ES2582504T3 - Lotes de adenovirus recombinantes con extremos alterados - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende partículas de adenovirus recombinante, donde el adenovirus recombinante comprende un transgén y es un adenovirus humano recombinante de serotipo 5, 11a, 26, 34, 35, 49 ó 50 o un adenovirus de simio recombinante, caracterizada por que los genomas de al menos 99% de las partículas de adenovirus en dicha composición comprenden la secuencia de nucleótidos CTATCTAT como nucleótidos en el extremo 5'.

Description

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DESCRIPCION

Lotes de adenovirus recombinantes con extremos alterados

La invencion se relaciona con el campo de la medicina y con el campo de la administracion de genes para aplicaciones en la vacunacion y en la terapia genica. Mas particularmente, la invencion se relaciona con lotes de vectores que estan basados en adenovirus recombinantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los adenovirus humanos y animales recombinantes se usan extensamente en aplicaciones relacionadas con la terapia genica y con la vacunacion. El vector basado en adenovirus se emplea como vehmulo para el gen de interes que se desea introducir en las celulas huesped, para expresar un gen o parte de este que codifica un por ejemplo, antigeno deseado para provocar una respuesta inmune.

Se han identificado adenovirus humanos de mas de 50 serotipos diferentes. De ellos, los adenovirus del serotipo 5 (Ad5) han sido los mas estudiados historicamente como vehmulos para los genes. Recientemente, se han estudiado adenovirus de otros serotipos, tales como los serotipos humanos Ad11, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 o Ad50 o diversos serotipos de simio, para usarlos como vectores, debido a que en las poblaciones humanas hay niveles preexistentes bajos de anticuerpos neutralizadores contra ellos (vease, por ejemplo, WO 00/70071). Algunos ejemplos prometedores de estos adenovirus incluyen los adenovirus recombinantes Ad35 (rAd35) y rAd26, que han sido estudiados en diversos analisis clmicos.

La biologfa molecular de los adenovirus, que comprenden un genoma basado en ADN de cadena doble que tiene un tamano aproximado de 34-38 kb, ha sido estudiada en detalle. Todos los adenovirus se caracterizan por diversas repeticiones terminales invertidas (ITR), que tienen un tamano aproximado de 100 bp (Dan et al., 2001, Virus Genes, 22: 175-179; Liu et al., 2003, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 272: 131-164) y que se encuentran conservadas entre los serotipos de los diversos grupos (Shinagawa et al., 1987, Gene, 55: 85-93). El extremo 5' del genoma se une a traves de enlaces covalentes a una protema terminal (TP). Las ITR comprenden el origen de replicacion (Bernstein et al., 1986, Mol. Cell Biol., 6: 2115-2124; Challberg y Rawlins, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 100-104; Guggenheimer et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3069-3073; Harris y Hay, 1988, J. Mol. Biol., 201: 57-67; Hay, 1985, EMBO J., 4: 421-426, van Bergen et al., 1983, Nucleic Acids Res., 11: 1975-1989; Wang y Pearson, 1985, Nucleic Acids Res., 13: 5173-5187) y son cruciales para la replicacion del ADN, ya que tambien comprenden sitios para que puedan unirse las protemas celulares que promueven la replicacion y que facilitan la formacion de los husos. Las secuencias de las ITR comprenden una “region principal” corta canonica, que se encuentra altamente conservada, que se extiende entre los nucleotidos 9 y 18 (Liu et al., supra). Sin embargo, los 8 nucleotidos terminales que preceden la region principal vanan entre los diversos tipos y aislados de adenovirus (Alestrom et al., 1982, Gene, 18: 193-197; Dan et al., supra, Jacobs et al., 2004, J. Gen. Virol., 85: 3361-3366; Purkayastha et al., 2005, J. Clin. Microbiol., 43: 3083-3094; Rademaker et al., 2006, J. Gen. Virol., 87: 553-562; Shinagawa et al., 1987, supra; Shinagawa et al., 1983, Virology, 125: 491-495; Shinagawa y Padmanabhan, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3831-3835; Tokunaga et al., 1982, Gene, 18: 329-334; Houng et al., 2006, J. Clin. Virol., 35: 381-387). Si bien los 8 nucleotidos terminales de la mayona de los adenovirus son CATCATCA, se han descripto diversas secuencias alternativas.

La demanda de adenovirus recombinantes se ha incrementado notablemente a causa de las diversas enfermedades que podnan ser tratadas o prevenidas mediante el uso de vehmulos apropiados para transferir genes, en combinacion con la gran cantidad de personas que se ven afectadas por estas enfermedades y el crecimiento constante de la poblacion mundial.

En el contexto de los lotes clmicos que han de ser administrados en los seres humanos, la produccion a gran escala de los adenovirus recombinantes (rAd) debe ser segura y eficaz y debe ser acorde con los lineamientos de las buenas practicas de manufactura (GMP). En este contexto, un aspecto importante es asegurar la homogeneidad de los lotes de rAd que se produzcan.

En la presente se indica que, sorprendentemente, se descubrieron cambios en la secuencia de las ocho bases que se hallan mas cercanas al extremo 5' de determinados rAd, lo que podna dar como resultado lotes con secuencias heterogeneas.

De esta manera, existe la necesidad de proveer lotes de rAd a gran escala que presenten una homogeneidad superior. En la presente invencion se proveen lotes de este tipo y metodos para elaborarlos. Ademas, los rAd en los lotes de acuerdo con la presente invencion se caracterizan por una replicacion superior en los procesos de elaboracion.

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RESUMEN DE LA INVENCION

En la invencion se provee una composicion que comprende una pluralidad de partfculas de adenovirus recombinantes, donde los adenovirus recombinantes son adenovirus humanos recombinantes de los serotipos 5, 11a, 26, 34, 35, 48, 49 o 50 o adenovirus de simio recombinantes, donde los genomas de esencialmente todas las partfculas de los adenovirus en dicha composicion comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'.

En la invencion tambien se provee un metodo para preparar un lote de (preferiblemente al menos 1 x 107) partfculas de adenovirus recombinantes, donde los genomas de esencialmente todas las partfculas comprenden secuencias de nucleotidos identicas en el extremo 5', que comprende a) poner en practica un paso de clonacion molecular para cambiar los extremos 5' de origen natural de los genomas de los adenovirus por extremos 5' alterados, que como nucleotidos terminales comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT; b) propagar los adenovirus recombinantes que comprenden los extremos 5' alterados en celulas huesped; y c) cosechar los adenovirus recombinantes para obtener un lote de partfculas de adenovirus recombinantes, donde los genomas de esencialmente todas las partfculas comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'.

En la invencion tambien se provee un metodo para preparar un lote de partfculas de adenovirus recombinantes, donde los genomas de esencialmente todas las partfculas comprenden secuencias de nucleotidos identicas en los extremos 5', que comprende a) poner en practica un procedimiento para purificar los adenovirus en placas, donde los adenovirus recombinantes son adenovirus humanos recombinantes de los serotipos 5, 11a, 26, 34, 35, 48, 49 o 50 o adenovirus de simio recombinantes, de manera tal de aislar los adenovirus o adenovirus recombinantes, a partir de una unica placa, donde dichos adenovirus o dichos adenovirus recombinantes comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5' de sus genomas; b) propagar los adenovirus recombinantes que se obtuvieron a partir de una unica placa en el paso a) en celulas huesped; y c) cosechar los adenovirus recombinantes para obtener un lote de partfculas de adenovirus recombinantes, donde los genomas de esencialmente todas las partfculas comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'.

En determinados aspectos, los adenovirus recombinantes en las composiciones o los metodos son adenovirus humanos recombinantes, y preferiblemente no son adenovirus humanos de los serotipos 3, 4, 7, 8, 9, 11p, 15, 21, 29, 37 o 53. En determinadas formas de realizacion, los adenovirus recombinantes en las composiciones o los metodos de acuerdo con la invencion son adenovirus humanos recombinantes de los serotipos 5, 26, 35, 49 o 50 como se definen en la reivindicaciones. Preferiblemente, los adenovirus recombinantes son adenovirus humanos recombinantes de los serotipos 26 o 35.

Los adenovirus recombinantes carecen de al menos una porcion de la region E1.

En determinadas formas de realizacion, los adenovirus recombinantes comprenden un transgen.

En determinadas formas de realizacion, la composicion o el lote de adenovirus recombinantes comprenden al menos 1 x 107, preferiblemente al menos 1 x 108, preferiblemente al menos 1 x 109, y preferiblemente al menos 1 x 1010 partfculas de adenovirus recombinantes.

En determinadas formas de realizacion, el paso b) de los metodos de acuerdo con la invencion se lleva a cabo en un biorreactor, que preferiblemente tiene un volumen de entre aproximadamente 2 litros y 20000 litros.

En determinadas formas de realizacion, los metodos de acuerdo con la invencion tambien comprenden purificar los adenovirus recombinantes.

En determinadas formas de realizacion de las composiciones o los metodos de acuerdo con la invencion, los adenovirus recombinantes se formulan en una composicion farmaceutica.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS

Figura 1. Emergencia de secuencias de ITR alternativas. Los detalles pueden hallarse en el ejemplo 3.

Figura 2. Cinetica de la replicacion de vectores Ad35 y Ad5 con secuencias de ITR alternativas u originales. Los detalles pueden hallarse en el ejemplo 5.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

En la presente se describe que, despues de varios pasajes, sorprendentemente se descubrio una secuencia espedfica en el extremo 5' (CTATCTAT) de diversos adenovirus recombinantes que inicialmente conteman otras secuencias terminales, y que la presencia de esta secuencia puede dar como resultado un incremento en la cantidad de adenovirus producidos.

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Los inventores aprovecharon esta observacion y concibieron y/o implementaron un paso de seleccion activa, cuyo proposito fue obtener adenovirus recombinantes con genomas que comprendieran la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5', a partir de adenovirus de serotipos de los que se habfa informado que comprendfan una secuencia terminal diferente en sus genomas salvajes.

Por lo tanto, la presente invencion se relaciona con una secuencia particular (CTATCTAT), que puede estar presente en un extremo del genoma de un adenovirus recombinante, y con su uso en la produccion de adenovirus recombinantes. Esta secuencia terminal puede emplearse en adenovirus de cualquier serotipo que no comprendan esta secuencia en el extremo 5' de su genoma salvaje.

En principio, las composiciones (los lotes) de adenovirus de acuerdo con la invencion pueden contener la secuencia CTATCTAT en 100% de los extremos 5' de su genoma (debido a que los adenovirus iniciales han sido creados y/o seleccionados de manera activa de acuerdo con la invencion). A causa de las mutaciones naturales que pueden aparecer ocasionalmente y al azar en cualquier sistema biologico, la cantidad real puede ser ligeramente inferior a 100%, aunque en formas de realizacion preferidas, la cantidad de secuencias terminales diferentes de CTATCTAT en los lotes de adenovirus de acuerdo con la invencion es inferior al lfmite de deteccion. Por consiguiente, de acuerdo con la invencion, los genomas de esencialmente todos los adenovirus en las composiciones o los lotes de partmulas de adenovirus recombinantes comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'. El termino “esencialmente todos”, tal como se emplea en la presente, hace referencia a una proporcion de al menos 90%, preferiblemente de al menos 98%, mas preferiblemente de al menos 99%, aun mas preferiblemente de al menos 99.9%, e incluso de hasta 100% (de las partmulas de adenovirus en la composicion). A modo de ejemplo, esto puede determinarse con metodos como la pCr, con la cual puede detectarse facilmente 1 partmula en 1000 y en las composiciones de partmulas de adenovirus recombinantes de acuerdo con la invencion, no se detectaron adenovirus con las secuencias terminales originales.

