ES2583281T3

ES2583281T3 - Anticuerpos anti-MST1R y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2583281T3
Application number: ES10710107.3T
Authority: ES
Inventors: Reimi Kawaida; Toshiaki Ohtsuka; Toshinori Agatsuma; Philip Rodley; Sandra Miller; Ulrike Schubert
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2009-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2016-09-20
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: CO6420322A2; WO2010093055A1; AU2010214301A1; US9403909B2; RU2011137405A; EP2396084B1; KR20110117677A; KR101745025B1; BRPI1007979A2; CA2752136C; CN102438702B; RU2534890C2; SG173196A1; US20120034215A1; CA2752136A1; NZ594452A; AU2010214301B2; EP2396084A1; HK1164193A1; JP2012517223A

Abstract

Anticuerpo humano o humanizado, o fragmento funcional del mismo, que comprende una región de unión al antígeno que es específica de un péptido parcial de MST1R, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, en el que se aplica uno de los siguientes requisitos: 1) dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo inhibe la fosforilación dependiente y/o independiente del ligando de MST1R; 2) dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo tiene una afinidad contra dicho péptido parcial de MST1R como una KD inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 1 nM, inferior a 0,5 nM o inferior a 0,1 nM determinada mediante resonancia de plasmón superficial o mediante valoración de equilibrio en solución; 3) dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo suprime la proliferación de células favorecida por MSP o la migración de células tumorales que expresan MST1R; 4) dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo interioriza el MST1R; o 5) dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo reacciona de forma cruzada con los seres humanos y con al menos otra especie distinta; y en el que dicha región de unión al antígeno comprende: una región H-CDR3 que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 4, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o 4; una región H-CDR2 que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 5, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o 5; una región H-CDR1 que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o 6, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 o 6; una región L-CDR3 que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 o 12, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 o 12; una región L-CDR1 que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o 15, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 13 o 15; y una región L-CDR2 que tiene (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o 16, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 14 o 16.

Description

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TABLA 1: Afinidades de los anticuerpos

Anticuerpo (Fab): BIACORE (Fab) KD [nM] SET (Fab) KD [nM]

MOR07692: 0,80 0,25

MOR07919: 0,98 0,27

MOR07923: 0,07 0,02

MOR07924: 0,20 0,03

MOR07925: 0,02 0,01

MOR07926: 0,13 0,04

Con referencia a la Tabla 1, la afinidad de los anticuerpos MOR X se midió mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) en MST1R humano recombinante inmovilizado. Los estudios Biacore se realizaron en antígeno directamente inmovilizado. El formato Fab de los MOR X presenta un intervalo de afinidades monovalentes entre aproximadamente 0,02 y 0,98 nM de proteína MST1R inmovilizada, mostrando el Fab MOR07925 la afinidad más alta, seguido de los Fab MOR07923 y MOR07926. Además, el formato Fab de los MOR X presenta un intervalo de afinidades de entre aproximadamente 0,01 y 0,27 nM, mostrando el Fab MOR07925 la mayor afinidad, seguido de Fab MOR07923 y MOR07924 en estudios de SET.

Otra característica de los anticuerpos descritos en el presente documento es su especificidad por una superficie dentro de la región N-terminal de MST1R. Por ejemplo, MOR X desvelado en el presente documento se puede unir específicamente a la región N-terminal de MST1R.

El tipo de epítopo al que se une un anticuerpo como el descrito en el presente documento puede ser lineal (es decir un tramo consecutivo de aminoácidos) o conformacional (es decir, múltiples tramos de aminoácidos). Para determinar si el epítopo de un determinado anticuerpo es lineal o conformacional, el experto en la materia puede analizar la unión de los anticuerpos a péptidos solapantes (por ejemplo, péptidos 13-meros con un solapamiento de 11 aminoácidos) que cubren diferentes dominios de MST1R. Se realizó el análisis ELISA usando un péptido parcial MST1R recombinante, que tenía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Dado que MOR X no era aplicable al análisis de inmunotransferencia para detectar la forma desnaturalizada de la misma proteína MST1R recombinante, MOR X debía tener epítopos conformacionales dentro de los restos de aminoácidos de SEQ ID NO:

17.

