocimiento de A BamHI en el extremo 5' y se incorporo un codon que codifica un aminoacido cistema y la secuencia de reconocimiento SalI en el extremo 3' del ADN de IgA. La secuencia de ADN se rastreo usando MapDraw, (DNASTAR Inc.) para secuencias de escision de enzimas de restriccion incorporadas durante la traduccion inversa. Cualquier secuencia de escision que se encuentre y se considere comun a las requeridas para clonacion se elimino manualmente de la secuencia de codificacion propuesta que asegura que el uso de codones de E. coli comun se mantiene. El uso de codones de E. coli se mediante evaluo
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Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el contenido de %GC y la proporcion del uso de codones se evaluo con referencia a tablas de uso de codones publicadas. Esta secuencia de ADN optimizada (SEQ ID74) que contiene marco de lectura abierta (ORF) de IgA se sintetiza asf comercialmente.
La IgA (SEQ ID74) se inserta en el ORF de LC-grupo enlazador-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID25) usando enzimas de restriccion BamHI y Sail para sustituir la LC por el ADN de la proteasa de IgA. La construccion final contiene el ORF de IgA-grupo enlazador A-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID75) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID76.
Ejemplo 29 - Preparacion y evaluacion de una protema de fusion de endopeptidasa dirigida a nociceptina con una marca de purificacion de histidina extrafole.
Se preparo ADN que codifica una marca His extrafble de Factor Xa (his6), aunque esta claro que son posibles tambien sitios de proteasas alternativos como Enterocinasa y marcas de purificacion alternativas como marcas de histidina mas largas. Usando una de entre una variedad de herramientas de programa de traduccion inversa [por ejemplo traduccion inversa de E. coli EditSeq best (DNASTAR Inc.), o herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], se determina la secuencia de ADN que codifica la region de marca His extrafble de Factor Xa. A continuacion se incorporan sitios de restriccion en la secuencia de ADN y pueden disponerse como Nhel-grupo enlazador-SpeI-PstI-HN/A-XbaI-LEIEGRSGHHHHHH-codon de detencion-HindIII (SEQ ID77). En la secuencia de ADN se rastrean secuencias de restriccion incorporadas y se elimina cualquier secuencia adicional manualmente del resto de la secuencia para asegurar que se mantiene el uso de codones de E. coli comun. El uso de codones de E. coli se evalua por referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el contenido de %GC y la proporcion del uso de codones se evaluan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank version 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4. Con el fin de crear CPNv-A-FXa-HT (SEQ ID78, construccion de marca His extrafble) el vector pCR 4 que codifica la marca extrafble His se escinde con NheI y HindIII. A continuacion se inserta el fragmento Nhel- HindIII en el vector LC/A-CPNv-Hn/A (SEQ ID25) que tambien se ha escindido mediante NheI y HindIII. La construccion final contiene las secuencias de ORF de LC/grupo enlazador A-variante de nociceptina-separador-HN- FXa-marca His-H/ndIII (SEQ ID78) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en sEq ID79. La Figura 27 ilustra la purificacion de CPNv-A-FXa-HT a partir de E. coli siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 9.
Ejemplo 30 - Preparacion de una protema de fusion de endopeptidasa dirigida a leu-encefalina que contiene un dominio de translocacion derivado de toxina difterica
La secuencia de ADN se disena por traduccion inversa de la secuencia de aminoacidos del dominio de translocacion de la toxina difterica (obtenida de fuentes de bases de datos de disposicion libre como GenBank (n° de entrada 1XDTT) usando una de entre una variedad de herramientas de programa de traduccion inversa [por ejemplo, traduccion inversa de E. coli EditSeq best (DNASTAR Inc.), o herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. A continuacion se incorporan los sitios de restriccion en la secuencia de ADN y pueden disponerse como NheI-grupo enlazador-SpeI-PstI-dominio de translocacion de difteria-XbaI-codon de detencion-HindIII (SEQ ID80). Las secuencias de reconocimiento PstI/XbaI se incorporan en los extremos 5' y 3' del dominio de translocacion respectivamente de la secuencia que mantiene el marco de lectura correcto. En la secuencia de ADN se rastrean (usando un programa como MapDraw, DNASTAR Inc.) secuencias de escision de enzimas de restriccion incorporadas durante la traduccion inversa. Cualquier secuencia de escision que se encuentre comun a las requeridas por el sistema de clonacion se elimina manualmente de la secuencia de codificacion propuesta que asegura que el uso de codones de E. coli comun se mantiene. El uso de codones de E. coli se evalua por referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el