ES2566044T3 - Vacuna contra el virus de la fiebre del Nilo - Google Patents
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Abstract
Composición inmunógena para su uso en la protección de los equinos contra el virus de la fiebre del Nilo (WN) o vacuna para su uso en la protección de los equinos contra el virus de la fiebre del Nilo (WN), que comprende uno o varios virus recombinados avipox y que expresa las proteínas prM, M y E del virus WN, comprendiendo los virus recombinados uno o varios polinucleótidos que codifican una o varias proteínas prM, M y E, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Description
señal del activador tisular del plasminógeno humano (tPA) (Hartikka J. y col., Human Gene Therapy, 1996, 7, 12051217). La secuencia nucleotídica que codifica el péptido de señal se introduce en fase y por delante de la secuencia que codifica E o sus combinaciones, por ejemplo prM-M-E.
5 [0048] Los vectores de expresión in vivo son vectores víricos, los avipox (en particular canarypox, fowlpox, pigeonpox, quailpox).
[0049] El vector de expresión es un canarypox o un fowlpox, pudiendo estar estos poxvirus en su caso atenuados. Se puede citar el canarypox disponible comercialmente en ATCC con el número de acceso VR-111. Se
10 han descrito canarypox atenuados en los documentos US-A-5.756.103 y WO-A-01/05.934. Puede accederse a numerosas cepas de vacuna de virus fowlpox, por ejemplo, la vacuna DIFTOSEC CT® comercializada por MERIAL y la vacuna NOBILS® VARIOLE comercializada por Intervet.
[0050] Para los poxvirus, el experto en la materia puede referirse al documento WO-A-90/12.882, para el
15 fowlpox a los documentos US-A-5.174.993; US-A-5.505.941; US-5.766.599; para el canarypox al documento US-A5.756.103; para el swinepox al documento US-A-5.382.425; para el raccoonpox al documento WO-A-00/03.030.
[0051] Los sitios de inserción del o de los polinucleótidos para su expresión están situados en particular en, o constituidos por, los ORF C3, C5 y C6. Los sitios de inserción están situados en particular en, o constituidos por, los
20 ORFF7yF8.
[0052] Preferentemente, el polinucleótido que debe expresarse se inserta bajo el control de un promotor específico de los poxvirus, especialmente el promotor de vacuna 7,5 kDa (Cochran y col., J. Virology, 1985, 54, 3035), el promotor de vacuna I3L (Riviere y col., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), el promotor de vacuna HA (Shida,
25 Virology, 1986, 150, 451-457), el promotor cowpox ATI (Funahashi y col., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o incluso el promotor de vacuna H6 (Taylor J. y col. Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. y col. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. y col. J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).
[0053] Preferentemente el vector de expresión es un canarypox.
30 [0054] Se describen igualmente vectores de expresión usados para expresar in vitro las proteínas en un sistema celular apropiado. Las proteínas pueden recogerse a continuación en el sobrenadante de cultivo, después de la secreción o no (si no hay secreción, se procede a una lisis celular), concentradas en su caso por técnicas clásicas de concentración, especialmente por ultrafiltración y/o purificadas por medios de purificación clásicos,
35 especialmente las técnicas de cromatografía de tipo afinidad, intercambio iónico o filtración en gel.
[0055] La producción se efectúa por transfección de células de mamífero por plásmidos, por replicación de vectores víricos en células de mamífero o células aviares o por replicación de Baculovirus (US-A-4.745.051; Vialard
J. y col., J. Virol., 1990, 64(1), 37-50; Verne A., Virology, 1988, 167, 56-71), por ejemplo Autographa californica
40 Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV, en células de insectos (por ejemplo, células Sf9 Spodoptera frugiperda, depósito ATCC CRL 1711). Como células de mamíferos se pueden usar especialmente células de hámster (por ejemplo, CHO o BHK-21), células de mono (por ejemplo, COS o VERO). La divulgación cubre así igualmente estos vectores de expresión que incorporan un polinucleótido según la divulgación las proteínas de WN o fragmentos así producidos y las preparaciones que los contienen.
45 [0056] La presente divulgación, tiene así también por objeto las preparaciones purificadas y/o concentradas de proteínas WN. Cuando el polinucleótido codifica varias proteínas éstas son segmentadas, y las preparaciones anteriores contienen así proteínas segmentadas.
50 [0057] La invención tiene por objeto las composiciones inmunógenas y las vacunas contra el virus WN tal como se han descrito en las reivindicaciones para su uso tal como se describe en las reivindicaciones.
