ES2564241T3 - Nanopartículas para su uso en composiciones inmunogénicas - Google Patents

Abstract

Una composición de nanopartículas liofilizada esterilizada por filtración que comprende (a) un polímero biodegradable seleccionado de un poli(α-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, un policianoacrilato y combinaciones de los mismos, (b) un tensioactivo que es poli(alcohol vinílico), (c) un agente crioprotector que comprende una combinación de un alditol y un sacárido y (d) un antígeno polipeptídico en la que las nanopartículas dentro de la composición tienen un tamaño de partícula promedio Z menor de 250 nm, menor de 200 nm o menor de 150 nm.

Description

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DESCRIPCION

Nanopartfculas para su uso en composiciones inmunogenicas Antecedentes

Se han usado vetnculos en partfculas con antigenos adsorbidos o inmovilizados en intentos de inducir respuestas inmunitarias adecuadas. Dichos vetnculos presentan multiples copias de un antigeno seleccionado al sistema inmunitario y se cree que promueven la inmovilizacion y retencion de antfgenos en ganglios linfaticos locales. Las partfculas pueden fagocitarse por macrofagos y pueden potenciar la presentacion de antfgenos mediante liberacion de citocinas.

Por ejemplo, la Publicacion Internacional del mismo solicitante n.° WO 98/33487 y la Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos relacionada n.° 2003/0049298 describen el uso de micropartfculas con antigeno adsorbido y con antigeno encapsulado para estimular respuestas inmunologicas, incluyendo respuestas inmunologicas mediadas por celulas, as^ como procedimientos para preparar las micropartfculas. Los polfmeros usados para formar las micropartfculas incluyen poli(lactida) y poli(lactida-co-glicolido) (PLG).

La Publicacion Internacional del mismo solicitante n.° WO 00/06123 y WO 01/36599 y la Patente de Estados Unidos n.° 6.884.435 desvelan procedimientos para preparar micropartfculas que tienen macromoleculas adsorbidas, incluyendo polinucleotidos y antfgenos polipeptidicos. Las micropartfculas comprenden, por ejemplo, un polfmero tal como poli(alfa-hidroxiacido) (por ejemplo, PLG, un acido polihidroxi butmco, una policaprolactona, un poliortoester, un polianhndrido y similares) y se forman usando, por ejemplo, detergentes cationicos, anionicos o no ionicos. Pueden usarse micropartfculas que contienen detergentes anionicos, tales como micropartfculas de PLG que contienen dodecil sulfato sodico (SDS), con macromoleculas con carga positiva, tales como polipeptidos. Pueden usarse micropartfculas que contienen detergentes cationicos, tales como micropartfculas de PLG con CTAB (tambien conocido como cetrimida o bromuro de cetil trimetil amonio), con macromoleculas con carga negativa, tales como ADN. Tambien se desvela el uso de dichas micropartfculas para estimular respuestas inmunologicas, incluyendo respuestas inmunologicas mediadas por celulas.

El documento WO96/20698 desvela una forma de dosificacion de liberacion sostenida que comprende: nanopartfculas que comprenden un nucleo polimerico biocompatible, biodegradable, que tiene un diametro promedio de menos de aproximadamente 300 nm; teniendo las nanopartfculas asociado o incorporado con las mismas al menos un agente bioactivo y/o al menos un agente modificador de superficie.

El documento WO 2004/060396 desvela nanopartfculas incluyendo partfculas de PLG que comprende DSS, y un excipiente de manitol:sacarosa.

S.-Y Kim y col: “Oral immunization with helicobacter pylori-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles”. Helicobacter, vol.4, n.° 1, 1999, paginas 33-39, XP002977235 desvela nanopartfculas de PLG que contienen lisados de H. pylori preparados usando tecnica de evaporacion de disolvente/emulsion de agua en aceite-agua con alcohol polivimlico (PVA) como un estabilizante.

Z. Cui y col: “physical characterization and macrophage cell uptake of mannan-coated nanoparticles”. Drug development and industrial pharmacy, vol. 29, n.° 6, 2003, paginas 689-700, XP008090137 desvela nanopartfculas reconstituidas despues de liofilizacion con diferentes concentraciones de crioprotector (sacarosa o lactosa).

J. Samuel y col: “Polymeric nanoparticles for targeted delivery of therapeutic vaccines to dendritic cells”. Proceedings of the international conference on mems, nano and smart systems, 2003, XP010650296 desvela una formulacion de nanopartfculas de PLGA de BLP25 que indujo respuestas de linfocitos T potentes y efectos antineoplasicos en un modelo de cancer de pulmon de raton, indicando de este modo que las nanopartfculas de PLGA que imitan ciertas caractensticas de los patogenos son sistemas de suministro eficaces para dirigir vacunas terapeuticas a CD y activacion de respuestas de linfocitos T potentes.

M. Auvillain y col: “Lyophilisation de vecteurs colloidaux submicroniques”. S.T.P Pharma, vol. 5, n.° 11, 1989, paginas 738-744, XP008090138 desvela que la conservacion de vectores coloidales submicrometricos, nanopartfculas y nanocapsulas habitualmente requiere desecacion. La liofilizacion sigue siendo, sin embargo, el procedimiento ideal.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona una composicion de nanopartfculas liofilizada esterilizada por filtracion que comprende

(a) un polfmero biodegradable seleccionado de un poli(a-hidroxiacido), un acido polihidroxibutmco, una policaprolactona, un poliortoester, un polianhndrido, un policianoacrilato y combinaciones de los mismos,

(b) un tensioactivo que es poli(alcohol vimlico),

(c) un agente crioprotector que comprende una combinacion de un alditol y un sacarido y

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(d) un antigeno polipeptfdico

en la que las nanopartfculas dentro de la composicion tienen un tamano de partfcula promedio Z de menos de 250 nm, menos de 200 nm o menos de 150 nm.

Dichas composiciones son utiles, por ejemplo, porque son inmunogenicas y porque forman facilmente suspensiones de nanopartfculas. Por ejemplo, tras mezclar composiciones de nanopartfculas liofilizadas de la presente invencion con agua destilada en una concentracion de 0,005 g/ml (intervalo de 5-10 mg/ml), puede formarse espontaneamente una suspension de nanopartfculas inmunogenicas en la que el promedio de Z o valor de D(v, 0,5) de dichas nanopartfculas suspendidas es de menos de 250 nm, por ejemplo variando de 250 nm a 200 nm a 150 nm a 100 nm o menos.

Los antigenos pueden adsorberse, por ejemplo, en la superficie de las nanopartfculas, inmovilizarse dentro de las nanopartfculas o ambos. Los antigenos pueden derivar, por ejemplo, de celulas tumorales y de organismos patogenos tales como virus, bacterias, hongos y parasitos.

La invencion tambien proporciona la composicion de la invencion, para su uso en

(i) un procedimiento para estimular una respuesta inmunitaria en un hospedador vertebrado, que comprende: combinar la composicion con un lfquido acuoso para formar una suspension; y administrar la suspension al hospedador en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria, o

(ii) un procedimiento para inmunizar un hospedador vertebrado contra un tumor o un organismo patogeno, que comprende: combinar la composicion con un lfquido acuoso para formar una suspension; y administrar la suspension al hospedador en una cantidad eficaz para inducir una respuesta protectora, o

(iii) procedimiento para tratar un tumor o una infeccion por organismo patogeno en un huesped vertebrado, que comprende: combinar la composicion con un lfquido acuoso para formar una suspension; y administrar la suspension al huesped en una cantidad eficaz para inducir una respuesta de tratamiento.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invencion pueden comprender componentes complementarios, tales como adyuvantes inmunologicos, que pueden, por ejemplo, adsorberse en la superficie de las nanopartfculas, inmovilizarse dentro de las nanopartfculas, o ambos. Los ejemplos de adyuvantes inmunologicos complementarios incluyen oligonucleotidos CpG, ARN bicatenario, toxinas termolabiles de E. coli, alumbre, compuestos de fosfatos de liposacaridos y mimeticos de fosfatos de liposacaridos, entre otros.

Cuando se empleen dos antfgenos, dos adyuvantes inmunologicos, o un antfgeno y un adyuvante inmunologico, pueden, por ejemplo, (a) adsorberse en la misma poblacion de nanopartfculas, (b) adsorberse cada uno en poblaciones separadas de nanopartfculas, (c) adsorberse uno en nanopartfculas y el otro en solucion, (d) adsorberse uno en nanopartfculas y el otro inmovilizarse dentro de la misma poblacion de nanopartfculas, (e) adsorberse uno en una primera poblacion de nanopartfculas e inmovilizarse el otro dentro de una segunda poblacion de nanopartfculas, y asf sucesivamente.

En otros aspectos, la presente invencion proporciona procedimientos para producir composiciones de nanopartfculas tales como las anteriores que comprenden: (a) combinar (i) un primer lfquido que comprende dicho polfmero biodegradable disuelto en un disolvente organico con (ii) un segundo lfquido que comprende agua, tras lo cual se forma una suspension de nanopartfculas que comprenden dichos polfmero biodegradable, (b) adsorber dicho antfgeno en dichas nanopartfculas para formar una suspension de nanopartfculas con antfgeno adsorbido y (c) liofilizar dicha suspension de nanopartfculas con antfgeno adsorbido.

Tambien se desvelan procedimientos para suministrar las composiciones de nanopartfculas a un animal huesped (por ejemplo, para fines terapeuticos, profilacticos o diagnosticos). El animal huesped es preferentemente un animal vertebrado, o mas preferentemente un mairnfero, y aun mas preferentemente un ser humano. Puede realizarse suministro de las composiciones de nanopartfculas de la invencion por cualquier procedimiento conocido.

En aspectos adicionales, la presente invencion proporciona kits que comprenden un primer recipiente que comprende la composicion de nanopartfculas liofilizadas de la invencion, y opcionalmente que comprende ademas un segundo recipiente que comprende un medio lfquido esteril util para resuspender la composicion de nanopartfculas liofilizada en el primer recipiente.

En comparacion con tecnologfas basadas en micropartfculas, tales como las descritas anteriormente en los antecedentes de la invencion, las ventajas de la presente invencion incluyen facilidad de preparacion (por ejemplo, no es necesaria homogeneizacion de alto corte y porque las nanopartfculas pueden esterilizarse por filtracion, no es necesario que el proceso de preparacion de nanopartfculas sea estrictamente aseptico), y la capacidad de adsorber mayores niveles de antfgenos y otras especies en la superficie de las nanopartfculas, entre otras ventajas.

Estos y otros aspectos, realizaciones y ventajas de la presente invencion resultaran mas facilmente evidentes para los expertos en la materia a la vista de la divulgacion del presente documento.

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La materia objeto que no esta abarcada por el alcance de las reivindicaciones no forma parte de la presente invencion reivindicada.

Breve descripcion de los dibujos

La FIGURA 1 representa graficos de carga de BSA en micropartfculas de PLG y nanopartfculas a pH=5 y a pH=7.

La FIGURA 2 representa graficos de carga de Me[eta]B 287 en micropartfculas de PLG y nanopartfculas a pH=5. Descripcion detallada de la invencion

La practica de la presente invencion empleara, a no ser que se indique de otro modo, procedimientos convencionales de qmmica, qmmica polimerica, bioqmmica, biolog^a molecular, inmunologfa y farmacolog^a, dentro de la experiencia de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, VoIs. HV, 5a ed. (Blackwell Publishers, 1996); Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2o0l); Ausubel, F. M. y col., Short Protocols In Molecular Biology, 5a ed. (Current Protocols, 2002); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S., ed, CRC Press, 1997) y Seymour/Carraher's Polymer Chemistry, 5a ed. (Marcel Dekker Inc., 2000).

Como se usa en la presente memoria descriptiva y cualquier reivindicacion adjunta, las formas singulares “un” y “el” incluyen referencias plurales a no ser que el contenido claramente dicte otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, el termino “nanopartfcula” se refiere a una o mas nanopartfculas.

A no ser que se indique de otro modo o a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa, todos los porcentajes y las reacciones en el presente documento se proporcionan en peso.

A. DEFINICIONES

Al describir la presente divulgacion, se emplearan los siguientes terminos, y se pretende que se definan como se indica a continuacion.

El termino “nanopartfcula” como se usan en el presente documento, se refiere a una partfcula de menos de 1.000 nm de diametro. Las nanopartfculas dentro de las composiciones de la presente invencion tfpicamente tienen una distribucion de tamanos en la que el promedio de Z y/o el valor de D(v,0,5) es menor de 250 nm, y mas tfpicamente menor de 150 nm y en el que el promedio de Z y/o D(v,0,9) es menor de 350 nm, y mas tfpicamente menor de 200 nm.

El tamano de las partfculas puede determinarse (medirse) usando procedimientos disponibles en la tecnica. Por ejemplo, el tamano de las partfculas puede determinarse usando espectroscopia de correlacion fotonica, dispersion de luz dinamica o dispersion de luz cuasi elastica. Estos procedimientos se basan en la correlacion del tamano de las partfculas con las propiedades de difusion de partfculas obtenidas de mediciones del movimiento Browniano. El movimiento Browniano es el movimiento aleatorio de las partfculas debido al bombardeo por las moleculas del disolvente que rodean a las partfculas. Cuando mayor sea la partfcula, mas lento sera el movimiento Browniano. La velocidad se define por el coeficiente de difusion de traslacion (D). El valor medido se refiere a como se mueve una partfcula dentro de un lfquido (diametro hidrodinamico). El diametro que se obtiene es el diametro de una esfera que tiene el mismo coeficiente de difusion de traslacion que la partfcula.

El tamano de partfcula tambien puede determinarse usando dispersion de la luz estatica, que mide la intensidad de la luz dispersada por partfculas en una solucion en un momento individual. La dispersion de luz estatica mide la intensidad de la luz en funcion del angulo de dispersion y la concentracion de soluto. Las partfculas que pasan a traves de una fuente de luz, por ejemplo, un haz de laser, dispersan luz a un angulo que es inversamente proporcional a su tamano. Las partfculas grandes generan un patron de difraccion a angulos de dispersion bajos con alta intensidad, mientras que las partfculas pequenas dan lugar a senales de intensidad baja y angulo amplio. Pueden calcularse distribuciones de tamano de partfculas si la intensidad de la luz dispersada a partir de una muestra se mide en funcion del angulo. La informacion angular se compara con un modelo de dispersion (por ejemplo, teona de Mie) para calcular la distribucion de tamanos.

En general, el tamano de las partfculas se determina a temperatura ambiente e implica multiples analisis de la muestra en cuestion (por ejemplo, al menos 3 mediciones repetidas en la misma muestra) para producir un valor promedio para el diametro de la partfcula.

Para espectroscopia de correlacion de fotones, el promedio Z (tambien denominada la media acumulativa o el diametro hidrodinamico) se calcula tfpicamente a partir de analisis acumulativos (monomodales).

Para mediciones de dispersion de la luz estatica (y tambien para espectroscopia de correlacion de fotones en algunas realizaciones), pueden medirse parametros de tamanos basados en volumen. Por ejemplo, el D(v,0,5) (en el

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que v significa volumen) es un parametro de tamano cuyo valor se define como el punto en el que el 50 % de las partfculas (en volumen) en la composicion, como se mide, tienen un tamano que es menor que el valor D(v,0,5), y el 50 % de las partfculas en la composicion tienen un tamano que es mayor que el valor de D(v,0,5). De forma similar, el D(v,0,9) es un parametro de tamano cuyo valor se define como el punto en el que el 90 % (en volumen) de las partfculas en la composicion tienen un tamano que es menor que el valor D(v,0,9), y el 10 % de las partfculas en la composicion tienen un tamano que es mayor que el valor de D(v,0,9).

Como se define en el presente documento, una “suspension de nanopartfculas” es una fase lfquida que contiene nanopartfculas. Una “solucion acuosa” es una solucion que contiene agua, tipicamente una solucion que contiene mas de 50 % en peso de agua, por ejemplo, de 50 a 75 a 90 a 95 % en peso o mas agua. Una “suspension de nanopartfculas acuosas” es una fase lfquida que contiene agua que contiene nanopartfculas. Las suspensiones de nanopartfculas acuosas de acuerdo con la invencion tfpicamente contienen mas del 50 % en peso de agua, por ejemplo del 50 al 75 al 90 al 95 % en peso o mas de agua.

Las nanopartfculas para su uso en el presente documento se forman tfpicamente a partir de polfmeros que son esterilizables, sustancialmente no toxicos y biodegradables. Dichos materiales incluyen poli(a-hidroxiacidos), acidos polihidroxibutmcos, policaprolactonas, poliortoesteres, polianfndridos y policianoacrilatos (por ejemplo,

polialquilcianoacrilato o “PACA”). Mas tfpicamente, las nanopartfculas para su uso con la presente invencion son nanopartfculas polimericas derivadas de poli(a-hidroxiacidos), por ejemplo, de una poli(lactida) (“PLA”) tal como poli(D,L-lactida), un copolfmero de lactida y glicolico, tal como un poli(D,L-lactida-co-glicolido) (“PLG”), o un copolfmero de D,L-lactida y caprolactona. Las nanopartfculas polimericas pueden derivar de cualquiera de diversos materiales de partida polimericos que tienen una diversidad de pesos moleculares y, en el caso de los copolfmeros, tales como PLG, una diversidad de relaciones de monomero (por ejemplo, lactida:glicolido), cuya seleccion sera principalmente opcional, dependiendo en parte de la especie coadministrada. Estos parametros se analizan adicionalmente posteriormente.

El termino “tensioactivo” viene de la expresion “agente activo en superficie”. Los tensioactivos se acumulan en interfaces (por ejemplo, en interfaces lfquido-lfquido, lfquido-solido y/o lfquido-gas) y cambian las propiedades de esa interfaz. Como se usa en el presente documento, los tensioactivos incluyen detergentes, agentes de dispersion, agentes de suspension, estabilizadores de emulsion.

Como se define en el presente documento, los “carbohidratos” incluyen monosacaridos, oligosacaridos y polisacaridos, asf como sustancias derivadas de monosacaridos, por ejemplo, por reduccion (por ejemplo, alditoles), por oxidacion de uno o mas grupos terminales a acidos carboxflicos (por ejemplo, acido glucuronico), o por reemplazo de uno o mas grupos hidroxi por un atomo de hidrogeno o un grupo amino (por ejemplo, beta-D- glucosamina y beta-D-galactosamina).

Como se define en el presente documento, un “monosacarido” es un alcohol polifndrico, es decir, un alcohol que comprende ademas un grupo aldefndo (en cuyo caso el monosacarido es una aldosa) o un grupo ceto (en cuyo caso el monosacarido es una cetosa). Los monosacaridos tfpicamente contienen de 3 a 10 carbonos. Ademas, los monosacaridos tienen habitualmente la formula emprnca (CH2O)n en la que n es un numero entero de tres o mas, tfpicamente 3-10. Los ejemplos de aldosas de 3-6 carbonos incluyen gliceraldehfdo, eritrosa, treosa, ribosa, 2- desoxirribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, astrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa y talosa. Los ejemplos de cetosas de 3-6 carbonos incluyen dihidroxiacetona, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa y tagatosa. Se encuentran normalmente monosacaridos de origen natural en la forma de isomero D, a diferencia de la forma L.

Un “oligosacarido” se refiere a un polfmero monosacarido relativamente corto, es decir, uno que contiene de 2 a 30 unidades de monosacaridos. Un “polisacarido” es un polfmero monosacarido que tiene una longitud mayor que los oligosacaridos (es decir, uno que contiene mas de 30 unidades monosacaridas). Ademas, como se usa en el presente documento, el termino “polisacarido” tambien se refiere a un polfmero monosacarido que contiene dos o mas monosacaridos ligados. Para evitar la ambiguedad, la segunda definicion debe aplicarse en todo momento, a no ser que haya indicaciones explfcitas de lo contrario. El termino “polisacarido” tambien incluye derivados polisacaridos, tales como derivados polisacaridos funcionalizados con carboxilo y funcionalizados con amino, entre muchos otros. Los monosacaridos tfpicamente se ligan por enlaces glucosfdicos. Los ejemplos espedficos incluyen disacaridos (tales como sacarosa, lactosa, trehalosa, maltosa, gentiobiosa y celobiosa), trisacaridos (tales como rafinosa), tetrasacaridos (tales como estaquiosa) y pentasacaridos (tales como verbascosa).

Como se usa en el presente documento, el termino “sacarido” abarca monosacaridos, oligosacaridos y polisacaridos. Una “especie que contiene sacaridos” es una molecula, al menos una parte de la cual es un sacarido. Los ejemplos incluyen agentes crioprotectores de sacaridos, antfgenos de sacaridos, antfgenos que comprenden sacaridos conjugados con peptidos vehfculo, y asf sucesivamente.