contenido de %GC y la proporcion del uso de codones se evalua por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el dominio de translocacion de difteria es sintetizada entonces comercialmente como NheI-grupo enlazador-SpeI-PstI-dominio de translocacion de difteria-XbaI-codon de detencion-HindIII (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4 (Invitrogen). El vector pCR 4 que codifica el dominio de translocacion de difteria se escinde con NheI y XbaI. A continuacion el fragmento NheI-XbaI se inserta en el vector LC/A-CPLE-Hn/A (SEQ ID68) que tambien se ha escindido mediante NheI y XbaI. La construccion final contiene las secuencias de ORF de LC/A-leu- encefalina-separador-dominio de translocacion de difteria (SEQ ID81) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID82.
Ejemplo 31 - Preparacion de una protema de fusion de endopeptidasa dirigida a variante de nociceptina que contiene un dominio LC derivado de toxina tetanica.
La secuencia de ADN se disena por traduccion inversa de las secuencias de aminoacidos LC de toxina tetanica (obtenidas de fuentes de bases de datos de disposicion libre como GenBank (n° de entrada X04436) usando una de entre una variedad de herramientas de programa de traduccion inversa [por ejemplo traduccion inversa de E. coli EditSeq (DNASTAR Inc.), o herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. Las secuencias de reconocimiento BamHI/SalI se incorporan en los extremos 5' y 3' respectivamente de la secuencia que mantiene el marco de lectura correcto (SEQ ID83). En la secuencia de ADN se rastrean (usando un programa como MapDraw, DNASTAR Inc.)
secuencias de escision de enzimas de restriccion incorporadas durante la traduccion inversa. Cualquier secuencia de escision que se encuentre comun a las requeridas por el sistema de clonacion se elimina manualmente de la secuencia de codificacion propuesta que asegura que el uso de codones de E. coli comun se mantiene. El uso de codones de E. coli se evalua por referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser 5 (Geneart), y el contenido de %GC y la proporcion del uso de codones se evaluan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el marco de lectura abierta (ORF) de LC de la toxina tetanica es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4 (Invitrogen). El vector pCR 4 que codifica la LC TeNT se escinde con BamHI y Sail. A continuacion se inserta el 10 fragmento BamHI-Sall en el vector LC/A-CPNv-Hn/A (SEQ ID25) que tambien se ha escindido mediante BamHI y Sail. La construccion final contiene las secuencias de ORF de TeNT LC-grupo enlazador-variante de nociceptina- separador-HN (SEQ ID84) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID85.
Ejemplo 32 - Preparacion de una protema de fusion de LC/C-variante de nociceptina-HN/C con un grupo enlazador de serotipo C nativo que es susceptible de escision por Factor Xa
15 Siguiendo los metodos usados en el Ejemplo 4, LC/C (SEQ ID5) y Hn/C (SEQ ID6) se crean y se insertan en el grupo de enlazador de la variante de nociceptina de serotipo C dispuesto como BamHI-SalI-grupo enlazador- variante de nociceptina-WfreI-separador-SpeI-PsfI-XbaI-codon de detencion-HindIII (SEQ ID86). La construccion final contiene las secuencias de ORF de LC-grupo enlazador-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID87) para la expresion como una protema de la secuencia ilustrada en SEQ ID88. La protema de fusion se denomina CPNv-C 20 (acc. C).
5
10
15
20
25
30
Listado de secuencias
<110> Syntaxin Limited Allergan, Inc. Chaddock, John Foster, Keith Marks, Philip Stancombe, Patrick Aoki, K Roger Francis, Joseph Steward, Lance
<120> Tratamiento del dolor
<130> P29323GB/MRM
<160> 88
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1302
<212>ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetico <400> 1
ggatccatgg
agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60
attgcttaca
tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120
cacaacaaaa
tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180
ctgaacccgc
caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240
tctaccgata
acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300
tactccaccg
acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360
ggcggttcta
ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420
cagccggacg
gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480
gatatcatcc
agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540
ggctacggtt
ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600
tccctggaag
tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660
gttaccctgg
ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720
ccgaaccgtg
tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780
agcttcgaag
aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840
gaaaacgagt
tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900
aaagcgaaat
ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960
5
10
15
20

gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020

gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080

aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140

gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200

gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260

ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagetg ctgtgcgtcg ac 1302
<210>2 <211> 1257 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sintetico <400>2

ctgcagtgta tcaaggttaa caactgggat ttattcttca gcccgagtga agacaacttc 60

accaacgacc tgaacaaagg tgaagaaatc acctcagata ctaacatcga agcagccgaa 120

gaaaacatct cgctggacct gatccagcag tactacctga cctttaattt cgacaacgag 180

ccggaaaaca tttctatcga aaacctgagc tctgatatca tcggccagct ggaactgatg 240

ccgaacatcg aacgtttccc aaacggtaaa aagtacgagc tggacaaata taccatgttc 300

cactacctgc gcgcgcagga atttgaacac ggcaaatccc gtatcgcact gactaactcc 360

gttaacgaag ctctgctcaa cccgtcccgt gtatacacct tcttctctag cgactacgtg 420

aaaaaggtca acaaagcgac tgaagctgca atgttcttgg gttgggttga acagcttgtt 480

tatgatttta ccgacgagac gtccgaagta tctactaccg acaaaattgc ggatatcact 540

atcatcatcc cgtacatcgg tccggctctg aacattggca acatgctgta caaagacgac 600

ttcgttggcg cactgatctt ctccggtgcg gtgatcctgc tggagttcat cecggaaatc 660

gccatcccgg tactgggcac ctttgctctg gtttcttaca ttgcaaacaa ggttctgact 720

gtacaaacca tcgacaacgc gctgagcaaa cgtaacgaaa aatgggatga agtttacaaa 780

tatatcgtga ccaactggct ggctaaggtt aatactcaga tcgacctcat ccgcaaaaaa 840

atgaaagaag cactggaaaa ccaggcggaa gctaccaagg caatcattaa ctaccagtac 900

aaccagtaca ccgaggaaga aaaaaacaac atcaacttca acatcgacga tctgtcctct 960

aaactgaacg aatccatcaa caaagctatg atcaacatca acaagttcct gaaccagtgc 1020

tctgtaagct atctgatgaa ctccatgatc ccgtacggtg ttaaacgtct ggaggacttc 1080

gatgcgtctc tgaaagacgc cctgctgaaa tacatttacg acaaccgtgg cactctgatc 1140

ggtcaggttg atcgtctgaa ggacaaagtg aacaatacct tatcgaccga catccctttt 1200

cagctcagta aatatgtcga taaccaacgc cttttgtcca ctctagacta gaagctt 1257
<210> 3 <211>1323 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sintetico <400>3
5
10
ggatccatgc cggttaccat caacaacttc aactacaacg acccgatcga caacaacaac 60 atcattatga tggaaccgcc gttcgcacgt ggtaccggac gttactacaa ggcttttaag 120 atcaccgacc gtatctggat catcccggaa cgttacacct tcggttacaa acctgaggac 180 ttcaacaaga gtagcgggat tttcaatcgt gacgtctgcg agtactatga tccagattat 240 ctgaatacca acgataagaa gaacatattc cttcagacta tgattaaact cttcaaccgt 300 atcaaaagca aaccgctcgg tgaaaaactc ctcgaaatga ttatcaacgg tatcccgtac 360 ctcggtgacc gtcgtgtccc gcttgaagag ttcaacacca acatcgcaag cgtcaccgtc 420 aacaaactca tcagcaaccc aggtgaagtc gaacgtaaaa aaggtatctt cgcaaacctc 480 atcatcttcg gtccgggtcc ggtcctcaae gaaaacgaaa ccatcgacat cggtatccag 540 aaccacttcg caagccgtga aggtttcggt ggtatcatgc agatgaaatt ctgcccggaa 600 tacgtcagtg tcttcaacaa cgtccaggaa aacaaaggtg caagcatctt caaccgtcgt 660 ggttacttca gcgacccggc actcatcctc atgcatgaac tcatccacgt cctccacggt 720 ctctaaggta tcaaagttga cgacctcccg atcgtcccga acgagaagaa attcttcatg 780 cagagcaccg