ES2581387T3 - Una composición antimicrobiana - Google Patents

Abstract

Una composición antimicrobiana que comprende (i) un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o más de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa donde el sistema proporciona una liberación de peróxido de hidrógeno en dos fases en la que (a) el peróxido de hidrógeno producido de forma endógena estable en almacenamiento está biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberación inmediata; y (b) la liberación sostenida de peróxido de hidrógeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratación del sistema; y (ii) el antibiótico Clindamicina, Cefradina o Cefuroxima; o el agente antifúngico seleccionado de entre uno o más de Clotrimazol, Ciclopiroxalomina, Terbinafina y/o Ketoconazol.

Description

DESCRIPCION

Una composicion antimicrobiana.

5 Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una composicion antimicrobiana mejorada que comprende una fuente de peroxido de hidrogeno y uno o mas agentes antimicrobianos.

10 Antecedentes de la invencion

Existen muchas composiciones antimicrobianas ya conocidas. Por ejemplo, dichas composiciones antimicrobianas incluyen tratamientos convencionales tales como antisepticos y antibioticos. Sin embargo, existen muchos efectos adversos potenciales y reales asociados al uso clfnico de dichas composiciones antimicrobianas. Los efectos 15 adversos asociados al uso de antibioticos incluyen reacciones alergicas, destruccion de la microflora benefica, desarrollo de especies resistentes de microorganismos, supresion inmunitaria, crecimiento excesivo de Candida albicans y flora intestinal indeseable, desarrollo del sfndrome de fatiga cronica y perdida de nutrientes que puede dar como resultado un estado de deficiencia de nutrientes. El grado al que estos efectos adversos ocurren depende normalmente de la concentracion de antimicrobiano administrado.

20

Uno de los mas importantes de estos efectos secundarios adversos, es la aparicion de resistencia a los antibioticos. La continua aparicion de patogenos resistentes a los antibioticos es una grave amenaza para el control de infecciones y proporciona una razon convincente para desarrollar nuevas terapias disenadas para superar este problema. Sera deseable cualquier tratamiento que supera o mejora este efecto adverso significativo.

25

Ademas, los efectos secundarios asociados al uso de antibioticos potentes y potencialmente toxicos no pueden pasarse por alto. De nuevo, sera deseable cualquier tratamiento que supere o mejore estos efectos adversos.

Otro tratamiento convencional usado en el tratamiento de acne vulgar leve a moderado, es la combinacion de un 30 antibiotico y peroxido de benzoflo. Ahora existe una considerable bibliograffa sobre el uso de peroxido de benzoflo para el tratamiento del acne y aumento de eficacia en combinacion con antibioticos, especialmente eritromicina. Se ha descubierto que esta terapia de combinacion proporciona una mejor eficacia sobre los agentes individuales, con el potencial de reducir la aparicion de cepas resistentes de P. acnes. (Bowman, S., Gold, M., Nasir, A., y Vamvakias, G. Comparison of clindamycinlbenzoyl peroxide, tretinoin plus clindamycin, and the combination of 35 clindamycin/benzoyl peroxide and tretinoin plus clindamycin in the treatment of acne vulgaris: a randomized, blinded study. Journal of Drugs in Dermatology, Sept-Oct, 2005).

Ademas, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4.497.794 se refiere al uso de peroxido de benzoflo y eritromicina. Todos los ejemplos en esta patente de Estados Unidos se refieren al uso de peroxido de benzoflo y 40 eritromicina en solitario. Otras publicaciones, en relacion con el uso de peroxido de benzoflo y eritromicina incluyen Burkhart CN, Specht K Neckers D, "Synergistic activity of benzoyl peroxide and erythromycin"; Skin Pharmacol Appl Skin Physiol.: 2000 Sep-Oct;13(5): 292-6 y Eady eA, Farmery MR, Ross JI, Cove JH, Cunliffe WJ. "Effects of benzoyl peroxide and erythromycin alone and in combination against antibiotic-sensitive and -resistant skin bacteria from acne patient": Br J Dermatol. sept. de 1994; 131(3): 331-6. Ambas de estas publicaciones indican que la 45 combinacion de peroxido de benzoflo y eritromicina no es sinergica y que el aumento de beneficio se debe al peroxido de benzoflo que ademas mata a las cepas resistentes a eritromicina. Finalmente, la publicacion de patente internacional N° 96/10998 se refiere a un tratamiento topico para el acne que comprende un peroxido y antibiotico de la familia de lincomicina. De nuevo, todos los ejemplos en esta patente se refieren al uso de peroxido de benzoflo en solitario.

50

Otros tratamientos antimicrobianos incluyen geles que contienen plata, compuestos que contienen metales pesados y soluciones de peroxido de hidrogeno y sustancias farmaceuticamente activas naturales y sinteticas. Sin embargo, incluso estos tratamientos tienen efectos secundarios, por ejemplo, los altos niveles peroxido de hidrogeno tienen un efecto toxico. Ademas, el peroxido de hidrogeno en solucion es tfpicamente inestable y es diffcil de proporcionar un 55 sistema de administracion sostenida para este material.

Adicionalmente, recientemente ha vuelto a resurgir el interes por la eficacia terapeutica de la miel, en concreto, en el ambito de la curacion de heridas. Como producto natural, la miel ofrece una alternativa atractiva a los tratamientos convencionales. Muchos tipos diferentes de miel tienen actividad antimicrobiana. Durante los ultimos anos, se ha

reconocido que la miel de Manuka tiene una actividad superior a la de la mayorfa de las mieles. Se conoce la miel de Manuka para el tratamiento de infecciones de heridas y por su actividad antibacteriana. Sin embargo, la miel natural como agente antibacteriano tiene varias desventajas. En primer lugar, la miel natural esta compuesta por una mezcla diversa de compuestos organicos e inorganicos identificados y no identificados a diversas concentraciones. A este 5 respecto, se puede esperar demostrar un grado de variabilidad que puede ser inaceptable para su uso en muchas aplicaciones clfnicas. En segundo lugar, la miel se usa principalmente para aplicacion topica. Esto se debe a que cuando la miel se diluye, por ejemplo, mediante absorcion en el intestino, esta se vuelve demasiado diluida para tener alguna actividad detectable. Finalmente, la miel es un producto natural, que tendra muchos compuestos adicionales presentes y algunos de estos compuestos pueden dar lugar a una reaccion alergica al aplicarse.

10

Por lo tanto, por una amplia diversidad de razones diferentes, los tratamientos antimicrobianos convencionales disponibles hasta la fecha tienen muchas desventajas. Asf, por lo tanto, existe la necesidad de mejores sistemas antimicrobianos que superen las desventajas que se han mencionado anteriormente.

15 Estados de la invencion

De acuerdo con un primer aspecto general de la presente invencion, se proporciona una composicion antimicrobiana mejorada que comprende una fuente de peroxido de hidrogeno y uno o mas agentes antimicrobianos para su uso en terapia, idealmente en el tratamiento y/o profilaxis de infecciones microbianas.

20

Idealmente, la composicion antimicrobiana mejorada esta en forma de una terapia de combinacion o preparacion combinada. La fuente de peroxido de hidrogeno puede ser peroxido de hidrogeno per se o un medio para generar peroxido de hidrogeno de forma ideal en forma de un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende una enzima oxido-reductasa, un sustrato para la enzima oxido reductasa, azucares 25 adicionales y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa y el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

30

De acuerdo con un segundo aspecto general de la presente invencion, se proporciona una composicion antimicrobiana mejorada que comprende una fuente de peroxido de hidrogeno en forma de un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema 35 proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema. La composicion antimicrobiana mejorada de este aspecto de la invencion tambien puede usarse en el tratamiento y/o profilaxis de una infeccion microbiana. 40 De esta manera, el sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento puede usarse como la composicion antimicrobiana per se o en combinacion con uno o mas agentes antimicrobianos.

De acuerdo con la invencion, se proporciona una composicion antimicrobiana que comprende (i) un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o 45 mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema; y (ii) el antibiotico Lincosamida o 50 Cefalosporina; o el agente antifungico seleccionado de entre uno o mas de Clotrimazol, Ciclopiroxolamina, Terbinafina y/o Ketoconazol.

En una realizacion de la invencion, se proporciona una terapia de combinacion antimicrobiana que comprende (i) un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D- 55 glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema; y (ii) el antibiotico Lincosamida

o Cefalosporina; o el agente antifungico seleccionado de entre uno o mas de Clotrimazol, Ciclopiroxolamina, Terbinafina y/o Ketoconazol; para su uso en terapia.

En otra realizacion de la invencion, se proporciona una terapia de combinacion antimicrobiana que comprende (i) un 5 sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D- glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al 10 menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema; y (ii) el antibiotico Lincosamida o Cefalosporina; o el agente antifungico seleccionado de entre uno o mas de Clotrimazol, Ciclopiroxolamina, Terbinafina y/o Ketoconazol; para su uso en el tratamiento simultaneo, separado o secuencial de una infeccion microbiana.

15 En una realizacion adicional de la invencion, se proporciona una composicion antimicrobiana o terapia de combinacion en forma de una preparacion combinada.

En una realizacion alternativa de la invencion, se proporciona una composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada, donde la combinacion de la fuente de peroxido de hidrogeno y el agente antibiotico o 20 antifungico proporciona una eficacia mayor que la eficacia de cualquier agente administrado en solitario.

En una realizacion alternativa de la invencion, se proporciona una composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada, donde la combinacion de la fuente de peroxido de hidrogeno y el agente antibiotico o antifungico proporciona una eficacia mayor que la eficacia de cualquier agente administrado en solitario.

25

En otra realizacion de la invencion, se proporciona una composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada donde la fuente de peroxido de hidrogeno es un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde una cantidad eficaz de glucosa oxidasa esta presente a una 30 actividad de al menos 10 U por 100 g del sistema; donde D-glucosa esta presente del 20 % al 85 % en peso en base al peso del sistema total; uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa estan presentes del 10 % al 70 % en peso en base al peso del sistema total; el agua esta presente del 10 al 20 % en peso en base al peso del sistema total; el sistema tiene un pH de 4 a 8; y el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el 35 sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

En otra realizacion de la invencion, se proporciona una composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada donde la infeccion microbiana es una infeccion bacteriana o fungica, preferiblemente una infeccion 40 cutanea, una infeccion de unas, mastitis, MRSA u otra infeccion resistente a antibioticos.

En una realizacion adicional de la invencion, se proporciona una composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada donde la fuente de peroxido de hidrogeno y/o el agente antibiotico o antifungico estan adaptados para administracion topica, enteral o parenteral.

45

En una realizacion alternativa de la invencion, se proporciona una composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada donde la fuente de peroxido de hidrogeno y el agente antimicrobiano estan adaptados para administracion topica.

50 La invencion se refiere adicionalmente al uso de las composiciones, terapias de combinacion o preparaciones combinadas de la invencion en un metodo para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una infeccion microbiana.

Descripcion detallada de la invencion

55

En la memoria descriptiva, se entendera que los terminos "antimicrobiano" o "antibacteriano" se usan de forma intercambiable en el presente documento e incluyen actividad biocida o bioestatica frente a diversos tipos de microorganismos, incluyendo, pero sin limitacion, bacterias, hongos, virus, levaduras, microorganismos parasitos o patogenos y/o mohos.

En la memoria descriptiva, tambien se entendera que la expresion "un agente antimicrobiano" incluye todos los farmacos antimicrobianos quimioterapeuticos, preferiblemente antibioticos o agentes antifungicos, antivfricos y antiparasitarios.

Tambien se entendera que la expresion "composicion antimicrobiana" incluye tanto la fuente de peroxido de hidrogeno per se (tal como el sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que se describe a continuacion) como la terapia de combinacion/preparacion combinada que comprende la fuente de peroxido de hidrogeno y el agente antimicrobiano.

10

En esta memoria descriptiva, se entendera que la expresion "fuente de peroxido de hidrogeno" incluye tanto peroxido de hidrogeno per se como un medio para generar peroxido de hidrogeno. En una realizacion preferida, la fuente de peroxido de hidrogeno es el sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento (el "sistema antimicrobiano") que se describe a continuacion.

15

En la memoria descriptiva, el termino "en peso", "porcentaje de su peso" o "% p/p" se refiere al peso de la composicion o sistema final. Estos valores p/p son intercambiables con p/v.

Terapia de combinacion

20

De acuerdo con un primer aspecto general de la presente invencion, se proporciona una composicion antimicrobiana mejorada que comprende una fuente de peroxido de hidrogeno y uno o mas agentes antimicrobianos.

La fuente de peroxido de hidrogeno puede ser peroxido de hidrogeno per se o un medio para generar peroxido de 25 hidrogeno.

El agente antimicrobiano puede ser uno o mas antibioticos antibacterianos, uno o mas antibioticos antifungicos, uno o mas agentes antiparasitarios y/o uno o mas agentes antivfricos.

30 Idealmente, la fuente de peroxido de hidrogeno y uno o mas agentes antimicrobianos estan presentes como parte de una terapia de combinacion o preparacion combinada. En esta memoria descriptiva, la expresion "terapia de combinacion" se usa ampliamente. La terapia de combinacion puede producirse en una forma farmaceutica que comprende ambos principios activos o en dos formas separadas, incluyendo comprimidos, capsulas, polvos, mezclas o soluciones. Por lo tanto, la expresion "terapia de combinacion" incluye tanto la administracion simultanea, 35 secuencial como separada de la fuente de peroxido de hidrogeno y el agente o agentes antimicrobianos.

Por consiguiente, los principios activos de la terapia de combinacion pueden administrarse sustancialmente al mismo tiempo o en diferentes momentos.

40 Por lo tanto, la expresion "terapia de combinacion" incluye la combinacion de agente o agentes antimicrobianos y la fuente de peroxido de hidrogeno como una unica entidad, es decir, una preparacion combinada. De esta manera, la fuente de peroxido de hidrogeno puede combinarse, integrarse o secuestrarse con el agente o agentes antimicrobianos durante o despues de la fabricacion.

45 Como alternativa, el agente o agentes antimicrobianos pueden envasarse por separado a la fuente de peroxido de hidrogeno para su administracion concomitante. En esta situacion, tambien puede proporcionarse un conjunto de instrucciones para su administracion concomitante. Por ejemplo, la invencion tambien proporciona un medio mediante el cual el uso sistemico de agentes antimicrobianos para tratar una infeccion topica puede aumentarse por el tratamiento topico simultaneo de la infeccion con la invencion.

50

Se entendera que la composicion antimicrobiana de la invencion debe estar presente en una cantidad terapeuticamente eficaz para eliminar o inhibir o controlar el crecimiento de los microorganismos que se tratan. Sin embargo, tambien es posible usar una menor cantidad de agente antimicrobiano debido al efecto sinergico o aditivo entre el agente antimicrobiano y el peroxido de hidrogeno. Se ha descubierto sorprendentemente que, en algunos 55 casos, la composicion antimicrobiana de la invencion tiene una mayor eficacia antimicrobiana que la conseguida por los componentes individuales en solitario. Este efecto va mas alla de un efecto de combinacion/aditivo y se observa tras una reduccion en la concentracion de los agentes antimicrobianos individuales presentes en la composicion, indicando que la concentracion reducida de componentes individuales no afecta a la actividad antimicrobiana e indicando inesperadamente que la actividad antimicrobiana de la composicion de la invencion esta de hecho

mejorada. Se concluye que el aumento de la eficacia de la composicion antimicrobiana de la invencion es resultado de una accion ventajosa, es decir, algun nivel de sinergia, entre el peroxido de hidrogeno y el agente antimicrobiano. De esta manera, la composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada de la invencion proporciona una eficacia mayor que la eficacia de cualquier agente administrado en solitario.

5

En particular, cuando se uso una fuente de peroxido de hidrogeno en combinacion con ciertos agentes antibioticos y antifungicos (incluyendo, pero sin limitacion, lincosamidas (tal como Clindomicina) o cefalosporinas (primera o segunda generacion, tal como Zinacef® o Velocef® (Cefuroxima o Cefradina respectivamente)), se observo un efecto sinergico. Esta es una de las principales ventajas de la invencion. Este efecto inesperado proporciona una 10 ventaja significativa sobre las composiciones antimicrobianas de la tecnica anterior y proporciona una terapia mejorada para el tratamiento de infecciones microbianas.

Ventajosamente, este aspecto de la invencion tambien proporciona un medio por el que la concentracion de un antimicrobiano puede reducirse al combinarse con peroxido de hidrogeno para el tratamiento de infecciones 15 microbianas. Por ejemplo, la composicion de la invencion tiene distintas ventajas donde el uso de antimicrobianos toxicos esta indicado medicamente ya que la cantidad de antimicrobiano toxico puede reducirse.

Finalmente, ventajosamente, se sostiene que el constituyente de peroxido de hidrogeno de la invencion proporciona un medio por el que los organismos resistentes antimicrobianos pueden adquirir de nuevo sensibilidad 20 antimicrobiana. Es probable que la eficacia antimicrobiana no especffica del peroxido de hidrogeno afecte de forma negativa al modo de resistencia del organismo resistente antimicrobiano. La resistencia a los antimicrobianos esta mediada generalmente por la disminucion de la permeabilidad celular, un eflujo activo de antimicrobiano, la inactivacion enzimatica del antimicrobiano, la modificacion del sitio receptor de antimicrobianos y la sfntesis de una ruta metabolica resistente. La toxicidad aleatoria no especffica de peroxido de hidrogeno puede proporcionar un 25 medio por el cual se pueden superar los mecanismos de resistencia. Este es un efecto importante y sorprendente de la invencion y lo importante es que no se limita a combinaciones donde se ha demostrado que se produce sinergia.

Otra aplicacion ventajosa y significativa de este aspecto de la invencion es la eliminacion de las biopelfculas, donde las bacterias encerradas en capas limosas son menos susceptibles a los antibioticos y han estado implicadas en 30 infecciones persistentes. Los ensayos ya in vitro sobre biopelfculas con yodo muestran inhibicion, y el peroxido de hidrogeno tambien ofrece potencial para la alteracion de las biopelfculas y, en consecuencia, un aumento de la susceptibilidad a los antibioticos presentes en la invencion. El desarrollo de las biopelfculas es de gran importancia en el tratamiento de la fibrosis qufstica y en el cuidado de heridas. (Costerton, J. W., Stewart, P. S, y Greenberg, E, P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 1999; 284 (5418): 1318-22/Kunisada, T., 35 Yamada, K., Oda, S. y Hara, O. Investigation on the efficacy of povidone-iodine against antiseptic-resistant species. Dermatology 1997; 195 Comp. 2: 14-8/Presterl, E., Suchomel, M., Eder, M., Reichmann, S., Lassnigg, A., Wolfgang Graninger, W., y Rotter, M. Effects of alcohols, povidone-iodine and hydrogen peroxide on biofilms of Staphylococcus epidermidis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2007, 60(2): 417-420; doi: 10.1093/jac/dkm221).

40 Agente antimicrobiano

Como se ha definido previamente, el agente antimicrobiano del primer aspecto de la invencion incluye, pero sin limitacion, uno o mas antibioticos antibacterianos, uno o mas antibioticos antifungicos, uno o mas agentes antiparasitarios y/o uno o mas agentes antivfricos. Idealmente, se usaran agentes antimicrobianos o farmacos 45 antimicrobianos quimioterapeuticos disponibles en el mercado.

Los antibioticos que muestran propiedades beneficiosas al combinarse con una fuente de peroxido de hidrogeno incluyen lincosamidas y cefalosporinas.

50 Las lincosamidas (por ejemplo, lincomicina, clindamicina) son una clase de farmacos que se unen a la porcion 23s de la subunidad 50S de las ribosomas bacterianos e inhiben el alargamiento temprano de la cadena peptfdica inhibiendo la reaccion de la transpeptidasa. En este sentido, tienen una accion similar a los macrolidos.