Como se usa en el presente documento, un “agente crioprotector” es un agente que protege una composicion de experimentar efectos adversos tras congelar y descongelar. Por ejemplo, en la presente invencion, pueden anadirse agentes crioprotectores para evitar que se produzca aglomeracion de nanopartfcula sustancial cuando se resuspenden las composiciones liofilizadas de la invencion.

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Un “polinudeotido” es un poftmero de acido nucleico. Como se usa en el presente documento, un “polinudeotido” puede incluir tan pocos como 5, 6, 7 u 8 nucleotidos.

Ademas, un “polinudeotido” puede incluir secuencias tanto monocatenarias como bicatenarias e incluye ADNc de ARNm vftico, procariota o eucariota, secuencias de ARN y ADN genomico de ADN vmco (por ejemplo virus y retrovirus de ARN y ADN) o ADN procariota, y secuencias de ADN sinteticas. El termino tambien captura secuencias que incluyen cualquiera de los analogos basicos conocidos de ADN y ARN. El termino incluye ademas modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), a una secuencia nativa, por ejemplo, en las que la molecula de acido nucleico codifica una protema antigenica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagenesis dirigida, o pueden ser accidentales, tal como mediante mutaciones de huespedes que producen antigenos.

Como se define en el presente documento un “oligonucleotido” es un polinudeotido que tiene un tamano en el intervalo de 5 a 100 y mas preferentemente de 5 a 30 nucleotidos.

Como se usa en el presente documento, la expresion “acido nucleico” se refiere a ADN, ARN o quimericas formadas a partir de los mismos.

Una “especie que contiene polinucleotidos” es una molecula, al menos una parte de la cual es un polinudeotido. Los ejemplos incluyen construcciones de vectores de ARN, construcciones de vectores de ADN y asf sucesivamente.

Los terminos “polipeptido” y “protema” se refieren a un poftmero de restos de aminoacidos y no se limitan a una longitud minima del producto. Por lo tanto, se incluyen dentro de la definicion peptidos, oligopeptidos, dfmeros, mulftmeros. La definicion abarca tanto protemas de longitud completa como fragmentos de las mismas. Los terminos tambien incluyen modificaciones, tales como supresiones, ediciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), a una secuencia nativa, por ejemplo, de modo que la protema mantenga la capacidad para inducir una respuesta inmunologica o tenga un efecto terapeutico en un sujeto al que se administra la protema.

Una “especie que contiene polipeptido” es una molecula, al menos una parte de la cual es un polipeptido. Los ejemplos incluyen polipeptidos, protemas incluyendo glucoprotemas, antfgenos sacaridos conjugados con protemas vehftculo, y asf sucesivamente.

La expresion “producto farmaceutico” se refiere a compuestos biologicamente activos tales como antibioticos, agentes antivmcos, factores de crecimiento, hormonas, anftgenos.

El termino “adyuvante” se refiere a cualquier sustancia que ayude o modifique la accion de un producto farmaceutico, incluyendo adyuvantes inmunologicos, que aumentan o diversifican la respuesta inmunitaria a un antfgeno. Por lo tanto, los adyuvantes inmunologicos son compuestos que son capaces de potenciar una respuesta inmunitaria a anftgenos. Los adyuvantes inmunologicos pueden potenciar la inmunidad humoral y/o celular.

Por “antfgeno” se entiende una molecula que contiene uno o mas epftopos capaces de estimular el sistema inmunitario de un hospedador para realizar una respuesta inmunitaria espedfica de anftgeno celular cuando se presente el antfgeno, o una respuesta de anticuerpo humoral. Un anftgeno puede ser capaz de inducir una respuesta celular y/o humoral por sf solo o cuando se presenta en combinacion con otra molecula.

Un “epftopo” es la parte de una molecula antigenica o complejo antigenico que determina su especificidad inmunologica. Un epftopo esta dentro del alcance de la presente definicion de antfgeno. Habitualmente, un epftopo es un polipeptido o polisacarido en un antfgeno de origen natural. En antfgenos artificiales puede ser una sustancia de bajo peso molecular tal como un derivado de acido arsamlico. Un epftopo reaccionara espedficamente in vivo o in vitro con, por ejemplo, anticuerpos homologos o linfocitos T. Son descriptores alternativos determinante antigenico, agrupamiento estructural antigenico o agrupamiento haptenico.

Frecuentemente, un epftopo incluira entre aproximadamente 5 y 15 aminoacidos. Los epftopos de una protema dada pueden identificarse usando cualquier variedad de tecnicas de mapeo de epftopos, bien conocidas en este campo. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epftopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultaneamente grandes numeros de peptidos en soportes solidos, correspondiendo los peptidos a partes de la molecula proteica, y haciendo reaccionar los peptidos con anticuerpos mientras que los peptidos aun estan unidos a los soportes. Dichas tecnicas se conocen en este campo y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.° 4.708.871; Geysen y col. (1984) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002); Geysen y col. (1986) (Molec. Immunol. 23: 709-715). De forma similar, se identifican facilmente epftopos conformacionales determinando la conformacion espacial de aminoacidos tales como, por ejemplo, por cristalografta de rayos x y resonancia magnetica nuclear bidimensional. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, mencionado anteriormente.

El termino “antfgeno” como se usa en el presente documento indica antfgenos subunitarios, es decir, antfgenos que estan separados y son distintos de un organismo completo con el que se asocia el anftgeno en la naturaleza, asf como bacterias muertas, atenuadas o inactivadas, virus, parasitos u otros patogenos o celulas tumorales. Los

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anticuerpos tales como anticuerpos antiidiotipicos, o fragmentos de los mismos, y mimotopos peptidicos sinteticos, que pueden imitar a un antigeno o determinante antigenico, tambien se capturan bajo la definicion de antigeno como se usa en el presente documento.

De forma similar, un oligonucleotido o polinucleotido que expresa una protema inmunogenica, o determinante antigenico in vivo, tal como en aplicaciones de inmunizacion de acidos nucleicos, tambien se incluye en la definicion de antigeno en el presente documento.

Ademas, para fines de la presente invencion, un “antigeno” se refiere a una protema que tiene modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), en la secuencia nativa, siempre que la protema mantenga la capacidad para inducir una respuesta inmunologica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagenesis dirigida, o pueden ser accidentales, tales como mediante mutaciones de huespedes que producen los antigenos.

Una “respuesta inmunologica” o “respuesta inmunitaria” a un antfgeno o una composicion es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular a moleculas presentes en la composicion de interes. Para fines de la presente invencion, una “respuesta inmunitaria humoral” se refiere a una respuesta inmunitaria mediada por moleculas de anticuerpo, mientras que una “respuesta unitaria celular” es una mediada por linfocitos T y/u otros globulos blancos. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una respuesta espedfica de antfgeno por linfocitos T citoltticos (“CTL”). Los CTL tienen especificidad por antfgenos peptfdicos que se presentan en asociacion con protemas codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y se expresan en las superficies de celulas. Los CTL ayudan a inducir y promover la destruccion intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de celulas infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta espedfica de antfgeno por linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T auxiliares actuan para ayudar a estimular la funcion, y centran la actividad de celulas efectoras no espedficas contra celulas que presentan antfgenos peptfdicos en asociacion con moleculas del MHC en su superficie. Una “respuesta inmunitaria celular” tambien se refiere a la produccion de citocinas, quimiocinas y otras moleculas tales producidas por linfocitos T activados y/u otros globulos blancos, incluyendo los derivados de linfocitos T CD4+ y CD8+.

Una composicion tal como una composicion inmunogenica o una vacuna que induce una respuesta inmunitaria celular puede actuar para sensibilizar a un sujeto vertebrado por la presentacion de antfgeno en asociacion con moleculas del MHC en la superficie celular. La respuesta inmunitaria mediada por celulas se dirige a, o cerca de, celulas que presentan antfgenos en su superficie. Ademas, pueden generarse linfocitos T espedficos de antfgeno para permitir la futura proteccion de un huesped inmunizado.

La capacidad de un antfgeno o una composicion particular para estimular una respuesta inmunologica mediada por celulas puede determinarse por varios ensayos conocidos en la tecnica, tales como por ensayos de linfoproliferacion (activacion de linfocitos), ensayos de celulas citotoxicas CTL, ensayando con respecto a linfocitos T espedficos para el antfgeno en un sujeto sensibilizado, o por medicion de la produccion de citocinas por linfocitos T en respuesta a reestimulacion con antfgeno. Dichos ensayos se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, Erickson y col. (1993) (J. Immunol. 151: 4189-4199); Doe y col. (1994) (Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376); y los ejemplos posteriores.

Por lo tanto, una respuesta inmunologica puede incluir, por ejemplo, uno o mas de los siguientes efectos: la produccion de anticuerpos por linfocitos B; y/o la activacion de linfocitos T supresores y/o linfocitos T yS dirigidos espedficamente a un antfgeno o antfgenos presentes en la composicion o vacuna de interes. Estas respuestas pueden actuar para neutralizar la infecciosidad y/o mediar en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o anticuerpo-complemento para proporcionar proteccion a un huesped inmunizado. Dichas respuestas pueden determinarse usando inmunoensayos convencionales y ensayos de neutralizacion, bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, radioinmunoensayos y ELISA.

Las composiciones inmunogenicas de la presente invencion presentan “inmunogenicidad potenciada” cuando poseen una mayor capacidad para inducir una respuesta inmunitaria que la respuesta inmunitaria inducida por una cantidad equivalente del antfgeno en una composicion diferente. Por lo tanto, una composicion puede presentar “inmunogenicidad potenciada”, por ejemplo, porque la composicion genera una respuesta inmunitaria mas fuerte, o porque es necesaria una dosis menor de antfgeno para conseguir una respuesta inmunitaria en el sujeto al que se administra. Dicha inmunogenicidad potenciada puede determinarse, por ejemplo, administrando las composiciones de la invencion, y controles de antfgenos, a animales y comparando los resultados de ensayo de los dos.

Como se usa en el presente documento, “tratamiento” (incluyendo variaciones del mismo, por ejemplo, “tratar” o “tratado”) se refiere a cualquiera de (i) la prevencion de un patogeno o trastorno en cuestion (por ejemplo cancer o una infeccion patogena, como en una vacuna tradicional), (ii) la reduccion o eliminacion de smtomas, y (iii) la eliminacion sustancial o completa del patogeno o trastorno en cuestion. El tratamiento puede efectuarse de forma profilactica (antes de la llegada del patogeno o trastorno en cuestion) o terapeutica (despues de la llegada del mismo).

Las expresiones “cantidad eficaz” o “cantidad farmaceuticamente eficaz” de una composicion inmunogenica de la presente invencion se refieren en el presente documento a una cantidad suficiente de la composicion inmunogenica

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para tratar o diagnosticar una afeccion de interes. La cantidad exacta requerida variara entre sujetos, dependiendo, por ejemplo, de la especie, la edad y la condicion general del sujeto; la gravedad de la afeccion que se trate; el antigeno particular de interes; en el caso de una respuesta inmunologica, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos, por ejemplo, y el grado de proteccion deseado; y el modo de administracion, entre otros factores. Una cantidad “eficaz” apropiada en cualquier caso individual puede determinarse por un experto habitual en la materia. Por lo tanto, una “cantidad terapeuticamente eficaz” quedara tipicamente en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios.

Por “sujeto vertebrado” o “animal vertebrado” se entiende cualquier miembro del subfilo cordados, incluyendo, sin limitacion, mairnferos tales como vacas, ovejas, cerdos, cabras, caballos y seres humanos; animales domesticos tales como perros y gatos; y aves, incluyendo aves domesticas, salvajes y de caza tales como gallos y gallinas incluyendo pollos, pavos y otras aves gallinaceas. La expresion no indica una edad particular. Por lo tanto, estan abarcados animales tanto adultos como neonatos.

Por “farmaceuticamente aceptable” o “farmacologicamente aceptable” se entiende un material que no es biologicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede administrarse a un individuo sin provocar ningun efecto biologico indeseable excesivo en el individuo o interaccionar de una manera excesivamente deleterea con ninguno de los componentes de la composicion en la que esta contenido.

El termino “excipiente” se refiere a cualquier sustancia esencialmente adyuvante que pueda estar presente en la forma de dosificacion final. Por ejemplo, el termino “excipiente” incluye vehnculos, aglutinantes, disgregantes, cargas (diluyentes), lubricantes, emolientes (potenciadores del flujo), ayudantes de compresion, colorantes, edulcorantes, conservantes, agentes de suspension/dispersantes, formadores de pelfcula/revestimientos, saponferos y tintas de impresion.

Por “pH fisiologico” o un “pH en el intervalo fisiologico” se entiende un pH en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 8,0 inclusive, mas tfpicamente en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 7,6 inclusive.

Como se usa en el presente documento, la expresion “construccion de vector” se refiere en general a cualquier ensamblaje que sea capaz de dirigir la expresion de una secuencia o secuencias de acido nucleico o gen o genes de interes. Una construccion de vector tfpicamente incluye promotor/potenciador de la transcripcion o elemento o elementos que definen un locus, u otros elementos que controlan la expresion genica por otros medios tales como corte y empalme alternativo, exportacion de ARN nuclear, modificacion postraduccional del mensajero, o modificacion postranscripcional de la protema. Ademas, la construccion de vector tfpicamente incluye una secuencia que, cuando se transcribe, esta unida operativamente con la secuencia o las secuencias o el gen o los genes de interes y actua como una secuencia de inicio de la traduccion. La construccion de vector puede incluir tambien opcionalmente una senal que dirige la poliadenilacion, un marcador seleccionable, asf como uno o mas sitios de restriccion y una secuencia de terminacion de la traduccion. Ademas, si la construccion de vector se coloca en un retrovirus, la construccion de vector puede incluir una senal de empaquetamiento, repeticiones terminales largas (LTR) y sitios de union a cebador de cadena positiva y negativa apropiados para el retrovirus usado (si estos no estan ya presentes).

Una “construccion de vector de ADN” se refiere a una molecula de ADN que es capaz de dirigir la expresion de una secuencia o secuencias de acido nucleico gen o genes de interes.

Un tipo espedfico de construccion de vector de ADN es un plasmido, que es una molecula de ADN episomica circular capaz de replicar de forma autonoma dentro de una celula huesped. Tfpicamente, un plasmido es un ADN bicatenario circular, bucle en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. pCMV es un plasmido espedfico que se conoce bien en la tecnica. Un vector pCMV preferido contiene el potenciador/promotor temprano inmediato de CMV y un terminador de hormona de crecimiento bovina. Un ejemplo espedfico se describe en detalle en Chapman, B. S., y col. (1991) (Nucleic Acids Res. 19: 3979-3986).

Se conocen otras construcciones de vectores de ADN, que se basan en virus de ARN. Estas construcciones de vectores de ADN tfpicamente comprenden un promotor que actua en una celula eucariota, 5' de una secuencia de ADNc para la que el producto de transcripcion es una construccion de vector de ARN (por ejemplo, un replicon de vector de ARN de alfavirus), y una region de terminacion 3'. La construccion del vector de ARN preferentemente comprende un genoma de ARN de un picornavirus, togavirus, flavivirus, coronavirus, paramixovirus, virus de la fiebre amarilla o alfavirus (por ejemplo, virus Sindbis, virus del Bosque de Semliki, virus de la encefalitis equina Venezolana o virus del Rfo Ross), que se ha modificado por el reemplazo de uno o mas genes proteicos estructurales con una secuencia de acido nucleico heterologa seleccionada que codifica un producto de interes. Las construcciones de vectores de ARN pueden obtenerse por transcripcion in vitro a partir de un molde de ADN. Los ejemplos espedficos incluyen plasmidos basados en virus Sindbis (pSIN) tales como pSINCP, descritos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.814.482 y 6.015.686, asf como en las Publicaciones Internacionales n.° WO 97/38087, WO 99/18226 y WO 02/26209. La construccion de dichos vectores, en general, se describe en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.814.482 y 6.015.686.

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Otros ejemplos de construcciones de vectores incluyen construcciones de vectores de ARN (por ejemplo, construcciones de vectores de alfavirus) y similares. Como se usa en el presente documento, “construccion de vector de ARN”, “replicon de vector de ARN” y “replicon” se refieren a una molecula de ARN que es capaz de dirigir su propia amplificacion o autorreplicacion in vivo, tipicamente dentro de una celula diana. La construccion de vector de ARN se usa directamente, sin la necesidad de introducir ADN en una celula y transportarlo al nucleo en el que se producina transcripcion. Usando el vector de ARN para suministro directo al citoplasma de la celula hospedadora, se produce eficazmente replicacion autonoma y traduccion de la secuencia de acido nucleico heterologa.

B. PROCEDIMIENTOS GENERALES

Como se ha indicado anteriormente, las composiciones de nanopartfculas de la presente invencion contienen uno o mas polfmeros biodegradables, uno o mas tensioactivos, uno o mas agentes crioprotectores, uno o mas antfgenos y, opcionalmente, uno o mas componentes complementarios, por ejemplo, uno o mas adyuvantes inmunologicos, entre otros.

1. COMPOSICIONES DE NANOPARTfcULAS

Los polfmeros utiles para formar las composiciones de nanopartfculas inmunogenicas descritas en el presente documento incluyen homopolfmeros, copolfmeros y mezclas de polfmeros, tanto naturales como sinteticas. Dichos polfmeros pueden derivar, por ejemplo de lo siguiente: acido polihidroxibutmco (tambien conocido como polihidroxibutirato), acido polihidroxivalerico (tambien conocido como polihidroxivalerato); acido poliglicolico (PGA) (tambien conocido como poliglicolido); acido polilactico (PLA) (tambien conocido como polilactida); polidioxanona; policaprolactona; poliortoester, policianoacrilatos; poliantndridos; y combinaciones de los mismos. Son mas tfpicos poli(a-hidroxiacidos), tales como poli(L-lactida), poli(D,L-lactida) (ambos denominados PLA en el presente documento), poli(hidroxibutiratos), copolfmeros de lactida y glicolico, tales como poli(D,L-lactida-co-glicolidos) (designados “PLG” en el presente documento) o copolfmeros de D,L-lactida y caprolactona.

Los polfmeros anteriores estan disponibles en una diversidad de pesos moleculares, y el peso molecular apropiado para un uso dado se determina facilmente por un experto en la materia. Por lo tanto, por ejemplo, un peso molecular adecuado para PLA puede estar en el orden de aproximadamente 2.000 a 5.000. Un peso molecular adecuado para PLG puede variar de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 200.000.

Cuando se emplean copolfmeros, pueden estar disponibles copolfmeros con una diversidad de relaciones monomericas. Por ejemplo, cuando se usa PLG para formar las nanopartfculas, una diversidad de relaciones molares de lactida:glicolido encontraran uso en el presente documento, y la relacion es en gran medida una cuestion de eleccion, dependiendo en parte de cualquier especie coadministrada adsorbida y/o inmovilizada y la velocidad de degradacion deseada. Por ejemplo, un polfmero de PLG 50:50, que contiene D,L-lactida 50% y glicolido 50%, proporcionara un copolfmero de reabsorcion mas rapida, mientras que PLG 75:25 se degrada mas lentamente, y 85:15 y 90:10, aun mas lentamente, debido al componente lactida aumentado. Las mezclas de nanopartfculas con diversas relaciones de lactida:glicolido tambien puede encontrar uso en el presente documento para conseguir la cinetica de liberacion deseada. La velocidad de degradacion de las nanopartfculas de la presente invencion tambien puede controlarse por factores tales como el peso molecular del polfmero y la cristalinidad del polfmero.

Cuando se usen los copolfmeros de PLG son tfpicamente los que tienen una relacion molar de lactida/glicolido que vana, por ejemplo, de 20:80 a 25:75 a 40:60 a 45:55 a 55:45 a 60:40 a 75:25 a 80:20, y que tienen un peso molecular que vana, por ejemplo, de 5.000 a 10.000 a 20.000 a 40.000 a 50.000 a 70.000 a 100.000 a 200.000 Dalton, entre otros.