acgcaatcca ggctgaggaa ctctacacct tcggtggcca agacccaagt 840 atcataaccc cgtccaccga caaaagcatc tacgacaaag tcctccagaa cttcaggggt 900 atcgtggaca gactcaacaa agtcctcgtc tgcatcagcg acccgaacat caatatcaac 960 atatacaaga acaagttcaa agacaagtac aaattcgtcg aggacagcga aggcaaatac 1020 agcatcgacg tagaaagttt cgacaagctc tacaaaagcc fccatgttcgg tttcaccgaa 1080 accaaeatcg ccgagaacta caagatcaag acaagggcaa gttacfctcag cgacagcctc 1140 ccgcctgtca aaatcaagaa cctcttagac aacgagattt acacaattga agagggcttc 1200 aacatcagtg acaaagacat ggagaaggaa tacagaggtc agaacaaggc tatcaacaaa 1260 caggcatacg aggagatcag caaagaacac ctcgcagtct acaagatcca gatgtgcgtc 1320 gac 1323
<210>4 <211> 1260 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sintetico <400> 4
ctgcagtgca tcgacgttga caacgaagac ctgttcttca tcgctgacaa aaacagcttc 60 agtgacgacc tgagcaaaaa cgaaegtatc gaatacaaca cccagagcaa ctacatcgaa 120 aacgacttcc cgatcaacga actgatcctg gacaccgacc tgataagtaa aatcgaactg 180 ccgagcgaaa acaccgaaag tctgaccgac ttcaacgttg acgttccggt ttacgaaaaa 240 cagccggcta tcaagaaaat cttcaccgac gaaaacacca tcttccagta cctgtacagc 300 cagaccttcc cgctggacat ccgtgacatc agtctgacca gcagtttcga cgacgctctg 360 ctgttcagca acaaagttta cagtttcttc agcatggact acatcaaaac cgctaacaaa 420 gttgttgaag cagggctgtt cgctggttgg gttaaacaga tcgttaacga cttcgfctatc 480 gaagctaaca aaagcaacac tatggacaaa atcgctgaca tcagtctgat cgttccgtac 540 atcggtctgg ctctgaacgt tggtaacgaa accgctaaag gtaactttga aaacgctttc 600 gagatcgctg gtgcaagcat cctgctggag ttcatcccgg aactgctgat cccggttgtt 660 ggtgctttcc tgctggaaag ttacatcgac aacaaaaaca agatcatcaa aaccatcgac 720 aacgctctga ccaaacgtaa cgaaaaatgg agtgatatgt acggtctgat cgttgctcag 780 tggctgagca ccgtcaacac ccagttctac accatcaaag aaggtatgta caaagctctg 840 aactaccagg ctcaggctct ggaagagatc atcaaatacc gttacaacat ctacagtgag 900 aaggaaaaga gtaacatcaa catcgacttc aacgacatca acagcaaact gaacgaaggt 960 atcaaccagg ctatcgacaa catcaacaac ttcatcaacg gttgcagtgt tagctacctg 1020 atgaagaaga tgatcccgct ggctgttgaa aaactgctgg acttcgacaa caccctgaaa 1080 aagaacctgc tgaactacat cgacgaaaac aagctgtacc tgatcggtag tgctgaatac 1140 gaaaaaagta aagtgaacaa atacctgaag accatcatgc cgttcgacct gagtatctac 1200 accaacgaca ccatcctgat cgaaatgttc aacaaataca actctctaga ctagaagctt 1260
<210>5 <211> 1329 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetico
10
<400>5
ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac
60
aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtecgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcaectt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattae 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaaectg aaegttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgac 1329
<210>6 <211> 1263 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetico
10
<400>6
ctgcagtgtc gtgaactgct ggtgaaaaac gatgtgaaaa ccgatatctt cctgcgcaaa tacccggata acgtgagcgt tgatcaggtg
accgatctgc
gatatcaacg
atcctgagca
cgtttattgg
cgatatcagc 60
aagaaaccga
agtgatctac 120
aaaacaccag
cgaacatggt 180
5
10
15
20
25