Un anticuerpo desvelado en el presente documento reacciona de forma cruzada con los seres humanos y con al menos otra especie, que puede ser, por ejemplo, un mono o un ratón. Un anticuerpo que reacciona de forma cruzada con al menos el mono cinomolgo, por ejemplo, puede proporcionar una mayor flexibilidad y ventajas frente a los anticuerpos anti-MST1R diana conocidos, a los efectos de realizar estudios in vivo en múltiples especies con el mismo anticuerpo.

En una realización, el anticuerpo descrito no solo es capaz de unirse a MST1R, sino que también es capaz de inhibir la activación de la MST1R. La inhibición del receptor conduce a la supresión de la actividad quinasa intrínseca del receptor y regula por disminución la transducción de señales. Dicha regulación por disminución puede tener lugar, por ejemplo, limitando la unión del ligando a MST1R, cambiando la conformación de MST1R o interiorizando el MST1R. Más concretamente, el anticuerpo desvelado en el presente documento puede mediar su efecto terapéutico por MST1R a través de funciones efectoras de anticuerpos.

Otra realización más se refiere a la inhibición de la actividad de fosforilación de MST1R dependiente del ligando de MST1R por los anticuerpos descritos en el presente documento. El valor de CI50 de los anticuerpos desvelados de al menos 100 ng/ml, al menos 50 ng/ml, al menos 20 ng/ml, al menos 10 ng/ml o al menos 5 ng/ml en el sistema de ensayo de transducción de señales de MST1R tal como un "ensayo de la luciferasa Elk1".

Otro anticuerpo descrito en el presente documento también inhibe la activación de MST1R independiente del ligando.

Un anticuerpo adicional desvelado en el presente documento también inhibe la fosforilación de ERK en respuesta al ligando MSP de MST1R.

Otro anticuerpo más descrito en el presente documento también suprime la proliferación favorecida por MSP de las células tumorales que expresan MST1R.

(Variantes peptídicas)

Los anticuerpos de la presente invención se describen en las reivindicaciones 1-14 y 27. Los anticuerpos descritos a lo largo de la divulgación no se limitan a las secuencias peptídicas específicas proporcionadas en el presente documento, sino que también se incorporan variantes de estos polipéptidos. El experto en la materia será capaz de preparar, ensayar y utilizar variantes funcionales de los anticuerpos desvelados en el presente documento, al tiempo que reconocerá aquellas variantes que tendrán la capacidad de suprimir la activación dependiente y/o independiente del ligando de MST1R en el ámbito de la presente invención.

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Una variante puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo que tenga al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) alterada (hipervariable) y/o un dominio/una posición marco conservada (FR) (variable), en relación con una secuencia peptídica desvelada en el presente documento. Para ilustrar mejor este concepto, se presenta una breve descripción de la estructura del anticuerpo.

Un anticuerpo se compone de dos cadenas peptídicas, conteniendo cada una uno (cadena ligera) o tres (cadena pesada) dominios constantes y una región variable (VL, VH), la última de las cuales está compuesta, en cada caso, de cuatro regiones FR y tres CDR separadas. El sitio de unión al antígeno está formado por una o más CDR, aunque las regiones FR proporcionan el marco estructural para las CDR y, por tanto, desempeñan un papel importante en la unión al antígeno. Mediante la modificación de uno o más restos de aminoácidos en una región CDR o FR, el experto puede generar de forma rutinaria secuencias de anticuerpos mutadas o diversificadas, que se pueden explorar contra el antígeno, por ejemplo, para determinar nuevas y mejores propiedades.

La FIG. 1 (VH) y la FIG. 2: (VL) delimitan las regiones CDR y FR (de acuerdo con la definición de Kabat) para ciertos anticuerpos desvelados en el presente documento y comparan los aminoácidos en una posición dada entre sí y con respecto a las secuencias de "gen maestro" HuCAL correspondientes (según lo descrito en la patente de EE.UU. n.º 6.300.064).

