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ES2595489T3 - Métodos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos "ultracortos" basados en PCR - Google Patents

Métodos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos "ultracortos" basados en PCR Download PDF

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ES2595489T3
ES2595489T3 ES14194371.2T ES14194371T ES2595489T3 ES 2595489 T3 ES2595489 T3 ES 2595489T3 ES 14194371 T ES14194371 T ES 14194371T ES 2595489 T3 ES2595489 T3 ES 2595489T3
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nucleic acids
nucleic acid
urine sample
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English (en)
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Eugene M. Shekhtman
Hovsep S. Melkonyan
Samuil R. Umansky
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Cardiff Oncology Inc
Original Assignee
Trovagene Inc
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Publication date
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Abstract

Un método de detección de ácidos nucleicos que no son de hospedador que se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente, que comprende: (a) obtener una muestra de orina de dicho paciente; (b) aislar sustancialmente dichas secuencias de ácido nucleico en dicha muestra, sin excluir ácidos nucleicos de 10 a 150 pares de bases; y (c) ensayar la presencia de una o más secuencias específicas de ácidos nucleicos que no son de hospedador que han atravesado la barrera renal detectando una o más secuencias específicas de 20-50 nucleótidos de longitud, con un método que comprende reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación.

Description

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DESCRIPCION
Metodos para la deteccion de secuencias de acidos nucleicos “ultracortos” basados en PCR Campo de la invencion
La presente invencion proporciona metodos altamente sensibles usados para el diagnostico y control de diversas enfermedades y trastornos detectando y analizando acidos nucleicos “ultracortos” (20-50 pares de bases) obtenidos de fluidos corporales.
Antecedentes de la invencion
La muerte celular es un acontecimiento esencial en el desarrollo y funcionamiento de organismos multicelulares. En organismos adultos, la muerte celular desempena una funcion complementaria a la mitosis en la regulacion de poblaciones celulares. La patogenesis de numerosas enfermedades implica insuficiencia de homeostasis tisular que se supone que esta relacionada con danos citotoxicos o perdida de control normal de muerte celular.
Existen dos tipos principales de muerte celular, la necrosis y la apoptosis, marcados por diferentes caractensticas moleculares y morfologicas (Kerr et al., Br. J. Cancer. 26: 239-257, 1972; Umansky, J. Theor. Biol. 97: 591-602, 1982; Umansky y Tomei, Adv Pharmacol. 41: 383-407, 1997; Ameisen, Cell Death Differ. 11: 4-10, 2004; Lockshin y Zakeri, Int J Biochem Cell Biol. 36: 2405-19,2004; y Kroemer, et al., Cell Death and Differentiation 12: 1463-1467, 2005). La necrosis se considera que es una disfuncion metabolica catastrofica producida directamente por lesion molecular y/o estructural grave y conduce a inflamacion y lesion secundaria a celulas circundantes. La apoptosis, tambien denominada muerte celular programada, es un fenomeno biologico muchos mas frecuente que la necrosis y puede inducirse por senales espedficas tales como hormonas, citocinas, por ausencia de senales espedficas, tales como factores de crecimiento o de adhesion, o por lesion molecular que no causa perdida catastrofica de integridad. La apoptosis es un resultado de una respuesta celular activa que implica el inicio de una cascada ordenada y espedfica de sucesos moleculares. La apoptosis conduce a la aparicion de condensacion y marginacion distintiva de la cromatina, a la fragmentacion nuclear, a la contraccion celular y al ampollamiento de las membranas. La fragmentacion internucleosomal enzimatica de ADN nuclear es un atributo de la apoptosis, aunque algunas celulas mueren por apoptosis sin escision de ADN internucleosomal (Umansky et al., Biochim Biophys Acta. 655: 9-17,1981; Arends et al., Am J Pathol. 136: 593-608, 1990; y Zimmermann et al., Pharmacol Ther. 92: 57-70,2001). Tambien se han descrito otras formas mas raras de muerte celular, caracterizadas por su morfologfa espedfica, por ejemplo, la denominada muerte celular autofagica.
Se sabe bien que la apoptosis, o muerte celular programada, que es una forma principal de muerte celular en organismos multicelulares, viene acompanada por fragmentacion internucleosomal de aDn nuclear. Este ADN se origina en todas las celulas que experimentan apoptosis y por tanto en todos los tejidos del organismo. Muchos laboratorios han demostrado que, en seres humanos, una parte de este ADN aparece en sangre (Lo et al., Ann NY Acad Sci. 945: 1-7, 2001; Lichtenstein et al., Ann NY Acad Sci. 945: 239-249, 2001; Taback y Hoon, Curr Opin Mol Ther. 6: 273-278, 2004; y Bischoff et al., Hum Reprod Update. 8: 493-500, 2002). Tambien se ha observado que este ADN fragmentado atraviesa la barrera renal (ADN Transrenal o ADN-Tr) y que puede detectarse en la orina (Botezatu et al., Clin Chem. 46: 1078-1084, 2000; Su et al., J Mol Diagn. 6: 101-107, 2004; y Su et al., Ann NY Acad Sci. 1022: 81-89, 2004).
Como herramientas de diagnostico se ha usado ADN tanto plasmatico acelular como ADN Transrenal (ADN-Tr) cuando el marcador diagnostico esta en presencia de secuencias conocidas, espedficas, diferentes de ADN genomico masivo. Por ejemplo, la deteccion de ADN espedfico de tumor que resulta de mutaciones caractensticas puede usarse para diagnostico tumoral, la deteccion de secuencias espedficas del cromosoma Y masculino en orina o sangre de una gestante puede usarse para determinar el genero masculino del feto y la deteccion de mutaciones caractensticas de enfermedad hereditaria puede proporcionar una herramienta para ensayos geneticos prenatales (Chan y Lo, Semin Cancer Biol. 12: 489-496, 2002; Goessl, Expert Rev Mol Diagn. 3: 431-442, 2003; Su et al., J Mol Diagn. 6: 101-107, 2004; Wataganara y Bianchi, Ann NY Acad Sci. 1022: 90-99, 2004; Botezatu et al., Clin Chem. 46: 1078-1084, 2000; y Ding et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101: 10762-10767,2004).
El destino del ARN de celulas muertas, en particular, los mecanismos de su degradacion, se investiga mucho menos. Sin embargo, se sabe que el ARN fetal puede detectarse en plasma de gestantes y que el ARN con mutaciones espedficas de tumores puede detectarse en plasma de pacientes con diferentes tipos de cancer (Tsui et al., Ann NY Acad Sci. 2006; 1075: 96-102; Lo y Chiu, Nat Rev Genet. 8: 71-77, 2007; y Tsang y Lo, Pathology 39: 197-207, 2007).
Estos biomarcadores de acido nucleico espedficos a menudo son muy cortos y su concentracion en fluidos corporales es normalmente baja, especialmente si se aborda un ensayo en una fase temprana de la gestacion o de una enfermedad. Por tanto, se requieren nuevos metodos para detectar estos biomarcadores sensibles. La presente invencion aborda esta necesidad en la tecnica.
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Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo de deteccion de acidos nucleicos que no son de hospedador que se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente; y analizar la muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos que no son del paciente que son diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente y que han atravesado la barrera renal comprendiendo el analisis la etapa de detectar dicha una o mas secuencias espedficas en los acidos nucleicos de 20-50 nucleotidos de longitud de la muestra de orina.
La presente invencion tambien proporciona un metodo de deteccion de acidos nucleicos de un patogeno, donde los acidos nucleicos se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente, que incluye la obtencion de una muestra de orina del paciente; y analizar la muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos patogenos que son diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente y son de acidos nucleicos patogenos que tienen 20-50 nucleotidos de longitud y que han atravesado la barrera renal donde el analisis incluye la etapa de detectar la una o mas secuencias espedficas del patogeno.
La presente invencion tambien proporciona un metodo de deteccion de cancer en un paciente que incluye obtener una muestra de orina del paciente; y analizar la muestra de orina para detectar uno o mas acidos nucleicos espedficos de 20-50 nucleotidos de longitud, que son indicativos de cancer, y que han atravesado la barrera renal, donde el analisis incluye la etapa de detectar el uno o mas acidos nucleicos espedficos indicativo de cancer.
La presente invencion tambien proporciona un metodo de deteccion de una enfermedad o trastorno genetico en un feto, que incluye obtener una muestra de orina de una gestante; y analizar la muestra de orina para detectar uno o mas acidos nucleicos fetales espedficos de 20-50 nucleotidos de longitud, que han atravesado las barreras placentaria y renal, donde el analisis incluye la etapa de detectar el uno o mas acidos nucleicos fetales espedficos indicativo de una enfermedad genetica.
La presente invencion tambien proporciona un metodo de control de celulas, tejidos u organos transplantados en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente, que incluye la obtencion de una muestra de orina del paciente; y analizar la muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos que no son del paciente de 20-50 nucleotidos de longitud de las celulas, tejidos u organos trasplantados que son diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente y que han atravesado la barrera renal para controlar las celulas, tejidos u organos transplantados en zonas distintas a las del tracto urinario en el paciente. La etapa de analizar puede adicionalmente incluir analizar cuantitativamente la muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de los acidos nucleicos acelulares, transrenales de celulas muertas en las celulas, tejidos u organos trasplantados, que son diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente donde el analisis comprende la etapa de detectar dicha una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos de las celulas, tejidos u organos trasplantados en los acidos nucleicos que tienen una longitud de 20-50 nucleotidos de las muestras de orina y que han atravesado la barrera renal para controlar el rechazo o aceptacion de las celulas, tejidos u organos trasplantados.
Los acidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. El patogeno puede ser un virus, una bacteria, un hongo, un micoplasma o un protozoo.
La etapa de analizar la muestra de orina puede incluir hibridacion, reaccion de sondas con ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena, o PCR para analizar polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion.
La etapa de analizar la muestra de orina puede incluir una reaccion en cadena de la polimerasa que usa pares de cebadores suficientemente complementarios para hibridarse con una secuencia diana de los acidos nucleicos de interes. Preferentemente, las secuencias de union a la diana para dichos pares de cebadores estan solapadas o inmediatamente adyacentes entre sf.
La degradacion de acido nucleico en la muestra de orina puede reducirse. La reduccion de la degradacion de acido nucleico puede incluir la inhibicion de la actividad nucleasa aumentando el pH, aumentando la concentracion salina, termo inactivando, o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina o dodecilsulfato sodico. Preferentemente, la muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
La etapa de analizar la muestra de orina puede incluir adicionalmente aislar sustancialmente los acidos nucleicos de interes en dicha muestra de orina. Preferentemente, el aislamiento puede ser por precipitacion o usando un material adsorbente solido. Preferentemente, el aislamiento es por adsorcion de los acidos nucleicos en una resina.
En algunas realizaciones, los metodos comprenden adicionalmente filtrar la muestra de orina para eliminar las sustancias contaminantes. Preferentemente, el filtrado elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de
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aproximadamente 1000 nucleotidos o mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
En algunas realizaciones, el analisis comprende cuantificar dichos acidos nucleicos de interes.
A menos que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comunmente entendido por un experto habitual en la tecnica a la cual pertenece esta invencion. Aunque en la practica o ensayo de la presente invencion pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, mas adelante se describen metodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, se controlara la presente memoria descriptiva, incluyendo sus definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion se pondran de manifiesto a partir de la siguiente descripcion detallada y sus reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es una representacion esquematica que muestra la dependencia de la sensibilidad de la PCR sobre el tamano del amplicon.
La Figura 2 es una representacion esquematica que muestra una PCR basada en FRET con cebadores marcados con fluoroforos cerca del extremo 3'.
La Figura 3 es un grafico que muestra la dependencia de la senal de fluorescencia sobre la distancia entre los fluoroforos donador y aceptor.
La Figura 4, Panel A, es un grafico que muestra la deteccion de secuencias espedficas del VEB por PCR en tiempo real basada en FRET. El Panel B muestra una curva de calibracion.
La Figura 5 es un grafico que muestra la amplificacion de una diana SRY de 36 pb en un ensayo de PCR en tiempo real basado en FRET con cebador marcado.
La Figura 6 es un grafico que muestra la deteccion del genero fetal por ensayo de PCR en tiempo real basado en FRET con cebador marcado, de ADN extrafdo de la orina de una gestante.
La Figura 7 es una representacion esquematica que muestra la PCR basada en FRET con cebadores que tienen colas y marcados con fluoroforos cerca del extremo 5'.
La Figura 8 es una representacion esquematica que muestra una version de un ensayo de PCR en tiempo real en un solo tubo en dos fases.
La Figura 9, Panel A, es un grafico que muestra la deteccion de secuencias IS6110 de M. tuberculosis (diana de 39 pb) por el ensayo de PCR en tiempo real en un solo tubo en dos fases de la Figura 8. El Panel B muestra la deteccion de ADN-Tr de M. tuberculosis en las muestras de orina de pacientes con tuberculosis pulmonar y controles no infectados.
La Figura 10 es una representacion esquematica que muestra una segunda version de un ensayo de PCR en tiempo real en un solo tubo en dos fases.
La Figura 11 es un grafico que muestra la amplificacion de patrones SRY (diana de 25 pb) mediante el ensayo de PCR en tiempo real en un solo tubo en dos fases de la Figura 10.
La Figura 12 es un grafico que muestra la deteccion del genero fetal de ADN extrafdo de orina de una gestante por el ensayo de PCR en tiempo real en un solo tubo en dos fases de la Figura 10.
La Figura 13 es un grafico que muestra una comparacion de deteccion de secuencias TSPY espedficas del cromosoma Y (diana de 43 pb) en ADN urinario purificado por metodos de Q-Sepharose y sflice por el ensayo de PCR en tiempo real en un solo tubo en dos fases de la Figura 8.
La Figura 14 es una fotograffa de un gel de sflice que muestra la separacion de acidos nucleicos urinarios de alto/medio y bajo peso molecular en base a su retencion diferencial por sflice en presencia de etanol.
La Figura 15 es una fotograffa de un gel de sflice que muestra la abundancia comparativa de moldes espedficos de MTB en acidos nucleicos fraccionados purificados de la orina de un paciente con tuberculosis pulmonar activa.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona diversos metodos que proporcionan un aumento significativo en la sensibilidad para el analisis de acidos nucleicos acelulares, ultracortos (20-50 pares de bases) obtenidos de un fluido corporal.
Actualmente, los metodos mas sensibles para la deteccion de secuencias de ADN o ARN espedficas se basan en PCR o en otras tecnicas de amplificacion. El analisis de ADN acelular aislado de plasma, orina y heces, por metodos convencionales basados en sflice, demuestran que los fragmentos de ADN originados de celulas fetales o tumorales muertas, son relativamente pequenos, de alrededor de 150 nucleotidos (Chan et al., Cancer Res. 63: 2028-2032, 2003; Botezatu et al., Clin Chem. 46:1078-1084, 2000; Su et al., J Mol Diagn. 6: 101-107,2004; y Diehl et al., Gastroenterology 135: 489-98, 2008). Sin embargo, no siempre se reconoce que la fragmentacion de ADN apoptotico sea al azar, y que por consiguiente, una secuencia diana de interes se localice en fragmentos de ADN que se han escindido de diversas maneras. De hecho, en cualquier poblacion de fragmentos de ADN determinada
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producidos por escision al azar, la probabilidad de que cualquier secuencia diana determinada sobreviva intacta para estar disponible para su uso como un molde de PCR es inversamente proporcional a la longitud de dicha secuencia diana, como se ilustra en la Figura 1. Diferentes lmeas en la Figura 1 representan fragmented de ADN cortos (los fragmented de 157 pares de bases se proporcionan como un ejemplo) generados por escision al azar de K-RAS en la zona del codon 12. La lmea continua en negrita representa el unico fragmento que se amplifica por cebadores disenados para el amplicon de 157 pb. Las lmeas continuas finas representan un subconjunto de fragmentos de ADN amplificados por los pares de cebadores que dirigen el amplicon de 87 pb. Las lmeas discontinuas son fragmentos de ADN que no estan amplificados por ningun conjunto de cebadores. Por ejemplo, Su et al., utilizan dos conjuntos de cebadores disenados para la deteccion de K-RAS mutante (Su, et al., Ann. Nueva York Acad. Sci. 1022: 81-89, 2004).
Las dianas mas largas estan fuera de fase determinadas por los cebadores respectivos. Por tanto, la ventaja de un tamano de diana mas corto es muy significativa, especialmente cuando los tamanos de las dianas se aproximan al promedio de la longitud del fragmento. El ADN aislado de orina con un metodo basado en sflice convencional consta de dos fracciones, ADN de alto peso molecular, que se origina de celulas desprendidas y una fraccion de ADN-Tr de bajo peso molecular (150-250 pares de bases) (Botezatu et al., Clin Chem. 46: 1078-1084,2000; y Su et al., J Mol Diagn. 6: 101-107, 2004).
Ademas, la aplicacion de tecnicas recientemente desarrolladas para aislar acidos nucleicos acelulares de fluidos corporales para el aislamiento de acidos nucleicos transrenales ha revelado en la orina, la presencia de fragmentos de ADN y ARN que son mucho mas cortos de 150 pares de bases (Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 20080139801). Si estos fragmentos tambien representan acidos nucleicos transrenales, la amplificacion de dianas con PCR “ultracortas” u otras tecnicas, capaces de detectar secuencias de acidos nucleicos muy cortas con suficiente especificidad, pueden aumentar significativamente la sensibilidad de los ensayos basandose en analisis de acidos nucleicos acelulares en orina y en otros fluidos corporales.
Otra razon para intentar conseguir dianas “ultracortas” es la posible presencia de roturas (cortes) monocatenarias en fragmentos de ADN acelulares. En la reaccion de PCR, como moldes se usan fragmentos de acido nucleico en su forma monocatenaria, reduciendo asf adicionalmente su longitud eficaz si los fragmentos de ADN acelulares en plasma y ADN-Tr estan cortados. Estas cuestiones requieren un diseno de ensayo PCR capaz de detectar secuencias diana excepcionalmente cortas. Todas las cuestiones comentadas anteriormente tambien pueden aplicarse a cualquier situacion donde deban analizarse fragmentos de ADN cortos degradados al azar, por ejemplo, ADN de muestras tisulares incluidas en parafina, forenses o paleontologicas.
Para disenar cebadores y sondas para la deteccion de dianas de ADN ultracortas por PCR convencional y en tiempo real se usaron diversas estrategias y se describen con detalle en el presente documento. Los datos obtenidos con conjuntos de cebadores/sondas, disenados para la deteccion de dianas de ADN ultracortas (20-50 pares de bases), demuestran: (i) la presencia en la orina de fragmentos de ADN y ARN, que son mucho mas cortos que los descritos anteriormente; (ii) la presencia de estos fragmentos de secuencias de acidos nucleicos de bajo peso molecular que se originan en tejidos localizados fuera del sistema urinario, lo que significa que han atravesado la barrera renal - ADN transrenal (ADN-Tr); (iii) mucha mayor sensibilidad de los ensayos basados en ADN-Tr cuando se detectan dianas de ADN ultracortas en comparacion con tamanos de dianas de PCR convencionales.
