ES2581214T3 - La vacunación génica de consenso IG-P protege de inmunopatología dependiente de anticuerpos en enfermedad autoinmunitaria. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión, en el que el polipéptido de fusión comprende un antígeno propio ligado de manera operable a una región Fc de un anticuerpo, en el que el antígeno propio es pCons SEC ID Nº: 2.

Description

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DESCRIPCION

La vacunacion genica de consenso IG-P protege de inmunopatolog^a dependiente de anticuerpos en enfermedad autoinmunitaria.

Campo tecnico

La invencion se refiere a metodos y composiciones utiles para tratar enfermedades y trastornos autoinmunitarios. En un aspecto, la invencion proporciona construcciones geneticas y polipeptidos y metodos para tratar lupus eritematoso sistemico (LES).

Antecedentes

La presencia de hipergammaglobulinemia con frecuencia se asocia a trastornos inflamatorios cronicos y se observa comunmente en el lupus eritematoso sistemico (LES), una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por multiples anticuerpos (Ab) para antigenos propios que pueden formar inmunocomplejos que se depositan en el rinon, un procedimiento que conduce a perdida de la funcion renal.

Los ratones (NZB x NZW)Fi (NZB/W F1) desarrollan espontaneamente una enfermedad autoinmunitaria sistemica que se parece bastante a LES humano. Estos animales desarrollan auto-Ab en suero para diversos Ag propios incluyendo ADN(ds) bicatenario, cromatina e histonas, y mueren de fallo renal secundario a la deposicion de Ab patogenico e inmunocomplejos en los glomerulos del rinon. Aunque las celulas B son cruciales para el desarrollo de LES y la deficiencia genetica de estos linfocitos puede proteger de lupus, las celulas T son igualmente importantes en la patogenesis de la enfermedad. En particular, las celulas colaboradoras T (Th) en LES pueden reconocer determinantes de celulas T dentro de idiotipos de auto-Ab y proporcionan ayuda a las celulas B para la produccion de auto-Ab. Sin embargo, los elevados niveles de IgG policlonal en LES representan un componente patogenico principal de la enfermedad que contribuye altamente tanto a su morbilidad como mortalidad.

Resumen

Una produccion aumentada de IgG policlonal (hipergammaglobulinemia) y una perturbacion de las respuestas inmunitarias humorales son caractensticas importantes del lupus eritematoso sistemico (LES). De manera similar a los seres humanos, los ratones con predisposicion a lupus (NZB x NZW)Fi (NZB/W Fi) hembra presentan niveles aumentados en suero de IgG que pueden formar inmunocomplejos cuando son reactivos para antfgeno propio. Puesto que esos inmunocomplejos se pueden depositar en el rinon y causar glomerulonefritis - una causa principal de mortalidad en LES - una reduccion de la produccion de IgG probablemente beneficiana el pronostico de LES. La invencion demuestra que la transferencia de celulas B somatica de un minigen que codifica una secuencia de consenso de determinantes de celulas T en IgG de murina puede presentar una produccion elevada sostenida de IgG ratones NZB/W Fi, con proteccion resultante de enfermedad renal acelerada y posterior supervivencia aumentada de los animales.

El mecanismo implicado en la proteccion de hipergammaglobulinemia incluye una extension de celulas T CD8+CD28- productoras de TGFbeta que suprime la estimulacion espedfica del antfgeno de celulas T CD4+ de una manera independiente del contacto de la celula. De manera significativa, la transferencia adoptiva de celulas T CD8+CD28- de ratones protegidos con minigenes en ratones NZB/W Fi con hipergammaglobulinemia tambien protege del desarrollo de enfermedad renal. Estos datos indican la posibilidad de induccion a base de minigenes de circuitos inmunorreguladores que puedan retrasar el desarrollo de nefritis lupica murina suprimiendo la hipergammaglobulinemia.

La invencion demuestra que la hipergammaglobulinemia y posterior enfermedad renal acelerada puede ser suprimida en un modelo animal de LES (por ej., ratones NZB/W Fi) por celulas T CD8+ inducidas por minigenes Ig que hacen las celulas T CD4+ hiposensibles a estimulacion antigenica, produciendo asf inhibicion de enfermedad renal y posterior supervivencia aumentada de los ratones. La materia de la presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. En particular, la presente invencion se refiere a un polinucleotido que codifica un polipeptido de fusion, en el que el polipeptido de fusion comprende un antfgeno propio ligado de manera operable a una region Fc de un anticuerpo, en el que el antfgeno propio es pCons SEC ID N°: 2. Ademas, la invencion se refiere a un vector de expresion que comprende dicho polinucleotido. En un aspecto mas, la invencion se refiere a dicho polinucleotido para uso en la prevencion o tratamiento de lupus eritematoso sistemico induciendo inmunidad tolerogenica en un individuo, en el que el polinucleotido es para expresion en el individuo. Por otra parte, la invencion se refiere a un polipeptido de fusion como se define en las presentes reivindicaciones y a una composicion farmaceutica que comprende dicho polipeptido de fusion. Finalmente, la invencion se refiere a dicho polipeptido de fusion para uso en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario para reprimir una respuesta inmunitaria a un antfgeno propio, en particular a un antfgeno propio que comprende SEC ID N°: 2, en el que el trastorno autoinmunitario es lupus eritematoso sistemico.

Breve descripcion de los dibujos

Figura i. Mapas de minigenes, transcripciones y productos genicos. a. Representacion esquematica de

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construcciones que codifican hIgGi (Ig solo, pig [parte superior]; en asociacion con pCons, pIgCons [medio] o en asociacion con pNeg, pigNeg [fondo]). b. rT-PCR en ARN ex^do de celulas COS-7 transinfectadas con los diferentes minigenes (pig, pigCons, pigNeg). El tamano molecular esperado se marca a la izquierda como “minigen”. MPM, marcador de peso molecular. c. Metodo Western de protemas de fusion de peso molecular esperado en lisados de celulas COS-7 transinfectadas con los diferentes minigenes. MPM, marcador de peso molecular. d. Respuestas proliferativas de una estirpe (T) de celulas T espedficas de pCons procedente de ratones inmunizados con pCons a celulas B transinfectadas con plg (B/plg) o pigCons (B/plgCons); P<0,004. La especificidad se indica por ausencia de proliferacion de celulas B transinfectadas con pigCons cuando se cultivan solas (B/plgCons) y por proliferacion optima de la estirpe de celulas T cuando se co-cultivan con celulas B y peptido pCons pero no cuando se co-cultivan con peptido pNeg. Representativo de seis experimentos.

Figura 2. El tratamiento de ratones NZB/W Fi con pigCons se asocia con el desarrollo retrasado de proteinuria y la supervivencia aumentada de los animales tratados. Cada raton recibio 6x105 celulas B transinfectadas con el minigen relativo como se describe en los Materiales y Metodos. El grupo de control de PBS solo recibio PBS. a. Proteinuria cinco semanas despues de tratamiento, pigCons frente a pig o pigNeg, P<0,01. Diez semanas despues de tratamiento, pigCons frente a pig o pigNeg, P<0,0001 y P<0,0002, respectivamente. b. Se vigilo en los ratones la supervivencia hasta 50 semanas despues de transferencia de celulas B transinfectadas con plasmidos pig, pigCons, pigNeg o pCMV. Un grupo de control de ratones recibio solo PBS. P<0,004 por analisis de Kaplan Meyer.

Figura 3. Histologfa de los rinones de los ratones usados en el estudio. a. La coloracion con hematoxilina- eosina muestra que los ratones tratados con pigCons presentan una implicacion glomerular reducida y arquitectura de tejido conservada comparado con ratones tratados con pig o pigNeg. b-c. La coloracion por inmunofluorescencia indica precipitacion de higG (b) y migG (c) aumentada en los glomerulos de ratones tratados con pig y pigNeg cuando se compara con ratones tratados con pigCons. Aumento: 200X. d. Puntuacion de actividad glomerular acumulativa (PAG) y puntuacion de actividad tubulointersticial (PATi) de rinones de ratones tratados con pig (izquierda), pigNeg (medio) y pigCons (derecha). P<0,0001 para tanto PAG como PATi.

Figura 4. Respuestas anti-ig despues de vacunacion con minigenes. Media ± DE de igG anti-humano (a) e igG anti-raton (b) respuestas en ratones tratados y controles (n = 6 a 12 por grupo) a las 5 y 10 semanas despues de tratamiento. P<0,0001 a tanto 5 como 10 semanas.

Figura 5. Respuestas de celulas T a vacunacion con minigenes. Se midieron las respuestas de celulas T espedficas de Ag a 4 (a, b) y 8 (c, d) semanas despues de tratamiento. El mdice de estimulacion medio (±DE) se indica sobre el eje y (4-9 ratones por grupo). Fondo cpm: 0,5-2,0 x 103. ay c, proliferacion en presencia de peptidos (eje x) solo. by d, proliferacion en presencia de peptidos (eje x) mas iL-2. P<0,07 a las 4 semanas; P<0,05 a las 8 semanas.

