ES2593458T3 - Uso de hidrogeles para biosensores con sensibilidad elevada - Google Patents
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Abstract
Uso de un hidrogel a base de polímero que se compone de al menos un polímero soluble en agua en un sensor para el enriquecimiento de una proteína de unión a glucosa disuelta, en el que el al menos un polímero puede interaccionar con la proteína de unión a glucosa y en el que la proteína de unión a glucosa se encuentra en un complejo con un ligando, comprendiendo el hidrogel a base de polímero una primera matriz de hidrogel de alginato y una segunda matriz de hidrogel, que forma una red interpenetrante dentro de la primera matriz de hidrogel.
Description
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DESCRIPCION
Uso de hidrogeles para biosensores con sensibilidad elevada
La presente invencion se refiere al uso de un hidrogel a base de poUmero que comprende al menos un polfmero soluble en agua en un sensor para el enriquecimiento de una protema de union a glucosa disuelta, en el que el al menos un polfmero puede interaccionar con la protema de union a glucosa y en el que la protema de union a glucosa se encuentra en un complejo con un ligando.
La determinacion de la concentracion de glucosa mediante una tecnica de medicion eficiente y fiable es de gran importancia en muchos campos de la tecnica. No solo en la analttica de laboratorio pura, sino tambien en la industria alimentaria, por ejemplo en el campo de la enologfa, asf como en el campo de la medicina, por ejemplo en el diagnostico de enfermedades que se provocan por un metabolismo de glucosa alterado, por ejemplo diabetes mellitus o smdrome metabolico, la determinacion rapida y fiable de la concentracion de glucosa desempena un papel fundamental en soluciones predeterminadas. En el campo del diagnostico de enfermedades que se basan en el metabolismo de glucosa alterado, se usan sensores de glucosa tanto en dispositivos que pueden implantarse en el cuerpo y pueden medir el contenido en glucosa en una muestra tomada dentro del cuerpo, como en sensores que miden ex vivo el contenido en glucosa en una muestra de un sujeto de prueba.
Para la determinacion del contenido en glucosa en una disolucion se han descrito sistemas de molecula de sensor y ligando, siendo el sensor una protema de union a glucosa y el ligando un competidor por la glucosa que, en el sensor, se encuentra en primer lugar unido a la protema de union a glucosa. Mediante competicion con glucosa durante el proceso de medicion se desplaza el competidor por la protema de union a glucosa. El desplazamiento del competidor por la glucosa por la protema de union a glucosa puede detectarse en este caso por medio de una variacion de una propiedad ffsica o qmmica de las moleculas, por ejemplo por medio de transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET). Los sistemas mencionados anteriormente deben encontrarse, naturalmente, en una zona espacialmente limitada del sensor.
Para la inclusion de los componentes de sistema, es decir de la protema de union a glucosa y del ligando, en medio acuoso, se usan membranas semipermeables. Las membranas de este tipo pueden componerse por ejemplo de celulosa regenerada, polietilenglicol, poliuretano, capas layer-bilayer (LBL) (capa-bicapa), polietersulfonas, capas de parileno o sflice perforada (vease por ejemplo el documento US2007/0122829). Como alternativa, se emplean tambien hidrogeles que, en cambio, se incluyen habitualmente tambien por una membrana adicional (vease por ejemplo el documento US 6.485.703; el documento US2007/0105176).
Los sensores de glucosa descritos en el estado de la tecnica presentan sin embargo una actividad de glucosa relativamente baja. La actividad de glucosa y, con ello, el rendimiento del sensor se determina de forma decisiva mediante las constantes de union para los complejos de protema de union a glucosa y competidor asf como protema de union a glucosa y glucosa. Ademas, tambien desempena un papel la movilidad de los componentes de sensor. Esta esta mas bien limitada en las matrices de hidrogel (Rounds 2007, J. Fluoroec. 17: 57-63).
La publicacion de Cheung et al. (Anal. Chim. Acta (2008), 607, paginas 204-210) describe el desarrollo de una plataforma de bioensayos reutilizable con el uso de almohadillas de hidrogel de permeabilidad controlada para la deteccion selectiva de sacaridos.
En el caso de sensores in vivo para la medicion de glucosa, el sensor debe reaccionar continuamente de forma reversible a cambios de concentracion del analito. Con ello, la constante de union no debe ser demasiado alta, dado que el sensor estana saturado de lo contrario ya a bajas concentraciones de analito y ya no podna indicar cambios de concentracion. Ademas, una problematica adicional de los sensores in vivo consiste en que puede establecerse el intervalo de la concentracion de analito y no puede optimizarse mediante dilucion o concentraciones. En el estado de la tecnica se describen esencialmente sistemas de ligando y protema de union a glucosa en los que se realizan constantes de union medias. Una adaptacion de las sensibilidades de medicion mediante la variacion de las concentraciones (por ejemplo mediante enriquecimiento) de, o bien protema de union a glucosa o ligando o bien ambos, esta limitada normalmente por la baja solubilidad de las moleculas correspondientes. En este sentido, en el caso de los sensores descritos en el estado de la tecnica mencionado anteriormente, esta limitada tanto la sensibilidad de medicion como la precision de medicion del sensor.
Es objetivo de la presente invencion proporcionar medidas que permiten mejorar la sensibilidad de medicion y la precision de biosensores para la medicion del nivel de glucosa. La invencion se consigue mediante las formas de realizacion descritas en las reivindicaciones asf como las formas de realizacion que se divulgan a continuacion.
La invencion se refiere por lo tanto al uso de un hidrogel a base de polfmero que se compone de al menos un polfmero soluble en agua en un sensor para el enriquecimiento de una protema de union a glucosa disuelta, en el que el al menos un polfmero puede interaccionar con la protema de union a glucosa y en el que la protema de union a glucosa se encuentra en un complejo con un ligando, comprendiendo el hidrogel a base de polfmero una primera
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matriz de hidrogel de alginato y una segunda matriz de hidrogel, que forma una matriz interpenetrante dentro de la primera matriz de hidrogel.
El termino "hidrogel" describe un polfmero que contiene agua, cuyas moleculas estan enlazadas qmmica o ffsicamente formando una red tridimensional. Las moleculas de polfmero pueden enlazarse entre sf mediante enlaces covalentes o ionicos o mediante entrelazado o entretejido para formar la red tridimensional. Los polfmeros que forman el hidrogel contienen componentes de polfmero hidrofilos que permite la absorcion de disoluciones acuosas asf como grupos que pueden interaccionar con la protema de union a glucosa. En particular, para lectinas tales como concanavalina A se describieron, ademas de un sitio de union para monosacaridos, por ejemplo glucosa, tambien un sitio de union adicional para moleculas de azucar terminales (Moothoo 1999, Glycobiology 9(6): 539-545; Bryce 2001, Biophysical Journal 81: 1373-1388; Moothoo 1998, Glycobiology 8(2): 173-l8l; Delatorre 2007, BMC Structural Biology 7:52). Los azucares o moleculas o restos estructuralmente similares en las moleculas de polfmero del hidrogel pueden interaccionar preferentemente con estos sitios de union adicionales. En funcion del tipo de la protema de union a glucosa se selecciona de acuerdo con la invencion un polfmero que dispone de restos que pueden interaccionar con la protema de union a glucosa sin, a este respecto, bloquear los sitios de union para glucosa. Restos adecuados pueden ser en este sentido tambien anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, tales como Fab F(ab)2, scFv o similares, que se acoplan al polfmero y que reconocen espedficamente la protema de union a glucosa. En lugar de anticuerpos, pueden usarse de manera analoga tambien aptameros que reconocen espedficamente la protema de union a glucosa.