La deteccion y analisis de dianas de ADN ultracortas (20-50 pares de bases) en fluidos corporales pueden aumentar significativamente la sensibilidad de los ensayos basados en analisis de fragmentos de ADN-Tr y ADN acelular de otros fluidos corporales. El enfoque de PCR cuantitativa (PCRc) mas comunmente usado es el sistema PCR de TaqMan en Tiempo Real, que implica el uso de 3 componentes espedficos de secuencias diana: 2 cebadores y 1 sonda TaqMan marcada. Este ensayo convencional idoneo para amplicones no mas cortos de aproximadamente 50 bases, estando el tamano mmimo limitado por la longitud de huella combinada de 3 componentes espedficos de secuencia. Existen diversos enfoques de PCRc alternativos que eliminan la necesidad de una sonda TaqMan distinta usando diversas formas de cebadores marcados, lo que por tanto permite dianas correspondientemente mas cortas. Sin embargo, la eliminacion de 1 de los 3 componentes espedficos de secuencia es probablemente reducir la especificidad del ensayo por la diana. La presente invencion aborda la especificidad la diana frente a la longitud de la diana minima desarrollando nuevos ensayos PCRc con cebador marcado y ensayos TaqMan modificados. Se proporcionan diversas estrategias nuevas para el diseno de cebadores y conjuntos de cebadores/sondas para la deteccion y el analisis cuantitativo de secuencias ultracortas por PCR en Tiempo Real. Usando estas tecnicas, se ha demostrado que: (i) el analisis de dianas de ADN ultracortas aumenta significativamente la sensibilidad de los ensayos basados en ADN-Tr; (ii) los fragmentos de ADN cortos (30-150 pares de bases) contienen secuencias de ADN-Tr de ser humano y patogenos; (iii) los fragmentos de ADN-Tr mas grandes tambien se detectan mas eficazmente por cebadores para dianas de ADN ultracortos, mas probablemente debido a la presencia de roturas monocatenarias en estos fragmentos de ADN.
La invencion se refiere a un aumento significativo en la sensibilidad de los ensayos basados en analisis de acidos nucleicos acelulares obtenidos de un fluido corporal seleccionado, pero sin limitacion, del grupo que comprende sangre, plasma sangumeo, suero, linfa, fluido intersticial, orina, saliva, sudor, lfquido cefalorraqrndeo y otros. Preferentemente, el fluido corporal se obtiene de manera no invasiva.
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La presente invencion puede usarse para muchas aplicaciones, incluyendo, pero sin limitacion, analizar la presencia de acidos nucleicos patogenos, detectar la presencia de acidos nucleicos indicativos de cancer, detectar la presencia de acidos nucleicos indicativos de una enfermedad genetica en un feto, analizar la presencia de acidos nucleicos fetales, analizar la presencia de secuencias de acidos nucleicos espedficas de hospedador y espedficas que no son de hospedador, para analizar la forma y el grado de metilacion de un acido nucleico diana, la deteccion de polimorfismos mononucleotfdicos y analisis forenses.
La presente invencion proporciona metodos de deteccion de acidos nucleicos de un patogeno, donde dichos acidos nucleicos se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente, que comprende: (a) obtener una muestra de orina de dicho paciente; y (b) analizar dicha muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos patogenos que son diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente y son de acidos nucleicos patogenos que tienen una longitud de 20-50 nucleotidos y que han atravesado la barrera renal, comprendiendo dicho analisis la etapa de detectar dicha una o mas secuencias espedficas del patogeno.
Un patogeno es un agente biologico que puede causar enfermedades a su hospedador. Un sinonimo de patogeno es “agente infeccioso”. El termino “patogeno” se usa mas frecuentemente para agentes que alteran la fisiologfa normal de un organismo multicelular.
La infeccion es la invasion y multiplicacion de microorganismos en tejidos corporales, que puede ser clmicamente no evidente o producir un dano celular local debido al metabolismo competitivo, toxinas, replicacion intracelular o respuesta de anticuerpo a antigeno.
Los acidos nucleicos patogenos pueden ser ADN o ARN. El patogeno se selecciona del grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un micoplasma y un protozoo.
Los metodos de la invencion pueden aplicarse a todos los agentes patogenos virales, incluyendo virus de ARN, ADN, episomales e integrativos. Tambien puede aplicarse a virus recombinantes, tales como los adenovirus o lentivirus utilizados en terapia genica. Los ejemplos de virus infecciosos incluyen: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, tales como el VIH-1, tambien denominado, HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o VIH-111; y otros aislados, tales como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, coxsackie virus humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Fidoviridae (por ejemplo, virus del Ebola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus paragripal, virus de las paperas, virus del sarampion, virus sincitial respiratorio); Orthomyxoviridae (por ejemplo virus gripal); Buiigaviridae (por ejemplo virus de Hantaan, bungavirus, flebovirus y Nairovirus); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorragica); Reoviridae (por ejemplo reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, poliomavirus); Adenoviridae (la mayona de los adenovirus); Herperviridae (virus del herpes simple (VHS) 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV), herpes virus); Poxviridae (virus de la viruela, virus de la vacuna, poxvirus); e Iridoviridae (por ejemplo virus de la fiebre porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiologicos de encefalopatfas Espongiformes, el agente de la hepatitis delta (que se piensa que es un satelite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no A, no B (clase 1 - internamente trasmitidos; clase 2 - parenteralmente transmitidos (es decir Hepatitis C); virus Norwalk y relacionados y astrovirus).
Los metodos de la invencion pueden aplicarse a todos los agentes bacterianos patogenos. Los ejemplos de bacterias infecciosas incluyen: Helicobacter pyloris, Borrelia (por ejemplo, Borrelia afzelii, Borrelia anserine, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia hermsii, Borrelia recurrentis, Borrelia valaisiana, y Borrelia vincentii); Rickettsia (por ejemplo Rickettsia felis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia africae o Rickettsia akari); Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. Intracellulare, M. kansaii M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeriamonocytogenes, Streptococcuspyogenes (Grupo A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grupo B Streptococcus), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaerobias), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patogena, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium penfi ingers, Clostridium tetani, Enterobacter erogenes, Klebsiella pneuomiae, Pasturella multicoda, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Sreptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira y Actinomyces israelli.
Los ejemplos de hongos infecciosos incluyen: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Otros organismos infecciosos (por ejemplo protistas) incluyen: Plasmodium falciparum y Toxoplasma gondii.
En algunas realizaciones preferidas, el patogeno no viral puede ser Helicobacter pylori, Bacillus anthracis, especies de Plasmodium o especies de Leishmania.
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La etapa de analizar la presencia de dicha secuencia de acido nucleico patogeno de 20-50 nucleotidos de longitud puede realizarse usando una o mas de una variedad de tecnicas, incluyendo, pero sin limitacion, hibridacion, reaccion con sondas de ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena, o PCR para analizar polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion. Preferentemente, la etapa de analisis tambien incluye deteccion fluorescente dependiente de FRET. Preferentemente, la etapa de realizar la reaccion en cadena de la polimerasa puede comprende el uso de cebadores con sitios de union que estan inmediatamente adyacentes entre sf en la secuencia diana o ligeramente solapantes (que no tienen secuencias intermedias entre los sitios de union al cebador).
La presente invencion incluye adicionalmente metodos que tienen la etapa de reducir la degradacion de ADN en dicha muestra de orina, que en una realizacion incluye el tratamiento con un compuesto seleccionado del grupo que comprende: acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico. La degradacion de ADN puede reducirse adicionalmente tomando una muestra de orina que haya permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
En una realizacion, es beneficioso aislar sustancialmente dicha secuencia de acido nucleico antes de analizar en la orina la presencia de una secuencia de acido nucleico patogeno, que ha atravesado la barrera renal. En realizaciones alternativas, la secuencia de acido nucleico se afsla sustancialmente por precipitacion o por tratamiento con un material adsorbente solido. En otra realizacion, la muestra de orina se filtra para eliminar las sustancias contaminantes y, en una realizacion espedfica, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 1000 nucleotidos. Preferentemente, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
En la presente invencion tambien se incluye un kit diagnostico para detectar patogenos en la orina, que comprende: reactivos para facilitar el aislamiento de la orina de ADN de 20-50 nucleotidos de longitud; reactivos para facilitar la amplificacion de ADN de 20-50 nucleotidos de longitud por la reaccion en cadena de la polimerasa; una polimerasa de ADN termoestable; y un oligodesoxinucleotido espedfico para una secuencia de acido nucleico patogeno.
La presente invencion proporciona metodos de deteccion de cancer en un paciente, que comprende: proporcionar una muestra de orina de un paciente; y analizar dicha muestra de orina para detectar una secuencia de acido nucleico de 20-50 nucleotidos de longitud, indicativa de cancer, que ha atravesado la barrera renal.
En una realizacion, el analisis para detectar la presencia de dicha secuencia de acido nucleico comprende amplificar dicha secuencia de acido nucleico indicativa de cancer. En otra realizacion espedfica, dicho analisis comprende cuantificar el numero de copias de dicha secuencia de acido nucleico. En una realizacion dicha secuencia de acido nucleico contiene una anomalfa indicativa de cancer de colon. En otra realizacion, dicha secuencia de acido nucleico contiene ADN K-ras mutante.
El cancer incluye tumores solidos, asf como, tumores hematologicos y/o tumores malignos. Los diversos cancer a tratar incluyen, pero sin limitacion, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, cancer pancreatico, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma renal, hepatoma, cancer de cerebro, melanoma, mieloma multiple, linfoma, linfoma Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfomas juveniles y linfomas de origen linfodtico y cutaneo, leucemia, leucemia juvenil, tricoleucemia, leucemia linfocftica aguda, leucemia mielocftica aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielodtica cronica, leucemia mielogena cronica y leucemia mastocftica, neoplasmas mieloides, neoplasmas mastocfticos, tumor hematologico y tumor linfoide, incluyendo lesiones metastasicas en otros tejidos u organos distantes del sitio tumoral primario. Los canceres a tratar incluyen, pero sin limitacion, sarcoma, carcinoma y adenocarcinoma.
La etapa de analizar la presencia de dicha secuencia de acido nucleico de 20-50 nucleotidos de longitud puede realizarse usando una o mas de una variedad de tecnicas, incluyendo, pero sin limitacion, hibridacion, reaccion con sondas de ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion. Preferentemente, la etapa de analisis tambien incluye deteccion fluorescente dependiente de FRET. Preferentemente, la etapa de realizar la reaccion en cadena de la polimerasa puede comprender el uso de cebadores con sitios de union que estan inmediatamente adyacentes entre sf en la secuencia diana o ligeramente solapantes (es decir sin secuencias intermedias entre los sitios de union al cebador).
La presente invencion incluye adicionalmente metodos que tienen la etapa de reducir la degradacion de ADN en dicha muestra de orina, que, en una realizacion, incluye el tratamiento con un compuesto seleccionado del grupo que comprende: acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N- lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico. La degradacion de ADN puede reducirse adicionalmente tomando una muestra de orina que haya permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
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En una realizacion, es beneficioso aislar sustancialmente dicha secuencia de acido nucleico antes de analizar en la orina la presencia de una secuencia de acido nucleico, indicativa de cancer, que ha atravesado la barrera renal. En realizaciones alternativas, la secuencia de acido nucleico se afsla sustancialmente por precipitacion o por tratamiento con un material adsorbente solido. En otra realizacion, la muestra de orina se filtra para eliminar las sustancias contaminantes, y, en una realizacion espedfica, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 1000 nucleotidos. Preferentemente, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
En otra realizacion adicional, se incluye un metodo para controlar el tratamiento del cancer en un paciente, que comprende: proporcionar una muestra de orina de un paciente; y analizar dicha muestra de orina para determinar la cantidad de una secuencia de acido nucleico de 20-50 nucleotidos de longitud, indicativa de cancer, que ha atravesado la barrera renal.
En la presente invencion tambien se incluye un kit diagnostico para detectar una mutacion genetica indicativa de cancer en el ADN de un paciente, que comprende; reactivos para facilitar el aislamiento de ADN de 20-50 nucleotidos de longitud de la orina; reactivos para facilitar la amplificacion de ADN de 20-50 nucleotidos de longitud por la reaccion en cadena de la polimerasa; una ADN polimerasa termoestable; y un oligodesoxinucleotido espedfico para una secuencia que solo aparece en una mutacion genetica caractenstica de cancer.
La presente invencion proporciona metodos para analizar un fragmento de ADN fetal de 20-50 nucleotidos de longitud que ha atravesado la barrera placentaria y renal, que comprende; obtener, de una gestante, una muestra de orina, que se sospecha que contiene acidos nucleicos transrenales polimericos fetales; y ensayar la presencia de dicho ADN polimerico fetal de 20-50 nucleotidos de longitud en dicha muestra de orina.
En una realizacion de la presente invencion, la presencia del ADN fetal exclusivo particular de 20-50 nucleotidos de longitud es indicativa de una enfermedad genetica.
La secuencia de ADN fetal diana puede ser, por ejemplo, una secuencia que este solo presente en el cromosoma Y. La etapa de ensayar la presencia de una secuencia de ADN fetal exclusiva de 20-50 nucleotidos de longitud puede realizarse usando una o mas de una variedad de tecnicas, incluyendo, pero sin limitacion, hibridacion, reaccion con sondas de ciclado, deteccion de productos de escision , reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion. Preferentemente, la etapa de analisis tambien incluye deteccion fluorescente dependiente de FRET. La etapa de realizar la reaccion en cadena de la polimerasa puede comprender el uso de cebadores sustancialmente complementarios a una parte de la secuencia de ADN fetal exclusiva, y la secuencia de ADN fetal exclusiva puede ser una secuencia que este presente en el genoma paterno y que no presente en el genoma materno. Preferentemente, la etapa de realizar la reaccion en cadena de la polimerasa puede comprender el uso de cebadores con sitios de union que estan inmediatamente adyacentes entre sf en la secuencia diana o ligeramente solapantes (que no tienen secuencias intermedias entre los sitios de union al cebador).
La presente invencion incluye adicionalmente metodos que tienen la etapa de reducir la degradacion de ADN en la muestra de orina. La reduccion de la degradacion de ADN puede ser por tratamiento con compuestos seleccionados del grupo que consiste en: acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de Guanidina, N- lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico. La degradacion de ADN puede reducirse adicionalmente tomando una muestra de orina que haya permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
La presente invencion, incluye metodos en los que el ADN presente en la muestra de orina esta sustancialmente aislado antes del ensayo para detectar la presencia de una secuencia de ADN fetal exclusiva en la muestra de orina. El aislamiento sustancial puede ser, pero sin limitacion, por precipitacion y adsorcion en una resina.
En algunos casos, puede ser deseable filtrar la muestra de orina para eliminar los acidos nucleicos contaminantes antes del ensayo. En una realizacion espedfica, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 1000 nucleotidos. Preferentemente, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
La presente invencion incluye adicionalmente un metodo para determinar el sexo de un feto, que comprende: obtener de una gestante una muestra de orina, que se sospecha que contiene ADN masculino fetal de 20-50 nucleotidos de longitud; amplificar una parte del ADN masculino de 20-50 nucleotidos de longitud presente en la muestra de orina por reaccion en cadena de la polimerasa, usando un cebador oligodesoxinucleotfdico que tiene secuencias espedficas para una parte del cromosoma Y, para producir ADN amplificado; y detectar la presencia del ADN amplificado.
La presente invencion tambien incluye un kit diagnostico para detectar, en la orina materna, la presencia de ADN fetal masculino humano de 20-50 nucleotidos de longitud, que comprende: reactivos para facilitar el aislamiento de ADN de la orina; reactivos para facilitar la amplificacion de ADN por la reaccion en cadena de la polimerasa; una
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ADN polimerasa termoestable; y un oligodesoxinucleotido espedfico para una secuencia que solo se produce en el cromosoma Y.
La presente invencion tambien incluye metodos para analizar en la orina una secuencia de acido nucleico diana de 20-50 nucleotidos de longitud, que comprende: proporcionar una muestra de orina; y ensayar la muestra de orina para determinar la presencia de una secuencia de acido nucleico diana de 20-50 nucleotidos de longitud que ha atravesado la barrera renal.
En una realizacion, la secuencia de acido nucleico diana de 20-50 nucleotidos de longitud comprende una secuencia genica alterada, y esta secuencia genica alterada puede comprender una modificacion que se produce espedficamente en celulas tumorales. La secuencia de acido nucleico diana de 20-50 nucleotidos de longitud puede ser un acido nucleico de hospedador o un acido nucleico que no es de hospedador.
Las secuencia de acido nucleico diana puede ser un polimorfismo mononucleotfdico (SNP), que es una variacion de secuencia de ADN que se produce cuando un solo nucleotido en el genoma (u otra secuencia compartida) difiere entre miembros de una especie (o entre cromosomas emparejados en un individuo). La secuencia de acido nucleico que comprende el SNP puede tener cualquier longitud. Preferentemente, la secuencia de acido nucleico que comprende el SNP tiene menos de 50 nucleotidos. Mas preferentemente, la secuencia de acido nucleico que comprende el SNP tiene una longitud entre 20-50 nucleotidos. La secuencia de acido nucleico que comprende el SNP puede ser un acido nucleico de hospedador o un acido nucleico que no es de hospedador.
La presente invencion tambien incluye metodos para analizar una secuencia de acido nucleico diana de 20-50 nucleotidos de longitud en cualquier fluido o tejido corporal para realizar analisis forenses, que comprende: proporcionar una muestra de fluido o tejido; y ensayar la muestra de fluido o tejido para detectar la presencia de una secuencia de acido nucleico diana de 20-50 nucleotidos de longitud que ha atravesado la barrera renal. El metodo puede comprender adicionalmente el analisis cuantitativo de dicha secuencia de acido nucleico diana. Preferentemente, el metodo puede comprender adicionalmente la secuenciacion de dicha secuencia de acido nucleico diana usando cualquier metodo conocido en la tecnica.
La etapa de ensayar la presencia de una secuencia de ADN diana puede seleccionarse del grupo que consiste en hibridacion, reaccion con sondas de ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion. La etapa de ensayo para detectar la presencia de una secuencia de ADN diana puede comprender tecnicas para amplificar el aDn diana. Preferentemente, la etapa de analisis tambien incluye deteccion fluorescente dependiente de FRET. Preferentemente, la etapa de realizar la reaccion en cadena de la polimerasa puede comprender el uso de cebadores con sitios de union que estan inmediatamente adyacentes entre sf en la secuencia diana o ligeramente solapantes (es decir sin secuencias intermedias entre los sitios de union al cebador).