Figura 6. Analisis de citometna de flujo en celulas mononucleares perifericas dos semanas despues de vacunacion con minigenes. a. Expresion superficial de CD8 en celulas T de CD3+ de ratones tratados con pig (izquierda), pigNeg (centro) y pigCons (derecha) indica una expansion de celulas CD8+ en ratones pigCons comparado con ratones tratados con plg- y pigNeg. b-c. En el compartimento de celulas T (regulado) CD8+, las celulas CD8+CD28- se extienden en ratones pigCons pero no en ratones de control; P<0,005 (b), P<0,001 (c). d. La coloracion para TGF-beta intracelular en linfocitos CD8+CD28- regulados de ratones tratados con pigCons (negro) y de ratones tratados con pigNeg (gris) indica la expresion de esta citocina en celulas T del grupo pigCons pero no en el grupo pigNeg de ratones. Representativo de experimentos por duplicado en ratones individuales (n=5/grupo).

Figura 7. Actividad in vitro e in vivo de linfocitos CD8+CD28- de ratones tratados con pigCons. a. Las celulas CD8+CD28- suprimen in vitro la proliferacion de celulas T CD4+ (dosis escalar de relacion efector a diana); P<0,02 frente a pig o pigNeg; no significativo a relacion 1:1. b. La transferencia in vivo de celulas T CD8+CD28- purificadas de ratones tratados con pigCons retrasa la proteinuria en ratones con hipergammaglobulinemia. 1x107 celulas T CD8+CD28- de ratones tratados con pigCons (•) (n = 6) o pigNeg (o) (n = 8) se transformaron en ratones NZB/ W F1 hembra con igG de suero >10 mg/ml y se vigilo en los receptores cada dos semanas el desarrollo de proteinuria (>100 mg/dl). P<0,001 por analisis de Kaplan Meyer.

Descripcion detallada

Las descripciones ejemplares proporcionadas en la presente memoria son ejemplares y explicatorias solo y no son

restrictivas de la invencion, como se reivindica. Por otra parte, la invencion no esta limitada a las realizaciones

particulares descritas, ya que las mismas pueden variar, por supuesto. Ademas, la terminologfa usada para describir

realizaciones particulares no esta destinada a ser limitante.

Con respecto a los intervalos de los valores, la invencion incluye cada uno de los valores que intervienen entre los

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Ifmites superior e inferior del intervalo a al menos un decimo de la unidad del Umite inferior, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Ademas, la invencion incluye cualquier otro valor que intervenga indicado. Por otra parte, la invencion tambien incluye intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los lfmites superior e inferior del intervalo, a menos que se excluya de manera espedfica del intervalo indicado.

A menos que se defina de otro modo, los significados de todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente memoria son los entendidos comunmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invencion. Un experto en la materia tambien apreciara que cualquier metodo y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se puede usar tambien para llevar a la practica o ensayar la invencion.

Se debe observar que, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular “un”, “o” y “el” incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Asf, por ejemplo, la referencia a “un polipeptido relacionado” incluye una pluralidad de dichos polipeptidos y la referencia a “el agente” incluye referencia a uno o mas agentes y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, etcetera.

"Celulas T CD8+" representa una clase de linfocitos T caracterizados por la posesion del marcador de superficie de celulas CD8. Las celulas T CD8+ son "las CTL" restringidas de Clase I MHC o "celulas T supresoras".

"Celulas T CD4+" representa una clase de linfocitos T caracterizada por la posesion del marcador de superficie de celulas CD4. Las celulas T CD4+ son linfocitos T restringidos de Clase II MHC. Hay dos tipos de celulas T CD4+ referidas como “celulas T colaboradoras” de tipo 1 o tipo 2.

Se genera una respuesta inmunitaria a un antigeno por la interaccion del antigeno con las celulas del sistema inmunitario. La respuesta inmunitaria resultante puede distinguirse ampliamente en respuestas inmunitarias humorales o mediadas por celulas (caracterizadas tradicionalmente por anticuerpo y mecanismos de efector celular de proteccion, respectivamente). Estas categonas de respuesta han sido denominadas respuestas de tipo Th1 (respuesta mediada por las celulas) y respuestas inmunitarias de tipo Th2 (respuesta humoral). Las respuestas inmunitarias de tipo Th1 se pueden caracterizar por la generacion de las CTL restringidas de haplotipo, espedficas de antfgeno y respuestas de celulas asesinas naturales. En los ratones, las respuestas de tipo Th1 se caracterizan con frecuencia por la generacion de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano estas corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 se caracterizan por la generacion de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en IgG1, IgA e IgM de ratones.

Una fuerza impulsora detras del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunitarias son las citocinas, una serie de mensajeros de protemas identificados que sirven para ayudar a las celulas del sistema inmunitario y dirigir la eventual respuesta inmunitaria a una respuesta de Th1 o Th2. Asf, los altos niveles de citocinas de tipo Thl tienden a favorecer la induccion de respuestas inmunitarias mediadas por celulas al antfgeno determinado, mientras que los niveles altos de citocinas de tipo Th2 tienden a favorecer la induccion de las respuestas inmunitarias humorales al antfgeno. Es importante recordar que la distincion de las respuestas inmunitarias de tipo Th1 y Th2 no es absoluta. Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 se asocian a la produccion de las citocinas INF-y e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas asociadas directamente con frecuencia a la induccion de respuestas inmunitarias de tipo Th1 no son producidas por celulas T, tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas de tipo Th2 se asocian con la secrecion de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y factor de necrosis tumoral-p (TNF-p).

Una diferencia entre celulas B y celulas T es como el antfgeno reconoce las celulas By T. Las celulas B reconocen antfgeno en su forma natural. Por ejemplo, reconocen el antfgeno en la sangre o linfa usando dominios de reconocimiento de antfgeno ligado a membrana que comprenden inmunoglobulina ligada. Las celulas T, tales como las celulas T colaboradoras, reconocen antfgeno en una forma tratada, como un fragmento peptfdico presentado por una molecula MHC de celulas que presentan antfgeno al receptor de celulas T.

Cuando una celula B reconoce un antfgeno, la celula B ingiere por un procedimiento de endocitosis el antfgeno en asociacion con el dominio de inmunoglobulina que reconoce el antfgeno. La celula B trata entonces el antfgeno y une partes del antfgeno a una protema MHC. Este complejo se mueve al exterior de la membrana celular, donde puede ser reconocido por un linfocito T, que es compatible con estructuras similares sobre la membrana celular de un linfocito B. Si las estructuras de la celula B y la celula T coinciden, el linfocito T activa el linfocito B, que produce anticuerpos contra los fragmentos de antfgeno presentados en su superficie.

La mayona de los antfgenos son T-dependientes, asf las celulas colaboradoras T CD4+ requenan maxima produccion de anticuerpos. Cuando una celula B trata y presenta un antfgeno apropiado a una celula T, la celula colaboradora T segrega citocinas que activan la celula B. Estas citocinas desencadenan la proliferacion de celulas B y la diferenciacion en celulas plasmaticas y la produccion de anticuerpo. Las celulas T supresoras que comprenden CD8, por otra parte, reducen la produccion de anticuerpo. Las celulas T supresoras son esenciales en la regulacion de respuestas inmunitarias en particular cuando se relacionan con antfgenos propios.

El termino "polipeptido Fc" como se usa en la presente memoria incluye formas naturales y de mutema de polipeptidos formados de la region Fc de un anticuerpo que comprende cualquiera o todos los dominios CH de la

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region Fc. Polipeptidos Fc ejemplares comprenden un polipeptido Fc procedente de un anticuerpo IgG1 humano. Como una alternativa, se prepara un polipeptido de fusion usando polipeptidos procedentes de inmunoglobulinas ligados de manera operable a un polipeptido antigenico (por ej., pCons). La preparacion de polipeptidos de fusion que comprenden ciertos polipeptidos heterologos fusionados a varias porciones de polipeptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) se ha descrito, por ej., por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10.535, 1.991); Byrn et al. (Nature 344:677, 1.990) y Hollenbaugh and Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Polypeptides", en Current Protocols in Immunology, Supl. 4, paginas 10.19.1-.10.19.11, 1.992). Tisch et al. (The Journal of Immunology, The Williams and Wilkins co. Baltimore, vol. 166, n° 3, Enero de 2.001, pags. 2.122-2.132) describen una construccion genica que codifica una protema de fusion que consta de un fragmento de acido glutamico descarboxilasa 65 (GAD65) ligada a IgGFc e IL-4.