El experto en la materia puede usar los datos en la FIG. 1 y la FIG. 2 para diseñar variantes de péptidos que estén dentro del ámbito de las realizaciones desveladas en el presente documento. En una realización, las variantes se construyen cambiando los aminoácidos de una o más regiones CDR; una variante también podría tener una o más regiones marco conservadas alteradas. Con referencia a una comparación de los nuevos anticuerpos entre sí, los restos candidatos que se pueden cambiar incluyen restos de la cadena ligera variable y restos de la cadena pesada variable de los MOR X. También se pueden realizar modificaciones en las regiones marco conservadas. Por ejemplo, se podría modificar un dominio FR peptídico en el que haya una desviación en un resto en comparación con una secuencia de línea germinal.

Con referencia a la comparación de los nuevos anticuerpos con la secuencia consenso correspondiente o del "gen maestro", se pueden cambiar restos candidatos incluyendo los restos de la cadena ligera variable del MOR X, tales como los restos de VLλ3, e incluyendo los restos de la cadena pesada variable de MOR X, tales como los restos de VH3. Como alternativa, el experto en la materia podría hacer el mismo análisis comparando las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con secuencias conocidas de la misma clase de dichos anticuerpos, usando, por ejemplo, el procedimiento descrito por Knappik y col. (J. Mol. Biol. 296, 57-86, 2000) y la patente de EE.UU. n.º 6.300.064 expedida a Knappik y col.

Además, se pueden obtener variantes usando un MOR X como punto de partida para la optimización mediante la diversificación de uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de MOR X, preferentemente restos de aminoácidos de una o más CDR, y mediante la exploración de la colección resultante de variantes de anticuerpos para determinar las variantes con mejores propiedades. La diversificación de uno o más restos de aminoácidos en la CDR-3 de VL, la CDR-3 de VH, la CDR-1 de VL y/o la CDR-2 de VH puede realizarse mediante la síntesis de una colección de moléculas de ADN usando la tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (TRIM) (Virnekäs, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, K. C., Wellnhofer, G., y Moroney S. E. (1994) "Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis". Nucl. Acids Res. 22, 5600).

(Variantes de aminoácidos conservadas)

Se pueden crear variantes polipeptídicas que conserven la estructura molecular global de una secuencia peptídica de los anticuerpos descritos en el presente documento. Dadas las propiedades de los aminoácidos individuales, algunas sustituciones racionales serán reconocidas por el experto en la materia. Las sustituciones de aminoácidos, es decir, las "sustituciones conservadoras", se pueden realizar, por ejemplo, basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilidad y/o naturaleza anfipática de los restos implicados.

Por ejemplo; (a) los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; (b) los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; (c) los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y (d) los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Por lo general, se pueden realizar sustituciones en los grupos (a)-(d). Además, la glicina y la prolina pueden sustituirse entre sí basándose en su capacidad de interrupción de las hélices α. De manera similar, determinados aminoácidos tales como alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutámico, glutamina, histidina y lisina se encuentran más comúnmente en las hélices α, mientras que valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptófano y treonina se encuentran más comúnmente en las láminas β plisadas. Glicina, serina, ácido aspártico, asparagina y prolina se encuentran comúnmente en los giros. Se pueden realizar algunas sustituciones preferidas entre los siguientes grupos: (i) S y T; (ii) P y G; e (iii) A, V, L e I. Dado el código genético conocido, y técnicas de ADN recombinante y sintético, el experto en la materia puede construir fácilmente ADN que codifiquen las variantes de aminoácidos conservadoras.

Como se usa en el presente documento, "identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos indica el

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porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. "Homología de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que bien es idéntico o que representa sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las secuencias de polipéptidos de la invención tienen una identidad de secuencia en las regiones CDR de al menos el 80 %, opcionalmente al menos el 90 % o al menos el 95 %. Los anticuerpos de las realizaciones también tienen una homología de secuencia en las regiones CDR de al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %.

(Moléculas de ADN)

La presente divulgación también se refiere a las moléculas de ADN que codifican un anticuerpo descrito en la reivindicación 17. Estas secuencias incluyen, pero sin limitación, las moléculas de ADN expuestas en las FIG. 3A, 3B y 4A a 4F.