Las cefalosporinas son una clase de antibioticos p-lactamicos. Los antibioticos p-lactamicos son una clase amplia de 55 antibioticos que incluyen derivados de penicilina, cefalosporinas, monobactamas, carbapenems, e inhibidores de p- lactamasa, es decir, cualquier agente antibiotico que contiene un nucleo p-lactama en su estructura molecular. Son el grupo mas ampliamente utilizado de los antibioticos. Velocef® (Cefradina) es un antibiotico de cefalosporina de primera generacion. Zinacef® (Cefuroxima) es un antibiotico de cefalosporina de segunda generacion que ha estado ampliamente disponible en Estados Unidos como Ceftin desde 1977.

Otros antibioticos que pueden usarse incluyen:

- Los macrolidos (tal como Klacid) son un grupo de farmacos (tfpicamente antibioticos) cuya actividad parte de la 5 presencia de un anillo macrolido, un anillo de lactona macrocfclico grande al que puede anadirse uno o mas

azucares desoxi, normalmente cladinosa y desosamina. Los anillos lactona tienen normalmente 14, 15 o 16 miembros. Los macrolidos pertenecen a la clase de los policetidos de productos naturales. La eritromicina es un antibiotico macrolido que tiene un espectro antimicrobiano similar a o ligeramente mayor que el de la penicilina, y a menudo se usa para personas que tienen alergia a las penicilinas. Para infecciones del tracto respiratorio, tiene 10 mejor cobertura de los organismos anormales, incluyendo micoplasma y legionelosis.

- Los antibioticos p-lactamicos (tal como amoxicilina) son una clase amplia de antibioticos que incluyen derivados de penicilina, cefalosporinas, monobactamas, carbapenems, e inhibidores de p-lactamasa, es decir, cualquier agente antibiotico que contiene un nucleo p-lactama en su estructura molecular. Son el grupo mas ampliamente utilizado de

15 los antibioticos. La flucloxacilina (INN) o floxacilina (USAN) es un antibiotico beta-lactana de espectro estrecho de la clase de las penicilinas. Se usa para tratar infecciones causadas por las bacterias Gram-positivas susceptibles. A diferencia de otras penicilinas, la flucloxacilina tiene actividad frente a organismos productores de beta-lactamasa, tal como Staphylococcus aureusas que es estable a beta-lactamasa. Sin embargo, es ineficaz frente a MRSA. Es muy similar a la dicloxacilina y estos dos agentes se consideran intercambiables. La flucloxacilina tambien esta disponible 20 bajo una diversidad de nombres comerciales, incluyendo Flopen (CSL) y Floxapen (GSK).

- Co-amoxiclav (Augmentine en Reino Unido) es un antibiotico de combinacion que contiene amoxicilina trihidrato, un antibiotico p-lactamico, con clavulanato de potasio, un inhibidor de p-lactamasa. Esta combinacion da como resultado un antibiotico con un espectro aumentado de accion y eficacia restaurada frente a bacterias resistentes a

25 amoxicilina productoras de p-lactamasa.

Ahora se ha demostrado especfficamente que dos clases de antibioticos demuestran efectos que van mas alla de un mero efecto de combinacion o aditivo con la fuente de peroxido de hidrogeno. Los antibioticos que muestran sinergia estan en dos clases generales 30

(a) Lincosamida (por ejemplo, Clindamicina); y/o

(b) Cefalosporinas (por ejemplo, Cefradina, Cefuroxima - Velocef® y Zinacef®);

35 Como se ha analizado anteriormente, la resistencia a los antimicrobianos esta mediada generalmente por la disminucion de la permeabilidad celular, un eflujo activo de antimicrobiano, la inactivacion enzimatica del antimicrobiano, la modificacion del sitio receptor de antimicrobianos y la sfntesis de una ruta metabolica resistente. La toxicidad aleatoria no especffica de peroxido de hidrogeno (ya se proporcione per se o se produzca por la fuente de peroxido de hidrogeno de la invencion) proporciona un medio por el que dichos mecanismos de resistencia 40 puedan superarse. Es probable que este efecto se extienda por todo el espectro de clases de antibioticos, mas alla de los ilustrados especfficamente anteriormente. Se espera generalmente que la medida del efecto varfe de un antibiotico a otro.

Ademas, la accion antimicrobiana no especffica potente del peroxido de hidrogeno per se o el peroxido de hidrogeno 45 producido por la fuente de peroxido de hidrogeno, tambien puede proporcionar un efecto adyuvante en combinacion con otros antimicrobianos, tales como agentes antivfricos y antifungicos en los que puede conseguirse una antimicrobiosis mejorada global (aditiva y/o sinergica).

Se proporcionan ejemplos de farmacos antivfricos adecuados en la tabla a continuacion:

Farmaco

Virus Tipo qufmico Diana

Vidarabina

Virus del herpes Analogo nucleosido Virus polimerasa

Aciclovir

Virus del herpes simple (VHS) Analogo nucleosido Virus polimerasa

Ganciclovir y Valcyte™ (valganciclovir)

Citomegalovirus (CMV) Analogo nucleosido Virus polimerasa (necesita virus UL98 cinasa para la activacion)

Inhibidores de la transcriptasa inversa

Retrovirus (VIH) Analogo Transcriptasa inversa

analogos de nucleosidos (NRTI): AZT (Zidovudina), ddl (Didanosina), ddC (Zalcitabina), d4T (Estavudina), 3TC (Lamivudina)

nucleosido

Inhibidores de transcriptasa inversa no nucleosidos (NNRTI): Nevirapina, Delavirdina

Retrovirus (VIH) Analogo nucleosido Transcriptasa inversa

Inhibidores de la proteasa: Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir

VIH Analogo peptfdico Proteasa del VIH

Ribavirina

Amplio espectro: VHC, VHS, sarampion, paperas, fiebre de Lassa Triazol carboxamida Mutagen de ARN

Amantadina/Rimantadina

Cepas de gripe A Amina tricfclica Protefna de matriz/hemaglutinina

Relenza y Tamiflu

Cepas A y B de gripe Mimetico de acido neuramfnico Inhibidor de neuraminidasa

Pleconarilo

Picomavirus Ciclico pequeno Union de bloques y sin revestimiento

Interferones

Hepatitis B y C Protefna Protefnas de defensa celular inactivadas

Tambien se ha demostrado que varias clases de antifungicos demuestran efectos que van mas alia de un efecto de combinacion/aditivo con el peroxido de hidrogeno. Los agentes antifungicos descubiertos para demostrar estos efectos incluyen Clotrimazol; Ciclopiroxalomina; Terbinafina; y/o Ketoconazol. Pueden contemplarse otros agentes 5 antifungicos.

Fuente de peroxido de hidrogeno

Como se ha definido previamente, la fuente de peroxido de hidrogeno del primer aspecto de la invencion incluye un 10 peroxido de hidrogeno per se o, como alternativa, puede ser un medio para generar una liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno.

De acuerdo con una realizacion, la fuente de peroxido de hidrogeno de la invencion comprende un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento ("el sistema antimicrobiano") que comprende una 15 enzima oxido-reductasa, un sustrato para la enzima oxido reductasa, azucares adicionales y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa y el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

20

Idealmente, la enzima oxidorreductasa del sistema se selecciona de entre uno o mas de los siguientes compuestos: glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, colesterol oxidasa, galactosa oxidasa, piranosa oxidasa, colina oxidasa, piruvato oxidasa, glicolato oxidasa y/o aminoacido oxidasa. Se entiende que cada enzima oxidorreductasa actua en un sustrato especffico. Los sustratos correspondientes para estas enzimas oxidorreductasa son D-glucosa, hexosa, 25 colesterol, D-galactosa, piranosa, colina, piruvato, glicolato y/o aminoacidos, respectivamente. Se entendera que se puede utilizar una mezcla de una o mas enzimas oxidorreductasa y uno o mas sustratos para las enzimas oxidorreductasa.

Preferiblemente, la enzima oxidorreductasa es glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, galactosa oxidasa y/o piranosa 30 oxidasa y el sustrato respectivo para la enzima oxidorreductasa es D-glucosa, hexosa, D-galactosa y/o piranosa.

De acuerdo con una realizacion preferida, la enzima oxidorreductasa es glucosa oxidasa y el sustrato es D-glucosa.

De acuerdo con otra realizacion preferida, la fuente de peroxido de hidrogeno es un sistema antimicrobiano e 35 inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que

(a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena y estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para una liberacion inmediata; y

5 (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

Las realizaciones preferidas adicionales en relacion con el sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento se tratan a continuacion.

10

Se entendera que el sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento puede usarse con el agente antimicrobiano que se ha definido anteriormente como parte de una terapia de combinacion o puede usarse por si mismo en el tratamiento profilaxis de infecciones microbianas.

15 Esta composicion antimicrobiana, que comprende el agente antimicrobiano y el sistema antimicrobiano que se ha definido anteriormente, de la invencion puede proporcionarse en muchas formas ffsicas diferentes (incluyendo, pero sin limitacion, preparaciones lfquidas, preparaciones solidas o semi-solidas) dependiendo del modo de uso.

Por ejemplo, se entendera que la composicion antimicrobiana de la invencion puede estar presente en muchas 20 formas de administracion diferentes. Estas formas incluyen, pero sin limitacion, formas adaptadas para su administracion, topica, enteral o parenteral. Se entendera que el agente antimicrobiano y/o el sistema antimicrobiano pueden estar en la misma o diferente forma de administracion. Por ejemplo, la fuente de peroxido de hidrogeno (el sistema antimicrobiano) puede estar en una forma adaptada para su uso topico, y el agente antimicrobiano (por ejemplo, un antibiotico) puede estar en una forma adaptada para su administracion topica, enteral o parenteral.

25

Las formas adecuadas para la administracion topica incluyen una pomada, crema, locion, aceite, linimento, lfquido y/o gel topico. Por ejemplo, la composicion antimicrobiana puede aplicarse, por via epicutanea, intranasal, a traves del ojo y/o gotas para los ofdos. Una realizacion particular proporciona la composicion antimicrobiana de la invencion en una forma adaptada para administracion intramamaria. En esta situacion, la composicion de la invencion puede 30 adaptarse para su administracion como parte de un sellador de pezones y un deposito intramamario administrado a traves del conducto del pezon. Las composiciones adicionales pueden estar adaptadas como tejidos, vendajes o apositos.

Otra forma adecuada para administracion topica incluye la composicion antimicrobiana de la invencion donde la 35 composicion antimicrobiana esta en una forma adaptada para su administracion a traves de una banda o bandas de pelfcula soluble. En esta situacion, la composicion antimicrobiana es soluble en su aplicacion.

La administracion enteral incluye, pero sin limitacion, la administracion oral. Otras formas de administracion oral incluyen supositorios y enemas. Las formas adecuadas para administracion oral incluyen una capsula, granulo, 40 capsula de gel, pastilla, pfldora, globulo, hilo dental, pasta de dientes, enjuague bucal, goma de mascar medicada, bandas de pelfcula soluble y/o formas adaptadas para su administracion como parte de un protector bucal. De acuerdo con una realizacion, la composicion antimicrobiana esta en una forma adecuada para una administracion controlada o de liberacion sostenida. Por ejemplo, la forma de administracion oral puede tener un revestimiento enterico para proporcionar una administracion controlada o de liberacion sostenida. Este aspecto de liberacion 45 sostenida es importante para el tratamiento de infecciones de Campylobacter en aves y el tratamiento de infecciones por Cryptosporidium en ganado.

Las formas de administracion parenteral incluyen, pero sin limitacion, inyeccion. Por ejemplo, la composicion antimicrobiana puede adaptarse para inyeccion mediante administracion intramamaria. Esto es particularmente util 50 para el tratamiento de la mastitis. La inyeccion intramamaria por este medio implica la inyeccion directa en el conducto del pezon mediante un tubo o jeringa con una boquilla del tamano apropiado, por ejemplo, aprox. 1,0 mm. En esta situacion, la inyeccion se dirige a una cavidad corporal o absceso.

Como se ha analizado anteriormente, se entendera que la fuente de peroxido de hidrogeno y el agente 55 antimicrobiano puede estar en diferentes formas de administracion. Por ejemplo, ambos pueden estar en una forma adecuada para su administracion topica. Opcionalmente, la fuente de peroxido de hidrogeno puede estar en una forma adecuada para su administracion topica y el agente antimicrobiano puede estar en una forma para administracion sistemica (por ejemplo, administracion enteral). A continuacion se destacan algunas realizaciones especfficas:

Por ejemplo, de acuerdo con una realizacion, la composicion antimicrobiana mejorada que comprende la fuente de peroxido de hidrogeno y uno o mas agentes antimicrobianos puede proporcionarse como parte de un aposito. Dichos apositos incluyen gasas, vendajes, pelfculas, geles, espumas - Lyofoam®, hidrocoloides - Granuflex®, alginatos - 5 Kaltostat® (Comvita), hidrogeles - Intrasite Gel® y pastas polisacaridas, granulos y gotas.

Ventajosamente, de acuerdo con otra realizacion, la composicion antimicrobiana de la presente invencion puede estar presente en una matriz en gel. Idealmente, la composicion antimicrobiana mejorada puede estar presente junto con una matriz de vendaje de heridas. Idealmente, la relacion de la composicion antimicrobiana con respecto a la 10 matriz de vendaje de heridas es aproximadamente 1:1, aunque se contemplan otras relaciones. La matriz del vendaje de heridas puede ser una matriz de colageno o una matriz de colageno-GAG (glicosaminoglicano).

De acuerdo con una realizacion adicional del primer aspecto de la invencion, se proporciona una composicion antimicrobiana de la invencion para su uso en un metodo de terapia.

15

De acuerdo con una realizacion, se proporciona la composicion antimicrobiana de la invencion para su uso en un metodo de tratamiento de una infeccion microbiana. Ademas, la composicion antimicrobiana tambien puede utilizarse en la prevencion profilactica de dichas infecciones microbianas.

20 Adicionalmente, y acuerdo con otra realizacion, se proporciona la composicion antimicrobiana de la invencion para la regeneracion y/o reparacion de tejidos y/o de celulas, incluyendo tejidos y/o celulas danados. Se entendera que el sistema o composicion farmaceutica de la invencion mejora una respuesta inmune mediante la estimulacion de la liberacion de interleucina-1 (IL-1). Las propiedades inmunoestimuladoras del sistema o la composicion farmaceutica de la presente invencion son responsables de la estimulacion, regeneracion y reparacion de los tejidos y/o celulas 25 danados. Se entendera que las celulas incluyen, pero sin limitacion, celulas de la piel.

La composicion antimicrobiana proporciona una doble funcionalidad tanto antimicrobiana como inmunoestimuladora. Ventajosamente, esta doble funcionalidad permite que el sistema se use para una amplia gama de aplicaciones terapeuticas y profilacticas.

30

Idealmente, la infeccion microbiana que puede tratarse usando la composicion antimicrobiana de la invencion es cualquier infeccion microbiana que puede tratarse por peroxido de hidrogeno y/o un agente antimicrobiano.

Se entendera que la infeccion microbiana puede estar causada por bacterias Gram positivas, bacterias Gram 35 negativas, bacterias acidorresistentes, virus, levaduras, microorganismos parasitos o patogenos y/o hongos. Las bacterias acidorresistentes incluyen Mycobacteria, incluyendo tuberculosis por micobacterias que causa TB. Dichas infecciones microbianas pueden causarse, pero sin limitacion, por Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, estreptococos beta hemolfticos del grupo A, Campylobacter coli, 40 Campylobacter jejuni, Staphylococcus Aureus resistentes a meticilina (MRSA), y/o tuberculosis por micobacterias.

Ademas, la infeccion microbiana puede estar causada por Cryptosporidium, un patogeno protozoo del Phylum Apicomplexa. Cryptosporidium causa una enfermedad diarreica denominada criptosporidiosis. Otros patogenos apicomplejos cubiertos por la presente solicitud incluyen el parasito Plasmodium de la malaria y el Toxoplasma, el 45 agente causante de la toxoplasmosis.

Ventajosamente, la composicion antimicrobiana puede usarse en el tratamiento o prevencion profilactica del MRSA u otros microorganismos y bacterias resistentes a los antibioticos. Por lo tanto, la invencion supera el problema de las cepas de microorganismos resistentes a los antibioticos de una forma no toxica.

50

Se trata de una importante ventaja de la presente invencion respecto a los sistemas convencionales. Para esta aplicacion, la composicion antimicrobiana puede administrarse por via topica, por ejemplo, en forma de una pomada topica, crema, locion, aceite, linimento, lfquido y/o gel. De forma opcional, la composicion antimicrobiana puede administrarse como parte de un tejido o toallita para la piel. Este tipo de administracion puede ser importante en la 55 prevencion profilactica de las infecciones de MRSa y del tipo MRSA.

La infeccion microbiana puede ser una infeccion bucal, ocular y/o de ofdos. La infeccion bucal puede ser una enfermedad de las encfas, ulceracion bucal y/o un trastorno en la higiene bucal. El trastorno de higiene bucal puede ser halitosis y/o gingivitis. Como alternativa, la infeccion bucal puede ser una infeccion de garganta o una infeccion

nasal, incluyendo infecciones por estafilococos nasales. Una infeccion ocular puede incluir conjuntivitis.

Otra afeccion es mastitis, incluyendo mastitis humeda y/o seca. La mastitis es una afeccion importante tanto en seres humanos como en animales y esta inicialmente causada por una infeccion microbiana a traves de la piel 5 danada, el bloqueo del conducto del pezon o el contacto con superficies infectadas. En particular, la mastitis tiene una tremenda importancia economica para la industria lactea. Por lo tanto, terapias alternativas a las terapias con antibioticos convencionales estan bajo evaluacion. Los microorganismos mas comunes causantes de la mastitis que se han descubierto incluyen: Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus, especies Streptococcus, Escherichia coli, Salmonella species, tuberculosis por Mycobacterium, mastitis fungica, Candida albicans y Cryptococcus 10 neoformans.

Se ha descubierto ventajosamente que la composicion antimicrobiana puede usarse en el tratamiento mejorado de la mastitis. Como se ha indicado previamente, el componente de peroxido de hidrogeno de la invencion puede tener una forma adaptada para la administracion intramamaria, por ejemplo, en una forma adaptada para la administracion 15 como parte de un sellador de pezones, tejido, toallita para la piel, vendaje o aposito o en una forma adecuada para inyeccion intramamaria. El componente antibiotico puede administrarse de manera convencional.

Adicionalmente, la infeccion microbiana puede ser una infeccion cutanea y/o de las unas.

20 Como alternativa, la composicion antimicrobiana puede usarse en el tratamiento de una infeccion por hongos en la piel y/o en las unas. Las infecciones por hongos en la piel incluyen pie de atleta y/o tina en humanos. En medicina veterinaria, las afecciones por hongos en la piel incluyen tina y el control de las infecciones zoonoticas de la piel. Las infecciones por hongos en las unas incluyen onicomicosis.

25 Adicionalmente, la composicion antimicrobiana puede usarse en el tratamiento de un trastorno de la piel. El trastorno de la piel puede ser acne, eczema y/o psoriasis y fascitis necrotizante. Ventajosamente, se ha descubierto que la composicion de la invencion es tan eficaz como las terapias anti-acne convencionales. Se entendera que el acne y el eczema tambien pueden tener un componente de infeccion microbiana que el sistema trata. Ademas, las infecciones microbianas secundarias de lesiones psoriasicas causadas por aranazos pueden tratarse por el sistema de la 30 presente invencion. El efecto inmunoestimulador del sistema de la presente infeccion tambien puede facilitar la regeneracion y la reparacion de los tejidos y celulas cutaneas danados.