Una construccion Fc de fusion o minigen comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido/polipeptido de fusion de Fc. Dicho minigen puede ser insertado en un vector de expresion apropiado. El polipeptido/polipeptidos de fusion Fc se expresan en celulas huesped transformadas o transinfectadas con el vector de expresion recombinante o polinucleotido recombinante que codifica el polipeptido de fusion y se permite que se ensamblen y sean procesados. Un polipeptido Fc adecuado, descrito en la solicitud de patente internacional PCT WO 93/10151, es un polipeptido de cadena unica que se extiende desde la region bisagra N-terminal al C-terminal natural de la region Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipeptido Fc util es la mutema Fc descrita en la Patente de EE.UU. N° 5.457.035 y en Baum et al., (EMBO J. 13:3.992, 1.994).

La secuencia de aminoacidos de esta mutema es identica a la de la secuencia Fc natural presentada en la patente internacional WO 93/10151, excepto que el aminoacido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoacido 20 se ha cambiado de Leu a Glu y el aminoacido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. Los polipeptidos de fusion ya descritos que comprenden restos Fc ofrecen la ventaja de ser tratados por APC de manera que se presenten apropiados por aPc. En otras realizaciones, los polipeptidos de la invencion pueden ser sustituidos por la porcion variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo. Un “polinucleotido” se refiere en general a cualquier polirribonucleotido (ARN) o polidesoxirribonucleotido (aDn), que puede ser ARN o ADN no modificado o modificado. Los polinucleotidos incluyen, sin limitacion, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Los polinucleotidos tambien incluyen moleculas hforidas que comprenden ADN y ARN que puede ser monocatenario, o mas tfpicamente, bicatenario o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Ademas, "polinucleotido" se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Los polinucleotidos tambien incluyen ADNs o ARNs con una o mas bases modificadas y los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otras razones. Bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se puede realizar una variedad de modificaciones a aDn y ARN; asf, "polinucleotido" abarca formas modificadas de manera qrnmica, de manera enzimatica o de manera metabolica de polinucleotidos como se encuentran tfpicamente en la naturaleza, asf como las formas qrnmicas de ADN y ARN caractensticas de virus y celulas. Los oligonucleotidos son polinucleotidos relativamente cortos. Ejemplos de polinucleotidos usados en los metodos y las composiciones de la invencion comprenden un polinucleotido que codifica un peptido con determinantes de celulas T en IgG de mamffero, por ej., IgG de murina o IgG humano, en particular el peptido de consenso pCons (FIEWNKLRFRQGLEW (SEC ID N°: 2), que une I-Ed y Kd). El peptido artificial pCons se basa en un algoritmo que define las secuencias de aminoacidos estimuladoras de celulas T de las regiones Vh de anticuerpos IgG de murina a ADN (Hahn et al., Artritis & Rheumatism, John Wiley & Sons, Inc., US, vol. 44, n° 2, Febrero de 2.001, pags. 432-441). En un aspecto, el polinucleotido comprende la secuencia 5'- TTTATCGAGTGGAATAAGCTGCGATTTCGTCAGGGCCTGGAGTGG-3' (SEC ID N°: 1). Ademas, la invencion describe un polinucleotido que codifica una variante o fragmento funcional del peptido de consenso pCons, por ej., una variante en la que 1, 2 o 3 aminoacidos de la secuencia pCons han sido sustituidos por diferentes aminoacidos o un fragmento funcional de pCons que comprende 10, 11, 12, 13 o 14 aminoacidos consecutivos de pCons o una variante de los mismos.

Un "polipeptido" se refiere a cualquier polipeptido que comprenda dos o mas aminoacidos unidos entre sf por enlaces peptfdicos o enlaces peptfdicos modificados. Un “polipeptido” se refiere a ambas cadenas cortas, referido comunmente como peptidos, oligopeptidos u oligomeros y a cadenas mas largas, referidas en general como protemas. Los polipeptidos pueden contener aminoacidos distintos de los codificados normalmente por un codon. Preferiblemente, los polipeptidos comprenden un peptido con determinantes de celulas T en IgG de mamffero, por ej., IgG de murina o IgG humano. Un polipeptido ejemplar comprende pCons (SEC ID N°: 2). Ademas, la invencion describe una variante o fragmento funcional del peptido de consenso pCons, por ej., una variante en la que 1, 2 o 3 aminoacidos de la secuencia pCons han sido sustituidos por diferentes aminoacidos. Este polipeptido presenta preferiblemente una longitud de al menos 10, por ej., al menos 15 aminoacidos y hasta 100, por ej., hasta 20 aminoacidos. En otro aspecto, un polipeptido pCons de SEC ID N°:2 o una variante o fragmento del mismo puede incluir uno o mas D-aminoacidos. Los D-aminoacidos (en contraste con L-aminoacidos) aumentan la bioestabilidad y reducen la degradacion por enzimas.

Los polipeptidos incluyen secuencias de aminoacidos modificadas por procedimientos naturales, tales como tratamiento postraduccional o por tecnicas de modificacion qrnmica que son conocidas en la tecnica. Dichas modificaciones estan descritas en la bibliograffa y son conocidas en la tecnica. Pueden tener lugar modificaciones en

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cualquier parte de un polipeptido, incluyendo la cadena principal peptidica, las cadenas secundarias de los aminoacidos y los extremos amino o carboxilo. Dichas modificaciones pueden estar presentes para grados iguales o variables en varios sitios en un polipeptido determinado. Tambien, un polipeptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipeptidos pueden ser ramificados como resultado de ubiquitinacion y pueden ser dclicos, con o sin ramificacion. Los polipeptidos dclicos, ramificados y dclicos ramificados pueden proceder de procedimientos naturales postraduccionales o se pueden preparar por metodos sinteticos. Las modificaciones incluyen acetilacion, acilacion, ribosilacion de ADP, amidacion, biotinilacion, union covalente de flavina, union covalente de un resto heme, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un lfpido o derivado de lfpido, union covalente de fosfotidilinositol, reticulacion, ciclizacion, formacion de enlace disulfuro, desmetilacion, formacion de reticulaciones covalentes, formacion de cistina, formacion de piroglutamato, formilacion, gamma-carboxilacion, glucosilacion, formacion de anclaje de GPI, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, tratamiento proteolftico, fosforilacion, prenilacion, racemizacion, selenilacion, sulfacion, adicion mediada por ARN de transferencia de aminoacidos a protemas tales como arginilacion y ubiquitinacion. El polipeptido util en los metodos y composiciones de la invencion comprende el polipeptido pCons presentado en la SEC iD N°: 2.

La invencion proporciona antigenos pCons que son inmunoprotectores por generacion de inmunotolerancia. Dichos antigenos se pueden suministrar en una serie de maneras al huesped de manera que se estimule una respuesta inmunitaria protectora tolerogenica. Por ejemplo, el antigeno propio (por ej., pCons) se puede suministrar como un polipeptido de fusion. El polipeptido de fusion comprende un antfgeno propio ligado a un polipeptido heterologo o molecula pequena. En particular, la presente invencion se refiere a un polipeptido de fusion que comprende un primer dominio que comprende un antigeno propio que es una secuencia conservada encontrada en determinantes de celulas T en la region FR1/CDR1 de Vh de anticuerpos IgG humano y murino, en el que el antfgeno propio es la SEC ID N°: 2 y un segundo dominio que comprende un polipeptido heterologo o molecula pequena. Tfpicamente, el polipeptido heterologo o molecula pequena ayuda en la absorcion, tratamiento o suministro del antfgeno propio. Los polipeptidos heterologos ejemplares incluyen polipeptidos Fc, dominios de transduccion de protemas (por ej., TAT), u otro polipeptido adyuvante conocido en la tecnica. Ventajosamente, la invencion demuestra que el antfgeno pCons suministrado por presentacion somatica de celulas B proporciona respuesta tolerogenica mejorada comparado con inyeccion directa.

Los antfgenos de la presente invencion pueden ser administrados a un individuo con necesidad de los mismos, por ejemplo como una vacuna de polinucleotidos, una vacuna de polipeptidos o una vacuna viva.

La invencion proporciona un minigen que comprende el antfgeno propio pCons en asociacion operable con una secuencia codificadora de polipeptidos Fc. El minigen se usa para suministrar el antfgeno al sistema inmunitario de un individuo.

Alternativamente, los antfgenos se pueden suministrar por administracion directa del polipeptido a un individuo con necesidad del mismo.