cagctggatc tgctgtatcc gageattgat agcgaaagcg aaattctgcc gggcgaaaac 240

caggtgtttt acgataaccg tacccagaac gtggattacc tgaacagcta ttactacctg 300

gaaagccaga aactgagcga taacgtggaa gattttacct ttacccgcag cattgaagaa 360

gcgctggata acagcgcgaa agtttacacc tattttccga ccctggcgaa caaagttaat 420

gcgggtgttc agggcggtct gtttctgatg tgggcgaacg atgtggtgga agatttcacc 480

accaacatcc tgcgtaaaga taccctggat aaaatcagcg atgttagcgc gattattccg 540

tatattggtc cggcgctgaa cattagcaat agcgtgcgtc gtggcaattt taccgaagcg 600

tttgcggtta ccggtgtgac cattetgctg gaagcgtttc cggaatttac cattccggcg 660

ctgggtgcgt ttgtgatcta tagcaaagtg caggaacgca acgaaatcat caaaaccatc 720

gataactgcc tggaacagcg tattaaacgc tggaaagata gctatgaatg gatgatgggc 780

acctggctga gccgtattat cacccagttc aacaacatca gctaccagat gtacgatagc 840

ctgaactatc aggegggtgc gattaaagcg aaaatcgatc tggaatacaa aaaatacagc 900

ggcagcgata aagaaaacat caaaagccag gttgaaaacc tgaaaaacag cctggatgtg 960

aaaattagcg aagcgatgaa taacatcaac aaattcatcc gcgaatgcag cgtgacctac 1020

ctgttcaaaa acatgctgcc gaaagtgatc gatgaactga acgaatttga tcgcaacacc 1080

aaagcgaaac tgatcaacct gatcgatagc cacaacatta ttctggtggg cgaagtggat 1140

aaactgaaag cgaaagttaa caacagcttc cagaacacca tcccgtttaa catcttcagc 1200

tataccaaca acagcctgct gaaagatatc atcaacgaat acttcaatct agactagaag 1260

ctt 1263
<210>7 <211> 207 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sintetico <400>7

ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat cgaaggtcgt 60

tttggcggtt tcacgggcgc acgeaaatca gcgcgtaaat tagetaacca ggcgctagcg 120

ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 180

acgcacggtc tagaatgata aaagctt 207
<210>8 <211> 108 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sintetico <400> 8
ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga aacaaagcgc tgaacctgca gacgcacggt ctagaatgat aaaagctt
60
108
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<210>9 <211> 186 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sintetico
<400> 9

catatgaata acctcgggat tgagggtcgt tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca 60

gcgcgtaaat tagctaacea gactagtggc ggtgggggta gtggeggtgg cggttcgggc 120

gggggtggga gccctagggg atccgtcgac ctgcagggtc tagaagcgct agcgtgataa 180

aagctt 186
<210> 10 <211>180 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sintetico <400> 10

ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgttttggcg gtttcacggg cgcacgcaaa 60

tcagcgcgta aattagctaa ccaggcgcta gcgggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt 120

agcggcggtg gcggtagcgc actagtgctg cagacgcacg gtctagaatg ataaaagctt 180
<210> 11 <211> 249 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetico <400> 11

ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat cgaaggtcgt 60

tacggtggtt tcatgacctc tgaaaaatct cagaccccgc tggttaccct gttcaaaaae 120

gctatcatca aaaacgctta caaaaaaggt gaagcgctag cgggtggtgg tggttctggt 180

ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctgca ctagtgctgc agacgcacgg tctagaatga 240