El termino “lote” de adenovirus, de acuerdo con la invencion, hace referencia a una composicion que ha sido producida en un procedimiento en un solo recipiente, o alternativamente puede hacer referencia a una pluralidad de partmulas de adenovirus en una composicion que esta presente en un solo recipiente (por ejemplo, un biorreactor, una bolsa, un frasco, una botella, un vial para multiples dosis, un vial para una sola dosis, una jeringa, etc.). Un lote de adenovirus de acuerdo con la invencion o una composicion que comprende adenovirus de acuerdo con la invencion preferiblemente comprenden al menos 107 partmulas de adenovirus recombinantes, y en determinadas formas de realizacion, comprenden al menos 108, 109, 1010 partmulas de adenovirus. Ademas de los adenovirus recombinantes, un lote o una composicion pueden comprender o no otros componentes relevantes.

El termino “recombinantes”, tal como se emplea en la presente con relacion a los adenovirus, hace referencia al resultado de una modificacion por parte del hombre, por ejemplo, a una alteracion en los extremos basada en una clonacion y/o a la introduccion de un gen heterologo, por lo que dichos adenovirus no son adenovirus salvajes.

En la presente, las secuencias se describen en el sentido 5' a 3', lo cual es habitual en la tecnica.

El termino “protema de la capside de un adenovirus” hace referencia a una protema que se encuentra en la capside de un adenovirus y que participa en la determinacion del serotipo y/o el tropismo de un adenovirus particular. Las protemas de la capside de los adenovirus tfpicamente abarcan las protemas que estan relacionadas con las fibras, con las pentonas y/o con las hexonas. Un adenovirus de un serotipo determinado de acuerdo con la invencion (o un adenovirus que “esta basado” en dicho serotipo) tfpicamente comprende protemas relacionadas con las fibras, las pentonas y/o las hexonas del serotipo en cuestion, y preferiblemente comprende protemas relacionadas con las fibras, las pentonas y las hexonas de dicho serotipo. Estas protemas tfpicamente estan codificadas por el genoma de los adenovirus recombinantes. Los adenovirus recombinantes de un serotipo determinado opcionalmente pueden comprender y/o codificar otras protemas de adenovirus de otros serotipos.

Segun se utiliza en la presente, un adenovirus recombinante “esta basado” en un adenovirus por derivacion del tipo salvaje, al menos en la secuencia. Este resultado puede obtenerse sobre la base de una clonacion molecular, mediante el uso del genoma salvaje o de partes de este como material de partida. Tambien es posible usar secuencias conocidas de genomas de adenovirus salvajes para generar nuevos genomas (o partes de estos) a traves de un procedimiento de smtesis del ADN, que puede ser puesto en practica de acuerdo con metodos de rutina, por comparuas relacionadas con el area de la smtesis del DNA y/o con la clonacion molecular (por ejemplo, GeneArt, GenScripts, Invitrogen o Eurofins). De esta manera, y a modo de ejemplo no limitativo, un adenovirus recombinante que no esta basado en el adenovirus humano Ad4 es un adenovirus recombinante que no comprende pentonas, hexonas o fibras del adenovirus humano Ad4, mientras que se considera que un adenovirus recombinante que comprende hexonas, pentonas y fibras del adenovirus humano Ad35 es un adenovirus recombinante que esta basado en Ad35, etc.

Merced a las investigaciones extensas que se han llevado a cabo sobre los serotipos de los adenovirus y sobre la organizacion de su genoma, aquellos versados en la tecnica han de conocer los lfmites de las ITR en el genoma de los adenovirus. La secuencia CTATCTAT esta localizada en las posiciones mas cercanas a los extremos del genoma de los adenovirus recombinantes de acuerdo con la presente invencion. A modo de ejemplo, la cadena

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superior de la ITR izquierda de la variante salvaje del adenovirus Ad5 comienza con 5’-CATCATCA...-3’ y en el contexto de la presente invencion, esta secuencia se modifica para obtener la secuencia preferida 5-CTATCTAT...- 3'. Aquellos versados en la tecnica han de saber que la ITR derecha, que se extiende en el sentido 5’ a 3’, esta localizada en la cadena inferior.

La modificacion de una secuencia original (progenitora) para obtener una secuencia alterada de la invencion puede efectuarse con diversos metodos, que han de resultar conocidos y habituales para aquellos versados en la tecnica. Los ejemplos incluyen la generacion directa de las secuencias, sobre la base de una PCR, o la subclonacion a partir de los genomas originales de aquellos adenovirus en cuyos extremos se ha determinado que se encuentra la secuencia deseada.

Cuando se modifica la secuencia de un extremo, por ejemplo, mediante el uso de procedimientos de biologfa molecular, que pueden ser procedimientos de recombinacion basados en plasmidos/cosmidos homologos (vease, por ejemplo, WO 99/55132), mientras que no se modifica el otro extremo, durante la produccion y la replicacion, se copiara la ITR izquierda o derecha del adenovirus resultante, con lo que se obtendra una poblacion mixta de adenovirus que solamente comprenderan extremos modificados y adenovirus que solamente comprenderan extremos no modificados (que, si el cultivo y la propagacion se llevan a cabo in vitro, segun se indica en la presente, evolucionara hasta generar una poblacion que comprendera cada vez mas extremos alterados, que comprenderan la secuencia CTATCTAT, debido a la ventaja en el crecimiento que confiere dicha secuencia terminal). Resulta preferible que un adenovirus recombinante de acuerdo con la presente invencion comprenda un genoma que presente la secuencia CTATCTAT tanto en el extremo izquierdo como en el extremo derecho.

En este contexto, los adenovirus recombinantes de acuerdo con la invencion comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5’.

Los vectores de la presente invencion son adenovirus recombinantes, tambien denominados vectores basados en adenovirus recombinantes. La preparacion de los vectores basados en adenovirus recombinantes es bien conocida en la tecnica.

En determinadas formas de realizacion, un vector basado en un adenovirus de acuerdo con la invencion presenta una deficiencia en la funcion de al menos un gen esencial de la region E1 del genoma del adenovirus, por ejemplo, de la region E1a y/o de la region E1b, que es imprescindible para la replicacion del virus. En determinados aspectos, un vector basado en un adenovirus presenta una deficiencia en al menos una parte de la region no esencial E3. En determinados aspectos, el vector presenta una deficiencia en la funcion de al menos un gen esencial de la region E1 y en al menos una parte de la region no esencial E3. El vector basado en un adenovirus puede presentar “deficiencias multiples”, es decir, puede presentar una deficiencia en la funcion de uno o mas genes esenciales, que pueden estar presentes en dos o mas regiones de su genoma. A modo de ejemplo, los vectores basados en adenovirus, mencionados anteriormente, que presentan deficiencias en la region E1 o en las regiones E1 y E3 tambien pueden presentar deficiencias en al menos un gen esencial de la region E4 y/o la region E2 (por ejemplo, la region e2a y/o la region E2B).

Los vectores basados en adenovirus, los metodos para construirlos y los metodos para propagarlos son bien conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los EE. UU. N° 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 y 6113913 y en Thomas Shenk, “Adenoviridae and their Replication”, M. S. Horwitz, “Adenovirus”, capftulos 67 y 68, respectivamente, de Virology, B. N. Fields et al., editores, 3.a edicion, Raven Press, Ltd., Nueva York (1996), asf como en otras referencias que se citan en la presente. Tfpicamente, la construccion de los vectores basados en adenovirus esta basada en el uso de protocolos convencionales de biologfa molecular, tales como los que se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2.a edicion, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); Watson et al., Recombinant DNA, 2.a edicion, Scientific American Books (1992); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), asf como en otras referencias que se citan en la presente.

Un adenovirus de acuerdo con la invencion puede pertenecer a la familia Adenoviridae, y preferiblemente pertenece al genero Mastadenovirus. Puede tratarse de un adenovirus que ataca a los seres humanos, pero tambien puede ser un adenovirus capaz de infectar otras especies, lo que abarca, sin limitaciones, los adenovirus que atacan a los bovinos (por ejemplo, el adenovirus bovino 3, BAdV3), los adenovirus que atacan a los caninos (por ejemplo, CAdV2), los adenovirus que atacan a los porcinos (por ejemplo, PAdV3 o PAdV5) y los adenovirus que atacan a los primates simiiformes (lo que incluye los adenovirus que atacan a los monos o a los hominoideos, tales como el adenovirus del chimpance). Preferiblemente, el adenovirus es un adenovirus humano (HAdV o AdHu; en la presente, los adenovirus humanos se representan con la sigla Ad, sin que se detalle la especie: por ejemplo, la abreviatura “Ad5” se emplea como sinonimo de HAdV5, que hace referencia a los adenovirus humanos del serotipo 5) o un adenovirus de simio, tal como el adenovirus del chimpance (ChAd, AdCh o SAdV).

Preferiblemente, los adenovirus recombinantes de acuerdo con la invencion son adenovirus de los que se ha informado que en estado salvaje comprenden una secuencia diferente (de la secuencia CTATCTAT, que por ejemplo, puede ser la secuencia CATCATCA, que puede hallarse con una frecuencia elevada) en el extremo 5’. En

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la tabla I se detallan los 8 nucleotidos en el extremo 5' que han sido informados o inferidos para adenovirus de diversos serotipos. En US 2009/227000 se describe un adenovirus Ad11p que comprende la secuencia CTATCTAT en su extremo 5'. Los estudios mas avanzados se llevaron a cabo con adenovirus humanos, los cuales resultan preferibles con relacion a determinados aspectos de la invencion. En determinados aspectos, los adenovirus recombinantes estan basados en adenovirus humanos, pero no estan basados en adenovirus humanos de los serotipos 3, 4, 7, 8, 9, 11p, 15, 21,29, 37 o 53. Los adenovirus recombinantes pueden estar basados en adenovirus humanos de los serotipos 1, 2, 5, 6, 10, 11a, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 22, 26, 28, 31, 34, 35, 36, 40, 41, 46, 48, 49, 50, 53, 54, 55, 56 o 57. Mas preferiblemente, los adenovirus recombinantes estan basados en adenovirus humanos de los serotipos 5, 11a, 26, 34, 35, 48, 49 o 50. De acuerdo con un ejemplo particularmente preferido, los adenovirus son adenovirus humanos de uno de los serotipos 26, 35, 48, 49 o 50. Una ventaja de estos serotipos es que presentan una prevalencia baja en el suero y/o que para ellos hay una titulacion preexistente de anticuerpos neutralizadores baja en las poblaciones humanas. Los serotipos mas preferidos para los adenovirus recombinantes son el serotipo humano 35 y el serotipo humano 26, los cuales han sido evaluados en analisis clmicos. La preparacion de los vectores rAd26 se describe, por ejemplo, en WO 2007/104792 y en Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Pueden hallarse ejemplos de secuencias de los genomas de los vectores Ad26 en el acceso GenBank EF 153474 y en SEQ ID N° 1 de WO 2007/104792. La preparacion de los vectores rAd35 se describe, por ejemplo, en la Patente de los EE. UU. N° 7270811, en WO 00/70071 y en Vogels et al., (2003) J. Virol., 77(15): 8263-71. Pueden hallarse ejemplos de secuencias de los genomas de los vectores Ad35 en el acceso GenBank AC_000019 y en la figura 6 de WO 00/70071.

Los adenovirus de los simios generalmente tambien presentan una prevalencia baja en el suero, y/o para ellos tambien suele haber una titulacion preexistente de anticuerpos neutralizadores baja en las poblaciones humanas. Se han realizado numerosos trabajos con vectores basados en adenovirus de chimpance (por ejemplo, US6083716, WO 2005/071093, WO 2010/086189 y WO 2010085984; Farina et al., 2001, J. Virol., 75: 11603-13; Cohen et al., 2002, J. Gen. Virol., 83: 151-55; Kobinger et al., 2006, Virology 346: 394-401; y Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy, 15: 608-17; tambien puede consultarse la revision de Bangari y Mittal, 2006, Vaccine, 24: 849-62, y la revision de Lasaro y Ertl, 2009, Mol. Ther., 17: 1333-39). Por lo tanto, en otras formas de realizacion preferidas, los adenovirus recombinantes de acuerdo con la invencion estan basados en adenovirus de simio, por ejemplo, en adenovirus de chimpance. En determinadas formas de realizacion, los adenovirus recombinantes estan basados en adenovirus de simio de los tipos 1, 7, 8, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 o SA7P.