La presente invencion tambien incluye metodos que tienen la etapa de reducir la degradacion de ADN en la muestra de orina antes de ensayar la muestra de orina para detectar la presencia de una secuencia de ADN diana que ha atravesado la barrera renal. La reduccion de la degradacion de ADN puede ser por tratamiento con compuestos seleccionados del grupo que consiste en: acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico. La degradacion de ADN puede reducirse adicionalmente tomando una muestra de orina que haya permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
La presente invencion incluye metodos en los que el ADN en la muestra de orina esta sustancialmente aislado antes de ensayar la presencia de una secuencia de ADN diana que ha atravesado la barrera renal. El aislamiento sustancial puede ser, pero sin limitacion, por precipitacion y adsorcion en una resina. En algunos casos, es deseable filtrar la muestra de orina para eliminar los acidos nucleicos contaminantes antes de ensayar la presencia de una secuencia de ADN diana que ha atravesado la barrera renal. En una realizacion espedfica, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 1000 nucleotidos. Preferentemente, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
La presente invencion tambien incluye metodos para analizar en la orina una secuencia de acido nucleico diana, que comprende: proporcionar una muestra de orina de un paciente, que se sospecha que contiene ADN que ha atravesado la barrera renal,; amplificar una secuencia de ADN diana en el ADN que ha atravesado la barrera renal, que comprende el uso de un cebador sustancialmente complementario a una parte de la secuencia de ADN diana que no se produce en celulas del tracto urinario del paciente y preparar ADN diana amplificado; y detectar la presencia del ADN diana amplificado. La amplificacion puede comprender realizar una reaccion en cadena de la polimerasa. La secuencia de ADN diana puede comprender una secuencia genica alterada, tal como una modificacion que se produce en celulas tumorales.
La presente invencion proporciona metodos para controlar material trasplantado en un paciente, que comprende; proporcionar una muestra de orina que se sospecha que contiene acido nucleico de material trasplantado; y analizar dicha muestra de orina para detectar una secuencia de acido nucleico de 20-50 nucleotidos de longitud que ha
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atravesado la barrera renal y que no esta presente en el paciente antes del trasplante. En una realizacion espedfica, la secuencia de acido nucleico de 20-50 nucleotidos de longitud no esta presente en las celulas del tracto urinario de dicho paciente.
En una realizacion espedfica, el analisis comprende amplificar dicha secuencia de acido nucleico de 20-50 nucleotidos de longitud con un cebador sustancialmente complementary a una parte de dicha secuencia de acido nucleico que no se produce en celulas del tracto urinario del paciente, para preparar ADN diana amplificado, y detectar la presencia de dicho ADN diana amplificado. Mas espedficamente, la amplificacion puede comprender realizar una reaccion en cadena de la polimerasa. Preferentemente, la etapa de analisis tambien incluye deteccion fluorescente dependiente de FRET. Preferentemente, la etapa de realizar la reaccion en cadena de la polimerasa puede comprender el uso de cebadores con sitios de union que estan inmediatamente adyacentes entre sf en la secuencia diana o ligeramente solapantes (que no tienen secuencias intermedias entre los sitios de union al cebador).
En otra realizacion espedfica se incluye la etapa adicional de reducir la degradacion de ADN en dicha muestra de orina, lo cual puede realizarse de cualquier manera conocida, aunque incluye, sin limitacion, situaciones en las que la reduccion de la degradacion de ADN es por tratamiento con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico. La degradacion de ADN puede reducirse adicionalmente tomando una muestra de orina que haya permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
En algunas realizaciones es deseable aislar sustancialmente dicha secuencia de acido nucleico. En realizaciones alternativas, la secuencia de acido nucleico se afsla sustancialmente por precipitacion y/o por adsorcion sobre una resina. Adicionalmente, se puede filtrar la muestra de orina para eliminar las sustancias contaminantes. En una realizacion espedfica, la filtracion elimina ADN que comprende mas de aproximadamente 1000 nucleotidos.
En la presente invencion tambien se incluye un kit diagnostico para detectar en la orina de un paciente ADN de un material trasplantado, que comprende: reactivos para facilitar el aislamiento de la orina de ADN de 20-50 nucleotidos de longitud; reactivos para facilitar la amplificacion de ADN de 20-50 nucleotidos de longitud mediante la reaccion en cadena de la polimerasa; ADN polimerasa termoestable; y un oligodesoxinucleotido espedfico para una secuencia que se produce en el material trasplantado, y que no se produce en el paciente antes del trasplante.
La presente invencion proporciona metodos para analizar la presencia de secuencias espedficas fetales de acido nucleico ultracorto o modificaciones de acido nucleico ultracorto detectando secuencias espedficas fetales de acido nucleico en fluidos corporales. Preferentemente, las secuencias de acido nucleico han atravesado las barreras placentaria y renal y estan presentes en la orina materna. Los metodos generalmente implican las etapas de obtener una muestra de orina de una gestante y someter el material a un metodo para detectar una secuencia espedfica fetal de acido nucleico ultracorto o modificacion de interes. En una realizacion, el metodo incluye adicionalmente purificar sustancialmente acidos nucleicos presentes en la muestra de orina antes de detectar la secuencia espedfica de acido nucleico ultracorto o modificacion de interes. Estos metodos tienen una variedad de aplicaciones diagnosticas, que incluyen la determinacion del sexo del feto y la identificacion de enfermedades geneticas fetales, tales como las heredadas del padre para diversos fines, incluyendo determinaciones de paternidad.
La invencion descrita en el presente documento puede usarse, por ejemplo, para diagnosticar cualquiera de mas de 3000 enfermedades geneticas actualmente conocidas o a identificar (por ejemplo hemofilia, talasemia, distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer y fibrosis qrnstica). Cualquier enfermedad genetica para la que se conoce la mutacion (o mutaciones) u otra modificacion (o modificaciones) y la secuencia de nucleotidos circundante, puede identificarse mediante los metodos de la presente invencion. Algunas enfermedades pueden estar relacionadas con variaciones conocidas en metilacion de acidos nucleicos, que tambien pueden identificar los metodos de la presente invencion.
Ademas, cada vez hay mas pruebas de que algunas secuencias de ADN pueden predisponer a un individuo a cualquiera de una serie de enfermedades tales como diabetes, arteriosclerosis, obesidad, diversas enfermedades autoinmunitarias y cancer (por ejemplo, cancer colorrectal, de mama, de ovario, de pulmon) o anomalfas cromosomicas (prenatal o postnatalmente). El diagnostico de una enfermedad genetica, aneuploidfa cromosomica o predisposicion genetica puede realizarse prenatalmente recogiendo de la gestante un fluido corporal apropiado, tal como orina.
Los analisis de ADN ultracorto obtenidos no invasivamente de un fluido corporal proporcionan un modo mas facil y seguro para realizar el ensayo prenatal. Preferentemente, el fluido corporal es orina. Un feto recibe la misma cantidad de informacion genetica de ambos padres. La perdida de una gran cantidad de celulas fetales durante el desarrollo es una parte principal del programa genetico para las diferenciaciones embrionarias y la formacion de un organismo normal. El ADN de estas celulas embrionarias muertas no solo se libera en la corriente sangumea de la madre, sino que tambien atraviesa la barrera renal donde aparece en la orina materna. Las partes del cromosoma Y espedfico del genero masculino se han descubierto en la orina de gestantes con fetos de dicho genero. La informacion genetica fetal se encontro en la orina de la madre tan pronto como de la 7a a la 8a semana de gestacion,
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es decir, al menos 6-8 semanas antes de poder obtenerse por amniocentesis o muestreo de vellosidades corionicas. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° RE39.920.
En una realizacion de esta invencion, puede usarse un ensayo no invasivo sencillo para la determinacion precoz del sexo fetal. Sin embargo, hay consecuencias mas transcendentales de estos hallazgos con respecto al desarrollo de modernas tecnicas diagnosticas seguras. El descubrimiento de que el ADN ultracorto del embrion en desarrollo aparece en la orina materna presenta la oportunidad de desarrollar rapidamente productos para analisis de genes hereditarios del padre. Estos incluyen genes que contienen mutaciones relacionadas con enfermedades o que pueden causar problemas en diferentes trasfondos geneticos. Como ejemplo, si una gestante es Rh-(factor Rhesus negativo) y produce anticuerpos anti-RhD y el padre es Rh+, normalmente se recomienda la amniocentesis para un diagnostico precoz de incompatibilidad de Rh, que a menudo producen anemia hemolttica letal en el bebe recien nacido. La deteccion de la secuencia espedfica del gen de RhD en la orina materna sera una excelente alternativa a la amniocentesis, considerada cada vez mas peligrosa por la mayona de medicos de todo el mundo. Este ensayo tambien es menos costoso y mas rentable, porque evita la necesidad de una etapa quirurgica para obtener muestras para el analisis.
Con la llegada de iniciativas de amplio mapeo genetico, tal como el Proyecto del Genoma Humano, hay una lista de dianas y aplicaciones que se amplia para el analisis genetico de ADN ultracorto en orina. Muchas enfermedades heredadas por el feto seran facilmente detectables por analisis de ADN en la orina materna. Estas incluyen el Smdrome de Marfan, la anemia falciforme, la enfermedad de Tay Sachs y un grupo de trastornos neurodegenerativos, que incluyen la enfermedad de Huntington, la ataxia espinocerebelar 1, la enfermedad de Machado-Joseph, la atrofia dentato-rubro-palido-luisiana y otras que afectan al feto y al recien nacido. El analisis de ADN en la orina puede detectar la presencia del gen mutante heredado del padre. Ademas, si el genoma de la madre lleva una mutacion, el ensayo puede ayudar a determinar si una version normal del gen se ha heredado del padre.
Ademas de proporcionar respuestas a las cuestiones normalmente formuladas por los futuros padres, la determinacion del sexo fetal tambien puede ser muy util si hay riesgo de enfermedad hereditaria ligada al cromosoma X, por ejemplo Hemofilia o Distrofia Muscular de Duchenne. De nuevo, el ensayo prenatal para enfermedades hereditarias se realiza habitualmente con espedmenes obtenidos por amniocentesis. Existen dos desventajas principales de esta tecnologfa: en primer lugar, la amniocentesis solo puede realizarse despues de la decimocuarta semana de gestacion. En segundo lugar, en algunos casos, el riesgo asociado con un trastorno hereditario es comparable con el riesgo asociado con el procedimiento quirurgico de la amniocentesis. La tecnologfa basada en ADN presente en orina puede ofrecer la informacion evitando al mismo tiempo ambos problemas.
Los metodos de la presente invencion proporcionan un aumento significativo en cuanto a sensibilidad para analizar acidos nucleicos acelulares, fetales y ultracortos (20-50 pares de bases).
Otro factor importante que contribuye al exito de cualquier nuevo ensayo diagnostico es la necesidad de que los pacientes y los medicos expresen una preferencia para el nuevo ensayo. Con frecuencia, las pacientes rechazan el ensayo prenatal invasivo debido a los riesgos acompanantes para el feto y la madre. Si a partir de un ensayo de orina seguro y sencillo, puede obtenerse la misma informacion, es probable que el ensayo tenga una aceptacion generalizada por el publico y la comunidad medica.
La presente invencion tambien proporciona metodos que permiten la deteccion de secuencias de acido nucleico ultracorto espedficas que se originan del acido nucleico endogeno del propio paciente. Estas secuencias de acido nucleico ultracorto se obtienen de modo no invasivo de un fluido corporal. Preferentemente, las secuencias de acidos nucleico deben atravesar la barrera renal para aparecer en la orina. El metodo generalmente implica las etapas de obtener una muestra de orina de un paciente y someter el material a un metodo para detectar una secuencia de acido nucleico diana. En una realizacion, el metodo incluye adicionalmente purificar sustancialmente los acidos nucleicos presentes en la muestra de orina antes de detectar el acido nucleico diana. Este metodo tiene una variedad de aplicaciones diagnosticas, incluyendo, pero sin limitacion, diagnosticos de tumores y diagnosticos de enfermedades causadas por expansion clonal de celulas que contienen modificaciones de ADN acompanadas por muerte de al menos un subconjunto de las celulas portadoras de modificaciones de ADN.
El exito del tratamiento tumoral normalmente depende del tipo de tumor y del metodo de tratamiento. Sin embargo, el factor mas importante que determina el exito de la terapia del cancer es la deteccion del tumor en la fase mas temprana posible del desarrollo. Cuanto mas pronto se detecte un tumor mejor sera el pronostico. En muchas afecciones pre-neoplasicas, tales como predisposicion hereditaria a un tipo de tumor espedfico o a una enfermedad que promueve la transformacion neoplasica, (por ejemplo hepatitis y cirrosis cronica), se estan aplicando actualmente esfuerzos significativos para la deteccion precoz del tumor aunque las tecnicas existentes son normalmente invasivas y costosas. El arsenal de los oncologos incluye ahora ensayos que no son solo invasivos, con frecuencia peligrosos, sino tambien menos fiables de lo esperado.
Desde el punto de vista del paciente, los ensayos invasivos son costosos y suficientemente desagradables para justificar la decision de renunciar a ensayos necesarios, tales como recto colonoscopfa para el diagnostico de cancer
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colorrectal. El problema del cumplimiento es de suma importancia cuando los pacientes en riesgo se animan a someterse a procedimientos que son claramente molestos y desagradables. La mejora drastica del cumplimiento de los pacientes de alto riesgo es una necesidad absoluta para el futuro. Por tanto, el desarrollo de nuevos metodos para la deteccion precoz de tumores es absolutamente necesario para un progreso sustancial en este campo de la medicina. Tambien esta claro que dichos metodos no deben basarse solo en tecnicas mas sensibles para la deteccion de smtomas clmicos de crecimiento neoplasico, sino mas bien en dar a conocer marcadores espedficos de celulas tumorales.
Los metodos de la presente invencion proporcionan un aumento significativo en sensibilidad para analizar acidos nucleicos acelulares, ultracortos (20-50 pares de bases), que se originan del acido nucleico endogeno del propio paciente o sujeto.
Los cambios celulares precoces que pueden usarse como un marcador de transformacion neoplasica son cambios que causan la transformacion, es decir, modificacion de genetica y epigenetica de ADN. Los diversos cambios en las secuencias de ADN y/o en el estado de metilacion de las islas CpG (especialmente de las localizadas en regiones promotoras de genes supresores de tumores) se usan actualmente como marcadores tumorales. A medida que se descubrieron mas de dichos marcadores, se ha hecho evidente que algunos son caractensticos de fases tumorales precoces, o incluso de afecciones pre-neoplasicas. Otras modificaciones del ADN pueden indicar fases relativamente tardfas de transformacion neoplasica. Tambien hay esperanzas de que algunos cambios en las secuencias de ADN y su patron de metilacion ayuden a predecir el potencial metastasico y la sensibilidad de las celulas tumorales contra diferentes agentes quimioterapeuticos. La muerte celular se produce en todas las fases del crecimiento tumoral y la deteccion de cambios espedficos de tumores en el ADN de la orina puede ser un excelente marcador para el diagnostico tumoral y para el control de la terapia antitumoral. Una mutacion espedfica de tumor del gen K-ras puede detectarse en la orina de pacientes con tumores colorrectales que portan esta mutacion.
Uno de los mayores desaffos clmicos para la quimioterapia tumoral es la sensibilidad variable de diferentes tumores a farmacos anti-tumorales y la ausencia de un ensayo sencillo para la evaluacion rapida en una fase precoz de la terapia anti-tumoral. Normalmente, el oncologo puede observar los resultados del tratamiento solo despues de varios meses. Mientras tanto, el tumor puede seguir creciendo y posiblemente metastatizando si el regimen quimioterapeutico es ineficaz. Una realizacion de la presente invencion, util para el control inmediato de la eficacia de la terapia tumoral, es el analisis cuantitativo de mutaciones espedficas de tumores en el ADN de la orina de los pacientes. Si el tratamiento es eficaz, entonces mueren mas celulas tumorales, y aumentara la proporcion de la secuencia mutante con respecto a cualquier secuencia de referencia normal contenida en la orina. Eventualmente, si la quimioterapia es eficaz, la secuencia espedfica de tumor mutante desaparecera. Analisis periodicos de un ADN de la orina de un paciente puede usarse para controlar un posible recrecimiento tumoral. La indicacion temprana de ineficacia quimioterapeutica permitina tiempo para intentar otros tratamientos quimioterapeuticos y anti-tumorales. Este enfoque es similarmente eficaz para la evaluacion de la eficacia de la radioterapia y otras terapias contra el cancer y para controlar despues el tratamiento quirurgico de crecimientos cancerosos.
La presente invencion tambien proporciona metodos que permiten la deteccion de secuencias de acido nucleico ultracorto espedficas que no se originan de las secuencias de acido nucleico endogeno del paciente. Estas secuencias de acido nucleico ultracorto se obtienen de manera no invasiva de un fluido corporal. Preferentemente, las secuencias de acido nucleico deben atravesar la barrera renal para aparecer en la orina. Las etapas son las mismas que para la deteccion de acidos nucleicos originados de hospedador, excepto que el metodo de deteccion se selecciona para secuencias de acido nucleico que no son de hospedador. Este metodo tiene una diversidad de aplicaciones diagnosticas, incluyendo, pero sin limitacion, el diagnostico de infeccion por patogenos que contienen acido nucleico que infectan zonas distintas a las del tracto urinario, y no liberan acidos nucleicos directamente al tracto urinario.
Los metodos de la presente invencion proporcionan un aumento significativo en sensibilidad para analizar acidos nucleicos acelulares, ultracortos (20-50 pares de bases) que no se originan del acido nucleico endogeno del propio paciente o sujeto.
En una realizacion, la presente invencion tiene importantes aplicaciones en la ciencia de trasplante de organos y tejidos. El trasplante de diferentes organos, tejidos y celulas u otro material que contiene acidos nucleicos (denominado "material trasplantado") se usa ahora ampliamente en la practica clmica. El problema mas importante con el que tiene que enfrentarse el paciente trasplantado y el sistema de administracion sanitario es el requisito para controlar cuidadosamente la respuesta inmunitaria normal del receptor que conduce al rechazo y fracaso del trasplante. A pesar de la intensa terapia disenada para suprimir la respuesta inmunitaria del receptor, los episodios de rechazo a menudo se producen durante el periodo posterior al trasplante y su deteccion precoz puede ser muy util, si no cntica, para un control clmico eficaz.