Estan disponibles en el mercado copolfmeros de PLG con diversas relaciones de lactida:glicolido y pesos moleculares de varias fuentes incluyendo de Boehringer Ingelheim, Alemania y Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL, Estados Unidos. Algunos copolfmeros de PLG ejemplares incluyen: (a) RG 502, un PLG que tiene una relacion molar de lactida/glicolido 50:50 y un peso molecular de 12.000 Da; (b) RG 503, un PLG que tiene una relacion molar de lactida/glicolido 50:50 y un peso molecular de aproximadamente 34.000 Da; (c) RG 504, un PLG que tiene una relacion molar de lactida/glicolido 50:50 y un peso molecular de aproximadamente 48.000 Da, (d) RG 752, un PLG que tiene una relacion molar de lactida/glicolido 75:25 y un peso molecular de aproximadamente 22.000 Da; y (e) RG 755, un PLG que tiene una relacion molar de lactida/glicolido 75:25 y un peso molecular de aproximadamente 68.000 Da. Tambien pueden sintetizarse polfmeros de PLG por policondensacion sencilla del componente de acido lactico usando tecnicas bien conocidas en este campo, tales como las descritas en Tabata y col. (1988) (J. Biomed. Mater. Res. 22: 837-858).

Pueden prepararse nanopartfculas de acuerdo con la invencion usando cualquier procedimiento adecuado.

Por ejemplo, el procedimiento de nanoprecipitacion, tambien denominado el procedimiento de desplazamiento de disolvente, es un ejemplo de un procedimiento adecuado para formar nanopartfculas para su uso en la invencion. Vease, por ejemplo, Patente Europea n.° 0274961B1 titulada “Process for the preparation of dispersible colloidal systems of a substance in the form of nanocapsules”, Devissaguet y col., Patente de Estados Unidos n.° 5.049.322 del mismo tttulo y Fessi y col., Patente de Estados Unidos n.° 5.118.528, “Process for the preparation of dispersible colloidal systems of a substance in the form of nanoparticles”.

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Como se adapta para la presente invencion, un poKmero se disuelve en un disolvente organico (por ejemplo, disolventes organicos hidrofilos tales como acetona, etanol). La solucion organica resultante se combina con un disolvente adicional, que es miscible con el disolvente organico siendo al mismo tiempo no disolvente para el polfmero, tfpicamente una solucion acuosa. La solucion acuosa puede ser, por ejemplo, agua desionizada, solucion salina normal, una solucion tamponada, tal como por ejemplo solucion salina tamponada con fosfato (PBS) o una solucion de tampon de citrato sodico/acido etilendiamintetraacetico (citrato sodico/EDTA). Estas ultimas soluciones pueden (a) proporcionar una tonicidad, es decir, osmolalidad, que es esencialmente la misma que los fluidos fisiologicos normales y (b) mantener un pH compatible con las condiciones fisiologicas normales. En una realizacion particular, las caractensticas de tonicidad y/o pH de las composiciones de la presente invencion pueden ajustarse despues de la formacion de nanopartfculas.

La solucion organica y la solucion acuosa se combinan despues en volumenes relativos adecuados (por ejemplo 1:10 a 1:5 a 1:2 a 1:1 a 2:1 a 5:1 a 10:1, tfpicamente de 1:2 a 2:1, mas tfpicamente aproximadamente 1:1). Por ejemplo, la solucion organica puede verterse o inyectarse en el no disolvente mientras se agita, o viceversa. Seleccionando un sistema en el que el polfmero es soluble en el disolvente organico, siendo al mismo tiempo significativamente menos soluble en la mezcla miscible del disolvente organico con el no disolvente, puede formarse una suspension de nanopartfculas practicamente instantanea. Posteriormente, el disolvente organico puede eliminarse de la suspension, por ejemplo, por evaporacion en condiciones ambientales o evaporacion con presion reducida y/o temperatura elevada.

La solucion organica, la solucion acuosa, o ambas tambien pueden contener diversas otras especies segun se desee. Por ejemplo, en algunas realizaciones, es deseable inmovilizar una o mas especies adicionales dentro de las nanopartfculas o para proporcionar una o mas especies adicionales en la interfaz de partfcula-fluido. Dichas especies adicionales pueden incluir, por ejemplo, antfgenos, tensioactivos, agentes crioprotectores, adyuvantes inmunologicos, y asf sucesivamente. Estas especies se anaden tfpicamente (a) a la solucion organica, si estan en forma soluble en aceite o dispersable en aceite o (b) a la solucion acuosa, si esta en forma soluble en agua o dispersable en agua.

En algunas realizaciones, se anaden una o mas especies adicionales despues de la formacion de nanopartfculas (y tfpicamente despues de la retirada del disolvente organico, asf como despues de las etapas de lavado, si las hubiera). Por ejemplo, pueden anadirse agentes para ajustar la tonicidad o el pH, antfgenos, tensioactivos, agentes crioprotectores, adyuvantes inmunologicos y asf sucesivamente. Frecuentemente, estas especies adicionales se anaden a las nanopartfculas como una solucion o dispersion acuosa. Estas especies pueden estar, por ejemplo, en solucion o acumularse en la interfaz de partfcula-solucion, por ejemplo, adsorberse en la superficie de la nanopartfcula (vease, por ejemplo, los Ejemplos posteriores en los que diversos antfgenos se adsorben en la superficie de la nanopartfcula). El contenido de especies adsorbidas puede determinarse usando tecnicas convencionales.

Una vez que se ha proporcionado suspension de la composicion deseada, puede usarse tal cual o liofilizarse para su uso posterior.

Las composiciones de acuerdo con la invencion pueden esterilizarse por filtracion despues de la formacion de nanopartfculas. Por ejemplo, las composiciones pueden esterilizarse por filtracion en cualquier momento despues de la formacion de nanopartfculas, tales como por ejemplo, despues de la formacion de nanopartfculas pero antes de la adsorcion de cualquier especie inmunologica (por ejemplo, un adyuvante y/o un antfgeno inmunologico), despues de la adsorcion de cualquier especie inmunologica y antes de la liofilizacion, y asf sucesivamente.

En general, las micropartfculas dentro de las composiciones, tanto antes como despues de la liofilizacion, tienen un promedio de Z y/o un tamano de D(v,0,5) de menos de 250 nm, por ejemplo que vanan de 250 nm a 200 nm, a 150 nm a 100 nm o menos.

Tomando las nanopartfculas formadas usando PLG como ejemplo, hay varias ventajas de las tecnicas de la presente invencion, en comparacion con tecnicas de formacion de micropartfculas (por ejemplo, las descritas en referencias citadas en la seccion de Antecedentes mencionada anteriormente y en Singh, M., y col. (2004) (J. Pharm. Sci. 93(2): 273-282)). Un primer beneficio es la facilidad de preparacion. El procedimiento de nanopartfculas es una tecnica de una unica etapa y no necesita homogeneizacion de alto corte, solamente agitacion magnetica. Ademas, el proceso de preparacion de partfculas de micropartfcula completa es tfpicamente aseptico, mientras que, debido a su pequeno tamano, las nanopartfculas pueden esterilizarse por filtracion despues de la preparacion de partfculas, lo que conduce a requisitos de produccion menos estrictos.

Ademas, el tipo de disolvente organico usado con los procedimientos es diferente. El procedimiento de nanopartfculas puede realizarse usando acetona mientras que el procedimiento de micropartfculas tfpicamente implica el uso de diclorometano (DCM) como un disolvente. La Administracion de Farmacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) clasifica DCM como un disolvente de Clase 2 y tiene lfmites establecidos acerca de las cantidades de disolvente residual permisible que pueden estar presentes en productos farmaceuticos, mientras que la acetona es un disolvente de Clase 3 para el que la FDA ha establecido lfmites superiores en las cantidades permisibles.

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2. TENSIOACTIVOS

Como se ha indicado anteriormente los tensioactivos para su uso en la divulgacion incluyen detergentes, agentes de dispersion, agentes de suspension, estabilizantes de la emulsion.

Los tensioactivos incluyen tensioactivos cationicos, anionicos y no ionicos. Los tensioactivos cationicos incluyen, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio o “CTAB” (por ejemplo, cetrimida), cloruro de benzalconio, DDA (bromuro de dimetil dioctodecil amonio) y DOTAP (dioleoil-3-trimetilamonio-propano), entre otros. Los tensioactivos anionicos incluyen, por ejemplo, SDS (dodecil sulfato sodico), SLS (lauril sulfato sodico), DSS (disulfosuccinato), y alcoholes grasos sulfatados, entre otros. Los tensioactivos no ionicos incluyen, por ejemplo, PVA (alcohol polivimlico), povidona (tambien conocida como polivinilpirrolidona o PVP), esteres de sorbitan, polisorbatos, glicolmonoeteres polioxietilados, alquil fenoles polioxietilados y poloxameros, entre otros.

Las composiciones de acuerdo con la divulgacion pueden contener cantidades muy diversas de tensioactivo. En general, la cantidad de tensioactivo sera eficaz para promover la suspension de nanopartmulas aceptable (y resuspension despues de la liofilizacion). La relacion en peso de tensioactivo frente al polfmero biodegradable puede variar, por ejemplo, de menos de 0,001:1 a 0,5:1 o mas, por ejemplo, de 0,005:1 a 0,1:1, entre otras relaciones. En general, se usan tensioactivos ionicos en relaciones mas bajas que los tensioactivos no ionicos.

De acuerdo con la invencion, el tensioactivo es poli(alcohol vimlico).

3. AGENTES CRIOPROTECTORES

Como se ha indicado anteriormente, pueden anadirse agentes crioprotectores a las composiciones de la presente invencion para prevenir que se produzca aglomeracion de nanopartfculas sustancial cuando se resuspenden composiciones liofilizadas de acuerdo con la invencion.

Los agentes crioprotectores comunes incluyen (a) aminoacidos tales como acido glutamico y arginina, entre otros; (b) polioles, incluyendo dioles tales como etilenglicol, propanodioles tales como 1,2-propilenglicol, 1,3-propilenglicol y butanodioles tales como 2,3-butilenglicol, entre otros, trioles tales como glicerol, entre otros, asf como otros polioles superiores; y (c) carbohidratos incluyendo, por ejemplo, (i) monosacaridos (por ejemplo, glucosa, galactosa y fructosa, entre otros), (ii) polisacaridos incluyendo disacaridos (por ejemplo, sacarosa, lactosa, trehalosa, maltosa, gentiobiosa y celobiosa, entre otros), trisacaridos (por ejemplo, rafinosa, entre otros), tetrasacaridos (por ejemplo, estaquiosa entre otros), pentasacaridos (por ejemplo, verbascosa entre otros), asf como numerosos polisacaridos superiores distintos, y (iii) alditoles tales como xilitol, sorbitol y manitol, entre otros (a este respecto, se indica que los alditoles son polioles superiores, ademas de ser carbohidratos).

Las composiciones de acuerdo con la divulgacion pueden contener cantidades ampliamente diversas de agente crioprotector, dependiendo de la cantidad que sea eficaz para evitar la aparicion de aglomeracion de nanopartmulas sustancial cuando se resuspenden las composiciones liofilizadas de la invencion. La relacion en peso del tensioactivo con respecto al polfmero biodegradable puede variar, por ejemplo, de menos de 0,01:1 a 0,5:1 o mas, por ejemplo, de 0,05:1 a 0,1:1, entre otras relaciones.

De acuerdo con la invencion, el agente crioprotector comprende una combinacion de un alitol y un sacarido.

4. ANTfGENOS

Las composiciones de la invencion incluyen uno o mas antfgenos polipeptfdicos, cada antfgeno una cantidad eficaz (por ejemplo, una cantidad eficaz para uso en procedimientos terapeuticos, profilacticos o de diagnostico de acuerdo con la invencion). Por ejemplo, las composiciones de la presente invencion pueden usarse para tratar o prevenir infecciones provocadas por cualquiera de los patogenos enumerados posteriormente.

Los antfgenos para su uso con la divulgacion incluyen uno o mas de los siguientes antfgenos expuestos posteriormente, o antfgenos derivados de uno o mas de los patogenos expuestos posteriormente:

A. ANTfGENOS BACTERIANOS

Los antfgenos bacterianos adecuados para su uso en la divulgacion incluyen protemas, polisacaridos, lipopolisacaridos, y vesmulas de la membrana externa que pueden aislarse, purificarse o derivar de una bacteria. Ademas, los antfgenos bacterianos incluyen lisados bacterianos y formulaciones de bacterias inactivadas. Pueden producirse antfgenos bacterianos por expresion recombinante. Los antfgenos bacterianos incluyen preferentemente epttopos que estan expuestos en la superficie de la bacteria durante al menos un estadio de su ciclo vital. Los antfgenos bacterianos estan preferentemente conservados entre multiples serotipos. Los antfgenos bacterianos incluyen antfgenos derivados de una o mas de las bacterias expuestas posteriormente asf como los ejemplos de antfgenos espedficos identificados posteriormente.

Neisseria meningitidis: los antfgenos de meningitidis incluyen protemas (tales como las identificadas en los documentos WO99/24578; WO99/36544; WO99/57280; WO00/22430; Tettelin y col. (2000) Science 287: 18091815; WO96/29412; y Pizza y col. (2000) Science 287:1816-1820), sacaridos (incluyendo un polisacarido,

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oligosacarido o lipopolisacarido), o vesmulas de membrana externa (documento WO 01/52885; Bjune y col. (1991) Lancet 338(8775): 1093-1096; Fuskasawa y col. (1999) Vaccine 17: 2951-2958; y Rosenqist y col. (1998) Dev. Biol. Strand 92: 323-333) purificadas o derivadas de serogrupo de N. meningitidis tal como A, C, W135, Y y/o B. Pueden seleccionarse antigenos proteicos de meningitidis de adhesiones, autotransportadores, toxinas, protemas de adquisicion de Fe y protemas asociadas a membrana (preferentemente protema membrana externa integral).

Streptococcus pneumoniae: los antigenos de Streptococcus pneumoniae incluyen un sacarido (incluyendo un polisacarido o un oligosacarido) y/o una protema de Streptococcus pneumoniae. Los antigenos sacaridos pueden seleccionarse de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F. Pueden seleccionarse antigenos proteicos de una protema identificada en los documentos WO 98/18931; WO 98/18930; Patente de Estados Unidos n.° 6.699.703; Patente de Estados Unidos n.° 6.800.744; WO 97/43303; y WO 97/37026. Pueden seleccionarse protemas de Streptococcus pneumoniae de la familia de Triada de Poli Histidina (PhtX), la familia de Protemas de Union a Colina (CbpX), truncados de CbpX, familia de LytX, truncados de LytX, protemas quimericas de truncado de CbpX-truncado de LytX, neumolisina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 o Sp133.

Streptococcus pyogenes (Streptococcus de Grupo A): los antigenos de Streptococcus de Grupo A incluyen protemas identificadas en los documentos WO 02/34771 y wO 2005/032582 (incluyendo GAS 40), fusiones de fragmentos de protemas GAS M (incluyendo las descritas en el documento WO 02/094851; y Dale (1999) Vaccine 17: 193-200, y Dale (1996) vaccine 14(10): 944-948), protema de union a fibronectina (Sfb1), protema asociada a hemo Estreptococico (Shp) y Estreptolisina S (SagA).

Moraxella catarrhalis: los antigenos de Moraxella incluyen antfgenos identificados en los documentos WO 02/18595; y WO 99/58562, antigenos proteicos de membrana externa (HMW-OMP), antigeno C y/o LPS.

Bordetella pertussis: los antigenos de pertussis incluyen holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente tambien combinacion con antigeno pertactina y/o aglutinogenos 2 y 3.

Staphylococcus aureus: los antfgenos de Staphylococcus aureus incluyen polisacaridos capsulares de S. aureus tipo 5 y 8 opcionalmente conjugados con exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa recombinante no toxica, tales como StaphVAX™, y antfgenos derivados de protemas superficiales, invasinas (leucocidina, quinasas, hialuronidasa), factores de superficie que inhiben el envolvimiento factocftico (capsula, Protema A), carotenoides, produccion de catalasa, Protema A, coagulasa, factor de coagulacion y toxinas de dano a membrana (opcionalmente destoxificadas) que lisan membranas de celulas eucariotas (hemolisinas, leucotoxina, leucocidina).

Staphylococcus epidermidis: los antfgenos de S. epidermidis incluyen antfgeno asociado a limo (SAA).

Clostridium tetani (Tetanos): los antfgenos del tetanos incluyen toxoide tetanico (TT), preferentemente usado como una protema vehmulo en conjuncion/conjugado con las composiciones de la presente invencion.

Cornynebacterium diphtheriae (Difteria): los antfgenos de difteria incluyen toxina difterica, preferentemente destoxificada, tal como CRM197. Adicionalmente, los antfgenos capaces de modular, inhibir o asociarse con ribosilacion de ADP se contemplan para combinacion/coadministracion/conjugacion con las composiciones de la presente invencion. Los toxoides diftericos pueden usarse como protemas vehmulo.

Haemophilus influenzae B (Hib): los antfgenos de Hib incluyen un antfgeno sacarido de Hib.

Pseudomonas aeruginosa: los antfgenos de Pseudomonas incluyen endotoxina A, protema Wzz, LPS de P. aeruginosa, mas particularmente LPS aislados de PAO1 (serotipo O5), y Protemas de Membrana Externa, incluyendo Protemas de Membrana Externa F (OprF) (Price y col. (2001) Infect Immun. 69(5): 3510-3515).

Legionella pneumophila. Los antfgenos bacterianos pueden derivar de Legionella pneumophila.

Streptococcus agalactiae (Streptococcus de Grupo B): los antfgenos de Streptococcus de grupo B incluyen antfgenos proteicos y sacaridos, tales como los identificados en los documentos WO 02/34771; WO 03/093306; WO 04/041157; y WO 2005/002619 (incluyendo las protemas GBS 59, GBS 67, GBS 80, GBS 104, GBS 276, GBS 322, e incluyendo antfgenos sacaridos derivados de los serotipos la, Ib, la/c, II, III, IV, V, VI, VII y VIII).

Neisseria gonorrhoeae: los antfgenos de gonorrhoeae incluyen protema Por (o porina), tal como PorB (vease, por ejemplo, Zhu y col. (2004) Vaccine 22: 660-669), una protema de union a transferrina, tal como TbpA y TbpB (vease, por ejemplo, Price y col. (2004) Infect. Immun. 71(1): 277-283), una protema de opacidad (tal como Opa), una protema de reduccion modificable (Rmp) y preparaciones de vesmulas de membranas externas (OMV) (vease, por ejemplo Plante y col. (2000) J. Infect. Dis. 182: 848-855); documentos WO 99/24578; WO 99/36544; WO 99/57280; y WO02/079243).

Chlamydia trachomatis: los antfgenos de Chlamydia trachomatis incluyen antfgenos derivados de los serotipos A, B, Ba y C (agentes de tracoma, una causa de ceguera), serotipos L1, L2 y L3 (asociados con Lymphogranuloma venereum), y serotipos D-K. Los antfgenos de Chlamydia trachomatis tambien incluyen antfgenos identificados en

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los documented WO 00/37494; WO 03/049762; WO 03/068811; y WO 05/002619, incluyendo PepA (CT045), LcrE (CT089), ArtJ (CT381), DnaK (CT396), CT398, OmpH-like (CT242), L7/L12 (CT316), OmcA (CT444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823), MurG (CT761), CT396 y CT761, y combinaciones espedficas de estos antigenos.

Treponema pallidum (Sffilis): los antigenos de sffilis incluyen antigeno TmpA.

Haemophilus ducreyi (que provoca chancro): los antigenos de Ducreyi incluyen protema de membrana externa (DsrA).

Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium: los antigenos incluyen una repeticion trisacarida y otros antigenos derivados de Enterococcus proporcionados en la Patente de Estados Unidos n.° 6.756.361.

Helicobacter pylori: los antigenos de H. pylori incluyen Cag, Vac, Nap, HopX, HopY y antigeno de ureasa.

Staphylococcus saprophyticus: los antigenos incluyen la hemaglutinina de 160 kDa del antigeno de S. saprophyticus.

Yersinia enterocolitica: los antigenos incluyen LPS (Xu y col. (2002) Infect. Immun. 70(8): 4414-4423).

E. coli: los antfgenos de E. coli pueden derivar de E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), E. coli de adherencia difusa (DAEC), E. coli enteropatogena (EPEC), o E. coli enterohemorragica (EHEC).

Bacillus anthracis (carbunco): los antfgenos de B. anthracis estan opcionalmente destoxificados y pueden seleccionarse de componentes A (factor letal (LF) y factor de edema (EF)), ambos de los cuales pueden compartir un componente B comun conocido como antigeno protector (PA). En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invencion no incluyen un antfgeno de carbunco.

Yersinia pestis (peste): los antigenos de la peste incluyen antigeno capsular F1 (Gosfeld y col. (2003) Infect. Immun. 71(1)): 374-383), LPS (Fields y col. (1999) Infect. Immun. 67(10): 5395-5408), antfgeno V de Yersinia pestis (Hill y col. (1997) Infect. Immun. 65(11): 4476-4482).