El al menos un polfmero se selecciona del grupo que consiste en: alginatos, Sepharose, acido hialuronico, quitosan, carragenanos, poli(alcoholes vimlicos) (PVA), polietilenglicoles (PEG), poli(2-oxazolinas), poliacrilamidas (por ejemplo dimetilacrilamida), polihidroxiacrilatos (por ejemplo polihidroximetacrilato, polihidroxiacrilamidas, polivinilpirolinonas), polfmeros de (2-metil-3-etil[2-hidroxietilo]), polihidroxialcanoatos (PHA), poli(2-metil-2 oxazolinas), poli(2-etil-2-oxazolinas), poli(2-hidroxietil-2-oxazolinas), poli(2-(1-(hidroximetil)-etil)-2-oxazolinas), poli- (hidroxietilmetacrilato) (PHEMA), poli-(hidroxietilacrilato) (PHEA), poli-vinilpirolidonas, poli-(dimetil)acrilamida, poli- (hidroxietil)acrilamida, poli(alcoholes vimlicos) (inclusive copolfmeros con acetatos de vinilo y/o etilenos), poli(etileno- co-alcohol vimlico), poli(acetato de vinilo-co-alcohol vimlico), poli(etileno-co-acetato de vinilo-co-alcohol vimlico), polietilenglicoles y poli(etilenglicol-co-propilenglicol).
Preferentemente, el al menos un polfmero se selecciona del grupo que consiste en:
alginatos, Sepharose, acido hialuronico, quitosan y carragenanos. De manera especialmente muy
preferentemente, el al menos un polfmero es un alginato.
Se entiende que el hidrogel puede presentar en el sensor tambien otros polfmeros. En particular, el hidrogel a base de polfmero puede comprender una primera matriz de hidrogel de alginato y una segunda matriz de hidrogel que forma una matriz interpenetrante dentro de la primera matriz de hidrogel. Esta segunda matriz de hidrogel se compone preferentemente de un polfmero soluble en agua con al menos un grupo reticulable por molecula y un peso molecular de como maximo 500.000. Se prefiere especialmente un peso molecular de como maximo 250.000, 200.000, 150.000, 100.000 o 50.000. Preferentemente, el polfmero de la segunda matriz de hidrogel se selecciona, en este caso, del grupo que consiste en: poli(alcoholes vimlicos) (PVA), polietilenglicoles (PEG), poli(2-oxazolinas), poliacrilamidas (por ejemplo dimetilacrilamida), polihidroxiacrilatos (por ejemplo polihidroximetacrilato, polihidroxiacrilamidas, polivinilpirolinonas), polfmeros de (2-metlil-3-etil[2-hidroxietilo]), polihidroxialcanoatos (PHA), poli(2-metil-2-oxazolinas), poli(2-etil-2-oxazolinas), poli(2-hidroxietil-2-oxazolinas), poli(2-(1-(hidroximetil)-etil)-2- oxazolinas), poli-(hidroxietilmetalcrilato) (PHEMA), poli-(acrilato de hidroxietilo) (PHEA), poli-vinilpirolidonas, poli- (dimetil)acrilamida, poli-(hidroxietil)acrilamida, poli(alcoholes vimlicos) ((inclusive copolfmeros con acetatos de vinilo y/o etilenos), poli(etileno-co-alcohol vimlico), poli(acetato de vinilo-co-alcohol vimlico), poli(etileno-co-acetato de vinilo-co-alcohol vimlico), polietilenglicoles y poli(etilenglicol-co-propilenglicol).
De manera especialmente preferente, la segunda matriz de hidrogel se forma a partir de poli(alcohol vimlico). Se prefiere especialmente el poli(alcohol vimlico) con un peso molecular de 10.000 a 100.000, mas preferentemente de 10.000 a 50.000, ademas preferentemente de 10.000 a 20.000 y de manera muy especialmente preferente 15.000. De manera especialmente preferente, el poli(alcohol vimlico) presenta un contenido en agente reticulante de como maximo 0,5 mmol/g, 0,4 mmol/g, 0,35 mmol/g o 0,3 mmol/g y de manera muy especialmente preferente 0,35 mmol/g. Ademas el poli(alcohol vimlico) presenta de manera especialmente preferente un contenido en solidos del prepolfmero inferior al 40 por ciento en peso.
El hidrogel de acuerdo con la invencion puede contener, ademas de la primera matriz de hidrogel y la segunda matriz de hidrogel aditivos, por ejemplo estabilizadores, emulsionantes, antioxidantes, estabilizadores UV, detergentes, y/o iniciadores UV.
El hidrogel usado de acuerdo con la invencion puede estar rodeado ademas por un material de envuelta adicional, preferentemente semipermeable. Mediante este encerramiento se impide un "desangrado" ("leaching') de los componentes de sensor del hidrogel. Como material de envuelta se tienen en cuenta membranas semipermeables u otras matrices de hidrogel. Las membranas semipermeables pueden componerse preferentemente de celulosa
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regenerada, polietilenglicol, poliuretano, capas de capa-bicapa (LBL), polietersulfonas, capas de parileno o s^lice perforada. Como material de envuelta se tiene en cuenta tambien otra matriz de hidrogel. Preferentemente, este puede formarse a partir de un polfmero seleccionado del grupo que consiste en alginatos, Sepharose, acido hialuronico, quitosan, carragenanos, poli(alcoholes vimlicos) (PVA), polietilenglicoles (PEG), poli(2-oxazolinas), poliacrilamidas (por ejemplo dimetilacrilamida), polihidroxiacrilatos (por ejemplo polihidroximetacrilato, polihidroxiacrilamidas, polivinilpirolinonas), polfmeros de (2-metil-3-etil[2-hidroxietil]), polihidroxialcanoatos (PHA), poli(2-metil-2 oxazolinas), poli(2-etil-2-oxazolinas), poli(2-hidroxietil-2-oxazolinas), poli(2-(1-(hidroximetil)-etil)-2- oxazolinas), poli-(hidroxietilmetacrilato) (PHEMA), poli-(acrilato de hidroxietilo) (PHEA), poli-vinilpirolidonas, poli- (dimetil)acrilamida, poli-(hidroxietil)acrilamida, poli(alcoholes vimlicos) (inclusive copolfmeros con acetatos de vinilo y/o etilenos), poli(etileno-co-alcohol vimlico), poli(acetato de vinilo-co-alcohol vimlico), poli(etileno-co-acetato de vinilo-co-alcohol vimlico), polietilenglicoles y poli(etilenglicol-co-propilenglicol).