Cada persona tiene un patron de genes codificados por ADN exclusivo y unico. Dado que el ADN del donante es geneticamente diferente del ADN del receptor, la presente invencion puede usarse para "controlar material trasplantado" que se define como detectar y/o medir el rechazo o la aceptacion de organos, tejidos y celulas trasplantados por el receptor. Esto reducira e incluso eliminara en algunos casos la necesidad de tomar biopsias de
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tejido de pacientes ya debilitados. Se ha descrito un ensayo para determinar la presencia de secuencias de ADN espedficas del cromosoma Y en la orina de mujeres receptoras que han recibido transfusiones sangumeas con sangre de varones. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° RE39.920. Estos experimented demostraron que, debido a la muerte de leucocitos del donante varon, las secuencias espedficas del cromosoma Y aparedan en la orina de la mujer receptora. Estas celulas sangumeas mueren de la misma manera que las celulas de un organo trasplantado que ha sido atacado por el sistema inmunitario del receptor. Los metodos de la presente invencion pueden usarse para rastrear el progreso de receptores de trasplantes de celulas, tejidos u organos.
Los cambios en la metilacion de ADN de regiones genomicas espedficas afectan a la estructura de la cromatina y a la transcripcion de ADN, y por consiguiente, se estan investigado para determinar su implicacion en diversos procesos patologicos. Como tal, el analisis de metilacion del ADN transrenal ultracorto es una herramienta diagnostica util.
Las mutaciones y cambios en el estado de metilacion del ADN que se producen durante la progresion tumoral pueden usarse como marcadores tumorales (Esteller et al., Cancer Res 59:67-70,1999; Wong et al., Cancer Res 59: 71-3, 1999). Diversos cambios en las secuencias de ADN y/o en el estado de metilacion de islas CpG (especialmente las localizadas en regiones promotoras de genes supresores tumorales) se usan actualmente como marcadores tumorales (Baylin et al, Adv Canc Res. 72: 141-96,1998). Tambien hay esperanzas de que algunos cambios en las secuencias de ADN y su patron de metilacion ayuden a predecir el potencial metastasico y la sensibilidad de las celulas tumorales contra diferentes agentes quimioterapeuticos, la metilacion en islas CpG de algunos genes, por ejemplo, el gen de MYF-3, puede relacionarse con diferentes fases de carcinogenesis. La hipermetilacion de este gen en comparacion con mucosa normal se observo en el 88 % de adenomas y en el 99 % de carcinomas (Shannon et al, Int J Cancer 84: 109-13,1999).
Para el CHC no hay marcadores fiables basados en mutaciones de ADN. Sin embargo, en este caso hay un grupo de marcadores en desarrollo que se basan en la metilacion de islas CpG en una region promotora genica, por ejemplo, el promotor p16 o GSTP1. La metilacion de p16 se encontro en mas del 70 % de los tejidos de CHC y entre los casos de CHC con metilacion aberrante tambien se detectaron cambios similares en aproximadamente el 80 % de las muestras de plasma (Wong et al, Cancer Res. 59: 71-3,1999; Matsuda et al, Gastroenterologfa 116: 394-400,
1999) . La hipermetilacion somatica de islas CpG en GSTP1 se observo en ADN de mas del 80 % de casos de CHC (Tchou et al, Int J Oncol 16: 663-76, 2000).
La metilacion de islas CpG en promotores de genes supresores tumorales conduce a su inactivacion y esta implicada en afecciones pre-neoplasicas y carcinogenesis, y, como tal, puede usarse para el diagnostico de aquellos procesos patologicos. La metilacion de genes receptores de estrogeno se ha relacionado con enfermedad cardiaca (Fricker J., Mol. Med. Today, 5, 505-506,1999). El smdrome del cromosoma X fragil no solo esta asociado con la expansion del numero de repeticiones en tandem del trinucleotido CGG en la region 5' no traducida del gen FMR1 sino tambien con la hipermetilacion en las repeticiones CGG y las islas CpG adyacentes (Panagopoulos et al., Hum. Mutat., 14,71-79,1999). El analisis del estado de metilacion en las islas CpG del gen del polipeptido N asociado a la ribonucleoprotema nuclear pequena (SNRPN) usando cultivos celulares de lfquido amniotico o muestras de vellosidades corionicas cultivadas se ha recomendado para el diagnostico prenatal del smdrome de Prader-Willi y Angelman (Kubota et al., J. Med. Genet., 33,1011-1014,1996). La hipermetilacion de ADN de la region promotora del gen de la E-cadherina es caractenstica de hepatitis cronica y cirrosis hepatica (Kanai et al., Cancer Lett., 148, 73-80,
2000) . Por supuesto, muchas mas modificaciones en el estado de metilacion del ADN estaran asociadas con diversas enfermedades en el futuro. La deteccion de estas modificaciones en el ADN transrenal sera un marcador util en el ensayo prenatal asf como para el diagnostico de procesos patologicos en organismos adultos.
Tambien se sabe que el envejecimiento viene acompanado por cambios espedficos en el estado de metilacion del genoma, la hipermetilacion de algunas islas CpG y la desmetilacion en regiones codificantes del genoma (Toyota and Issa, Seminars in Cancer Biol., 9, 349-357, 1998). La deteccion de estos cambios en el ADN transrenal, que contiene fragmentos de ADN de diversos tipos de celulas, puede usarse como un marcador de procesos de envejecimiento normal y patologico.
En diversas referencias, incluyendo, pero sin limitacion, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Vol. 1-3, eds. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); y Current Protocols en Molecular Biology, eds. Ausubel et al., Greene Publishing y Wiley-Interscience: Nueva York (1987) y actualizaciones periodicas, se describen tecnicas de manipulacion de acido nucleico utiles para la practica de la presente invencion. Descripciones espedficas, aunque sin pretender limitar el alcance de la presente invencion, proporcionan una orientacion en la practica de determinados aspectos de la presente invencion.
El ADN se somete a degradacion por DNasas presentes en fluidos corporales, tales como orina. La presente invencion incluye diversos metodos para prevenir o reducir la degradacion de ADN al mismo tiempo en la orina de tal manera que secuencias suficientemente grandes esten disponibles para la deteccion por metodos de deteccion de ADN conocidos tales como los descritos a continuacion. En una realizacion, las muestras de orina se toman cuando la orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas, en una realizacion espedfica la orina permanece en la vejiga urinaria durante menos de 5 horas, mas preferentemente durante menos de 2 horas. La recogida y
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analisis de una muestra de orina antes de haber permanecido en la vejiga urinaria durante un largo penodo de tiempo reduce la exposicion del ADN a cualquier DNasa presente en la orina.
En otra realizacion de la presente invencion, despues de su recogida, la muestra de orina se trata usando uno o mas metodos de inhibicion de la actividad DNasa. Los metodos para inhibir la actividad DNasa incluyen, pero sin limitacion, el uso de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), clorhidrato de guanidina, GITC (isotiocianato de guanidina), N-lauroilsarcosina, dodecilsulfato sodico (SDS), concentracion salina elevada y termoinactivacion de DNasa.
Incluso en otra realizacion, despues de la recogida, la muestra de orina se trata con un adsorbente que atrapa el ADN, despues de lo cual el adsorbente se retira de la muestra, se lava y se trata para liberar el ADN atrapado para la deteccion y analisis. Este metodo no so lo afsla el ADN de la muestra de orina, sino que, cuando se usa con algunos adsorbentes, incluyendo, pero sin limitacion membranas de Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Piscataway, NJ) protege al ADN de la degradacion por actividad DNasa.
En algunos casos, la cantidad de ADN en una muestra de orina es limitada. Por lo tanto, para determinadas aplicaciones, la presente invencion incluye realizaciones en las que la sensibilidad de deteccion aumenta mediante cualquier metodo (o metodos) conocido en la tecnica incluyendo, sin limitacion, uno o mas de los siguientes metodos.
Cuando el ADN esta presente en cantidades minoritarias en la orina, pueden recogerse muestras de orina mas grandes y despues de eso concentrarse mediante cualquier medio que no afecte a la deteccion del ADN presente en la muestra. Algunos ejemplos incluyen, sin limitar el alcance de la invencion, la reduccion de lfquidos presentes en la muestra mediante concentracion con butanol o concentracion usando Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway NJ).
La PCR anidada puede usarse para mejorar la sensibilidad por diversos ordenes de magnitud. Debido a la vulnerabilidad de la PCR anidada contra resultados imprecisos debido a la contaminacion del ADN, en una realizacion de la presente invencion, se toman precauciones para impedir la contaminacion del ADN de la muestra. Por ejemplo, sin limitar la presente invencion, se pueden tratar reactivos de la PCR con una o mas endonucleasas de restriccion que escinden dentro de la secuencia diana, antes de anadirlos a la muestra de ADN de ensayo.
En una realizacion, la presente invencion incluye purificar o aislar sustancialmente acidos nucleicos de una muestra antes de la deteccion. Las moleculas de acido nucleico pueden aislarse de la orina usando cualquiera de los diversos procedimientos que son muy conocidos en la tecnica. Se acepta cualquier metodo de aislamiento que facilite la deteccion de acido nucleico diana. Por ejemplo, el ADN puede aislarse por precipitacion, como describen Ishizawa et al., Nucleic Acids Res. 19, 5972 (1991). Cuando una muestra de gran volumen contiene una baja concentracion de ADN, como con la orina, se incluye un metodo de aislamiento de ADN preferido. En este metodo, se trata una muestra con un adsorbente que actua concentrando el ADN. Por ejemplo, una muestra puede tratarse con un material solido que adsorbera el ADN, tal como, sin limitacion, DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway NJ), un filtro de ADN y/o leche de vidrio. La muestra de ADN se eluye del adsorbente despues lavar las otras composiciones.
Considerando la sensibilidad de diversas tecnicas de analisis de acido nucleico, tales como la PCR, la presente invencion tambien incluye metodos para reducir la presencia de acidos nucleicos contaminantes en la muestra de orina. La contaminacion de muestras de orina con secuencias de acido nucleico que no han atravesado la barrera renal puede introducirse por celulas que se desprenden del revestimiento del tracto urinario, por relaciones sexuales, o durante el procesamiento de la muestra de orina antes de la deteccion de la secuencia de ADN de interes. Sin pretender limitar la presente invencion a ningun mecanismo, se cree que el ADN que atraviesa la barrera renal y aparece en la orina tiene probablemente, por termino medio, una longitud mas corta que el ADN introducido a partir de fuentes contaminantes debido la fragmentacion que se produce en las celulas apoptoticas y en las celulas necroticas en el organismo, combinado con la accion de la DNasa en la sangre y orina.
La filtracion puede usarse para reducir el nivel de ADN contaminante en una muestra de orina antes de la deteccion, seleccionando secuencias mas cortas de ADN. En una realizacion de la presente invencion los acidos nucleicos contienen mas de aproximadamente 1000 pares de bases, o 1000 nucleotidos cuando esta desnaturalizado, que se eliminan de la muestra antes de la deteccion. En una realizacion espedfica de la presente invencion, las muestras de orina se filtran antes de la amplificacion por PCR para eliminar sustancialmente todo el ADN que comprende mas de 300 pares de bases, o 300 nucleotidos cuando esta desnaturalizado. Sin limitar la invencion a un mecanismo espedfico, se propone que dicha filtracion elimine el ADN contaminante de celulas que se desprenden de la pared de la uretra/vejiga urinaria o que se introducen en la uretra durante las relaciones sexuales. La mayona del ADN procedente de dichas fuentes contaminantes comprende probablemente mas de 300 nucleotidos dado que el ADN no es en su mayor parte producto de fragmentacion de acidos nucleicos como resultado de muerte celular apoptotica.
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Las moleculas de acido nucleico tambien pueden aislarse por electroforesis en gel, mediante la cual, los fragmented de acido nucleico se separan de acuerdo con el peso molecular. La tecnica de polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion (PLFR), aplica los metodos de separacion por electroforesis, seguido de deteccion de acido nucleico que permite realizar la comparacion por peso molecular de fragmentos de dos o mas alelos de una secuencia genica espedfica.
Los metodos de purificacion anteriormente mencionados pretenden describir, pero no limitar, los metodos idoneos para su uso en la invencion. Los metodos de aislamiento de acidos nucleicos se incluyen en la destreza de un experto en la materia y no se describen con detalle en el presente documento.
La expresion "ensayar la presencia de una secuencia de acido nucleico" se refiere al uso de cualquier metodo para determinar si una secuencia de acido nucleico esta o no presente en una muestra. Los metodos incluyen, pero sin limitacion, tecnicas de hibridacion, amplificacion y deteccion de acidos nucleicos. Un experto en la tecnica tiene acceso a una multitud de estos metodos, incluyendo, pero sin limitacion, los expuestos en Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., Greene Publishing y Wiley-Interscience: Nueva York (1987) y actualizaciones periodicas. Se contempla que dos o mas metodos puedan usarse en combinacion para confirmar los resultados o mejorar la sensibilidad del ensayo. Un ejemplo de analizar por la combinacion de metodos para determinar si una secuencia de acido nucleico esta o no presente, es la tecnica de polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion basada en PCR ("PCR-PLFR"), donde las secuencias de acido nucleico se amplifican, se tratan con enzimas de restriccion y se separan por electroforesis, lo que permite la deteccion de acidos nucleicos que contienen pequenas modificaciones, tales como modificaciones puntuales.
Los terminos "detectar" y "analizar" en relacion a una secuencia de acido nucleico, se refieren al uso de cualquier metodo de observacion, determinacion o cuantificacion de senales que indican la presencia de la secuencia de acido nucleico diana en una muestra o la cantidad absoluta o relativa de esa secuencia de acido nucleico diana en una muestra. Los metodos pueden combinarse con metodos de marcaje de acido nucleico para proporcionar una senal, por ejemplo, mediante: fluorescencia, radioactividad, colorimetna, gravimetna, difraccion o adsorcion de rayos X, magnetismo, actividad enzimatica y similar. Despues, la senal puede detectarse y/o cuantificarse, mediante metodos apropiados para el tipo de senal, para determinar la presencia o ausencia, de la secuencia de ADN espedfica de interes.
"Cuantificar", en relacion a una secuencia de acido nucleico, se refiere al uso de cualquier metodo para estudiar la cantidad de una secuencia de acido nucleico particular, incluyendo, sin limitacion, metodos para determinar el numero de copias de una secuencia de acido nucleico o para determinar el cambio en la cantidad de copias de la secuencia de acido nucleico a lo largo del tiempo, o determinar la concentracion relativa de una secuencia cuando se compara con otra secuencia.
Para ayudar en la deteccion y analisis, la secuencias de ADN espedficas pueden "amplificarse" de diversas maneras, incluyendo, pero sin limitacion, reaccion de ciclado de sondas (Bekkaoui, F. et al, BioTechniques 20,240248 (1996), reaccion en cadena a la polimerasa (PCR), PCR anidada, PCR-SSCP (polimorfismo conformacional monocatenario), reaccion en cadena de la ligasa (LCR) (F. Barany Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189-93 (1991)), clonacion, amplificacion por desplazamiento de cadena (ADC) (GK Terrance Walker et al., Nucleic Acids Res. 22: 2670-77 (1994), y variaciones tales como amplificacion espedfica de alelos (AEA).
Una alternativa a la amplificacion de una secuencia de ADN espedfica que puede usarse para indicar la presencia de esa secuencia en metodos de la presente invencion se basa en la hibridacion de una estructura de escision de acido nucleico con la secuencia espedfica, seguido por escision de la estructura de escision de una manera espedfica de sitio. Este metodo se denomina en el presente documento "deteccion del producto por escision". Este metodo se describe con detalle en las Patentes de Estados Unidos Nos 5.541.331 y 5.614.402, y en las publicaciones PCT Nos WO 97/27214 y WO 94/29482. Permite la deteccion de pequenas cantidades de secuencias de acido nucleico espedficas sin amplificar la secuencia de ADN de interes.
Los metodos de la presente invencion proporcionan un aumento significativo en cuanto a sensibilidad para el analisis de acidos nucleicos acelulares, ultracortos (20-50 pares de bases).
Un metodo de deteccion y analisis de dianas espedficas de ADN ultracorto utiliza cebadores espedficos que internamente estan marcados con fluoroforos. En un ejemplo, se disenaron pares de cebadores espedficamente para la diana de ADN ultracorto de interes de tal manera que los sitios de union al cebador caredan de cualquier secuencia intermedia en el producto PCR bicatenario. Es decir, las secuencias diana cebadoras se encuentran inmediatamente adyacentes entre sf o se solapan. Cada uno de los cebadores en el par de cebadores esta internamente marcado con un fluoroforo cerca del extremo 3'. Los fluoroforos apropiados se seleccionan de los conocidos en la tecnica. En algunas realizaciones, los fluoroforos son 6-carboxifluorescema y carboxi-X-rodamina. Preferentemente, las bases mas cercanas al extremo 3' no se marcan para garantizar el inicio libre de la reaccion de polimerizacion de ADN. Los fluoroforos estan separados de tal manera que en los dos cebadores hay 6-11 bases entre los fluoroforos. Preferentemente, la separacion entre fluoroforos es de 6-10 bases. Despues de la union de los cebadores marcados, y de la inclusion de los materiales apropiados necesarios para la amplificacion por PCR, una
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reaccion de PCR amplifica la secuencia diana generando productos oligo nucleotidicos bicatenarios, trans-marcados con los dos fluoroforos en estrecha proximidad. El producto marcado amplificado se detecta despues por fluorescencia dependiente de transferencia de energfa de resonancia de Foster (FRET, siglas en ingles). En algunas realizaciones, los productos inespedficos se diferencian de los productos espedficos midiendo la temperatura de fusion (disociacion). El Ejemplo 1 y la Figura 2 describen estos cebadores y la posterior reaccion de amplificacion.
Otro metodo de deteccion y analisis de dianas espedficas de ADN ultracorto utiliza cebadores espedficos que comprenden colas oligonucleotidicas en los extremos 5' de sus secuencias de union a diana. Estas colas oligonucleotfdicas estan marcadas en sus extremos 5' con fluoroforos apropiados. Las colas oligonucleotidicas no tienen homologfa con ninguna otra secuencia en la reaccion, salvo que se disenen secuencias cortas adyacentes a los fluoroforos para ser complementarias a secuencias en la cola oligonucleotfdica del par de cebadores opuesto, de tal manera que, si las dos colas oligonucleotfdicas se ponen en estrecha proximidad, se uniran entre sr Cada cebador en el par de cebadores contiene una base de replicacion bloqueante para separar la region de union a diana de la cola oligonucleotfdica que comprende el fluoroforo. Esto garantiza que las colas no se repliquen durante la PCR y que sigan siendo monocatenarias. Puede utilizarse cualquier base de replicacion bloqueante conocida en la tecnica, tal como, iso-dC. Despues de la union de los cebadores marcados, y de la inclusion de los materiales apropiados necesarios para la amplificacion por PCR, una reaccion de PCR amplifica la secuencia diana generando productos oligo nucleotfdicos bicatenarios. Las secuencias complementarias de las colas oligonucleotfdicas se hibridan, acercando estrechamente los pares de fluoroforos. El producto marcado amplificado se detecta despues por fluorescencia dependiente de FRET. La fluorescencia se mide a una temperatura a la cual los extremos adhesivos solo se hibridan si son parte de la misma molecula bicatenaria del producto de la PCR. El Ejemplo 2 y la Figura 7 describen estos cebadores y la posterior reaccion de amplificacion.