De acuerdo con otra realizacion, la composicion antimicrobiana de la invencion puede utilizarse en un metodo de cuidado de las heridas, incluyendo el tratamiento de una herida y/o el tratamiento o gestion de la sepsis en heridas. 35 La herida puede ser una herida aguda, herida cronica, herida quirurgica, quemadura cronica y/o quemadura aguda. Este aspecto de la invencion implica tanto el tratamiento de una infeccion microbiana como la regeneracion/reparacion de tejidos y celulas danados, preferiblemente las celulas epidermicas. Una realizacion particular de este aspecto implica el uso de la composicion antimicrobiana en un metodo de la gestion del estoma. El estoma puede ser resultado de una colostomfa, ileostomfa, jejunostomfa y/o gastrostomfa. Otra realizacion implica el 40 tratamiento de ulceras diabeticas o heridas.

Como alternativa, la composicion antimicrobiana puede usarse en la prevencion profilactica de la sepsis en heridas.

De acuerdo con otra realizacion mas de la presente invencion, la composicion antimicrobiana puede usarse en la 45 eliminacion de biopelfculas.

Se entendera que la composicion antimicrobiana puede usarse tanto en aplicaciones de medicina veterinaria como humana.

50 Muchas de estas aplicaciones humanas especfficas se han definido previamente. Sin embargo, como se ha definido anteriormente, la composicion antimicrobiana puede usarse en el tratamiento de infecciones microbianas generales y el tratamiento o la gestion de trastornos cutaneos, cuidado de heridas y/o el tratamiento de quemaduras. El tratamiento o la gestion de heridas y de quemaduras pueden implicar tanto el efecto antimicrobiano como inmunoestimulador de la composicion antimicrobiana.

55

Las aplicaciones veterinarias importantes tambien implican el tratamiento de infecciones microbianas y el tratamiento o la gestion del cuidado de heridas y/o el tratamiento de quemaduras. Sin embargo, las afecciones especfficas incluyen la mastitis humeda y seca en el ganado u otros animales domesticos, infecciones cutaneas cronicas en perros (infecciones subcutaneas por estafilococos), otitis externa (infecciones del ofdo), cuidados bucales de los

animales, infecciones por campilobacter en polios, coliosis, infecciones microbianas entericas en cerdos, aves y ganado, infecciones por Cryptosporidium, eliminacion de infecciones zoonoticas, apositos, por ejemplo, eliminacion de quemaduras y el tratamiento de abscesos. La presente invencion presenta las ventajas particulares en el uso veterinario, permitiendo el tratamiento de infecciones microbianas sin necesidad de introducir antibioticos en la 5 cadena alimenticia.

De acuerdo con otra realizacion del primer aspecto de la invencion, se proporciona el uso de la composicion antimicrobiana de la presente invencion para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una infeccion microbiana o para la prevencion profilactica de una infeccion microbiana.

10

Adicionalmente, se proporciona el uso de la composicion antimicrobiana de la presente invencion para la fabricacion de un medicamento para la reparacion y/o regeneracion de tejidos y/o celulas danados. La composicion antimicrobiana de la presente invencion mejora idealmente una respuesta inmune estimulando la liberacion de interleucina-1 (IL-1) como se ha definido previamente.

15

Se entendera que la infeccion microbiana, el trastorno cutaneo, la herida u otro trastorno pueden tratarse por un metodo que comprende la administracion topica, enteral y/o parenteral del sistema o la composicion farmaceutica de la presente invencion, como se ha definido previamente.

20 De acuerdo con una cuarta realizacion del primer aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para tratar una infeccion microbiana y/o la reparacion y/o regeneracion de tejidos danados y/o de celulas de un paciente que comprende las etapas de aplicar una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion antimicrobiana de la invencion a una zona infectada del paciente, preferiblemente por modos de administracion topica, enteral y/o parenteral.

25

De acuerdo con un segundo aspecto de la invencion, se proporciona una fuente de peroxido de hidrogeno en forma de un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende una enzima oxidorreductasa, un sustrato para la enzima oxidorreductasa, azucares adicionales opcionales, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa, donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos 30 fases en la que

(a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena y estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para una liberacion inmediata; y

35 (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

Idealmente, el sustrato para la enzima oxidorreductasa esta presente hasta en un 90 % en peso, el agua esta presente hasta en un 20 % en peso en base al peso del sistema total, y el sistema tiene un pH de aproximadamente 40 4 a 8. Opcionalmente, los azucares adicionales comprenden uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa.

De esta manera, el sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que se ha definido anteriormente es una fuente de peroxido de hidrogeno como se ha definido previamente. Esta fuente de peroxido de hidrogeno puede usarse como una composicion antimicrobiana por si misma o en combinacion con uno o mas 45 agentes antimicrobianos como se ha definido previamente. Por lo tanto, se entendera que los siguientes pasos son aplicables a la fuente de peroxido de hidrogeno per se o la terapia de combinacion que se ha definido anteriormente. Ademas, las diversas formas de administracion y usos terapeuticos para la composicion antimicrobiana descrita en relacion con el primer aspecto de la invencion pueden aplicarse igualmente a este segundo aspecto, el sistema antimicrobiano en solitario.

50

Idealmente, la enzima oxidorreductasa del sistema se selecciona de entre uno o mas de los siguientes compuestos: glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, colesterol oxidasa, galactosa oxidasa, piranosa oxidasa, colina oxidasa, piruvato oxidasa, glicolato oxidasa y/o aminoacido oxidasa. Se entendera que cada enzima oxidorreductasa actua en un sustrato especffico. Los sustratos correspondientes para estas enzimas oxidorreductasa son D-glucosa, hexosa, 55 colesterol, D-galactosa, piranosa, colina, piruvato, glicolato y/o aminoacidos, respectivamente. Se entendera que se puede utilizar una mezcla de una o mas enzimas oxidorreductasa y uno o mas sustratos para las enzimas oxidorreductasa.

Preferiblemente, la enzima oxidorreductasa es glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, galactosa oxidasa y/o piranosa

oxidasa y el sustrato respectivo para la enzima oxidorreductasa es D-glucosa, hexosa, D-galactosa y/o piranosa.

Idealmente, la enzima oxidorreductasa es glucosa oxidasa y el sustrato es D-glucosa.

5 De acuerdo con una realizacion preferida, el sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que

10 (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena y estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para una liberacion inmediata; y

(b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

15

De acuerdo con otra realizacion preferida, se proporciona un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa

20 donde esta presente una cantidad eficaz de glucosa oxidasa en una actividad de al menos 10 U por 100 g del sistema;

donde D-glucosa esta presente de hasta aproximadamente el 90 %, preferiblemente de aproximadamente el 20 % al 85 % en peso en base al peso del sistema total;

25

uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa estan presentes de aproximadamente el 10 % al 70 % en peso en base al peso del sistema total;

el agua esta presente del 10 al 20 % en peso en base al peso del sistema total;

30

el sistema tiene un pH de aproximadamente 4 a 8; y

el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que

35 (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena y estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para una liberacion inmediata; y

(b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

40

De acuerdo con otra realizacion preferida mas de este aspecto general de la invencion, se proporciona un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento como se ha definido anteriormente que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa, maltosa y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa 45

donde la D-glucosa esta presente de aproximadamente el 26 % a aproximadamente el 43 % en peso en base al peso del sistema total;

la sacarosa esta presente entre el 0,5 % al 2,5 % en peso en base al peso del sistema total;

50

la fructosa esta presente entre el 30 % al 40 % en peso en base al peso del sistema total;

la maltosa esta presente entre el 5 % al 15 % en peso en base al peso del sistema total.

55 De acuerdo con otra realizacion preferida mas de este aspecto general de la invencion, se proporciona un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que contiene glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa, maltosa y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa y un agente tamponante opcional;

donde esta presente una cantidad eficaz de glucosa oxidasa en una actividad de al menos 10 U por 100 g del sistema;

donde la D-glucosa esta presente de aproximadamente el 33% a aproximadamente el 43 % en peso en base al peso 5 del sistema total;

la sacarosa esta presente entre el 0,5 % al 2,5 % en peso en base al peso del sistema total; la fructosa esta presente entre el 30 % al 40 % en peso en base al peso del sistema total;

10

la maltosa esta presente entre el 5 % al 15 % en peso en base al peso del sistema total;

el agua esta presente del 10 al 20 % en peso en base al peso del sistema total;

15 un agente tamponante opcional esta presente en una cantidad eficaz para conseguir un sistema con un pH de aproximadamente 4 a 8; y

el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que

20 (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena y estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para una liberacion inmediata; y

(b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

25

De forma ventajosa, esta fuente de peroxido de hidrogeno es un sistema de componente unico estable en almacenamiento que esta listo para su uso inmediato y proporciona una doble funcionalidad en cuando a la actividad antimicrobiana e inmunoestimuladora. Ademas, esta fuente de peroxido de hidrogeno tiene una eficacia aumentada en cuanto al efecto antimicrobiano e inmunoestimulador en comparacion con la miel de Manuka y los 30 antimicrobianos convencionales, tal como apositos de plata.

El efecto antimicrobiano de esta fuente de peroxido de hidrogeno esta mediado por la liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases que proporciona ventajosamente una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases de una manera regulada, definida y reproducible.

35

Una de las principales ventajas de esta fuente de peroxido de hidrogeno es que proporciona peroxido de hidrogeno estable en almacenamiento para su liberacion inmediata. Este deposito endogeno proporciona un peroxido de hidrogeno disponible de forma inmediata y un efecto antimicrobiano inmediato. Adicionalmente, despues de la rehidratacion, el sistema proporciona un segundo nivel de actividad de peroxido de hidrogeno que implica la 40 liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno durante al menos un periodo de veinticuatro o cuarenta y ocho horas.

Preferiblemente, el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento se encuentra biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg, preferiblemente 75 mg de peroxido de hidrogeno por litro o partes por millon para su liberacion inmediata. Sin embargo, se entendera que el nivel de peroxido de hidrogeno 45 producido de forma endogena que esta inmediatamente biodisponible en el sistema, dependera de la cantidad de enzima oxidorreductasa presente en el sistema. Por lo tanto, el nivel podrfa ser muy superior de 10 o 75 mg de peroxido de hidrogeno por litro del sistema si la actividad de enzima oxidorreductasa usada es elevada. Por lo tanto, si se aumenta la concentracion de enzima oxidorreductasa y/o el sustrato para la enzima oxidorreductasa, entonces el conjunto de peroxido de hidrogeno endogeno aumenta. Por ejemplo, se ha descubierto que aproximadamente 50 175 U de enzima oxidorreductasa por 100 g del sistema genera un conjunto endogeno de aproximadamente 10 mg de peroxido de hidrogeno por litro. Ademas, aproximadamente 1400 U de enzima oxidorreductasa por 100 g de sistema genera un conjunto endogeno de aproximadamente 25 mg de peroxido de hidrogeno por litro.

Este deposito endogeno inicial de peroxido de hidrogeno presente es estable en almacenamiento y permanece en el 55 sistema hasta que se libera el segundo nivel de peroxido de hidrogeno. En el contexto de esta solicitud, estable en almacenamiento significa que el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena se mantiene en el sistema durante un periodo de hasta aproximadamente 36 meses. Ademas, el sistema no se degrada, separa ni pierde actividad durante este periodo de tiempo. La caducidad esperada para el sistema en condiciones normales es de aproximadamente 36 meses. Ademas, el sistema, cuando se somete a esterilizacion, por ejemplo, mediante

irradiacion, no se deteriora en calidad ni actividad.

Tras el uso o aplicacion del sistema, se libera un segundo nivel de peroxido de hidrogeno cuando el nivel de peroxido de hidrogeno de liberacion sostenida producido en el momento de la rehidratacion del sistema es de al 5 menos 10 mg, preferiblemente de 20 mg de peroxido de hidrogeno por litro o partes por millon. De nuevo, el nivel de peroxido de hidrogeno de liberacion sostenida generado dependera de la cantidad de enzima oxidorreductasa y/o sustrato para la enzima oxidorreductasa presente en el sistema. Ventajosamente, se ha descubierto despues del periodo establecido y la posterior dilucion/rehidratacion que la cantidad de peroxido de hidrogeno de liberacion sostenida supera a la presente en la miel natural. Ademas, se ha descubierto ventajosamente que la liberacion 10 sostenida de mas peroxido de hidrogeno en el sistema se produce durante al menos un periodo de veintiocho, sino cuarenta y ocho horas.

De forma general, el efecto inmunoestimulador del sistema esta mediado por la interleucina-1. El sistema de la presente invencion promueve la liberacion de interleucina-1 (IL-1) de las celulas de la piel. IL-1 es una citocina 15 tambien secretada por macrofagos, monocitos y celulas dendrfticas. Se trata de una parte importante de la respuesta inflamatoria del cuerpo contra la infeccion. Aumenta la expresion de los factores de adhesion sobre las celulas endoteliales para permitir la transmigracion de leucocitos a los sitios de infeccion. Tambien actua sobre el centro termorregulador del cerebro que conduce a un aumento de la temperatura corporal en forma de fiebre. Por lo tanto, tambien se denomina pirogeno endogeno. El aumento de la temperatura corporal ayuda al sistema inmune corporal 20 a combatir la infeccion. Esta es la fase inicial de una respuesta inmune inflamatoria que aumenta la actividad antimicrobiana del sistema. La respuesta inflamatoria juega un papel central en la curacion de las heridas a traves de su defensa contra una posible infeccion y participando en la reparacion y regeneracion celular y tisular. El efecto antimicrobiano del sistema de la presente invencion se facilita y se complementa por el efecto inmunoestimulador que facilita la regeneracion y la reparacion de los tejidos y/o celulas danados.

25

De acuerdo con esta realizacion especffica de la invencion, la fuente de peroxido de hidrogeno proporciona un sistema que proporciona un nivel regulado, definido y reproducible de actividad antimicrobiana y demuestra una diferencia y aumento significativo en la actividad respecto a un producto de miel natural. Un beneficio adicional del sistema de la invencion es la capacidad para alterar la cantidad de principios activos y de excipientes, permitiendo 30 asf la produccion de una gama de formulaciones de diversas fuerzas y propiedades. Esto incluye la capacidad de optimizar el pH para el sitio de destino correspondiente. Ademas, el sistema permite un elevado nivel de control de calidad con respecto a la seguridad y la eficacia, consistencia en lotes, determinacion de la potencia, y un mayor control de impurezas, en el mantenimiento con los requisitos actuales de Buena Practica de Fabricacion (cGMP). Es aun una ventaja adicional del sistema que no provocara ninguna reaccion alergica, debido a su composicion 35 definida. Ventajosamente, esto permite unas instrucciones de etiquetado precisas como se requiere la normativa de la UE para los productos farmacologicos activos.

Cada uno de los componentes preferidos del sistema antimicrobiano e inmunoestimulador se analizan a continuacion.

40

Idealmente, la enzima oxidorreductasa, preferiblemente glucosa oxidasa, esta presente en el sistema con una actividad de al menos 10 U por 100 g del sistema. Generalmente hablando, una unidad (U) es la cantidad de enzima que provoca la oxidacion de un micromol de glucosa por minuto a 25 °C y un pH de 7,0. Se entendera que habra suficiente enzima oxidorreductasa presente para catalizar el sustrato y formar el peroxido de hidrogeno segun sea 45 necesario. Preferiblemente, la enzima oxidorreductasa esta presente en el sistema con una actividad de al menos 100 U, 1400 U o incluso 5600 U por 100 g del sistema.

Idealmente, la D-glucosa esta presente hasta aproximadamente el 90 %, preferiblemente de aproximadamente el 20 % al 85 %, preferiblemente del 25 al 65 %, preferiblemente del 28 al 48 %, mas preferiblemente del 25 al 45 %, 50 incluso mas preferiblemente del 25 % al 40 %, aun mas preferiblemente del 30 % al 40 %, todavfa mas preferiblemente del 30 al 35 % en peso en base al peso del sistema total. Opcionalmente, la D-glucosa puede estar presente de aproximadamente el 26 % a aproximadamente el 43 % en peso en base al peso del sistema total, o como alternativa, del 33 % a aproximadamente el 43 % en peso en base al peso del sistema total o como alternativa del 26 % a aproximadamente el 37 % en peso en base al peso del sistema total.

55

Idealmente, el agua se encuentra presente en el sistema a un nivel de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 % en peso en base al peso del sistema total. Mas preferiblemente, el agua puede estar presente a un nivel de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 15 % en peso en base al peso del sistema total. La cantidad de agua presente inicialmente en el sistema es un aspecto crucial de la invencion. La adicion de un

exceso de agua puede conducir a inestabilidad del sistema, dado que un exceso de agua puede dar lugar a la hidrolisis de la glucosa oxidasa, por lo que es importante que el agua unicamente este inicialmente presente dentro de los parametros definidos. Ademas, el sistema requiere suficiente agua para permitir la generacion de H2O2, facilitar la aplicacion y evitar la precipitacion de azucares durante el almacenamiento.

5

Idealmente, el sistema tiene un pH de aproximadamente 4 a 8, preferiblemente de 5 a 7, y mas preferiblemente de aproximadamente 5,5. El pH es importante ya que juega un papel primordial en muchos aspectos terapeuticos de la presente invencion, por ejemplo, la curacion de heridas y tambien asegura que la oxidorreductasa tenga unas condiciones correctas segun sea necesario para una actividad optima. Ventajosamente, el pH del presente sistema 10 puede ajustarse a un pH deseado segun se requiera para una aplicacion particular. Pueden usarse agentes tamponantes para manipular el pH. Opcionalmente, el sistema comprende adicionalmente un agente tamponante, preferiblemente acido carbonico-bicarbonato y/o acido fosforico/hidrogenofosfato disodico. Preferiblemente, el agente tamponante se disuelve previamente y reemplaza parte del agua del sistema. Se pueden usar diferentes concentraciones de agente tamponante en funcion del pH que se desee obtener.

15

Idealmente, uno o mas azucares adicionales en forma de sacarosa, fructosa y/o maltosa estan presentes de aproximadamente el 5 % al 80 %, del 10 % al 70 %, preferiblemente del 30,6 % al 61,5 %, aun preferiblemente del 20 % al 50 %, incluso mas preferiblemente del 30 % al 40 % en peso en base al peso del sistema total. Estos "azucares adicionales" son azucares no que no se incluyen por la expresion "sustrato para la enzima 20 oxidorreductasa". Los azucares adicionales tienen una funcion importante para garantizar que la viscosidad apropiada se mantenga y pueden actuar como un agente modificador de la viscosidad. Por ejemplo, un cambio en los indices de los azucares adicionales puede dar como resultado un aumento o disminucion correspondiente en la viscosidad del sistema. Idealmente, la fructosa esta presente de aproximadamente el 8 al 50 % p/p, preferiblemente del 25 al 45 %, la maltosa esta presente de aproximadamente el 4 al 15 % p/p, preferiblemente del 5 al 15 %, y la 25 sacarosa esta presente de aproximadamente el 0,5 al 3 % p/p, preferiblemente del 0,5 al 1,5 % en base al peso del sistema total. Idealmente, los azucares adicionales se encuentran presentes en combinacion con el sustrato para la enzima oxidorreductasa con un indice de azucares anadidos en el sustrato de aproximadamente 10:1 a 0,01:1, preferiblemente, de 3,5:1 a 0,05:1. El indice superior preferido de 3,5:1 se basa en un sustrato mfnimo para el contenido de enzima oxidorreductasa del 20 %, un contenido de agua mfnimo del 10 % y un contenido de azucar 30 adicional maximo del 70 %. El indice inferior preferido de 0,05:1 se basa en un sustrato maximo para el contenido de enzima oxidorreductasa del 85 %, un contenido mfnimo de agua del 10 % y un contenido de azucar adicional del 5 %.

De acuerdo con otra realizacion de este aspecto de la invencion, el sistema puede incluir adicionalmente al menos 35 un ingrediente modificador de la viscosidad. Idealmente, el agente modificador de la viscosidad se selecciona de entre uno o mas de los siguientes: Metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, Carbopol, alcohol polivinflico, polivinil pirrolidona, aceites vegetales hidrogenados, goma xantano y otras gomas naturales , polietilenglicoles (peso molecular bajo y alto), parafina (lfquida, semisolida y solida) y/o glicerol. Puede encontrarse el ingrediente modificador de la viscosidad ademas de los azucares 40 adicionales que se han mencionado anteriormente. Tambien se pueden utilizar otros agentes modificadores de la viscosidad convencionales.