La expresion "protema de union a glucosa" se refiere, en el contexto de la invencion, a protemas que pueden interaccionar espedficamente con glucosa. Si una protema puede interaccionar espedficamente con glucosa, puede determinarse sin mas por el experto, mediante pruebas de union conocidas en el estado de la tecnica. Preferentemente, la protema de union a glucosa puede ademas, interaccionar con el polfmero del hidrogel. Preferentemente, esta interaccion no se media por el sitio de union a glucosa de la protema de union a glucosa. De manera especialmente preferente, la protema de union a glucosa se selecciona del grupo que se compone de lectinas, enzimas que se unen a glucosa como sustrato, y anticuerpos que reconocen espedficamente glucosa. La expresion abarca tambien moleculas subrogadas que pueden reconocer glucosa espedficamente, preferentemente aptameros, que reconocen espedficamente glucosa. De manera muy especialmente preferente, la protema de union a glucosa es concanavalina A.
Las secuencias de acido nucleico y secuencias de aminoacidos que codifican para las protemas de union a glucosa mencionadas anteriormente, son conocidas en el estado de la tecnica (Yamauchi 1990, FEBS Letters 260(1): 127130). Por consiguiente, las protemas mencionadas anteriormente pueden proporcionarse sin mas por el experto. Dichas protemas pueden producirse por ejemplo de manera recombinante o purificarse a partir de una fuente biologica. Ademas, las protemas pueden sintetizarse tambien qmmicamente. La mayona de las protemas mencionadas anteriormente se encuentran ademas comercialmente disponibles. Los anticuerpos o aptameros, que reconocen espedficamente glucosa, pueden proporcionarse por el experto sin mas mediante metodos conocidos en el estado de la tecnica para la obtencion de anticuerpos o aptameros.
Las protemas de union a glucosa mencionadas anteriormente y en particular concanavalina A pueden presentar preferentemente tambien modificaciones qmmicas que, median una solubilidad en agua elevada en comparacion con versiones no modificadas de las protemas de union a glucosa. Tales modificaciones comprenden preferentemente la funcionalizacion con un polfmero soluble en agua y pueden seleccionarse en una forma de realizacion especialmente preferente, del grupo que consiste en: pegilacion, acetilacion polioxazolinizacion y succinilacion.
La deteccion de glucosa en una muestra que va a analizarse tiene lugar en el dispositivo de acuerdo con la invencion mediante un desplazamiento del ligando unido a la protema de union a glucosa mediante la glucosa contenida en la muestra (competicion entre ligando y glucosa). Preferentemente, el ligando tiene por lo tanto una menor afinidad con la protema de union a glucosa que la glucosa. El desplazamiento puede detectarse preferentemente mediante marcaje del ligando con un colorante u otra molecula de marcador detectable. Han resultado ser especialmente adecuados para la deteccion de un desplazamiento, colorantes u otras moleculas de marcador, que al aproximarse a las moleculas unidas a los mismos provocan una variacion de al menos una propiedad ffsica o qmmica medible. Los sistemas adecuados abarcan aquellos en los que por medio de transferencia de energfa entre las moleculas de colorante o bien se suprime o bien se genera una senal medible. Tales sistemas basados en transferencia de energfa se describen en detalle por ejemplo en el documento WO2001/13783. Preferentemente, en este caso puede tratarse de sistemas en los que mediante efectos de hinchamiento se suprime una senal de fluorescencia cuando el colorante o las moleculas de marcador y, con ello la protema de union a glucosa y su ligando, estan en proximidad espacial. Despues del desplazamiento del ligando por el analito se aumenta entonces el efecto de hinchamiento. Este efecto puede detectarse mediante una variacion de la fluorescencia. Para la deteccion pueden emplearse por ejemplo fotometros de fluorescencia tal como se describe en el documento WO2002/087429. Otros sistemas adecuados son los denominados sistemas de deteccion basados en transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET). En este caso, se marcan dos componentes que interaction, tal como la protema de union a glucosa y su ligando, con colorantes de fluorescencia. Un componente se acopla con un colorante aceptor, el otro con un colorante donador. Mediante la interaccion de los componentes se aproximan espacialmente los colorantes mediante lo cual se media el efecto FRET. En este caso se transfiere la energfa de excitacion del colorante donador al colorante aceptor y con ello se reduce de forma medible la intensidad del colorante donador. Tan pronto como se interrumpe la interaccion de los componentes, aumenta de nuevo la intensidad de fluorescencia del donador. En el caso del dispositivo de acuerdo con la invencion, la glucosa puede detectarse por lo tanto a traves del aumento de la intensidad de una senal que se genera por un colorante o molecula de marcador despues de la separacion del complejo de la protema de union a glucosa y el ligando se genera mediante los analitos. El colorante o la molecula de marcador esta acoplado o bien a la protema de union a glucosa o bien a los ligandos. Por ejemplo, un colorante donador puede estar acoplado a la protema de union a
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glucosa o el ligando, estando acoplado el componente no acoplado con el colorante donador con un colorante aceptor adecuado. En un dispositivo de acuerdo con la invencion configurado de esta manera, antes de cargarse con una muestra que contiene glucosa, puede observarse el efecto FRET como resultado de la union del ligando a la protema de union a glucosa. Tras cargarse, la glucosa desplaza el ligando, de modo que aumenta la intensidad medible de la fluorescencia del colorante donador, en concreto, proporcionalmente a la cantidad de glucosa.
Birch et. al (Birch 2001, Spectrochimica Acta Parte A 57: 2245-2254) han calculado la solucion matematica del equilibrio qmmico para el caso de concanavalina A como protema de union a glucosa y dextrano como ligando. Simulaciones con concentraciones variables de concanavalina A y dextrano han dado como resultado que la relacion (dextrano) / (complejo ConA-dextrano) solo depende ligeramente de las concentraciones de partida y las constantes de union KDex y Kgiuc son los factores principales para el funcionamiento del sensor.
Sorprendentemente, la estructura de los colorantes repercute, sin embargo, asf mismo sobre la actividad de glucosa. De este modo, de acuerdo con la invencion es claramente superior una combinacion de un colorante de rodamina y un colorante de oxazina de la combinacion usada convencionalmente de un colorante de xanteno y un colorante de rodamina (FITC-TMR).
Preferentemente, la protema de union a glucosa, que se emplea en el contexto del uso de acuerdo con la invencion, esta ligada con un colorante de oxazina. El experto conoce absolutamente un enlace de este tipo y se describe suficientemente en el estado de la tecnica. De manera especialmente preferente, el colorante de oxazina es un aceptor de oxazina, seleccionado del grupo que consiste en: ATTO655, ATTO680, EVObluelO, EVOblue30, EVOblue90 y EVObluelOO. De manera muy especialmente preferente se emplea ATTO680. Los colorantes de oxazina mencionados se encuentran comercialmente disponibles.