Las secuencias de la mayona de los adenovirus humanos y no humanos que se mencionaron con anterioridad son conocidas y para otros, pueden obtenerse sobre la base de procedimientos de rutina.

Los adenovirus recombinantes de acuerdo con la invencion pueden presentar deficiencias en la replicacion o pueden ser capaces de replicarse normalmente.

En determinadas formas de realizacion, los adenovirus presentan deficiencias en la replicacion, por ejemplo, debido a que contienen una supresion en la region E1 del genoma. Aquellos versados en la tecnica han de saber que, en el caso de supresiones de las regiones esenciales del genoma de un adenovirus, las funciones codificadas por las regiones en cuestion, deben proporcionarse en trans, preferiblemente en la celula que se emplea para la produccion, es decir, cuando se elimina una parte o la totalidad de las regiones E1, E2 y/o E4 de los adenovirus, estas han de estar presentes en la celula que se emplee para la produccion, por ejemplo, que esten integradas en su genoma o que tomen la forma de adenovirus asistentes o plasmidos asistentes. Los adenovirus tambien pueden presentar una supresion en la region E3, que es prescindible para la replicacion, por lo que no es necesario complementar una supresion de este tipo.

En la presente, para la produccion podra usarse cualquier celula (a la cual se le denomina en la presente y en la tecnica en ocasiones “celula de envasado”, “celula huesped” o “celula complementaria”) en la que pueda propagarse el adenovirus deseado. Por ejemplo, los vectores basados en adenovirus recombinantes podran propagarse en celulas que se empleen en la produccion y sean apropiadas para complementar las deficiencias que puedan presentar los adenovirus. En el genoma de las celulas que se empleen para la produccion, preferiblemente habra al menos una secuencia propia de los adenovirus E1, con lo que se posibilitara la complementacion de aquellos adenovirus recombinantes que presenten una supresion en la region E1. Podra usarse cualquier celula que sea apropiada para complementar una supresion en la region E1, por ejemplo, una celula de retina humana inmortalizada que comprenda la region E1, como es el caso de las celulas 911 o PER.C6 (vease la Patente de los EE. UU. N° 5994128), un aminocito que haya sido transformado con la region E1 (vease la Patente EP 1230354), una celula A549 que haya sido transformada con la region E1 (veanse, por ejemplo, WO 98/39411 y la Patente de los EE. UU. N° 5891690), una celula GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Human Gene Therapy, 11: 213-219), 293 o una celula semejante. En determinados aspectos, las celulas que se emplean para la produccion pueden ser, por ejemplo, celulas HEK293, celulas PER.C6, celulas 911, celulas IT293SF o celulas semejantes.

En el caso de los adenovirus que presentan deficiencias en la region E1 y que no derivan de los adenovirus de los subgrupos C o E, resulta preferible que se cambie la secuencia que codifica el ORF 6 de la region E4 que no sea propia de los adenovirus de los subgrupos C o E por una secuencia que codifique el ORF 6 de la region E4 que

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provenga de los adenovirus del subgrupo C, como es el caso de los adenovirus Ad5. De esta manera, los adenovirus podran propagarse en lmeas de celulas complementarias conocidas donde se expresen genes que codifiquen la region E1 de los adenovirus Ad5, como es el caso de las celulas 293 o las celulas PER.C6 (veanse, por ejemplo, Havenga et al., 2006, J. Gen. Virol., 87: 2135-2143, y WO 03/104467.

En ejemplos alternativos, no sera necesario introducir una region heterologa que codifique el ORF 6 de la region E4 (que por ejemplo, provenga de un adenovirus Ad5) en el vector basado en un adenovirus. En lugar de esto, el vector que presente una deficiencia en la region E1 y que no este relacionado con los subgrupos Co E podra propagarse en una lmea de celulas en las que se exprese tanto la region E1 como un ORF 6 de la region E4 que sea compatible, por ejemplo, en la lmea de celulas 293-ORF6, en las que se expresa la region E1 y el ORF 6 de la region E4 de los adenovirus Ad5 (veanse, por ejemplo, Brough et al., 1996, J. Virol., 70: 6497-501, donde se describe la generacion de las celulas 293-ORF6; Abrahamsen et al., 1997, J. Virol., 71: 8946-51; y Nan et al., 2003, Gene Therapy 10: 326-36, donde se describe la generacion de vectores basados en adenovirus que no pertenecen al subgrupo C de los que se ha eliminado la region E1 a partir de la lmea de celulas que se ha mencionado).

Como alternativa, podra usarse una lmea de celulas complementarias en las que se exprese una region E1 que sea propia del serotipo que se desee propagar (veanse, por ejemplo, WO 00/70071 y WO 02/40665).

En el caso de los adenovirus del subgrupo B, como es el caso de Ad35, que comprenden una supresion en la region E1, resulta preferible que se retenga el extremo 3' del marco abierto de lectura de E1B 55K en el adenovirus, por ejemplo, los 166 pares de bases que se encuentran directamente hacia el extremo 5' del marco abierto de lectura de pIX, o bien que se retenga un fragmento que los comprenda, que podra ser un fragmento de 243 pares de bases que se encuentre directamente hacia el extremo 5' del codon de inicio de pIX (que comprende un sitio de restriccion para Bsu36I en el extremo 5' del genoma de Ad35), con el proposito de que se incremente su estabilidad, ya que el promotor del gen pIX reside en parte en el area que se ha mencionado (veanse, por ejemplo, Havenga et al., 2006, J. Gen. Virol., 87: 2135-2143, y WO 2004/001032).

El termino “acido nucleico heterologo” (tambien denominado en la presente “transgen”), aplicado a un adenovirus de acuerdo con la invencion, hace referencia a un acido nucleico que no esta presente de manera natural en el adenovirus. Se lo introduce en el adenovirus, por ejemplo, sobre la base de procedimientos convencionales de biologfa molecular. Puede codificar una protema de interes o una parte de esta. A modo de ejemplo, es posible clonarlo en la localizacion en la que se ha eliminado la region E1 o E3 de un vector basado en un adenovirus. Un transgen generalmente esta unido operativamente a secuencias que son apropiadas para controlar la expresion, lo que, por ejemplo, puede ser el resultado de la colocacion de un acido nucleico que codifica uno o mas transgenes bajo el control de un promotor. Es posible agregar mas secuencias reguladoras. Para expresar los transgenes, pueden usarse numerosos promotores conocidos por aquellos versados en la tecnica. Un ejemplo no limitativo de un promotor apropiado para llevar a cabo la expresion en las celulas eucariotas es el promotor del CMV (US 5385839), que por ejemplo, puede ser el promotor inmediato temprano del CMV, que puede comprender los nucleotidos -735 a +95 del potenciador/promotor inmediato temprano del gen correspondiente del CMV. Detras de los transgenes, puede haber presente una senal de poliadenilacion, por ejemplo, la senal de poliadenilacion de la hormona de crecimiento bovina (US 5122458).

En determinados aspectos, puede resultar deseable expresar mas de una protema a partir de un unico adenovirus, y en estos casos, pueden unirse numerosas secuencias codificantes, de manera tal de formar un unico transcripto en un unico casete de expresion o pueden estar presentes en dos casetes de expresion separados, que pueden clonarse en partes diferentes del genoma del adenovirus.

La identidad del transgen no es fundamental en el contexto de la presente invencion, que podra ponerse en practica con cualquier adenovirus que comprenda cualquier transgen. Los transgenes apropiados han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica, y por ejemplo, pueden incluir transgenes que abarcan marcos abiertos de lectura, que pueden ser marcos abiertos de lectura que codifican polipeptidos que presentan efectos terapeuticos y que pueden ser utiles en una terapia genica, o que tambien pueden ser polipeptidos que pueden desencadenar una respuesta inmune deseada cuando se emplea el vector rAd en el contexto de una vacunacion. Los acidos nucleicos heterologos particularmente preferidos son los genes que codifican los determinantes antigenicos de interes, contra los cuales se desea desencadenar una respuesta inmune. Tfpicamente, los determinantes antigenicos de este tipo tambien se conocen como antfgenos. Un vector basado en un adenovirus podra codificar cualquier antfgeno deseado. En ejemplos tfpicos, los antfgenos pueden ser peptidos, polipeptidos o protemas provenientes de organismos que pueden provocar enfermedades o trastornos. Por lo tanto, en otro aspecto preferido, los acidos nucleicos heterologos de interes codifican determinantes inmunogenicos. Mas preferiblemente, los determinantes inmunogenicos son antfgenos provenientes de bacterias, de virus, de levaduras o de parasitos. Las enfermedades que pueden ser provocadas por estos organismos generalmente se conocen como “enfermedades infecciosas” (aunque no se limitan a los organismos que pueden “infectar”, sino que tambien abarcan aquellos que pueden ingresar en un huesped y provocar una enfermedad). Los antfgenos que se conocen como “autoantfgenos”, que por ejemplo, pueden ser antfgenos tumorales, tambien son conocidos en la tecnica y pueden estar codificados por los acidos nucleicos heterologos que se hallan en los adenovirus recombinantes de acuerdo con la presente invencion. Los ejemplos no limitativos de determinantes antigenicos (o antfgenos) incluyen los que provienen de los organismos

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que pueden provocar la malaria, como es el caso de Plasmodium falciparum, de los organismos que pueden provocar la tuberculosis, tales como Mycobacterium tuberculosis, de levaduras o de virus. En otras formas de realizacion preferidas, en las composiciones de acuerdo con la presente invencion pueden usarse antigenos de diversos virus, como es el caso de los flavivirus (por ejemplo, el virus del Nilo occidental, el virus de la hepatitis C, el virus de la encefalitis japonesa o el virus del dengue), el virus del ebola, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el virus de Marburg. En un ejemplo, dicho antigeno es la protema CS o una parte inmunogenica de esta, que proviene de P. falciparum (pueden hallarse ejemplos de vectores basados en adenovirus que codifican la protema CS en Havenga et al., 2O06, J. Gen. Virol., 87: 2135-2143, Ophorst et al., 2007, Vaccine, 25:1426-36, y WO 2004/055187). En otro aspecto, el determinante antigenico es una protema de un antfgeno o una protema de fusion de varios antigenos de M. tuberculosis, como es el caso de las protemas Ag85A, Ag85B y/o TB10.4, o una o mas partes inmunogenicas de estas (la construccion y la produccion de las vacunas para la TB que estan basadas en virus se describen, por ejemplo, en WO 2006/053871). En aun otro aspecto, el determinante antigenico es una glucoprotema viral o una parte inmunogenica de esta, que puede ser, por ejemplo, una GP de un filovirus, tal como el virus del ebola o el virus de Marburg (veanse, por ejemplo, Sullivan et al., (2003) Nature, 424(6949): 681-684; Sullivan, et al., (2006) PLoS Med., 3(6): e177; y Geisbert et al., (2011) J. Virol., 85: 4222-4233). En aun otros aspectos, el determinante inmunogenico proviene de una protema del VIH, tal como gag, pol, env, nef o una variante de cualquiera de ellas (pueden hallarse ejemplos de vacunas para el VIH basadas en adenovirus en WO 2009/026183, WO 2010/096561, WO 2006/120034, WO 02/22080 o WO 01/02607). En otros ejemplos, el determinante antigenico es una protema HA, NA, Mo NP o una parte inmunogenica de cualquiera de ellas, que por ejemplo, puede provenir de un virus de la influenza (veanse, por ejemplo, Zhou et al., 2010, Mol. Ther., 18:2182-9; Hu et al., 2011, Virus Res., 155: 156-62; y la revision de Vemula y Mittal, 2010, Expert Opin. Biol. Ther., 10: 146987). En otras formas de realizacion, el determinante antigenico es una protema hA o una parte inmunogenica de esta, que puede provenir de un virus del sarampion (vease, por ejemplo, WO 2004/037294). En otros aspectos, el determinante antigenico es una glucoprotema del virus de la rabia (vease, por ejemplo, Zhou et al., 2006, Mol. Ther., 14: 662-672).