Otro metodo de deteccion y analisis de dianas espedficas de ADN ultracorto utiliza tres componentes espedficos de secuencia, incluyendo una sonda TaqMan. Este metodo permite amplicones muy cortos mediante un solapamiento parcial de la secuencia de reconocimiento diana de la sonda TaqMan con el cebador en sentido (misma cadena) espedfico de diana. Este metodo utiliza un esquema de PCRc, de un solo tubo, en dos fases. En la fase 1, el ADN diana es el que se amplifica usando los cebadores C1 y C2, que mapean muy proximos entre sf en la secuencia diana, permitiendo de este modo moldes muy cortos. El cebador C1 lleva una secuencia de extension en el extremo 5' no relacionada con la diana, que se incorpora en los productos intermedios PI1/PI2 de la PCR, junto con la secuencia molde. El producto intermedio PI2 resultante de la PCR es lo suficientemente largo como para servir como molde en la fase 2, donde intervienen los cebadores C3 y C2 y una sonda So TaqMan, que se marca con un fluoroforo y un inactivador.
La mecanica de la fase 2 es muy parecida a la de un ensayo PCRc TaqMan convencional. Durante esta fase, al igual que en un ensayo PCRc TaqMan convencional, la cantidad de producto final de la PCR se controla midiendo el aumento de fluorescencia de la mezcla PCR. Los tres componentes espedficos de diana en el ensayo son los cebadores C3 y C2 y la sonda (So) TaqMan. La determinacion de las temperaturas de hibridacion (Th) de los oligonucleotidos participates, sus concentraciones, temperaturas de extension y el numero de ciclos en cada fase es una parte importante del desarrollo del ensayo. El ensayo resultante demuestra ser excepcionalmente sensible, altamente espedfico de secuencia e idoneo para la deteccion de fragmentos diana tan cortos como de 20 a 50 bases (dianas "ultracortas").
Cuando se selecciona entre posibles dianas, se otorga preferencia a las localizadas en las regiones de la secuencia genomica de Tf relativamente alta, lo que permite el diseno de cebadores y sondas correspondientemente cortos. La Tf del complejo sonda So/producto PCR se selecciono que fuese de 68 °C a 70 °C. La Tf de las secuencias de reconocimiento diana de los cebadores C2 y C3 se selecciono para que fuese de 8 °C a 10 °C por debajo de la de la sonda So, como normalmente sena en un ensayo TaqMan convencional. La Tf de la secuencia de reconocimiento diana del cebador C1 se selecciono para que fuese de 8 °C a 10 °C por debajo de la de los cebadores C2 y C3 para permitir el control de la duracion de cada fase modificando la temperatura de la fase de hibridacion/extension. Este requisito de baja Tf tambien permite una secuencia de reconocimiento diana muy corta en el cebador C1, reduciendo de esta manera la longitud global necesaria minima del molde. Este metodo se muestra esquematicamente en la Figura 8 y se describe en el Ejemplo 3.
En el ejemplo preferido del metodo descrito anteriormente, el cebador C1 se modifica adicionalmente de tal manera que este en una configuracion plegada de tallo-bucle y mantenga esta estructura a la temperatura de la fase de hibridacion/extension de la etapa 2. Esto consigue una mejor linealidad del ensayo e impide que el cebador C1 compita por el molde con la sonda So en la fase 2. Ademas, la region bucle-tallo comprende adicionalmente una base de replicacion bloqueante conocida en la tecnica. La inclusion de una base de replicacion bloqueante impide que la region bucle-tallo se copie en el producto PCR. En un ejemplo, la base de replicacion bloqueante es iso-DC. Este metodo se muestra esquematicamente en la Figura 10 y se describe en el Ejemplo 4.
Sin limitar la presente invencion a ningun metodo espedfico de deteccion, analisis o cuantificacion de regiones metiladas del ADN, las siguientes tecnicas son utiles para evaluar la metilacion del ADN. Los metodos para el mapeo y cuantificacion de las regiones metiladas del ADN, en general, y para el analisis de ADN transrenal, en particular, pueden agruparse en dos clases: metodos que permiten evaluar el estado de metilacion global de islas
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CpG y metodos para analizar la metilacion espedfica de secuencias.
Los metodos del primer grupo se basan en un enfoque de hibridacion de Southern, basado en la utilizacion de propiedades de nucleasas de restriccion sensibles a metilacion. Hatada et al., describen un metodo de barrido genomico para organismos superiores usando sitios de restriccion como puntos de referencia (Proc Natl Acad Sci USA 88 (21): 9523-7,1991). Issa et al., muestran que la metilacion de las islas CpG del receptor estrogenico se relacionan con el envejecimiento y la neoplasia en colon humano (Nat Genet (4): 536-40, 1994). Pogribny y Yi, describen un nuevo metodo sensible para la deteccion rapida de patrones de metilacion anomalos en ADN global con y dentro de islas CpG (Biochem Biophys Res Commun 262 (3): 624-8,1999).
En este grupo tambien puede incluirse la tecnologfa basada en micromatrices de ADN recientemente disenada. Huang et al., describen perfiles de metilacion de islas CpG en celulas de cancer de mama humano (Genet (3): 45970,1999).
Los metodos en el segundo grupo se basan en el registro de las diferencias de secuencia entre alelos metilados y no metilados resultantes del tratamiento de ADN con bisulfito. El registro normalmente se realiza por amplificacion PCR usando cebadores espedficos para ADN metilado y no metilado. Herman et al, describen una PCR espedfica de metilacion: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands (Proc Natl Acad Sci USA 93(18):9821-6, 1996). Dependiendo del entorno experimental se han desarrollado diversos enfoques basados en esta estrategia.
Tambien hay diversas opciones para la cuantificacion de islas CpG metiladas en pequenas cantidades de ADN (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res 25(12):2532-4,1997, describen COBRA: un ensayo de metilacion de ADN sensible y cuantitativo y Olek et al., Nucleic Acids Res 24(24):5064-6,1996, describen un metodo modificado y mejorado de analisis de metilacion de citosina basado en bisulfito) y ADN parcialmente degradado procedente de secciones de patologfa microdiseccionada (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res 25 (12): 2529-31, 1997, describen la rapida cuantificacion de diferencias de metilacion en sitios espedficos usando extension con cebador mononucleotidico sensible a metilacion (Ms-SNuPE, por las siglas Methylation Sensitive Single Nucleotide Primer Extension)). Adicionalmente, hay un SSCP (polimorfismo conformacional monocatenario) sensible a metilacion que se desarrollo para el analisis de sitios de metilacion multiples en islas CpG (Kinoshita et al, Anal Biochem 278 (2):. 165-9, 2000, describen metodos para explorar regiones hipermetiladas por polimorfismo conformacional monocatenario sensible a metilacion) y una pCr en tiempo real espedfica de metilacion extremadamente sensible (Eads et al., Nucleic Acids Res 28 (8): E32, 2000, describen MethyLight: un ensayo de alto rendimiento para medir la metilacion del ADN).
La reaccion en cadena de la polimerasa mediada por ligamiento (LMPCR, siglas en ingles) se ha usado para la deteccion de aductos de ADN en posiciones de nucleotidos individuales en genes de mairnfero. Enzimas espedficas de aductos, tales como la endonucleasa V de T4, enzimas reparadoras de escision de bases, como la nucleasa UVTABC, y escision qmmica, pueden usarse para convertir los aductos en roturas de cadena de ADN. Las posiciones de estas roturas se detectan despues por LMPCR. Yoon y Lee, Mol Cells 10(1):71-5,2000, describen el mapeo de aductos de ADN-altromicina B a resolucion nucleotidica en el ADN genomico humano por PCR mediada por ligamiento. Pfeifer, et al, Proc Natl Acad Sci USA 88 (4): 1374-8,1991, describen el mapeo in vivo de un aducto de ADN a resolucion nucleotidica: deteccion de fotoproductos de pirimidina (6-4) pirimidona por reaccion en cadena de la polimerasa mediada por ligamiento. Pfeifer y Tang, Toxicol Lett 102-130: 447-51, 1998, describen enfoques basados en PCR para el analisis de aductos.
Usando este enfoque, se mapeo la distribucion de aductos de benzo[a]pireno diol epoxido (formados por benzo[a]pireno, el carcinogeno principal del humo de tabaco) en el gen P53 a resolucion nucieotfdica. La formacion del aducto se observo en las posiciones nucleotfdicas que paredan ser puntos calientes mutacionales en canceres de pulmon humano. Denissenko et al., Science 274 (5286): 430-2, 1996, describen la formacion preferencial de aductos de benzo[a]pireno en puntos calientes mutacionales de cancer de pulmon en P53. Se observo una tendencia similar en el caso de cancer de piel. Tommasi et al, Cancer Res 57 (21): 4727-30, 1997, muestran que la luz solar induce la produccion de dfmeros de pirimidina preferentemente en bases de 5-metilcitosina. Por tanto, la distribucion de aductos de ADN en el gen p53, causada por carcinogenos ambientales, se corresponde con puntos calientes mutacionales de determinados canceres.
Estos datos indican que la cuantificacion tanto de aductos de ADN como su mapeo nucleotfdico espedfico de genes en ADN transrenal puede usarse para la evaluacion de efectos genotoxicos de factores ambientales, nutricionales y otros carcinogenos, asf como para la prediccion de la predisposicion resultante a un tipo de cancer espedfico.
Para facilitar el entendimiento de la invencion, a continuacion se definen diversos terminos.
El termino "gen" se refiere a una secuencia de ADN que comprende secuencias de control y codificantes necesarias para la transcripcion de una secuencia de ARN. El termino "genoma" se refiere al complemento genico completo de un organismo, contenido en un conjunto de cromosomas en eucariotas.
La expresion "ultracorta" se refiere a una secuencia de ADN o ARN menor de 50 nucleotidos. Preferentemente, menor de 45 nucleotidos, menor de 40 nucleotidos, menor de 35 nucleotidos, menor de 30 nucleotidos, menor de 25
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nucleotidos, menor de 20 nucleotidos, menor de 15 nucleotidos, menor 10 nucleotidos, menor de 5 nucleotidos. Mas preferentemente, la secuencia de ADN o ARN tiene entre 20 y 50 nucleotidos.
Un gen o una secuencia genica “de tipo silvestre" es aquel gen o aquella secuencia que se observa mas frecuentemente en una poblacion y por tanto se denomina arbitrariamente como la forma "normal" o “de tipo silvestre" del gen. En cambio, los terminos "modificado(a)", "mutante", "anomaKa" o "alterado(a)" se refieren a un gen, a una secuencia o a un producto genico que presenta modificaciones en su secuencia y/o propiedades funcionales (es decir, caractensticas alteradas) cuando se compara con el gen, la secuencia y/o el producto genico de tipo silvestre. Por ejemplo, una secuencia alterada detectada en la orina de un paciente puede presentar una modificacion que se produce en las secuencias de ADN de celulas tumorales y no se produce en las celulas normales del paciente (es decir, no cancerosas). Se observa que los mutantes de origen natural pueden aislarse; se identifican debido a que tienen caractensticas alteradas cuando se comparan con el gen o producto genico de tipo silvestre. Sin limitar la invencion a la deteccion de cualquier tipo espedfico de anomalfa, las mutaciones pueden adoptar diversas formas, incluyendo mutaciones por adicion, adicion-delecion, delecion, por desplazamiento de fase, por sentido erroneo, puntuales, por desplazamiento de fase de lectura, inversas, transicionales y de transversion, asf como alteraciones de microsatelites.
Una " anomalfa genetica asociada con enfermedad" se refiere a un gen, a una secuencia o a un producto genico que presenta modificaciones en la secuencia cuando se compara con el gen de tipo silvestre y que es indicativa de la propensidad a desarrollar o a la existencia de una enfermedad en el portador de esa anomalfa. Una anomalfa genetica asociada con enfermedad abarca, sin limitacion, anomalfas hereditarias, asf como nuevas mutaciones.
La expresion "secuencia exclusiva de ADN fetal " se define como una secuencia de acido nucleico que esta presente en el genoma del feto, pero no en el genoma materno.
Los terminos "oligonucleotido" y "polinucleotido" y acido nucleico "polimerico" son intercambiables y se definen como una molecula que comprende dos o mas desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, preferentemente mas de tres, y normalmente mas de diez. El tamano exacto dependera de muchos factores, que a su vez dependeran de la funcion o uso final del oligonucleotido. El oligonucleotido puede generarse de cualquier manera, incluyendo smtesis qmmica, replicacion, transcripcion inversa de ADN, o una combinacion de las mismas.
Dado que para constituir oligonucleotidos, se hace reaccionar a los mononucleotidos de tal manera que el fosfato 5' de un anillo de pentosa mononucleotfdico se una al oxfgeno 3' de su vecino en una direccion mediante un enlace fosfodiester, un extremo de un oligonucleotido se denomina "extremo 5'” si su fosfato 5' no esta unido al oxfgeno 3' de un anillo de pentosa mononucleotfdico y lo mismo para el “extremo 3'” si su oxfgeno 3' no esta unido a un fosfato 5' de un anillo de pentosa mononucleotfdico subsiguiente. Como se usa en el presente documento, una secuencia de acido nucleico, incluso si es interna con respecto a un oligonucleotido mas grande, tambien puede decirse que tiene extremos 5' y 3'.
Cuando dos oligonucleotidos diferentes, no solapantes, se hibridan con regiones diferentes de la misma secuencia de acido nucleico complementaria lineal, y el extremo 3' de un oligonucleotido apunta hacia el extremo 5' del otro, el primero puede denominarse oligonucleotido "cadena arriba" y el ultimo oligonucleotido "cadena abajo".
El termino "cebador" se refiere a un oligonucleotido que puede actuar como un punto de inicio de smtesis cuando se coloca en condiciones en las que se inicia la extension del cebador. Un "cebador" oligonucleotido puede producirse de manera natural, como en una digestion purificada por restriccion, o puede producirse de manera sintetica.
Un cebador se selecciona para ser "sustancialmente" complementario a una cadena de secuencia espedfica del molde. Un cebador debe ser suficientemente complementario como para hibridarse con una cadena molde para que se produzca la elongacion del cebador. Una secuencia cebadora no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento nucleotfdico no complementario puede unirse al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia cebadora sustancialmente complementaria a la cadena. Las bases no complementarias o secuencias mas largas pueden intercalarse en el cebador, siempre que la secuencia cebadora tenga suficiente complementariedad con la secuencia del molde para hibridarse y por lo tanto formar un complejo cebador molde para la smtesis del producto de extension del cebador.
Un acido nucleico "diana" es una secuencia de acido nucleico a evaluar por hibridacion, amplificacion o por cualquier otro medio de analisis de una secuencia de acido nucleico, incluyendo una combinacion de metodos de analisis.
Los metodos de "hibridacion" implican el apareamiento de una secuencia complementaria con el acido nucleico diana (la secuencia a analizar). La capacidad de dos polfmeros de acido nucleico que contienen secuencias complementarias para encontrarse entre sf y emparejarse a traves de la interaccion de emparejamiento de bases es un fenomeno muy reconocido. Se han seguido las observaciones iniciales del proceso de "hibridacion" de Marmur y Lane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46: 453 (1960) y de Doty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46: 461 (1960) por el perfeccionamiento de este proceso en una herramienta esencial de biologfa moderna. La hibridacion incluye, pero sin limitacion, tecnicas de hibridacion por ranura, mancha y transferencia.
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Es importante, para algunas aplicaciones diagnosticas, determinar si la hibridacion representa complementariedad completa o parcial. Por ejemplo, cuando se desea detectar simplemente la presencia o ausencia de ADN patogeno (tal como de un virus, bacteria, hongo, micoplasma, protozoo) solo es importante que el metodo de hibridacion garantice la hibridacion cuando la secuencia en cuestion este presente; pueden seleccionarse condiciones en las que se hibriden sondas tanto parcialmente complementarias como sondas totalmente complementarias. Otras aplicaciones diagnosticas, sin embargo, podnan requerir que el metodo de hibridacion diferencie entre complementariedad parcial y completa. Puede ser interesante detectar polimorfismos geneticos.
Los metodos que permiten el mismo nivel de hibridacion en el caso de complementariedad tanto completa como parcial son generalmente inadecuados para dichas aplicaciones; la sonda se hibridara tanto con la secuencia diana variante como normal. La presente invencion contempla que para algunos propositos diagnosticos, la hibridacion se combine con otras tecnicas (tales como analisis con enzimas de restriccion). La hibridacion, independientemente del metodo usado, requiere algun grado de complementariedad entre la secuencia a analizar (la secuencia diana) y el fragmento de ADN usado para realizar el ensayo (la sonda). (Por supuesto, puede obtenerse la union sin ninguna complementariedad pero esta union es no espedfica y ha de evitarse).
El complemento de una secuencia de acido nucleico como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleotido que, cuando se alinea con la secuencia de acido nucleico de tal manera que el extremo 5' de una secuencia se empareja con el extremo 3' de la otra, este en " asociacion antiparalela". Pueden incluirse bases espedficas no normalmente encontradas en acidos nucleicos naturales en los acidos nucleicos de la presente invencion e incluyen, por ejemplo, inosina y 7-desazaguanina. La complementariedad no tiene por que ser perfecta; los duplex estables pueden contener pares de bases desparejados o bases no emparejadas. Los expertos en la tecnica de tecnologfa de acidos nucleicos pueden determinar empmcamente la estabilidad de los duplex considerando diversas variables que incluyen, por ejemplo, la longitud del oligonucleotido, la composicion de bases y secuencias del oligonucleotido, la fuerza ionica y la frecuencia de pares de bases desparejados.
Como se usa en el presente documento, el termino " Tf" se usa en referencia a la "temperatura de fusion". La temperatura de fusion es la temperatura a la cual una poblacion de moleculas de acido nucleico bicatenario comienza a medio disociarse en cadenas sencillas. La ecuacion para calcular la Tf de los acidos nucleicos es bien conocida en la tecnica. Como indican referencias convencionales, una estimacion simple del valor de la Tf puede calcularse mediante la ecuacion: Tf = 81,5 + 0,41 (% G + C), cuando un acido nucleico esta en solucion acuosa a NaCl 1 M (vease, por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridisation, in Nucleic Acid Hybridisation (1985). Otras referencias incluyen calculos mas sofisticados que tienen en cuenta caractensticas estructurales asf como de secuencia para el calculo de la Tf.