[0058] La noción de composición inmunógena recubre todas las composiciones susceptibles, una vez administrada a la especie diana, de inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra el virus WN. Por vacuna se
55 entiende una composición capaz de inducir una protección eficaz. Las especies diana son los equinos.
[0059] Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos perfectamente por el experto en la materia. A modo de ejemplo, puede tratarse de solución salina NaCl al 0,9% o de tampón de fosfato. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables engloban también cualquier compuesto o combinación
7
[0096] En el caso de las composiciones inmunógenas o de las vacunas a base de poxvirus, de manera general una dosis está comprendida entre aproximadamente 102 pfu y aproximadamente 109 pfu.
[0097] Los volúmenes de dosis de las composiciones inmunógenas y de las vacunas de equinos a base de 5 vectores víricos están comprendidos en general entre 0,5 y 2,0 ml, preferentemente entre 1,0 y 2,0 ml, preferentemente de 1,0 ml.
[0098] El experto en la materia posee también para este tipo de vacuna las competencias necesarias para optimizar el número de administraciones, la vía de administración y las dosis que se usarán para cada protocolo de 10 inmunización. En particular se prevén dos administraciones en el caballo, por ejemplo, con un intervalo de 35 días.
[0099] La divulgación se refiere también al uso de un vector de expresión in vivo o de una preparación de vectores o de polipéptidos según la divulgación para la preparación de una composición inmunógena o de una vacuna destinada a proteger las especies diana contra el virus WN y en su caso contra al menos otro agente
15 patógeno. Las diferentes características enunciadas en el resto de la descripción se aplican a este otro objeto de la divulgación
[0100] Una vacuna vírica que expresa una o varias proteínas del virus WN para su uso según la presente invención, no inducirá en el animal vacunado la producción de anticuerpos contra las otras proteínas de este virus 20 que no están representadas en la composición inmunógena o vacuna. Esta característica puede usarse para el desarrollo de procedimientos de diagnóstico diferencial que permiten establecer la distinción entre los animales infectados por el virus patógeno WN y los animales vacunados con ayuda de vacunas según la invención. En estos últimos, estas proteínas y/o anticuerpos dirigidos contra ellas están presentes y pueden ser detectados por una reacción antígeno-anticuerpo. No sucede así en los animales vacunados de acuerdo con la invención que
25 permanecen negativos. Para realizar esta discriminación, se usa una proteína que no está representada en la vacuna (no presente o no expresada), por ejemplo, la proteína C o la proteína NS1, NS2A, NS2B o NS3 cuando no está representada en la vacuna.
[0101] La presente divulgación describe así el uso de los vectores, preparaciones y polipéptidos según la 30 divulgación para la preparación de composiciones inmunógenas y de vacunas según la invención que permite discriminar entre animales vacunados y animales infectados.
[0102] Describe además un procedimiento de inmunización y de vacunación asociado a un procedimiento de diagnóstico que permite esta discriminación.
35 [0103] La proteína seleccionada para el diagnóstico o uno de sus fragmentos o epítopos se usa como antígeno en la prueba de diagnóstico, y/o se usa para producir anticuerpos, policlonales o monoclonales. El experto en la materia dispone de los conocimientos y de la práctica para producir estos anticuerpos y para implementar antígenos y/o anticuerpos en las técnicas de diagnóstico clásicas, por ejemplo pruebas ELISA.
40 [0104] A continuación se describirá la invención más en detalle con ayuda de formas de realización tomadas a modo de ejemplos no limitativos.
45 [0105] Todas las construcciones se realizan usando las técnicas estándar de la biología molecular (clonación, digestión por enzimas de restricción, síntesis de un ADN complementario monocatenario, reacción en cadena de la polimerasa, elongación de un oligonucleótido por una ADN polimerasa...) descritas por Sambrook J. y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. Nueva York. 1989).
50 Todos los fragmentos de restricción usados para la presente invención, así como los diversos fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa (= RCP o PCR), se aíslan y se purifican usando el kit "Geneclean®" (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
55 [0106] Para su amplificación, se cultivan virus de la fiebre del Nilo NY99 (Lanciotti R. S. y col., Science, 1999, 286, 2333-7) en células VERO (células renales de mono, accesibles en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número CCL-81).
12
[0138] Este fragmento es digerido por EcoRI y después por XbaI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRI-XbaI de aproximadamente 2.019 pb. Este fragmento se liga con el plásmido de expresión pAB110 (ejemplo 3) digerido previamente por XbaI y EcoRI, para dar el plásmido pFC104 (7.105 pb). Este
5 plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto que codifica la secuencia-señal del activador del tPA seguida de la secuencia que codifica la proteína prM-M-E.