Las moléculas de ADN descritas en el presente documento no se limitan a las secuencias desveladas en el presente documento, sino que también incluyen variantes de las mismas. Las variantes de ADN de las diversas realizaciones pueden describirse por referencia a sus propiedades físicas en la hibridación. El experto en la materia reconocerá que el ADN se puede usar para identificar su complemento y, ya que el ADN es bicatenario, su equivalente u homólogo, usando técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. También se reconocerá que la hibridación puede producirse con menos del 100 % de complementariedad. Sin embargo, dada la selección apropiada de las condiciones, se pueden usar técnicas de hibridación para diferenciar entre secuencias de ADN basándose en su relación estructural con una determinada sonda. Para orientarse con respecto a estas condiciones véase, Sambrook y col., 1989 (Sambrook, J., E. F. Fritsch y T. Maniatis (1989) “Molecular Cloning: A laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EE.UU.) y Ausubel y col, 1995 (Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Sedman, J. A. Smith y K. Struhl. eds. (1995). “Current Protocols in Molecular Biology”. Nueva York: John Wiley and Sons).

La semejanza estructural entre dos secuencias de polinucleótidos se puede expresar en función de la "rigurosidad" de las condiciones en las que las dos secuencias se hibridarán entre sí. Como se usa en el presente documento, el término "rigurosidad" se refiere a la medida en que las condiciones desfavorecen la hibridación. Las condiciones rigurosas desfavorecen enormemente la hibridación, y solo las moléculas más relacionadas estructuralmente se hibridarán entre sí en dichas condiciones. Por el contrario, las condiciones no rigurosas favorecen la hibridación de moléculas que muestran un menor grado de relación estructural. Por lo tanto, la rigurosidad de la hibridación es directamente proporcional a las relaciones estructurales de dos secuencias de ácido nucleico. Las siguientes relaciones son útiles en la correlación de la hibridación y la relación (donde Tm es la temperatura de fusión de un dúplex de ácido nucleico):

a.

Tm = 69,3 + 0,41(G + C)%

b.: La Tm de un dúplex de ADN disminuye en 1 ºC con cada aumento del 1 % en el número de pares de bases no coincidentes.

c.

(Tm)μ2-(Tm)μ1 = 18,5 Iog10μ2/μl

donde μ1 y μ2 son las fuerzas iónicas de dos soluciones.

La rigurosidad de la hibridación es una función de muchos factores, incluyendo la concentración total de ADN, la fuerza iónica, la temperatura, el tamaño de la sonda y la presencia de agentes que interrumpen el enlace de hidrógeno. Los factores que potencian la hibridación incluyen las altas concentraciones de ADN, fuerzas iónicas altas, bajas temperaturas, tamaño de sonda más largo y la ausencia de agentes que interrumpen el enlace de hidrógeno. La hibridación normalmente se realiza en dos fases: la fase de "unión" y la fase de "lavado".

En primer lugar, en la fase de unión, la sonda se une a la diana en condiciones que favorecen la hibridación. En esta etapa, la rigurosidad se controla normalmente modificando la temperatura. Para una alta rigurosidad, la temperatura normalmente es de entre 65 ºC y 70 ºC, a menos que se usen sondas de oligonucleótidos cortas (< 20 nt). Una solución de hibridación representativa comprende 6 x SSC, SDS al 0,5 %, solución de 5 x Denhardt y 100 μg de ADN portador no específico. Véase Ausubel y col., apartado 2.9, suplemento 27 (1994). Por supuesto, se conocen muchas condiciones de tamponamiento diferentes, pero funcionalmente equivalentes. Cuando el grado de relación es más bajo, se puede seleccionar una temperatura más baja. Las temperaturas de unión de baja rigurosidad están entre aproximadamente 25 ºC y 40 ºC. Una rigurosidad media es de entre al menos aproximadamente 40 ºC a menos de aproximadamente 65 ºC. Una alta rigurosidad es de al menos aproximadamente 65 ºC.