Los antfgenos pueden ser suministrados mediante un vector atenuado o celula lograda geneticamente comprendiendo un minigen de la invencion que da como resultado la presentacion del antfgeno via clase I y/o II MHC. El termino “atenuado”, cuando se usa con respecto a una bacteria o virus, significa que el vector (por ejemplo, bacteria o virus) ha perdido algo o toda su capacidad para proliferar y/o ocasionar enfermedad u otro efecto adverso cuando la bacteria infecta a un organismo. Por ejemplo, una bacteria “atenuada” puede ser incapaz de replicarse en absoluto o puede limitarse a uno o algunos ciclos de replicacion. Alternativamente o adicionalmente, una bacteria “atenuada” podfa presentar una o mas mutaciones en un gen o genes que esten implicados en patogenicidad de las bacterias. Se conocen muchos genes, puntos u operones, mutaciones en que dara como resultado una bacteria atenuada. Los ejemplos de bacterias atenuadas usadas como vacunas vivas incluyen S. typhi que soporta una mutacion en su gen galE o htrA y V. cholerae que soporta mutaciones en su gen ctxA. El suministro de pCons, por ejemplo, en un vector atenuado logrado geneticamente dana como resultado la endocitosis y la presentacion de pCons en asociacion con MHC de manera que se supriman de manera apropiada las celulas T como se describio anteriormente.

Los microorganismos que se usan para expresar los PCON para uso en composiciones inmunoprotectoras incluyen, sin limitacion, Campylobacter sp. Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Lactobacillis sp., Estreptococcus gordonii, Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. y Escherichia coli (veanse por ej., las Patentes de EE.UU. N° 5.858.352 y 6.051.416 y Levine et al., en "New Generation Vaccines Second Edition" ed. Levine et al., Marcel Dekker, Inc. pags 351-361 (1.997), Levine et al., en "New Generation Vaccines Second Edition" ed. Levine et al., Marcel Dekker, Inc. pags 437-446 (1.997), Butterton et al., en "New Generation Vaccines Second Edition" ed. Levine et al., Marcel Dekker, Inc. pags 379-385 (1.997) y Fennelly et al., en "New Generation Vaccines Second Edition" ed. Levine et al., Marcel Dekker, Inc. pags 363-377 (1.997)). Por ejemplo, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Helicobacter pylori, Helicobacter felis, Gastrospirillum hominus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Bacteroides fragilis, Clostridium difficile, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae y Enterococcus faecalis. Escherichia coli incluye

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pero no se limita a cepas entero-toxicas, entero-hemorragicas, entero-invasivas, entero-patogenicas u otras cepas puede ser usadas en la invencion.

Alternativamente, o en adicion a, se puede usar un vector atenuado no bacteriano tal como vectores vmcos deficientes de replicacion que comprenden un minigen de la invencion en los metodos y composiciones de la invencion. Dichos vectores vmcos utiles en los metodos y las composiciones de la invencion incluyen, pero no se limitan a, Vacuna, Avipox, Adenovirus, AAV, virus Vacuna NYVAC, cepa vacuna modificada Ankara (MVA), virus del bosque Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana y virus del herpes.

En aun un aspecto mas, las celulas que presentan antigeno autologo o alogenico (por ejemplo, celulas B) pueden ser logradas geneticamente usando un vector de expresion adecuado (incluyendo vectores vmcos) ex vivo tal que pCons se exprese dentro de la celula en asociacion con un polipeptido Fc para facilitar el tratamiento y la presentacion por APC.

Ejemplos de vectores vmcos adecuados incluyen vectores vmcos del herpes simple, vectores vacuna o alfa-virus y retrovirus, incluyendo lentivirus, adenovirus y virus adeno-asociados. En una realizacion, estos vectores son vectores vmcos de replicacion defectuosa. Las tecnicas de transferencia de genes que usan estos virus son conocidas por los expertos en la materia. Los vectores retrovmcos, por ejemplo, se pueden usar para integrar de manera estable el polinucleotido de la invencion en el genoma huesped, aunque dicha recombinacion puede no ser aconsejable. Los vectores de adenovirus de replicacion defectuosa por el contrario siguen siendo episomales y por lo tanto permiten la expresion transitoria.

En una realizacion espedfica, el adenovirus usado como un vector vivo es un adenovirus humano o de simio de replicacion defectuosa. Tfpicamente estos virus contienen una supresion E1 y pueden cultivarse en estirpes celulares que se transforman con un gen E1. Los adenovirus de simio adecuados son, por ejemplo, virus aislados de Chimpance. Los ejemplos de virus adecuados para uso en la presente invencion incluyen C68 (tambien conocido como Pan 9) (Patente de EE.UU. N° 6.083.716) y Pan 5, 6 y Pan 7 (Patente Internacional WO 03/046124). Asf, estos vectores se pueden manipular para insertar un polinucleotido heterologo codificador de un antfgeno o minigen de manera que se exprese el producto. La formulacion de uso y fabricacion de dichos vectores adenovmcos recombinantes se explica con detalle en la Patente Internacional WO 03/046142.

La invencion proporciona una composicion y vacuna inmunogenica que usa un metodo para facilitar que suministre antfgenos inmunogenicos pCons y facilita el tratamiento de manera que proporcione una presentacion antigenica telerogenica similar al tratamiento natural. Se suministran antfgenos pCons en uno o mas vectores capaces de inducir presentacion via Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) Clase II y Clase I.

El vector de suministro atenuado libera antfgenos potencialmente inmunoprotectores que comprenden un polipeptido Fc unido de manera operable a un antfgeno propio (por ej., pCons) en el citoplasma de la celula huesped, despues de que se han tratado y presentado al sistema inmunitario. Tales antfgenos se presentan al sistema inmunitario via moleculas de clase I de MHC, dando como resultado el cebado de celulas T CD8 incluyendo celulas T supresoras.

La invencion demuestra que la transferencia de minigenes de peptidos de consenso IgG somatica puede reducir hipergammaglobulinemia y retrasar la enfermedad renal en modelos animales reconocidos de LES (por ej., ratones NZB/W F1). La produccion sostenida de IgG que causa sobrecarga de Ig (un smtoma de LES) puede ser suprimida por celulas T CD8+. Cabe destacar, la supresion de respuestas de celulas T CD4+ por supresores de CD8+CD28- inducidos por minigenes presenta analogfas interesantes con observaciones previas por Suciu-Foca y colaboradores, donde las celulas T CD8+CD28- espedficas de Ag restringidas de clase I de MHC fueron capaces de suprimir respuestas proliferativas de celulas T CD4+ espedficas de Ag via mecanismos que inclman anergia en sus dianas. Tambien, el hallazgo de un efecto protector de celulas T CD8+CD28- en LES puede ser de interes en relacion con los hallazgos previos de una correlacion entre funcion deficiente de celulas supresoras T CD8+ y actividad de enfermedad en pacientes de LES.

El mecanismo de proteccion inducida por transferencia de minigenes somatica de pCons difiere de lo que se observo cuando se administra pCons como peptido soluble para ratones NZB/W F1. En esos experimentos, se observo una extension de celulas que expresan Foxp3 que no se observa usando pCons como minigen. Las diferencias pueden estar relacionadas con el hecho de que los peptidos solubles in vivo han acelerado el catabolismo cuando se compara con la semivida de los productos codificados de vacunas genicas. Tambien, la disponibilidad in vivo a largo plazo de pCons a APC y/o las celulas T supresoras proporcionadas por vacunacion de minigenes conduce a respuesta prolongada o a una diferente manipulacion para celulas inmunitarias. Por ejemplo, los minigenes podfan producir disponibilidad de genes codificados dentro de la ruta endodtica (donde tiene lugar carga de moleculas de MHC) - de un modo similar a la manipulacion de antfgenos endogenos (Ag) - en vez de proporcionar absorcion de Ag exogeno como para peptido soluble. Cualquier caso puede contribuir a los efectos protectores de minigen pCons, el estudio extiende la aplicabilidad de la vacunacion de celulas B somaticas a nuevas posibilidades. La transferencia somatica de los minigenes en tan poco como 70 celulas B se mostro que era eficaz en la induccion de inmunidad de celulas T protectoras contra el virus de la influenza.

La invencion demuestra que la transferencia de minigenes de celulas B somaticas puede inducir respuestas

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tolerogenicas protectoras en la autoinmunidad. Las implicaciones de esta memoria descriptiva indican nuevas posibilidades para la intervencion con esta estrategia y sugiere que la induccion de supresor T CD8+ via este metodo puede modular circuitos inmunoreguladores e hipergammaglobulinemia.

Una “vacuna” como se usa en la presente memoria se refiere a una composicion de materia que comprende una molecula que, cuando se administra a un individuo, induce una reaccion inmunitaria. En un aspecto, la reaccion inmunitaria es una supresion de activacion de celulas T en a un antigeno propio tal como PCons. Las vacunas pueden comprender moleculas de polinucleotido, moleculas de polipeptidos y moleculas de carbohidratos, as^ como derivados y combinaciones de cada uno, tales como glucoprotemas, lipoprotemas, conjugados de carbohidrato- protema, fusiones entre dos o mas polipeptidos o polinucleotidos y similares. Una vacuna puede comprender ademas un diluyente, un adyuvante, un portador o combinaciones de los mismos, como entendenan facilmente los expertos en la materia.