El grado de marcaje preferido (DOL, "degree of labeling") para la protema de union a glucosa, por ejemplo concanavalina A, es de 0,1 a 4 mas intenso, preferentemente de 1 a 4 y de manera especialmente preferente de 1 a 3. En el caso de la concanavalina A un dOl de 1 corresponde en este caso a un mol de colorante por mol de concanavalina A tetramero (MW = 104.000). En el caso de un DOL alto y el uso de colorantes relativamente no polares (normalmente colorantes de fluorescencia de onda larga), la protema de union a glucosa esta preferentemente funcionalizado con PEG. El grado de pegilacion preferente es de 0,1 a 5, el peso molecular preferido es de 200 a 10.000, de manera especialmente preferente de 800 a 8.000 y de manera muy especialmente preferente de 800 a 5.000.
En el contexto de los experimentos en los que se basa la presente invencion se establecio que las modificaciones qmmicas de las protemas de union a glucosa, que median una solubilidad en agua elevada en comparacion con variantes no modificadas, pueden emplearse de manera ventajosa para alcanzar un mejor grado de marcaje en las protemas de union a glucosa. Para las protemas de union a glucosa modificadas de acuerdo con la presente invencion pueden alcanzarse tambien mayores grados de marcaje con un colorante que para variantes no modificadas de las mismas. Para tales protemas de concanavalina A modificadas pueden conseguirse preferentemente concentraciones mayores que 0,5 mg/(g de matriz) y de manera muy especialmente preferente entre 2 y 60 mg/(g de matriz). Sorprendentemente, la actividad de glucosa medida de protemas de concanavalina A modificadas era en este caso tambien comprable con la de concanavalina A nativa en hidrogel.
Preferentemente, la protema de union a glucosa disuelta en el hidrogel puede encontrarse en este caso en una concentracion elevada al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces en comparacion con una disolucion acuosa.
La solubilidad mejorada es en particular relevante cuando las protemas de union a glucosa deben marcarse con un colorante, dado que las protemas de union a glucosa marcadas con colorantes, por ejemplo una concanavalina A modificada con uno de los colorantes de oxazina mencionados anteriormente, tienen una solubilidad reducida de nuevo en disolucion acuosa. En este sentido, cuanto mayor es el grado de marcaje, menor es la solubilidad en disolucion acuosa. Sin embargo, un alto grado de marcaje se necesita precisamente para protemas de union a glucosa como componentes de sensor en los dispositivos de acuerdo con la invencion.
La expresion "ligando de la protema de union a glucosa" designa una molecula que puede adoptar una union espedfica con la protema de union a glucosa, interaccionando la molecula esencialmente con el mismo sitio de union que la glucosa, de modo que la molecula unida puede desplazarse por la glucosa del sitio de union en la protema de union a glucosa. Las moleculas adecuadas como ligando estan relacionadas por lo tanto estructuralmente con glucosa. Preferentemente, el ligando de la protema de union a glucosa es un oligosacarido, una macromolecula glicosilada, por ejemplo una protema o peptido glicosilado, o una nanopartmula glicosilada. Las moleculas mencionadas anteriormente, que pueden emplearse como ligandos de la protema de union a glucosa, son conocidas en el estado de la tecnica y pueden proporcionarse sin mas por el experto. De manera especialmente preferente se emplea un dextrano como ligando de la protema de union a glucosa.
Preferentemente, el ligando de la protema de union a glucosa esta acoplado en el sensor con un colorante de rodamina. De manera especialmente preferente, en este sentido pueden emplearse ATTO590, ATTO610, ROX,
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TMR, rodamina G6, colorantes Alexa fluor o Dy590 y de manera muy especialmente preferente ATTO590.
El grado de marcaje (DOL) preferente para los ligandos de la protema de union a glucosa, por ejemplo dextrano, es de 0,00003 a 0,017 (mol de colorante)/(mol de subunidad), de manera especialmente preferente de 0,0005 a 0,007 (mol de colorante)/(mol de subunidad) y de manera muy especialmente preferente de 0,001 a 0,0016 (mol de colorante)/(mol de subunidad). El grado de marcaje del ligando tiene asf mismo una influencia sobre la actividad de glucosa. Grados de marcaje demasiado bajos al igual que demasiado altos llevan a una peor actividad de glucosa.
En una forma de realizacion preferida del uso de acuerdo con la invencion la protema de union a glucosa es concanavalina A. Asf mismo, la concanavalina A mediante modificaciones qmmicas, preferentemente pegilacion, acetilacion polioxazolinizacion o succinilacion, presenta una solubilidad en agua elevada en comparacion con la concanavalina A no modificada. La protema de union a glucosa esta ligada en una forma de realizacion preferida con un colorante de oxazina y el ligando de la protema de union a glucosa con un colorante de rodamina. De manera muy especialmente preferente se usa un sistema de concanavalina A / dextrano en el sensor, en el que el dextrano esta ligado con un colorante donador de rodamina y la concanavalina A con un colorante aceptor de oxazina. En el sistema de concanavalina A / dextrano preferido, los componentes se encuentran preferentemente en una relacion de masas (dextrano/ConA) de 1:1 a 1:40, prefiriendose especialmente relaciones de masas proximas a 1:10.
En el contexto de la presente invencion se establecio que la combinacion de colorantes de oxazina y rodamina provoca una interaccion heterodfmera entre los restos de colorante, que refuerza la actividad de glucosa. Por lo tanto, mediante el uso de colorantes aceptores de oxazina y donadores de rodamina pudo conseguirse ya en disolucion acuosa preferentemente una actividad de glucosa de 2,1 veces. En el hidrogel empleado en el contexto de la presente invencion pudo provocarse incluso un aumento de 2,6 veces de la actividad de glucosa.
Mediante el uso de un polfmero que puede interaccionar con la protema de union a glucosa, puede conseguirse ventajosamente una mayor concentracion de protema de union a glucosa y ligando en el hidrogel del sensor. Esto aumenta la sensibilidad de medicion pero tambien la precision de medicion del sensor, en particular en aplicaciones in vivo con una concentracion de glucosa dada.