taaaagctt 245
<210> 12 <211> 207 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetico <400> 12
ggatccacgc
acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat cgaaggtcgt 60
tttggcggtt
tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaac gtaagaacca ggcgctagcg 120
ggcggtggcg
gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 180
acgcacggtc
tagaatgata aaagctt 207
<210> 13 <211> 2709 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetico
10
<400> 13
ggatccatgg
agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagtfcaa cggtgttgac 60
attgcttaca
tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120
cacaacaaaa
tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180
ctgaacccgc
caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240
tctaccgata
acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300
tactccaccg
acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360
ggcggttcta
ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420
cagccggacg
gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480
gatatcatcc
agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540
ggctacggtt
ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600
tccctggaag
tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660
gttaccctgg
ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720
ccgaaccgtg
tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780
agcttcgaag
aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840
gaaaacgagt
tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900
aaagcgaaat
ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa . 960
gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgaoaagg cagtatteaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactaeac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacccggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaattagcta accaggcgct agcgggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtatc aaggttaaca actgggattt attcttcagc 1500 ccgagtgaag acaacttcac caacgacctg aacaaaggtg aagaaatcac ctcagatact 1560 aacatcgaag cagccgaaga aaacatctcg ctggacctga tccagcagta ctacctgacc 1620 tttaatttcg acaacgagcc ggaaaacatt tctatcgaaa acctgagctc tgatatcatc 1680 ggccagctgg aactgatgcc gaacatcgaa cgtttcccaa acggtaaaaa gtacgagctg 1740 gacaaatata ccatgttcca ctacctgcgc gcgcaggaat ttgaacacgg caaatcccgt 1800 atcgcactga ctaactccgt taacgaagct ctgctcaaco cgtcccgtgt atacaccttc 1860 ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt 1920 tgggttgaac agettgttta tgattttacc gacgagaegt ccgaagtatc tactaccgac 1980 aaaattgcgg atatcactat catcaecccg tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac 2040 atgctgtaca aagacgactt cgttggcgca ctgatcttct ccggtgcggt gatcctgctg 2100 gagttcatcc cggaaatcgc catcccggta ctgggcacct ttgctctggt ttcttacatt 2160 gcaaacaagg ttctgactgt acaaaccatc gacaacgcgc tgagcaaacg taacgaaaaa 2220 tgggatgaag tttacaaata tatcgtgacc aactggctgg ctaaggttaa tactcagatc 2280 gacctcatec gcaaaaaaafc gaaagaagca ctggaaaacc aggcggaagc taccaaggca 2340 atcattaact accagtacaa ccagtacacc gaggaagaaa aaaacaacat caacttcaac 2400 atcgacgatc tgtcctctaa actgaacgaa tccatcaaca aagctatgat caacatcaac 2460 aagttcctga accagtgctc tgtaagctat ctgatgaact ccatgatccc gtacggtgtt 2520 aaacgtctgg aggacttcga tgcgtctctg aaagacgccc tgctgaaata catttacgac 2580 aaccgtggca ctctgatcgg tcaggttgat cgtctgaagg acaaagtgaa caatacctta 2640 tcgaccgaca tcccttttca gctcagtaaa tatgtcgata accaacgcct tttgtccact 2700 ctagactag 2709
<210> 14 <211> 902 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sintetico
<400> 14