Una vacuna puede estar constituida por componentes separados. Como se usa en la presente memoria, “componente separados” se refiere a una situacion en la que la vacuna comprende dos vacunas discretas que se tienen que administrar por separado a un individuo. En ese sentido, una vacuna constituida por componentes separados se puede considerar como un estuche o un envase que comprende componentes de vacuna separados. Por ejemplo, en el contexto de la invencion, un envase puede comprender una primera composicion inmunogenica que comprende un vector bacteriano atenuado y una segunda composicion antigenica que comprende un vector vmco atenuado que comprende los mismos antfgenos propios o diferentes.

Una vacuna “induce” una reaccion inmunitaria cuando el antfgeno o los antfgenos presentes en la vacuna producen que el individuo vacunado suba o reduzca una respuesta inmunitaria a ese antfgeno o antfgenos. El individuo vacunado generara una respuesta inmunitaria, como se pone de manifiesto por la activacion de, o la reduccion (supresion) del sistema inmunitario, que incluye la produccion de celulas B espedficas de antfgeno de vacuna y la supresion de celulas T CD4+ con actividad aumentada de celulas T CD8+CD28-. La respuesta inmunitaria resultante se puede medir por varios metodos incluyendo ELISPOT, ELISA, ensayos de liberacion de cromo, coloracion de citocinas intracelulares, analisis FACS y coloracion de tetramero de MHC (para identificar celulas espedficas de peptido). Un experto tambien puede usar estos metodos para medir una respuesta inmunitaria primaria o una respuesta inmunitaria secundaria.

Un “antfgeno” es una sustancia capaz de generar una respuesta inmunitaria en un individuo expuesto al antfgeno. Los antfgenos son normalmente polipeptidos y son el foco de la respuesta inmunitaria del huesped. Un “epftopo” o “determinante antigenico” es esa parte de un antfgeno al que se unen de manera espedfica celulas T y anticuerpos. Un antfgeno puede contener epftopos multiples. Los antfgenos de la invencion comprenden preferiblemente una secuencia conservada encontrada en determinantes de celulas T en la region FRI/CDR1 de VH de anticuerpos de IgG humano y murino. Un ejemplo de dicho antfgeno incluye pCons que comprende la SEC ID N°: 2.

En varios aspectos de la invencion, el antfgeno propio (por ej., pCons) esta conectado de manera operable a un polipeptido Fc u otro polipeptido heterologo por uso de un ligador. En el caso de que se use un minigen, la region codificadora de antfgeno propio y el polipeptido Fc se puede separar por una region codificadora del ligador. Tfpicamente un ligador sera un resto ligador peptfdico. La longitud del resto ligador se elige para optimizar la actividad biologica de expresion de un polipeptido de fusion de antfgeno propio-Fc y se pueden determinar de manera empmca sin experimentacion excesiva. El resto ligador puede ser un peptido entre aproximadamente uno y 30 restos de aminoacidos de longitud, tfpicamente entre aproximadamente dos y 15 restos aminoacido. Los restos ligadores ejemplares son:

--Gly-Gly-, GGGGS (SEC ID N°:3), (GGGGS)n (SEC ID N°:4), GKSSGSGSESKS (SEC ID N°:5), GSTSGSGKSSEGKG (SEC ID N°:6), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEC ID N°:7), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEC ID N°:8) o EGKSSGSGSESKEF (sEc ID N°:9). Los restos ligadores se describen, por ejemplo, en Huston, J. S., et al., PNAS 85: 5.879 (1.988), Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6: 989 (1.993) y Newton, D. L., et al., Biochemistry 35: 545 (1.996). Otros ligadores peptfdicos adecuados son los descritos en las Patentes de EE.UU. N° 4.751.180 y 4.935.233. Una secuencia de ADN que codifica un ligador peptfdico deseado se puede insertar en medio y en el mismo marco de lectura como secuencias de ADN de la invencion, usando cualquier tecnica convencional adecuada. Por ejemplo, el ligador que codifica oligonucleotido sintetizado de manera qrnmica puede ser ligado entre una secuencia de polinucleotidos pCons y una secuencia de polinucleotidos Fc. En algunas realizaciones, un polipeptido de fusion puede comprender de dos a cuatro dominios de antfgeno propio (por ej., pCONs) y polipeptido Fc, separados por ligadores peptfdicos.

Cada composicion tolerogenica (vacuna) que comprende un minigen de la invencion expresado en un vector atenuado o celula inmunitaria autologa o alogenica se administra, por ejemplo, por via subcutanea, por via intramuscular, por via intranasal, inhalado o incluso por via oral a un individuo mamffero. La composicion/vacuna se puede administrar como parte de una estrategia cebador-reforzador homologo o heterologo.

Las vacunas atenuadas se pueden administrar directamente al marnffero. Las composiciones inmunogenicas y las vacunas obtenidas usando los metodos de la invencion se pueden formular como composiciones farmaceuticas para administracion de cualquier manera adecuada. Una via de administracion es oral. Otras vfas de administracion

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incluyen rectal, intratecal, bucal (por ej., sublingual), inhalacion, intranasal y transdermica y similares (vease por ej., la Patente de EE.UU. N° 6.126.938). Aunque se puede usar mas de una ruta para administrar una composicion particular, una ruta particular puede proporcionar con frecuencia una reaccion mas inmediata y mas eficaz que otra ruta (por ej., via ingeniena celular ex-vivo).

Se proporcionan las composiciones inmunoprotectoras que se tienen que administrar en una disolucion farmaceuticamente aceptable tal como una disolucion acuosa, con frecuencia una disolucion salina o disolucion tamponada. Hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmaceuticas de la invencion. Vease, por ej., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Vols. 1-3 (1.998); Remington's Pharmaceutical Science, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1.985) y publicaciones similares. Las composiciones tambien pueden incluir un adyuvante.

Las formulaciones adecuadas para administracion oral pueden comprender: (a) disoluciones lfquidas, tales como una cantidad eficaz de la celula recombinante suspendida en diluyentes, tal como agua tamponada, disolucion salina o PEG 400; (b) capsulas, bolsitas o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de la composicion inmunogenica; (c) las suspensiones en un lfquido apropiado y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de comprimido pueden incluir uno o mas de: lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidon de mafz, almidon de patata, tragacanto, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, dioxido de silicio coloidal, croscarmelosa de sodio, talco, estearato de magnesio, acido estearico y otros excipientes, colorantes, cargas, aglutinantes, diluyentes, agentes tampon, agentes humectantes, conservantes, saborizantes, colorantes, agentes disgregantes y portadores farmaceuticamente compatibles. Las formas de rombo pueden comprender el principio activo en un sabor, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto, asf como pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte, tal como emulsiones de gelatina y glicerina o sacarosa y goma arabiga, geles y similares que contienen, ademas del principio activo, portadores conocidos en la tecnica. Se reconoce que las vacunas atenuadas o preparaciones celulares, cuando se administran por via oral, se deben proteger de la digestion. Esto se lleva a cabo tipicamente por complejacion de las vacunas con una composicion para hacerla resistente a hidrolisis acida y enzimatica o por envasado de las vacunas en un portador apropiadamente resistente tal como capsulas recubiertas de liposomas o entericas. Los medios para proteger las bacterias atenuadas, virus o preparacion celular de la digestion son conocidos en la tecnica. Las composiciones farmaceuticas pueden ser encapsuladas, por ejemplo, en los liposomas, o en una formulacion que proporcione liberacion lenta del principio activo.

Las vacunas atenuadas, solas o en asociacion con otros componentes adecuados, se pueden preparar en formulaciones de aerosol (por ej., pueden ser “nebulizadas”) para ser administradas via inhalacion. Las formulaciones de aerosol se pueden poner en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrogeno y similares.

Las dosis administradas a un individuo, en el contexto de la invencion debenan ser suficientes para efectuar una respuesta terapeutica y/o profilactica beneficiosa en el individuo con el tiempo. La dosis se determinara por la eficacia de la composicion inmunotolerogenica particular empleada y la afeccion del paciente, asf como el peso corporal o superficie vascular del individuo que se tiene que tratar. El tamano de la dosis tambien se determinara por la existencia, naturaleza y extension de cualquier efecto secundario adverso que acompane a la administracion de una vacuna particular en un individuo particular.

En la determinacion de la cantidad eficaz de la vacuna que se tiene que administrar en el tratamiento o la profilaxis de una infeccion u otra enfermedad, el medico evalua las toxicidades de la vacuna, la progresion de la enfermedad y la produccion de anticuerpos a la respuestas del antfgeno propio o la celula colaboradora T, si hay.