En el contexto de la presente invencion se establecio ventajosamente que el uso de un hidrogel, que se compone de una primera matriz de hidrogel como alginato y una segunda matriz de hidrogel, que forma dentro de la primera una matriz interpenetrante, puede crear un entorno para los componentes de sensor, en concreto la protema de union a glucosa y los ligandos competitivos de la protema de union a glucosa, que permite una determinacion eficiente de la actividad de glucosa. Muchos planteamientos para la medicion de glucosa por medio de fluorescencia son satisfactorios en disolucion, pero pierden su actividad cuando los componentes de sensor se integran en matrices de hidrogel, dado que se limita la movilidad de los componentes de sensor (Rounds 2007, J. Fluoroesc. 17: 57-63; documento US 2007/0105176 A1). Sorprendentemente en particular tambien con respecto a los calculos de Birch et al (Birch 2001, loc cit) pudo establecerse sin embargo en el presente caso una actividad aumentada hasta 2,6 veces con respecto a disoluciones acuosas. Mediante la eleccion de matrices de hidrogel adecuadas pudo conseguirse un enriquecimiento de la protema de union a glucosa en gran medida a traves de su lfmite de solubilidad en disolucion acuosa. En el caso de concanavalina A pudo conseguirse por ejemplo una concentracion elevada mas de 10 veces con respecto a una concentracion que puede alcanzarse en disolucion libre. Habitualmente se influye en la solubilidad del componente de receptor en disolucion libre aun negativamente mediante la adicion del ligando, dado que el complejo de receptor / competidor debido a su tamano y con frecuencia tambien debido a multivalencias una menor solubilidad. Mientras que por ejemplo un complejo concanavalina A / dextrano en disolucion comienza a precipitar en una relacion en masa de 1:10 ya a partir de una concentracion de concanavalina A de 0,5 mg/(g de disolucion), en un hidrogel adecuado con la misma relacion en masa puede ajustarse una concentracion de concanavalina A de mas de 50 mg/(g de matriz). Por lo tanto, puede ampliarse el intervalo de concentracion aplicable 100 veces. Esto es de importancia en particular para aplicaciones en las que la concentracion de analito es fija y no puede adaptarse mediante diluciones o concentracion. Tales dificultades aparecen precisamente en aplicaciones in vio, tales como la determinacion del nivel de glucosa en fluidos corporales. La concentracion del analito glucosa, en la situacion in vivo, no puede adaptarse a las condiciones de ensayo espedficas, sino que debe aceptarse como viene dada.
Un problema de solubilidad adicional aparece en particular en aplicaciones in vivo de sensores biologicos. Debido a la mayor longitud de onda, disminuye la fluorescencia propia del tejido, de modo que en aplicaciones in vivo pueden emplearse colorantes de fluorescencia de onda larga. Estos colorantes de fluorescencia son sin embargo normalmente apolares debido a su estructura y tamano moleculares (sistemas conjugados). Si la protema de union a glucosa se marca solamente con un colorante de este tipo, se disminuye la solubilidad adicionalmente, de modo que tampoco son posibles altos grados de marcaje. Tal como ya se describio anteriormente, puede ser necesario funcionalizar la protema de union a glucosa con, por ejemplo, polietilenglicol, para permitir una solubilidad aumentada y con ello mayores grados de marcaje relacionados. La funcionalizacion con polietilenglicol (pegilacion) lleva sin embargo en disolucion normalmente a una actividad de glucosa fuertemente reducida de por ejemplo concanavalina A nativa (actividad de glucosa relativa de 0,4 o menos). Sorprendentemente, en el contexto de la presente invencion se establecio que en el hidrogel del dispositivo sensor no aparece este empeoramiento. Mas bien, pueden conseguirse actividades de glucosa para concanavalina A funcionalizada con polietilenglicol, que pueden compararse con las de concanavalina A nativa (actividad de glucosa relativa = 2,2 o 2,6). Ademas, se
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descubrio que la actividad de glucosa puede aumentarse aun adicionalmente mediante el aumento del grado de marcaje en la concanavalina A en un hidrogel, tal como se emplea en el dispositivo sensor de acuerdo con la invencion. De este modo se consiguieron sorprendentemente en el hidrogel enriquecido, mediante aumento del grado de marcaje en la concanavalina A funcionalizada con polietilenglicol incluso doblar la actividad de glucosa. En comparacion con la medicion en disolucion, se aumenta la actividad de glucosa en el hidrogel usado de acuerdo con la invencion en el dispositivo sensor incluso 4,3 veces. Es decir, el uso del hidrogel en el dispositivo de acuerdo con la invencion permite ajustar relaciones de concentracion para la protema de union a glucosa y sus ligandos que permitan a grados de marcaje correspondientes, actividades de glucosa que esten 4 veces elevadas con respecto a concentraciones que pueden ajustarse en disoluciones acuosas. Esto permite de manera ventajosa tambien el uso del dispositivo de acuerdo con la invencion en condiciones en las que la concentracion de analito no puede adaptarse a las condiciones de ensayo.
En el contexto del uso de acuerdo con la invencion, puede emplearse el sensor preferentemente para la determinacion del contenido en glucosa.
En este caso puede examinarse una muestra. Por el termino "muestra" se entiende en el contexto de la presente invencion una composicion, preferentemente una composicion acuosa, que contiene glucosa presumible o realmente. Preferentemente en el caso de la muestra se trata de una muestra biologica. De manera muy especialmente preferente en el caso de la muestra se trata de un fluido corporal, en particular, lfquido intersticial (fluido intersticial), sangre, plasma, suero, linfa, saliva, lfquido lacrimal, sudor u orina. De manera especialmente preferente en el caso de la muestra se trata de lfquido intersticial, sangre, suero o plasma.
Siempre que la muestra sea un material biologico, por ejemplo un fluido corporal, puede obtenerse preferentemente de un sujeto de prueba que presenta un metabolismo de glucosa alterado o bien real o bien presumiblemente. Preferentemente, el metabolismo de glucosa alterado se provoca en este sentido por diabetes mellitus o el smdrome metabolico.
Es decir, el sensor puede emplearse en el contexto del uso de acuerdo con la invencion tambien para el diagnostico ex vivo de enfermedades o trastornos del metabolismo de la glucosa. En particular, el sensor puede emplearse para el diagnostico de un metabolismo de glucosa alterado y relacionado con ello, de enfermedades tales como diabetes mellitus o el smdrome metabolico o para la determinacion de la necesidad de una medida terapeutica en un paciente con metabolismo de glucosa alterado.
Las medidas terapeuticas mencionadas anteriormente abarcan aquellas que se emplean para el tratamiento de diabetes mellitus o el smdrome metabolico. A estas pertenece, ademas de la administracion de farmacos, por ejemplo insulina, tambien la realizacion de otras medidas terapeuticas, sobre las que puede decidirse debido al metabolismo de glucosa alterado determinado. Entre ellas figuran intervenciones terapeuticas, por ejemplo operaciones de derivacion gastrica, o cambios de los habitos, por ejemplo la realizacion de dietas especiales. El sensor puede acoplares con un dispositivo adicional, por ejemplo un dispositivo que controla al emision de un farmaco. En este sentido se prefiere un dispositivo para la emision de insulina. La emision de insulina puede controlarse entonces basandose en la necesidad determinada por el sensor.
El sensor del uso de acuerdo con la invencion puede introducirse para la aplicacion ex vivo por ejemplo en placas de microtftulo y alft anclarse. Las muestras que van a medirse se aplican entonces en las cavidades de las placas de microtftulo y pueden entonces medirse con un dispositivo lector. Un planteamiento de este tipo permite la medicion simultanea de un gran numero de muestras y es por lo tanto tambien economico, en particular en el modo de diagnostico clmico.