El termino "sonda" como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleotido (es decir, una secuencia de nucleotidos), bien de origen natural como en una digestion purificada por restriccion o bien producida sinteticamente, que forma una estructura duplex u otro complejo con una secuencia en otro acido nucleico, debido a la complementariedad u otro medio de interaccion atrayente reproducible, de al menos una secuencia en la sonda con una secuencia en el otro acido nucleico. Las sondas son utiles en la deteccion, identificacion y aislamiento de secuencias genicas particulares. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invencion se marcara con cualquier "molecula indicadora", de tal manera que sea detectable en cualquier sistema de deteccion, incluyendo, pero sin limitacion, sistemas enzimaticos (por ejemplo, ELISA, asf como ensayos histoqmmicos basados en enzimas), fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. Tambien se contempla que el oligonucleotido de interes (es decir, a detectar) se marcara con una molecula indicadora. Tambien se contempla que tanto la sonda como el oligonucleotido de interes se marcaran. No se pretende que la presente invencion se limite a ningun sistema de deteccion o marcador particular.
El termino "marcador" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier atomo o molecula que pueda usarse para proporcionar una senal detectable (preferentemente cuantificable), y que pueda unirse al acido nucleico o protema. Los marcadores proporcionan senales detectables mediante diversos metodos, incluyendo, pero sin limitacion, fluorescencia, radiactividad, colorimetna, gravimetna, difraccion por rayos X o absorcion, magnetismo, y actividad enzimatica.
La expresion "sustancialmente monocatenaria" cuando se usa en referencia a una diana de acido nucleico, significa que la molecula diana existe principalmente como una sola cadena de acido nucleico a diferencia de una diana bicatenaria que existe como dos cadenas de acido nucleico que se mantienen unidas entre sf por interacciones de pares de bases intercatenarios.
La expresion "variacion de secuencia" como se usa en el presente documento, se refiere a diferencias en la secuencia de acido nucleico entre dos moldes de acido nucleico. Por ejemplo, un gen estructural de tipo silvestre y una forma mutante de este gen estructural de tipo silvestre puede variar en secuencia por la presencia de sustituciones y/o deleciones o inserciones de una sola base de uno o mas nucleotidos. Estas dos formas del gen estructural se dice que vanan en secuencia entre sf. Puede existir una segunda forma mutante del gen estructural. Esta segunda forma mutante se dice que vana en secuencia a partir de tanto el gen de tipo silvestre como de la primera forma mutante del gen.
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Las expresiones "firma de estructura de sonda ", "firma de hibridacion" y "perfil de hibridacion" se usan indistintamente en el presente documento para indicar el nivel medido de formacion de complejo entre un acido nucleico diana y una sonda o conjuntos de sondas, siendo dichos niveles medidos caractensticos del acido nucleico diana cuando se comparan con niveles de formacion de complejos que implican dianas o sondas de referencia.
La expresion "emparejamiento de cebadores oligonucleotidicos o complementarios a una secuencia genica" se refiere a cebadores oligonucleotidicos capaces de facilitar la smtesis dependiente de molde de acidos nucleicos mono o bicatenarios. El emparejamiento de cebadores oligonucleotfdicos o complementariedad con una secuencia genica pueden usarse en las PCR, RT-PCR y similar.
La expresion "secuencia de acido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleotido, nucleotido o polinucleotido, y a fragmentos o a partes de los mismos, y a ADN o ARN de origen genomico o sintetico que puede ser mono o bicatenario, y representa la cadena en sentido o antisentido.
Una "delecion" se define como un cambio en cualquier secuencia de nucleotidos o de aminoacidos donde falta uno o mas nucleotidos o restos de aminoacidos, respectivamente.
Una "insercion" o "adicion" es ese cambio en una secuencia de nucleotidos o de aminoacidos que ha resultado de la adicion de uno o mas nucleotidos o restos de aminoacidos, respectivamente, en comparacion con secuencias de origen natural.
Una "sustitucion" se produce por el reemplazo de uno o mas nucleotidos o aminoacidos por diferentes nucleotidos o aminoacidos, respectivamente.
Una "modificacion" en una secuencia de acido nucleico se refiere a cualquier cambio en una secuencia de acido nucleico, incluyendo, pero sin limitacion, una delecion, una adicion, una adicion-delecion, una sustitucion, una insercion, una inversion, una transversion, una mutacion puntual, una alteracion de microsatelite, metilacion o formacion de aducto nucleotidico.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "purificada", "descontaminada" y "esterilizada" se refieren a la eliminacion de una o mas sustancias contaminantes de una muestra.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "sustancialmente purificadas" y "sustancialmente aisladas" se refieren a secuencias de acido nucleico que se han extrafdo, aislado o separado de su medio natural, y preferentemente carecen del 60 %, mas preferentemente del 75 %, y aun mas preferentemente del 90 % de otros componentes con los que se asocian en la naturaleza. Por lo tanto un "polinucleotido aislado” es un polinucleotido sustancialmente purificado. Se contempla que para poner en practica los metodos de la presente invencion, los polinucleotidos pueden estar, pero no necesariamente, sustancialmente purificados. En la tecnica se conocen diversos metodos para la deteccion de secuencias de acido nucleico en forma no purificada.
La "amplificacion" se define como la produccion de copias adicionales de una secuencia de acido nucleico y se realiza generalmente usando reaccion en cadena de la polimerasa u otras tecnologfas bien conocidas en la materia (por ejemplo, Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York [1995]). Como se usa en el presente documento, la expresion "reaccion en cadena de la polimerasa "("PCR") se refiere al metodo de KB Mullis (Patentes de Estados Unidos Nos 4.683.195 y 4.683.202) que describen un metodo para aumentar la concentracion de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genomico sin clonacion o purificacion. Este proceso para amplificar la secuencia diana consiste en la introduccion de un gran exceso de dos cebadores oligonucleotfdicos a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido por una secuencia exacta de ciclado termico en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores se complementan con sus respectivas cadenas de la secuencia diana bicatenaria. Para efectuar la amplificacion, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores se emparejan despues con sus secuencias complementarias en la molecula diana. Despues del emparejamiento, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de cadenas complementarias. Las etapas de desnaturalizacion, emparejamiento de cebadores y extension con polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir, la desnaturalizacion, el emparejamiento y la extension constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentracion de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina mediante las posiciones relativas de los cebadores uno con respecto a otro, y por lo tanto, esta longitud es un parametro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del proceso, el metodo se denomina "reaccion en cadena de la polimerasa" (en lo sucesivo en el presente documento "PCR"). Dado que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en cuanto a concentracion) en la mezcla, se dice que estan " amplificados por PCR".
Como se usa en el presente documento, el termino "polimerasa" se refiere a cualquier enzima adecuada para su uso en la amplificacion de acidos nucleicos de interes. Se pretende que el termino incluya dichas ADN polimerasas y ADN polimerasa de Taq obtenida de Thermus aquaticus, aunque en esta definicion tambien se incluyen otras polimerasas, tanto termoestables como termolabiles.
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Con la PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia diana espedfica en ADN genomico a un nivel que pueda detectarse por diversas metodolog^as diferentes (por ejemplo, tincion, hibridacion con una sonda marcada; incorporacion de cebadores marcados con biotina, seguido de deteccion de conjugado avidina-enzima; incorporacion de trifosfatos desoxinucleotidicos marcados con 32P, tales como dCTP o dATP, en el segmento amplificado). Ademas de ADN genomico, puede amplificarse cualquier secuencia oligonucleotidica con el conjunto apropiado de moleculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el propio proceso de la PCR, son de por sf mismos, moldes eficaces para posteriores amplificaciones por PCR. Las secuencias diana amplificadas pueden usarse para obtener segmentos de ADN (por ejemplo genes) para su insercion en vectores recombinantes.
Como se usa en el presente documento, las expresiones " producto de PCR" y "producto de amplificacion" se refieren a la mezcla de compuestos resultante despues de completar dos o mas ciclos de etapas de desnaturalizacion, emparejamiento y extension de la PCR. Estos terminos incluyen el caso en el que ha habido una amplificacion de uno o mas segmentos de una o mas secuencias diana.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "endonucleasas de restriccion" y "enzimas de restriccion" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales cortan ADN bicatenario en o cerca de una secuencia de nucleotidos espedfica.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "complementario" o "complementariedad" se usan en referencia a polinucleotidos (es decir, una secuencia de nucleotidos) relacionada por las normas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T", es complementaria a la secuencia "T-C-A". La complementariedad puede ser "parcial", donde solo algunas de las bases de acidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases. O puede haber una complementariedad "completa" o "total" entre los acidos nucleicos. El grado de complementariedad entre cadenas de acidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y fuerza de hibridacion entre cadenas de acidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificacion, asf como en los metodos de deteccion que dependen de la union entre acidos nucleicos.
El termino "homologfa" se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber una homologfa parcial o una homologfa completa (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria es una que inhibe al menos parcialmente una secuencia completamente complementaria de la hibridacion con un acido nucleico diana al cual se hace referencia usando el termino funcional "sustancialmente homologo". La inhibicion de la hibridacion de la secuencia completamente complementaria con la secuencia diana puede examinarse usando un ensayo de hibridacion (transferencia de Southern o Northern, hibridacion en solucion y similar) en condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia o sonda sustancialmente homologa competira por e inhibira la union (es decir, la hibridacion) de un homologo completamente con una diana en condiciones de baja rigurosidad. Esto no quiere decir que las condiciones de baja rigurosidad sean tales que se permita la union no espedfica; las condiciones de baja rigurosidad requieren que la union de dos secuencias entre sf sea una interaccion espedfica (es decir, selectiva). La ausencia de union no espedfica puede ensayarse mediante el uso de una segunda diana que carece incluso de un grado de complementariedad parcial (por ejemplo, identidad menor de aproximadamente 30 %); en ausencia de union no espedfica la sonda no se hibridara con la segunda diana no complementaria.
Para comprender las condiciones de baja o alta rigurosidad pueden emplearse numerosas condiciones equivalentes; se consideran factores tales como la longitud y la naturaleza (composicion de ADN, ARN, bases) de la sonda y naturaleza de la diana (composicion de ADN, ARN, bases, presente en solucion o inmovilizado, etc.) y la concentracion de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol) y la solucion de hibridacion puede variar para generar condiciones de hibridacion de baja o alta rigurosidad diferentes, pero equivalentes, de las condiciones indicadas anteriormente. El termino "hibridacion" como se usa en el presente documento incluye "cualquier proceso mediante el cual una cadena de acido nucleico se une con una cadena complementaria a traves del emparejamiento de bases (Coombs, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York N.Y. [1994].
La "rigurosidad" generalmente se produce en un intervalo de Tf de aproximadamente 5 °C .(5 °C. por debajo de la Tf de la sonda) a aproximadamente 20 °C. a 25 °C por debajo de la Tf. Como comprenderan los expertos en la tecnica, puede usarse una hibridacion rigurosa para identificar o detectar secuencias polinucleotfdicas identicas o para identificar o detectar secuencias polinucleotfdicas similares o relacionadas.
Como se usa en el presente documento, la expresion "complejo de hibridacion" se refiere a un complejo formado entre dos secuencias de acido nucleico en virtud de la formacion de enlaces hidrogeno entre bases de G y C complementarias, y entre bases de A y T complementarias; estos enlaces de hidrogeno pueden estabilizarse adicionalmente por interacciones de apilamiento de bases. Las dos secuencias de acido nucleico complementarias se unen mediante enlaces hidrogeno en una configuracion antiparalela. Puede formarse un complejo de hibridacion en solucion (por ejemplo analisis COt o ROt) o entre una secuencia de acido nucleico presente en solucion y otra secuencia de acido nucleico inmovilizada en un soporte solido (por ejemplo, una membrana de nylon o un filtro de nitrocelulosa como se emplea en la transferencia de Southern y Northern, transferencia puntual o un portaobjetos como se emplea en la hibridacion in situ, incluyendo FISH [hibridacion fluorescente in situ]).
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Como se usa en el presente documento, el termino "antisentido" se usa en referencia a secuencias de ARN que son complementarias a un ARN espedfico (por ejemplo, ARNm) o a una secuencia de ADN. El ARN antisentido puede producirse mediante cualquier metodo, incluyendo smtesis por corte y empalme de uno o mas genes de interes en una orientacion inversa a un promotor viral que permite la smtesis de una cadena codificante. Una vez introducida en una celula, esta cadena transcrita se combina con el ARNm natural producido por la celula para formar duplex. Estos duplex bloquean despues la transcripcion posterior del ARNm o su traduccion. De esta manera, pueden generarse fenotipos mutantes. La expresion "cadena antisentido" se usa en referencia a una cadena de acido nucleico que es complementaria a la cadena en "sentido". El sfmbolo (-) (es decir, "negativo") se usa a veces en referencia a la cadena antisentido, usandose el sfmbolo (+) algunas veces en referencia a la cadena en sentido (es decir, "positiva").
El termino "muestra" como se usa en el presente documento se usa en su mas amplio sentido. Una muestra biologica que se sospecha que contiene acido nucleico puede comprender, pero sin limitacion, ADN genomico (en solucion o unido a un soporte solido, tal como para analisis de transferencia de Southern), ADNc (en solucion o unido a un soporte solido), y similar.
La expresion "tracto urinario" como se usa en el presente documento se refiere a los organos y conductos que participan en la secrecion y eliminacion de la orina del organismo.
Las expresiones "ADN transrenal" y "acido nucleico transrenal" como se usan en el presente documento se refieren a acidos nucleicos que han atravesado la barrera renal. El ADN transrenal como se usa en el presente documento se diferencia del miARN. Espedficamente, el ADN transrenal comprende caracteres aleatorios en los extremos 3' y 5', que no estan presentes en el miARN.
La presente invencion incluye una plataforma para la deteccion y analisis espedfico de genes de fragmentos de ADN transrenal “ultracortos” que portan diferentes lesiones nucleotfdicas y aductos causados por diversos factores externos e internos modificadores de ADN. Sin limitar el alcance de la invencion, pero con el interes de aclarar, algunos factores que generan modificaciones del ADN deben agruparse en tres clases: (i) ffsicos, incluyendo pero sin limitacion, radiacion gamma y UV, fluctuaciones de temperatura; (ii) qmmicos, incluyendo, pero sin limitacion, contaminantes ambientales, genotoxinas de origen natural, carcinogenos, farmacos anticancerosos y (iii) metabolitos en reactivos, tales como formas activas de oxfgeno, productos de peroxidacion lipfdica y agentes hidrolfticos.
A continuacion la invencion se describe adicionalmente a traves de los siguientes ejemplos. Los ejemplos tambien ilustran metodologfa util para poner en practica la invencion. Estos ejemplos no limitan la invencion reivindicada.
Ejemplos
Ejemplo 1
El Ejemplo 1 muestra el diseno de cebadores con fluoroforos internamente localizados para la deteccion de dianas de ADN ultracorto por PCR usando fluorescencia dependiente de FRET.
La especificidad de un ensayo tfpico de PCRc con cebador marcado esta exclusivamente determinada por la especificidad de los dos cebadores, y por lo tanto dicho ensayo no puede diferenciar entre moldes que tienen los mismos sitios de union a cebador pero diferentes secuencias intermedias. Para detectar fragmentos diana muy cortos y superar esta limitacion, se desarrollaron nuevos ensayos con cebador marcado, espedficos para dianas en las que los sitios de union a cebador estan inmediatamente adyacentes entre sf o incluso ligeramente solapantes, careciendo de este modo de cualquier secuencia intermedia. Dichos amplicones se caracterizan por el par de secuencias derivadas de cebadores dispuestas muy cerca entre sf en el producto de la PCR bicatenario. En el ensayo, la proximidad mutua de oligonucleotidos marcados con fluorescencia se detecto por transferencia de energfa por resonancia de Forster (FRET) entre ellos. Para ensayar la eficacia de un ensayo FRET, se diseno un sistema modelico que consistina en dos cebadores internamente marcados con un par de fluoroforos FRET ampliamente usados, la 6-carboxifluorescema (FAM) y la carboxi-X-rodamina (ROX).
Direccion
ID Molde SEC ID N°:
Cebador directo:
ES0343-FL 5'-CGTCCGTGCTGTCGACG-[FL-dT]-AG-3' 1
Cebador inverso
ES0344-RX 5'-CATACCACGCCATCAGAG-[ROX-dT]-GC-3' 2
Como se muestra en la Figura 2, cada fluoroforo se conjugo con una base de timina en la posicion 3 a partir del extremo 3' de cada cebador. En la Figura 2, M indica un molde; C1 y C2 indica cebadores; D y A indican fluoroforos Donador y Aceptor, respectivamente. El marcaje de los cebadores en bases internas y el dejar al menos las 2 bases mas proximas al extremo 3' sin marcar es necesario para garantizar el inicio libre de la reaccion de polimerizacion de ADN (Ahmad and Ghasemi, Anal Bioanal Chem. 387: 2737-43,2007). Ese sistema modelico se utilizo para
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determinar la separacion entre los fluoroforos que produce la mayor eficiencia FRET ensayandolo en diversos moldes oligonucleotfdicos con un intervalo de separacion entre los 2 sitios de union al cebador.
MOLDE
SEPARACION ENTRE FLUOROFOROS SEC ID N°:
5'-CAGCACGTCCGTGCTGTCGACGTAGACATCAGC ACTCTGATGGCGTGGTATGACGAC-3'
11 3 4
5’-CAGCACGTCCGTGCTGTCGACGTAGCATCAGC ACTCTGATGGCGTGGTATGACGAC-3'
10 5 6
5'-CAGCACGTCCGTGCTGTCGACGTAGATCAGC ACTCTGATGGCGTGGTATGACGAC-3'
9 7 8
5'-CAGCACGTCCGTGCTGTCGACGTAGATGC ACTCTGATGGCGTGGTATGACGAC-3'
7 9 10
5'-CAGCACGTCCGTGCTGTCGACGTAGAGC ACTCTGATGGCGTGGTATGACGAC-3'
6 11 12
5'-CAGCACGTCCGTGCTGTCGACGTAGGC ACTCTGATGGCGTGGTATGACGAC-3•
5 13 14
5’-CAGCACGTCCGTGCTGTCGACGTAC ACTCTGATGGCGTGGTATGACGAC-3'
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La PCR genera un producto oligonucleotidico bicatenario trans-marcado con los 2 fluoroforos, la distancia espacial entre la cual se supone que se correlaciona directamente con la separacion entre los sitios de union al cebador en el molde proporcionado. Aunque la variacion de senal para diferentes moldes no fue muy significativa, la Figura 3 muestra un pico en la eficiencia FRET en la separacion de fluoroforo de 6 a 10 bases en el producto PCR. Basandose en los resultados de la Figura 3, el ensayo puede detectar fragmentos diana muy cortos, conteniendo estos los dos sitios de union al cebador en proximidad inmediata entre sn La longitud minima de fragmentos diana detectable con este sistema se aproxima por la longitud combinada de los 2 sitios de union al cebador, alcanzando aproximadamente de 20 a 50 bases.