Se entendera que los azucares anadidos y/o los ingredientes que modifican la viscosidad se anaden para proporcionar las propiedades ffsicas necesarias para la aplicacion especffica del sistema. Por ejemplo, si el sistema 45 se usa de forma topica, debe contar con la viscosidad suficiente para adherirse a la superficie aplicada. En esta situacion, puede ser deseable usar un ingrediente que modifique la viscosidad y/o modificar los indices presentes de azucares adicionales. En otra situacion, puede ser ventajoso modificar la viscosidad de tal forma que el sistema pueda ser una preparacion intramamaria eficaz.

50 De acuerdo con otra realizacion de esta aspecto de la invencion, el sistema puede comprender adicionalmente un agente tamponante, preferiblemente acido carbonico/bicarbonato y/o acido fosforico/hidrogenofosfato disodico.

De acuerdo con una realizacion preferida de este aspecto de la invencion, el sustrato para la enzima oxidorreductasa, preferiblemente D-glucosa, se encuentra presente del 20 al 85 % p/p, preferiblemente del 10 al 55 85 % p/p, y los azucares anadidos, preferiblemente uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, se encuentran presentes del 5 al 70 % p/p. Idealmente, con fructosa del 8 al 50 % p/p, maltosa del 4 al 15 % p/p y sacarosa del 0,5 al 3 % p/p. El pH del sistema sera de 5 a 7 y el agua esta idealmente presente del 10 % al 20 % v/v. Opcionalmente, el indice de fructosa:sustrato para la enzima oxidorreductasa:maltosa:sacarosa es de aproximadamente 1,5:4:2:1 a aproximadamente 3,5:4:1:0,1. Un indice preferido es aproximadamente 4,5:4:1:1,7.

De acuerdo con una realizacion preferida de este aspecto de la presente invencion, se proporciona un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa;

donde D-glucosa se encuentra presente hasta el 90 %, preferiblemente el 85 % en peso, y el agua se encuentra presente hasta el 20 % en peso e base al peso de la composicion total; el sistema tiene un pH de aproximadamente 4 a 8; y el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos etapas en la que

10 (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena y estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para una liberacion inmediata; y

(b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

15

Este sistema puede estar en muchas formas ffsicas diferentes, incluyendo, pero sin limitacion, preparaciones lfquidas, solidas o semisolidas. Para preparar formulaciones solidas o semisolidas, los ingredientes del sistema deberan manipularse para reducir el contenido de agua y aumentar el contenido de otros componentes.

20 El sistema puede estar en forma de una preparacion lfquida. Las preparaciones lfquidas incluyen, pero sin limitacion, un jarabe, pasta, pulverizacion, gota, pomadas, cremas, lociones, aceites, linimentos y/o geles. Un gel tfpico incluye un gel alcoholico tales como isopropanol, etanol o propanol y/o un hidrogel.

Como alternativa, el sistema puede estar en forma de una preparacion solida o semisolida. Las preparaciones 25 solidas o semisolidas incluyen, pero sin limitacion, capsulas, granulos, capsulas en gel, hidrogeles, pastillas, pfldoras y/o globulos. Pueden adoptarse otros medios usados para la administracion de medicamentos convencional, por ejemplo, se puede contemplar la administracion liposomal.

De acuerdo con este segundo aspecto de la invencion, el sistema puede usarse como un sistema antimicrobiano y/o 30 estimulador per se. Opcionalmente, el sistema puede usarse en combinacion con un agente antimicrobiano de acuerdo con el primer aspecto. Las formas de administracion y usos terapeuticos se tratan en relacion con el primer aspecto de la invencion. Se entendera que estas formas de administracion y usos terapeuticos pueden aplicarse igualmente a este segundo aspecto de la invencion al usarse en solitario.

35 Adicionalmente, el sistema como se define en relacion con el segundo aspecto de la invencion puede estar presente en forma de y para su uso como una composicion cosmetica junto con al menos un excipiente o adyuvante cosmetico adecuado. Dichos excipientes o adyuvantes cosmeticos se utilizan normalmente en este campo. Las aplicaciones cosmeticas incluyen diferentes aplicaciones de cuidado personal. Idealmente, para estos tipos de aplicaciones, el sistema se proporciona en una forma adaptada para aplicaciones topicas, aunque tambien se 40 contemplan otras formas de administracion que se han mencionado previamente. Dichas aplicaciones cosmeticas incluyen, pero sin limitacion, el tratamiento de afecciones del cabello o el tratamiento del olor corporal. Las afecciones del cabello incluyen la caspa y el sistema de la presente invencion elimina la piel muerta que se acumula en el cuero cabelludo y tambien puede tratar cualquier infeccion microbiana subyacente. El sistema puede utilizarse como una alternativa al uso convencional del peroxido de hidrogeno para el control del olor corporal y cualquier 45 infeccion microbiana asociada que cause o aumente un problema de olor corporal. Adicionalmente, y ventajosamente, la composicion o sistema antimicrobiano de la invencion puede usarse en el tratamiento de afecciones cutaneas, por ejemplo, acne, eczema, psoriasis, pie de atleta, infeccion por hongos en las unas.

Otra aplicacion cosmetica incluye el uso del sistema de la presente invencion en un metodo para blanqueamiento 50 dental. Un blanqueamiento dental convencional implica la aplicacion de una solucion de peroxido de hidrogeno o blanqueante en las superficies externas de los dientes, normalmente bajo la supervision de un dentista. Puesto que el peroxido penetra en los dientes, estos adquieren un color mas claro. Ventajosamente, el sistema de la presente invencion se proporciona en una forma adaptada para su administracion oral a traves de una banda o bandas de pelfcula soluble, hilo dental, pasta de dientes, goma masticable medicada, enjuague bucal y/o formas adaptadas 55 para su administracion a traves de un protector bucal. La administracion mediante estos medios permite aclarar el color de los dientes allf donde el peroxido de hidrogeno se libera del sistema de la presente invencion. El sistema de la presente invencion proporciona una liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno que es ideal para el blanqueamiento dental. Ademas, el sistema esta hidratado y se tolera facilmente, superando asf las desventajas asociadas a los sistemas de blanqueamiento convencionales que emplean peroxido de hidrogeno per se. Por lo

tanto, el sistema de la presente invencion puede utilizarse como una fuente de peroxido de hidrogeno alternativa para reemplazar el uso del blanqueador utilizado en un gran numero de aplicaciones para el cuidado personal.

El proceso para la fabricacion del sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento, como se 5 define en el primer y segundo aspectos de la invencion, y que comprende una enzima oxidorreductasa, un sustrato para la enzima oxidorreductasa y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa comprende las etapas de

a. calentar el agua a una temperatura de al menos 60 °C, preferiblemente de aproximadamente 75 °C a 95 °C;

10 b. anadir el sustrato para la enzima oxidorreductasa al agua caliente para formar una solucion de azucar en agua,

c. enfriar la solucion de azucar en agua hasta una temperatura por debajo de aproximadamente 40 °C para permitir la retencion de la actividad enzimatica;

15 d. anadir la enzima oxidorreductasa a la solucion de azucar en agua de la etapa (c) con agitacion para formar peroxido de hidrogeno a un fndice controlado predeterminado; y

e. enfriar la mezcla resultante de la etapa (d) hasta la temperatura ambiente para producir un sistema con peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento y biodisponible, a un nivel de al menos 20 10 mg por litro para una liberacion inmediata.

El tratamiento por calor no controlado de los azucares tiende a producir una caramelizacion que da como resultado una formulacion que adquiere una coloracion de amarillo a pardo. Para eliminar la caramelizacion, y producir asf un material transparente, se desarrollo el proceso de fabricacion que se ha mencionado anteriormente en el que el 25 orden de la adicion de los azucares y su disolucion por calentamiento se selecciona cuidadosamente para evitar el proceso de caramelizacion.

Preferiblemente, el proceso comprende la etapa adicional de anadir un agente tamponante al sistema para conseguir un pH de aproximadamente 4 a 8, preferiblemente de 5 a 7, mas preferiblemente 5,5. El agente tamponante puede 30 anadirse durante o despues de la etapa (d).

La enzima oxidorreductasa y los componentes adicionales de la invencion se han definido anteriormente.

Opcionalmente, los azucares adicionales, como se ha definido previamente, pueden anadirse al sistema en la etapa 35 (b). Idealmente, cuando se anaden uno o mas azucares, cada azucar se anade de forma secuencial despues de que el azucar anterior se haya disuelto completamente en el agua de la etapa (a).

De acuerdo con una realizacion de este aspecto de la invencion, los azucares se anaden en la siguiente secuencia: fructosa, glucosa, maltosa y sacarosa. Cada azucar se disuelve completamente en el agua por calentamiento a 40 aproximadamente 90 °C antes de anadir el siguiente azucar. Como alternativa, los azucares pueden prepararse como se ha indicado anteriormente al vacfo a aproximadamente -0,5 Bar. Este vacfo reduce el punto de ebullicion de los azucares a una temperatura de menos de 90 °C, evitando la decoloracion.

Opcionalmente, puede anadirse al menos un ingrediente modificador de la viscosidad al sistema durante el proceso 45 anterior. Idealmente, el ingrediente modificador de la viscosidad se selecciona de entre polietilenoglicol, glicerol y/o parafina lfquida. Pueden contemplarse ingredientes modificadores de la viscosidad convencionales.

Una vez que el sistema de la presente invencion se realiza de acuerdo con el procedimiento anterior, el sistema de la invencion puede envasarse en un recipiente opaco e impermeable. Esto evitara la produccion adicional de 50 peroxido de hidrogeno, que unicamente podra reiniciarse en una atmosfera aerobia.

El sistema generado de acuerdo con el proceso anterior puede ser una solucion lfquida, preparacion solida o semi- solida. Despues de la fabricacion, el sistema puede procesarse entonces en el producto final deseado, es decir, en una forma de administracion, tal como una forma solida o semi-solida adecuada para las diferentes formas de 55 administracion que se han analizado anteriormente. Por ejemplo, el sistema puede combinarse con un gel alcoholico para proporcionar una forma de gel adecuada para su administracion. Adicionalmente, el sistema puede incorporarse en diversos apositos disponibles en el mercado.

El sistema tambien puede someterse a una esterilizacion posterior a su fabricacion, por ejemplo, mediante

irradiacion. Dicha esterilizacion posterior a su fabricacion no tiene un efecto negativo sobre la fuente de peroxido de hidrogeno.

La invencion se ilustrara ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos con referencia a las siguientes 5 figuras, en las que:

La figura 1a muestra un perfil de inhibicion de la miel de Manuka en Staphylococcus aureus. La miel de Manuka muestra un perfil de inhibicion de segundo nivel. La actividad de inhibicion microbiana de primer nivel se produce entre diluciones del 50 % a aproximadamente el 6,25 %, y el segundo nivel de actividad de inhibicion microbiana se 10 produce en diluciones del 3,125 % a aproximadamente el 0,195 %;

la figura 1b muestra un perfil de inhibicion microbiana de la miel de Manuka de pH ajustado en Staphylococcus aureus. El ajuste del pH de la miel de Manuka de su pH natural de aproximadamente 4,0 a un pH de 6,8 no afecta al perfil de inhibicion microbiana;

15

la figura 1c muestra un perfil de inhibicion microbiana de la miel de Manuka de pH ajustado al que se ha anadido un exceso de catalasa en Staphylococcus aureus. El pH de la miel de Manuka ajustado a casi un pH neutro seguido de la adicion de catalasa en exceso altera el perfil de inhibicion microbiana de la miel. El primer nivel de inhibicion microbiana unicamente se ve ligeramente afectado pero el segundo nivel se ve considerablemente afectado, lo que 20 indica que el efecto antibacteriano en el segundo nivel es principalmente el resultado de la liberacion de peroxido de hidrogeno;

la figura 2 muestra un perfil de inhibicion microbiana de la miel de Manuka y una formulacion prototipo en Staphylococcus aureus. La formulacion prototipo demuestra una mayor actividad en comparacion con la de la miel 25 de Manuka;

la figura 3a muestra los resultados de un ensayo de inhibicion microbiana usando formulaciones prototipo a base de gel en Staphylococcus aureus, E. coli y Candida Albicans. Ambos geles a base de celulosa demuestran una disminucion de la estabilidad y la formulacion de gel a base de celulosa tampoco es tan activa como la formulacion 30 prototipo, tal como demuestran las zonas mas pequenas de inhibicion en los ensayos de difusion (comparese la figura 3a (geles) con la figura 3b (formulacion prototipo));

la figura 3b muestra los resultados de un ensayo de inhibicion microbiana de las formulaciones prototipo en Staphylococcus aureus. Son evidentes unas zonas grandes de inhibicion que indican actividad;

35

la figura 4a muestra los resultados del ensayo de inhibicion microbiana de la glucosa/glucosa oxidasa utilizando formulaciones con diferentes bacterias. Ensayos de inhibicion microbiana de 4 replicas de D-glucosa al 75 % con GOX al 0,5 % 5600 U/g en pocillos y su actividad antimicrobiana frente a varias bacterias diferentes. Estas formulaciones demuestran un grado limitado de actividad antibacteriana. Esta actividad se encuentra por debajo de 40 la observada con la formulacion antimicrobiana prototipo descrita en el ejemplo 2, como se pone de manifiesto por las zonas mas pequenas de inhibicion en los ensayos de difusion de pocillo/disco (comparese figura 4a (geles) con la figura 4b (prototipo));

la figura 4b muestra los resultados del ensayo de inhibicion microbiana de la formulacion prototipo frente a varias 45 bacterias diferentes;

la figura 5a muestra la actividad de A3IS que contiene concentraciones enzimaticas diferentes de GOX (5600 U/g) frente a S. aureus. Se midio la variacion del contenido de la glucosa oxidasa en A3IS y su efecto sobre el perfil de inhibicion. La actividad antibacteriana de A3IS aumenta proporcionalmente con respecto a la concentracion de 50 glucosa oxidasa. Se consigue un efecto antibacteriano sustancial a una concentracion enzimatica del 0,05 %;

la figura 5b muestra una generacion de H2O2 en el tiempo por A IS que contiene la enzima GOX Aldrich sigma al 0,5 % 5600 U/g diluida al 50 % (C1), al 25 % (C2), al 12,5 % (C3) o al 6,25 % en agua desionizada (DI). A3IS genera un aumento considerable de los niveles de peroxido de hidrogeno en comparacion con la miel de Manuka diluida al 55 50 % en agua DI;

la figura 5c muestra una generacion de H2O2 en el tiempo por A3IS. La produccion de H2O2 mediante A3IS con enzima GOX Aldrich sigma al 0,5 % 5600 U/g y diluido al 25 % en agua DI se mantiene durante un periodo de, al menos, 48 h;

la figura 5d muestra que la actividad antimicrobiana de A3IS aumenta con un aumento de la concentracion de la glucosa oxidasa. La potencia/eficacia depende de la concentracion de glucosa oxidasa en las formulaciones de A3IS. Los resultados muestran un aumento de la eficacia con una concentracion en aumento de glucosa oxidasa al 5 ensayarse en Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli;

la figura 6 muestra los resultados de estabilidad y retencion del deposito de H2O2 mediante A3IS durante un periodo de diez meses. El deposito de H2O2 disponible, producido mediante A3IS, es estable en almacenamiento. El nivel de H2O2 disponible presente se determino inicialmente inmediatamente despues de colocarse en tubos y nuevamente 10 despues de que haya transcurrido un periodo de 7 y 10 meses. No existe una evidencia de una perdida de H2O2 disponible dentro de la formulacion de A3IS, indicando asf la estabilidad. Se han obtenido resultados similares con bacterias diferentes.

la figura 7a muestra la actividad antimicrobiana en una formulacion de A3IS en Staphylococcus aureus durante 3 15 meses. La actividad antimicrobiana en una formulacion de A3IS en Staphylococcus aureus demuestra un nivel consistente de actividad antimicrobiana a traves del tiempo como se determina mediante las zonas de inhibicion medidas en cada punto temporal de muestreo y los resultados se representan en graficas utilizando limites de confianza del 95 % durante un periodo de 3 meses;

20 la figura 7b muestra la actividad antimicrobiana en una formulacion de A3IS en Staphylococcus aureus durante 14 meses. La actividad antimicrobiana en una formulacion de A3IS en Staphylococcus aureus demuestra un nivel consistente de actividad antimicrobiana a traves del tiempo como se determina por las zonas de inhibicion medidas en cada punto temporal de muestreo y los resultados se representan graficamente utilizando limites de confianza del 95 % durante un periodo de 14 meses;

25

la figura 8a muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra Staphylococcus aureus, el metodo de curva de eliminacion de NCCLS. Actividad antimicrobiana de A3IS contra Staphylococcus aureus, segun se determino mediante el metodo de curva de eliminacion de NCCLS. A3IS tiene una eficacia aumentada en comparacion con la miel de Manuka y una eficacia comparable con vendaje de plata;

30

la figura 8b muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra Staphylococcus aureus, un metodo especffico del fabricante de dispositivos medicos. Actividad antimicrobiana de A3iS contra Staphylococcus aureus, segun se determina mediante un protocolo especffico del fabricante para dispositivos medicos. A3IS tiene una eficacia aumentada en comparacion con la miel de Manuka y una eficacia comparable con el vendaje de plata;

35

la figura 8c muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra el grupo A de Streptococci beta hemolfticos. Resultados de un ensayo de inhibicion (repeticiones de 3 dfas) para A3IS, Medihoney® y gel de fenol al 10 % ensayado contra 5 aislados clfnicos del Grupo A de Streptococci beta hemolfticos. A3IS esta a un pH normal de 5,5 (material de ensayo A) y pH 7 (material de ensayo B), se incluye un control negativo de A3IS que no contiene GOX. 40 La formulacion de A3lS demuestra que es comparable con la eficacia in vitro del gel de fenol al 10 % y es superior a Medihoney®;

la figura 8d muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra Campylobacter. Resultados de un ensayo de inhibicion (repeticiones de 3 dfas) para A3IS, miel de Manuka y gel de fenol al 10% al ensayarse contra 5 aislados 45 clfnicos de Campylobacter spp. La formulacion de A3IS esta a un pH normal de 5,5 (material de ensayo A) y pH 7 (material de ensayo B), se incluye un control negativo de A3IS que no contiene GOX. Los resultados indican una eficacia in vitro anti-Campylobacter significativa y la superioridad de A3IS con respecto a la miel de Manuka;

la figura 9a muestra la actividad antimicrobinana de A3IS contra P. acnes. Actividad de A3IS contra P. acnes en 50 condiciones de incubacion variable: luz y oscuridad aerobia, luz y oscuridad anaerobios. A3IS demuestra un alto nivel de actividad contra P. acnes, lo que indica el potencial de los materiales para aplicacion topica en acne;

la figura 9b muestra la actividad antimicrobiana A3IS contra P. acnes. Se muestra la actividad antimicrobiana de A3IS y los productos comerciales anti-acne disponibles actualmente incluyen algunos productos comerciales que 55 incorporan los antibioticos. A3IS demuestra un alto nivel de actividad comparable con los productos anti-acne disponibles en el mercado, lo que indica el potencial de los materiales para aplicacion topica en acne;

la figura 10 muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra 8 cepas de MRSA durante tres dfas diferentes y en comparacion con un estandar de fenol al 10 % y con miel de Manuka. La formulacion de A3IS esta a un pH normal

de 5,5 (material de ensayo A) y pH 7 (material de ensayo B), se incluye un control negativo de A3IS que no contiene GOX. Los resultados demuestran una eficacia significativa de anti-MRSA in vitro y la superioridad de A3IS con respecto a la miel de Manuka y un control de gel de fenol al 10 %;