En la invencion tambien se provee un metodo con el que puede prepararse un lote de partmulas de adenovirus recombinantes que comprenden secuencias de nucleotidos esencialmente identicas en el extremo 5' de sus genomas, donde el metodo comprende a) poner en practica un paso de clonacion molecular para cambiar los extremos 5' de origen natural de los genomas de los adenovirus por extremos 5' alterados, que como nucleotidos terminales comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT; b) propagar los adenovirus recombinantes que comprenden los extremos 5' alterados en celulas huesped; y c) cosechar los adenovirus recombinantes para obtener un lote de partmulas de adenovirus recombinantes, donde los genomas de esencialmente todas las partmulas comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'. En un aspecto preferido, los extremos 5' de los genomas se modifican de manera activa sobre la base de procedimientos de clonacion molecular, los cuales son de uso habitual y han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica de la biologfa molecular. En el contexto de la invencion, la identificacion de estas secuencias terminales ventajosas CTATCTAT posibilita la puesta en practica de este paso activo. Este paso puede resultar particularmente ventajoso cuando se emplean adenovirus que comprenden secuencias diferentes en su extremo 5' (es decir, diferentes de CTATCTAT) como material de partida o base para la generacion de un (lote o una composicion de) adenovirus recombinante(s) de acuerdo con la invencion, los cuales por ejemplo, pueden pertenecer a cualquiera de los serotipos preferidos de la invencion que se describen en la presente. Una ventaja esta relacionada con el control y la certeza de que la secuencia deseada CTATCTAT estara presente desde el comienzo en la totalidad de los genomas de los adenovirus que se empleen como material de partida en el paso b), y debido a que esta secuencia resulta particularmente estable, segun se describe en la presente, los lotes de adenovirus que se obtengan en el paso c) comprenderan partmulas de adenovirus las cuales tienen todas esencialmente la misma secuencia deseada en sus extremos 5'.

Por otro lado, como una alternativa a la clonacion molecular, sera posible aprovechar las variaciones de origen natural y seleccionar aquellos adenovirus que presenten secuencias alteradas CTATCTAT en sus extremos, de manera tal de obtener un material de partida con extremos 5' estables que sea apropiado para propagarlo y obtener lotes de adenovirus en cualquier escala. Por ende, como alternativa, se provee un metodo con el que puede prepararse un lote de partmulas de adenovirus recombinantes que comprenden secuencias de nucleotidos esencialmente identicas en el extremo 5' de sus genomas, donde el metodo comprende: a) poner en practica un procedimiento para purificar adenovirus en placas, donde dichos adenovirus no son adenovirus humanos de los serotipos 3, 4, 7, 8, 9, 11p, 15, 21, 29, 37 o 53 o formas recombinantes de estos, de manera tal de aislar los adenovirus o adenovirus recombinantes, a partir de una unica placa, donde dichos adenovirus o dichos adenovirus recombinantes comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5' de sus genomas; b) propagar los adenovirus recombinantes que se obtuvieron a partir de una unica placa en el paso a) en celulas huesped; y c) cosechar los adenovirus recombinantes para obtener un lote de partmulas de adenovirus recombinantes, donde los genomas de esencialmente todas las partmulas comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'. En este caso, el paso activo abarca la preparacion de una unica placa de adenovirus (recombinantes) y la determinacion o la confirmacion de que su genoma comprende la secuencia deseada CTATCTAT en el extremo 5'. Aquellos versados en la tecnica han de apreciar que el paso a) de este ejemplo podra ponerse en practica con adenovirus que ya sean adenovirus recombinantes o con un aislado de adenovirus que todavfa sean salvajes, en donde en este ultimo caso, los adenovirus recombinantes se elaboraran

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antes del paso b) (por ejemplo, sobre la base de una clonacion, mediante la cual podran introducirse los transgenes en el genoma). Aquellos versados en la tecnica de la manipulacion de adenovirus han de conocer los procedimientos de purificacion basados en placas, con los cuales puede asegurarse que el material de partida para su elaboracion posterior es homogeneo y que proviene de un unico aislado. La seleccion activa de un adenovirus (recombinante) que comprendiera la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5' de su genoma no habfa sido descripta con anterioridad, y antes de la presentacion de la presente invencion, tampoco habna tenido sentido alguno. Por el contrario, la identificacion de una secuencia de este tipo, se la habna considerado una anomalfa y las placas se habnan descartado por contener una alteracion genetica antes de la presente invencion. Se considera un logro de la presente invencion, la seleccion de estos adenovirus (recombinantes) como material de partida para asegurar la estabilidad genetica y dar como resultado lotes de adenovirus recombinantes tales que los genomas de esencialmente todos los adenovirus comprendan los nucleotidos identicos deseados en su extremo 5'. Los adenovirus recombinantes de acuerdo con la invencion podnan presentar caractensticas de replicacion superiores.

Una celula huesped que puede obtenerse de acuerdo con los metodos de acuerdo con la invencion puede ser una celula de envasado, que puede ser util para complementar las deficiencias en los genomas de los adenovirus recombinantes, las cuales, por ejemplo, pueden ser deficiencias en la region E1. Los pasos b) y c) de los metodos para elaborar lotes de adenovirus recombinantes de acuerdo con la invencion son de uso habitual y han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica.

En determinados aspectos, el paso b) de estos metodos se lleva a cabo en un biorreactor, que puede tener un volumen de entre aproximadamente 1 litro y aproximadamente 20000 litros. De este modo, podra obtenerse una cantidad de las composiciones de adenovirus deseadas que sea suficiente para una aplicacion a escala industrial. El termino “aproximadamente”, aplicado a los valores numericos que se proveen en la presente, hace referencia a un rango de ±10%. En determinados ejemplos, el volumen de trabajo es de entre 10 l y 10000 l, por ejemplo, de entre 20 l y 2000 l. El volumen de trabajo es el volumen efectivo del cultivo en el biorreactor. El volumen del biorreactor podra ser seleccionado por aquellos versados en la tecnica sobre la base de la demanda real. A traves de la presente invencion, puede asegurarse que esencialmente todas las partfculas de los adenovirus en los lotes finales que se produzcan comprendan extremos identicos, es decir, que sean homogeneas desde el punto de vista genetico, lo cual resultara deseable en un producto farmaceutico.

La mayona de los cultivos en suspension a gran escala se operan como procesos en lotes individuales o consecutivos, que son los mas sencillos y adaptables a cualquier escala. En la actualidad, se estan tornando mas comunes los procesos continuos que estan basados en el principio de la perfusion, y tambien pueden resultar apropiados (veanse, por ejemplo, WO 2010/060719 y WO 2011/098592, donde se describen metodos apropiados para obtener y purificar grandes cantidades de adenovirus recombinantes).

Las celulas que se emplean para la produccion se cultivan para incrementar su cantidad y la cantidad y/o la titulacion de los virus. Las celulas se cultivan para posibilitar el metabolismo, el crecimiento, la division y/o la generacion de los virus de interes de acuerdo con la invencion. Esto puede llevarse a cabo de acuerdo con metodos que han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica, e incluye sin caracter limitante el suministro de nutrientes para las celulas, por ejemplo, a traves de un medio de cultivo apropiado. Los medios de cultivo apropiados han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica, y generalmente pueden obtenerse en grandes cantidades a partir de proveedores comerciales o pueden elaborarse a medida, de acuerdo con protocolos convencionales. El cultivo puede llevarse a cabo, por ejemplo, en placas, en botellas agitadas o en biorreactores, mediante el uso de sistemas en lotes individuales o consecutivos, sistemas continuos o sistemas semejantes. Las condiciones apropiadas para cultivar las celulas han de resultar conocidas (veanse, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973); y R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, cuarta edicion (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).

Tfpicamente, los adenovirus seran expuestos a las celulas que sean apropiadas para llevar a cabo la produccion, que se encontraran en un cultivo, de manera tal que estas puedan captarlo. Usualmente, la agitacion optima es de aproximadamente entre 50 y 300 rpm, tipicamente es de aproximadamente 100-200 rpm, y por ejemplo, puede ser de aproximadamente 150 rpm. La Do tfpica es de 20-60%, por ejemplo, puede ser de 40%. El pH optimo es de entre 6,7 y 7,7. La temperatura optima es de entre 30°C y 39°C, por ejemplo, puede ser de 34-37°C. La MOI optima es de entre 5 y 1000, por ejemplo, puede ser de aproximadamente 50-300. Tfpicamente, los adenovirus infectan las celulas que se emplean para la produccion de manera espontanea, y usualmente el contacto entre dichas celulas y las partfculas de los rAd es suficiente para que tenga lugar la infeccion. En general, se le agrega una solucion madre que comprende los adenovirus al cultivo para iniciar la infeccion, y posteriormente, los adenovirus se propagan en las celulas que se emplean para la produccion. Todos estos procedimientos son de uso habitual y han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica. Las soluciones madre que comprenden los adenovirus de acuerdo con la invencion pueden comprender partfculas de adenovirus recombinantes, y los genomas de esencialmente todas las partfculas de los adenovirus en las soluciones madre pueden comprender la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'.

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Una vez que tiene lugar la infeccion con los adenovirus, los virus pueden replicarse en las celulas, con lo cual puede incrementarse su cantidad. Este proceso se conoce en la presente como la propagacion de los adenovirus. Eventualmente, la infeccion de las celulas con los adenovirus da como resultado su lisis. Sobre la base de las caractensticas ltticas de los adenovirus, pueden ponerse en practica dos modalidades de elaboracion diferentes. La primera modalidad esta basada en la cosecha de los virus antes de la lisis de las celulas, y comprende el uso de factores externos para efectuar dicha lisis. La segunda modalidad esta basada en la cosecha del sobrenadante que comprende los virus despues de la lisis (practicamente) completa de las celulas por parte del virus producido (vease, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. 6485958, donde se describe la cosecha de adenovirus sin la lisis de las celulas huesped mediante el uso de un factor externo). Resulta preferible emplear factores externos para lisar de manera activa las celulas y cosechar los adenovirus.

Aquellos versados en la tecnica han de conocer diversos metodos para lisar las celulas de manera activa. Se los describe, por ejemplo, en WO 98/22588, p. 28-35. Los metodos utiles en este contexto incluyen, por ejemplo, los ciclos de congelacion-descongelacion, la agitacion en una fase solida, la lisis hipertonica y/o hipotonica, la agitacion en una fase lfquida, la sonicacion, la extrusion a presion elevada, la lisis con detergentes, las combinaciones de estos metodos y los metodos semejantes. En un ejemplo, las celulas se lisan usando al menos un detergente. El uso de un detergente para la lisis resulta ventajoso, ya que se trata de un metodo sencillo, cuya escala puede modificarse con facilidad.

Los detergentes que pueden emplearse y la modalidad de su uso han de resultar conocidos en general para aquellos versados en la tecnica. A modo de ejemplo, puede consultarse WO 98/22588, p. 29-33. Los detergentes pueden ser anionicos, cationicos, zwitterionicos o no ionicos. La concentracion de los detergentes puede variar, y por ejemplo, puede hallarse en el rango aproximado de 0,1%-5% (p/p). En un aspecto, el detergente que se emplea es Triton X-100.

Pueden emplearse nucleasas para remover los contaminantes, lo cual, en el contexto de las celulas que se emplean para la produccion, abarca principalmente los acidos nucleicos. Los ejemplos de nucleasas que son apropiadas para usar en la presente invencion incluyen Benzonase®, Pulmozyme® y cualquier otra ADNasa o ARNasa de uso habitual en la tecnica. En ejemplos preferidos, la nucleasa es Benzonase®, que puede hidrolizar rapidamente los acidos nucleicos al hidrolizar los enlaces de fosfodiester internos entre nucleotidos espedficos, con lo que puede reducirse la viscosidad del lisado celular. Benzonase® puede obtenerse en el proveedor comercial Merck KGaA (codigo W214950). La concentracion en la cual puede emplearse la nucleasa preferiblemente se encuentra en el rango de 1-100 unidades/ml. Como alternativa a un tratamiento con una nucleasa, o adicionalmente, es posible separar el ADN de las celulas huesped de los preparados de adenovirus durante la purificacion de estos, sobre la base de una precipitacion selectiva, para lo cual pueden emplearse agentes de precipitacion selectivos como el bromuro de domifeno (veanse, por ejemplo, US 7326555, Goerke et al., 2005, Biotechnology and bioengineering, Vol. 91: 12-21, WO 2011/045378 y WO 2011/045381).