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso en la prevencion o supresion de un estado doloroso
    espedfico en un individuo, en donde dicho estado doloroso se selecciona del grupo que consiste en: dolor neuropatico, dolor inflamatorio, cefalalgia, dolor somatico, dolor visceral y dolor referido, y en donde dicha protema de fusion polipeptfdica comprende:
    a. una proteasa no citotoxica, o un fragmento de la misma, proteasa o fragmento de proteasa que es capaz de dividir una protema del aparato de fusion exocitosico de un aferente sensorial nociceptivo; en donde la proteasa no citotoxica comprende una cadena L de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA;
    b. un resto de guiado que es capaz de unirse a un sitio de union en el aferente sensorial nociceptivo, sitio de union que es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse en un endosoma en el aferente sensorial nociceptivo en donde el resto de guiado se selecciona del grupo que consiste en: un opioide, nociceptina; p-endorfina, endomorfina-
    1. endomorfina-2, dinorfina, metencefalina, leu-encefalina, galanina y peptido PAR-2;
    c. un sitio de escision de la proteasa en el que la protema de fusion puede ser escindida por una proteasa, en donde el sitio de escision de la proteasa esta situado entre la proteasa no citotoxica o fragmento de la misma y el resto de guiado; y
    d. un dominio de translocacion peptfdico que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de proteasa desde el interior de un endosoma, a traves de la membrana endosomica y al citosol del aferente sensorial nociceptivo;
    en donde el resto de guiado esta situado entre el sitio de escision de la proteasa y el dominio de translocacion, y en donde el resto de guiado y el sitio de escision de la proteasa estan separados por cero residuos de aminoacidos.
  2. 2. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun la reivindicacion 1, en donde el dominio de
    translocacion comprende una cadena H de neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma.
  3. 3. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en donde
    el resto de guiado se une a un receptor ORL1.
  4. 4. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en donde
    el resto de guiado tiene al menos el 80% de homologfa con una secuencias de aminoacidos seleccionada del grupo
    que consiste en: SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma; SEQ ID No. 40 o un fragmento de la misma; SEQ ID No. 42 o un fragmento de la misma; SEQ ID No. 44 o un fragmento de la misma; SEQ ID No. 46 o un fragmento de la misma; SEQ ID No. 48 o un fragmento de la misma o SEQ ID No. 50 o un fragmento de la misma.
  5. 5. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en donde la protema de fusion polipeptfdica comprende una secuencia polipeptfdica segun una SEQ ID NO seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 52, 59, 61, 64, 67, 69, 71, 73, 76, 79, 82, 85 u 88.
  6. 6. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en donde la protema de fusion polipeptfdica esta en la forma de un polipeptido bicatenario en donde:
    a. la primera cadena comprende la proteasa no citotoxica, o un fragmento constitutivo de la misma;
    b. la segunda cadena comprende el RG y los componentes de translocacion; y las cadenas primera y segunda estan ligadas entre sf por enlaces disulfuro.
  7. 7. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en donde el dolor neuropatico se selecciona del grupo que consiste en: neuralgia; desaferenciacion; un smdrome de dolor regional complejo; y neuropatfa.
  8. 8. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el dolor inflamatorio se selecciona de un dolor asociado con un estado inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en: trastorno artntico; enfermedad autoinmunitaria; trastorno de los tejidos conjuntivos; lesion; infeccion; neuritis; o inflamacion articular.
  9. 9. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la cefalalgia se selecciona del grupo que consiste en: cefalea muscular/miogenica; cefalea vascular; cefalea por alta presion arterial; cefalea de traccion e inflamatoria; cefalea hormonal; cefalea de rebote; cefalea por sinusitis cronica; cefalea organica; o cefalea ictal.
  10. 10. Una protema de fusion polipeptfdica para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el dolor somatico se selecciona del grupo que consiste en: tension muscular excesiva; trastorno por movimientos repetitivos; trastorno muscular; mialgia; infeccion; o farmacos.
  11. 11. Una protema de fusion polipeptidica para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el dolor visceral se selecciona del grupo que consiste en: dolor visceral funcional; inflamacion gastrointestinal cronica; dolor autoinmunitario; dolor visceral organico; o dolor visceral inducido por el tratamiento.
  12. 12. Una protema de fusion polipeptidica para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en 5 donde el dolor referido se selecciona del grupo que consiste en dolor asociado con: hernia de disco intervertebral; o
    isquemia miocardica.
    imagen1
    11 H I Ht
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    DPM
    Ensayo de competencia: fusiones de nociceptina-LHN/A con respecto a [3H]-nociceptina 1 nM en GRDe (4°C)
    3000 i
    2500 -
    2000 -
    1500 -
    1000 *
    500 -
    imagen5
    1e-2 1e-1
    —,---------------1-----------—i—
    1e+0 1e+1 1e+2
    Exceso molar
    1e+3
    1e+4
    1e+5
    Absorbancia 450 (nm)
    imagen6
    Concentracion de proteinas (pg/ml)
    imagen7
    DPM
    Ensayo de competencia: fusiones de CPN con respecto a [3H]-nociceptina 1 nM en GRDe durante 1 hora a 4°C
    imagen8
    Exceso molar
    Tocris
    CPN-LiyA
    •€h- CPNv-LHn/A • Controles
    imagen9
    CPN-A (GS10)
    CPN-A (GS15)
    CPN-A (GS25)
    M S FT FUSION
    MS FT
    FUSION
    MS. FT
    FUSON
    -
    CPN-A (GS30)
    CPN-A (HX27)
    % inhibicion de liberacion de SP/escision de SNAP-25
    CPN-Aen GRDe durante 1 dia
    imagen10
    0,1
    10 100
    Concentracion (nM)
    1000 10000
    % inhibicion de liberacion de SP/escision de SNAP-25
    Duracion de accion despues de exposicion a GRDe durante 1 dia
    BoNT/A 0,3 nM
    imagen11
    imagen12
    imagen13
    imagen14
    Nociceptina (Tocris)
    CPN-LHn/A
    CPNv-LHn/A
    300
    250
    = 200
    150
    100
    [Competidorl, exceso molar
    imagen15
    imagen16
    imagen17
    Escision de sintaxina (%)
    imagen18
    imagen19
    imagen20
    Umbral de retirada de la pata (g)
    imagen21
    221
    Dosis (ng)
    Diferencial de FRP normalizado (%) (respuesta maxima - valor de referencia)
    o
    K> . O
    •fc.
    o
    ON
    ©
    00
    o
    o
    o
    imagen22
    (Q
    S)
    ro
    imagen23
    imagen24
    imagen25
  13. 9 .10
    imagen26
    imagen27
    imagen28
    w,
    1 2 3 4 5
    imagen29
    % union total
    imagen30
    imagen31
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