Ejemplo 7: Construcción del plásmido pFC105
10 [0139] El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit «Gene Amp RNA PCR Kit» (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT.06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor.
15 [0140] Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción «TI-RCP» o «RT-PCR») con 50 µl de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes:
FC107 (36 mer) (SEQ ID NO: 9)
y FC106 (33 mer) (SEQ ID NO: 8).
25 [0141] Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRV y de un sitio de restricción XbaI y de un codón de terminación en posición 3’ del inserto.
[0142] La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC106, después de hibridación de este último en la matriz de ARN.
30 [0143] Las condiciones de síntesis de la primera cadena de ADNc son una temperatura de 42°C durante 15 min, después de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción PCR en presencia del par de oligonucleótidos FC106 y FC107 son una temperatura de 95°C durante 2 min, después 35 ciclos (95°C durante 1 min, después 62°C durante 1 min y 72°C durante 2 min), y finalmente 72°C durante 7 min
35 para producir un fragmento de 2.076 pb.
[0144] Este fragmento es digerido por EcoRV y después por XbaI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-XbaI de aproximadamente 2.058 pb.
40 [0145] Este fragmento se liga con el plásmido de expresión pVR1012, digerido previamente por XbaI y EcoRV, para dar el plásmido pFC105 (6.953 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto que codifica la poliproteína prM-M-E.
[0146] El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit «Gene Amp RNA PCR Kit» (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor.
50 [0147] Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción «TI-RCP» o «RT-PCR») con 50 µl de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes:
55 FC108 (36 mer) (SEQ ID NO: 10)
5’ TTTTTTGATATCATGTATAATGCTGATATGATTGAC 3’
y FC109 (36 mer) (SEQ ID NO: 11)
16
aproximadamente 136 pb. Este fragmento se ha ligado a continuación con el plásmido pC6L, digerido previamente por SmaI y EcoRI, para dar el plásmido pFC113.
Ejemplo 16: Construcción de los virus recombinados vCP1717 y vCP1718
5 [0173] Se ha realizado una reacción PCR usando el plásmido pFC106 (ejemplo 8) como matriz y los oligonucleótidos siguientes:
FC114 (33 mer) (SEQ ID NO: 26):
y FC115 (42 mer) (SEQ ID NO: 27):
para amplificar un fragmento PCR de aproximadamente 2.973 pb. Este fragmento ha sido digerido con las enzimas de restricción PmlI y BamHI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción Pmll-BamHl de aproximadamente 2.958 pb (fragmento F). El plásmido pFC113 (ejemplo 15) ha sido digerido por las
20 enzimas de restricción PmlI y BamHI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción PmlI-BamHI de aproximadamente 4.500 pb (fragmento G). A continuación se han ligado conjuntamente los fragmentos F y G para dar el plásmido pFC114.
[0174] El plásmido pFC114 se ha linealizado mediante NotI, y después se ha transfectado en células
25 primarias de embriones de pollo infectadas con el virus canarypox vCP1713 (ejemplo 11) según la técnica de precipitación con fosfato de calcio descrita anteriormente (Panicali y Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. 79. 49274931; Piccini y col. In Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Se han seleccionado intervalos positivos sobre la base de una hibridación con una sonda radiomarcada específica de la secuencia nucleotídica de la glucoproteína de envoltura E. Estos intervalos han experimentado 4 ciclos
30 sucesivos de selección/purificación de intervalos hasta que se haya aislado una población pura. A continuación se ha amplificado un intervalo representativo de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC114 y el genoma del virus canarypox ALVAC y la reserva de virus recombinado obtenido se ha designado como vCP1717.
[0175] El plásmido pFC114 linealizado por NotI ha servido igualmente para transfectar células primarias de
35 embriones de pollo infectadas con el virus canarypox vCP1712 (ejemplo 10) según la técnica descrita anteriormente. La reserva de virus recombinado así obtenido se ha designado como vCP1718.
Ejemplo 17: Construcción del plásmido pFC115
40 [0176] El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit «Gene Amp RNA PCR Kit» (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor.
[0177] Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena
45 (Reacción «TI-RCP» o «RT-PCR») con 50 µl de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes:
FC116 (39 mer) (SEQ ID NO: 28)
y FC106 (33 mer) (SEQ ID NO: 8).
[0178] Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRV y de un sitio de 55 restricción XbaI, de un codón iniciador en posición 5’ y de un codón de terminación en posición 3’ del inserto.
[0179] La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC106, después de hibridación de este último en la matriz de ARN.
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