Se describe una aplicacion in vivo. Para ello puede introducirse el sensor en el cuerpo. En este sentido ha de tenerse en cuenta que la medicion del nivel de glucosa, que tambien es la base para el diagnostico, presupone que el sensor entra en contacto con un fluido corporal que contiene glucosa, siendo la concentracion de la glucosa en el fluido representativa del nivel de glucosa que va a determinarse. Los fluidos corporales adecuados se enumeran en otro punto en la descripcion. De manera especialmente preferente el fluido corporal es ftquido intersticial.
El sensor se introduce preferentemente en sitios en el cuerpo que permiten una medicion optica de la senal generada por el sensor. Son adecuados sitios con, o bien un pequeno grosor de tejido entre dispositivo y superficie corporal o bien con tejidos transparentes que pueden penetrarse adecuadamente por la senal generada. De manera especialmente preferente, el dispositivo se coloca bajo la piel (por via subcutanea) o en el ojo (por via subconjuntiva). Procedimientos correspondientes para el implante del dispositivo son conocidos en el estado de la tecnica.
Como alternativa, la senal generada por el dispositivo tambien puede transmitirse por medio de un medio de transmision adecuado desde el cuerpo. Para ello puede emplearse preferentemente un material conductor de senales como cable flexible, por ejemplo un cable de fibra de vidrio. La transmision de la senal puede tener lugar sin embargo tambien sin contacto por ejemplo como senal infrarroja, de radio o radioelectrica. Se entiende que en este caso, la senal generada por el dispositivo debe leerse en primer lugar por un detector, que debe estar instalado
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igualmente en el dispositivo o al menos en proximidad espacial y convertirse en una senal electromagnetica, por ejemplo una senal radioelectrica. Esta senal electromagnetica puede recibirse entonces por un receptor situado fuera del cuerpo y evaluarse.
Mediante el uso de acuerdo con la invencion del hidrogel en el sensor se permite un diagnostico ex vivo eficiente del nivel de glucosa y con ello el reconocimiento temprano de enfermedades que van acompanadas de un metabolismo de glucosa alterado, as^ como su tratamiento clmico y la eleccion de medidas terapeuticas.
La invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos de realizacion.
Ejemplos
Ejemplo 1: Produccion de sensores para la determinacion de glucosa Produccion de partculas de hidrogel (matriz enriquecedora)
Se disuelve 1 g de sal sodica de acido algmico en 100 g de agua con agitacion. En un recipiente de 5 l se disuelven 66,2 g de CaC12 x 2H2O en 4931,3 g de agua.
La disolucion de alginato se transporta a traves de una bomba en una boquilla de dos sustancias. Al mismo tiempo se aplica aire comprimido en la segunda entrada de la boquilla, de modo que la disolucion de alginato se atomiza en gotas finas. Las gotas se portan mediante el flujo de aire a un bano con la disolucion de cloruro de calcio, donde gelifican y bajan al fondo. Las esferas gelificadas se recogen a continuacion.
Produccion de sensores en matriz enriquecedora:
Se incuban esferas de alginato para su carga una tras otra en una disolucion de concanavalina A marcada con colorante y una disolucion de dextrano marcada con colorante. A continuacion se separan por centrifugacion las esferas cargadas y se separa por decantacion la disolucion sobrenadante. Las esferas cargadas se incuban, opcionalmente, a continuacion durante la noche en una disolucion de un segundo polfmero (por ejemplo a base de PVA, PEG) y se separan, opcionalmente, mediante centrifugacion. A continuacion se mezclan las esferas en una disolucion acuosa de un polfmero reticulable fotoqmmicamente. Esta mezcla se reticula a continuacion con luz UV para impedir la lixiviacion de los componentes de sensor a partir de las esferas de alginato.
Las cantidades dependen a este respecto de la concentracion del analito que va a medirse y el grado de marcaje se seleccionan en funcion de la intensidad deseada de la senal de fluorescencia. Como polfmero reticulable fotoqmmicamente puede usarse por ejemplo polfmero Nelfilcon, un poli(alcohol vimlico) modificado con grupos acrilamida. Para la reticulacion fotoqmmica se anade aun un 0,1% de Irgacure 2959. La disolucion acabada se dosifica en formas adecuadas y se endurece mediante luz UV.
Produccion de sensores en matriz no enriquecedora:
La disolucion de concanavalina A marcada con colorante y la disolucion de dextrano marcada con colorante se anaden una tras otra a una mezcla de prepolfmero a base de agua y se agitan durante 3 horas.
Las cantidades dependen a este respecto de la concentracion del analito que va a medirse y el grado de marcaje se selecciona en funcion de la intensidad deseada de la senal de fluorescencia. Como prepolfmero reticulable fotoqmmicamente puede usarse por ejemplo polfmero Nelfilcon, un poli(alcohol vimlico) modificado con grupos acrilamida. Para la reticulacion fotoqmmica se anade aun un 0,1% de Irgacure 2959. La disolucion acabada se dosifica en formas adecuadas y se endurece mediante luz UV.
Ejemplo 2: Determinacion de la actividad de glucosa para los sensores
Determinacion de la actividad de glucosa en sensores:
El espectro de fluorescencia de los sensores se determina a distintas concentraciones de glucosa. La variacion de las intensidades de fluorescencia del donador con contenido en glucosa creciente sirve como medida para la calidad del sensor de glucosas. Dado que en el caso de un sensor de glucosa in vivo deben medirse concentraciones de glucosa entre 50 y 500 mg/dl, se calcula la actividad de glucosa del siguiente modo:
AG = (Intensidad500mg/dl - Intensidad50mg/dl) / Intensidad50mg/dl
Todos los valores de respuesta se normalizan para su mejor comparacion con respecto a la respuesta del mismo sistema en disolucion. Para determinar la actividad de glucosa relativa se divide la actividad de glucosa de los sensores (en la matriz) entre la actividad de glucosa en disolucion
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AG rel. = AG (matriz) / AG (disolucion)
Determinacion de la actividad de glucosa en disolucion:
La disolucion de ConA y disolucion de dextrano se diluyen en disolucion tampon y se agita durante varias horas. El espectro de fluorescencia de la disolucion se determina a distintas concentraciones de glucosa. La variacion de las intensidades de fluorescencia del donador con contenido en glucosa creciente sirve como medida para la calidad del sistema. Dado que en el caso de un sensor de glucosa in vivo deben medirse concentraciones de glucosa entre 50 y 500 mg/dl, se calcula la actividad de glucosa del siguiente modo:
AG = (Intensidad500mg/dl - Intensidad50mg/dl) / Intensidad50mg/dl
Ejemplo 3: Determinacion de la influencia de la matriz
De acuerdo con la invencion se incorporan la protema de union a glucosa y el ligando en una matriz de hidrogel que presenta una cierta interaccion con la protema de union a glucosa. A este respecto, la matriz de hidrogel se selecciona de modo que, por un lado, la interaccion de protema de union a glucosa y matriz de hidrogel es mayor que aquella entre protema de union a glucosa y disolucion acuosa (enriquecimiento de los componentes de sensor). Por otro lado, la interaccion entre protema de union a glucosa y el analito (glucosa) no debe verse afectada o no esencialmente por la interaccion de protema de union a glucosa y matriz de hidrogel.