Mycobacterium tuberculosis: los antigenos de tuberculosis incluyen lipoprotemas, LPS, antigenos de BCG, una protema de fusion del antigeno 85B (Ag85B) y ESAT-6 formulado opcionalmente en vesteulas lipfdicas cationicas (Olsen y col. (2004) Infect. Immun. 72(10): 6148-6150), antigenos asociados con isocitrato deshidrogenasa de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) (Banerjee y col. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12652-12657) y antfgenos de MPT51 (Suzuki y col. (2004) Infect. Immun. 72(7): 3829-3837).

Rickettsia: los antfgenos incluyen protemas de membrana externa, incluyendo la protema A y/o B de membrana externa (OmpB) (Chao y col. (2004) Biochim. Biophys. Acta. 1702(2): 145-152), LpS, y antfgeno de protema de superficie (sPa) (Carl y col. (1989) J. Autoimmun. 2 Supl: 81-91).

Listeria monocytogenes: los antfgenos bacterianos pueden derivar de Listeria monocytogenes.

Chlamydia pneumoniae: los antfgenos incluyen los identificados en los documentos WO 02/02606 y WO 05/084306, incluyendo CPn0324, Cpn0301, Cpn0482, Cpn0503, Cpn0525, Cpn0558, Cpn0584, Cpn0800, Cpn0979, Cpn0498, Cpn0300, Cpn0042, Cpn0013, Cpn450, Cpn0661, Cpn0557, Cpn0904, Clpn0795, Cpn0186 y Cpn0604, y combinaciones espedficas de estos antfgenos.

Vibrio cholerae: los antfgenos incluyen antigenos de proteinasa, LPS, particularmente lipopolisacaridos de Vibrio cholerae II, polisacaridos espedficos de O O1 Inaba, 0139 de V. cholera, antfgenos de la vacuna IEM108 (Liang y col. (2003) Infect. Immun. 71(10): 5498-5504), y toxina de Zonula occludens (Zot).

Salmonella typhi (fiebre tifoidea): los antfgenos incluyen polisacaridos capsulares preferentemente conjugados (Vi, es decir vax-TyVi).

Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme): los antfgenos incluyen lipoprotemas (tales como OspA, OspB, Osp C y Osp D), otras protemas de superficie tales como protemas relacionadas con OspE (Erps), protemas de union a decorina (tales como DbpA), y protemas VI antigenicamente variables, tales como antfgenos asociados con P39 y P13 (una protema integral de membrana, Noppa y col. (2001) Infect. Immun. 69(5): 3323-3334), Protema de Variacion Antigenica VlsE (Lawrenz y col. (1999) J. Clin. Microbiol. 37(12): 3997-4004).

Porphyromonas gingivalis: los antfgenos incluyen protema de membrana externa (OPM) de P. gingivalis.

Klebsiella: los antfgenos incluyen OMP, incluyendo OMP A, y polisacaridos opcionalmente conjugados con toxoide del tetanos.

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Otros antigenos bacterianos incluyen antigenos capsulares, antigenos polisacaridos o antigenos proteicos de cualquiera de los anteriores. Los antigenos bacterianos adicionales tambien incluyen preparaciones de vesmulas de membrana externa (OMV). Adicionalmente, los antigenos incluyen versiones vivas, atenuadas y/o purificadas de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas. Los antigenos pueden derivar de bacterias gram negativas o gram positivas. Los antfgenos pueden derivar de bacterias aerobias o anaerobias.

Adicionalmente, cualquiera de los sacaridos derivados de bacterias anteriores (polisacaridos, LPS, LOS u oligosacaridos) pueden conjugarse con otro agente u otro antigeno, tal como una protema vehmulo (por ejemplo, CRM197). Dicha conjugacion puede ser conjugacion directa efectuada por aminacion reductora de restos carbonilo en el sacarido a grupos amino en la protema, como se proporciona en la Patente de Estados Unidos n.° 5.360.897; y Roy y col. (1984) Can. J. Biochem. Cell Biol. 62(5): 270-275. En otra realizacion, los sacaridos pueden conjugarse mediante un engarce, tal como, con succinamida u otros enlaces proporcionados en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, 1a ed., Academic Press (1996) y Wong, S. S., cRc, Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking, 1a ed., CRC-Press (1991).

B. ANTfGENOS VfRICOS

Los antfgenos vmcos adecuados para su uso en la divulgacion incluyen virus inactivado (o muerto), virus atenuado, formulaciones de virus divididos, formulaciones de subunidades purificadas, protemas vmcas que pueden aislarse, purificarse o derivarse de un virus, y Partmulas de Tipo Vmco (VLP). Los antfgenos vmcos pueden derivar de virus propagados en cultivo celular u otro sustrato o expresarse de forma recombinante. Los antfgenos vmcos preferentemente incluyen epftopos que se exponen en la superficie del virus durante al menos un estadio de su ciclo vital. Los antfgenos vmcos estan preferentemente conservados entre multiples serotipos o aislados. Los antfgenos vmcos incluyen antfgenos derivados de uno o mas de los virus expuestos posteriormente asf como los ejemplos de antfgenos espedficos identificados posteriormente.

Orthomyxovirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de un Orthomyxovirus, tal como Gripe A, B y C. Los antfgenos de Orthomyxovirus pueden seleccionarse de una o mas de las protemas vmcas, incluyendo hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleoprotema (NP), protema de la matriz (M1), protema de membrana (M2), uno o mas de los componentes de transcriptasa (PB1, PB2 y PA). Los antfgenos preferidos incluyen HA y NA.

Los antfgenos de la gripe pueden derivar de cepas de la gripe interpandemicas (anuales). Los antfgenos de la gripe pueden derivar de cepas con el potencial de provocar un brote pandemico (es decir, cepas de la gripe con nueva hemaglutinina en comparacion con la hemaglutinina en cepas actualmente en circulacion, o cepas de la gripe que son patogenas en sujetos aviares y tienen el potencial de transmitirse horizontalmente en la poblacion humana, o cepas de la gripe que son patogenas para seres humanos). Los antfgenos de la gripe pueden derivar de virus cultivados en huevos o cultivo celular.

Virus Paramyxoviridae: los antfgenos vmcos pueden derivar de virus Paramyxoviridae, tales como Neumovirus (VSR), Paramixovirus (PIV) y Morbillivirus (Sarampion).

Pneumovirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de un Pneumovirus, tales como virus sincitial respiratorio (VSR), virus sincitial respiratorio bovino, virus de neumoma de raton y virus de rinotraquettis de pavo. Preferentemente, el Pneumovirus es VSR. Los antfgenos de Pneumovirus pueden seleccionarse de una o mas de las siguientes protemas, incluyendo protemas de superficie de fusion (F), Glucoprotema (G) y protema Hidrofoba Pequena (SH), protemas de la matriz M y M2, protemas de la nucleocapsida N, P y L y protemas no estructurales NS1 y NS2. Los antfgenos de Pneumovirus preferidos incluyen F, G y M. Vease por ejemplo Johnstone y col. (2004) J. Gen. Virol. 85(Pt 11): 3229-3238. Los antfgenos de Pneumovirus tambien pueden formularse en o derivar de virus quimericos. Por ejemplo, los virus VSR/PIV pueden comprender componentes tanto de VSR como de PIV.

Paramixovirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de un Paramixovirus, tal como virus Paragripal tipos 1-4 (PIV), Paperas, virus Sendai, virus de simio 5, virus paragripal bovino y virus de enfermedad de Newcastle. Preferentemente, el Paramixovirus es PIV o Paperas. Pueden seleccionarse antfgenos de Paramixovirus de una o mas de las siguientes protemas: hemaglutinina neuraminidasa (HN), protemas de fusion F1 y F2, Nucleoprotema (NP), Fosfoprotema (P), protema grande (L) y protema de la Matriz (M). Las protemas de Paramixovirus preferidas incluyen HN, F1 y F2. Los antfgenos de paramixovirus tambien pueden formularse en o derivar de virus quimericos. Por ejemplo, los virus VSR/PIV quimericos pueden comprender componentes tanto de VSR como de PIV. Las vacunas de paperas disponibles en el mercado incluyen virus de paperas atenuados vivos, bien en una forma monovalente o bien en combinacion con vacunas de sarampion y rubeola (MMR).

Morbillivirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de un Morbillivirus, tal como sarampion. Los antfgenos de Morbillivirus pueden seleccionarse de una o mas de las siguientes protemas: hemaglutinina (H), Glucoprotema (G), factor de fusion (F), protema grande (L), Nucleoprotema (NP), fosfoprotema de polimerasa (P) y Matriz (M). Las vacunas de sarampion disponibles en el mercado incluyen virus de sarampion atenuados vivos, tfpicamente en combinacion con paperas y rubeola (MMR).

Picornavirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de Picornavirus, tales como Enterovirus, Rinovirus, Heparnavirus, Cardiovirus y Aftovirus. Se prefieren antfgenos derivados de Enterovirus, tales como Poliovirus.

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Enterovirus: los antigenos vmcos pueden derivar de un Enterovirus, tal como Poliovirus tipos 1, 2 o 3, virus Coxsackie A tipos 1 a 22 y 24, virus Coxsackie B tipos 1 a 6, virus Echovirus (ECHO) tipos 1 a 9, 11 a 27 y 29 a 34 y Enterovirus 68 a 71. Preferentemente, el Enterovirus es poliovirus. Los antigenos de enterovirus se seleccionan preferentemente de una o mas de las siguientes protemas de la Capsida VP1, VP2, VP3 y VP4. Las vacunas de la poliomielitis disponibles en el mercado incluyen Vacuna de la Poliomielitis Inactivada (IPV) y vacuna de poliovirus Oral (OPV).

Heparnavirus: los antigenos vmcos pueden derivar de un Heparnavirus, tal como virus de la Hepatitis A (VHA). Las vacunas de VHA disponibles en el mercado incluyen vacuna de VHA inactivada.

Togavirus: los antigenos vmcos pueden derivar de un Togavirus, tal como un Rubivirus, un Alfavirus o un Arterivirus. Se prefieren antigenos derivados de Rubivirus, tales como virus de la Rubeola. Pueden seleccionarse antfgenos de Togavirus de E1, E2, E3, C, NSP-1, NSPO-2, NSP-3 y NSP-4. Los antigenos de Togavirus se seleccionan preferentemente de E1, E2 y E3. Las vacunas de Rubeola disponibles en el mercado incluyen un virus adaptado al frio vivo, tfpicamente en combinacion con vacunas de paperas y sarampion (MMR).

Flavivirus: los antigenos vmcos pueden derivar de un Flavivirus, tales como encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), Dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), Fiebre Amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis del Nilo Occidental, encefalitis de St. Louis, encefalitis de verno-estival ruso, encefalitis de Powassan. Los antigenos de Flavivirus pueden seleccionarse de PrM, M, C, E, NS-1, NS-2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5. Los antigenos de Flavivirus se seleccionan preferentemente de PrM, M y E. La vacuna de TBE disponible en el mercado incluye vacunas de virus inactivados.

Pestivirus: los antigenos vmcos pueden derivar de un Pestivirus, tal como diarrea vmca bovina (BVDV), fiebre porcina clasica (CSFV) o enfermedad de la frontera (BDV).

Hepadnavirus: los antigenos vmcos pueden derivar de un Hepadnavirus, tal como virus de la Hepatitis B. Los antigenos de Hepadnavirus pueden seleccionarse de antfgenos de superficie (L, M y S), antigenos del nucleo (HBc, HBe). Las vacunas de VHB disponibles en el mercado incluyen vacunas subunitarias que comprenden la protema de antigeno de superficie S.

Virus de la Hepatitis C: los antigenos vmcos pueden derivar de un virus de la Hepatitis C (VHC). Los antigenos de VHC pueden seleccionarse de uno o mas de E1, E2, E1/E2, poliprotema NS345, poliprotema de nucleo NS 345, nucleo y/o peptidos de las regiones no estructurales (Houghton y col. (1991) Hepatology 14: 381-388).

Rhabdovirus: los antigenos vmcos pueden derivar de un Rhabdovirus, tal como Lyssavirus (virus de la Rabia) y Vesiculovirus (VSV). Los antfgenos de Rhabdovirus pueden seleccionarse de glucoprotema (G), nucleoprotema (N), protema grande (L) y protemas no estructurales (NS). Las vacunas de virus de la Rabia disponibles en el mercado comprenden virus muertos cultivados en celulas diploides humanas o celulas de pulmon de mono rhesus fetal.

Caliciviridae: los antfgenos vmcos pueden derivar de Calciviridae, tales como virus Norwalk y virus de tipo Norwalk, tales como Virus de Hawai y Virus de la Montana Nevada.

Coronavirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de un Coronavirus, SARS, coronavirus respiratorio humano, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis de raton (MHV) y virus de gastroenteritis transmisible porcina (TGEV). Los antfgenos de Coronavirus pueden seleccionarse de pua (S), envoltura (E), matriz (M), nucleocapsida (N), y glucoprotema de Hemaglutinina esterasa (HE). Preferentemente, el antfgeno de Coronavirus deriva de un virus de SARs. Los antfgenos vmcos de SARS se describen en el documento WO 04/92360;

Retrovirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de un Retrovirus, tal como un Oncovirus, un Lentivirus o un Spumavirus. Los antfgenos de Oncovirus pueden derivar de HTLV-1, HTLV-2 o HTLV-5. Los antfgenos de Lentivirus pueden derivar de VIH-1 o VIH-2. Los antfgenos de Retrovirus pueden seleccionarse de gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu, y vpr. Los antfgenos de VIH pueden seleccionarse de gag (p24gag y p55gag), env (gp160 y gp41), pol, tat, nef, rev vpu, miniprotemas, (preferentemente p55 gag y gp140v delete). Los antfgenos de VIH pueden derivar de una o mas de las siguientes cepas: VIHiiib, VIHsf2, VIHlav, ViHlai, VIHmn, VIH-1cm235, VIH-1us4.

Reovirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de un Reovirus, tal como un Ortorreovirus, un Rotavirus, un Orbivirus, o un Coltivirus. Los antfgenos de Reovirus pueden seleccionarse de protemas estructurales X1, X2, X3, |i1, |i2, ct1, ct2, o ct3, o protemas no estructurales ctNS, |iNS, o a1s. Los antfgenos de Reovirus preferidos pueden derivar de un Rotavirus. Los antfgenos de Rotavirus pueden seleccionarse de VP1, VP2, VP3, VP4 (o el producto escindido VP5 y VP8), NSP 1, VP6, NSP3, NSP2, Vp7, NSP4 o NSP5. Los antfgenos de Rotavirus preferidos incluyen VP4 (o el producto escindido VP5 y VP8) y VP7.

Parvovirus: los antfgenos vmcos pueden derivar de un Parvovirus, tal como Parvovirus B 19. Los antfgenos vmcos pueden seleccionarse de VP-1, VP-2, VP-3, NS-1 y NS-2. Preferentemente, el antfgeno de Parvovirus es protema de la capsida VP-2.

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Virus de la hepatitis delta (VHD): los antigenos vmcos pueden derivar de VHD, particularmente antigeno 8 de VHD (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.378.814).

Virus de la hepatitis E (VHE): los antigenos vmcos pueden derivar de VHE.

Virus de la hepatitis G (VHG): los antigenos vmcos pueden derivar de VHG.

Herpesvirus Humano: los antigenos vmcos pueden derivar de un Herpesvirus Humano, tal como los Virus del Herpes Simple (VHS), virus de Varicela zoster (VZV), virus de Epstein-Barr (VEB), Citomegalovirus (CMV), Herpesvirus Humano 6 (HHV6), Herpesvirus Humano 7 (HHV7) y Herpesvirus Humano 8 (HHV8). Los antfgenos de Herpesvirus Humano pueden seleccionarse de protemas tempranas inmediatas (a), protemas tempranas (P) y protemas tardfas (y). Los antigenos de VHS pueden derivar de cepas VHS-1 o VHS-2. Los antigenos de VHS pueden seleccionarse de glucoprotemas gB, gC, gD y gH, protema de fusion (gB) o protemas de escape inmunitario (gC, gE o gl). Los antigenos de VZV pueden seleccionarse de protemas del nucleo, de nucleocapsida, de tegumento o de envoltura. Una vacuna de VZV atenuada viva esta disponible en el mercado. Los antfgenos de VEB pueden seleccionarse de protemas antigenicas tempranas (EA), antfgeno de capsida vmca (VCA) y glucoprotemas del antfgeno de membrana (MA). Los antfgenos del CMV pueden seleccionarse de protemas de la capsida, glucoprotemas de envoltura (tales como gB y gH) y proteinasa del tegumento.

Papovavirus: los antfgenos pueden derivar de Papovavirus, tales como Papilomavirus y Poliomavirus. Los Papilomavirus incluyen los serotipos de VPH 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 y 65. Preferentemente, los antfgenos de VPH derivan de los serotipos 6, 11, 16 o 18. Los antfgenos del VPH pueden seleccionarse de protemas de la capsida (L1) y (L2), o E1 - E7, o fusiones de las mismas. Los antfgenos del VPH se formulan preferentemente en partroulas de tipo vmco (VLP). Los virus poliomavirus incluyen virus BK y virus JK. Los antfgenos de Poliomavirus pueden seleccionarse de VP1, VP2 o VP3.

Otros antfgenos, composiciones, procedimientos y microbios para su uso en la invencion se describen en Plotkin, S. A. y col., Vaccines, 4a ed., W. B. Saunders Co. (2004); Murray, P. R. y col., Medical Microbiology 5a ed., Mosby Elsevier (2005); Joklik, W. K. (ed.), Virology, 3a ed., Appleton y Lange (1988); Howley, P. M. y col. (eds.), Fundamental Virology, 4a ed., Lippincott Williams y Wilkins (1991); y Fields, B. N. y col. (eds.), Fields Virology, 4a ed., Lippincott Williams y Wilkins (2001).

C. ANTfGENOS FUNGICOS

Los antfgenos fungicos para su uso en la divulgacion pueden derivar de uno o mas de los hongos expuestos posteriormente.

Los antfgenos fungicos pueden derivar de Dermatofitos, incluyendo:

Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme.

Los patogenos fungicos pueden derivar de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp y Cladosporium spp.

Se conocen en la tecnica procesos para producir antfgenos fungicos (vease Patente de Estados Unidos n.° 6.333.164). En un procedimiento preferido, una fraccion solubilizada extrafda y separada de una fraccion insoluble que puede obtenerse de celulas fungicas de las que se ha eliminado sustancialmente o al menos se ha eliminado parcialmente la pared celular, caracterizada por que el proceso comprende las etapas de: obtener celulas fungicas vivas; obtener celulas fungicas de las que se ha eliminado sustancialmente o al menos se ha eliminado parcialmente la pared celular; estallar las celulas fungicas de las que se ha eliminado sustancialmente o al menos se ha eliminado parcialmente la pared celular; obtener una fraccion insoluble; y extraer y separar una fraccion solubilizada de la fraccion insoluble.

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D. ANTIGENOS DE ETS

Las composiciones de la invencion pueden incluir uno o mas antfgenos polipeptfdicos derivados de una enfermedad de transmision sexual (ETS). Dichos antigenos pueden proporcionar profilaxis o terapia para ETS tales como clamidia, herpes genital, hepatitis (tal como VHC), verrugas genitales, gonorrea, sffilis y/o chancroide (vease documento WO 00/15255). Los antigenos pueden derivar de una o mas ETS vmcas o bacterianas. Los antfgenos de ETS vmcas para su uso en la invencion pueden derivar de, por ejemplo, VIH, virus del herpes simple (VHS-1 y VHS- 2), papilomavirus humano (VPH) y hepatitis (VHC). Los antfgenos de ETS bacterianas para su uso en la invencion puede derivar de, por ejemplo, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, E. coli y Streptococcus agalactiae. Se han descrito anteriormente ejemplos de antigenos espedficos derivados de estos patogenos.

E. ANTIGENOS RESPIRATORIOS

Las composiciones de la invencion pueden incluir uno o mas antfgenos polipeptfdicos derivados de un patogeno que provoca enfermedad respiratoria. Por ejemplo los antigenos respiratorios pueden derivar de un virus respiratorio tal como Ortomixovirus (gripe), Neumovirus (VSR), Paramixovirus (PIV), Morbilivirus (sarampion), Togavirus (Rubeola), VZV y Coronavirus (SARS). Los antfgenos respiratorios pueden derivar de una bacteria que provoca enfermedad respiratoria, tal como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bacillus anthracis y Moraxella catarrhalis. Se han descrito anteriormente ejemplos de antfgenos espedficos derivados de estos patogenos.