Despues, este metodo se ensayo con respecto a su capacidad para detectar la secuencia de la region BamHI-W del virus de Epstein-Barr (VEB). Se diseno un par de cebadores y se marcaron internamente con FAM y ROX, y la amplificacion por PCR de la diana en tiempo real se controlo midiendo la senal de emision de fluorescencia a 610 nm con una excitacion a 492 nm.
Direccion
ID Molde SEC ID N°:
Cebador directo:
ES0430-FL 5'-ATCGCAGAGCCCAGGATG-[FL-dT]-CC-3' 17
Cebador inverso
ES0431-RX 5'-ACGAGCTCTAGGGTCCCTTC-[ROX-dT]-GG-3' 18
Diana de 39 pb
5'-CAGAGCCCAGGATGTCCCCCAGAAGGGACCCTAG-3' 19
Para controlar el nivel de fluorescencia de fluoroforos individuales, tambien se midio la emision de fluorescencia a 516 nm con una excitacion de 492 nm (FAM), y una emision a 610 nm con una excitacion de 585 nm (ROX). En la reaccion no se observo aumento simultaneo en el nivel de fluorescencia de los fluoroforos individuales, lo que indica que todo el aumento de la fluorescencia (492 nm ex / 610 nm em) era atribuible a la FRET entre los fluoroforos. La Figura 4 muestra que este metodo permite la deteccion de tan solo 10 copias de la secuencia del VEB diana en una reaccion de 25 |il. Espedficamente, la Figura 4, Panel A muestra la amplificacion de patrones del VEB en el ensayo de PCR en tiempo real basado en FRET con cebador marcado y la Figura 4, Panel B muestra la curva de calibracion.
En otro ejemplo de la aplicacion de PCR en tiempo real basada en FRET con cebador marcado, se diseno un par de cebadores marcados con fluoroforo para la deteccion de una secuencia espedfica del cromosoma Y. La PCR con estos 2 cebadores amplifica una region de 36 pb del gen de SRY (Sex-determining Region Y), dando lugar a un producto con los fluoroforos donador y aceptor separados entre sf por 6 bases.
Direccion
ID Molde SEC ID N°:
Cebador directo:
ES0619-FL 5'-CCGCAGATCCCGC-[FL-dT]-TCG-3' 20
Cebador inverso
ES0620-RX 5'-GCACTTCGCTGCAGAG-[ROX-dT]- ACC-3' 21
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Direccion
ID Molde SEC ID N°:
Diana 39 pb
5'-CCGCAGATCCCGCTTCGGTACTCTGCAGCGAAGTGC-3' 22
La Figura 5 muestra la amplificacion de la region de SRY de 36 pb como se ha descrito anteriormente.
El ensayo de SRY por FRET se aplico a muestras de ADN purificadas de la orina de gestantes. Los resultados de la Figura 6 muestran la deteccion de secuencias SRY en muestras de gestantes con fetos de sexo masculino, pero no en una muestra de una gestante con un feto de sexo femenino. En la Figura 6, M indica muestras de gestantes con fetos del sexo masculino y F indica una muestra de una gestante con un feto del sexo femenino.
La senal de fluorescencia detectada por el metodo de FRET con cebador marcado indica la presencia de productos de amplificacion bicatenarios en los que (i) ambos cebadores marcados se incorporan y (ii) los cebadores se incorporan de tal manera que los fluoroforos se colocan muy proximos entre sf. En la mayona de los casos, estos dos requisitos bastan para garantizar que solamente los productos de PCR espedficos generan senal de fluorescencia detectable. Sin embargo, la desventaja de usar un metodo de PCR altamente sensible es la generacion ocasional, incontrolada, de productos inespedficos, que tambien pueden dar lugar a una senal fluorescente dependiente de FRET. En la PCR convencional, los productos inespedficos se diferencian generalmente por tamano usando electroforesis en gel. El metodo de FRET con cebador marcado permite diferenciar estos productos inespedficos midiendo su temperatura de fusion (disociacion). Por ejemplo, un producto inespedfico mas grande presenta probablemente una mayor temperatura de fusion que la de un producto espedfico. Dado que la FRET solo se produce cuando estos productos estan en su estado bicatenario, su transicion a un estado monocatenario viene acompanada por una disminucion en la fluorescencia FRET. Por lo tanto, la temperatura de esta transicion puede medirse inmediatamente despues de la fase de amplificacion, sin necesidad de ningun colorante adicional. La fase de amplificacion y las senales de fluorescencia en la fase de fusion se basan en el mismo efecto FRET, garantizando de este modo que en ambos casos se analiza el mismo producto.
Ejemplo 2
El Ejemplo 2 muestra el diseno de cebadores con fluoroforos localizados en el extremo 5' para la deteccion de dianas de ADN ultracorto por PCR usando fluorescencia dependiente de FRET.
En comparacion con cebadores no marcados, el uso de cebadores marcados con fluoroforos cerca de sus extremos 3' puede disminuir la eficacia de la PCR, mas probablemente debido a la reduccion en la capacidad de procesamiento de la polimerasa ya que esta lee bases marcadas con fluoroforo de los cebadores incorporados en los moldes. Para superar este problema, se desarrollo otra variante del esquema PCRc FRET con cebador marcado. En este ejemplo, como se muestra en la Figura 7, los cebadores contienen colas oligonucleotfdicas en los extremos 5' de sus secuencias de union a diana. En la Figura 7, M indica molde; C1 y C2 indican cebadores; D y A indican fluoroforos donadores y aceptores, respectivamente; los drculos en negrita indican las posiciones de modificaciones de replicacion bloqueante. Las colas estan marcadas en sus extremos 5' con fluoroforos apropiados, de tal manera que cada molecula bicatenaria del producto PCR lleva un par de fluoroforos FRET. En cada cebador, la cola esta separada de la region de union a diana mediante una base de replicacion bloqueante, tal como iso-dC, para garantizar que las colas no se replican durante la PCR, y por tanto permanecen monocatenarias. Las colas se seleccionan para que no tengan homologfa con ninguna otra secuencia en el sistema, con la excepcion de que se disenan tramos de secuencia cortos inmediatamente adyacentes a los fluoroforos para que sean complementarios entre sf (extremos adhesivos). El emparejamiento de los extremos adhesivos acerca estrechamente los fluoroforos del par FRET entre sf. Debido a su concentracion local aumentada, se espera que estos extremos adhesivos se emparejen mas rapidamente cuando ambos formen parte del mismo producto PCR bicatenario. La fluorescencia se mide a una temperatura a la cual los extremos adhesivos se emparejan solamente si forman parte de la molecula bicatenaria del producto PCR. La intensidad de fluorescencia FRET medida a esta temperatura se correlaciona directamente con el rendimiento del producto PCR. Los productos PCR inespedficos de longitud significativamente mas grande no deben contribuir a la senal de fluorescencia FRET porque sus extremos adhesivos estan demasiado separados como para emparejarse entre sf.
Se diseno un sistema modelico para analizar esta version de ensayo con cebador marcado. Se mezclaron dos oligonucleotidos "cebadores" marcados en sus extremos 5' con los colorantes FAM y ROX, respectivamente y se anadieron a una serie de oligonucleotidos "molde", y se midieron las curvas de disociacion de las mezclas. Los moldes conteman secuencias complementarias entre sf de los dos cebadores y difenan en la distancia entre estas secuencias. En cada mezcla se generaron las curvas de disociacion. Se observo una senal FRET aumentada de los oligonucleotidos marcados en presencia de los “moldes”, lo que muestra que es posible detectar la incorporacion de los cebadores marcados en los productos PCR.
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Ejemplo 3
El Ejemplo 3 muestra el diseno del esquema de la PCR de un solo tubo para la deteccion de dianas de ADN ultracorto.
Se desarrollo un nuevo esquema de PCRc que ofrece alta especificidad diana utilizando tres componentes espedficos de secuencia, que inclman una sonda TaqMan, que incluso permite amplicones muy cortos mediante un solapamiento de secuencia de reconocimiento diana parcial de la sonda TaqMan con el cebador espedfico de diana en sentido (misma cadena). Para alojar el solapamiento de la sonda y el cebador, se diseno un nuevo esquema de PCRc de un solo tubo en 2 fases. El diagrama de flujo proporcionado en la Figura 8 muestra los detalles y etapas espedficos de la reaccion. En la Figura 8, M indica molde; C1, C2, y C3 indican cebadores; PI1 y PI2 indican productos intermedios; So indica sonda TaqMan™, doblemente marcada con fluoroforo F e inactivador I. En la fase 1, el molde M de ADN diana se amplifico usando los cebadores C1 y C2, que mapean en estrecha proximidad entre sf en la secuencia diana, lo que permite moldes muy cortos. El cebador C1 lleva una secuencia de extension en el extremo 5' no relacionada diana, que se incorpora en el producto PI 1/PI2 de la PCR junto con la secuencia molde. El producto intermedio PI2 de la PCR resultante es suficientemente largo para servir como molde en la fase 2, lo que implica los cebadores C3 y C2 y una sonda So TaqMan marcada. Los mecanismos de la fase 2 son en gran medida identicos a los de un ensayo PCRc TaqMan convencional. Durante esta fase, al igual que en un ensayo PCRc TaqMan convencional, la cantidad de producto final de la PCR se controla midiendo el aumento de fluorescencia de la mezcla de PCR. Los tres componentes espedficos de diana en el ensayo son los cebadores C3 y C2 y la sonda (So) TaqMan. La determinacion de las temperaturas de emparejamiento (Te) de los oligonucleotidos participates, sus concentraciones, temperaturas de extension y el numero de ciclos en cada fase es una parte importante del desarrollo del ensayo. El ensayo resultante confirma ser excepcionalmente sensible, altamente espedfico de secuencia e idoneo para la deteccion de fragmentos diana tan cortos con tan solo 20 a 50 bases (dianas "ultracortas").
Los componentes oligonucleortdicos implicados en el ensayo PCRc en 2 fases para dianas ultracortas se diseno con las siguientes consideraciones:
- Cuando se selecciona entre posibles dianas, se da preferencia a las localizadas en regiones de secuencia genomica de Tf relativamente elevada, lo que permite el diseno de cebadores y sondas correspondientemente cortos.
- La Tf del complejo producto PCR - So sonda se selecciono que era de 68 °C a 70 °C.
- La Tf de las secuencias de reconocimiento diana de los cebadores C2 y C3 se seleccionaron que eran de 8 °C a 10 °C por debajo de la de la sonda So, como normalmente sena en un ensayo TaqMan convencional.
- La Tf de la secuencia de reconocimiento diana del cebador C1 se selecciono que era de 8 °C a 10 °C por debajo de la de los cebadores C2 y C3 lo que permite controlar la duracion de cada fase alterando la temperatura de la fase de emparejamiento/extension. Este requisito de baja Tf tambien permite secuencias de reconocimiento diana muy cortas del cebador C1, reduciendo por tanto la longitud total necesaria minima del molde.
Un ejemplo espedfico de este metodo es un ensayo desarrollado con la finalidad de detectar secuencias de M. tuberculosis en muestras de ADN en orina. La diana es una region de 39 pb dentro de la repeticion IS6110 de la bacteria.
Direccion
ID Molde SEC ID
Cebador directo 1a fase (C1)
ES0564 r-GAACACGACC?ACGAC3AGXAGCA TCTAGCTTCXJG\CCACCA-3r 23
Cebador inverso (C2)
ES0563 5'-CTGCTACCCACAGCCGGTTAG-3' 24
Cebador directo 2a fase (C3)
ES0565 5'-CACGACCTACGACGAGTCAGC-3' 25
Sonda (So) TaqMan MGB
ES0566-M FAM-5'-TTCGGACCACCAGCAC-3'-MGB-NFQ 26
Diana MTB
51- GCTTCG G ACC AOC AGCACCTAACCGGCTGTGGG TAGCAG-31 27
La Figura 9, panel A, demuestra que esta tecnica detecta eficazmente 5 equivalentes genomicos de M. tuberculosis por reaccion. La Figura 9, panel B ilustra la aplicacion de este ensayo para la deteccion de ADN-Tr de M. tuberculosis en muestras de orina de pacientes con tuberculosis pulmonar y controles no infectados. Espedficamente, el panel A muestra la amplificacion de patrones IS6110 y el panel B muestra la deteccion de IS6110 en ADN de muestras de orina de 8 pacientes con tuberculosis (TB1 a TB8) y de dos individuos sanos (H1 y H2).
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Ejemplo 4
El Ejemplo 4 muestra un diseno alternativo del esquema PCR de un solo tubo para la deteccion de dianas de ADN ultracorto.
Al realizar los experimentos descritos anteriormente, se determino que para conseguir una mejor linealidad del ensayo es importante impedir que el cebador C1 compita por el molde con la sonda So en la fase 2 de la reaccion. Para esta finalidad, el cebador C1 se modifico de tal manera que existe preferentemente en una configuracion plegada, de tallo-bucle a la temperatura (temperaturas) de etapa de emparejamiento/extension de la fase 2. Como se muestra en la Figura 10, para impedir que la region bucle-tallo se copie en el producto de la PCR, se introdujo una base de replicacion bloqueante iso-dC en la parte bucle del cebador C1. En la Figura 10, M indica molde; C1, C2 y C3 indican cebadores; PI1 y PI2 indican productos intermedios; So indica sonda TaqMan™, doblemente marcada con fluoroforo F e inactivador I. ® indica iso-dC.
Se ha demostrado que el ensayo de PCR en tiempo real de 2 fases puede detectar un numero de dianas diverso. Para cada diana, se diseno a medida un conjunto de secuencias de cebador y sonda, y las condiciones ffsicas del ensayo se optimizaron. Los factores optimizados incluyeron concentracion de Mg2+, concentraciones de cebadores y sonda, las temperaturas de la etapa de emparejamiento/extension para cada fase, y la longitud (es decir, el numero de ciclos de amplificacion) de la fase 1. Las respuestas del sistema que se optimizaron incluyeron ensayar la sensibilidad, especificidad y linealidad. Se descubrio que el ensayo de la PCRc de 2 fases puede usarse para detectar de modo fiable dianas ultracortas a concentraciones tan bajas como de 1 a 5 copias por reaccion.
Uno de dichos sistemas de PCR en tiempo real de 2 fases se diseno para detectar la diana SRY de 25 pb. En la Figura 11 se muestran las curvas de amplificacion de la concentracion patron de moldes de control positivo. La Figura 12 ilustra la deteccion de secuencias SRY fetales en ADN aislado de orina de gestante con feto de sexo masculino pero no con feto de sexo femenino. En la Figura 12, M y F indican muestras de gestantes con fetos de sexo masculino y femenino, respectivamente.
Ejemplo 5
El Ejemplo 5 muestra la deteccion de secuencias fetales de tamano diferente en ADN aislado de orina materna mediante dos metodos.
El ADN de la orina de gestantes con fetos de sexo masculino se aislo mediante el metodo basado en sflice de Botezatu et al., Clin Chem. 46: 1078-1084, 2000 y mediante la tecnica basada en intercambio anionico descrita en la Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 20080139801. Despues, el ADN aislado se analizo para determinar la presencia de secuencias TSPY, espedficas del cromosoma Y, por PCR en tiempo real usando cebadores disenados para la deteccion de dianas ultracortas de 43 pares de bases y de 84 pares de bases. El metodo basado en sflice afsla fragmentos de ADN de 100-150 pares de bases y mas grandes. La tecnica basada en intercambio anionico afsla fragmentos de ADN mas grandes que 10 pares de bases. Independiente del metodo de purificacion de ADN, las secuencias espedficas del genero masculino se detectaron satisfactoriamente en ADN urinario usando el ensayo de amplicon de 43 pares de bases, pero no el ensayo de 84 pares de bases. Ademas, la Figura 13 demuestra que la cantidad detectada de secuencias TSPY en la preparacion con Q-Sepharose era dos veces mayor que la de la preparacion con sflice.
Los siguientes experimentos se disenaron para caracterizar ADN-Tr fetal con mas detalle. Usando cuatro conjuntos de cebadores y sondas, que amplificaron secuencias del gen de SYR de 25 pares de bases, 39 pares de bases, 65 pares de bases y 88 pares de bases, se realizo PCR en tiempo real con aDn aislado de las mismas muestras de orina de gestantes con fetos de sexo masculino mediante dos tecnicas, la basada en sflice o la absorcion en resina Q. Los datos presentados en la siguiente tabla demuestran claramente que ambos factores son muy importantes, un metodo de aislamiento de ADN y el tamano del amplicon. En primer lugar, la sensibilidad es mayor con un tamano de amplicon mas corto. Incluso el aumento de tamano de una secuencia diana de 25 pares de bases a 39 pares de bases disminuyo la sensibilidad del ensayo, y el ADN fetal no pudo detectarse en todas las muestras con un amplicon de 88 pares de bases. En segundo lugar, el aislamiento de fragmentos de ADN mas cortos que 150 pares de bases con la tecnica basada en resina-Q aumento significativamente la sensibilidad cuando se amplificaron secuencias de 25 pares de bases y de 39 pares de bases. Ambos metodos de aislamiento de ADN dieron resultados similares con el amplicon de 65 pares de bases.
La cantidad de embarazos detectados satisfactoriamente con fetos de sexo masculino depende del tamano del amplicon. El ADN se aislo mediante dos metodos de muestras de orina de diez gestantes con fetos de sexo masculino.
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Metodo de aislamiento de ADN
Tamano de la diana SRY
25 pares de bases
39 pares de bases 65 pares de bases 88 pares de bases
Resina Q
10 8 3 0
Sflice
7 4 3 0
Los datos obtenidos proporcionan informacion sobre las propiedades de ADN-Tr, en particular caractensticas de ADN-Tr fetal en la orina materna. En primer lugar, una mayor sensibilidad de deteccion de la secuencia fetal en ADN purificado con resina Q cuando se comparo con ADN aislado por el metodo de sflice demuestra que fragmentos de ADN de 50 - <150 pares de bases contienen ADN-Tr fetal. Esta diferencia en sensibilidad se observa con amplicones solo de 25 pares de bases y 39 pares de bases, lo que significa que fragmentos mas grandes de ADN-Tr fetal detectable con amplicones de 65 pares de bases pertenece a fracciones de ADN aislado por ambos metodos, mas probablemente a fragmentos de aDn con 150-200 pares de bases.