Las composiciones se administran a un individuo que presenta o esta en riesgo de adquirir un trastorno o enfermedad autoinmunitarios (por ej., LES) para al menos evitar o al menos detener parcialmente el desarrollo de la enfermedad o trastorno y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para llevar a cabo esto se define como una “dosis terapeuticamente eficaz”. Las cantidades eficaces para uso terapeutico dependeran de, por ejemplo, la composicion inmunotolerogenica, la manera de administracion, el peso y el estado general de salud del individuo, y el juicio del medico que le atiende. Se pueden administrar dosis unicas o multiples de las composiciones dependiendo de la dosis y la frecuencia requeridas y toleradas por el individuo y la via de administracion. Ademas, se puede administrar un reforzante en la misma formulacion o diferente.

En realizaciones particulares, se administra una dosis terapeuticamente eficaz de la composicion inmunoprotectora a un individuo. Las cantidades de bacterias atenuadas vivas o no bacterias que expresan el polipeptido de fusion PCONs-Fc u otros antfgenos oscilan en general de aproximadamente 5x105 a 5x1011 organismos por individuo y mas comunmente de aproximadamente 5x108 a 5x109 organismos por individuo.

La existencia de una respuesta inmunitaria a la primera dosis de la composicion inmunoprotectora se puede determinar por metodos conocidos (por ejemplo, obteniendo suero del individuo antes y despues de la inmunizacion inicial y demostrando un cambio en el estado inmunitario del individuo, por ejemplo un ensayo de inmunoprecipitacion o un ELISA, o un metodo Western, o ensayo de flujo citometrico o similar) previamente a la administracion de una dosis posterior. La existencia de una respuesta inmunitaria (por ej., una respuesta inmunitaria reducida) a la primera dosis se puede asumir tambien esperando durante un periodo de tiempo despues de la

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primera inmunizacion que, basado en la previa experiencia, es un tiempo suficiente para que tenga lugar una respuesta inmunitaria.

Las composiciones inmunoprotectoras se administran tfpicamente a un individuo que es inmunologicamente original con respecto a PCONs. Normalmente, pueden ser suficientes 2-4 dosis de una composicion inmunologica de la invencion, sin embargo pueden requerirse dosis adicionales para conseguir un alto nivel de inmunidad. En general, la administracion a cualquier individuo debena empezar previamente al primer signo de enfermedad.

La toxicidad y la eficacia terapeutica de la composicion proporcionada por la invencion se determina usando procedimientos farmaceuticos clasicos en cultivos celulares o animales experimentales. Se puede determinar la ED50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion) usando procedimientos presentados en la presente memoria y los conocidos de otro modo por los expertos en la materia.

Un minigen de la descripcion se puede envasar para uso en los laboratorios clmicos y de investigacion. Por ejemplo, se puede proporcionar un minigen de la invencion que comprende un polinucleotido que codifica un pCONs ligado de manera operable a un polipeptido Fc para uso en la generacion de un vector de expresion. Alternativamente, se puede proporcionar el minigen en un vector de expresion. En otro aspecto mas, el minigen puede ser proporcionado en un vector huesped para uso en inmunizacion de un individuo. La composicion inmunogenica de la invencion se puede envasar en paquetes, dispositivos dispensadores y estuches para administrar vacunas geneticas a un mairnfero. Por ejemplo, se proporcionan paquetes o dispositivos dispensadores que contienen una o mas formas farmaceuticas unitarias. Tfpicamente, las instrucciones para administracion de los compuestos se proporcionaran con el envase, junto con una indicacion adecuada en la etiqueta de que el compuesto es adecuado para tratamiento de una afeccion indicada.

Los siguientes ejemplos espedficos se destinan a ser ilustrativos y no limitantes. Los expertos en la materia reconoceran varias modificaciones y sustituciones que se pueden realizar en las composiciones y metodos que siguen. Dicha modificacion y las sustituciones no se apartan de la invencion y estan incluidas en la misma.

Ejemplos

Materiales y metodos

Ratones. Se adquirieron ratones (NZB x NZW)Fi (NZB/W F1) (H-2d/z) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) o se criaron en UCLA y se trataron de acuerdo con las directrices Institucionales. Todos los experimentos se realizaron en ratones hembra.

Antfgenos. El peptido de consenso pCons (FIEWNKLRFRQGLEW, que une I-Ed y Kd) y el peptido de control negativo pNeg (AlAWAKARARQGLEW) son peptidos sinteticos que contienen determinantes de celulas T comunes a varias regiones Vh J558 diferentes de IgG anti-ADNds de ratones NZB/W F111. Otro peptido de control, pHyHEL (VKQRPGHGLEWIGEI), procede de la region Vh CDR 1/marco 2 de un mAb murino a lisozima de huevo de gallina (HEL, por sus siglas en ingles) y tambien une I-Ed 10 Se sintetizaron peptidos por un metodo microcorona en Chiron (San Diego, CA), purificados para unico pico en HPLC y analizado por espectrometna de masas para el contenido en aminoacidos esperado.

Construcciones de plasmido de minigenes. El vector pCMVscript (pCMV) (Stratagene, La Jolla, CA) contiene el activador de citomegalovirus (CMV) que conduce la expresion de insertos clonados en celulas de mai^ero. Usando pCMV como cadena principal, se insertaron minigenes en el sitio EcoRI del poliligador. El plasmido pig codifica Ch2- Ch3 de IgG1 clonado por PCR de PBMC humano. El cebador sentido contiene un codon de iniciacion y el sitio de restriccion Xbal (subrayado): 5-ATGTCTAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC-3', el cebador antisentido es espedfico para el extremo 3' de higG1 (5'-CGGCCGTCGCACTCATTTACC-3'). Las condiciones de ciclacion de PCR fueron: 95°C para 2 min, seguido por 94°C para 30 s, 57°C para 30 s y 72°C para 45 s para 30 ciclos, despues 72°C para 10 min. Los plasmidos pigCons y pigNeg codifican tanto pig como peptidos pCons o pNeg, respectivamente (Figura 1a). Los oligonucleotidos para pCons fueron:

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CT AGATTT ATCG AGTGGAAT AAGCTGCG ATTT CGT CAGGGCCT G G AGT G GA-3’ y

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CT AGTCCACT CCAGGCCCT GACGAAATCGCAGCTTATTCCACT CGAT AA AT-3’,

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CTAGT CCACT CT AAAC CTTGTCTAG CGC G AG CTTT AG CCC AAG CG ATAG CT-3’.

Para cada plasmido, se hibridaron los oligonucleotidos sentido y antisentido y se insertaron en el marco en el extremo 5' de la secuencia IgG1 humana en los sitios Xbal. Se purifico ADN de plasmido de E. Coli transformada usando estuches Maxi-prep endo-exentos (Qiagen, Valencia, CA). La extraccion de ARN total y la smtesis de ADNc para la expresion de confirmacion de RT-PCR de transcripciones de ARNm se realizaron siguiendo procedimientos clasicos. Se extrajo ARN celular total con reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) a partir de 3 x 106 celulas. Se realizo RT-PCR usando el RT-PCR de Una Etapa Invitrogen Superscript con estuche Platinum Taq en un termociclador Hybrid PCR Express (Milford, MA). Se realizo multiplicacion con el cebador antisentido comun 5'- GTCACAAGATTTGGGCTCaAc-3' y los siguientes cebadores sentido: para IgGi, 5'-

ATGTCTAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC-3'; para pCons, 5'-ATGTCTAGATTTATCGAGTGG-3'; para pNeg, 5'- ATGTCTAGAGCTATCGCTTG-3'.

Las condiciones PCR usadas fueron: 95°C para 2 min, seguido por 94°C para 30 s, 57°C para 30 s, 72°C para 45 s para 30 ciclos y 72°C para 10 min. Los genes constitutivos p-actina se multiplicaron en paralelo usando las mismas condiciones PCR con los cebadores: 5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3' y 5'-

CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3'. Se realizaron analisis de secuencias por secuenciacion automatizada en una maquina ABI 3100 usando Big Dye Terminator (Applied Biosystem, Foster City, CA).

En experimentos seleccionados, se transinfectaron celulas COS-7 eucariotas (ATCC, Manassas, VA) con los plasmidos usando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN), segun las instrucciones del fabricante. Se realizo la resolucion de lisados de protemas por metodo western usando un conjugado IgGi-HRP anti-humano de cabra (Sigma, Saint Louis, MO).