Los metodos para cosechar los adenovirus a partir de los cultivos que comprenden las celulas que se emplean para la produccion se describen en detalle en WO 2005/080556.

En determinadas formas de realizacion, los adenovirus cosechados tambien se someten a una purificacion adicional. La purificacion de los adenovirus puede llevarse a cabo en varios pasos, que pueden abarcar una depuracion, una ultrafiltracion, una diafiltracion o una separacion sobre la base de una cromatograffa, tal como se describe, por ejemplo, en WO 05/080556. La depuracion puede basarse en un paso de filtracion, en el que pueden eliminarse los residuos celulares y otras impurezas del lisado celular. La ultrafiltracion se emplea para concentrar la solucion que comprende el virus. La diafiltracion, o intercambio de amortiguadores, que puede llevarse a cabo en un dispositivo de ultrafiltracion, es un metodo apropiado para remover y cambiar las sales, los azucares y otros elementos semejantes. Aquellos versados en la tecnica han de saber como determinar las condiciones optimas para cada paso de purificacion. En WO 98/22588 tambien se describen metodos para producir y purificar vectores basados en adenovirus. Estos metodos comprenden cultivar las celulas huesped, infectarlas con adenovirus, cosecharlas y lisarlas, concentrar el lisado en bruto, cambiar el amortiguador en dicho lisado, tratarlo con una nucleasa y someter el virus a una purificacion adicional a traves de una cromatograffa.

Preferiblemente, en la purificacion se emplea al menos un paso de cromatograffa, tal como se describe, por ejemplo, en WO 98/22588, p. 61-70. Se han descripto numerosos procesos para llevar a cabo el paso de purificacion adicional de los adenovirus, que suelen comprender procedimientos de cromatograffa. Aquellos versados en la tecnica han de conocer estos procesos y han de poder realizar modificaciones exactas en los procedimientos de cromatograffa para optimizarlos. A modo de ejemplo, es posible purificar los adenovirus a traves de diversos pasos basados en procedimientos de cromatograffa de intercambio anionico, segun se describe, por ejemplo, en WO 2005/080556. Se han descripto una cantidad significativa de metodos diferentes para purificar los adenovirus, que han de resultar conocidos para aquellos versados en la tecnica. Se describen otros metodos para producir y purificar los adenovirus, por ejemplo, en WO 00/32754, WO 04/020971, US 5837520, US 6261823 y WO 2006/108707.

En el contexto de la administracion en los seres humanos, en la presente invencion pueden emplearse composiciones farmaceuticas que comprenden un rAd y un vetnculo o un excipiente farmaceuticamente aceptable.

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De esta manera, el termino “farmaceuticamente aceptable” denota que el vehuculo o el excipiente, en las dosis y las concentraciones que se emplean, no dan como resultado efectos indeseables o daninos en los sujetos a los que se los administra. Los vehuculos y los excipientes farmaceuticamente aceptables son bien conocidos en la tecnica (veanse Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a edicion, A. R. Gennaro, editor, Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, editores, Taylor y Francis (2000); y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edicion, A. Kibbe, editor, Pharmaceutical Press (2000)). El rAd purificado preferiblemente se formula y se administra en forma de una solucion esteril, aunque tambien es posible emplear preparaciones liofilizadas. Las soluciones esteriles se elaboran sobre la base de una filtracion bajo condiciones esteriles o con metodos conocidos en la tecnica. Posteriormente, las soluciones se liofilizan o se colocan en recipientes apropiados para envasar dosis farmaceuticas. El pH de estas soluciones generalmente se halla en el rango de entre 3,0 y 9,5, por ejemplo, entre 5,0 y 7,5. El rAd tfpicamente se encuentra en una solucion que comprende un amortiguador apropiado, y que tambien puede contener una sal. Opcionalmente, puede haber presente un agente estabilizador, tal como la albumina. En determinados aspectos, se agrega un detergente. En determinados ejemplos, el rAd puede formularse en una preparacion inyectable. Las formulaciones de este tipo pueden comprender cantidades eficaces del rAd, tfpicamente son soluciones lfquidas, suspensiones lfquidas o versiones liofilizadas esteriles, y opcionalmente pueden contener estabilizadores o excipientes. Una vacuna basada en adenovirus tambien puede administrarse por via intranasal, en forma de aerosol (vease, por ejemplo, WO 2009/117134).

A modo de ejemplo, los adenovirus pueden almacenarse en el mismo amortiguador que se emplea tambien para almacenar las referencias mundiales de adenovirus (Hoganson et al., Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing, Marzo de 2002, p. 43-48), que comprende Tris 20 mM, pH 8, NaCl 25 mM y 2,5% de glicerol. La formulacion de otro amortiguador que es util para administrarselo a los seres humanos comprende Tris 20 mM, 2 MgCl2 mM, NaCl 25 mM, 10% p/v de sacarosa y 0,02% p/v de polisorbato-80. Evidentemente, ha de ser posible emplear otros amortiguadores, y pueden hallarse diversos ejemplos de formulaciones apropiadas para almacenar preparaciones de (adeno)virus purificados y para llevar a cabo su administracion farmaceutica en la Patente Europea N° 0853660, en la Patente de los EE. Uu. 6225289 y en las solicitudes de patentes internacionales WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763, WO 03/078592 y WO 03/061708.

En determinados ejemplos, una composicion que comprende adenovirus tambien comprende uno o mas coadyuvantes. Se sabe que los coadyuvantes son utiles para incrementar aun mas la respuesta inmune contra el determinante antigenico que se administra. A modo de ejemplo, en WO 2007/110409, se describen composiciones farmaceuticas que comprenden adenovirus y coadyuvantes apropiados. Los terminos “coadyuvante” y “estimulante inmune” se usan indistintamente en la presente, y abarcan aquellas sustancias que son utiles para estimular el sistema inmune. En este contexto, se emplea un coadyuvante para incrementar la respuesta inmune que se genera con los vectores basados en adenovirus de acuerdo con la invencion. Los ejemplos de coadyuvantes apropiados incluyen las sales de aluminio, tales como el hidroxido de aluminio y/o el fosfato de aluminio, las emulsiones oleosas (las emulsiones de aceite en agua), que pueden ser emulsiones de escualeno y agua, tales como MF59 (vease, por ejemplo, WO 90/14837), las formulaciones a base de saponina, tales como QS21, los complejos inmunoestimulantes (ISCOMS; veanse, por ejemplo, US 5057540, WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762 y WO 2005/002620), los derivados de bacterias o de microbios, tales como el monofosforil lfpido A (MPL), el MPL 3-O-desacilado (3dMPL), los oligonucleotidos que contienen motivos CpG, las toxinas bacterianas que pueden ribosilar el ADP o las mutantes de estas, como es el caso de la enterotoxina LT de E. coli labil ante el calor o la toxina CT del colera, y semejantes. Tambien es posible usar coadyuvantes codificados por vectores, por ejemplo, mediante el uso de un acido nucleico heterologo que codifica una fusion entre el dominio de oligomerizacion de la protema que puede unirse a C4 (C4bp) y el antfgeno de interes (vease, por ejemplo, Solabomi et al., 2008, Infect. Immun., 76: 3817-23). En determinados aspectos, las composiciones comprenden aluminio como coadyuvante, por ejemplo, en forma de hidroxido de aluminio, de fosfato de aluminio, de fosfato de aluminio y potasio o de una combinacion de estos, en una concentracion de aluminio de entre 0,05 y 5 mg por dosis, por ejemplo, de entre 0,075 y 1,0 mg por dosis.

En otros aspectos, las composiciones no comprenden coadyuvantes.

Las composiciones de adenovirus pueden administrarseles a sujetos que pueden ser sujetos humanos. La dosis total de los adenovirus que se le administra a los sujetos en cada administracion puede variar, lo cual ha de resultar evidente para aquellos versados en la tecnica. En general, la dosis es de entre 1 x 107 partfculas virales (vp) v 1 x 1012 vp, preferiblemente es de entre 1 x 108 vp y 1 x 1011 vp, y por ejemplo, puede ser de entre 3 x 108 y 5 x 1010 vp, tal como entre 109 y 3 x 1010 vp.

La administracion de las composiciones de adenovirus puede llevarse a cabo a traves de rutas convencionales de administracion. Los aspectos no limitativos abarcan la administracion parenteral tal como, por medio de una inyeccion, por ejemplo por via intradermica o intramuscular, etc., o una administracion subcutanea o transcutanea o a traves de una mucosa, por ejemplo las rutas intranasal u oral, y similares. En un ejemplo, una composicion se administra por medio de una inyeccion intramuscular, por ejemplo, en el musculo deltoide del brazo o en el musculo vastus lateralis del muslo. Aquellos versados en la tecnica han de conocer las diversas modalidades posibles para administrar una composicion, por ejemplo, una vacuna, con el proposito de inducir una respuesta inmune contra los uno o mas antfgenos que comprende.

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El termino “sujeto”, tal como se lo emplea en la presente, preferiblemente hace referencia a un mairnfero, que puede ser, por ejemplo, un roedor, tal como un raton, un primate no humano o un ser humano. Preferiblemente, el sujeto es un sujeto humano.

Tambien es posible realizar una o mas administraciones de refuerzo con una o mas vacunas basadas en adenovirus. Si se recurre a una vacunacion de refuerzo, tipicamente se la administra al mismo sujeto entre una semana y un ano despues de la primera administracion de la composicion (que en estos casos se conoce como la “vacunacion inicial”), preferiblemente entre dos semanas y cuatro meses despues de la primera administracion. En regfmenes de refuerzo alternativos, a los sujetos tambien pueden administrarseles diversos vectores, por ejemplo, uno o mas adenovirus de serotipos diferentes, o bien vectores de tipos diferentes, que pueden comprender MVA, ADN o protemas, como vacunaciones iniciales o de refuerzo.

La invencion se describe con mayor detalle en los siguientes ejemplos, que se proveen para facilitar su comprension.

EJEMPLOS

Metodos

Plasmidos:

La secuencia de la ITR alternativa para el adenovirus Ad35 se introdujo en la ITR izquierda por medio de una clonacion en pAdapt, mientras que la secuencia de la ITR alternativa para el adenovirus Ad5 se introdujo en la ITR derecha por medio de una clonacion en plasmidos pBr (veanse, por ejemplo, Havenga, M., et al., 2006, J. Gen. Virol., 87: 2135-2143; Havenga, M., et al., 2001, J. Virol., 75: 3335-3342). Para introducir la secuencia de la ITR alternativa en la ITR izquierda, se puso en practica una fusion basada en una PCR con un cebador directo que comprendio un sitio para ScaI (GTGACTGGTGAGTACTC, SEQ ID N° 1), un cebador inverso que comprendio un sitio para AvrII (GACCACCTAGGCTGAC, SEQ ID N° 2) y un par de cebadores directo e inverso para la fusion que comprendieron la secuencia de la ITR alternativa (el cebador directo con la ITR alternativa 1 fue TTAATTAATCGATCTATCTATATAATATACCTTATAG, SEQ ID N° 3, el cebador directo con la ITR alternativa 2 fue GATCTATCTATATAATATACCTTATAGATGGAATGG, SEQ ID N° 4, y el cebador inverso con la ITR alternativa fue ATTATATAGATAGATCGATTAATTAATTCGAACCC, SEQ ID N° 5). En la PCR, se usaron dos cebadores directos que estuvieron parcialmente superpuestos con la ITR, de manera tal de amplificar uno de los fragmentos de la fusion e incrementar la eficiencia del procedimiento en conexion con una region extremadamente rica en AT en el molde. El producto de la fusion que se obtuvo por medio de la PCR primero se subclono en el vector pTopo, con el fin de facilitar su subclonacion ulterior, y luego se inserto en el plasmido pAdapt35, mas particularmente en los sitios para AvrII y para ScaI en los transgenes correspondientes.