En segundo lugar, se retira el exceso de sonda mediante lavado. Es en esta fase cuando normalmente se aplican condiciones más rigurosas. Por lo tanto, es esta etapa de "lavado" la más importante en la determinación de la relación a través de la hibridación. Por lo general, las soluciones de lavado contienen menores concentraciones de sal. Una solución ilustrativa de rigurosidad media contiene 2 x SSC y SDS al 0,1 %. Una solución de lavado de alta

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(Citometría de flujo ("FACS"))

Se incubaron células (5 x 105 células/pocillo) con anticuerpos Fab o IgG a las concentraciones indicadas en 50 μl de tampón FACS (PBS, FCS al 5 %) durante 60 min a 4 ºC en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo redondo (Corning). Se lavaron las células dos veces y después se incubaron con anticuerpo de detección conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) durante 30 min a 4 ºC. Se volvieron a lavar las células de nuevo, se volvieron a suspender en 0,3 ml de tampón FACS y después se analizaron por citometría de flujo en un Cytomics FC500 (Beckman Coulter, Inc.). Los datos se analizaron mediante el software FlowJo (Tomy digital biology Co., Ltd.). Se usó anticuerpo IgG anti-hMSP R policlonal de cabra (R&D Systems) o anticuerpo M2 anti-FLAG (Sigma) como control positivo, y anticuerpo MOR03207 (antilisozima) como control negativo.

(Resonancia de plasmón superficial)

Se determinaron las constantes cinéticas kas y kdis con diluciones en serie de los respectivos Fab que se unen a la proteína de fusión MST1R-Fc inmovilizada de forma covalente (R&D Systems) usando el instrumento BIAcore 3000 (Biacore). Para la inmovilización covalente del antígeno, se usó la química de acoplamiento de aminas EDC-NHS convencional. Para el acoplamiento directo de la proteína de fusión MST1R-Fc, se recubrieron chips de sensor CM5 (Biacore) con ~600-700 UR en tampón de acetato 10 mM, pH 4,5. Para la celda de flujo de referencia, se usó una cantidad respectiva de HSA (albúmina de suero humano). Se realizaron las mediciones cinéticas en PBS (NaCl 136 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,76 mM, pH 7,4) a un caudal de 20 μl/min usando un intervalo de concentraciones de Fab de 15,6 a 500 nM. El tiempo de inyección para cada concentración fue de 1 min, seguido de la fase de disociación de 3 min. Para la regeneración, se usaron 5 μl de HCl 10 mM. Todos los sensogramas se ajustaron globalmente usando el software de evaluación BIA 3.2 (Biacore).

(Valoración de equilibrio en solución (SET))

La determinación de la afinidad en solución se realizó básicamente como se describe en la bibliografía (Friguet, B., Chaffotte, A. F., Djavadi-Ohaniance, L. y Goldberg, M. E. (1985) J Immunol Methods 77,305-319). Con el fin de mejorar la sensibilidad y la exactitud del procedimiento de SET, se modificó el procedimiento del ELISA clásico a la tecnología basada en ECL (Haenel, C., Satzger, M., Ducata, D. D., Ostendorp, R. y Brocks, B. (2005) Anal Biochem 339, 182-184).

Ejemplo 1

(Generación de anticuerpos a partir de bibliotecas HuCAL)

Para la generación de anticuerpos terapéuticos contra MST1R, se llevaron a cabo selecciones con la biblioteca de presentación de fagos HuCAL GOLD MorphoSys. HuCAL GOLD® es una biblioteca de Fab basada en el concepto de HuCAL® (Knappik y col. J. Mol. Biol., 296, 57-86, 2000); Krebs y col., J. Immunol. Methods, 254, 67-84, 2001; Rothe y col., J. Mol. Biol., 376(4):1182-200, 2008), en la que las seis CDR están diversificadas, y que emplea la tecnología CysDisplay™ para unir los fragmentos Fab a la superficie del fago (documento WO 01/05950).