5 la figura 11a muestra una actividad antimicrobiana de A3IS contra MRSA en comparacion con un estandar de fenol al 10 % y con la miel de Manuka. La formulacion de A3IS esta a un pH normal de 5,5 (material de ensayo A) y pH 7 (material de ensayo B), se incluye un control negativo de A3IS que no contiene GOX. Los resultados demuestran una eficacia anti-MRSA in vitro significativa y la superioridad de A3IS con respecto a la miel de Manuka y un control del gel de fenol al 10 %;

10

la figura 11b muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra aislados clfnicos de mastitis en comparacion con antibioticos. Ensayo de inhibicion de A3IS (repeticiones de 3 dfas) en comparacion con cuatro antibioticos (vancomicina, estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol) al ensayarse contra 22 aislados clfnicos de organismos de Staphylococcus aureus que provocan mastitis. A3IS demuestra una eficacia superior in vitro con la totalidad de estos 15 antibioticos. El aislado clfnico numero 15 es resistente a vancomicina, estreptomicina y tetraciclina y muestra unicamente una leve sensibilidad a cloranfenicol, sin embargo, demuestra sensibilidad a A3iS;

la figura 11c muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra aislados clfnicos de mastitis en comparacion con productos anti-mastitis disponibles en el mercado. Ensayo de inhibicion de A3IS (repeticiones de 3 dfas) en 20 comparacion con cuatro de los productos multi-antibioticos, anti-mastitis disponibles en el mercado al ensayarse contra 22 aislados clfnicos de organismos Staphylococcus aureus que provocan mastitis. La formulacion de A3IS demuestra una eficacia in vitro comparable en comparacion con tres de los productos comerciales principales y es superior a uno de estos productos;

25 la figura 11d muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra aislados clfnicos de mastitis en comparacion con una solucion de nisina al 2 %. Ensayo de inhibicion de A3IS (repeticiones de 3 dfas) en comparacion con una solucion de nisina al 2 % sobre 21 aislados clfnicos de organismos de Staphylococcus aureus que provocan mastitis. La formulacion de A3IS demuestra una eficacia superior in vitro a la solucion de nisina al 2 %. Observacion: El aislado clfnico numero 15 de la figura 11b fue irrecuperable del almacenamiento y no se incluye en este ensayo;

30

la figura 11e muestra el desarrollo de resistencia a nisina. Una colonia resistente a nisina al 2 % (indicada por la flecha) dentro de la zona de inhibicion durante el estudio de eficacia de nisina. Nunca se han observado colonias resistentes a A3IS;

35 la figura 12a muestra una evaluacion de toxicidad MTT de A3IS en NHF (fibroblastos humanos normales). Se incluyen en el ensayo una concentracion al 50 % de A3IS, un rango de concentraciones de gel que contiene plata comercial y un producto de gel que contiene cinc comercial, en comparacion con azida sodica (control positivo). A3IS, demuestra menor toxicidad que el gel que contiene plata comercial o el producto de gel que contiene cinc comercial;

40

la figura 12b muestra la evaluacion de toxicidad MTT de A3IS en NHK (Queratinocitos Humanos Normales). Se incluyen en el ensayo una concentracion al 50 % de A3IS, un rango de concentraciones de un gel que contiene plata comercial y un producto de gel que contiene cinc comercial, en comparacion con azida sodica (control positivo). A3IS demuestra menor toxicidad que el gel que contiene plata comercial o el producto de gel que contiene cinc comercial; 45

la figura 12c muestra una evaluacion de citotoxicidad de revestimiento con agar de A3IS en las celulas L929. Se incluyen en el ensayo una concentracion al 50 % de A3IS, un rango de concentraciones de un gel que contiene plata comercial y un producto de gel que contiene cinc comercial, en comparacion con azida sodica (control positivo). A3IS demuestra menor toxicidad que el gel que contiene plata comercial o el producto de gel que contiene cinc comercial; 50

la figura 12d muestra A3IS y otro ensayo de irritacion MTT de material de ensayo durante un periodo de 24 horas empleando el modelo de piel Skinethic® 3D. A3IS demuestra menos irritacion en este ensayo tridimensional que los productos disponibles en el mercado ensayados;

55 la figura 12e muestra una seccion transversal tenida con hematoxilina/eosina (H&E) de piel Skinethic® 3D expuesta al producto de gel que contiene placa comparativo. Observese que la formulacion de plata provoca desprendimiento de la capa epidermica de la capa basal;

la figura 12f muestra una seccion transversal tenida con hematoxilina/eosina (H&E) de piel Skinethic® 3D expuesta

al producto de gel que contiene placa comparative. Observese que la formulacion de plata provoca el desprendimiento de la capa epidermica de la capa basal;

la figura 12g muestra una seccion transversal tenida con hematoxilina/eosina (H&E) de piel Skinethic® 3D expuesta 5 a A3IS. Observese que A3IS no provoca el desprendimiento de la capa epidermica de la capa basal;

la figura 12h muestra una seccion transversal tenida con hematoxilina/eosina (H&E) de piel Skinethic® 3D expuesta a A3IS. Observese que A3IS no provoca el desprendimiento de la capa epidermica de la capa basal;

10 la figura 13a muestra la induccion de la liberacion de IL-1 mediante A3IS. Ensayo ELISA del sobrenadante procedente de un ensayo de irritacion 3D durante un periodo de 48 horas, medicion y comparacion de la liberacion de IL-1 cuando se expone a la formulacion de A3IS, a un control positivo con azida sodica, y un producto de gel que contiene plata comercial. Los resultados indican que IL-1 se libera de las celulas de la piel expuestas a la formulacion de A3IS;

15

la figura 13b muestra la induccion de la liberacion de LDH mediante A3IS. Ensayo ELISA del sobrenadante procedente de un ensayo de irritacion 3D durante un periodo de 48 horas, medicion y comparacion de la liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) al exponerse a A3IS, un control positivo con azida sodica, y un producto de gel que contiene plata disponible comercialmente. La lactato deshidrogenasa se libera por las celulas expuestas a 20 compuestos destructivos. Los resultados indican que la formulacion de A3IS es menos toxica que los productos de gel que contienen plata disponibles en el mercado;

la figura 14 muestra A3IS antes y despues de la esterilizacion mediante irradiacion gamma. La irradiacion gamma no reduce la actividad como se muestra por la zona de ensayos de inhibicion en S. aureus, E. coli y Pseudomonas 25 aeruginosas;

la figura 15a muestra A3IS en una matriz de colageno-GAG y en vendajes comerciales para heridas ensayados para comprobar la actividad antibacteriana contra S. aureus. A3IS demuestra una actividad antibacteriana que es superior a la observada con el vendaje de plata disponible en el mercado utilizado como control;

30

las figuras 15b y 15c muestran la infiltracion de la matriz de colageno-GAG mediante los NHF. Infiltracion mediante los NHF de las matrices de colageno-GAG. Durante un periodo de 4 dfas despues de la adicion de las secciones de ensayo, se observo que los NHF se unen y crecen dentro y a lo largo de las matrices de colageno-GAG como se indica por la flecha;

35

la figura 16a muestra A IS en un gel alcoholico ensayado utilizando el bioensayo de discusion superficial para determinar las zonas de inhibicion contra S. aureus. Las zonas de inhibicion son pequenas debido a la propiedad absorbente de la matriz de gel, aunque existe una zona clara alrededor de la matriz de gel;

40 la figura 16b muestra la estabilidad de A3IS en un gel alcoholico. El A3IS en una formulacion de gel alcoholico se puso en un estudio de estabilidad a corto plazo de 6 semanas, incluyendo un ciclo de congelacion descongelacion y se ensayo utilizando el bioensayo de difusion superficial para determinar las zonas de inhibicion contra S. aureus. Los resultados indicaron que la formulacion de gel mantuvo la estabilidad a lo largo de todo el periodo de ensayo;

45 la figura 17 muestra una investigacion comparativa de la eficacia de A3IS. A3IS se vertio sobre la superficie de un rango de vendajes disponibles en el mercado Kaltostat® (Comvita), Kendal® (Telfa) y una matriz de colageno-GAG (glucosaminoglicano) como se ha descrito anteriormente y se dejo difundir en el vendaje durante varias horas. Las secciones se cortaron y se colocaron sobre placas de agar, inoculadas anteriormente con S. aureus, E. coli y P. aeruginosa. Despues, la eficacia antibacteriana de los vendajes impregnados con A3IS se comparo con Aquacel® 50 (Convatec) y Betadine® (Seton), vendajes disponibles en el mercado que contienen plata y yodo elemental. Los vendajes de A3IS son tan eficaces desde un punto de vista antimicrobiano como Aquacel® (Convatec) y Betadine® (Seton) y un vendaje disponible comercialmente que utiliza plata y yodo elemental;

la figura 18a muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra Onychomycosis. Onychomycosis presente en una 55 una del pie antes del tratamiento con A3IS;

la figura 18b muestra la actividad antimicrobiana de A3IS contra Onychomycosis. A3IS cubierto con un vendaje cuyo relleno se humedece usando agua. Por lo tanto, la una se cubre en un vendaje oclusivo;

la figura 18c muestra una actividad antimicrobiana de A3IS contra Onychomycosis. Fotograffa 48 horas despues del inicio del tratamiento con A3IS. Es evidente que la una ha cambiado de aspecto ya que ahora tiene un color mas oscuro; y

5 la figura 18d muestra una actividad antimicrobiana de A3IS contra Onychomycosis. Fotograffa 8 semanas despues del inicio del tratamiento con A3IS. En esta, la franja de una sin infectar es claramente visible, lo que indica que se han eliminado los dermatofitos;

figura 19 muestra los resultados de un ensayo de inhibicion usando (a) A3IS en solitario, (b) una combinacion de un 10 placebo (A3IS que no contiene GOX) y un agente antifungico, y (c) una combinacion de A3iS y un agente antifungico ensayado contra Candida albicans.

EJEMPLOS:

15 Materiales y metodos generales

Miel de Manuka:

Se preparo Manuka Care 18+® (Comvita) o Medihoney® en forma de un caldo de nutriente al 50 % v/v. Se hicieron 20 11 series 1 en 2 diluciones de la preparacion al 50 % v/v en caldo de nutrientes y se usaron para una prueba de inhibicion microbiana dando una menor concentracion del 0,01 %.

Azucares:

25 (D+) glucosa, D (-) fructosa, (D+) maltosa y (D+) sacarosa (Sigma Aldrich)

Glucosa oxidasa

Se uso polvo de glucosa oxidasa al 0,5 % (5600 U/100 g) en la fabricacion de A3IS.

30

Tambien se usaron 240 U/mg de glucosa oxidasa (Biozyme UK) (1 U es la cantidad de enzima que provoca la oxidacion de un micromol de glucosa por minuto a 25 °C y con un pH de 7,0) y de 100 U/mg a 250 U/mg de glucosa oxidasa (Sigma Aldrich) (1 U oxidara 1,0 mol de D-glucosa en D-gluconolactona y H2O2 por minuto a pH de 5,1 a 35 °C) en los siguientes ejemplos.

35

Ajuste del pH:

Se ajusto el pH de una solucion al 50 % v/v de miel de Manuka a pH 6,5 con NaOH 1 M, y se ajusto el pH de una muestra de mezcla de azucar sin glucosa oxidasa a pH a 3,8 con HCI 1 M. El pH se midio con un medidor del pH 40 (Hanna Instruments Hl 931410).

Preparaciones con un azucar:

Se prepararon soluciones al 50 % w/v de glucosa en solitario, fructosa en solitario y sacarosa en solitario y se 45 diluyeron en serie de forma similar que la miel de Manuka.

Medicion del contenido de humedad y agua disponible (Aw):

La determinacion del contenido de humedad se hizo mediante un aparato de titulacion Carl Fisher (Suiza). La 50 determinacion de Aw se hizo usando un medidor de Aw Aqua Lab, modelo serie 3Te, Decagon Devices Inc, Pullman, Washington, (con autorizacion del Glanbia Innovation Centre, Kilkenny).

Ensayo de H2O2:

55 El peroxido de hidrogeno se determino siguiendo el metodo de (Kerkvkiet 1996 y Serrano y col., 2004), usando una tira de ensayo Merckoquant (N° 10011, Merck, Alemania).

Eliminacion de H2O2:

Se anadio catalasa (Sigma Chemical Co, de hfgado de bovino, N° cat. C-30 12.800 U/mg) a diluciones de miel de Manuka de pH normal (pH inicial de 4) y a diluciones de miel de Manuka con un pH ajustado (pH inicial de 6,8) a las mismas concentraciones utilizadas por Taormina y col., Alien y col. y Molan y col., 1988). Tfpicamente, la concentracion anadida es 100 veces superior a la cantidad medida de H2O2 presente.

5

Tratamiento de calor de la miel de Manuka:

Un solucion al 50 % de miel de Manuka en un caldo de nutriente se calento tratada a una temperatura de 85 +/- 5 °C en un bano con agua. Esta temperatura se mantuvo durante un periodo de 60 minutos o 120 minutos. Un solucion al 10 50 % de miel de Manuka en un caldo de nutriente se introdujo en autoclave a 121 psi durante 15 minutos. A partir de estas preparaciones de miel tratada con calor se prepararon diluciones para su ensayo.

Cadenas microbianas:

15 - Se desarrollan Escherichia coli (NCIMB 8545), Staphylococcus aureus (NCIMB 9518) y Pseudomonas aeruginosa (NCIMB 8626) en agar de nutrientes o en un caldo de nutrientes, durante 24 horas a 37 °C.

- Se desarrollan Candida albicans (NCIMB 3179) y Saccharomyces cerevisiae en agar dextrosa Sabouraud o en un caldo de dextrosa Sabouraud durante 24 h a 37 °C.

20

- Se desarrolla Propionibacterium acnes (P. acnes ATCC/NTC 11827) de forma anaerobia en agar sangre o en un caldo de nutrientes durante 72 horas a 37 °C.

- 22 aislados de Staphylococcus aureus procedentes de mastitis clfnica obtenida de los laboratorios veterinarios 25 regionales de Sligo se desarrollan en agar de nutrientes o en un caldo de nutrientes durante 24 horas a 37 °C.

- Para un ensayo realizado en el Sligo Regional General Hospital, cinco aislados clfnicos de streptococci beta hemolfticos del grupo A se desarrollaron en agar sangre o en un caldo de nutrientes durante 24 horas a 37 °C.

30 - Se desarrolla Campylobacter coli (NCTC 11366) en agar de infusion de cerebro y corazon o en un caldo de infusion de cerebro y corazon durante 72 horas a 37 °C.

- Se desarrollan Campylobacter jejuni (NCTC 11322) y tres aislados clfnicos en agar de infusion de cerebro y corazon o en un caldo de infusion de cerebro y corazon durante 72 horas a 37 °C.

35

- Se desarrollan MRSA (ATCC 43300) y siete aislados clfnicos en agar de nutrientes o en un caldo de infusion de cerebro y corazon durante 72 horas a 37 °C.

- Se desarrollan aislados de moho de laboratorio en agar dextrosa Sabouraud o en un caldo de dextrosa durante 40 48 h a 25 °C.

- Se desarrolla Botrytis cinerea en agar dextrosa Sabouraud o en un caldo de dextrosa durante 48 h a 25 °C.

El crecimiento bacteriano se controla midiendo la densidad optica del cultivo (DO) en un espectrofotometro (Anthos 45 2010) con una longitud de onda de 620 nm.

Procedimientos de difusion de pocillo/disco - para la medicion de la inhibicion microbiana

Se inoculan placas de agar mediante un cultivo de exudado durante una noche sobre la superficie de la placa. Las 50 placas se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos, antes de su uso. Los pocillos de 8,2 mm de diametro se perforan en la superficie del agar. Se ponen ciento ochenta pl de muestra en cada pocillo. Las muestras se difunden en el agar alrededor del pocillo y se ensayan para ver si producen una zona de inhibicion. Las placas se incuban durante 24, 48 o 72 h y se miden las zonas de inhibicion usando un lector de zona automatico Autodata. El diametro de las zonas se registra, incluido el diametro del pocillo (8,2 mm).

55

Para los ensayos de disco, se colocan unos discos absorbentes esteriles (de 8,2 mm de diametro) en las diluciones de muestra durante 10 minutos antes de aplicarse directamente a placas de agar inoculadas. Las muestras se difunden del disco al agar y se ensayan para comprobar la capacidad de producir una zona de inhibicion. Las placas se incuban durante 24, 48 o 72 h y las zonas de inhibicion se miden usando un lector de zona automatico Autodata.

Se registra el diametro de las zonas, incluyendo el diametro del disco (8,2 mm). Cuantificaciones bactericidas de la miel

5 El ensayo de difusion de agar (ADA) es generalmente el metodo preferido para las cuantificaciones bactericidas de la miel y determinar la potencia biologica de los compuestos/activos - antibioticos, y se usa para los analisis en lote de produccion de miel de Manuka y procedimientos de liberacion (Gribbles Analytical Laboratories Kerkvliet, J.D., 1996. Screening method for the determination of peroxide accumulation in honey and relation with UMF content (Journal of Apiculture Research 35, 3, pags. 110-117). Sin embargo, la naturaleza subjetiva de este ensayo limita la 10 interpretacion de los resultados. Tambien requiere mucho tiempo y es laboriosa, ya que necesita la preparacion y enfriamiento de las placas, la perforacion de los pocillos de ensayo en agar y la medicion manual de las zonas de inhibicion despues de 24 horas de incubacion. La calidad de los resultados depende en gran medida de la tecnica y del juicio, y la precision sugerida no puede obtenerse cuando la zona de inhibicion es confusa o no es perfectamente circular.

15

Otros metodos - para la medicion de la inhibicion microbiana

El crecimiento microbiano, o la inhibicion del crecimiento, puede detectarse usando una diversidad de metodos biologicos, incluyendo, recuento microscopico directo, absorbancia, bioluminiscencia, ensayos que incorporan un 20 indicador de crecimiento colorimetrico y fluorometrico, turbidez, peso en seco y zonas de inhibicion.

Ensayo espectrofotometrico

Se desarrollo un ensayo espectrofotometrico mediante placas de microtitulacion de 96 pocillos (Patton T. y col., 25 Journal of Microbiological Methods (2006) paginas 84-95) y se comparo este metodo con los metodos estandar de difusion de pocillo/disco para evaluar las ventajas potenciales de este bioensayo en relacion con las propiedades antibacterianas de la miel de Manuka. Se consiguio un aumento de la automatizacion y del rendimiento (eficiencia) usando el ensayo espectrofotometrico que puede generar con rapidez grandes cantidades de datos que permiten un analisis estadfstico detallado de los resultados. El metodo es mas sensible y mas receptivo a los analisis estadfsticos 30 que los ensayos empleados actualmente, permitiendo estudios cineticos mas extensos incluso en presencia de bajas concentraciones de miel (Tabla 1). El ensayo es capaz de detectar unos niveles inhibitorios por debajo de los registrados para los ensayos de difusion de pocillo o disco. Este ensayo proporciona un procedimiento rapido y sensible para averiguar la actividad de la miel de Manuka.

35 Tabla 1

Disco Pocillo Es pectrofotometrico

Ensayo MIC50 Ensayo MIC50 Ensayo MIC50

Especies microbianas

Escherichia coli

22,4 % 24,5 % 5,6 %

Staphylococcus aureus

25,7 % 22,6 % 0,78 %

Bacillus cereus

24 % 21,9 % 2,00 %

Candida albicans

Sin inhibicion Sin inhibicion 40 %

Los valores de MIC50 indican el porcentaje de miel de Manuka presente, dando como resultado una inhibicion del 50 % en el crecimiento de un microorganismo de ensayo.