Para introducir la secuencia de la ITR alternativa en la ITR derecha, se puso en practica una fusion basada en una PCR con un cebador directo que comprendio un sitio para NdeI, un cebador inverso que comprendio un sitio para NruI y un par de cebadores directo e inverso para la fusion que comprendieron la secuencia de la ITR alternativa, sobre la base de una estrategia de fusion basada en una PCR que fue identica a la que se describio para la introduccion de la ITR izquierda. El producto de la fusion que se obtuvo por medio de la PCR primero se subclono en el vector pTopo y luego se inserto en el plasmido pBR.Ad35.PR.dE3 orf6/7, mas particularmente en los sitios para NdeI y para NruI.

Para generar los vectores basados en el adenovirus Ad5 con ITR alternativas, se empleo una estrategia como la que se describio con anterioridad.

Cultivo de las celulas:

Las celulas PER.C6 (Fallaux et al., 1998) se mantuvieron en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que comprendio 10% de suero fetal bovino (FBS) y estaba suplementado con MgCh 10 mM. Las celulas A549, HEK293, Hep2, HeLa y MRC5 se obtuvieron en la AtCC y se mantuvieron en un DMEM con 10% de FBS. Generacion de los adenovirus, infecciones y pasajes:

De no indicarse lo contrario, todos los virus se generaron en celulas PER.C6, sobre la base de una recombinacion homologa simple o doble, y se los produjo como se describio con anterioridad (Havenga et al., 2006). En resumen, los plasmidos se introdujeron en las celulas PER.C6 por medio de una transfeccion, mediante el uso de lipofectamina, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies). Las celulas se cosecharon un dfa despues de observar un CPE completo, se las sometio a un ciclo de congelacion y descongelacion, se las centrifugo a 3000 rpm durante 5 minutos y se las almaceno a -20°C. Se usaron entre 3 y 5 ml del lisado en bruto para inocular cuatro frascos T175 que comprendieron tres capas con celulas PER.C6 confluentes al 70%. Los virus se purificaron sobre la base de un metodo con dos pasos en el que se empleo CsCl. Finalmente, los virus se almacenaron en alfcuotas a -85°C.

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Para investigar el cambio de la secuencia de la ITR original por la secuencia de la ITR alternativa, los diversos virus fueron sometidos a varias series de pasajes, para lo cual se empleo el material que comprendio el virus en bruto, que se obtuvo despues de la purificacion en placas, o bien se usaron lotes de virus que se purificaron como se describio con anterioridad. Con este proposito, las celulas se infectaron con el vector viral correspondiente. Un dfa despues de observar un CPE completo, las celulas y los sobrenadantes se cosecharon y se congelaron. Las partfculas virales se liberaron de las celulas por medio de una descongelacion, y el material en bruto obtenido que comprendio los virus se uso para infectar otras celulas.

Aislamiento del ADN viral a partir de las celulas infectadas:

El ADN que se empleo en la PCR con especificidad por las ITR se aislo como se detalla a continuacion. Las partfculas virales se liberaron del material viral en bruto mediante la aplicacion de ciclos repetidos de congelacion y descongelacion. Posteriormente, el ADN de las celulas huesped se removio por medio de un tratamiento con la ADNasa I. Las partfculas virales se destruyeron incubandolas con 10% de SDS y tratandolas con la proteinasa K. El ADN viral se purifico a continuacion usando el conjunto de elementos GeneClean Spin (de MP Biochemicals), y luego se lo uso en el analisis basado en la PCR.

Se uso el lisado en bruto para aislar el ADN que se empleana en el analisis de la secuencia de las ITR. Con este proposito, el ADN se aislo mediante el aislamiento de PEG, a partir de 20 ml del lisado celular en bruto, se sometio a lisis con diversos ciclos consecutivos de congelacion y descongelacion, y se trato con una ADNasa I (de Roche, a razon de 0.01 mg/ml) y una ARNasa T1 (de Roche, a razon de 10 U/ml) y con una inactivacion ulterior con NaCl (1 M). Las partfculas virales se precipitaron con PEG 6000 (de BDH iochemical) al 10% en hielo durante 1 hora, despues de lo cual se llevo a cabo una centrifugacion a 9000 x G. El producto obtenido se suspendio nuevamente en 1 ml de un amortiguador SM (que comprendio NaCl 0.1 M, MgSO4 8 mM, Tris HCl 50 mM, pH 7.5, y 0.002% de gelatina). Las protemas de la capside de los virus se destruyeron usando SDS al 10% y un tratamiento con la proteinasa K, y el ADN se extrajo sobre la base de una precipitacion con fenol y cloroformo. El ADN completo fue digerido con EcoRI (Ad26), con SphI (Ad48, Ad5), con AgeI (Ad49, Ad11) o con NheI (Ad50), y finalmente fue secuenciado en Baseclear, Leiden.

PCR con especificidad por las ITR

Debido a que las regiones de las ITR son ricas en AT, se usaron cebadores que comprendieron acidos nucleicos fijos (LNA) para asegurar que hubiera suficiente cebador unido al molde. Los cebadores se adquirieron en Eurogentech. Se usaron los cebadores que se detallan a continuacion, donde las minusculas representan los nucleotidos de los LNA. El cebador ori.ITR fue CatcaTcaATAATATACC, SEQ ID N° 6. El cebador para la ITR alternativa de Ad35 fue CtatcTatATAATATACC, SEQ ID N° 7. El cebador inverso para la ITR izquierda de Ad35 fue

CTAAGTAGTTCCGTGAGAAAAG, SEQ ID N° 8. El cebador directo para la ITR derecha de Ad35 fue

GGTACGTCACATCCCATTAA, SEQ ID N° 9. El cebador inverso para la ITR izquierda de Ad5 fue

CACTTTTGCCACATCCGTC, SEQ ID N° 10. El cebador directo para la ITR derecha de Ad5 fue

CCCACGTTACGTCACTTC, SEQ ID N° 11. Los productos de la PCR se analizaron en un gel de agarosa.

Cinetica de la replicacion sobre la base de una qPCR

La cinetica de la replicacion se analizo infectando celulas 293 y PER.C6 utilizando 1000 partfculas virales por celula durante 3 horas, para luego aplicar un lavado. La presencia de las partfculas virales en las celulas y en el sobrenadante se analizo en el punto de tiempo posterior a la infeccion que se indica, sobre la base de un procedimiento de VP qPCR. Con este fin, las celulas infectadas se lisaron con Triton X-100 (de Sigma) al 0.5%, se incubaron a -80°C durante 1 hora y se congelaron.

Se puso en practica un procedimiento de qPCR con especificidad por el promotor del CMV, que estaba presente en todos los vectores basados en adenovirus que se usaron, mediante el uso de la mezcla maestra para expresar genes de Applied Biosystems, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia de la combinacion de cebador y sonda directos para el CMV fue TGGGCGGTAGGCGTGTA, SEQ ID N° 12. La secuencia de la combinacion de cebador y sonda inversos para el CMV fue CGATCTGACGGTTCACTAAACG, SEQ ID N° 13. La secuencia de la sonda ViC 5' fue TGGGAGGTCTATATAAGC-MGB-NFQ-3', SEQ ID N° 14. Todas estas secuencias se adquirieron en Applied Biosystems. Para determinar la cantidad de partfculas virales que hubo en cada muestra, se genero una curva de calibracion.

Alineamiento de las secuencias

Las secuencias de las ITR de los adenovirus se obtuvieron sobre la base de una busqueda BLAST. El alineamiento se creo con el software CLC. Los alineamientos se basaron en secuencias publicadas. Sin embargo, para algunas de estas secuencias publicadas, todavfa no se habfan secuenciado espedficamente las ITR. En lugar de esto, se asumio que las secuencias se habfan conservado entre los subtipos, lo que puede haber dado como resultado una representacion excesiva de la secuencia conservada CATCATCA. Cuando hubo diversas secuencias publicadas

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para un adenovirus de un serotipo determinado, solamente se las incluyo cuando se observaron diferencias entre ellas en los 8 nucleotidos terminales.

Ejemplo 1. Deteccion de una secuencia de una ITR alternativa durante la produccion de un vector apropiado como vacuna basado en el adenovirus Ad35 en celulas PER.C6

Para generar un vector basado en Ad35 que fuera util como vacuna, a partir del cual pudieran expresarse los antigenos Ag85A, Ag85B y TB10.4 de Mycobacterium tuberculosis, como los descritos con anterioridad (WO 2006/053871, Radosevic et al., 2007, Infect. Immun., 75: 4105-4115), se transfectaron celulas PER.C6 con plasmidos linealizados, lo que dio como resultado el virus Ad35.TBS, que podfa replicarse en las celulas PER.C6.

Antes de la elaboracion, mediante dos purificaciones en placa consecutivas, se aseguro que el virus inicial derivara de un unico clon geneticamente estable. La identidad del virus obtenido se caracterizo por medio de una PCR y una transferencia Western en distintas etapas del proceso de elaboracion. Mas aun, el virus fue secuenciado por completo antes de usarlo como virus inicial en la elaboracion a gran escala.

La secuencia del genoma fue estable y de esta manera identica a la del genoma codificado por los plasmidos de rescate, con la excepcion de los 8 nucleotidos terminales de la ITR derecha e izquierda. La secuencia codificada por el plasmido, CATCATCA, que de aqrn en adelante se conocera como la secuencia de la ITR original, sufrio una modificacion que dio como resultado la secuencia CTATCTAT, que de aqrn en adelante se conocera como la secuencia de la ITR alternativa. Vale decir, hubo cambios en 6 nucleotidos con relacion a la secuencia original del plasmido. Este es un descubrimiento inesperado, ya que los genomas de los adenovirus que se emplean en los vectores que han de usarse como vacunas suelen ser muy estables.

Para investigar con mayor detalle la inconsistencia entre las secuencias terminales de las ITR, se secuenciaron las ITR en diversas etapas durante el proceso de elaboracion del vector que actua como vacuna. Con este analisis, se determino que la secuencia de la ITR original todavfa estaba presente cinco pasajes despues de la purificacion en placas (VPN 5). Sin embargo, tambien se detecto una secuencia con modificaciones en el pasaje numero 5 de un proceso de elaboracion diferente, lo cual es indicativo de la presencia de secuencias mixtas. Con la excepcion de las modificaciones en los 8 nucleotidos terminales que se han mencionado, la secuencia remanente no presento inconsistencias. En el VPN 6, se observaron secuencias mixtas, que probablemente comprendieron aproximadamente la misma proporcion de la secuencia original y de la secuencia alternativa, la cual se transformo en una secuencia alternativa distinguible en el VPN 7.

Ejemplo 2. Puede observarse heterogeneidad a nivel de las ITR tanto en diversos vectores basados en Ad35 como en el virus salvaje

Para determinar si el fenomeno que se habfa observado era insignificante y para examinar la frecuencia del cambio de la secuencia de la ITR original, CATCATCA por la secuencia de la ITR alternativa, CTATCTAT, se analizaron cuatro placas que se habfan originado en el mismo procedimiento de rescate de virus. Despues de realizar una serie de pasajes repetidos, fue posible observar el cambio por la secuencia de la ITR alternativa entre los virus que se propagaron en todas las placas.

Ademas, fue posible observar la presencia de ITR alternativas durante el pasaje de vectores Ad35 a partir de los cuales se expresaban diversos transgenes, independientemente de la presencia de una supresion parcial en el promotor pIX (tabla II).

Por otro lado, no solamente se observaron secuencias mixtas entre los vectores que estuvieron basados en Ad35, sino tambien en el virus Ad35 salvaje, con lo que puede excluirse la posibilidad de que se haya producido un artefacto con el vector.