(A. Rescate de fagémidos, amplificación de fagos y purificación)

Se amplificó la biblioteca de fagémidos HuCAL GOLD® en 2 x medio YT que contenía 34 μg/ml de cloranfenicol y glucosa al 1 % (2 x YT-CG). Tras la infección del fago auxiliar (VCSM13) a una DO600nm de 0,5 (30 min a 37 ºC sin agitación; 30 min a 37 ºC con agitación a 250 rpm), se centrifugaron las células (4.120 g; 5 min; 4 ºC), se volvieron a suspender en 2 x YT/34 μg/ml de cloranfenicol/50 μg/ml de kanamicina/IPTG 0,25 mM y se cultivaron durante la noche a 22 ºC. Se precipitaron los fagos en PEG a partir del sobrenadante, se volvieron a suspender en PBS/glicerol al 20 % y se almacenaron a -80 ºC. La amplificación del fago entre dos series de selección se realizó de la siguiente manera: se infectaron las células TG1 en fase semilogarítmica con fagos eluidos y se sembraron en LB-agar suplementado con glucosa al 1 % y 34 μg/ml de cloranfenicol (LB-CG). Tras la incubación durante la noche a 30 ºC, se rasparon las colonias, y se usaron para inocular 2 x YT-CG hasta que se alcanzó una DO600nm de 0,5, y se añadieron fagos auxiliares VCSM13 para la infección como se ha descrito anteriormente.

(B. Selecciones con HuCAL GOLD®)

Para las selecciones, se dividieron fagos de anticuerpos HuCAL GOLD® en seis grupos que comprendían diferentes combinaciones de genes maestros VH (grupo 1: VH1/3/5 Κ, grupo 2: VH1/3/5 λ, grupo 3: VH2/4/6 K, grupo 4: VH2/4/6 λ, grupo 5: VH1-6 K, grupo 6: VH1-6 λ). Se sometieron estos grupos individualmente a 3 series de selección de células completas en células HEK 293FreeStyle™ transfectadas en vector de expresión de MST1R, seguidas de la elución de pH y una etapa posterior a la adsorción en células HEK 293FreeStyle™ negativas en MST1R para el agotamiento de los fagos de anticuerpos irrelevantes. Finalmente, el resto de fagos de anticuerpos se usó para infectar células TG1 de E. coli que luego se sembraron en placas de agar y se incubaron durante la noche a 30 ºC. Al día siguiente, se rasparon las colonias bacterianas de las placas, se rescataron los fagos y se amplificaron como se ha descrito anteriormente. La segunda y la tercera serie de selección se realizaron como la inicial. Además de las selecciones convencionales, se aplicó la tecnología LCDR3-RapMAT® para identificar potencialmente clones con mayor afinidad. RapMAT® representa un procedimiento de maduración de la afinidad incorporado para la rápida

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selección de anticuerpos de alta afinidad. Esta tecnología se basa en el diseño modular de la biblioteca de Fab HuCAL GOLD®. Para el procedimiento RapMAT®, se realizaron dos series de selección convencional con grupos separados de las bibliotecas lambda y kappa. Los grupos de Fab seleccionados de la segunda serie se diversificaron mediante el intercambio de LCDR3 con casetes de la biblioteca de LCDR3. Las bibliotecas de Fab resultantes se sometieron a dos series adicionales de selección en condiciones rigurosas.

(C. Subclonación y expresión de fragmentos Fab solubles)

Las inserciones codificantes de Fab de los fagémidos HuCAL GOLD® seleccionados se subclonaron en el vector de expresión pMORPH®x9_Fab_FS (Rauchenberger y col., J. Biol. Chem. 278(40):38194-205, 2003) para facilitar la rápida expresión de los Fab solubles. Con este fin, se cortaron las inserciones codificantes de Fab (ompA-VLCL y phoA-Fd) de los clones seleccionados del plásmido de ADN con XbaI y EcoRI, y se clonaron en el vector cortado con XbaI/EcoRI pMORPH®x9_FS. Los Fab expresados en este vector portan dos marcadores C-terminales (FLAG™ y Strep-tag® II) para la detección y la purificación.

(D. Expresión de anticuerpos Fab HuCAL GOLD® en E. coli y purificación)

La expresión de fragmentos Fab codificados por pMORPH®x9_Fab_FS en células TG-1 de E. coli se llevó a cabo en cultivos en matraces de agitador usando 750 ml de 2 x medio YT suplementado con 34 μg/ml de cloranfenicol. Se agitaron los cultivos a 30 ºC hasta que se alcanzó una DO600nm de 0,5. Se indujo la expresión mediante la adición de IPTG 0,75 mM durante 20 horas a 30 ºC. Se recogieron las bacterias por centrifugación y se preparó la fracción periplásmica usando 30-35 ml de BBS. Se purificaron los Fab a través de Strep-tag® II usando columnas de sefarosa Step-Tactin. La pureza de las muestras se analizó junto con patrones de calibración mediante SDS-PAGE en estado reducido, desnaturalizado, y mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en estado nativo. Las concentraciones de proteína se determinaron por espectrofotometría UV (Krebs y col., J. Immunol. Methods 254, 67-84, 2001).