40

Las diluciones de miel se inoculan con un 5 % v/v de cultivo de ensayo en volumen durante una noche. Se aplican doscientos microlitros de cada dilucion, usando 8 replicas por dilucion, a los pocillos de placas de microtitulacion de 96 pocillos de fondo plano con tapa para evitar la contaminacion cruzada (Costar, Corning Ltd. NY). Los pocillos de control recibieron 200 microlitros de un caldo inoculado de cultivo al 5 %. La densidad optica se determina en un

45 espectrofotometro a 620 nm antes de la incubacion, (T0). Las placas se incuban durante 24 h en la oscuridad en un agitador orbital Certomat MO a 100 rpm para impedir la adherencia y la aglomeracion. Despues de 24 h, las placas se leen de nuevo en un espectrofotometro a 620 nm, (T24). Los resultados mostrados son promedios de ocho determinaciones repetidas cinco veces en tres dfas separados.

La DO para cada replica en To se resulta de la DO para cada replica en T24. Despues, a la DO ajustada de cada pocillo de control se le asigna un valor de crecimiento al 100 %. La inhibicion del crecimiento para los pocillos de ensayo en cada dilucion se determina usando la formula:

5 Porcentaje de inhibicion = 1 - (DO pocillo de ensayo/DO del pocillo de control correspondiente) x 100 para cada fila de la placas de 96 pocillos, por ejemplo, la DO fila 1, columna 1, pocillo 1 (ensayo) se divide por el valor de DO de la Fila 1, columna 12, pocillo 12 (control).

Esto produce ocho valores de inhibicion de replicas para cada dilucion de miel. Todos los ensayos se repiten un 10 mfnimo de tres veces en tres dfas diferentes usando un mfnimo de tres placas por ensayo, es decir, cada punto de datos indicado es un promedio de un mfnimo de 72 determinaciones puntuales.

La desviacion estandar asociada a los valores de inhibicion calculados medios para los pocillos de replicas se determina y se representa como barras de error asociadas para cada punto de datos en las graficas. Cuando la 15 medicion resultante registro un valor de inhibicion negativo (promocion del crecimiento), esto se indica como una estimulacion usando la formula:

Porcentaje de crecimiento = (DO ensayo/DO control) x 100

20 Ejemplo 1: Caracterizacion de actividades antimicrobianas en miel de Manuka - Ausencia de peroxido de hidrogeno endogeno.

Mediante el bioensayo espectrofotometrico descrito, se determina la actividad antimicrobiana de la miel de Manuka disponible en el mercado, usando varias muestras para asegurar la consistencia. Los resultados mostrados en la 25 figura 1a demuestran que la miel de Manuka proporciona un primer nivel de actividad de inhibicion microbiana con diluciones del 50 % a aproximadamente el 6,25 % y un segundo nivel de actividad de inhibicion microbiana con diluciones del 3,125 % al aproximadamente el 0,195 %.

Se muestra que este efecto de doble nivel se produce por mecanismos separados. La inhibicion microbiana inicial en 30 una dilucion de miel baja (50 % - 6,25 %) es resultado de una combinacion de un bajo pH y el Aw (agua disponible) que limita el crecimiento y, en menor medida, por el peroxido de hidrogeno que unicamente se produce de novo tras la dilucion y despues de un periodo considerable de tiempo. No existe peroxido de hidrogeno endogeno detectable presente en la miel de Manuka diluida o no diluida, como muestra la Tabla 2.

35 Tabla 2

% de dilucion

50,00 25,00 12,50 6,25

Miel de Manuka

pH 3,89 pH 4,35 pH 4,96 pH 5,95

H2O2 mg/l (Tiempo 0 h)

0 0 0 0

Miel de Manuka

pH 3,89 pH 4,35 pH 4,96 pH 5,95

H2O2 mg/l (Tiempo 3 h)

0 35 35 65

Perfil de generacion de H2O2.de miel de Manuka

40 A medida que se diluye la concentracion de la miel, y despues de que haya transcurrido un periodo de tiempo, se produce peroxido de hidrogeno y contribuye adicionalmente al efecto antimicrobiano.

El ajuste del pH de la miel de Manuka de su pH natural a aproximadamente 4,0 a casi pH neutro 7,0 no afecta significativamente al perfil antimicrobiano (figura 1b). Cuando las diluciones de miel de Manuka son de un pH 45 ajustado a casi neutro seguido de la adicion de catalasa en exceso, el perfil antimicrobiano de la miel se altera (figura 1c). El primer nivel de inhibicion antimicrobiana se ve afectado solo ligeramente, pero el segundo nivel se ve afectado significativamente, lo que indica que el efecto antibacteriano en el segundo nivel es principalmente el resultado de la liberacion de peroxido de hidrogeno.

50 La creencia de que existe una actividad sin peroxido tambien denominada como un factor unico de Manuka (UMF)

se debe a un error del procedimiento experimental. Especfficamente, el fracaso por otros grupos de investigacion para neutralizar el pH de la miel de Manuka antes de la adicion de catalasa hace basicamente que la catalasa anadida resulte ineficaz, ya que el pH de la miel es demasiado acido para la actividad de la catalasa. Dado que la miel a la que se ha anadido la catalasa en exceso todavfa conserva actividad antimicrobiana, ha persistido la 5 creencia de que existe un UMF. Como muestra la figura 1b, el ajuste del pH de la miel de Manuka a pH 6,80 no afecta a la actividad antimicrobiana. Un pH de 6,80 esta cercano al pH optimo para la actividad de catalasa y en esta condicion, la catalasa anadida neutraliza la actividad del peroxido de hidrogeno, alterando asf el perfil de actividad antimicrobiana de la miel.

10 De manera sorprendente, tambien se ha descubierto que esta trayectoria de la glucosa oxidasa no es operativa inmediatamente en la aplicacion de la miel de Manuka y solo es operativa despues de la dilucion de la miel y despues de que haya transcurrido un periodo de tiempo.

EJEMPLO 2: Un sistema de aeneracion de peroxido de hidroaeno endoaeno antimicrobiano y de liberacion 15 sostenida prototipo

Se hace una formulacion prototipo que contuvo 31 +/- 5 g de glucosa: 35 +/- 5 g de fructuosa: 7 +/- 2 g de maltosa: 1,5 +/- 1 g de sacarosa, mezclando los ingredientes, preparando la mezcla hasta un volumen final de 100 ml en agua desionizada destilada (DI); la mezcla se esteriliza mediante autoclave. Se anade glucosa oxidasa al 0,05% en peso, 20 que es una concentracion similar a la contenida en la miel de Manuka.

La figura 2 muestra los resultados de un ensayo antimicrobiano sobre S. aureus usando esta formulacion prototipo. La formulacion prototipo de este ejemplo demostro una mayor actividad en comparacion con la miel de Manuka. Es probable que la funcion decisiva desempenada por la trayectoria enzimatica de la glucosa oxidasa en el efecto 25 antibacteriano se mejore una vez que este libre de impurezas y compuestos limitantes de la reaccion (tal como catalasa) presentes en la miel. Este prototipo demuestra una actividad bactericida muy eficaz.

EJEMPLO 2.1: Un sistema prototipo de aeneracion de peroxido de hidroaeno endoaeno antimicrobiano y de liberacion sostenida en gel

30

A la formulacion prototipo se le anaden agentes gelificantes que son ingredientes comunes en las formulaciones farmaceuticas topicas y se ensayan. Los geles ensayados incluyen celulosa reconstituida con agua y agentes de celulosa reconstituidos con alcohol (1. carbomero, 2. methocel, 3. polivinilpirrolidona y 4. goma xantano al 2 % en un hidrogel que incorpora la formulacion prototipo). Ambos geles a base de celulosa demuestran una disminucion de la 35 estabilidad. Es posible que la impedancia esterica y la hidrolisis de la glucosa oxidasa den como resultado una perdida de actividad antibacteriana. Incluso antes de la perdida de la actividad, debido a una disminucion de la estabilidad, ninguna de las formulaciones en gel son tan activas como la formulacion prototipo, como resulta evidente por las zonas menores de inhibicion en ensayos de difusion (comparese la figura 3a (geles) con la figura 3b (formulacion prototipo)).

40

EJEMPLO 2.2: Un sistema prototipo de aeneracion de peroxido de hidroaeno endoaeno antimicrobiano y de liberacion sostenida - Formulacion individual de azucar y ael enzimatico

En un intento por resolver la estabilidad en gel descrita en el ejemplo 2.1, se preparan formulaciones que contienen 45 glucosa y glucosa oxidasa unicamente. Las formulaciones de glucosa que varfan del 30 %-80 % de glucosa en agua se someten a autoclave o se calientan lentamente hasta el punto de ebullicion para facilitar la disolucion del azucar. Durante la disolucion mediante ebullicion, se anaden diversos agentes gelificantes y, cuando se enfrfan a menos de 40 °C, se anade glucosa oxidasa al 0,1 %. Estas formulaciones se ensayan para comprobar la actividad antibacteriana (figura 4a).

50

Estas formulaciones demuestran unicamente un grado limitado de actividad antibacteriana y esta actividad esta por debajo de la observada con la formulacion antimicrobiana prototipo que se ha descrito en el Ejemplo 2 como resulta evidente por las zonas menores de inhibicion en los ensayos de difusion de pocillo/disco (comparese la figura 4a (geles) con la figura 4b (prototipo)).

55

Ademas de la actividad reducida, las formulaciones que contienen altas concentraciones de glucosa, cuando se colocan en tubos de aluminio, solidifican haciendo que las formulaciones no se puedan utilizar. Los tubos que contienen las formulaciones con menores concentraciones de glucosa demuestran una falta de estabilidad como resulta evidente por una disminucion de la actividad antimicrobiana con el tiempo.

EJEMPLO 2.3: Caracterfsticas mejoradas de la formulacion del sistema de aeneracion de peroxido de hidroaeno endoaeno antimicrobiano y de liberacion sostenida - Variacion de la concentracion de carbohidrato y aaua

Este ejemplo describe los intentos de minimizar la cantidad de agua presente en las formulaciones de acuerdo con la invencion, para minimizar los problemas relacionados con la estabilidad ya que el exceso de agua puede dar lugar a la hidrolisis de la glucosa oxidasa. Las formulaciones todavfa requieren suficiente agua para permitir la generacion de H2O2, facilitar la aplicacion y evitar la precipitacion de azucares durante el almacenamiento. Se mezclan 10 concentraciones variables de azucares y se calientan como se ha descrito en el Ejemplo 2.2 para determinar la fuente principal para la precipitacion y la textura granular observada en las formulaciones anteriores. A partir de este analisis, las concentraciones de azucares se ajustan para reducir este efecto. Tras la adicion de la enzima, las formulaciones adecuadas se ensayan para determinar la actividad antibacteriana.

15 Se ha descubierto que la concentracion de agua podrfa reducirse del 20 % al 10 %, que es la concentracion minima que permite actividad enzimatica, facilitar la aplicacion y prevenir la precipitacion de azucares.

El tratamiento con calor sin control de los azucares tiende a producir caramelizacion dando como resultado una formulacion que adquiere un color amarillo a pardo. Para eliminar la caramelizacion, y producir asi un material 20 transparente, se desarrolla un proceso de fabricacion en el que se selecciona cuidadosamente el orden de adicion de azucares y su disolucion por calentamiento para evitar el proceso de caramelizacion. A esta formulacion se le anade la enzima de glucosa oxidasa y se evaluan la actividad antibacteriana, la estabilidad y la adecuabilidad para aplicacion. Estas mejoras a la formulacion prototipo forman la base para la totalidad de formulaciones/sistemas futuros descritos en el presente documento.

25

EJEMPLO 3: Sistema antimicrobiano de componente unico. que tiene un deposito de peroxido de hidroaeno endoaeno y liberacion sostenida

De acuerdo con la Tabla 3, se prepara una formulacion para un sistema antimicrobiano de componente unico (en lo 30 sucesivo aqui denominado como "sistema antimicrobiano" o A3IS o A3IS).

Tabla 3

Inarediente

Porcentaje en peso en el Ej. 3. Intervalo de porcentaje preferido

Agua purificada

13,5 aiustado para hacer el 100 % 10-20 %

Polvo de glucosa

38 % +/- 10, preferiblemente +/- 5 28-48 %

Polvo de fructosa

35 % +/- 10, preferiblemente +/- 5 25-45 %

Polvo de maltosa

10 % +/- 5 5-15 %

Polvo de sacarosa

1,5 % +/- 1 0,5-1,5 %

Polvo de glucosa

Enzima al 0,5 % (5600 U/g) disuelta previamente en el 1,5 % al menos 10 U por 100 g del

oxidasa

de agua purificada sistema

TOTAL

100 % 100%

35 El pH de A3IS se ajusta a pH 5,5. Este bajo pH esta dentro del intervalo de actividad de la glucosa oxidasa (pH 4,07,0, pH optimo de 5,5). Si es necesario, se puede anadir un tampon para obtener el pH deseado, como se ilustra en la tabla 4. El tampon se disuelve previamente en agua purificada y reemplaza parte del agua purificada de la formulacion anterior.

40 Tabla 4

Inaredientes tamponantes opcionales para pH 5.5

Porcentaje en peso

Acido cftrico/citrato sodico

0,918 % disuelto previamente en un 2 % de agua purificada para pH 5,5

Acido fosforico/fosfato de hidrogeno disodico

1,598 % disuelto previamente en un 2 % de agua purificada para pH 5,5

Se entendera que se pueden utilizar diferentes proporciones de ingredientes tamponantes dependiendo del pH deseado.

5 Se entendera que el Prototipo, que se ha descrito en el Ejemplo 2 y A3IS descrito aquf proporciona formulaciones adecuadas para su uso de acuerdo con la invencion. Los Ejemplos posteriores muestran el analisis de diversas caracterfsticas de A3IS.

Los azucares descritos en la tabla 3 se anaden en la siguiente secuencia: fructosa, glucosa, maltosa y sacarosa. 10 Cada carbohidrato se disuelve totalmente en el agua mediante calentamiento a aproximadamente 90 °C antes de anadir el siguiente carbohidrato. Como alternativa, los azucares pueden prepararse como anteriormente pero al vacfo a -0,5 bar, lo que reduce el punto de ebullicion de los azucares a una temperatura menor de 90 °C evitando la decoloracion.

15 Cuando los carbohidratos se disuelven totalmente y estan transparentes, la mezcla se deja enfriar por debajo de 60 °C y a la mezcla principal se le anaden los ingredientes tamponantes opcionales disueltos previamente en agua.

Cuando la mezcla base esta a una temperatura por debajo de 40 °C, una temperatura que permite la retencion de la actividad enzimatica, la enzima glucosa oxidasa que esta disuelta previamente en agua se anade y se dispersa en la 20 mezcla. La mezcla se deja enfriara a temperatura ambiente. Cuando se enfrfa, la mezcla se pone en tubos de aluminio que despues se cierran hermeticamente. Los tubos se almacenan a temperatura ambiente.

EJEMPLO 3.1: Un sistema prototipo de qeneracion de peroxido de hidroqeno endoqeno antimicrobiano y de liberacion sostenida - variacion de la concentracion y tipo de enzimas

25

Se sabe que la miel contiene varias enzimas ademas de la glucosa oxidasa, incluyendo diastasa e invertasa. Las enzimas diastasa e invertasa se incorporan en la formulacion prototipo del Ejemplo 2 para determinar si pueden mejorar la actividad antibacteriana total permitiendo una liberacion mas lenta pero sostenida de H2O2 actuando sobre diferentes carbohidratos en la formula.

30

Se investigan varias combinaciones y concentraciones de enzimas para determinar esta actividad antibacteriana potencialmente mejorada. Se anaden diastasa e invertasa en diferentes combinaciones a A3IS y se comparan con A3IS que contiene glucosa oxidasa unicamente. No se ha descubierto ninguna mejora en la actividad antibacteriana en ninguna de las formulaciones que contienen enzimas multiples.

35

Tambien se incorporan diferentes concentraciones de glucosa oxidasa y se comparan mediante ensayo espectrofotometrico para determinar su relacion de cantidad/actividad. La actividad antibacteriana de A3IS aumenta proporcionalmente con la concentracion de glucosa oxidasa. Se consigue un efecto antibacteriano sustancial a una concentracion enzimatica del 0,05 % (figura 5a).

40

Esto muestra que puede conseguirse una variacion de la actividad antibacteriana variando la concentracion de glucosa oxidasa. La enzima puede dispersarse con facilidad por todo el material durante la mezcla.

EJEMPLO 4: A3IS - Un sistema de qeneracion de peroxido de hidroqeno innovador y aumentado

45

El peroxido de hidrogeno se cuantifica siguiendo el metodo de (Kerkvliet 1996 y Serrano y col., 2004), usando una tira de ensayo Merckoquant (N° 10011; Merck, Alemania). Los resultados se expresan en miligramos de H2O2 por litro. La adecuabilidad del metodo para la determinacion de peroxido de hidrogeno se verifica anadiendo diluciones de miel de Manuka recien preparadas con H2O2 lfquido y verificando que el ensayo puede detectar de manera 50 precisa la cantidad de H2O2 presente.

La tabla 5 y la figura 5b muestran que A IS, con la enzimas GOX sigma Aldrich al 0,5 % 5600 U/g y diluida al 50 % (C1), 25 % (C2), 12,5 % (C3) o 6,25 % en agua desionizada (DI) generan niveles significativamente aumentados de peroxido de hidrogeno en comparacion con la miel de Manuka diluida al 50 % en agua DI.

Tabla 5

Muestra/mgH2O2/l

Tiempo h

C1 C2 C3 C4 Manuka

0

25 15 15 10

0

1

55 25 20 10 15

2

100 90 50 50 35

3

90 90 75 60 55

4

75 75 80 50 50

5

75 75 75 65 40

6

75 75 75 75 40

9

75 75 50 50 35

5 La figura 5c muestra que este aumento de produccion de peroxido de hidrogeno (A3IS diluido al 25 % en agua DI) se mantiene durante un periodo de al menos 48 h.

EJEMPLO 4.1: A3IS - Aumento de la actividad antimicrobiana con un aumento de la concentracion de qlucosa oxidasa

10

La figura 5d muestra una relacion dosis-respuesta entre el rango de concentracion de la glucosa oxidasa y el efecto antimicrobiano en S. aureus, segun se mide usando un bioensayo de inhibicion espectrofotometrica.

La figura 5d demuestra adicionalmente que es posible abordar el problema de la potencia/eficacia, ya que las 15 formulaciones producidas pueden ajustarse por variaciones de la concentracion de glucosa oxidasa que se incorpora durante la fabricacion, resultados mostrados en Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosas y Escherichia coli.

EJEMPLO 5: A3IS - Deposito de peroxido de hidrogeno endoqeno

20

Cuando A3IS se mezcla con agua dentro del intervalo de dilucion del 50 % al 0,1 %, la liberacion de peroxido de hidrogeno se detecta inmediatamente. La Tabla 6 muestra que se detectan hasta 75 mg/l de peroxido de hidrogeno en T = 0. Esto contrasta con la miel de Manuka que no puede registrar ninguna liberacion de peroxido en el momento cero (vease el Ejemplo 1, Tabla 2) y demuestra la presencia de un deposito endogeno significativo de 25 peroxido de hidrogeno generado durante el proceso de formulacion.

Ademas, despues de tres horas de incubacion de las muestras diluidas, la cantidad de peroxido detectado en A3IS excede significativamente la detectada en la miel natural, Tabla 6.