En el caso de la eleccion adecuada de la matriz de hidrogel se consigue, mediante la interaccion entre protema de union a glucosa y matriz de hidrogel, un enriquecimiento de la protema de union a glucosa en la matriz a traves del lfmite de solubilidad de la protema de union a glucosa en disolucion acuosa. En el caso de Con A pueden conseguirse por ejemplo concentraciones hasta 10 veces mayores que en disolucion libre. Aun mas extremos resultan los problemas de solubilidad tras la adicion del ligando (por ejemplo dextrano), dado que el complejo protema de union a glucosa-ligando, debido a su tamano y con frecuencia tambien debido a multivalencias, presenta una menor solubilidad. Mientras que el complejo ConA-dextrano en disolucion a una relacion en masa de 1:10 comienza a precipitar ya a partir de una concentracion de ConA de 0,5 mg/g, en una matriz de hidrogel adecuada con la misma relacion en masa pueden ajustarse concentraciones de ConA de mas de 50 mg/g. Mediante la matriz de hidrogel puede aumentarse el intervalo de concentracion de la protema de union a glucosa, por ejemplo ConA, unas 100 veces.
Dado que en una aplicacion in vivo, el intervalo de concentracion de analito permanece fijo y no puede adaptarse por ejemplo mediante dilucion o concentracion, las concentraciones de protema de union a glucosa y ligando deben adaptarse al intervalo de concentracion in vivo del analito. Con frecuencia, existe sin embargo la dificultad de que, por este motivo, senan necesarias concentraciones de protema de union a glucosa y / o concentraciones de ligando que superan el lfmite de solubilidad.
En el caso del sistema de ConA-dextrano, puede ajustarse por ejemplo en disolucion solo una concentracion de ConA de 0,5 mg/g a una relacion en masa (Dex : ConA) de 1:10, dado que, de lo contrario, el complejo ConA- dextrano comienza a precipitar. La actividad de glucosa (AG) alcanzada a esta concentracion se establece igual a 1 en este caso para la determinacion de la actividad de glucosa relativa (AG rel.). Como cabe esperar, en una matriz no enriquecedora, se reduce a la mitad la actividad de glucosa debido a la menor movilidad de los componentes de sensor (AG rel. = 0,52). En una matriz enriquecedora se obtiene, con la misma concentracion, casi la misma respuesta que en disolucion (AG rel. = 0,83). En la matriz enriquecedora pueden ajustarse sin embargo tambien concentraciones de ConA esencialmente mayores. En el caso de una concentracion de ConA de 10 mg/g se obtiene en la matriz de hidrogel enriquecedora, una actividad de glucosa aumentada 2,6 veces (vease la Tabla 1).
Tabla 1: Influencia de la matriz
- En disolucion En matriz no enriquecedora en matriz enriquecedora en matriz enriquecedora
- Concentracion de ConA
- 0,5 mg/g 0,5 mg/g 0,5 mg/g 10 mg/g
- AG rel.
- 1 0,52 0,83 2,55
- ConA nativa con DOL = 1, dextrano con 0,001 mol de colorante (C) por mol de subunidad de Dex (SU), relacion en masa Dex : ConA = 1:10
Ejemplo 4: Determinacion de la influencia de la concentracion del receptor
En la matriz enriquecedora se observa claramente una funcion de la actividad de glucosa de la concentracion de partida de la protema de union a glucosa y del ligando. En el caso de un aumento de la concentracion se obtiene tambien un aumento de la actividad de glucosa. En el caso de concentraciones de receptor muy elevadas disminuye de nuevo la actividad de glucosa. La concentracion de ConA optima para un ensayo in vivo se encuentra entre 8 y 20 mg de ConA / g de matriz (vease la Tabla 2).
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Tabla 2: Influencia de la concentracion de receptor
- Concentracion de ConA [mg/gl
- 0,5 10,0 13,3 30 52,2
- Actividad de glucosa relativa (AG rel.)
- 0,83 2,55 2,76 2,14 1,76
- ConA nativa con DOL = 1, dextrano con 0,001 mol de colorante (C) por mol de subunidad de Dex (SU), relacion
- en masa Dex : ConA = 1:10
Ejemplo 5: Determinacion de la influencia del grado de marcaje de receptor
Debido a la fluorescencia propia del tejido que disminuye con mayores longitudes de onda, deben emplearse en aplicaciones in vivo colorantes de fluorescencia de onda larga. Estos colorantes de fluorescencia son bastante no polares normalmente debido a los mayores sistemas conjugados. Si la protema de union a glucosa se marca con colorantes de este tipo, entonces disminuye su solubilidad, de modo que debido a la precipitacion, con frecuencia no son posibles altos grados de marcado. Para aumentar la solubilidad de la protema de union a glucosa, es ventajoso funcionalizarla por ejemplo con polietilenglicol. De este modo se aumenta la solubilidad de la protema de union a glucosa, mediante lo cual son posibles mayores grados de marcado durante la smtesis.
Las ConA pegiladas llevan sin embargo en disolucion solo a menos de la mitad de la actividad de glucosa de la ConA nativa (AG rel. = 0,4). Sorprendentemente, en la matriz de hidrogel no aparece este empeoramiento. Con PEG-ConA se obtiene una actividad de glucosa comparable con la de ConA nativa (AG rel. = 2,2 frente a 2,6) (vease la Tabla 3).
Tabla 3: Influencia del grado de marcaje (DOL)
- DOL ConA
- 1 1
- Tipo
- nativa pegilada
- Disolucion, c = 0,5 mg de ConA / g
- AG rel. 1 0,43
- Matriz, c = 10 mg de ConA / g
- AG rel. 2,55 2,22
Mediante la pegilacion se hace posible por primera vez dotar ConA de un alto grado de marcaje de un colorante de fluorescencia de onda larga, que es estable a largo plazo en disolucion y no precipita. Sorprendentemente, en la matriz enriquecedora en comparacion con en disolucion no se observa empeoramiento alguno de la actividad de glucosa mediante la pegilacion. Solamente mediante el efecto positivo de la matriz es por lo tanto posible emplear en un ensayo PEG-ConA con alto grado de marcado en altas concentraciones.
Sorprendentemente, la actividad de glucosa puede aumentarse adicionalmente mediante un aumento del grado de marcado en la ConA. En la matriz de hidrogel enriquecedora se consigue en el caso de ConA con DOL = 2,5 casi doblar la actividad de glucosa (AG rel. = 4,3 frente a 2,6). En comparacion directa con la medicion en disolucion, se aumenta la actividad de glucosa en la matriz mediante el efecto combinado de concentracion y DOL por lo tanto incluso 4,3 veces (vease la Tabla 4)
Tabla 4: Influencia del grado de marcaje (DOL)
- DOL ConA
- 1 1 2,5* 2,5
- Tipo
- nativa pegilada nativa* pegilada
- Disolucion, c = 0,5 mg de ConA / g
- AG rel. 1 0,43 1,03
- Matriz, c = 10 mg de ConA / g
- AG rel. 2,55 2,22 4,28
- *ATTO680-ConA nativa con un DOL de >1,5 no es estable en disolucion y precipita.