Transferencia de minigenes de celulas B somatica. Se ha descrito la transferencia de minigenes de celulas B somatica con detalle en otra parte. En resumen, se prepararon suspensiones de celulas de bazo unicas de ratones en condiciones asepticas y celulas B seleccionadas para enriquecimiento (> 96%) usando perlas magneticas anti- CD19 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) en un separador VarioMACS (Miltenyi Biotec). Se volvieron a suspender 4 x 106 celulas B purificadas en 200 jl de PBS que contema Ca2+ y Mg2+ y se incubaron con 25 |jg de plasmido durante 1 h a 37°C. Se diluyeron despues las celulas en medio completo (RPMI 1640 enriquecido con FCS al 10%, Hepes 10 mM, glutamina 200 mM, piruvato de sodio 100 mM y aminoacidos no esenciales) y se incubo durante la noche a 37°C en CO2 al 5%. La persistencia de la expresion de los minigenes en celulas transinfectadas duro hasta un mes (37) y la eficacia de transinfeccion previa a la transferencia a ratones se evaluo siempre por clasificacion de celulas activadas por fluorescencia via coloracion de la superficie con mAb conjugado de FITC a CD19 (BD Biosciences, San Diego, CA) acoplado para coloracion intracelular con mAb IgG1 anti-humano conjugado de FITC (Sigma). Se realizo coloracion intracelular usando el estuche BD Cytofix/Cytoperm, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se lavaron celulas B transinfectadas como se describio anteriormente en PBS y se diluyo en 200 jl de PBS para transferencia a ratones. El numero de linfocitos que expresan minigenes se estimo por clasificacion de celulas activadas por fluorescencia previamente a transferencia de 6x105 celulas B transinfectadas en cada raton. Los plasmidos usados para transferencia de minigenes de celulas B somatica y tratamiento de los ratones fueron pIg, pIgCons, pIgNeg y pCMV. Un grupo de control de ratones recibio solo PBS.

Control de los ratones. Se valoro proteinuria en todos los grupos de ratones pre- y post-tratamiento, en intervalos semanales, usando tiras Albustix (Bayer, Elkhart, IN).

Histologfa. Se colorearon secciones de rinon (4 pm de espesor) con hematoxilina y eosina (H/E) siguiendo procedimientos clasicos. La clasificacion de la patologfa incluyo la puntuacion de la actividad glomerular (PAG) y la puntuacion de la actividad tubulointersticial (PATI) y se realizo en un modo ciego en una escala de 0 a 3 donde 0 = ausencia de lesiones; 1 = lesiones en <30% de glomerulos; 2 = lesiones entre 30% a 60%; 3 = lesiones >60% de glomerulos. El GAS incluye proliferacion glomerular, cariorrexis, necrosis fibrinoide, celulas inflamatorias, medialunas celulares y depositos de hialina. Las PATI incluyen inflamacion intersticial, necrosis celular tubular y/o aplanamiento y celulas epiteliales o macrofagos en lumen tubular. Las puntuaciones brutas se promediaron para obtener una

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puntuacion media para cada caractenstica individual y despues se sumaron las puntuaciones medias para obtener una puntuacion promedio para obtener una puntuacion de biopsia de rinon compuesta. Para estudios de inmunofluorescencia, se fijaron secciones en acetona fna durante 10 minutos, se lavaron y se bloquearon con albumina de suero bovino al 2% (BSA) durante 1 hora previamente a adicion de IgG anti-raton de conejo o IgG anti- humano de conejo (Sigma) seguido por anticuerpos anti-conejo conjugados de FITC (BD Biosciences) y contracoloracion con H/E.

Ensayos de proliferacion de celulas T. Se sembraron esplenocitos (recuperados despues de lisis de globulos rojos) en pozos por triplicado a 2-5x105 celulas/pozo en un volumen de 200 pl de medio HL-1 (Cambrex, Rockland, ME) en presencia de peptidos (20 pg/ml) y /o 100 U de medio IL-2 recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los cultivos con medio solo o conteniendo concanavalina A se usaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Se mantuvieron las celulas a 37°C en CO2 al 5% durante 3 dfas y se pulsaron con 1 pCi de [3H]- Timidina ([3H]-Thy) durante las ultimas 12-18 h; se valoro la incorporacion de ADN de [3H]-Thy por recuento de centelleo lfquido en un contador automatizado (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Los resultados se expresan como mdice de estimulacion medio ± DE de triplicados de grupos de 6 a 8 ratones cada uno.

ELISA. Se recogieron sueros de ratones NZB/W F1 antes y despues de tratamiento de minigenes y se almacenaron a -80°C hasta uso experimental. Los tttulos de Ab y los niveles de suero total de IgG, IgG1 e IgG2a, se ensayaron usando estuches ELISA comerciales de BD Biosciences y R&D Systems, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Citometna de flujo. Despues de lavado y bloqueo de Fc-gammaR, se anadio Ab a marcadores superficiales o Ab marcado con fluorocromo emparejado de isotipo de control durante 20 min a 4°C en PBS/FCS al 2%. Para coloracion superficial, se usaron los mAb etiquetados con fluorocromo siguientes: anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti- CD25, anti-CD28, anti-CD19, anti-NK1.1, anti-CD44, anti-CD62L, anti-CD45RB, anti-CD69. Se realizo coloracion intracelular con posterioridad con mAb anti-Foxp3 o anti-TGF-beta etiquetado usando las instrucciones del fabricante. Todos los mAb fueron de BD Biosciences excepto mAb anti-Foxp3 (eBiosciences, San Diego, CA).

Analisis estadfsticos. Se compararon las diferencias entre grupos de resultados continuos usando la prueba t de Student. Se evaluaron las diferencias entre resultados continuos de grupos en la referencia y en puntos de tiempo sucesivos discretos usando pruebas t pareadas. Se modelo la supervivencia entre grupos usando analisis Kaplan- Meier. Todos los analisis se realizaron usando el programa informatico Prism 4 (GraphPad, San Diego). Los valores de P<0,05 se consideraron significativos.

Construccion y expresion de minigenes. Ratones NZB/W F1 premorbidos experimentaron transferencia de minigenes somatica de IgG1 humano codificador de plasmido (hIgG) (plasmido pig) (Figura 1a). Esta propuesta permitio la discriminacion entre IgG procedente de minigen e IgG de raton endogeno. Las construcciones adicionales usadas en el estudio inclrnan: i) plasmido pCMV, un plasmido vado de control negativo; ii) pIgNeg, un plasmido que codifica hIgG1 junto con pNeg - un peptido que une Clase II de MHC pero no tiene efecto sobre la activacion de celulas T o la enfermedad en ratones NZB/W F1 y iii) pIgCons, un plasmido que codifica hIgG junto con peptido de consenso Ig pCons - pCons es un peptido que protege ratones NZB/W F1 de LES. La validacion de transcripciones de ARNm se realizo por RT-PCR sobre celulas COS-7 transinfectadas con plasmidos pIgCons o pIgNeg o pIg (Figura 1b) y expresion de Ig analizada por metodo western en lisados celulares usando mAb anti-hIgG1 de conejo (Figura 1c). Finalmente, una estirpe de celulas T espedfica de pCons prolifero en respuestas a celulas B transinfectadas con pIgCons pero no a celulas B que habfan sido transinfectadas con pIg (Figura 1 d) o con los otros plasmidos de control.

La transferencia de minigenes de celulas B somatica con pIgCons protege a ratones NZB/W F1 de enfermedad renal acelerada. Ratones NZB/W F1 hembra prenefriticos de veinte a veintidos semanas con niveles bajos comparables de Ig anti-ADN recibieron cada uno 6x105 celulas B transinfectadas con pIg (n=19 ratones) o pIgCons (n=19 ratones) i. v. una vez. Los ratones de control recibieron numeros similares de celulas B transinfectadas con pIgNeg (n=11) o pCMV (n=6), o recibieron solo PBS (n=8). Se midio la proteinuria antes del comienzo de tratamiento (ningun raton era proteinurico cuando se inicio el tratamiento) y se controlo a intervalos semanales despues. Para medicion de los tftulos de Ig, se recogieron sueros de sangre periferica antes de tratamiento y cada dos semanas despues de tratamiento durante 30 semanas.

Los ratones que recibieron plg desarrollaron proteinuria acelerada cuando se comparo con ratones de control que habfan recibido el plasmido vado pCMV o PBS (Figura 2a). No se observaron diferencias significativas entre los ratones de control tratados con pCMV y PBS, que sugiere que el plasmido de por sf no influira en la enfermedad renal en los animales tratados. Significativamente, los ratones tratados con pIgCons presentaban niveles considerablemente inferiores de proteinuria a tanto 5 como 10 semanas despues de tratamiento en comparacion con ratones tratados con plg (Figura 2a). La proteccion de enfermedad renal acelerada inducida por plg se asocio espedficamente a pCons, puesto que los ratones que habfan recibido pIgNeg presentaron desarrollo acelerado de proteinuria similar al de ratones tratados con plg (Figura 2a).

Supervivencia de ratones e histologfa patologica renal. Los efectos de la transferencia de minigenes somatica sobre la proteinuria se asociaron a diferente supervivencia de los animales tratados. Los efectos perjudiciales de hipergammaglobulinemia sobre el diagnostico de enfermedades se reflejaron por la mortalidad acelerada de ratones

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tratados con plg cuando se comparo con ratones tratados con pIgCons (Figura 2b). Los animales tratados con pIgNeg presentaron una tasa baja similar de supervivencia que los ratones tratados con plg, sugiriendo que solo pCons ejerda efectos protectores sobre la enfermedad acelerada de Ig que dio como resultado la supervivencia elevada de los ratones. Por otra parte, el plasmido de por sf no influyo sobre la supervivencia de los ratones debido a que los ratones tratados con pCMV presentaron una tasa de supervivencia similar a la de los controles tratados con PBS (Figura 2b).