30 Tabla 6

% de dilucion

50,00 25,00 12,50 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 0,10 0,05 0,025

Manuka

pH normal

3,89 4,35 4,96 5,95 6,60 6,87 7,03 7,11 7,12 7,14 7,15 7,15

Aw a pH normal

0,908 0,970 0,985 0,994 0,994 0,995 0,996 0,996 0,996 0,996 0,996 0,997

% de agua

53,0 74,7 84,5 91,3 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

H2O2 mg/l (T = 0 horas)

0 0 0 0 0 0

H2O2 mg/l (T = 3 horas)

0 35 35 65 55 40 40 35 30 0 0 0

pH aiustado

6,6 6,6 6,88 7,02 7,10 7,13 7,18 7,20 7,20 7,21 7,21 721

Aw a pH aiustado

0,906 0,966 0,983 0,990 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

a3is

pH normal

5,5 6,0 6,96 7,05 7,13 7,17 7,17 7,19 7,2 7,21 7,21 7,19

Aw a pH

0,906 0,964 0,983 0,990 0,995 0,996 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997

normal

% de agua

52,4 71,8 83,9 90,7 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

H2O2 mg/l (T = 0 horas)

75,0 75,0 75,0 75,0 70,0 60,0 55 55 45 5 0 0

H2O2 mg/l (T = 3 horas)

90 90 75 80 - - - - - - - -

pH aiustado

3,8 5,6 6,55 6,9 7,03 7,12 7,17 7,19 7,20 7,21 7,21 7,21

Aw a pH ajustado

0,904 0,964 0,982 0,991 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

Este deposito endogeno, mostrado aquf variando entre 10 y 75 mg/l de peroxido de hidrogeno dependiendo de la cantidad de GOX presente en A3IS, se muestra en la figura 5a, la figura 5b y la tabla 6. Tal deposito proporciona ventajosamente peroxido de hidrogeno, y su actividad antimicrobiana, para un efecto inmediato con la aplicacion de 5 A3IS. Combinado con un mayor nivel de peroxido de hidrogeno producido con la dilucion, se podrfa esperar que contribuya a un efecto antimicrobiano significativamente aumentado en comparacion con otros sistemas, tal como miel de Manuka.

EJEMPLO 6: A3IS - El deposito de peroxido de hidrogeno endogeno es estable en almacenamiento

10

Una caracterfstica sorprendente y ventajosa de A3IS es la retencion tanto de la actividad antimicrobiana como del deposito de hidrogeno en el tiempo como se muestra en la figura 6.

El deposito de H2O2 disponible producido mediante A3IS es estable en almacenamiento ya que los lotes situados en 15 estabilidad retienen los mismos niveles de H2O2 que los detectados cuando los lotes se producen inicialmente. La retencion a traves de la estabilidad del H2O2 disponible inmediatamente es una caracterfstica unica de las formulaciones de A3IS. Utilizando el ensayo de difusion por pocillo para evaluar la actividad antimicrobiana, se demostro que se mantiene en el tiempo un nivel consistente de actividad antimicrobiana. La figura 7a muestra las zonas de inhibicion medidas en cada punto temporal de muestreo y los resultados se representan en graficos 20 usando lfmites de confianza al 95 % durante un perfodo de tres meses. De manera similar, la figura 7b muestra una estabilidad extendida de la actividad antimicrobiana durante un perfodo de 9 meses. Los datos de estabilidad extendida indican que la formulacion A3IS no muestra ninguna perdida de actividad ni siquiera despues de un periodo de 14 meses.

25 Usando el ensayo de difusion por pocillo para evaluar la actividad antimicrobiana, se demuestra un nivel consistente de actividad antimicrobiana en el tiempo. La figura 7a muestra las zonas de inhibicion medidas en cada punto temporal de muestreo y los resultados se representan en graficas usando lfmites de confianza del 95 % durante un perfodo de tres meses. De manera similar, la figura 7b muestra una estabilidad extendida de la actividad antimicrobiana durante un perfodo de 9 meses. Los datos de estabilidad extendida indican que la formulacion A3IS 30 no muestra ninguna perdida de actividad ni siquiera despues de un periodo de 14 meses.

EJEMPLO 7: A3IS - Actividad antimicrobiana potente contra Staphylococcus aureus

Se muestra que A3IS tiene actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus. La figura 8a y la figura 8b 35 muestran curvas de eliminacion bacteriana realizadas usando dos protocolos separados, las directrices NCCLS, un metodo (figura 8a) y un protocolo especifico del fabricante del dispositivo medico (figura 8b) durante un periodo de 6,0 horas. A3IS tiene eficacia aumentada en comparacion con la miel de Manuka y una eficacia comparable con el vendaje de plata.

40 La figura 8c muestra los resultados de un ensayo de inhibicion (repeticiones de 3 dfas) para A3IS, Medihoney® y un gel de fenol al 10 % al ensayarse frente a 5 aislados clfnicos del grupo A de Streptococcus beta hemolfticos. A3IS esta a pH normal de 5,5 (material de ensayo A) y pH 7 (material de ensayo B), se incluye un control negativo de A3IS que no contiene GOX. La formulacion de A3IS demuestra una eficacia in vitro comparable a un gel de fenol al 10 % y es superior a Medihoney®.

45

EJEMPLO 8: A3IS - Actividad antimicrobiana potente contra Campylobacter

Se muestra que A3IS tiene actividad antimicrobiana contra Campylobacter. La figura 8d muestra los resultados de un ensayo de inhibicion (repeticiones de 3 dfas) para la formulacion de A3IS, miel de Manuka y un gel de fenol al 10 % 50 al ensayarse frente a 5 aislados clfnicos de Campylobacter spp. La formulacion de A3IS esta a un pH normal de 5,5

(material de ensayo A) y pH 7 (material de ensayo B), se incluye un control negativo de A3IS que no contiene GOX. Los resultados indican una eficacia in vitro anti-Campylobacter significativa y la superioridad de A3IS con respecto a la miel de Manuka.

5 EJEMPLO 9: A3IS - Actividad antimicrobiana potente contra Propionibacterium acnes

Se muestra que A3IS tiene actividad antimicrobiana contra Propionibacterium acnes (P. acnes).

La figura 9a muestra los resultados de inhibicion de A3IS contra P. acnes en condiciones de incubacion variables: luz 10 y oscuridad aerobia, luz y oscuridad anaerobia. A3IS demuestra un alto nivel de actividad contra P. acnes, lo que indica que el material puede tener potencial para su aplicacion topica en acne. Los resultados para A3IS y los productos anti-acne comerciales disponibles actualmente, incluyendo algunos productos comerciales que incorporan antibioticos, se muestran en la figura 9b. Estos resultados indican que A3iS es comparable con "respecto a" la eficacia anti-acne in vitro para productos anti-acne disponibles en el mercado que contienen Clindamicina y peroxido 15 de benzoflo.

EJEMPLO 10: A3IS - Actividad antimicrobiana potente contra MRSA

Se muestra que la formulacion del sistema antimicrobiano tiene actividad antimicrobiana contra 8 cepas de MRSA en 20 tres dfas diferentes y en comparacion con un estandar de fenol al 10 % y con miel de Manuka, figura 10. La formulacion de A3IS esta a pH normal de 5,5 (material de ensayo A) y pH 7 (material de ensayo B), se incluye un control negativo de A3IS que no contiene GOX. Los resultados demuestran una eficacia anti-MRSA in vitro significativa y la superioridad de A3IS con respecto a la miel de Manuka y un control de gel de fenol al 10 %. Las zonas de inhibicion se muestran en la figura 11a. El material de ensayo A se ajusta a pH 5,5 y la muestra de pruebas 25 B se ajusta a pH 7. La figura 11a muestra los resultados mejorados de A3IS que son aproximadamente un 300 % mejores que la miel de Manuka. Esto muestra mas claramente que A3IS tiene propiedades superiores y ventajosas con respecto a la miel de Manuka anterior.

EJEMPLO 11: A3IS - Actividad antimicrobiana potente contra aislados clinicos de mastitis y retencion de 30 actividad en leche cruda

La figura 11b muestra los resultados de un ensayo de inhibicion (repeticiones de 3 dfas) para A3IS y cuatro antibioticos (vancomicina, estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol) al ensayarse contra 22 aislados clinicos de organismos de Staphylococcus aureus que provocan mastitis. La formulacion de A3IS demuestra una eficacia in vitro 35 superior para la totalidad de estos antibioticos. Sin embargo, el aislado clfnico numero 15 es resistente a vancomicina, estreptomicina y tetraciclina y muestra unicamente una sensibilidad leve a cloranfenicol, sin embargo, demuestra sensibilidad a A3lS.

La figura 11c muestra los resultados de un ensayo de inhibicion (repeticiones de 3 dfas) para A3IS al ensayarse 40 contra 22 aislados clinicos de organismos de Staphylococcus aureus que provocan mastitis. La formulacion de A3IS demuestra una eficacia in vitro comparable con tres de los principales productos multi-antibioticos disponibles en el mercado para la mastitis y es superior a uno de estos productos.

La figura 11d muestra los resultados de un ensayo de inhibicion (repeticiones de 3 dfas) para A3IS ensayado contra 45 una solucion de nisina al 2 % en 21 aislados clinicos de organismos de Staphylococcus aureus que provocan mastitis. La formulacion A3IS demuestra una eficacia in vitro superior con respecto a la solucion de nisina al 2 %. Observacion: el aislado clfnico numero 15 de la figura 11b fue irrecuperable del almacenamiento y no se incluyo en este ensayo.

50 La figura 11e muestra la presencia de una colonia resistente a nisina al 2 % dentro de la zona de inhibicion durante un estudio de eficacia de nisina. Las colonias resistentes a A3IS nunca se han observado en estudios de eficacia en base a la zona de ensayos de inhibicion, ni tiene regeneracion de cultivos producidos despues de ensayos de inhibicion de A3IS basados en espectrofotometrfa.

55 Se inoculan cinco ml de leche cruda con 0,1 ml de un cultivo durante una noche de Staphylococcus aureus (que contiene aproximadamente 5 x 107 ufc/ml) seguido de la adicion de 0,5 ml de la formulacion de A3IS. Esta mezcla se incuba durante una noche a 37 °C. Despues, la mezcla se analiza para la produccion de H2O2 y la supervivencia del Staphylococcus aureus inoculado. Se detectan niveles de H2O2 en exceso de 100 mg/l en esta leche y se recupera parte de los Staphylococcus inoculados. La mezcla no muestra senales de avinagrado, lo cual se podrfa esperar

despues de una incubacion durante una noche a alta temperature. Por el contrario, la leche cruda a la que se le anade A3IS se amarga y se coagula. Este hallazgo indica que A3IS mantiene la actividad incluso en un medio complejo tal como leche cruda.

5 EJEMPLO 12: A3IS - Medicion in vivo de la toxicidad/irritancia

La toxicidad/irritancia se determina usando fibroblastos humanos normales (NHF ECACC 90011807) y queratinocitos humanos normales (NHK CC-2501) desarrollados en medio esencial mfnimo de Eagle (EMEM) con, L-glutamina 2 mm, suero fetal de bovino al 10 % (FBS), incubado a 37 °C en CO2 al 5 %. Se realizan tres repeticiones de 10 ensayos bi-dimensionales usando placas de 24 y 12 pocillos, utilizando tanto rojo neutro como bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), Sigma, "kit de ensayo para toxicologfa in vitro" para ensayos celulares de contacto directo, para evaluar la viabilidad despues de la incubacion con materiales de ensayo durante 8 horas (azida sodica - control positivo, concentraciones de gel de plata, gel de cinc, A3IS y medio recien preparado - control negativo).

15

Tambien se usa el estandar ISO 10993, ensayos de citotoxicidad con revestimiento de agar: metodo in vitro, empleando celulas L929 (fibroblastos de raton ECACC 85011425). En resumen; se incuba una monocapa confluyente de celulas, esta despues se cubre con una capa de medio recien preparado (EMEM, L-Glutamina 2 mm, FBS al 5 %, Penicilina-Estreptomicina al 2 %) que contiene 1,5 g/l de agar suave y se deja solidificar. Un decimo de 20 la de la superficie se cubre con materiales de ensayo (que se han descrito anteriormente) y se incuba durante 24 horas. Despues de la incubacion, el material de ensayo se elimina cuidadosamente y se anade una cepa vital (rojo neutro) en medios recien preparados. Despues de la incubacion, esta se elimina, las celulas se lavan y despues el colorante se extrae de las celulas y se cuantifica espectrofotometricamente para comprobar la viabilidad celular.

25 Tambien se emplea un modelo de piel dermica tridimensional (Skinethic, Francia) para determinar el efecto irritante de la formulacion y controles sobre los queratinocitos diferenciados como en el estrato corneo, un equivalente de piel cultivado. El ensayo emplea un modelo de piel epidermica tridimensional y se realiza en varios puntos temporales. El modelo de epidermis humana reconstituida consiste en una construccion de tejido epidermico de capas multiples, vivo, aerea, producido en insertos de policarbonato en medio libre de suero y definido qufmicamente, que incorpora 30 una ultraestructura normal y funcionalidad equivalente con la epidermis humana in vivo. Los tejidos de epidermis humana reconstituidos in vitro por cuadruplicado, 17 dfas de edad, (tamano 0,63 cm2) se dosifican por via topica con 2-10 mg/cm2 de la formulacion durante 3 y 24 horas y se evalua la viabilidad del tejido usando el ensayo MTT, utilizando el protocolo validado del Instituto Federal Aleman para Valoracion de Riesgo (BFR-ZEBET).

35 El sobrenadante de cultivo celular del ensayo de irritancia que se ha descrito previamente se analiza usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas IL-1 (ELISA) (R&D Systems) y un ELISA de lactato de deshidrogenasa (LDH) (R&D Systems), para la medicion de citocina y enzimas para evaluar el efecto inmunoestimulador e irritante de los materiales de ensayo.

40 Las secciones transversales de los modelos de piel 3D utilizados para el ensayo de irritancia se tinen con hematoxilina y eosina (H&E), el procedimiento tecnico incluyo:

Fijacion: Los tejidos se estabilizan mecanica y bioqufmicamente en un fijador. El fijador es formalina tamponada neutra, formaldehfdo al 10 % en solucion salina tamponada con fosfato (PBS).

45

Incrustacion: La tecnica utilizada es incrustacion con cera. Las muestras se sumergen progresivamente en concentraciones en aumento (20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 80 % y 100 %) de etanol puro para deshidratar el tejido, seguido de un agente aclarante, xileno (100 %), y por ultimo cera de parafina fundida caliente (impregnacion) y se dejan enfriar y endurecer.

50

Seccion: Despues, el tejido de muestra se secciona en secciones de 5 micrometres usando un microtomo. Despues, estas porciones se colocan en un portamuestras de vidrio para tincion.

Tincion: para observar el tejido bajo un microscopio, las secciones se tinen con hematoxilina y eosina (H&E) para 55 evaluar la velocidad de degradacion epidermica superficial provocada por cada material de prueba.

La figura 12a y la figura 12b muestran los resultados de la evaluacion de toxicidad inicial de A3IS por medio de los ensayos de viabilidad MTT en los NHF (fibroblastos humanos normales) y los NHK (queratinocitos humanos normales). La toxicidad porcentual se calculo de acuerdo con la formula: % de toxicidad = 1 - (DO promedio de los

pocillos del material de ensayo/DO promedio de los pocillos de control correspondientes (sin ningun material de ensayo anadido)) x 100. En el ensayo se incluyeron una concentracion al 50 % de A3IS, un intervalo de concentraciones de un gel que contema plata comercial y un producto de gel que contema cinc comercial, en comparacion con azida sodica (control positivo). Para el ensayo de toxicidad, la concentracion del material de 5 ensayo usado fue dos veces la usada para el ensayo de irritancia, 100 mg por pocillo y el tiempo de contacto se extendio a 8 h.

La figura 12c, muestra los resultados del estandar internacional ISO, ensayo con revestimiento de agar 10993-5 para citotoxicidad durante 24 h utilizando rojo neutro en L929. La toxicidad porcentual se calculo de acuerdo con la 10 formula: % de toxicidad = 1 - (DO promedio de los pocillos del material de ensayo/DO promedio de los pocillos de control correspondientes (azida sodica anadida)) x 100. En el ensayo se incluyen una concentracion al 50 % de A3IS, un rango de concentraciones de gel que contiene plata comercial y producto de gel que contiene cinc comercial en comparacion con azida sodica (control positivo). El control positivo con azida sodica proporciona una toxicidad del 100 %. Para el analisis de toxicidad con cubierta de agar, la cantidad de los materiales de ensayo usados fue similar 15 a la usada para los ensayos de contacto directo inicial de 100 mg por pocillo, sin embargo el tiempo de contacto se extendio a 24 h.

Los resultados de un ensayo de irritancia de los materiales de prueba para un rango de tiempos de contacto empleando el modelo de piel 3D Skinethic® se muestran en la figura 12d. Este modelo de epidermis humana 20 reconstituida consiste de una estructura de tejido epidermico de capas multiples, viva, aerotransportada, producida en insertos de policarbonato en medio libre de suero y definido qmmicamente, incorporando una ultra-estructura y funcionalidad normales equivalentes a la epidermis humana in vivo. Los efectos de este contacto directo sobre las muestras de piel 3D se muestran en secciones transversales tenidas con hematoxilina/eosina (H&E) en la figura 12e y la figura 12f para el producto de gel que contiene plata comparativo. La figura 12g y la figura 12h muestran 25 secciones transversales tenidas con H&E despues del contacto directo de la formulacion de A3IS sobre las muestras de piel 3D. Los resultados muestran que la formulacion de placa provoca desprendimiento de la capa epidermica de la capa basal, mientras que la muestra de formulacion de A3IS no presenta dano.

Los tejidos epidermicos humanos reconstituidos in vitro por cuadruplicado, edad 17 dfas, (tamano 0,63 cm2) se 30 dosifican por via topica con 2-10 mg/cm2 de la formulacion durante 3 y 24 horas y la viabilidad tisular se evalua usando el ensayo MTT, utilizando el protocolo validado por el Instituto Federal Aleman para Valoracion de Riesgo (BFR-ZEBET). Se calculo la irritancia porcentual de acuerdo con la formula: % de irritancia = 1 - (DO promedio de las pieles del material de ensayo/DO promedio de las pieles de control correspondientes (sin material de ensayo anadido)) x 100. A3IS demuestra menos irritancia en este ensayo tridimensional que los productos disponibles en el 35 mercado ensayados.

EJEMPLO 13: A3IS - Induccion de la liberacion de IL-1 inflamatoria a partir de celulas de la piel

La figura 13a muestra los resultados de un ensayo ELISA del sobrenadante eliminado durante el ensayo de irritancia 40 3D durante un periodo de 48 horas, midiendo y comparando la liberacion de IL-1 cuando se expone a la formulacion de A3IS, con respecto a un control positivo de azida sodica, y un producto de gel que contiene plata comercial. Los resultados indican que IL-1 se libera de las celulas de la piel expuestas a la formulacion de A3IS. La figura 13b ilustra la medicion de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en el medio celular utilizado durante el protocolo de ensayo de irritancia. Los resultados muestran la liberacion de LDH mediante celulas despues de la exposicion a la formulacion 45 de A3IS, un control positivo de azida sodica, y un producto de gel que contiene plata disponible en el mercado. La lactato deshidrogenasa se libera por las celulas expuestas a compuestos destructivos. Los resultados indican que la formulacion de A3IS es menos toxica que los productos de gel que contienen plata disponibles en el mercado.

EJEMPLO 14: A3IS - Esterilizacion terminal

50

A3IS se lleno en botellas de vidrio y tubos de plastico. Despues, se esterilizaron mediante irradiacion gamma. Despues de la esterilizacion, la actividad antibacteriana de las muestras se comparo con los resultados antes de la esterilizacion. Se descubrio que la irradiacion gamma no reduce la actividad. Hubo una ligera decoloracion del recipiente primario; sin embargo el proceso de irradiacion no afecto la actividad o el color del material de ensayo. La 55 figura 14 muestra la eficacia de A3IS antes y despues de la irradiacion gamma en S. aureus, E. coli y Pseudomonas aeruginosa.

EJEMPLO 15: A3IS - Incorporacion en una matriz de colaaeno-GAG (alucosaminoalicano) - como un vendaje antibacteriano

Imagen de A3IS en GAG sobre S. aureus e imageries de la infiitracion de GAG (figura 15a a figura 15c).