F. ANTIGENOS DE VACUNAS PEDIATRICAS

Las composiciones de la invencion pueden incluir uno o mas antfgenos polipeptfdicos adecuados para su uso en sujetos pediatricos. Los sujetos pediatricos son tfpicamente de menos de aproximadamente 3 anos de edad, o menos de aproximadamente 2 anos de edad, o menos de aproximadamente 1 ano de edad. Los antfgenos pediatricos pueden administrarse multiples veces a lo largo de 6 meses, 1, 2 o 3 anos. Los antfgenos pediatricos pueden derivar de un virus que puede dirigirse a poblaciones pediatricas y/o un virus a cuya infeccion son susceptibles las poblaciones pediatricas. Los antfgenos vmcos pediatricos incluyen antfgenos derivados de uno o mas de Ortomixovirus (gripe), Neumovirus (VSR), Paramixovirus (PIV y Paperas), Morbilivirus (sarampion), Togavirus (Rubeola), Enterovirus (poliomielitis), VHB, Coronavirus (SARS) y virus de Varicela zoster (VZV), virus de Epstein Barr (VEB). Los antfgenos bacterianos pediatricos incluyen antfgenos derivados de uno o mas de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides, Streptococcus pyogenes (Estreptococus de Grupo A), Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani (Tetanos), Cornynebacterium diphtheriae (Difteria), Haemophilus influenzae B (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae (Estreptococus de Grupo B), y E. coli. Se han descrito anteriormente ejemplos de antfgenos espedficos derivados de estos patogenos.

G. ANTIGENOS ADECUADOS PARA SU USO EN INDIVIDUOS ANCIANOS O INMUNOCOMPROMETIDOS

Las composiciones de la invencion pueden incluir uno o mas antfgenos polipeptfdicos adecuados para su uso en individuos ancianos o inmunocomprometidos. Dichos individuos pueden necesitar vacunarse con mas frecuencia, con mayores dosis o con formulaciones con adyuvantes para mejorar su respuesta inmunitaria a los antfgenos diana. Los antfgenos que pueden ser diana para uso en individuos ancianos o inmunocomprometidos incluyen antfgenos derivados de uno o mas de los siguientes patogenos: Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Estreptococus de Grupo A), Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Clostridium tetani (Tetanos), Cornynebacterium diphtheriae (Difteria), Haemophilus influenzae B (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Streptococcus agalactiae (Estreptococus de Grupo B), Enterococcus faecalis, Helicobacter pylori, Clamydia pneumoniae, Ortomixovirus (gripe), Neumovirus (VSR), Paramixovirus (PIV y Paperas), Morbilivirus (sarampion), Togavirus (Rubeola), Enterovirus (poliomielitis), VHB, Coronavirus (SARS), virus de Varicela zoster (VZV), virus de Epstein Barr (VEB), Citomegalovirus (CMV). Se han descrito anteriormente ejemplos de antfgenos espedficos derivados de estos patogenos.

H. ANTIGENOS ADECUADOS PARA SU USO EN VACUNAS DE ADOLESCENTES

Las composiciones de la invencion pueden incluir uno o mas antfgenos polipeptfdicos adecuados para su uso en sujetos adolescentes. Los adolescentes pueden necesitar un refuerzo de un antfgeno pediatrico previamente administrado. Se han descrito anteriormente antfgenos pediatricos que pueden ser adecuados para su uso en adolescentes. Ademas, los adolescentes pueden ser el objetivo de suministro de antfgenos derivados de un patogeno de ETS para asegurar inmunidad protectora o terapeutica antes del comienzo de la actividad sexual. Se han descrito anteriormente antfgenos de ETS que pueden ser adecuados para su uso en adolescentes.

I. ANTIGENOS TUMORALES

Las composiciones de la divulgacion pueden incluir uno o mas antfgenos tumorales o cancerosos. Los antfgenos tumorales pueden ser, por ejemplo, antfgenos tumorales que contienen peptidos, tales como un antfgeno tumoral polipeptfdico o antfgenos tumorales glucoproteicos. Un antfgeno tumoral puede ser tambien, por ejemplo, un

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antigeno tumoral que contenga un sacarido, tal como un antigeno tumoral glucolip^dico o un antigeno tumoral gangliosido. Un antigeno tumoral puede ser ademas, por ejemplo, un antigeno tumoral que contiene un polinucleotido que expresa un antigeno tumoral que contiene un polipeptido, por ejemplo, una construccion de vector de ARN o una construccion de vector de ADN, tal como ADN plasirndico.

Los antigenos tumorales incluyen (a) antigenos tumorales que contiene polipeptidos, incluyendo polipeptidos (que pueden variar, por ejemplo, de 8 a 20 aminoacidos de longitud, aunque las longitudes fuera de este rango tambien son comunes), lipopolipeptidos y glucoprotemas, (b) antfgenos tumorales que contienen sacaridos, incluyendo polisacaridos, mucinas, gangliosidos, glucoKpidos y glucoprotemas y (c) polinucleotidos que expresan polipeptidos antigenicos.

Los antfgenos tumorales pueden ser, por ejemplo, (a) moleculas de longitud completa asociadas con celulas cancerosas, (b) homologos y formas modificadas de los mismos, incluyendo moleculas con partes suprimidas, anadidas y/o sustituidas, y (c) fragmentos de los mismos. Pueden proporcionarse antfgenos tumorales en forma recombinante. Los antfgenos tumorales incluyen, por ejemplo, antfgenos restringidos a clase I reconocidos por linfocitos CD8+ o antfgenos restringidos a clase II reconocidos por linfocitos CD4+.

Se conocen en la tecnica numerosos antfgenos tumorales incluyen: (a) antfgenos de cancer-testfculo tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 asf como polipeptidos de la familia RAGE, BaGe, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAgE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que pueden usarse, por ejemplo, para abordar melanoma, tumores de pulmon, de cabeza y cuello, NSCLC, de mama, gastrointestinal y de vejiga), (b) antfgenos mutados, por ejemplo p53 (asociado con diversos tumores solidos, por ejemplo, cancer colorrectal, de pulmon, de cabeza y cuello), p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cancer pancreatico y cancer colorrectal), CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma), MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociado con, por ejemplo, cancer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cancer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociado con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no de Hodgkin de linfocitos T), BCR-abl (asociado con, por ejemplo, leucemia mielogena cronica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT, (c) antfgenos sobreexpresados, por ejemplo, Galectina 4 (asociada con, por ejemplo, cancer colorrectal), Galectina 9 (asociada con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada con, por ejemplo, leucemia mielogena cronica), WT 1 (asociada con, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbonica (asociada con, por ejemplo, cancer renal), aldolasa A (asociada con, por ejemplo, cancer de pulmon), PRAME (asociada con, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu (asociado con, por ejemplo, cancer de mama, de colon, de pulmon y ovarico), alfa-fetoprotema (asociada con, por ejemplo, hepatoma), KSA (asociada con, por ejemplo, cancer colorrectal), gastrina (asociada con, por ejemplo, cancer pancreatico y gastrico), protema catalftica de telomerasa, MUC-1 (asociada con, por ejemplo, cancer de mama y ovarico), G-250 (asociado con, por ejemplo, carcinoma de celulas renales), p53 (asociado con, por ejemplo, cancer de mama, de colon), y antfgeno carcinoembrionario (asociado con, por ejemplo, cancer de mama, cancer de pulmon y canceres del tracto gastrointestinal tales como cancer colorrectal), (d) antfgenos compartidos, por ejemplo, antfgenos de diferenciacion de melanoma-melanocitos tales como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor de hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, protema relacionada con tirosinasa-1/TRP1 y protema relacionada con tirosinasa-2/TRP2 (asociada con, por ejemplo, melanoma), (e) antfgenos asociados a prostata tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con por ejemplo cancer de prostata, (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados con mieloma y linfomas de linfocitos B, por ejemplo) y (g) otros antfgenos tumorales, tales como antfgenos que contienen polipeptido y sacarido incluyendo (i) glucoprotemas tales como sialil Tn y sialil Lex (asociado con, por ejemplo, cancer de mama y cancer de mama y colorrectal), asf como diversas mucinas; pueden acoplarse glucoprotemas con una protema vehroulo (por ejemplo, MUC-1 puede acoplarse con KLH); (ii) lipopolipeptidos (por ejemplo, MUC-1 unida a un resto lipfdico); (iii) polisacaridos (por ejemplo, hexasacarido sintetico Globo H), que pueden estar acoplados con una protema vehmulo (por ejemplo, con KLH), (iv) gangliosidos tales como GM2, GM12, GD2, GD3 (asociados con, por ejemplo, cerebro, cancer de pulmon, melanoma), que tambien pueden acoplarse con protemas vehmulo (por ejemplo, KLH).

Otros antfgenos tumorales incluyen p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antfgenos de virus de Epstein Barr, EBNA, antfgenos de papilomavirus humano (VPH), incluyendo E6 y E7, antfgenos de virus de la hepatitis B y C, antfgenos de virus linfotropico de linfocito T humanos, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO- 029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (protema de union a Mac-2\protema asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS.

Se describen estos asf como otros componentes celulares por ejemplo en la Publicacion de Patente de Estados Unidos n.° 2002/0007173 y referencias citadas en la misma.

Los antfgenos que contienen polinucleotidos de acuerdo con la presente invencion tfpicamente comprenden polinucleotidos que codifican antfgenos polipeptfdicos de cancer tales como los enumerados anteriormente. Los antfgenos que contienen polinucleotidos preferidos incluyen construcciones de vector ADN o ARN, tales como vectores plasirndicos (por ejemplo, pCMV), que son capaces de expresar antfgenos polipeptfdicos de cancer in vivo.

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Los antigenos tumorales pueden derivar, por ejemplo, de componentes celulares mutados o alterados. Despues de la alteracion, los componentes celulares ya no realizan sus funciones regulares, y por lo tanto la celula puede experimentar crecimiento descontrolado. Los ejemplos representativos de componentes celulares alterados incluyen ras, p53, Rb, protema alterada codificada por el gen de tumor de Wilms, ubiquitina, mucina, protema codificada por los genes de DCC, APC y MCC, asf como receptores o estructuras de tipo receptor tales como neu, receptor de hormona tiroidea, receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), receptor de insulina, receptor de factor de crecimiento epidermico (EGF), y el receptor del factor estimulante de colonias (CSF). Estos componentes celulares, asf como otros, se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.° 5.693.522 y referencias citadas en la misma.

Pueden usarse antigenos bacterianos y vmcos, junto con las composiciones de la presente invencion para el tratamiento de cancer. En particular, pueden usarse protemas vehmulo, tales como CRM197, toxoide del tetanos o antigeno de Salmonella typhimurium junto con/en conjugacion con compuestos de la presente invencion para el tratamiento de cancer. Las terapias de combinacion de antigenos de cancer mostraran eficacia y biodisponibilidad aumentada en comparacion con terapias existentes.

Puede encontrarse informacion adicional sobre antigenos de cancer o tumorales, por ejemplo, en Moingeon (2001) Vaccine 19: 1305-1326; Rosenberg (2001) Nature 411: 380-384; Dermine y col. (2002) Brit. Med. Bull. 62: 149-162; Espinoza-Delgado (2002) The Oncologist 7 (supl 3): 20-33; Davis y col. (2003) J. Leukocyte Biol. 23: 3-29; Van den Eynde y col. (1995) Curr. Opin. Immunol. 7: 674-681; Rosenberg (1997) Immunol. Today 18: 175-182; Offringa y col. (2000) Curr. Opin. Immunol. 2: 576-582; Rosenberg (1999) Immunity 10: 281-287; Sahin y col. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: 709-716; Old y col. (1998) J. Exp. Med. 187: 1163-1167; Chaux y col. (1999) J. Exp. Med. 189: 767-778; Gold y col. (1965) J. Exp. Med. 122: 467-468; Livingston y col. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45: 1-6; Livingston y col. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45: 10-19; Taylor-Papadimitriou (1997) Immunol. Today 18: 105-107; Zhao y col. (1995) J. Exp. Med. 182: 67-74; Theobald y col. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1199311997; Gaudemack (1996) Immunotechnology 2: 3-9; documento wO 91/02062; Patente de Estados Unidos n.° 6.015.567; WO 01/08636; WO 96/30514; Patente de Estados Unidos n.° 5.846.538; y Patente de Estados Unidos n.° 5.869.445.

Antfgenos adicionales tambien pueden incluir una preparacion de vesmula de membrana externa (OMV).

Se proporcionan procedimientos de formulacion y antfgenos (especialmente antfgenos tumorales) adicionales en la Publicacion de Patente de Estados Unidos n.° 2004/0202680. Vease tambien Patente de Estados Unidos n.° 6.884.435.

J. REFERENCIAS DE ANTfGENOS

Las composiciones de la invencion pueden incluir antfgenos polipeptfdicos descritos en cualquiera de las siguientes referencias:

1 Publicacion Internacional n.° WO 99/24578.

2 Publicacion Internacional n.° WO 99/36544.

3 Publicacion Internacional n.° WO 99/57280.

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5 Tettelin y col. (2000) Science 287: 1809-1815.

6 Publicacion Internacional n.° WO 96/29412.

7 Pizza y col. (2000) Science 287: 1816-1820.

8 Publicacion Internacional n.° WO 01/52885.

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55 Publicacion Internacional n.° WO 98/42721.

56 Cruse y col. (eds.) Conjugate Vaccines, particularmente vol. 10: 48-114.

57 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, 1a ed., Academic Press (1996).

58 Publicacion de Patente Europea n.° 0 372 501.

59 Publicacion de Patente Europea n.° 0 378 881.

60 Publicacion de Patente Europea n.° 0 427 347.

61 Publicacion Internacional n.° WO 93/17712.

62 Publicacion Internacional n.° WO 98/58668.

63 Publicacion de Patente Europea n.° 0 471 177.

64 Publicacion Internacional n.° WO 00/56360.

65 Publicacion Internacional n.° WO 00/67161.

5. COMPONENTES COMPLEMENTARIOS OPCIONALES, INCLUYENDO ADYUVANTES INMUNOLOGICOS

Las composiciones inmunogenicas de la presente invencion pueden incluir una amplia diversidad de componentes complementarios opcionales.

Dichos componentes complementarios pueden administrarse, por ejemplo, simultaneamente con las composiciones que contienen nanopartfculas, por ejemplo, en la misma composicion o en una composicion separada. En otra realizacion, pueden administrarse componentes complementarios antes o despues de la administracion de las composiciones que contienen nanopartfculas. Cuando se administran en la misma composicion, los componentes complementarios pueden adsorberse en la superficie de las nanopartfculas, inmovilizarse dentro de las nanopartfculas, disolverse o dispersarse en solucion mientras no estan unidos a las nanopartfculas, adsorberse en o inmovilizarse dentro de otro grupo de nanopartfculas, y asf sucesivamente.

Dichos componentes complementarios incluyen: (a) productos farmaceuticos tales como antibioticos y agentes antivmcos, farmacos antiinflamatorios no esteroideos, analgesicos, vasodilatadores, farmacos cardiovasculares, psicotropicos, neurolepticos, antidepresivos, farmacos antiparkinsonianos, bloqueadores beta, bloqueadores del canal de calcio, inhibidores de bradiquinina, inhibidores de ACE, vasodilatadores, inhibidores de prolactina, esteroides, antagonistas hormonales, antihistammicos, antagonistas de serotonina, heparina, agentes quimioterapeuticos, antineoplasicos y factores de crecimiento, incluyendo PDGF, EGF, KGF, IGF-1 e IGF-2, FGF, (b) hormonas incluyendo hormonas peptfdicas tales como insulina, proinsulina, hormona del crecimiento, GHRH, LHRH, EGF, somatostatina, SNX-111, BnP, insulinotropina, ANP, FSH, LH, PSH y hCG, hormonas esteroideas gonadales (androgenos, estrogenos y progesterona), hormona estimulante del tiroides, inhibina, colecistoquinina, ACTH, CRF, dinorfinas, endorfinas, endotelina, fragmentos de fibronectina, galanina, gastrina, insulinotropina, glucagon, fragmentos de protemas de union a GTP, guanilina, las leucoquininas, magainina, mastoparanos, dermaseptina, sistemina, neuromedinas, neurotensina, pancreastatina, polipeptido pancreatico, sustancia P, secretina, timosina (c) enzimas, (d) mediadores de la transcripcion o traduccion y (e) intermedios en rutas metabolicas, y (f) inmunomoduladores, tales como cualquiera de las diversas citocinas incluyendo interleucina 1, interleucina 2, interleucina 3, interleucina 4 e interferon gamma.

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En una realizacion preferida, las composiciones de la invencion incluyen un adyuvante inmunologico. Los adyuvantes para su uso con la invencion incluyen uno o mas de los siguientes expuestos a continuacion:

A. COMPOSICIONES QUE CONTIENEN MINERALES

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invencion incluye sales minerales tales como hidroxidos (por ejemplo oxihidroxidos), fosfatos (por ejemplo hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos (vease, por ejemplo, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M. F. y Newman, M. J. eds.) (Nueva York: Plenum Press) 1995, Capftulos 8 y 9), o mezclas de diferentes compuestos minerales (por ejemplo una mezcla de un fosfato y un adyuvante de hidroxido, opcionalmente con un exceso del fosfato), tomando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo gel, cristalina, amorfa) y con adsorcion a la sal o las sales que se prefieran. Las composiciones que contienen minerales tambien pueden formularse como una partfcula de sal metalica (documento WO 00/23105).

Pueden incluirse sales de aluminio en vacunas de la invencion de modo que la dosis de Al3+ esta entre 0,2 y 1,0 mg por dosis.

En una realizacion, el adyuvante basado en aluminio para su uso en la presente invencion es alumbre (sulfato potasico de aluminio (AlK(SO4)2)), o un derivado de alumbre, tal como el formado in situ mezclando un antfgeno en tampon fosfato con alumbre, seguido de valoracion y precipitacion con una base tal como hidroxido de amonio o hidroxido sodico.

Otro adyuvante basado en aluminio para su uso en formulaciones de vacuna de la presente invencion es adyuvante de hidroxido de aluminio (Al(OH)3) y oxihidroxido de aluminio cristalino (AlOOH), que es un adsorbente excelente, que tiene un area de superficie de aproximadamente 500 m2/g. En otra realizacion, el adyuvante basado en aluminio es adyuvante de fosfato de aluminio (APO4) o hidroxifosfato de aluminio, que contiene grupos fosfato en lugar de algunos o todos los grupos hidroxilo de adyuvante de hidroxido de aluminio. Los adyuvantes de fosfato de aluminio preferidos proporcionados en el presente documento son amorfos y solubles en medios acidos, basicos y neutros.

En otra realizacion, el adyuvante comprende tanto fosfato de aluminio como hidroxido de aluminio. En una realizacion mas particular del mismo, el adyuvante tiene una mayor cantidad de fosfato de aluminio que de hidroxido de aluminio, tal como una relacion de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 o mayor de 9:1, en peso de fosfato de aluminio frente a hidroxido de aluminio. En otra realizacion, estan presentes sales de aluminio en la vacuna a 0,4 a 1,0 mg por dosis de vacuna, o 0,4 a 0,8 mg por dosis de vacuna, o 0,5 a 0,7 mg por dosis de vacuna, o aproximadamente 0,6 mg por dosis de vacuna.

En general, el adyuvante o los adyuvantes basados en aluminio preferidos, o relacion de multiples adyuvantes basados en aluminio, tales como fosfato de aluminio frente a hidroxido de aluminio se seleccionan por optimizacion de atraccion electroestatica entre moleculas de modo que el antfgeno porte una carga opuesta al adyuvante al pH deseado. Por ejemplo, el adyuvante de fosfato de aluminio (iep = 4) adsorbe lisozima, pero no albumina a pH 7,4. Si la albumina fuera la diana, se seleccionana adyuvante de hidroxido de aluminio (iep 11,4). Como alternativa, el pretratamiento de hidroxido de aluminio con fosfato reduce su punto isoelectrico, haciendolo un adyuvante preferido para antfgenos mas basicos.

B. EMULSIONES EN ACEITE

Las composiciones de emulsion en aceite y formulaciones adecuadas para su uso como adyuvantes (con o sin otros agentes inmunoestimulantes espedficos tales como peptidos de muramilo o componentes de la pared celular bacteriana) incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (Escualeno 5 %, Tween 80 0,5 % y Spa 0,5%, formulados en partfculas submicrometricas usando un microfluidificador). Vease documento WO 90/14837. Vease tambien, Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680; Frey y col. (2003) Vaccine 21: 4234-4237. MF59 se usa como el adyuvante en la vacuna de subunidad trivalente del virus de la gripe FLUAD™.