En segundo lugar, la sensibilidad de deteccion de secuencias fetales en ADN aislado con el metodo de sflice depende del tamano del amplicon en un intervalo de tamano de 25-88 pares de bases, aunque los fragmentos de ADN mas cortos aislados por esta tecnica tienen una longitud de aproximadamente 150 pares de bases. La explicacion mas plausible de estos resultados es la presencia de roturas monocatenarias en fragmentos de 150-200 pares de bases de ADN-Tr, que constituye dianas amplificables significativamente mas cortas.
Basandose en los resultados anteriores, la deteccion de dianas de ADN ultracorto es esencial para la deteccion satisfactoria de secuencias de ADN-Tr.
Ejemplo 6
El ejemplo 6 muestra la deteccion de secuencias de ADN transrenal bacteriano de diferente tamano en ADN aislado de orina de pacientes con tuberculosis mediante dos metodos.
Dado que el ADN bacteriano esta cubierto por diferentes protemas distintas en comparacion con el ADN eucariota y que no esta empaquetado en nucleosomas, los datos obtenidos con ADN-Tr humano no son necesariamente correctos para ADN procariota. Recientemente, se detecto ADN de Mycobacterium tuberculosis (MTB) mediante PCR anidada en la orina de pacientes con tuberculosis pulmonar (Cannas, A. et al., Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12: 146151, 2008). En el primer conjunto de experimentos con ADN de MTB, se aislo ADN urinario mediante por los dos metodos descritos anteriormente y se analizaron por PCR en tiempo real usando cebadores disenados para amplicones de diversos tamanos. La siguiente tabla demuestra que los fragmentos de ADN-Tr bacteriano pueden detectarse en la orina de pacientes infectados por amplificacion de dianas cortas y ultracortas, pero en el ultimo caso se detecto un numero de copias genicas espedficas de MTB significativamente mas alto. Incluso se detectaron mas copias de secuencias de ADN de MTB con cebadores disenados para dianas ultracortas en preparaciones de ADN aisladas por metodos basados en intercambio anionico.
Dependencia del tamano del amplicon de la deteccion de ADN-Tr de MTB (copias/ml) en acidos nucleicos aislados por dos metodos de la orina de un paciente con tuberculosis pulmonar activa.
Tamano de la Diana
Silice Q-Sepharose
39 pares de bases
24 50
49 pares de bases
5 4
99 pares de bases
0 0
Ejemplo 7
El Ejemplo 7 muestra la deteccion de ADN transrenal procariota y eucariota en ADN urinario fraccionado.
Los acidos nucleicos aislados de orina se separaron adicionalmente en fracciones de alto/medio y bajo peso molecular. Se anadio etanol a los acidos nucleicos elrndos de la Q-Sepharose al 30 % v/v, y la mezcla se hizo pasar a traves de una columna de sflice. Se recogio una fraccion a traves de flujo, y despues de la adicion de etanol hasta el 70 % la mezcla se cargo sobre otra columna de sflice. Acidos nucleicos de alto/medio y bajo peso molecular, respectivamente, se eluyeron de la primera y segunda columnas. La Figura 14 ilustra la separacion de acidos nucleicos urinarios de diferentes pesos moleculares. En la figura 14, el carril 1 muestra acidos nucleicos totales; el carril 2 muestra la fraccion de alto/medio peso molecular y el carril 3 muestra fracciones de peso molecular bajo.
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En el primer conjunto de experimented, se comparo la cantidad de secuencias TSPY y SRY espedficas del cromosoma Y en las fracciones de alto/medio y bajo peso molecular. Los dates presentados en la siguiente tabla demuestran que las ultimas conteman la cantidad significativa de secuencias espedficas de feto.
Concentraciones de ADN-Tr fetal en fracciones de acido nucleico de orina de una gestante con un feto de sexo masculino.
ADN
TSPY SRY
GE/ml de orina
GE/ml de orina
ADN total
44 67
PM alto/medio
3 19
PM bajo
33 61
Se realizaron experimentos similares para el analisis de la distribucion de ADN-Tr bacteriano en ADN urinario fraccionado. En la Figura 15 se presentan los resultados del analisis de ADN de MTB en ADN fraccionado de la orina de un paciente con tuberculosis pulmonar. En la Figura 15, el carril 1 muestra ADN total; el carril 2 muestra ADN de peso molecular alto/medio; el carril 3 muestra ADN de peso molecular bajo; el carril 5 muestra sin molde (reaccion control); y el carril 5 muestra control positivo con ADN genomico de MTB (cepa Erdman).
Una vez mas, se detectaron secuencias espedficas de MTB en la fraccion de peso molecular tanto alto/medio como bajo, conteniendo la ultima mas copias de ADN-r bacteriano.
A continuacion se exponen realizaciones ejemplares de la invencion:
1. Un metodo de deteccion de acidos nucleicos que no son de hospedador que se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente, que comprende:
(a) obtener una muestra de orina de dicho paciente; y
(b) analizar dicha muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos que no son del paciente que son diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente y que han atravesado la barrera renal donde dicho analisis comprende la etapa de detectar dichas una o mas secuencias espedficas en los acidos de 20-50 nucleotidos de longitud de dicha muestra de orina.
2. El metodo del punto 1, donde dichos acidos nucleicos son ADN.
3. El metodo del punto 1, donde dichos acidos nucleicos son ARN.
4. El metodo del punto 1, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una tecnica seleccionada del grupo que consiste en hibridacion, reaccion con sondas de ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y PCR para analizar polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion.
5. El metodo del punto 1, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una reaccion en cadena
de la polimerasa que usa pares de cebadores suficientemente complementarios para hibridar con una secuencia
diana de dichos acidos nucleicos.
6. El metodo del punto 5, donde las secuencias que se unen a la diana de dichos pares de cebadores se solapan o estan inmediatamente adyacentes entre sf
7. El metodo del punto 1, donde dicha degradacion de acido nucleico en dicha muestra de orina esta reducida.
8. El metodo del punto 7, donde la reduccion de la degradacion de acido nucleico comprende inhibir la actividad nucleasa aumentado el pH, aumentando la concentracion salina, termoinactivando o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico.
9. El metodo del punto 1, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
10. El metodo del punto 1, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos acidos nucleicos en dicha muestra de orina.
11. El metodo del punto 10, donde dicho aislamiento es por precipitacion o usando un material adsorbente solido.
12. El metodo del punto 1, que comprende adicionalmente filtrar dicha muestra de orina para eliminar las sustancias contaminantes.
13. El metodo del punto 12, donde dicha filtracion elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 1000 nucleotidos.
14. El metodo del punto 12, donde dicha filtracion elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de
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aproximadamente 300 nucleotidos.
15. El metodo del punto 1, donde dicho analisis comprende cuantificar dichos acidos nucleicos.
16. Un metodo de deteccion de acidos nucleicos de un patogeno, donde dichos acidos nucleicos se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente, que comprende:
(a) obtener una muestra de orina de dicho paciente; y
(b) analizar dicha muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos patogenos que son diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente y de los acidos nucleicos patogenos que tienen 20-50 nucleotidos de longitud y que han atravesado la barrera renal donde dicho analisis comprende la etapa de detectar dichas una o mas secuencias espedficas del patogeno.
17. El metodo del punto 16, donde dichos acidos nucleicos patogenos son ADN.
18. El metodo del punto 16, donde dichos acidos nucleicos patogenos son ARN.
19. El metodo del punto 16, donde el patogeno se selecciona del grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un micoplasma y un protozoo.
20. El metodo del punto 16, donde dicha etapa de analisis de dicha muestra de orina incluye una tecnica seleccionada del grupo que consiste en hibridacion, reaccion con sondas de ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y PCR para analizar polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion.
21. El metodo del punto 16, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una reaccion en cadena de la polimerasa que usa pares de cebadores suficientemente complementarios para hibridarse con una secuencia diana de dichos acidos nucleicos patogenos de dicho patogeno.
22. El metodo del punto 21, donde las secuencias que se unen a la diana para dichos pares de cebadores se solapan o estan inmediatamente adyacentes entre sf.
23. El metodo del punto 16, donde la degradacion del acido nucleico en dicha muestra de orina esta reducida.
24. El metodo del punto 23, donde la reduccion de la degradacion de acido nucleico comprende la inhibicion de la actividad nucleasa aumentando el pH, aumentando la concentracion salina, termoinactivando o portratamiento de dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico.
25. El metodo del punto 16, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
26. El metodo del punto 16, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos acidos nucleicos patogenos en dicha muestra de orina.
27. El metodo del punto 26, donde dicho aislamiento es por precipitacion usando un material adsorbente solido.
28. El metodo del punto 16, que adicionalmente comprende filtrar dicha muestra de orina para eliminar las sustancias contaminantes.
29. El metodo del punto 28, donde dicha filtracion elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 1000 nucleotidos.
30. El metodo del punto 28, donde dicha filtracion elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
31. El metodo del punto 16, donde dicho analisis comprende cuantificar dichos acidos nucleicos patogenos.
32. Un metodo de deteccion de cancer en un paciente que comprende:
(a) obtener una muestra de orina de dicho paciente; y
(b) analizar dicha muestra de orina para detectar uno o mas acidos nucleicos espedficos de 20-50 nucleotidos de longitud, que son indicativos de cancer, y que han atravesado la barrera renal, donde dicho analisis comprende la etapa de detectar dichos uno o mas acidos nucleicos espedficos indicativos de cancer.
33. El metodo del punto 32, donde dichos acidos nucleicos son ADN.
34. El metodo del punto 32, donde dichos acidos nucleicos son ARN.
35. El metodo del punto 32, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una tecnica seleccionada del grupo que consiste en hibridacion, reaccion de sondas de ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de una cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y PCR para analizar polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion.
36. El metodo del punto 32, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una reaccion en cadena de la polimerasa que usa pares de cebadores suficientemente complementarios para hibridar con una secuencia diana de dichos acidos nucleicos indicativos de cancer.
37. El metodo del punto 36, donde las secuencias que se unen a la diana para dichos pares de cebadores estan solapando o inmediatamente adyacentes entre sf.
38. El metodo del punto 32, donde la degradacion de acido nucleico en dicha muestra de orina esta reducida.
39. El metodo del punto 38, donde la reduccion de la degradacion de acido nucleico comprende la inhibicion de
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la actividad nucleasa aumentado el pH, aumentando la concentracion salina, termoinactivando, o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico.
40. El metodo del punto 32, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
41. El metodo del punto 32, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos acidos nucleicos, indicativos de cancer, en dicha muestra de orina.
42. El metodo del punto 41, donde dicho aislamiento es por precipitacion o usando un material adsorbente solido.
43. El metodo del punto 32, que adicionalmente comprende filtrar dicha muestra de orina para eliminar las sustancias contaminantes.
44. El metodo del punto 43, donde dicha filtracion elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 1000 nucleotidos.
45. El metodo del punto 43, donde dicha filtracion elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
46. El metodo del punto 32, donde dicho analisis comprende cuantificar dichos acidos nucleicos, indicativos de cancer.
47. Un metodo de deteccion de una enfermedad o un trastorno genetico en un feto, que comprende:
(a) obtener una muestra de orina de una gestante; y
(b) analizar dicha muestra de orina para determinar uno o mas acidos nucleicos fetales espedficos de 20-50 nucleotidos de longitud, que han atravesado las barreras placentaria y renal, donde dicho analisis comprende la etapa de detectar dichos uno o mas acidos nucleicos fetales espedficos indicativos de una enfermedad genetica.
48. El metodo del punto 47, donde dichos acidos nucleicos son ADN.
49. El metodo del punto 47, donde dichos acidos nucleicos son ARN.
50. El metodo del punto 47, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una tecnica seleccionada del grupo que consiste en hibridacion, reaccion con sondas de ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y PCR para analizar polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion.
51. El metodo del punto 47, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una reaccion en cadena de la polimerasa que usa pares de cebadores suficientemente complementarios para hibridarse con una secuencia diana de dichos acidos nucleicos indicativos de una enfermedad o trastorno genetico.
52. El metodo del punto 51, donde las secuencias que se unen a la diana para dichos pares de cebadores estan solapando o inmediatamente adyacentes entre sf.
53. El metodo del punto 47, donde la degradacion del acido nucleico en dicha muestra de orina esta reducida.
54. El metodo del punto 53, donde la reduccion de la degradacion del acido nucleico comprende la inhibicion de
la actividad nucleasa aumentando el pH, aumentando la concentracion salina, termoinactivando, o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico.
55. El metodo del punto 47, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
56. El metodo del punto 47, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos acidos nucleicos, indicativos de una enfermedad o trastorno genetico, en dicha muestra de orina.
57. El metodo del punto 56, donde dicho aislamiento es por precipitacion o usando un material adsorbente solido.
58. El metodo del punto 47, que adicionalmente comprende filtrar dicha muestra de orina para retirar las sustancias contaminantes.
59. El metodo del punto 58, donde dicha filtracion elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 1000 nucleotidos.
60. El metodo del punto 58, donde dicha filtracion elimina los acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
61. El metodo del punto 47, donde dicho analisis comprende cuantificar dichos acidos nucleicos, indicativos de una enfermedad o trastorno genetico.
62. Un metodo para controlar celulas, tejidos u organos trasplantados en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente que comprende:
(a) obtener una muestra de orina de dicho paciente; y
(b) analizar dicha muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos que no son del paciente de 20-50 nucleotidos de longitud de las celulas, tejidos u organos trasplantados que son
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diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente y que han atravesado la barrera renal para monitorizar las celulas, tejidos u organos trasplantados en zonas distintas a las del tracto urinario del paciente.
63. El metodo del punto 62, donde dicha etapa de analisis comprende adicionalmente analizar cuantitativamente dicha muestra de orina para detectar una o mas secuencias espedficas de los acidos nucleicos acelulares, transrenales de celulas muertas en las celulas, tejidos u organos trasplantados, que son diferentes de las secuencias de acidos nucleicos del paciente donde el analisis comprende la etapa de detectar dicha una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos de las celulas, tejidos u organos trasplantados en los acidos nucleicos que tienen una longitud de 20-50 nucleotidos de las muestras de orina y que han atravesado la barrera renal para controlar el rechazo o aceptacion de las celulas, tejidos u organos trasplantados.
64. El metodo del punto 62, donde dichos acidos nucleicos son ADN.
65. El metodo del punto 62, donde dichos acidos nucleicos son ARN.
66. El metodo del punto 62, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una tecnica seleccionada del grupo que consiste en hibridacion, reaccion de sondas de ciclado, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, PCR para analizar polimorfismos de conformacion de cadena sencilla, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y PCR para analizar polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion.
67. El metodo del punto 62, donde dicha etapa de analizar dicha muestra de orina incluye una reaccion en cadena de la polimerasa que usa pares de cebadores suficientemente complementarios para hibridarse con una secuencia diana de dichos acidos nucleicos.
68. El metodo del punto 67, donde las secuencias que se unen a la diana de dichos pares de cebadores estan solapando o inmediatamente adyacentes entre sf.
69. El metodo del punto 62, donde dicha degradacion de acido nucleico en dicha muestra de orina esta reducida.
70. El metodo del punto 69, donde la reduccion de la degradacion de acido nucleico comprende la inhibicion de la actividad nucleasa aumentando el pH, aumentando la concentracion salina, termoinactivando o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico.
71. El metodo del punto 62, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
72. El metodo del punto 62, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos acidos nucleicos en dicha muestra de orina.
73. El metodo del punto 72, donde dicho aislamiento es por precipitacion o usando un material adsorbente solido.
74. El metodo del punto 62, que adicionalmente comprende filtrar dicha muestra de orina para eliminar las sustancias contaminantes.
75. El metodo del punto 74, donde dicha filtracion elimina acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 1o0o nucleotidos.
76. El metodo del punto 74, donde dicha filtracion elimina acidos nucleicos que comprenden mas de aproximadamente 300 nucleotidos.
77. El metodo del punto 62, donde dicho analisis comprende cuantificar dichos acidos nucleicos.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de deteccion de acidos nucleicos que no son de hospedador que se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente, que comprende:
    (a) obtener una muestra de orina de dicho paciente;
    (b) aislar sustancialmente dichas secuencias de acido nucleico en dicha muestra, sin excluir acidos nucleicos de 10 a 150 pares de bases; y
    (c) ensayar la presencia de una o mas secuencias espedficas de acidos nucleicos que no son de hospedador que han atravesado la barrera renal detectando una o mas secuencias espedficas de 20-50 nucleotidos de longitud, con un metodo que comprende reaccion en cadena de la polimerasa y secuenciacion.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde dichos acidos nucleicos son ADN o ARN.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, donde dichos acidos nucleicos que no son de hospedador son acidos nucleicos patogenos, preferentemente donde el patogeno se selecciona del grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un micoplasma y un protozoo.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, donde dichos acidos nucleicos que no son de hospedador son acidos nucleicos fetales y el metodo es para detectar una enfermedad genetica o un trastorno en un feto, donde la muestra de orina se obtiene de una gestante y los acidos nucleicos han atravesado las barreras placentaria y renal.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, donde dichos acidos nucleicos que no son de hospedador son acidos nucleicos de celulas, tejidos u organos trasplantados y el metodo es para controlar celulas, tejidos u organos trasplantados en zonas distintas a las del tracto urinario.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente reducir la degradacion de acido nucleico en dicha muestra de orina, preferentemente donde la reduccion de la degradacion de acido nucleico comprende inhibir la actividad nucleasa aumentando el pH, aumentando la concentracion salina, termoinactivando, o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
    acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos acidos nucleicos en dicha muestra de orina por precipitacion o usando un material adsorbente solido.
  9. 9. Un metodo de deteccion del cancer en un paciente que comprende:
    (a) obtener una muestra de orina de dicho paciente;
    (b) aislar sustancialmente secuencias de acidos nucleicos en dicha muestra, sin excluir acidos nucleicos de 10 a 150 pares de bases; y
    (c) ensayar la presencia de uno o mas acidos nucleicos espedficos de 20-50 nucleotidos de longitud, que son indicativos de cancer, y que han atravesado la barrera renal, detectando una o mas secuencias espedficas de 20-50 nucleotidos de longitud, con un metodo que comprende reaccion en cadena de la polimerasa y secuenciacion.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, donde dichos acidos nucleicos son ADN o ARN.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 9, que comprende adicionalmente reducir la degradacion de acidos nucleicos en dicha muestra de orina, preferentemente donde la reduccion de la degradacion de acido nucleico comprende inhibir la actividad nucleasa aumentando el pH, aumentando la concentracion salina, termoinactivando, o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
    acido etilendiaminotetraacetico, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sodico.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 9, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 9, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos acidos nucleicos, indicativo de cancer, en dicha muestra de orina por precipitacion o usando un material adsorbente solido.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 1 o 9, donde dicho ensayo es mediante reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar los acidos nucleicos espedficos de 20-50 nucleotidos de longitud.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 1 o 9, donde la etapa (a) comprende filtrar dicha muestra para eliminar las 5 sustancias contaminantes.
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