Se analizo la patologfa renal en los diferentes grupos de ratones (Figura 3). La arquitectura de los rinones se conservo en ratones tratados con pIgCons cuando se compara con ratones de control de plg y pNeg (Figura 3a). Puesto que la arquitectura renal de los ratones pCMV que hadan recibido el vector vado se conservo relativamente, el plasmido de por sf no influyo sobre la patologfa renal. En gran medida, se observo precipitacion de hlg en los glomerulos de ratones plg y pIgNeg pero no en ratones pIgCons (Figura 3b) y se observo precipitacion de mlg en controles pero no en los ratones tratados con pIgCons (Figura 3c). Tambien, las puntuaciones de actividad glomerular y tubular fueron inferiores en los ratones tratados con plgCons que en ratones de control tratados con pIg-y pIgNeg (Figura 3d).

Expresion de Ig en animales tratados. El hallazgo de que los ratones que hadan recibido pIg y pIgNeg presentaron enfermedad renal acelerada cuando se compara con ratones tratados con pIgCons o para controlar ratones tratados con PBS o pCMV sugirio que la expresion de minigenes de Ig hada contribuido a la enfermedad renal a menos que pCons se expresara de manera simultanea. El efecto protector mediado por pCons podfa estar relacionado con el bloqueo de la produccion elevada de Ig procedente del plasmido o a un bloqueo de produccion de Ig endogena. Para discriminar entre estas dos posibilidades, se analizaron los tftulos de los sueros de hIgG procedente de minigenes en los diferentes grupos de ratones a las cinco y diez semanas despues de tratamiento (Figura 4). Se encontro que los efectos protectores de pCons no estaban relacionados con una expresion diferencial de hIgG en los diferentes grupos de ratones debido a que se detectaron niveles similares de hIgG en los sueros de ratones que hadan recibido pIg, pIgCons y pIgNeg (Figura 5a). Como control, no fueron detectables hIgG en los sueros de ratones que no hadan recibido IgG de codificacion de minigenes pero que hadan recibido el plasmido vado o PBS (Figura 4a). Estos datos indicaron que la expresion procedente de plasmido de Ig era comparable en los diferentes grupos de ratones y que los efectos protectores observados en ratones tratados con pIgCons teman que ser atribuidos a pCons. Puesto que el tratamiento genico induce Ab al producto12"14 genico codificado y una respuesta de anti-hlgG podfa haber influido en el tftulo de hIgG circulante, se analizo la concentracion en suero de Ab anti-hIgG en los diferentes grupos de ratones. Se encontraron niveles similares (bajos) de Ab anti-hlgG en ratones que recibieron plg, plgCons y plgNeg y ausencia en los ratones de control tratados con pCMV y PBS. En gran medida, sin embargo, el analisis de los niveles en suero de IgG murino despues de tratamiento indico solo que los ratones tratados con plgCons presentaban tftulos reducidos de IgG tanto a las cinco como a las diez semanas postratamiento (Figura 4b), que indica una asociacion entre pCons y produccion de IgG endogena reducida. Todas las demas condiciones no afectaron a la concentracion en suero de IgG de raton circulante.

Respuestas inmunitarias celulares inducidas por plgCons. Se comparo la respuesta de celulas T entre los grupos de ratones tratados con los diferentes minigenes. Se midio la proliferacion de linfocitos espedficos de Ag a las 4 semanas y 8 semanas postratamiento en ausencia o en presencia de rIL-2. Como se muestra en la Figura 6, no se observo una proliferacion significativa en ningun grupo de ratones para el Ag del respectivo producto de minigenes. Sin embargo, la adicion de IL-2 exogeno a los cultivos invirtio la hiposensibilidad a la estimulacion con pCons en los ratones tratados con plgCons y no en ratones tratados con plgNeg o en los otros controles, tanto a los 4 como a las 8 semanas postratamiento (Figura 5). Estos datos indicaron que solo los animales tratados con plgCons presentaron celulas T que eran hiposensibles a estimulacion antigenica. Para entender mejor las implicaciones de esta observacion, se uso citometna de flujo para determinar si la administracion de plgCons inflrna sobre el numero de subconjuntos de celulas inmunitarias esplenicas seleccionadas incluyendo celulas T, By NK. No se observaron cambios significativos en los numeros de porcentaje de celulas B o celulas NK despues de tratamiento con minigenes durante tanto como dos meses de seguimiento despues de tratamiento. Para celulas T, se observo la extension de celulas T CD8+ en el grupo de plgCons cuando se comparo con los grupos de control (Figura 6a). Para celulas T CD4+, no hubo diferencia en el fenotipo y/o expresion de CD25, CD44, CD62L, CD45RB o CD69. En su lugar, la extension del compartimento de celulas T CD8+ despues de tratamiento con plgCons asociada con un numero aumentado de celulas T CD8+CD28" (Figura 6b-c), que es un fenotipo que hada sido asociado previamente con supresion 17-20 de celulas T. Destaca que las celulas T CD8+CD28" extendidas en ratones tratados con plgCons expresaron TGF-beta intracelular, que no se expreso en celulas T CD8+CD28- de ratones tratados con plgNeg o controles (Figura 6d). Estas diferencias fenotfpicas en ratones plgCons frente a los controles estuvieron presentes tan pronto como 2 semanas despues de tratamiento. (Figura 6) y llego a ser mas pronunciada por 4 semanas despues de tratamiento. Cabe destacar, que las celulas T CD8+CD28- clasificadas de animales tratados con plgCons - pero no de los otros grupos de ratones - inhibio la proliferacion de celulas T CD4+ estimuladas (Figura 7a). Los efectos de supresion se mantuvieron en experimentos transpozo y se bloquearon por la presencia en cultivo de Ab anti-TGF-beta, indicando que la supresion mediada por celulas T CD8+CD28- no requena el contacto de las celulas y dependfa en parte de TGF-beta. Para ensayar si los supresores de CD8+ procedentes de plgCons podfan retrasar el desarrollo de enfermedad renal in vivo, se realizaron experimentos de transferencia adoptivos. Se encontro que la transferencia de celulas T CD8+CD28- de ratones tratados con plgCons en ratones NZB/W Fi con hipergammaglobulinemia retraso el desarrollo de proteinuria en animales receptores, comparado con ratones que

recibfan celulas T CD8+CD28- de controles tratados con plgNeg (Figura 7b).

Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un polinucleotido que codifica un polipeptido de fusion, en el que el polipeptido de fusion comprende un antigeno propio ligado de manera operable a una region Fc de un anticuerpo, en el que el antfgeno propio es pCons SEC ID N°: 2.
2. 2. El polinucleotido segun la reivindicacion 1, en el que la region Fc de un anticuerpo comprende un dominio CH de

   igGi.
3. 3. Un vector de expresion que comprende el polinucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
4. 4. El polinucleotido segun la reivindicacion 1, para uso en la prevencion o el tratamiento de lupus eritematoso sistemico por induccion de inmunidad tolerogenica en un individuo, en el que el polinucleotido es para expresion en el individuo.
5. 5. El polinucleotido para uso segun la reivindicacion 4, en el que el polinucleotido tiene que ser transformado o transinfectado en una celula inmunitaria del individuo.
6. 6. El polinucleotido para uso segun la reivindicacion 5, en el que la celula inmunitaria es una celula B.
7. 7. El polinucleotido para uso segun las reivindicaciones 5 o 6, en el que la celula tiene que ser transformada ex vivo.
8. 8. Un polipeptido de fusion que comprende:

   un primer dominio que comprende un antfgeno propio que es una secuencia conservada encontrada en determinantes de celulas T en la region FR1/CDR1 de Vh de anticuerpos IgG humano y murino, en el que el antfgeno propio es SEC ID N°: 2 y un segundo dominio que comprende un polipeptido heterologo o molecula pequena.
9. 9. El polipeptido de fusion segun la reivindicacion 8, en el que en el polipeptido heterologo comprende una region Fc de un anticuerpo o un polipeptido adyuvante.
10. 10. El polipeptido de fusion segun la reivindicacion 8, en el que la molecula pequena comprende una molecula adyuvante.
11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido de fusion segun la reivindicacion 8.
12. 12. Un polipeptido de fusion segun la reivindicacion 8, para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria para reprimir una respuesta inmunitaria a dicho antfgeno propio, en particular un antfgeno propio que comprende SEC ID N°: 2, en el que la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistemico (LES).