Se formulo la matriz de colageno-GAG (glucosaminoglicano) se ha descrito previamente (Wilkins, L., M., y col., 1993. 5 Development of a bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Organogenesis Inc.) y se anadio A3IS a esta matriz a una proporcion de 1:1.

La mezcla se vertio en una superficie esteril para formar una capa fina de aproximadamente 1 mm y se seco en una incubadora durante 24 horas para formar un vendaje para piel. Una vez seca, se cortaron secciones de 1 cm y se 10 colocaron sobre placas con agar inoculado con S. aureus, E. coli y P. acnes. Se observo actividad antibacteriana contra S. aureus, E. coli y P. acnes. Existen zonas definidas claras de inhibicion y no se observa desarrollo bacteriano bajo el vendaje.

Las secciones de ensayo tambien se colocan sobre una monocapa confluyente de los NHF (fibroblastos humanos 15 normales) en placas de 6 pocillos en To. Se descubre que hubo poca o ninguna toxicidad.

Despues, las secciones de ensayo se co-incubaron con celulas de NHF, en pocillos para cultivo celular. Se descubrio que, ademas de adherirse a la parte inferior de los pocillos de cultivo celular, como se esperaba, las celulas NHF tambien se infiltraron, se fijaron a y crecieron en las secciones de ensayo. Esto demuestra que los 20 matrices de colageno-GAG que incorporan A3IS son matrices adecuadas para la union y el crecimiento celular (veanse la figura 15b y la figura 15c).

EJEMPLO 16: A3IS - Incorporacion en un gel alcoholico

25 A3IS se mezcla con un gel alcoholico que consiste de alcohol absoluto, agente gelificante ultrez 10, diisopropanolamina y propilenglicol, que se mezcla antes de la adicion de A3IS dando como resultado un material no adhesivo transparente. Esta formulacion de gel se ensaya usando el bioensayo de difusion en pocillo y de difusion superficial para determinar las zonas de inhibicion contra S. aureus, E. coli y P. acnes. Se muestran los resultados para S. aureus, figura 16a. Se ha de apreciar que las zonas de inhibicion son artificialmente bajas en esta situacion 30 debido a la propiedad de absorcion de la matriz de gel, sin permitir asf la difusion libre a traves de la matriz de agar, pero hay una zona clara alrededor de la matriz de gel.

La formulacion de gel se pone en un estudio de estabilidad a corto plazo de 6 semanas, incluyendo una prueba de congelacion-descongelacion. Los resultados indican que la formulacion de gel mantuvo la estabilidad a todo lo largo 35 del periodo de ensayo, figura 16b. Se muestran los resultados para S. aureus.

EJEMPLO 17: A3IS - Incorporacion en vendajes para heridas disponibles en el mercado

Imagen de A3IS en vendajes para heridas, figura 17.

40

La formulacion A3IS se vertio sobre la superficie de un rango de vendajes disponibles en el mercado Kaltostat® (Comvita), Kendal® (Telfa) y una matriz de colageno-GAG (glucosaminoglicano) como se ha descrito anteriormente y se dejo en difusion en el vendaje durante varias horas para formar una capa fina de aproximadamente 1 mm. Se cortaron secciones de 1 cm2 y se colocaron sobre placas de agar, inoculadas anteriormente con S. aureus, E. coli y 45 P. aeruginosa. Despues, la eficacia antibacteriana de los vendajes impregnados con A3IS se comparo con los vendajes Aquacel® (Convatec) y Betadine® (Seton) disponibles en el mercado que contienen plata y yodo elementales, figura 17. Se descubrio que los vendajes con A3IS son tan eficaces desde el punto de vista antimicrobiano como Aquacel® (Convatec) y Betadine® (Seton) y un vendaje disponible en el mercado que utiliza plata y yodo elementales.

50

EJEMPLO 18: A3IS - Potente actividad antimicrobiana contra Onychomycosis

Se realizo un estudio de caso sobre la eficacia de A3IS en el tratamiento de infecciones de las unas por hongos en un voluntario humano. La una infectada fue la una del dedo gordo del pie derecho y la infeccion se localizo en el 55 costado izquierdo de la una. La infeccion habfa estado presente durante un periodo de tiempo considerable, aproximadamente 2 anos. Antes del tratamiento, se obtuvo una fotograffa de la una infectada, figura 18a. El tratamiento se realizo una vez al dfa por en la manana, posteriormente a la ducha del sujeto y el secado con toalla. Se aplico A3IS a la superficie de la una sobre la region infectada en lugar de sobre toda la superficie de la una. Despues, A3IS se cubrio con un vendaje cuyo relleno se habfa humedecido usando agua y, por lo tanto, la una se

cubrio en un vendaje oclusivo durante el resto del dfa, figura 18b. Este tratamiento se realizo a diario durante un periodo de tres semanas. Despues de un periodo de dos dfas, se tomo otra fotograffa, figura 18c. Es evidente que la region infectada de la una ha cambiado de apariencia y que ahora tiene un color mas oscuro. Durante el periodo de tratamiento, hubo poca evidencia de alteracion ffsica adicional, excepto el desarrollo de una seccion mayor en 5 aumento de crecimiento de la una sin infectar. Se muestra una fotograffa adicional 8 semanas despues del inicio del tratamiento, figura 18d. En esta, la franja de una sin infectar es claramente visible, lo que indica que se han eliminado los dermatofitos.

Ejemplo 19:

10

Formulaciones estables en almacenamiento de 2 niveles adicionales

Las siguientes formulaciones se prepararon de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 3 (en lotes de 50 g). Cada formulacion se ensayo para comprobar la presencia inmediata de peroxido de hidrogeno usando los protocolos que 15 se han descrito previamente. Las composiciones de cada una de las formulaciones preparadas se describen en las tablas a continuacion. Idealmente, enzima glucosa oxidasa al 0,5 % (idealmente al menos 5600 U/g) disuelta previamente en agua.

20

Formulacion N°: 1

Ingrediente

% p/p

Agua

10

Glucosa

79,5

Fructosa

7,5

Maltosa

2,2

Sacarosa

0,3

Glucosa Oxidasa

0,5

Formulacion N°: 2

Ingrediente

% p/p

Agua

20

Glucosa

69,5

Fructosa

7,5

Maltosa

2,2

Sacarosa

0,3

Glucosa Oxidasa

0,5

25

Formulacion N°: 3

Ingrediente

% p/p

Agua

10

Glucosa

20

Fructosa

52

Maltosa

15,4

Sacarosa

2,1

Glucosa Oxidasa

0,5

Formulacion N°: 4

Ingrediente

% p/p

Agua

20

Glucosa

10

Fructosa

52

Maltosa

15,4

Sacarosa

2,1

Glucosa Oxidasa

0,5

Formulacion N°: 5

Ingrediente

% p/p

Agua

18

Glucosa

30

Fructosa

40

Maltosa

10

Sacarosa

1,5

Glucosa Oxidasa

0,5

5

Formulacion N°: 6

Ingrediente

% p/p

Agua

20

Glucosa

40

Fructosa

29,5

Maltosa

10

Sacarosa

0

Glucosa Oxidasa

0,5

Formulacion N°: 7

Ingrediente

% p/p

Agua

20

Glucosa

40

Fructosa

38

Maltosa

0

Sacarosa

1,5

Glucosa Oxidasa

0,5

Formulacion N

°: 8

Ingrediente

% p/p

Agua

20

Glucosa

30

Fructosa

0

Maltosa

48

Sacarosa

1,5

Glucosa Oxidasa

0,5

15

Formulacion N°: 9

Ingrediente

% p/p

Agua

20

Glucosa

40

Fructosa

39,5

Maltosa

0

Sacarosa

0

Glucosa Oxidasa

0,5

Formulacion N°: 10

Ingrediente

% p/p

Agua

20

Glucosa

60

Fructosa

0

Maltosa

19,5

Sacarosa

0

Glucosa Oxidasa

0,5

Resultados

Se descubrio que todos los lotes tenfan tanto un contenido de peroxido de hidrogeno inicial como actividad 5 antibacteriana indicativa de la liberacion sostenida de peroxido durante un periodo de tiempo.

Generacion de H2O2 ma/l:

Formulacion N°

Dfa 0 Dfa 09 Dfa 20

1

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

2

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

3

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

4

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

5

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

6

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

7

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

8

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

9

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

10

>10 mg/l >10 mg/l >10 mg/l

10 Ejemplo 20

Ensayos de inhibicion para combinaciones de peroxido de hidrogeno y antibioticos

Se ensayaron diversas combinaciones de A3IS (del Ejemplo 3) y agentes antibioticos/antifungicos frente a un 15 placebo y A3IS en solitario usando un metodo de difusion de pocillo/disco. Se usaron las siguientes muestras:

a) 100 |jl de A3IS ;

b) combinacion placebo y antibiotico/antifungico que comprende 50 jl de placebo (A3IS que no contiene GOX) y 50 20 jg de un agente antibiotico/antifungico; y

c) combinacion A3IS y antibiotico/antifungico - 50 jl de combinacion de A3IS y 50 jg de un agente antibiotico/antifungico.

25 Metodos de difusion de pocillo/disco para la medicion de la inhibicion microbiana:

Se inocularon placas de agar mediante un cultivo de exudado durante una noche sobre la superficie de la placa. Las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de su uso. Los pocillos de 8,2 mm de diametro se perforaron en la superficie del agar. Se pusieron 100 pl de muestras (a) a (c) en cada pocillo. Las 30 muestras se difundieron en el agar alrededor del pocillo y se ensayaron para comprobar la capacidad de produccion de una zona de inhibicion. Las placas se incubaron durante 24, 48 o 72 h y se midieron las zonas de inhibicion. El diametro de las zonas se registra, incluyendo el diametro del pocillo (8,2 mm).

Resultados:

35

Los resultados se muestran en la figura 19. La figura 19 muestra los resultados de un ensayo de inhibicion contra Candida albicans.

Conclusion:

40

La combinacion de A3IS y antifungico dio como resultado una zona mayor de inhibicion que indicaba la sinergia entre los dos agentes. Se observa un efecto sinergico, que va mas alla de un efecto de combinacion/aditivo, a pesar de una reduccion eficaz al 50 % en la concentracion de A3IS cuando se usa en combinacion (50 ul) en comparacion con A3IS cuando se usa en solitario (100 ul). Este efecto se observo para Candida albicans.

Ejemplo 21

Pruebas de sinergia para combinaciones de peroxido de hidroaeno y antibioticos

Materiales y metodo:

Se realizo la tecnica en damero (Rochon-Edouard S, Pestel-Caron M, Lemeland JF, Caron F: In vitro synergistic effects of double and triple combinations of b-lactams, vancomycin and netilmicin against methicillin-resistant 10 Staphylococcus aureus strains. Antimicrob Agents Chemother 2000, 44: 3055-60; Eliopolus GM, Moellering RC Jr: Antimicrobial combinations. In Antibiotics in Laboratory medicine. 3a edicion. Williams y Wilkins, Co. Baltimore, MD Estados Unidos; 2000: 432-49), incluyendo las combinaciones: A3IS/Flucloxacilina, A3IS/Zinacef, A3IS/Eritrocina, A3IS/Klacid, A3IS/Velocef, A3IS/Amoxicilina, A3IS/Clindamicina y A3IS/Augmentine. Se prepararon soluciones madre de acuerdo con los estandares publicados (CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): Performance 15 Standards for Antimicrobial Susceptibility testing. Decimoquinto complemento informativo. Documento CLSI M100- S15. Pennsylvania Estados Unidos 2005, 19087-1898)

Se realizaron ensayos de sinergia en placas de microtitulacion de 96 pocillos que contenfan las combinaciones A3IS (del Ejemplo 3)/antibiotico en diluciones dobles dispensadas en damero el dfa del ensayo. Cada pocillo contenfa 20 0,1 ml de A3IS/antimicrobianas. Se preparo una suspension de cultivo de ensayo de suspension de S. aureus a partir de un caldo de cultivo durante una noche para producir un inoculo final de aproximadamente 3 x 105 a 5 x 105 UFC/ml. Se anadieron veinte microlitros de esta suspension a todos excepto los pocillos de control de esterilidad. Las MIC se leyeron despues de una noche de incubacion a 35 °C. Se incluyeron controles de crecimiento y esterilidad en cada placa. Cada aislado se ensayo dos veces. El crecimiento se determino examinando visualmente 25 cada pocillo para obtener pruebas de turbidez.

Interpretacion de los ensayos de sinergia

Para el primer pocillo transparente en cada fila de la placa de microtitulacion que contenfa ambos agentes 30 antimicrobianos, la concentracion inhibitoria fraccional (FIC) se calculo como se indica a continuacion: FIC del farmaco A (FICa) = MIC del farmaco A en combinacion/MIC del farmaco A en solitario, y la FIC del farmaco B (FICb) = MIC del farmaco B en combinacion/MIC del farmaco B en solitario. La suma de ambas FIC en cada pocillo se uso para clasificar la combinacion de agentes antimicrobianos como el efecto sinergico cuando los indices FIC fueron < 0,5; FIC sinergica parcial >0,5 pero < 1; FIC de aditivo = 1.0; efecto indiferente cuando los valores fueron >1 y < 4 y 35 antagonista cuando los valores fueron > 4.0 (Eliopolus GM, Moellering RC Jr: Antimicrobial combinations. In Antibiotics in Laboratory medicine. 3a edicion. Williams y Wilkins, Co. Baltimore, MD Estados Unidos; 2000: 432-49).

Resultados

40 Los resultados de las pruebas de sinergia en damero se resumen en las tablas a continuacion.

Ensayo de sinergia en damero

Concentraciones previas a la dilucion de A3IS y antibioticos.

A3IS Flucloxacilina Zinacef Eritrocina Klacid

GOX al 0,5 %

500 mg 750 mg 1,00 g 500 mg

Diluciones finales de A3IS y antibioticos para ensayo de sinergia en damero

A3IS Rucloxacilina Zinacef Eritrocina Klacid

3 %

1:3.200.000 1:400.000 1:1.600.000 1:1.600.000

MIC para A3IS y antibioticos en S. aureus NCIMB 9587.

A3IS Flucloxacilina Zinacef Eritrocina Klacid

1/8

1/2 1/2 1/2 1/2

FIC para combinacion (A3IS + antibiotico) en S. aureus NCIMB 9587 para ensayos de sinergia en damero.

A3IS + Flucloxacilina A3IS + Zinacef A3IS + Eritrocina A3IS + Klacid

1,35 0,5 2,00 1,0

Sin sinergia Sinergia Sin sinergia Sin sinergia

Ensayo de sinergia en damero (continuacion)

Concentraciones previas a la dilucion de A3IS y antibioticos.

A3IS Velocef Amoxicilina Clindamicina Augmentine

GOX al 0,5 %

500 mg 500 mg 1,00 g 1,00 g

Diluciones finales de A3IS y antibioticos para ensayo de sinergia en damero

A3IS Velocef Amoxicilina Clindamicina Augmentine

3 %

1:100.000 1:3.200.000 1:100 1:1.600.000

MIC para A3IS y antibioticos en S. aureus NCIMB 9587.

A3IS Velocef Amoxicilina Clindamicina Augmentine

1/8

1/4 1/4 1/2

1/8

FIC para combinacion (A3IS + antibiotico) en S. aureus NCIMB 9587 para ensayos de sinergia en damero.

A1IS + Velocef A3IS + Amoxicilina A3IS + Clindamicina A3IS + Augmentine

0,1248 1,5 0,125 2,00

Sinergia Sin sinergia Sinergia Sin sinergia

3 3 3

La combinacion de A IS/Zinacef, A IS/Velocef y A IS/Clindamicina muestran una FIC < 0,5 que indica un efecto sinergico con estas combinaciones. Se observa un efecto indiferente con las otras combinaciones de A3IS/antibioticos ensayadas. Ninguna de las combinaciones mostro un efecto antagonista.

5

Conclusion

La capacidad de A3IS para mediar un efecto sinergico cuando se usa en combinacion con varios antibioticos individuales tiene potencial clfnico. Aunque la sinergia se ha demostrado previamente con algunas combinaciones de 10 antibioticos, A3IS proporciona un vector antimicrobiano al que se le pueden anadir otros antibioticos para dar un mayor antimicrobiano del que es posible con el antibiotico en solitario.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composicion antimicrobiana que comprende

   5 (i) un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D- glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al 10 menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema; y

   (ii) el antibiotico Clindamicina, Cefradina o Cefuroxima; o el agente antifungico seleccionado de entre uno o mas de Clotrimazol, Ciclopiroxalomina, Terbinafina y/o Ketoconazol.

   15 2. Una terapia de combinacion antimicrobiana que comprende

   (i) un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D- glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno

   20 producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema; y

   (ii) el antibiotico Clindamicina, Cefradina o Cefuroxima; o el agente antifungico seleccionado de entre uno o mas de 25 Clotrimazol, Ciclopiroxalomina, Terbinafina y/o Ketoconazol;

   para su uso en terapia.
2. 3. Una terapia de combinacion antimicrobiana que comprende 30

   (i) un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D- glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa donde el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos

   35 10 mg por litro para liberacion inmediata; y (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema; y

   (ii) el antibiotico Clindamicina, Cefradina o Cefuroxima; o el agente antifungico seleccionado de entre uno o mas de Clotrimazol, Ciclopiroxalomina, Terbinafina y/o Ketoconazol;

   40

   para su uso en el tratamiento simultaneo, separado o secuencial de una infeccion microbiana.
3. 4. Una composicion antimicrobiana o terapia de combinacion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en forma de una preparacion combinada.

   45
4. 5. La composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la combinacion de la fuente de peroxido de hidrogeno y el agente antibiotico o antifungico proporciona una eficacia mayor que la eficacia de cualquier agente administrado en solitario.

   50 6. La composicion, terapia de combinacion, preparacion combinada de acuerdo con cualquiera de las

   reivindicaciones anteriores, donde la fuente de peroxido de hidrogeno es un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en almacenamiento que comprende glucosa oxidasa, D-glucosa, uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa, y peroxido de hidrogeno en una solucion acuosa

   55 donde esta presente una cantidad eficaz de glucosa oxidasa en una actividad de al menos 10 U por 100 g del sistema;

   donde D-glucosa esta presente del 20 % al 85 % en peso en base al peso del sistema total;

   uno o mas de sacarosa, fructosa y/o maltosa estan presentes del 10 % al 70 % en peso en base al peso del sistema total;

   el agua esta presente del 10 al 20 % en peso en base al peso del sistema total;

   5

   el sistema tiene un pH de 4 a 8; y

   el sistema proporciona una liberacion de peroxido de hidrogeno en dos fases en la que

   10 (a) el peroxido de hidrogeno producido de forma endogena y estable en almacenamiento esta biodisponible en el sistema a un nivel de al menos 10 mg por litro para una liberacion inmediata; y

   (b) la liberacion sostenida de peroxido de hidrogeno adicional durante al menos un periodo de veinticuatro horas se produce tras la rehidratacion del sistema.

   15
5. 7. La composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada de acuerdo con cualquiera de las

   reivindicaciones anteriores, donde la infeccion microbiana es una infeccion bacteriana o fungica, preferiblemente una infeccion cutanea, una infeccion de unas, mastitis, MRSA u otra infeccion resistente a antibioticos.

   20 8. La composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada de acuerdo con cualquiera de las

   reivindicaciones 1 a 7, donde la fuente de peroxido de hidrogeno y/o el agente antibiotico o antifungico estan adaptados para administracion topica, enteral o parenteral.
6. 9. La composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada de acuerdo con la reivindicacion 8, 25 donde la fuente de peroxido de hidrogeno y el agente antimicrobiano estan adaptados para administracion topica.
7. 10. El uso de una composicion, terapia de combinacion o preparacion combinada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en un metodo para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una infeccion microbiana.

   30