Ejemplo 3. La secuencia de la ITR alternativa es estable en Ad35.TBS despues de 10pasajes virales

Para determinar si el cambio por la secuencia de la ITR alternativa es estable durante varios pasajes virales, se construyeron vectores Ad35.TBS que comprendieron ITR con una secuencia original o con una secuencia alternativa, es decir, Ad35.TBS con la ITR original y Ad35.TBS con la ITR alternativa. Estos virus fueron sometidos a una serie de pasajes en celulas PER.C6 y la secuencia de los 8 nucleotidos terminales de la ITR se monitoreo sometiendo los virus en cada pasaje a un analisis de PCR. Para distinguir la secuencia original de la secuencia alternativa, en la PCR se emplearon conjuntos de cebadores diferentes, con los que pudiera amplificarse de manera espedfica la secuencia de la ITR original o la secuencia de la ITR alternativa. Mediante el analisis de cada pasaje viral, se determino que hubo una disminucion en la proporcion de la secuencia original entre el VPN 3 y el VPN 6. En el caso del vector Ad35.TBS que comprendio la ITR original, la secuencia alternativa surgio durante el VPN 6 (figura 1A) y se conservo durante los 4 pasajes restantes (figura 1A). Durante los 10 pasajes virales que se realizaron con el vector Ad35.TBS que comprendio la ITR alternativa, que habfa sido creado de manera artificial, con la PCR solamente pudo detectarse la secuencia alternativa (figura 1B), con lo que pudo excluirse que hubiera ocurrido una reversion a la secuencia original o que esta parte del genoma hubiera sido generalmente inestable.

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Por otra parte, la presencia de vectores Ad35 completamente identicos, con la excepcion de la presencia de ITR con secuencias originales o alternativas, tambien dio como resultado un desarrollo superior para la secuencia de la ITR alternativa, lo que es indicativo de que esta secuencia presenta una ventaja a nivel de crecimiento sobre la secuencia de la ITR original.

Debido a que se detecto el cambio de la secuencia de la ITR original por la secuencia de la ITR alternativa en Ad35, que es un vector del grupo B, tambien se analizaron vectores Ad5 vados con la ITR original y con la ITR alternativa (Ad5 es un vector del grupo C). En contraste con los resultados que se obtuvieron con el vector Ad35, el vector Ad5 no presento cambios en la secuencia de la ITR. Por el contrario, en el se conservaron las ITR originales durante 10 pasajes virales (figura 1C). Sin embargo, tal como se ilustra en el ejemplo 8 mas adelante, despues de una mayor cantidad de pasajes con el vector Ad5, tambien fue posible hallar una secuencia alternativa. Mas aun, los vectores Ad5 que se generaron de manera artificial, que comprendieron ITR alternativas, fueron estables durante 10 pasajes virales y no presentaron reversiones a la secuencia de la ITR original (figura 1D).

Ejemplo 4. Un vector Ad35 que comprende la secuencia de la ITR alternativa puede inducir un CPE posterior a la infeccion antes que un vector Ad35 que comprende la ITR original

Debido a que se habfa observado un desarrollo superior entre los virus Ad35 que comprendfan ITR alternativas en sus genomas, se asumio que estas confenan ventajas a nivel de la replicacion, en comparacion con las ITR originales. Para confirmar esto, se analizo la cinetica del crecimiento de diversos virus Ad35 que comprendfan ITR con secuencias originales o alternativas. Debido a que el CPE que se induce con una infeccion de adenovirus en lmeas complementarias que comprenden la region E1 es una indicacion apropiada de la velocidad de la replicacion, se infectaron primero celulas 293 y se observo el efecto citopatico 24, 48, 72 y 96 horas despues de la infeccion, con una MOI de 100 o 1000 partfculas virales por celula. 24 horas despues de la infeccion, no se observo CPE alguno con ninguna de las MOI que se han mencionado. Sin embargo, 48 horas despues de la infeccion, fue posible observar un CPE avanzado para el vector Ad35.dE1 que comprendio la ITR alternativa, con cualquiera de las MOI. 96 horas despues de la infeccion, se desarrollo un CPE completo. En contraste, solamente se observo un CPE limitado para el vector Ad35.dE1 que comprendio la ITR original en los puntos de tiempo posteriores a la infeccion que se han indicado.

Ejemplo 5. La secuencia de la ITR alternativa le confiere una ventaja a nivel de la replicacion al genoma

Con el proposito de cuantificar la diferencia sospechada en la cinetica de la replicacion, se utilizo un analisis de qPCR para determinar la replicacion del genoma en diversos puntos de tiempo posteriores a la infeccion. Mas espedficamente, se infectaron celulas 293 con 1000 partfculas virales por celula, se las liso y se las sometio a un analisis de qPCR, mediante el uso de un ensayo TaqMan que habfa sido concebido para detectar el promotor CMV, que estaba presente en el vector viral. En la figura 2 puede observarse que, si bien los vectores Ad35 que comprendieron la ITR original y la ITR alternativa alcanzaron una titulacion identica, de aproximadamente 1010 partfculas virales por ml, en el ultimo punto de tiempo que se analizo (90 horas despues de la infeccion), el vector Ad35 que comprendio la ITR original presento un crecimiento demorado. En los primeros puntos de tiempo posteriores a la infeccion, el vector Ad35 que comprendio la ITR alternativa se caracterizo por una curva de amplificacion del genoma mas pronunciada, de modo que la fase estacionaria se alcanzo mas temprano que en el caso del vector Ad35 que comprendio la ITR original (figura 2A). En contraste, la cinetica de la replicacion del vector Ad5 fue identica, independientemente de la presencia de una ITR alternativa u original (figura 2B).

La ventaja a nivel de la replicacion del genoma que se observo para el vector Ad35 que comprendio la ITR alternativa, en contraste con el vector Ad5 que comprendio la ITR alternativa, se corroboro en celulas PER.C6 (figuras 2C-D), donde originalmente se habfa determinado que la version alternativa del genoma presentaba un desarrollo superior.

Ejemplo 6. La secuencia de la ITR alternativa esta representada en secuencias publicadas de adenovirus humanos

Se determino si la secuencia de la ITR alternativa tambien estaba presente en secuencias publicadas de adenovirus. Con este proposito, se alinearon los nucleotidos 1-8 de diversas ITR humanas y no humanas publicadas. Los virus humanos comprendieron predominantemente la secuencia original, CATCATCA, por lo que se los clasifico como poseedores de “secuencias humanas conservadas” (tabla I).

Adicionalmente, se identificaron secuencias que difenan de la secuencia CATCATCA en 1-6 nucleotidos, y se las denomino “secuencias variables de los adenovirus humanos”. La secuencia predominante entre las “secuencias variables” fue la secuencia alternativa CTATCTAT, que tambien habfa sido identificada durante el pasaje de los vectores derivados de Ad35. Mediante el alineamiento de las secuencias no humanas (tabla I), se demostro que la secuencia CATCATCA es la mas frecuente. Una vez mas, fue posible hallar secuencias alternativas, por ejemplo, la secuencia alternativa GATGATGT, que se habfa identificado con anterioridad en adenovirus aviares. La mayona de las secuencias publicadas de las ITR fueron consistentes con el modelo de la replicacion de Jong (de Jong et al., 2003, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 272: 187-211; King y van der Vliet, 1994, EMBO J., 13: 5786-5792), donde hay

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una repeticion pequena, de dos, tres o cuatro nucleotidos, que es imprescindible para el mecanismo de regresion que ocurre durante el inicio de la replicacion.

En la tabla I se detallan secuencias publicadas de ITR que no pueden proveer una representacion equilibrada de las secuencias de ITR naturales. En algunos casos, los nucleotidos terminales de las ITR no han sido secuenciados, y simplemente se asume que son CATCATCA. Adicionalmente, antes de la secuenciacion, los adenovirus pueden desarrollarse a partir de muestras de diagnostico, durante varios ciclos de replicacion, lo que puede dar como resultado cambios a nivel de los nucleotidos. Independientemente de esto, vale destacar que la secuencia original CATCATCA puede detectarse en la naturaleza incluso despues de un penodo prolongado de evolucion concurrente entre el virus y el huesped, por lo que la secuencia alternativa CTATCTAT podna resultar mas beneficiosa en un cultivo de celulas que bajo condiciones naturales.

Ejemplo 7. Los pasajes repetidos dan como resultado un cambio en la secuencia de la ITR en diversas tfneas de celulas

Para descartar la posibilidad de que el cambio de la secuencia de la ITR original por la secuencia de la ITR alternativa que se habfa observado fuera un fenomeno propio de la lmea de celulas complementarias que comprendfan la region E1, que era la lmea de celulas que se habfa empleado en el proceso de produccion, se realizaron pasajes con un virus Ad35 salvaje que comprendfa la secuencia de la ITR original, CATCATCA, en diversos tipos de celulas. El rescate de Ad35, por tanto, se llevo a cabo usando plasmidos que comprendfan el genoma salvaje completo de Ad35, en celulas A549, HEK293, PER.C6, Hep2, HeLa y MRC5, que fueron seleccionadas como representantes de una amplia variedad de tipos celulares, ya que se trata de lmeas de celulas que derivan de diversos tejidos, tales como el epitelio o los fibroblastos, que se originan en carcinomas o que presentan ongenes diferentes, y que se caracterizan por diversos niveles de ploidfa (tabla III).

Sobre la base de los resultados que se detallan en la tabla III, puede concluirse que hubo un cambio por la ITR alternativa en el VPN 10 entre las lmeas de celulas asistentes HEK293 y PER.C6, aunque, en pasajes posteriores, tambien se observo un cambio o una combinacion a nivel del fenotipo de las otras lmeas de celulas que se analizaron.

Ejemplo 8. Un pasaje extendido da como resultado heterogeneidad a nivel de las ITR o un cambio completo por la secuencia de la ITR alternativa en la mayoria de los vectores basados en adenovirus que se analizaron

Se analizo la frecuencia del cambio por la secuencia alternativa CTATCTAT en vectores basados en adenovirus de diversos serotipos. En este contexto, se sometieron los vectores basados en adenovirus Ad26, Ad48, Ad49, Ad11(a), Ad50 y Ad5 a una serie de pasajes en celulas PER.C6, que se prolongaron hasta el VPN 15 despues de la purificacion en placas y se llevaron a cabo analisis de secuenciacion en el VPN 10 y en el VPN 15. Se incluyeron dos transgenes diferentes en los vectores de cada serotipo para excluir adicionalmente la posibilidad de que el efecto pudiera deberse a un transgen diferente.

Los resultados de este conjunto de experimentos se proveen en la tabla IV. Sorprendentemente, en todos los vectores que se analizaron, con la excepcion de Ad48, se determino que se produjo un cambio por la secuencia de la ITR alternativa o la adquisicion de un fenotipo mixto, lo cual podna ser una indicacion de una conversion en un pasaje viral ulterior. De manera consistente con lo que se habfa observado con anterioridad para Ad5, la secuencia de la ITR original se conservo hasta el VPN 10, sin embargo, fue posible observar una mezcla a partir del VPN 15. En contraste, los vectores derivados de Ad48 fueron los unicos en los que se conservo la secuencia de la ITR original hasta el VPN 15.

En cualquier caso, de acuerdo con la invencion, para obtener un mayor margen de seguridad, se sugiere introducir ITR con secuencias alternativas en todos los adenovirus recombinantes, incluso en aquellos basados en Ad5 o en Ad48. De esta manera, podra prevenirse el desarrollo potencial de heterogeneidad en los lotes, a causa de las mutaciones eventuales en los extremos del genoma que puedan ocurrir durante el cultivo de grandes volumenes o despues de una gran cantidad de pasajes. De esta manera, los genomas de esencialmente todas las partmulas de los adenovirus recombinantes en los lotes que se obtengan comprenderan la secuencia CTATCTAT de acuerdo con la invencion en el extremo 5'. Mas aun, cuando se rescaten vectores basados en adenovirus que comprendan una ITR con una secuencia alternativa como la que se ha mencionado, podra acelerarse el proceso de produccion de vectores que actuan como vacuna.