Son adyuvantes particularmente preferidos para su uso en las composiciones emulsiones de aceite en agua submicrometricas. Son emulsiones de aceite en agua submicrometricas preferidas para su uso en el presente documento emulsiones de escualeno/agua que contienen opcionalmente diversas cantidades de MTP-Pe, tales como emulsion de aceite en agua submicrometrica que contiene Escualeno 4-5% p/v, Tween 80™ 0,25-1,0% p/v (polioxietilensorbitan monooleato) y/o Span 85™ (sorbitan trioleato) 0,25-1,0 % y, opcionalmente, N-acetilmuramil-L- alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfoforiloxi)-etilamina (MTP-PE), por ejemplo, la emulsion de aceite en agua submicrometrica conocida como “MF59” (documento WO 90/14837; Patente de Estados Unidos n.° 6.299.884; Patente de Estados Unidos n.° 6.451.325; y Ott y col., “MF59 -- Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines” en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M. F. y Newman, M. J. eds.) (Nueva York: Plenum Press) 1995, pp. 277-296). MF59 contiene Escualeno 4-5% p/v (por ejemplo 4,3%), Tween 80™ 0,25-0,5% p/v y Span 85™ 0,5% p/v y opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE, formulado en partfculas submicrometricas usando un microfluidificador tal como microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA). Por ejemplo, MTP-PE puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0-500 |ig/dosis, mas preferentemente 0-250 |ig/dosis y mas preferentemente, 0-

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100 |ig/dosis. Como se usa en el presente documento, el termino “MF59-0” se refiere a la emulsion de aceite en agua submicrometrica anterior que carece de MTP-PE, mientras que el termino MF59-MTP indica una formulacion que contiene MTP-PE. Por ejemplo, “MF59-100” contiene 100 |ig de MTP-PE por dosis, y asf sucesivamente. MF69, otras emulsion de aceite en agua submicrometrica para uso en el presente documento, contiene Escualeno 4-3 % p/v, Tween 80™ 0,25 % p/v y Span 85™ 0,75 % p/v y opcionalmente MTP-PE. Otra emulsion mas de aceite en agua submicrometrica mas es mF75, tambien conocida como SAF, que contiene escualeno 10%, Tween 80™ 0,4%, polfmero en bloque con pluronic 5 % L121, y thr-MDP, tambien microfluidificado en una emulsion submicrometrica. MF75-MTP indica una formulacion de MF75 que incluye MTP, tal como de 100 a 400 |ig de MTP-PE por dosis.

Se describen en detalle emulsiones de aceite en agua submicrometricas, procedimientos para prepararlas y agentes inmunoestimulantes, tales como peptidos de muramilo, para uso en las composiciones, en el documento WO 90/14837; Patente de Estados Unidos n.° 6.299.884; y Patente de Estados Unidos n.° 6.451.325.

Tambien pueden usarse adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) como adyuvantes en la invencion.

C. FORMULACIONES DE SAPONINA

Las formulaciones de saponina tambien son adecuadas para su uso como adyuvantes en la invencion. Las saponinas son un grupo heterologo de glucosidos de esterol y glucosidos de triterpenoides que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las rafces e incluso las flores de una amplia serie de especies vegetales. Las saponinas aisladas de la corteza del arbol de Molina Quillaia saponaria se han estudiado ampliamente como adyuvantes. Las saponinas tambien pueden obtenerse en el mercado de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officinalis (jabonera). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, asf como formulaciones lipfdicas, tales como ISCOM. Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen adyuvante STIMULON® (Antigenics, Inc., Lexington, MA).

Se han purificado composiciones de saponina usando Cromatograffa en Capa Fina de Alto Rendimiento (HP-TLC) y Cromatograffa Liquida de Alto Rendimiento de Fase Inversa (RP-HPLC). Se han identificado fracciones purificadas espedficas usando estas tecnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Se desvela un procedimiento de produccion de QS21 en la Patente de Estados Unidos n.° 5.057.540. Las formulaciones de saponina tambien pueden comprender un esterol, tal como colesterol (vease el documento WO 96/33739).

Pueden usarse combinaciones de saponinas y colesteroles para formar parffculas unicas denominadas Complejos Inmunoestimulantes (ISCOM). Los ISCOM ffpicamente incluyen tambien un fosfolfpido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Puede usarse cualquier saponina conocida en ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o mas de Quil A, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en los documentos EP 0 109 942, WO 96/11711 y WO 96/33739. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de un detergente o detergentes adicionales. Vease documento WO 00/07621.

Puede encontrarse una revision del desarrollo de adyuvantes basados en saponina en Barr y col. (1998) Adv. Drug Del. Rev. 32: 247-271. Vease tambien Sjolander y col. (1998) Adv. Drug Del. Rev. 32: 321-338.

D. VIROSOMAS Y PARTfcULAS DE TIPO VfRICO (VLP)

Los virosomas y Parffculas de Tipo Vmco (VLP) tambien son adecuados como adyuvantes. Estas estructuras contienen en general una o mas protemas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolfpido. Son en general no patogenos, no replicantes y generalmente no contienen nada del genoma vmco nativo. Las protemas vmcas pueden producirse de forma recombinante o aislarse de virus completos. Estas protemas vmcas adecuadas para uso en virosomas o VLP incluyen protemas derivadas de virus de la gripe (tales como HA o NA), virus de la Hepatitis B (tales como protemas del nucleo de la capsida), virus de la Hepatitis E, virus del sarampion, virus Sindbis, Rotavirus, virus de Fiebre Aftosa, Retrovirus, virus Norwalk, virus del Papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago Qp (tales como protemas de cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tal como protema p1 de retrotransposon Ty). Se analizan VLP adicionalmente en los documentos WO 03/024480; WO 03/024481; Niikura y col. (2002) Virology 293: 273-280; Lenz y col. (2001) J. Immunol. 166(9): 5346-5355; Pinto y col. (2003) J. Infect. Dis. 188: 327-338; y Gerber y col. (2001) J. Virol. 75(10): 4752-4760. Los virosomas se analizan adicionalmente en, por ejemplo, Gluck y col. (2002) Vaccine 20: B10-B16. Se usan virosomas de la gripe reconstituidos inmunopotenciadores (IRIV) como el sistema de suministro de anffgenos subunitarios en el producto trivalente intranasal INFLEXAL™ (Mischler y Metcalfe (2002) Vaccine 20 Supl 5: B17-B23) y el producto INFLUVAC PLUS™.

E. DERIVADOS BACTERIANOS O MICROBIANOS

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invencion incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como:

(1) Derivados no toxicos de lipopolisacarido (LPS) enterobacteriano: dichos derivados incluyen Monofosforil lfpido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de monofosforil ffpido A 3 Des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de “parffcula pequena” preferida de monofosforil ffpido A 3 Des-O-acilado se

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desvela en el documento EP 0 689 454. Dichos “partfculas pequenas” de 3dMPL son suficientemente pequenas para esterilizarse por filtracion a traves de una membrana de 0,22 micrometros (vease documento EP 0 689 454). Otros derivados de LPS no toxicos incluyen mimeticos de monofosforil Kpido A, tales como derivados de aminoalquil glucoasaminida fosfato, por ejemplo, RC-529. Vease Johnson y col. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2273-2278.

(2) Derivados de Lfpido A: los derivados de lfpido A incluyen derivados de lfpido A de Escherichia coli tales como oM-174. OM-174 se describe por ejemplo en Meraldi y col. (2003) Vaccine 21: 2485-2491; y Pajak y col. (2003) Vaccine 21: 836-842.

(3) Oligonucleotidos inmunoestimuladores: los oligonucleotidos inmunoestimuladores o moleculas polimericas adecuadas para uso como adyuvantes en la invencion incluyen secuencias de nucleotidos que contienen un motivo CpG (una secuencia que contiene una citosina no metilada seguida de guanosina y unida por un enlace fosfato). Tambien se ha mostrado que el ARN bicatenario bacteriano u oligonucleotidos que contienen secuencias palindromicas o poli(dG) son inmunoestimulantes. Los CpG pueden incluir modificaciones de nucleotidos/analogos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Opcionalmente, la guanosina puede reemplazarse con un analogo tal como 2'-desoxi-7-desazaguanosina. Vease Kandimalla y col. (2003) Nucl. Acids Res. 31(9): 2393-2400; documentos WO 02/26757; y WO 99/62923 para ejemplos de posibles sustituciones analogas. El efecto adyuvante de oligonucleotidos de CpG se analiza adicionalmente en Krieg (2003) Nat. Med. 9(7): 831-835; McCluskie y col. (2002) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 32: 179-185; documentos WO 98/40100; Patente de Estados Unidos n.° 6.207.646; Patente de Estados Unidos n.° 6.239.116; y Patente de Estados Unidos n.° 6.429.199.

La secuencia de CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT. Vease Kandimalla y col. (2003) Biochem. Soc. Trans. 31 (parte 3): 654-658. La secuencia de CpG puede ser espedfica para inducir una respuesta inmunitaria de Th1, tal como un ODN CpG-A, o puede ser mas espedfica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CpG-B. Se analizan ODN CpG-A y CpG-B en Blackwell y col. (2003) J. Immunol. 170(8): 4061-4068; Krieg (2002) TRENDS Immunol. 23(2): 64-65; y documento WO 01/95935. Preferentemente el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleotido de CpG se construye de modo que el extremo 5' sea accesible para reconocimiento de receptor. Opcionalmente, pueden unirse dos secuencias oligonucleotfdicas CpG en sus extremos 3' para formar “inmunomeros”. Vease, por ejemplo, Kandimalla y col. (2003) BBRC 306: 948-953; Kandimalla y col. (2003) Biochem. Soc. Trans. 31 (parte 3): 664-658; Bhagat y col. (2003) BBRC 300: 853-861; y documento WO 03/035836.

Los oligonucleotidos inmunoestimulantes y moleculas polimericas tambien incluyen estructuras de cadena principal polimerica alternativas tales como cadenas principales de polivinilo (Pitha y col. (1970) Biochem. Biophys. Acta 204(1): 39-48; Pitha y col. (1970) Biopolymers 9(8): 965-977), y cadenas principales de morfolina (Patente de Estados Unidos n.° 5.142.047; Patente de Estados Unidos n.° 5.185.444). Se conocen en la tecnica una diversidad de otros analogos de polinucleotidos con carga y sin carga. Se conocen en la tecnica numerosas modificaciones de cadena principal, incluyendo enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriesteres, fosfoamidatos y carbamatos) y enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos y fosforoditioatos).

(4) Toxinas de ribosilacion de ADP y derivados detoxificados de las mismas: pueden usarse toxinas de ribosilacion de ADP bacterianas y derivados detoxificados de las mismas como adyuvantes en la invencion. Preferentemente, la protema deriva de E. coli (es decir, enterotoxina termolabil de E. coli “LT”), colera (“CT”) o tosferina (“PT”). El uso de toxinas que ribosilan ADP destoxificadas como adyuvantes de mucosa se describen en el documento WO 95/17211 y como adyuvantes parentales en el documento WO 98/42375. Preferentemente, el adyuvante es un mutante de LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LTR192G. El uso de toxinas que ribosilan ADP y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes puede encontrarse en las siguientes referencias: Beignon y col. (2002) Infect. Immun. 70(6): 3012-3019; Pizza y col. (2001) Vaccine 19: 2534-2541; Pizza y col. (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290(4-5): 455-461; Scharton- Kersten y col. (2000) Infect. Immun. 68(9): 5306-5313; Ryan y col. (1999) Infect. Immun. 67(12): 6270-6280; Partidos y col. (1999) Immunol. Lett. 67(3): 209-216; Peppoloni y col. (2003) Vaccines 2(2): 285-293; y Pine y col. (2002) J. Control Release 85(1-3): 263-270. La referencia numerica para sustituciones de aminoacidos se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de toxinas que ribosilan ADP expuestas en Domenighini y col. (1995) Mol. Microbiol. 15(6): 1165-1167.

Tambien pueden usarse como adyuvantes compuestos de formula I, II o III, o sales de los mismos:

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como se define en el documento WO 03/011223, tales como 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 o 'ER 804057' por ejemplo:

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F. INMUNOMODULADORES HUMANOS

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12), interferones (por ejemplo, interferon y), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF) y factor de necrosis tumoral (TNF).

10 G. BIOADHESIVOS Y MUCOADHESIVOS

Tambien pueden usarse como adyuvantes bioadhesivos y mucoadhesivos. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de acido hialuronico esterificadas (Singh y col. (2001) J. Cont. Release 70: 267-276) o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de acido poliacnlico, alcohol polivimlico, polivinil pirrolidona, polisacaridos y carboximetilcelulosa. Tambien pueden usarse quitosano y derivados del mismo como adyuvantes en la invencion 15 (vease documento WO 99/27960).

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H. LIPOSOMAS

Se describen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes en la Patente de Estados Unidos n.° 6.090.406; Patente de Estados Unidos n.° 5.916.588; y Publicacion de Patente de EP n.° EP 0 626 169.

I. FORMULACIONES DE POLIOXIETILEN ETER Y POLIOXIETILEN ESTER

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invencion incluyen polioxietilen eteres y polioxietilen esteres (vease, por ejemplo, documento WO 99/52549). Dichas formulaciones incluyen ademas tensioactivos de polioxietilen sorbitan ester en combinacion con un octoxinol (documento WO 01/21207) as^ como tensioactivos de polioxietilen alquil eteres o ester en combinacion con al menos un tensioactivo no ionico adicional tal como un octoxinol (documento WO 01/21152).

Se seleccionan polioxietilen eteres preferidos del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauril eter (lauret 9), polioxietilen-9- esteoril eter, polioxiteilen-8-esteoril eter, polioxietilen-4-lauril eter, polioxietilen-35-lauril eter y polioxietilen-23-lauril eter.

J. POLIFOSFACENO (PCPP)

Se describen formulaciones de PCPP adecuadas para su uso como adyuvantes, por ejemplo, en Andrianov y col. (1998) Biomaterials 19(1-3): 109-115; y Payne y col. (1998) Adv. Drug Del. Rev. 31(3): 185-196.

K. PEPTIDOS DE MURAMILO

Los ejemplos de peptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes incluyen W-acetil-muramil-L-treonil- D-isoglutamina (tr-MDP), W-acetil-normuramil-1-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP) y W-acetilmuramil-1-alanil-d-iso- glutaminil-1-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

L. COMPUESTOS DE IMIDAZOQUINOLINA

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolina adecuados para su uso como adyuvantes incluyen imiquimod y sus analogos, que se describen adicionalmente en Stanley (2002) Clin. Exp. Dermatol. 27(7): 571-577; Jones (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs 4(2): 214-218; y Patentes de Estados Unidos n.° 4.689.338; 5.389.640; 5.268.376; 4.929.624; 5.266.575; 5.352.784; 5.494.916; 5.482.936; 5.346.905; 5.395.937; 5.238.944; y 5.525.612.

M. COMPUESTOS DE TIOSEMICARBAZONA

Los ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona adecuados para su uso como adyuvantes, asf como procedimientos de formulacion, fabricacion y exploracion de dichos compuestos, incluyen los descritos en el documento WO 04/60308. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana para la produccion de citocinas, tales como TNF-a.

N. COMPUESTOS DE TRIPTANTRINA

Los ejemplos de compuestos de triptantrina adecuados para su uso como adyuvantes, asf como procedimientos para formular, fabricar y explorar dichos compuestos, incluyen los descritos en el documento WO 04/64759. Los compuestos de triptantrina son particularmente eficaces en la estimulacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana para la produccion de citocinas, tales como TNF-a.

O. ANALOGOS DE NUCLEOSIDOS

Pueden usarse diversos analogos de nucleosidos como adyuvantes, tales como (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8- oxoguanosina):

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y profarmacos de la misma; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos desvelados en la Patente de Estados Unidos n.° 6.924.271; la Publicacion de Estados Unidos n.° 2005/0070556; y la Patente de Estados Unidos n.° 5.658.731; (f) un compuesto que tiene la formula:

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en la que:

cada Ri y R2 es, independientemente, H, halo, -NRaRb, -OH, alcoxi C1-6, alcoxi Ci-6 sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, arilo C6-10, arilo C6-10 sustituido, alquilo C1.6 o alquilo C1.6 sustituido;

R3 esta ausente, o es H, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, arilo C6-10, arilo C6-10 sustituido, heterociclilo o heterociclilo sustituido;

cada R4 y R5 es, independientemente, H, halo, heterociclilo, heterociclilo sustituido, -C(O)-Rd, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, o se unen juntos para formar un anillo de 5 miembros como en R4-5:

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consiguiendose la union en los enlaces indicados mediante un cada X1 y X2 es, independientemente, N, C, O, o S;

R8 es H, halo, -OH, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, -OH, -NRaRb, -(CH2)n-O-Rc, -O-(alquilo C1.6), - S(O)pRe o -C(O)-Rd;

Rg es H, alquilo C1.6, alquilo C1-6 sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido o Rga, en la que Rga es:

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consiguiendose la union en el enlace indicado mediante un

cada R10 y R11 es, independientemente, H, halo, alcoxi C1-6, alcoxi C1.6 sustituido, -NRaRb u -OH; cada Ra y Rb es, independientemente, H, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, -C(O)Rd, arilo C6-10; cada Rc es, independientemente, H, fosfato, difosfato, trifosfato, alquilo C1-6 o alquilo C1.6 sustituido; cada Rd es, independientemente, H, halo, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, alcoxi C1-6, alcoxi C1.6 sustituido, -NH2, -NH(alquilo C1.6), -NH(alquilo C1.6 sustituido), -N(alquilo C1-6)2, -N(alquilo C1.6 sustituido)2, arilo C6-10 o heterociclilo;

cada Re es, independientemente, H, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, arilo C6-10, arilo C6-10 sustituido, heterociclilo o heterociclilo sustituido;

cada Rf es, independientemente, H, alquilo C1-6, alquilo C1.6 sustituido, -C(O)Rd, fosfato, difosfato o trifosfato;

cada n es, independientemente, 0, 1, 2, o 3; cada p es, independientemente, 0, 1, o 2; o

o (g) una sal farmaceuticamente aceptable de cualquiera de (a) a (f), un tautomero de cualquiera de (a) a (f), o una sal farmaceuticamente aceptable del tautomero.

P. LfPIDOS UNIDOS A UNA ESTRUCTURA BASICA ACfcLICA QUE CONTIENE FOSFATO

Los adyuvantes que contienen lfpidos unidos a una estructura basica adclica que contiene fosfato incluyen el antagonista de TLR4, E5564 (Wong y col. (2003) J. Clin. Pharmacol. 43(7):735-742; US2005/0215517):

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Q. INMUNOPOTENCIADORES DE MOLECULA PEQUENA (SMIPS)

Los SMIP incluyen:

N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; 1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2-butil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-pentil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; 1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;

1- (2-metilpropil)-2-(propiltio)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;

2- [[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-ciquinolin-2-il](metil)amino]etanol; acetato de 2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etilo; 4-amino-1-(2-metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona; N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; N2,N2-dimetiM-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina; 1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il}-2-metilpropan-2-ol; 1-[4-amino-2-(propilamino)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2-metilpropan-2-ol; N4,N4-dibencil-1-(2-metoxi-2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2,4-diamina.

R. PROTEASOMAS

Un adyuvante es una preparacion de proteasoma proteica de membrana externa preparada a partir de una primera bacteria Gram negativa en combinacion con una preparacion de liposacaridos derivada de una segunda bacteria Gram negativa, en la que las preparaciones de liposacaridos y proteasomas de protemas de membrana externa forman un complejo adyuvante no covalente estable.

Dichos complejos incluyen “IVX-908”, un complejo comprendido por membrana externa y lipopolisacaridos de Neisseria meningitidis. Se han usado como adyuvantes para vacunas de la gripe (documento WO 02/072012).

S. OTROS ADYUVANTES

Se desvelan otras sustancias que actuan como agentes inmunoestimulantes en Burdman, J. R. y col. (eds) (1995) (Vaccine Design: Subunit and Adjuvant Approach (Springer) (Capttulo 7) y O' Hagan, D. T. (2000) (Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Humana Press) (Volumen 42 de la serie Methods in Molecular Medicine)).

Las sustancias adyuvantes utiles adicionales incluyen:

• Metil inosin 5'-monofosfato (“MIMP”) (Signorelli y Hadden (2003) Int. Immunopharmacol. 3(8): 1177-1186).