Ejemplo 2

(Clonación, expresión y purificación de IgG1 HuCAL®)

Para expresar la IgG1 de longitud completa, se subclonaron fragmentos de los dominios variables de las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) a partir del vector de expresión de Fab en vectores pMORPH®2_hIg. Para subclonar los fragmentos VH, se usaron las enzimas de restricción Mfel y Blpl. Para subclonar los fragmentos VL kappa o VL lambda, se usaron las enzimas de restricción EcoRV y BsiWI o HpaI, respectivamente. Tras la digestión, se aislaron los fragmentos VH y VL a partir de gel de agarosa preparativo y se ligaron en los respectivos vectores de expresión de IgG (el fragmento VH en pMORPH®2_h_IgG1 f; el fragmento Vkappa en pMORPH®2_h_Igκ; el fragmento Vlambda en pMORPH®2_h_Igλ2). Los plásmidos de expresión de IgG resultantes se caracterizaron mediante análisis de restricción y secuenciación. Se realizó la expresión transitoria de IgG humana de longitud completa en células HKB11, que se transfectaron con vectores de expresión de cadena pesada y ligera de IgG. Se purificaron las IgG a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad a través de la columna de Proteína A Sefarosa. El procesamiento de corriente más abajo incluyó un intercambio de tampón mediante la filtración en gel y filtración estéril de la IgG purificada. El control de calidad reveló una pureza > 90 % mediante SDS-PAGE reductora y > 90 % de IgG monomérica determinada por cromatografía de exclusión molecular analítica.

Ejemplo 3

(Detección mediante ELISA de clones de Fab HuCAL® e IgG1 HuCAL®)

Se recubrieron los pocillos de una placa de microvaloración de 384 pocillos MaxiSorp™ con 0,5 μg/ml de proteína de fusión MST1R-Fc recombinante diluida en PBS. Se incubó la placa durante la noche a 4 ºC. Al día siguiente, se lavaron los pocillos 3 veces con PBST (Tween 20 al 0,05 % en PBS) y después se bloquearon con MPBST (leche en polvo al 5 % en PBST) durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de placas de microtitulación. Se lavaron los pocillos 3 veces con PBST antes de añadir el anticuerpo primario, es decir, extractos de BEL prebloqueado de clones de Fab HuCAL® o anticuerpos HuCAL® purificados y anticuerpos de control. Se incubó la placa durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador de placas de microtitulación y después se lavó 3 veces con PBST. Para la detección de los anticuerpos HuCAL®, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG humana con fosfatasa alcalina (Dianova, diluido a 1:5000 en leche en polvo al 0,5 % en PBST) y se incubó la placa durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador de placas de microtitulación. Posteriormente, se lavó la placa 5 veces con TBST (Tween 20 al 0,05 % en TBS). Se añadió Attophos (AttoPhos Substrate Set, Roche) (diluido a 1:10 en TBS) y se midió la fluorescencia en un lector de placas de microtitulación TECAN (emisión: 535 nm, excitación: 430 nm).

Ejemplo 4

(Análisis de reactividad cruzada mediante FACS)

Análisis FACS de las células que expresan ortólogos de MST1R: se construyeron vectores de expresión de MST1R de ser humano (la secuencia de nucleótidos de ADNc se muestra como el nº de referencia del GenBank:

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10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

MOR07924, MOR07925 y MOR07926 se muestra en SEQ ID NO: 13. La secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera variable (L-CDR1) de MOR07919 se muestra en SEQ ID NO: 15.

La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de MOR07692 se muestra en la SEQ ID: NO: 50. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MOR07692 se muestra en SEQ ID NO: 51. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de MOR07692 se muestra en SEQ ID: NO: 54. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MOR07692 se muestra en SEQ ID NO: 55.