Ejemplo 6: Determinacion de la influencia de los colorantes de fluorescencia
La estructura de los colorantes de fluorescencia, que estan unidos a protema de union a glucosa o ligando, tiene asf mismo una influencia sobre la actividad de glucosa. Ha resultado especialmente adecuada una combinacion de un colorante de rodamina y un colorante de oxazina. Para el sistema de ConA-dextrano se prefiere especialmente un donador de rodamina (por ejemplo ATTO590- o ATTO610-dextrano, ROX-dextrano) y un aceptor de oxazina (por ejemplo ATTO655- o ATTO680-ConA, Evoblue30-ConA). En contraposicion al sistema de TMR-ConA / FITC- dextrano usado convencionalmente (combinacion de xanteno - rodamina) se obtiene de este modo en disolucion una actividad de glucosa de 2,1 veces y en una matriz enriquecedora incluso una actividad de glucosa de 2,6 veces. En el caso de un par de colorantes de rodamina-oxazina, puede aparecer una interaccion de heterodfmero entre los colorantes que intensifica la actividad de glucosa (veanse las Tablas 5 y 6).
Tabla 5: Influencia de los colorantes
- Colorante de ConA Colorante de dextrano
- ATTO680 ATTO590 TMR FITC
- DOL ConA
- 2,5* 2,3
- Tipo
- nativo* nativo
- Disolucion, c = 0,5 mg de ConA / g
- AG rel. 2,4 1,17
- Actividad relativa en comparacion con el sistema convencional FITC/TMR
- 2,05 1
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20
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- Matriz, c = 10 mg de ConA / g | AG rel.
- 4,92 1,9
- Actividad relativa en comparacion con el sistema convencional FITC/TMR
- 2,59 1
- Valores correspondientes debidos a los valores experimentales con PEG-ConA extrapolados: 0,01 mol de C/mol de SU, relacion en masa Dex : ConA = 1:10
- FITC-dextrano con
Tabla 6: Influencia de los colorantes
- ATTO590/ATT0680 ROX/Evoblue30
- Matriz, c = 10 mg de ConA / g
- AG rel. 2,55 2,1
- ConA nativa con DOL = 1, dextrano con 0,001 mol de colorante (C) por mol de subunidad de Dex (SU), relacion
- en masa Dex : ConA = 1:10
Ejemplo 7: Determinacion de la influencia de la naturaleza de la matriz de hidrogel
La actividad de glucosa depende tambien de la naturaleza de la matriz de hidrogel. La matriz de hidrogel puede componerse de un polfmero o de una mezcla de varios polfmeros. Se ha comprobado que es ventajosa una matriz de hidrogel de alginato o una mezcla de un hidrogel de alginato y poli(alcohol vimlico). El hidrogel de alginato permite, mediante su interaccion con la ConA y el dextrano el enriquecimiento de los componentes de sensor en altas concentraciones.
El prepolfmero del segundo hidrogel (por ejemplo PVA) puede penetrar en las esferas de alginato y despues de su reticulacion forman una red interpenetrante con el alginato. El ancho de malla de la red interpenetrante influye en la movilidad de las moleculas de la protema de union a glucosa y del ligando y por lo tanto tambien la actividad de glucosa. El ancho de malla puede influirse mediante el tipo, el peso molecular, el contenido en solidos del polfmero asf como el porcentaje de grupos reticulantes, que determina el numero de nodos.
Un menor contenido en grupos reticulantes lleva a una mayor actividad de glucosa. Mediante una reduccion a la mitad de los grupos reticulantes puede aumentare la actividad incluso en 1,5 veces. En comparacion con el sistema en disolucion puede conseguirse por lo tanto asf mismo una mejora de 4,2 veces de la actividad de glucosa, sin un aumento del grado de marcado en la ConA (vease la Tabla 7).
Tabla 7: Influencia del contenido en agente reticulante
- Contenido en agente reticulante (mmol/g)
- 0,486 0,33 0,26
- AG rel.
- 2,76 4,04 4,24
- ConA nativa (13 mg/g) con DOL = 1, dextrano con 0,001 mol de colorante (C) por mol de subunidad de Dex (SU),
- relacion en masa Dex : ConA = 1:10
El contenido en solidos de la red tiene asf mismo una influencia sobre la actividad de glucosa. Cuanto mayor sea el contenido en solidos menor sera la actividad de glucosa (vease la Tabla 8).
Tabla 8: Influencia del contenido en solidos
- Prepolfmero FG
- 25% 30% 35% 40%
- AG rel.
- 2,87 2,76 2,48 1,96
- ConA nativa (13 mg/g) con DOL = 1, dextrano con 0,001 mol de colorante (C) por mol de subunidad de Dex (SU),
- relacion en masa Dex : ConA =
- 1:10
Claims (13)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Uso de un hidrogel a base de poUmero que se compone de al menos un poUmero soluble en agua en un sensor para el enriquecimiento de una protema de union a glucosa disuelta, en el que el al menos un polfmero puede interaccionar con la protema de union a glucosa y en el que la protema de union a glucosa se encuentra en un complejo con un ligando, comprendiendo el hidrogel a base de polfmero una primera matriz de hidrogel de alginato y una segunda matriz de hidrogel, que forma una red interpenetrante dentro de la primera matriz de hidrogel.
- 2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el ligando de la protema de union a glucosa es un oligosacarido, un macromolecula glicosilada o una nanopartroula glicosilada.
- 3. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la protema de union a glucosa disuelta se encuentra en una concentracion aumentada al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces en comparacion con una disolucion acuosa.
- 4. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la protema de union a glucosa se selecciona del grupo que consiste en: lectinas, enzimas que se unen a glucosa como sustrato, anticuerpos que reconocen espedficamente glucosa y aptameros que reconocen espedficamente glucosa.
- 5. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la protema de union a glucosa es concanavalina A.
- 6. Uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la concentracion de concanavalina A es mayor que 0,5 mg/(g de polfmero).
- 7. Uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la concentracion de concanavalina A se encuentra entre 2 y 60 mg/(g de polfmero).
- 8. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la concanavalina A mediante modificacion qmmica presenta una solubilidad en agua elevada en comparacion con concanavalina A no modificada.
- 9. Uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que la modificacion se selecciona del grupo que consiste en: pegilacion, acetilacion, succinilacion y polioxazolinizacion.
- 10. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 9, en el que la protema de union a glucosa esta ligada con un colorante de oxazina y el ligando de la protema de union a glucosa esta ligado con un colorante de rodamina.
- 11. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el sensor se emplea para la determinacion in vitro del contenido en glucosa.
- 12. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el sensor se emplea para el diagnostico in vitro de un metabolismo de glucosa alterado.
- 13. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el sensor se emplea para la determinacion de la necesidad de una medida terapeutica en un paciente con metabolismo de glucosa alterado.
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