• Un compuesto de pirrolizidina polihidroxilada (documento WO 2004/064715), tal como uno que tiene la formula:

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en la que R se selecciona del grupo que comprende hidrogeno, grupos acilo, alquilo (por ejemplo cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo sencillos o ramificados, no sustituidos o sustituidos, saturados o insaturados, o una sal o derivado farmaceuticamente aceptable de los mismos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3-ep/'-casuarina, 7-ep/'-casuarina, 3,7-diep/'-casuarina.

• Una gamma inulina (Cooper (1995) Pharm. Biotechnol. 6: 559-580) o derivado de la misma, tal como algamulina.

• Compuestos desvelados en el documento PCT/US2005/022769.

• Compuestos desvelados en el documento WO2004/87153, incluyendo: compuestos de Acilpiperazina, compuestos de Indolediona, compuestos de Tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de Benzociclodiona, compuestos de Aminoazavinilo, compuestos de Aminobencimidazol quinolinona (ABIQ) (Patente de Estados Unidos n.° 6.605.617; documento WO 02/18383), compuestos de Hidrafalamida, compuestos de Benzofenona, compuestos de Isoxazol, compuestos de Esterol, compuestos de Quinazilinona, compuestos de Pirrol (documento WO 2004/018455), compuestos de Antraquinona, compuestos de Quinoxalina, compuestos de Triazina, compuestos de Pirazalopirimidina y compuestos de Benzazol (documento WO03/082272).

• Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (Patente de Estados Unidos n.° 5.011.828).

• Una formulacion de un lfpido cationico y un colfpido (habitualmente neutro), tal como aminopropil-dimetil- miristoleiloxi-propanaminio bromuro-difitanoilfosfatidil-etanolamina (“Vaxfectin™”) o aminopropil-dimetil-bis- dodeciloxi-propanaminio bromuro-dioleoilfosfatidil-etanolamina (“GAP-DLRIE:DOPE”). Se prefieren formulaciones que contienen sales de (+)-N-(3-aminopropil)-W,A/-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminio (Patente de Estados Unidos n.° 6.586.409).

La invencion tambien puede comprender combinaciones de aspectos de uno o mas de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvante pueden usarse en la invencion: (1) una saponina y una emulsion de aceite en agua (documento WO 99/11241); (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no toxico (por ejemplo 3dMPL) (vease documento WO 94/00153); (3) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no toxico (por ejemplo 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) (documento WO 98/57659); (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (vease documentos EP 0 835 318; EP 0 735 898; y EP 0 761 231); (6) SAF, que contiene Escualeno 10 %, Tween 80 0,4 %, polfmero en bloque de pluronic 5 % L121 y thr-MDP, bien microfluidificado en una emulsion submicrometrica o agitado vorticialmente para generar una emulsion de tamano de partfcula mayor; (7) sistema de adyuvante de Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene Escualeno 2 %, Tween 80 0,2 % y uno o mas componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforillfpido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (8) una o mas sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no toxico de LPS (tal como 3dPML); (9) una o mas sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un oligonucleotido inmunoestimulante (tal como una secuencia de nucleotidos que incluye un motivo CpG).

Las sales de aluminio y MF59 son adyuvantes preferidos para su uso con vacunas de la gripe inyectables. Las toxinas bacterianas y bioadhesivos son adyuvantes preferidos para su uso con vacunas suministradas por via mucosa, tales como vacunas nasales.

6. ADMINISTRACION

Una vez formuladas (y resuspendidas, si es necesario), las composiciones de nanopartfculas de la invencion pueden administrarse por via parenteral, por ejemplo, mediante inyeccion (que puede ser sin aguja). A este respecto, las composiciones de nanopartfculas pueden proporcionarse liofilizadas en un vial u otro recipiente que se proporciona con un septo u otro medio adecuado para proporcionar un medio de resuspension (por ejemplo, Agua para Inyeccion) y para extraer la suspension resultante. Tambien puede proporcionarse para inyeccion una jeringa adecuada.

Las composiciones pueden inyectarse por via subcutanea, por via intradermica, por via intramuscular, por via intravenosa, por via intraarterial o por via intraperitoneal, por ejemplo. Otros modos de administracion incluyen administracion nasal, mucosa, intraocular, rectal, vaginal, oral y pulmonar, y aplicaciones transdermicas o transcutaneas.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invencion pueden usarse para suministro dirigido espedfico de sitio. Por ejemplo, la administracion intravenosa de las composiciones puede usarse para dirigir al pulmon, el tngado, el bazo, la circulacion sangumea o la medula osea.

Las composiciones de nanopartfculas de la presente invencion generalmente incluiran uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Por ejemplo, pueden usarse vehfculos tales como agua, solucion salina, glicerol, polietilenglicol, acido hialuronico, etanol. Pueden estar presentes otros excipientes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes biologicas. Un tampon biologico puede ser practicamente cualquier solucion que sea farmacologicamente aceptable y que proporciona a la formulacion el pH deseado, es decir, un pH en el intervalo fisiologico. Los ejemplos incluyen solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, solucion salina tamponada con Tris, solucion salina tamponada con Hank. Dependiendo de la forma de dosificacion final, tambien pueden introducirse otros excipientes conocidos en la tecnica, incluyendo aglutinantes, disgregantes, cargas (diluyentes), lubricantes, emolientes (potenciadores de flujo), ayudas de compresion, colorantes, edulcorantes,

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conservantes, agentes de suspension/dispersion, formadores de peKcula/revestimientos, saponferos y tintas de impresion.

El tratamiento puede realizarse de acuerdo con un programa de una unica dosis o un programa de multiples dosis. Un programa de multiple dosis es uno en el que puede proporcionarse un ciclo de administracion primario, por ejemplo, con 1-10 dosis separadas, seguido de otras dosis proporcionadas en intervalos temporales posteriores, elegidos para mantener y/o reforzar la respuesta terapeutica, por ejemplo a 1-4 meses para una segunda dosis, y si es necesario, una dosis o dosis posteriores despues de varios meses. El regimen de dosificacion tambien se determinara, al menos en parte, por la necesidad del sujeto y dependera del criterio del practicante.

Ademas, si se desea prevencion de enfermedad, las composiciones se administran en general antes de la llegada de la primera aparicion de la infeccion o el trastorno de interes. Si se desean otras formas de tratamiento, por ejemplo, la reduccion o eliminacion de smtomas o reapariciones, las composiciones se administran en general despues de la llegada de la aparicion primaria de la infeccion o el trastorno de interes.

7. KITS

La presente invencion abarca kits que pueden simplificar la administracion de cantidades apropiadas de principios activos a un sujeto. Un kit tfpico de la invencion comprende una forma de dosificacion unitaria de una composicion de nanopartfculas liofilizada de la invencion, preferentemente en un recipiente sellado. Los kits de la invencion pueden comprender ademas vehfculos farmaceuticamente aceptables que pueden usarse para administrar uno o mas principios activos. Por lo tanto, en una realizacion particular, el kit comprende ademas un recipiente sellado de un vetuculo adecuado en el que la composicion de nanopartfculas puede disolverse para formar una solucion esteril sin partfculas que es adecuada para la administracion, y un dispositivo que puede usarse para administrar el principio activo. Los ejemplos de dichos dispositivos incluyen jeringas, bolsas de goteo, parches e inhaladores.

C. EXPERIMENTAL

A continuacion hay ejemplos de realizaciones espedficas para llevar a cabo la presente invencion. Los ejemplos se ofrecen solamente para fines ilustrativos. Todas las nanopartfculas en las que el tensioactivo no es pVa quedan fuera del alcance reivindicado.

Se han realizado intentos de asegurar la precision con respecto a los numeros usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero debena tenerse en cuenta, por supuesto, algun error y desviacion experimental.

La sacarosa, manitol, glucosa, trehalosa, dextrano (PM = 70.000), Albumina de Suero Bovino (BSA) y ovoalbumina, clara de huevo de pollo (ovoalbumina u OVA), polivinilpirrolidona (PM= 40.000), carboximetilcelulosa (PM=90.000), Pluronic F68 (tambien conocido como poloxamero 188) y todos los otros productos qdmicos fueron de Sigma Chemicals (St. Louis, MO). El alcohol polivimlico (PM= 15.000) fue de ICN Biomedicals (ahora MP Biomedicals, Irvine, CA). La acetona fue de EMD Chemicals (Gibbstown, NJ).

Los antfgenos de la gripe (FluCC) y el antfgeno de serotipo B de Neisseria meningitidis (Men B 287) fueron de Chiron Vaccines. El candidato a vacuna del serotipo B de Neisseria meningitidis recombinante derivada de Escherichia coli, Men B 287 (Chiron Vaccines, IRIS, Chiron, S.r.l., Siena, Italia) se aislo y purifico como se ha descrito previamente (M. Comanducci, y col. (2002) J. Exp. Med. 195: 1445-1454). GBS1 fue de Chiron Vaccines y se identifico y purifico como se ha descrito previamente (D. Maione y col. (2005) Science 309: 148-150).

Ejemplo 1. Preparacion de nanoparticulas y microparticulas

Con el procedimiento de nanoprecipitacion (vease Fessi, H., F. Puisieux, y J. P. Devissaguet, “Process for the preparation of dispersible colloidal systems of a substance in the form of nanocapsules,” Patente Europea n.° 0274961B1, correspondiente a Devissaguet y col. Patente de Estados Unidos n.° 5.049.322), se crearon partfculas que variaban en tamano de 100 nm a 500 nm. Espedficamente, se crearon partfculas de ~100 a ~120 nm disolviendo RG503, un polfmero de PLG que tiene una relacion molar de lactida/glicolido 50:50 y un peso molecular de ~30 kDalton, disponible de Boehringer Ingelheim, en acetona (0,5 % p/vol) y anadiendo esta solucion en gotas a un volumen igual de agua con agitacion magnetica a 600 rpm y permitiendo que la acetona se evapore. En un caso se empleo RG 752, un PLG que tiene una relacion molar de lactida/glicolido 75:25 y un peso molecular de ~20 kDalton, disponible de Boehringer Ingelheim.

Se crearon nanoparticulas de tamanos diferentes ajustando la concentracion de PLG inicial en la fase organica o cambiando el disolvente de acetona a THF. Aumentando la concentracion de PLG se aumento el tamano de partfculas, mientras que el cambio de acetona a THF tambien aumento el tamano de partfculas. Ha habido varios informes en la bibliograffa que analizaron los parametros que permiten la preparacion de nanoparticulas de diversos tamanos (P. D. Scholes y col. (1993) J. Control Release 25: 145-153; L. Peltonen y col. (2002) AAPS PharmSciTech 3: E32; P. Wehrle y col. (1995) Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 41: 19-26). Por ejemplo, se prepararon partfculas pequenas (~120 nm) con 25 ml de PLG 0,5 % (p/v) en acetona anadida a 25 ml de agua. Se prepararon partfculas de tamano intermedio (~180 nm) con 25 ml de PLG 0,5 % (p/v) en tetrahidrofurano (THF) anadido a 25 ml de agua. Se prepararon partfculas grandes (~230 nm) con 12,5 ml de PLG 4 % (p/v) en acetona anadida a 40 ml de

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agua.

Se prepararon micropartfculas con dioctilo sulfosuccinato sodico (DSS) 0,05%, de tamano ~1 |im, mediante una emulsion doble previamente establecida, procedimiento de evaporacion de disolvente (vease Singh, M., y col. (2004) J. Pharm. Sci., 93(2): 273-282), que difiere significativamente del procedimiento de preparacion de nanoparticulas. Espedficamente, se uso una tecnica de emulsion de agua/aceite/agua para formar las microparticulas. El PLG se disolvio en diclorometano (DCM) (6 % p/volumen) y se anadio a una fase acuosa de solucion salina tamponada con fosfato (agua:aceite 1:4) (v:v) y se homogeneizo durante 2 minutos. Esta emulsion de agua en aceite se anadio despues a agua que contema DSS (emulsion de agua en aceite:agua 1:4) (v:v) y se homogeneizo en un bano de hielo a alta velocidad durante 10 minutos. La suspension resultante se agito de forma magnetica para permitir que el DCM se evaporara. Las microparticulas teman un tamano promedio (D(volumen, 50 %)) de 0,83 |im y un (D(volumen, 90 %)) de 1,24 |im.

Una ventaja para las nanoparticulas en comparacion con las microparticulas fue la facilidad de preparacion. El procedimiento de nanoparticulas se baso en una unica fase y no necesito homogeneizacion de alto corte, solamente agitacion magnetica. El tipo de disolvente organico usado con los dos procedimientos fue diferente. El procedimiento de nanoparticulas uso acetona, en comparacion con el mas toxico DCM usado en el procedimiento de microparticulas. La Administracion de Farmacos y Alimentos (FDA) clasifica DCM como un disolvente de Clase 2 y limita su uso en productos farmaceuticos. La acetona es disolvente de Clase 3 y la FDA tiene lfmites mayores sobre la cantidad de disolvente residual permisible.

Ejemplo 2. Esterilizacion por filtracion de nanoparticulas

Como se ha indicado previamente, una ventaja de las nanoparticulas mas pequenas es que pueden esterilizarse por filtracion despues de la preparacion de particulas. En este Ejemplo, se prepararon nanoparticulas en el intervalo de 110 a 230 nm y se esterilizaron por filtracion con un filtro de 0,2 |im Pall Acrodisc. El tamano de las nanoparticulas se midio con un Zetasizer 3000HSA (Malvern Instruments, Reino Unido) para particulas de menos de 500 nm. Se midieron las particulas mayores y agregados con un Horiba LA-930 (Irvine, CA, Estados Unidos). Este instrumento se basa en dispersion de la luz estatica para determinar el tamano de particulas, mientras que Zetasizer uso dispersion de la luz dinamica para detectar las particulas mas pequenas.

El potencial zeta se midio con el Zetasizer con una concentracion diluida tipica de 0,2 mg/ml de PLG es un diluyente espedfico. Para las nanoparticulas de 120 nm, el potencial zeta en Citrato Sodico 10 mM fue -39 m V y en Fosfato Sodico 10 mM, pH=7,0, fue de -48 mV. El potencial zeta estuvo en el intervalo esperado para el PLG anionico.

Se midio la concentracion de PLG antes y despues de la esterilizacion por filtracion colocando 1 ml de cada muestra, que se liofilizo, en un vial prepesado, y se determino el contenido de PLG por la masa restante. En general, solamente las nanoparticulas mas pequenas (~120 nm) teman concentraciones de PLG comparables a los valores previos a la esterilizacion por filtracion, sin observarse sustancialmente ningun cambio en el tamano de las particulas. Vease Tabla 1. Los niveles de endotoxina (LAL) de las nanoparticulas esterilizadas por filtracion estaban en el intervalo de 0,48-0,96 UE/ml. Como puede verse, solamente las microparticulas pequenas (~120 nm) teman concentraciones de PLG comparables a los valores previos a la esterilizacion por filtracion, sin ningun cambio en el tamano de particulas. El tamano de las particulas de 181 nm esterilizadas por filtracion no se determino.

TABLA 1

Antes de la Esterilizacion por Filtracion Despues de la Esterilizacion por Filtracion

PLG

Tamano (nm) Contenido de PLG (mg/ml) Tamano (nm) Contenido de PLG (mg/ml)

RG503

124,3 5,3 119,9 4,9

RG503

118,0 6,0 116,1 5,3

RG503

181,4 5,3 - 0,5

RG752

158,6 4,9 148,3 2,6

RG503

122,4 5,9 119,7 5,4

Ejemplo 3. Resuspension de nanoparticulas despues de liofilizacion

Una desventaja de las nanoparticulas en relacion con microparticulas es que, despues de la liofilizacion, no se resuspenden necesariamente hasta el tamano que teman antes de la liofilizacion. En el presente ejemplo, se pipetearon tensioactivos y/o agentes crioprotectores en las suspensiones de nanoparticulas inmediatamente antes de la liofilizacion. Las suspensiones se colocaron en viales de vidrio y se congelaron a -80 °C durante 30 minutos. La liofilizacion se llevo a cabo en un sistema de liofilizacion Labconco, Freezone 4.5 (Kansas City, MO, Estados Unidos)

actuando a -49 °C y en vado menor de 133x10-4 kPascales. Despues de la liofilizacion, se resuspendieron 5-10 mg de nanopartfculas en 1 ml de agua y se midieron. Antes de la medicion del tamano de las nanopartfculas, la muestra se diluyo 50 |il en 2 ml.

Como se ve a partir de la Tabla 2 posterior, pueden anadirse excipientes que permiten que se resuspendan las 5 nanopartfculas liofilizadas, sin un aumento inaceptable del tamano (por ejemplo, sin agregacion significativa). Por

ejemplo, puede usarse un tensioactivo para resuspender las nanopartfculas (por ejemplo, PVA, 131 % p/p (p de PVA/p de PLG)). Ademas, la cantidad de tensioactivo puede reducirse usando combinaciones de tensioactivos y agentes crioprotectores. Los ejemplos de dichas formulaciones incluyen PVA 10% (p/p) PVA con sacarosa 3% (p/vol) y manitol 4 % (p/vol), PVA 10 % (p/p) con trehalosa 5 % (p/vol) y manitol 2,5 % (p/vol) y DSS 0,5 % (p/p) con 10 trehalosa 5 % (p/vol) y manitol 2,5 % (p/vol).

TABLA 2

Excipiente

Tamano Inicial (nm) Tamano despues de la liofilizacion (nm) Comportamiento

Ninguno

125 113461 agregado

sacarosa 10 %(p/v)

127 25666 agregado

sacarosa 4 % (p/v) + manitol 3 % (p/v)

125 64659 agregado

DSS 0,5 % (p/p)

~ 120 102000 agregado

DSS 5 % (p/p)

~ 120 127,000 agregado

DSS 0,5 % (p/p)/sacarosa 4 % + manitol 3 % (p/v)

112 25237 agregado

DSS 0,05 % (p/p)/trehalosa 5 % + manitol 2,5 % (p/v)

~ 120 37000 agregado

DSS 0,1 % (p/p)/trehalosa 5 % + manitol 2,5 % (p/v)

~ 120 18000 agregado

DSS 0,25 % (p/p)/trehalosa 5 % + manitol 2,5 % (p/v)

~ 120 22000 agregado

manitol 10 % (p/v)

127 26100 agregado

dextrano 10 % (p/v)

127 21359 agregado

glucosa 5 % (p/v)

~ 120 28000 agregado

trehalosa 5 % + manitol 2,5 % (p/v)

~ 120 55000 agregado

Pluronic F-68 100 % (p/p)

~ 120 64000 agregado

Pluronic F-68 131 % (p/p)

~ 120 74000 agregado

Pluronic F-68 10 % (p/p)/sacarosa 4 % + manitol 3 % (p/v)

~ 120 61000 agregado

CMC 66 % (p/p)

127 26572 agregado

CMC 131 % (p/p)

~ 120 14000 agregado

CMC 10 % (p/p)/sacarosa 4 % + manitol 3 % (p/v)

~ 120 25000 agregado

PVP 66 % (p/p)

127 25758 agregado

PVP 100 % (p/p)

~ 120 133 resuspendido

PVP 131 % (p/p)

~ 120 137 resuspendido

PVP 10 % (p/p)/sacarosa 4 % + manitol 3 % (p/v)

~ 120 30000 agregado

PVA 10 %(p/p)

127 18507 agregado

PVA 66 % (p/p)

127 441 agregado

PVA 100 % (p/p)

~ 120 148 resuspendido

PVA 131 % (p/p) (PVA 5 mg/ml)

127 155 resuspendido

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(continuacion)

Excipiente

Tamano Inicial (nm) Tamano despues de la liofilizacion (nm) Comportamiento

PVA 10 % (p/p) / sacarosa 4 % + manitol 3 % (p/v)

121 146 resuspendido

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 % + manitol 2,5 % (p/v)

112 143 resuspendido

PVA 10 % (p/p) / trehalosa 5 % + manitol 2,5 % (p/v)

122 140 resuspendido

Mas particularmente, los azucares por s^ solos dieron como resultado agregacion de nanopartfculas. El tensioactivo por s^ solo (es decir, PVA) permitio la resuspension de nanopartfculas. Se consiguieron resultados de resuspension mejorados con formulaciones que conteman azucares y tensioactivo. Los azucares cumplen adicionalmente dos funciones importantes para una formulacion de vacuna liofilizada. Con antigenos proteicos, se ha mostrado que la sacarosa y la trehalosa ayudan a estabilizar las protemas durante el proceso de liofilizacion (J. F. Carpenter y col. (1997) Pharm. Res. 14: 969-975). El manitol es un agente de masificacion que se usa como armazon para evitar el colapso de la torta durante el proceso de liofilizacion (X. Tang y M. J. Pikal (2004) Pharm. Res. 21: 191-200). Con la adicion de azucares apropiados, por ejemplo, sacarosa y manitol o trehalosa y manitol, la cantidad de PVA necesaria se redujo al 10% (p/p). Con una formulacion tfpica que contiene de 10 a 20 mg/ml de PLG esto es equivalente a 1-2 mg/ml de PVA. Con CMC 10 % (p/p), PVP o Pluronic F68 y sacarosa y manitol, se agregaron las partfculas. La combinacion y concentracion de azucares satisfacen el requisito de isotonicidad, forman una torta elegante despues de la liofilizacion, y sirven para estabilizar el antfgeno proteico. Las osmolaridad de un producto de vacuna debena estar en el intervalo de 280 a 330 mOsm/l. Las concentraciones de sacarosa y manitol o trehalosa y manitol usadas con el PVA estan en el intervalo de osmolaridad apropiado y conducen a una torta liofilizada que es del mismo tamano que el volumen lfquido inicial. Tambien se descubrio que DSS proporciona resuspension adecuada a una concentracion suficiente en trehalosa y manitol.