Tabla I. Secuencias de los extremos 5' de adenovirus de diversos serotipos A. Secuencias humanas

Secuencias humanas conservadas

AdV humano 5

L43079 CAT CAT CA C

AdV humano 2

ADRCG

AdV humano 1

AF534906

AdV humano 6

FJ349096

AdV humano 57

HQ003817

AdV humano 17

HQ910407 D

AdV humano 19

AB448774

AdV humano 22

FJ619037

AdV humano 26

EF153474

AdV humano 28

FJ824826

AdV humano 36

GQ384080

AdV humano 36

DQ900900

AdV humano 46

AY875648

AdV humano 48

EF153473

AdV humano 49

DQ393829

AdV humano 53

AB605244

AdV humano 54

AB448770

AdV humano 56

HM770721

AdV humano 3

AY599836 B

AdV humano 7

AY601634

AdV humano 11a

FJ597732

AdV humano 14

AY803294

AdV humano 34

AY737797

AdV humano 35

AY128640

AdV humano 55

FJ643676

AdV humano 4

AY599837 E

AdV humano 40

L19443 F

AdV humano 41

DQ315364

AdV humano 31

AM749299 A

AdV humano 18

ADRP1IT1

Secuencias humanas variables

AdV humano 10

ADRJITR-1 .T. D

AdV humano 19

ADRITRAA ..A T.A T.

AdV humano 8

AB448769 .TA TC. AT

AdV humano 29

AB562587 .TA TC. AT

AdV humano 53

AB605246 .TA TC. AT

AdV humano 15

AB562586 .TA TC. AT

AdV humano 37

AF271992 .TA TC. AT

AdV humano 9

AF099665 .TA TC. AT B

AdV humano 3

DQ086466 .TA TC. AT

AdV humano 7

HQ659699 .TA TC. AT

AdV humano 7

AY495969 .TC TC. AT

AdV humano 16

AY601636 T.. .T

AdV humano 21

AY601633 .TA TC. AT

AdV humano 50

AY737798 ..A TCA AT

AdV humano 4

AY458656 .TC TC. .T E

AdV humano 4

AY594253 .TA TC. AT

AdV humano 41

HM565136 G.G TG. TG F

AdV humano 18

GU191019 .C. ATC T. A

AdV humano 12

AC_000005 .C. ATC T.

Consenso CAT CAT CA

B. Secuencias no humanas

AdV de simio 48

FJ025929 CAT CAT CA Mast-AdV

AdV de simio 29

FJ025916

AdV de simio 28.1

FJ025914

AdV de simio 41.1

FJ025913

AdV de simio 32

FJ025911

AdV de simio 46

FJ025930

AdV de simio 27.1

FJ025909

AdV de simio 33

FJ025908

AdV de simio 35.1

FJ025912

AdV de simio 44

FJ025899

AdV de simio 31.1

FJ025906

AdV de simio 42.1

FJ025903

AdV de simio 40.1

FJ025907

AdV de simio 34

FJ025905

AdV de simio 45

FJ025901

AdV de simio 43

FJ025900

AdV de simio 50

HQ241820

AdV de simio 49

HQ241819

AdV de simio SA7P

X01027

AdV de simio 8

ADRITR1

AdV de simio 7

DQ792570

AdV de simio 1

AY771780

AdV de simio 30

FJ025920

AdV de simio 23

AY530877

AdV de simio 39

FJ025924

AdV de simio 22

AY530876

AdV de simio 36

FJ025917

AdV de simio 26

FJ025923

AdV de simio 37.2

FJ025919

AdV de simio 24

AY530878

AdV de simio 36

FJ025917

AdV de simio 25

FJ025918.1

AdV de simio 25

AF391496 .C. TC. TC

AdV de simio 21

AC000010 .CA TCA TC

AdV equino 1

AEEADITR1

AdV porcino 3

AF083132

AdV porcino 5

AF221544-1

AdV bovino 2

AF252854-1

AdV bovino 1

ADRITRB

AdV bovino 3

AF030154

AdV bovino 4

AF036092 TCA T.

AdV bovino 5

AF238881 TCA T.

AdV bovino 10

AF238882

AdV canino 2

CAU77082

AdV canino 1

AC_000003

AdV murino 1

ADRITRRA

AdV murino 3

EU835513

AdV murino 2

NC_014899 .T. .T.

AdV de arbusto

AF258784

Mastadenovirus

ADRFRG G.. G.. GT

AdV ovino 7

OAU40839 .TA TTC AT

AdV de pavo A

AC_000016 ..A TCA AT Si-AdV

AdV de pavo A

AC_000016-1 ..A TCA AT

AdV de pavo 1

NC_014564 .T

AdV de sapo 1

NC_002501 ..A TCA AT

AdV aviar 1

AAU46933 G.. G.. GT Avi-AdV

AdV aviar 1

AY421750S1 .T

AdV aviar 1

AY421750S2 A.C .G

AdV aviar C

NC_015323 .T

AdV aviar 9

AF083975 .T

AdV aviar E

NC_014969 .T

AdV de pato A

AC_000004 .TC ATG TC At-AdV

Consenso CAT CAT CA

Tabla II. ITR de diversos virus rAd35 despues de un pasaje

Virus

Promotor pIX Tamano del genoma (kbp) CL o CL Z ITR

Ad35.TBS

+ 32.4 2 Mixta

Ad35.Ebo.GP.Z

+ 32.4 2 Alternativa

Ad35.Ebo.GP.S/G

+ 32.4 2 Mixta

Ad35.CS

+ 31.5 1 Mixta

Ad35.CS

- 31.3 1 Original

Ad35.Luc

+ 32.0 1 Mixta

Ad35.Luc

- 31.9 1 Mixta

Ad35.eGFP

+ 31.1 1 Mixta

Ad35.eGFP

- 30.9 1 Mixta

Ad35 vado

+ 30.4 1 Alternativa

Ad35 vado

- 30.2 1 Alternativa

Ad35.SIV-Gag

+ 31.9 1 Alternativa

Ad35 salvaje

NA 34.8 1 Mixta

Tabla III. Cambio de la ITR en diversas lmeas de celulas

Ad35wt

Tipo de celula Origen Ploidfa VP10 VP15

HEK293

E1 asistente, rinon Epitelial Diploide Alternativa -

PER.C6

E1 asistente, retina Epitelial Hipotriploide Alternativa -

A549

Carcinoma de pulmon Epitelial Hipotriploide Mixta Mixta

HeLa

Adeno-carcinoma de cuello cervical Epitelial Hipotriploide - Alternativa

Hep2

Conta-minante de HeLa Epitelial Diploide Original Mixta

MRC5

Pulmon normal Fibroblastos Diploide - Mixta

Tabla IV. Cambio de la ITR en diversos vectores

Vector

Subgrupo VPN 10 VPN 15

Ad26.eGFP

D Mixta Alternativa

Ad26.Luc

D Mixta Alternativa

Ad48.eGFP

D Original Original

Ad48.Luc

D Original Original

Ad49.eGFP

D Alternativa ND

Ad49.Luc

D Mixta Alternativa

Adll.Env

B Alternativa ND

Adll.SivGag

B Alternativa ND

Ad50.eGFP

B Alternativa ND

Ad50.Luc

B Mixta Alternativa

Ad5.eGFP

C Original Mixta

Ad5.Luc

C Original Mixta

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Crucell Holland B.V.

Vellinga, Jort Custers, Jerome

<120> Lotes de adenovirus recombinantes con extremos alterados <130> 0198 EP P00 PRI <160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 1

gtgactggtg agtactc 17

<210> 2 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 2

gaccacctag gctgac 16

<210> 3 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 3

ttaattaatc gatctatcta tataatatac cttatag 37

<210> 4 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 4

gatctatcta tataatatac cttatagatg gaatgg 36

<210> 5 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> cebador <400> 5

attatataga tagatcgatt aattaattcg aaccc

<210> 6 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 6

catcatcaat aatatacc 18

<210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 7

ctatctatat aatatacc 18

<210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 8

ctaagtagtt ccgtgagaaa ag 22

<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 9

ggtacgtcac atcccattaa 20

<210> 10 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 10

cacttttgcc acatccgtc 19

35

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 11

cccacgttac gtcacttc 18

<210> 12 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 12

tgggcggtag gcgtgta 17

<210> 13 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 13

cgatctgacg gttcactaaa cg 22

<210> 14 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador <400> 14

tgggaggtct atataagc 18

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende partfculas de adenovirus recombinante, donde el adenovirus recombinante comprende un transgen y es un adenovirus humano recombinante de serotipo 5, 11a, 26, 34, 35, 49 o 50 o un adenovirus de simio recombinante, caracterizada por que los genomas de al menos 99% de las partfculas de adenovirus en dicha composicion comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'.
2. 2. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el adenovirus recombinante es un adenovirus humano recombinante de serotipo 5, 26, 35, 49 o 50.
3. 3. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 2, donde el adenovirus recombinante es un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 o 35.
4. 4. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la cual es una composicion farmaceutica.
5. 5. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el adenovirus recombinante carece de al menos una porcion de la region E1.
6. 6. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos 1 x 107, preferiblemente al menos 1 x 108, preferiblemente al menos 1 x 109 y preferiblemente al menos 1 x 1010 partfculas de adenovirus recombinante.
7. 7. Un metodo para preparar un lote de partfculas de adenovirus recombinante, donde los genomas de al menos 99% de las partfculas de adenovirus en el lote comprenden secuencias de nucleotidos identicas en los extremos 5' y donde el adenovirus comprende un transgen, comprendiendo el metodo:

   a) poner en practica un paso de clonacion molecular para cambiar los extremos 5' de origen natural del genoma de un adenovirus que no sean CTATCTAT por extremos 5' alterados que como nucleotidos terminales comprendan la secuencia de nucleotidos CTATCTAT;

   b) propagar el adenovirus recombinante que comprende los extremos 5' alterados en celulas huesped; y

   c) cosechar el adenovirus recombinante para obtener un lote de partfculas de adenovirus recombinante, donde los genomas de al menos 99% de las partfculas de adenovirus en el lote comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'.
8. 8. Un metodo para preparar un lote de partfculas de adenovirus recombinante, donde los genomas de al menos 99% de las partfculas de adenovirus en el lote comprenden secuencias de nucleotidos identicas en los extremos 5' y donde el adenovirus comprende un transgen, comprendiendo el metodo:

   a) poner en practica un procedimiento para purificar un adenovirus en una placa, donde el adenovirus recombinante es un adenovirus humano recombinante de serotipo 5, 11a, 26, 34, 35, 49 o 50 o un adenovirus de simio recombinante, de manera tal de aislar un adenovirus o adenovirus recombinante, a partir de una unica placa, donde dicho adenovirus o dicho adenovirus recombinante comprende la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5' de su genoma;

   b) propagar un adenovirus recombinante que se obtuvo a partir de una unica placa en el paso a) en celulas huesped; y

   c) cosechar el adenovirus recombinante para obtener un lote de partfculas de adenovirus recombinante, donde los genomas de al menos 99% de las partfculas de adenovirus en el lote comprenden la secuencia de nucleotidos CTATCTAT como nucleotidos en el extremo 5'.
9. 9. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, donde el lote comprende al menos 1 x 107 partfculas de adenovirus recombinante.
10. 10. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde el adenovirus recombinante es un adenovirus humano recombinante de serotipo 5, 26, 35, 49 o 50.
11. 11. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde el adenovirus recombinante es un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 o 35.
12. 12. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, donde el adenovirus recombinante carece de al menos una porcion de la region E1.
13. 13. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, que tambien comprende purificar el adenovirus recombinante.
14. 14. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, que tambien comprende formular el adenovirus recombinante en una composicion farmaceutica.
15. 15. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-14, donde el paso b) se lleva a cabo en un 5 biorreactor.