La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de MOR07923 se muestra en la SEQ ID: NO: 50. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MOR07923 se muestra en SEQ ID NO: 51. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de MOR07923 se muestra en SEQ ID: NO: 56. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MOR07923 se muestra en SEQ ID NO: 57.

La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de MOR07924 se muestra en la SEQ ID: NO: 50. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MOR07924 se muestra en SEQ ID NO: 51. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de MOR07924 se muestra en la SEQ ID: NO: 58. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MOR07924 se muestra en SEQ ID NO: 59.

La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de MOR07925 se muestra en la SEQ ID: NO: 50. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MOR07925 se muestra en SEQ ID NO: 51. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de MOR07925 se muestra en SEQ ID: NO: 60. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MOR07925 se muestra en SEQ ID NO: 61.

La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de MOR07926 se muestra en SEQ ID: NO: 50. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MOR07926 se muestra en SEQ ID NO: 51. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de MOR07926 se muestra en SEQ ID: NO: 62. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MOR07926 se muestra en SEQ ID NO: 63

La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de MOR07919 se muestra en la SEQ ID: NO: 48. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MOR07919 se muestra en SEQ ID NO: 49. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de MOR07919 se muestra en SEQ ID: NO: 52. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MOR07919 se muestra en SEQ ID NO: 53.

Ejemplo 5

(Análisis de la actividad de unión mediante ELISA)

Se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos MaxiSorp™ con 1 μg/ml de proteína de fusión MST1R-Fc recombinante (que contenía la secuencia de aminoácidos de 25 a 571 de MST1R humano, R&D) diluida en PBS. Se incubó la placa durante la noche a 4 ºC. Al día siguiente, se lavaron los pocillos una vez con tampón de PBS-FCS (FCS al 5 % en PBS) y después se bloquearon con tampón de PBS-FCS durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras eliminar el tampón de PBS-FCS, se añadieron 4 μg/ml de anticuerpo primario a los pocillos recubiertos con MST1R-Fc y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar una vez con tampón de PBS-FCS, se añadió el anticuerpo secundario y se dejó incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces con tampón de PBS-FCS, se añadió sustrato de HRP (0,4 mg/ml de diclorhidrato de o-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno al 0,006 % en tampón de sustrato (citrato de tri-sodio deshidratado 50 mM, hidrógeno-fosfato de disodio 100 mM, pH 4,5)). Tras colorearse de amarillo, se añadió más HCl 1 M para detener la reacción. Se midió la absorbancia a 490 nm en un lector de placas de microtitulación EnVision. En la FIG. 11, todos los anticuerpos obtenidos (MOR07692, MOR07919, MOR07923, MOR07924, MOR07925 y MOR07926) mostraron unión a la parte 25-571 de MST1R humano. Cada anticuerpo era aplicable a la inmunoprecipitación de MST1R no reducido y no desnaturalizado, pero no a la transferencia Western para detectar el MST1R reducido y desnaturalizado (datos no mostrados). Ello indica que estos anticuerpos reconocen la conformación nativa de los restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

Ejemplo 6

(Ensayos biológicos)

(A. Ensayo del gen indicador de la luciferasa Elk1)

Se ensayó la funcionalidad de los anticuerpos mediante el ensayo del gen indicador de la luciferasa Elk1. El principio del ensayo se basa en la cotransfección de células 293α con varios vectores. MST1R está integrado en la membrana celular y se activa (se fosforila) para transducir la señal a la ERK (quinasa regulada por señales extracelulares) cuando se sobreexpresa o se estimula con MSP. Para ensayar la funcionalidad de los anticuerpos, se estableció el ensayo del gen indicador de la luciferasa Elk1 de la siguiente manera: en primer lugar, se construyó el vector pFR-Luc2CP. Para construir pFR-Luc2CP, se digirió el vector pFR-Luc (Stratagene) con HindIII, se trató con ADN polimerasa de T4 para la formación de extremos romos, y se digirió con BamHI para obtener un fragmento de aproximadamente 140 pb que contenía 5 x elemento de unión a GAL4 y la caja TATA. Se digirió

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Claims

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