Tambien se analizaron nanopartfculas grandes (221 nm) y pequenas (122 nm) tras la resuspension usando diversas concentraciones de PVA (PLG p/p) mas sacarosa 4 % (p/v) y manitol 3 % manitol (p/v). El contenido de PLG fue de 5 mg/ml. La cantidad de alcohol polivimlico (PVA) asociado con el sedimento frente a libre en solucion se midio separando en primer lugar la fase solida de la suspension por centrifugacion (Eppendorf 5415D, 20 minutos a 13200 rpm) y retirando la fraccion del sobrenadante. Ambas mezclas se hidrolizaron durante una noche en NaOH 2 N, se neutralizo el pH y se analizo una alfcuota de la solucion transparente siguiendo un procedimiento previamente descrito (J. H. Finley (1961) Anal. Chem. 33: 1925-1927); E. Allemann y col. (1998) Adv. Drug Delivery Rev. 34: 171189), en el que se mezclaron 0,2 ml de la solucion de ensayo con 1,00 ml de acido borico 4 % p/p y 0,20 ml de una solucion de yodo (I21,27 % p/p y KI 2,5 % p/p) y la absorbancia se leyo a 644 nm y se comparo con una curva de calibracion con linealidad > 0,995 (R2).

Los resultados se presentan en la Tabla 3. Sin desear quedar ligado a la teona, se cree que el PVA adicional necesario para resuspender las nanopartfculas mas pequenas se debe mas probablemente principalmente a su mayor area de superficie en comparacion con las nanopartfculas mayores, aunque tambien hubo probablemente un efecto debido a la particion del pVa entre la superficie y la solucion.

TABLA 3

Nanopartfculas Pequenas (122 nm) Concentracion de PVA PVA total (|ig de PVA/mg de PLG)

tamano final sedimento (|ig de PVA/mg de PLG)

PVA 1 % (p/p)

10 47 |im 8

PVA 3 % (p/p)

30 24 |im 13

PVA 5 % (p/p)

50 15 |im 18

PVA 7 % (p/p)

70 393 nm 25

PVA 10 % (p/p)

100 149 nm 35

Nanopartfculas Grandes (221 nm)

Concentracion de PVA PVA total (|ig de PVA/mg de PLG)

tamano final sedimento (|ig de PVA/mg de PLG)

PVA 1 % (p/p)

10 17 |im 6

PVA 3 % (p/p)

30 260 nm 11

PVA 5 % (p/p)

50 243 nm 17

PVA 7 % (p/p)

70 241 nm 20

PVA 10 % (p/p)

100 240 nm 24

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 4. Eficacia de absorcion de proternas para nanopartroulas y micropartroulas

Para la misma masa de partroulas, las nanoparticulas tienen un area de superficie mucho mayor en comparacion con microparticulas. En este caso, las nanoparticulas permiten una carga proteica mas eficaz por masa de partroula en comparacion con las micropartroulas de 1 |im. Esto permite el suministro de la misma cantidad de antigeno proteico con menos PLG (y en consecuencia menos tensioactivo total).

Se anadio un antigeno modelo, albumina de suero bovino (BSA), a la suspension de nanoparticulas o micropartroulas con el tampon apropiado y se agito en un balancrn de laboratorio a 4 °C durante una noche. Las nanoparticulas se separaron por centrifugacion. Los sedimentos se hidrolizaron durante una noche a 25 °C con NaOH 0,2 N. La concentracion de proteinas en el sobrenadante y en el sedimento hidrolizado se determino por un ensayo de BCA™ (dePierce, Rockford, IL, Estados Unidos). Como se muestra en la FIGURA 1, BSA mostro eficacia de carga aumentada en las nanoparticulas, en comparacion con las micropartroulas, a dos valores de pH, despues de 24 horas de adsorcion. La eficacia de carga aumentada permitio hasta 3,5 % de adsorcion (p de BSA / p de PLG) en las nanoparticulas, en comparacion con una carga maxima de 1,5% (p de BSC/p de PLG) para las micropartroulas.

Esta adsorcion potenciada fue particularmente notable a pH = 7, cuando las micropartroulas eran esencialmente resistentes a la adsorcion, mientras que las nanoparticulas permitieron que se produjera adsorcion significativa. Por lo tanto, puede verse que las nanoparticulas permitieron adsorcion significativa en condiciones de adsorcion de otro modo desfavorables. Esto puede ser util para formulaciones de partroulas en las que es necesario que el pH se ajuste a un valor particular, por ejemplo, para potenciar la estabilidad de los antigenos, entre otras razones.

Un antigeno de Neisseria meningitidis serotipo B (es decir, Men B 287) tambien se adsorbio en nanopartroulas y micropartroulas. En particular, el antigeno Men B 287 se anadio a la suspension de nanopartroulas o micropartroulas en tampon citrato 10 mM a pH = 5,0 y se agito en un balancrn de laboratorio a 4 °C durante una noche. Las micropartroulas se separaron por centrifugacion. Los sedimentos se hidrolizaron durante una noche a 25 °C con NaOH 0,2 N. Las concentraciones de proteinas en el sobrenadante y en el sedimento hidrolizado se determinaron por un ensayo de BCA™ (Pierce). Como se ve a partir de la FIGURA 2, como con la BSA, las nanopartroulas presentaron adsorcion potenciada de Men B 287 en comparacion con las micropartroulas.

La resuspension despues de la adsorcion y liofilizacion de antfgenos tambien fue una caractenstica importante de ciertas composiciones de la invencion. En este ejemplo, se anadieron proteinas, espedficamente, BSA, Ovoalbumina, FluCC, Men B 287, Men B 287 o GBS1 a la suspension de nanopartroulas en tampon de Histidina a pH 5 y se agitaron en un balancrn de laboratorio a 4 °C durante una noche. El tamano de partroulas inicial fue de ~120 nm. Se anadieron agentes tensioactivos y crioconservantes de acuerdo con la Tabla 3, y la mezcla se liofilizo. Despues de liofilizacion se resuspendieron 5-10 mg de nanopartroulas en 1 ml de agua y se midieron. Las nanopartroulas se separaron por centrifugacion. La cantidad restante en el sobrenadante (no adsorbido) se determino por cromatograffa de exclusion por tamano de HPLC, absorbancia a 214 nm. Como puede verse a partir de la Tabla 4, las nanopartroulas con proteinas adsorbidas sustancialmente conservaron su tamano pequeno y tienen alta eficacia de adsorcion de proteinas para cargas diana de 1 % (p/p) y 5 % (p/p).

TABLA 4

Proterna Adsorbida

Excipiente Tamano final % Adsorbido

OVA 1 % (p/p)

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 %+manitol 2,5 % (p/v) 173 nm 98

BSA 1 % (p/p)

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 %+manitol 2,5 % (p/v) 143 nm 100

BSA 5 % (p/p)

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 %+manitol 2,5 % (p/v) 134 nm 71

BSA 1 % (p/p)

PVA 10 % (p/p) / sacarosa 4 % + manitol 3 % (p/v) 216 nm 94

FluCC 1 % (p/p)

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 %+manitol 2,5 % (p/v) 242 nm 100

Men B 287 1 % (p/p)

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 %+manitol 2,5 % (p/v) 4850 |im 85

Men B 287 5 % (p/p)

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 %+manitol 2,5 % (p/v) 167 nm 95

Men B 287 1 % (p/p)

PVA 10 % (p/p) / sacarosa 4 % + manitol 3 % (p/v) 192 nm 77

Men B 287 5 % (p/p)

PVA 10 % (p/p)/ sacarosa 4 % + manitol 3 % (p/v) 169 nm 80

GBS1 1 % (p/p)

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 %+manitol 2,5 % (p/v) 23 |im 99

GBS1 5 % (p/p)

DSS 0,5 % (p/p) / trehalosa 5 %+manitol 2,5 % (p/v) 201 nm 93

5

10

15

20

25

30

35

40

45

La cantidad de protema asociada con las nanopartroulas despues de la liofilizacion (% de protema adsorbida) fue alta, variando de 71 % a 100%, al examinar el efecto de la concentracion de protemas, y se descubrio que eran mas faciles de resuspender niveles de carga de protemas mayores (p de protema/p de PLG). La mezcla de excipientes de PVA resuspendio nanopartroulas con anrtgeno Men B 287 al menor nivel de carga mientras que la mezcla de excipientes de DSS no. De forma similar, para el anrtgeno GBS1, la mezcla de excipientes de dSs, la formulacion cargada con protema al 5 % mayor se resuspendio, mientras que la carga 1 % menor no. BSA se resuspendio a cargas tanto menores como mayores. La resuspension con adsorcion de protemas parece depender por lo tanto de la protema, y puede evaluarse para cada anrtgeno proteico. La disponibilidad de multiples combinaciones de excipientes diferentes ofrece flexibilidad en el caso de que una combinacion no sea suficiente para una protema particular.

Ejemplo 5. Estudios in vivo

Se preparo una suspension de micropartroulas como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Para los grupos 36 y 9-12 en las Tablas 5 y 6 posteriores, se anadio Men B 287 a la suspension de micropartroulas o nanopartroulas a una carga diana de 1 % o 5 % (p de 287/p de PLG) en tampon de histidina 10 mM a pH 5,5 y se agito en un balancm de laboratorio a 4 °C durante una noche. Se anadieron agentes tensioactivos y crioprotectores y se liofilizo la mezcla.

Para los Grupo 3 y 9, Men B 287 se adsorbio a una carga de 1 % (p de 287/p de PLG) solamente con el DSS 0,05 % (p/p de PLG) de la preparacion de partroulas inicial como tensioactivo y sacarosa 4 % (p/volumen) y manitol 3 % (p/volumen) como un crioprotector. Para los Grupos 4 y 10, Men B 287 se adsorbio a una carga de 1 % (p de 287/p de PLG) con la adicion de PVA 10% (p de PVA/p de PLG) mas sacarosa 4% (p/volumen) y manitol 3% (p/volumen). Para los Grupos 5 y 11, se adsorbio Men B 287 a carga del 5 % (p de 287/p de PLG) con la adicion de DSS 0,5 % (p de DSS/p de PLG) mas trehalosa 5 % (p/volumen) y manitol 2,5 % (p/volumen). Para los Grupos 6 y 12, se adsorbio Men B 287 a una carga del 5 % (p de 287/p de PLG) con la adicion de PVA 10 % (p de PVA/p de PLG) mas sacarosa 4 % (p/volumen) y manitol 3 % (p/volumen). Despues de la liofilizacion, se reconstituyeron micropartroulas correspondientes a una dosis total de 1 |ig y 10 |ig de Men B 287, respectivamente, con 1,2 ml de Agua para Inyeccion. Las muestras reconstituidas se midieron con un Zetasizer 3000HSA para las nanopartroulas y un Horiba LA 930 para las micropartroulas. Los resultados se presentan en la Tabla 5.

Para los Grupos 2 y 8, se mezclo una emulsion de MF59 (Chiron Vaccines) con 2X PBS y 1 |ig o 10 |ig de Men B 287 inmediatamente antes de la inmunizacion.

Para los Grupos 1 y 7 se anadio Men B 287 a hidroxido de aluminio (Chiron Vaccines) en tampon de histidina 10 mM a pH 5,5 mas NaCl 9 mg/ml y se agito en un balancm de laboratorio a 4 °C durante una noche con una concentracion de alumbre de 2 mg/ml.

Para todos los grupos, las muestras se inyectaron a 1 M en grupos de 10 ratones CD-I hembra los dfas 0, 21 y 35. Para los grupos 3-6 y 9-12, se reconstituyeron micropartroulas o nanopartroulas liofilizadas con Agua para Inyeccion. Los grupos 1, 2, 7 y R se usaron como se ha descrito. El dfa 49, se analizan los tttulos de ELISA del suero (IgG, IgG1, IgG2a) como se describe en Singh, M., y col. (2004) (J. Pharm. Set. 93(2): 273-282), y se analizo la actividad bactericida del suero (SBA) como se describe en Pizza, M., y col. (2000) (Science 287(5459): 1816-1820). 2996 fue la cepa de MenB usada para analisis de SBA. Los resultados se presentan en la Tabla 6 posterior.

El estudio in vivo descubre que las nanopartroulas y micropartroulas son comparables para ambas dosis basandose en los tftulos en suero y SBA. El MF59 a la dosis alta es significativamente diferente para IgG que todos los otros grupos (p < 0,05 con ensayo de t de student de dos colas suponiendo varianza desigual). Los tftulos de IgG de grupos 1 y 4 son significativamente diferentes del grupo 6 (p < 0,05 con ensayo de t de student de dos colas suponiendo varianza desigual), sin embargo este resultado no es cierto para el SBA, que es el criterio de valoracion mas importante del estudio.

TABLA 5

Grupo Formulacion Tamano* (nm) pH

1

Alumbre/287, 1 |ig - 5,8

2

MF59/287, 1 |ig - -

3

PLG/MP/287, 1 |ig 805 5,0

4

PLG/NP/287/carga 1 %/PVA, 1 MS 158 5,0

5

PLG/NP/287/carga 5 %/DSS, 1 MS 149 5,0

6

PLG/NP/287/carga 5 %/PVA, 1 rtg 149 5,0

7

Alumbre/287, 10 |ig - 5,5

8

MF59/287, 10 |ig - -

9

PLG/MP/287, 10 |ig 790 5,8

(continuacion)

Grupo Formulacion

Tamano* (nm) pH

10

PLG/NP/287/carga 1 %/PVA, 10 |ig 123 5,3

11

PLG/NP/287/carga 5 %/DSS, 10 |ig 140 5,5

12

PLG/NP/287/carga 5 %/PVA, 10 ^g 160 5,3

* el tamano es despues de la liofilizacion

TABLA 6

1

Alumbre/287, 1 |ig 130 2.035 51 64

2

MF59/287, 1 |ig 1.889 2.829 304 128

3

PLG/MP/287, 1 |ig 1.023 1.861 36 64

4

PLG/NP/287/carga 1 %/PVA, 1 ^g 326 1.008 168 32

5

PLG/NP/287/carga 5 %/DSS, 1 ^g 758 2.663 94 64

6

PLG/NP/287/carga 5 %/PVA, 1 ^g 2.466 7.824 312 64

7

Alumbre/287, 10 |ig 2.252 15.496 142 128

8

MF59/287, 10 |ig 29.743 18.253 6.569 2048

9

PLG/MP/287, 10 |ig 8.340 19.258 628 256

10

PLG/NP/287/carga 1 %/PVA, 10 ^g 7.567 20.575 565 128

11

PLG/NP/287/carga 5 %/DSS, 10 iig 1.986 9.197 160 64

12

PLG/NP/287/carga 5 %/PVA, 10 ^g 4.348 15.746 373 128

5

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion de nanopartfculas liofilizada esterilizada por filtracion que comprende

   (a) un poUmero biodegradable seleccionado de un poli(a-hidroxiacido), un acido polihidroxibutmco, una policaprolactona, un poliortoester, un polianfndrido, un policianoacrilato y combinaciones de los mismos,

   (b) un tensioactivo que es poli(alcohol vimlico),

   (c) un agente crioprotector que comprende una combinacion de un alditol y un sacarido y

   (d) un antfgeno polipeptfdico

   en la que las nanopartfculas dentro de la composicion tienen un tamano de partfcula promedio Z menor de 250 nm, menor de 200 nm o menor de 150 nm.
2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que el antfgeno comprende antfgeno derivado de celula tumoral, o un antigeno derivado de organismo patogeno.
3. 3. La composicion de la reivindicacion 2, en la que el antigeno deriva de un organismo patogeno seleccionado de un virus, una bacteria, un hongo y un parasito.
4. 4. La composicion de la reivindicacion 2, en la que el antigeno deriva de un organismo patogeno seleccionado de virus de la hepatitis, varicela, poliovirus, sarampion, paperas, rubeola, virus de la gripe, Neisseria meningitidis, tosferina, Haemophilus influenzae tipo b, VIH y Streptococcus pneumoniae.
5. 5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el antfgeno esta adsorbido en las superficies de las nanopartfculas, o en la que el antfgeno esta retenido dentro de las nanopartfculas.
6. 6. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composicion comprende un poli(a- hidroxiacido) seleccionado de poli(lactida), poli(glicolido), poli(lactida-co-glicolido) y combinaciones de los mismos.
7. 7. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composicion comprende un poli(lactida-co-glicolido) que tiene una relacion molar de lactida:glicolido que vana de 40:60 a 60:40.
8. 8. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas un adyuvante inmunologico.
9. 9. La composicion de la reivindicacion 8, en la que el adyuvante inmunologico se adsorbe en la superficie de las nanopartfculas suspendidas, o en la que el adyuvante inmunologico esta retenido dentro de las nanopartfculas suspendidas.
10. 10. La composicion de la reivindicacion 9, en la que el adyuvante inmunologico se selecciona de oligonucleotidos CpG, ARN bicatenario, toxinas termolabiles de E. coli, alumbre y compuestos de fosfato de liposacarido.
11. 11. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en

    (i) un procedimiento para estimular una respuesta inmunitaria en un hospedador vertebrado, que comprende: combinar la composicion con un fluido acuoso para formar una suspension; y administrar la suspension al huesped en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria, o

    (ii) un procedimiento para inmunizar a un huesped vertebrado contra un tumor o un organismo patogeno, que comprende: combinar la composicion con un fluido acuoso para formar una suspension; y administrar la suspension al huesped en una cantidad eficaz para inducir una respuesta protectora, o

    (iii) un procedimiento para tratar un tumor o una infeccion de organismo patogeno en un huesped vertebrado, que comprende: combinar la composicion con un fluido acuoso para formar una suspension; y administrar la suspension al huesped en una cantidad eficaz para inducir una respuesta de tratamiento.
12. 12. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que dicha suspension se inyecta en dicho huesped vertebrado.
13. 13. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que dicho huesped vertebrado es un ser humano.
14. 14. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria celular, una respuesta inmunitaria de Th1 o una respuesta inmunitaria de CTL.
15. 15. Un procedimiento de produccion de la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende: (a) combinar (i) un primer lfquido que comprende dicho polfmero biodegradable disuelto en un disolvente organico con (ii) un segundo lfquido que comprende agua, tras lo cual se forma una suspension de nanopartfculas que comprende dicho polfmero biodegradable, (b) adsorber dicho antfgeno en dichas nanopartfculas para formar una suspension de nanopartfculas con antfgeno adsorbido y (c) liofilizar dicha suspension de nanopartfculas con antfgeno adsorbido.
16. 16. El procedimiento de la reivindicacion 15, en el que dicho agente crioprotector se anade inmediatamente antes de la liofilizacion.
17. 17. El procedimiento de la reivindicacion 15 o reivindicacion 16, que comprende ademas esterilizar por filtracion dicha suspension de nanopartfculas y dicho antfgeno antes de adsorber dicho antfgeno en dichas nanopartfculas.

    5 18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, que comprende ademas esterilizar por

    filtracion dicha suspension de nanopartfculas con antfgenos adsorbidos antes de la liofilizacion.
18. 19. Un kit que comprende un primer recipiente que comprende la composicion de nanopartfculas liofilizada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y que comprende ademas opcionalmente un segundo recipiente que comprende un medio lfquido esteril util para resuspender la composicion de nanopartfculas liofilizada en el primer

    10 recipiente.
19. 20. El kit de la reivindicacion 19, que comprende ademas una jeringa.