ES2564093T3

ES2564093T3 - Métodos para prevenir y/o tratar trastornos del almacenamiento lisosomal

Info

Publication number: ES2564093T3
Application number: ES10762469.4T
Authority: ES
Inventors: Robert Boyd; Gary Lee
Original assignee: Amicus Therapeutics Inc
Current assignee: Amicus Therapeutics Inc
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2016-03-17
Anticipated expiration: 2030-04-09
Also published as: JP2012523431A; WO2010118283A1; CA2758271C; NZ595629A; IL215583A; AU2010233188A1; EP2416656B1; CA2758271A1; IL215583A0; JP5645918B2; US8940766B2; EP2416656A4; AU2010233188B2; BRPI1010517A2; CN102625661B; CN102625661A; US20100260740A1; EP2416656A1

Abstract

Un compuesto seleccionado de 5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol, 5-(clorometil)piperidina-3,4-diol, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos, o cualquier combinación de dos o más de los mismos, para uso en prevenir y/o tratar trastornos del almacenamiento lisosomal en un paciente en riesgo de desarrollar o diagnosticado con el mismo.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para prevenir y/o tratar trastornos del almacenamiento lisosomal CAMPO DE LA INVENClON

La presente invencion proporciona 5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol, 5-(clorometil)piperidina-3,4-diol, o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos, o cualquier combinacion de dos o mas de los mismos, para uso en prevenir y/o tratar trastornos del almacenamiento lisosomal. En particular, la presente invencion proporciona metodos para prevenir y/o tratar la enfermedad de Gaucher.

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

Trastornos del almacenamiento lisosomal son provocados por un defecto en la funcion lisosomal que resulta en la acumulacion de sustancias dentro del lisosoma de las celulas. Este defecto es habitualmente una consecuencia de la deficiencia de una unica enzima requerida para el metabolismo de lfpidos, glucogeno, glicoprotemas o mucopolisacaridos. La enfermedad de Gaucher, el trastorno de almacenamiento lisosomal mas comun, se caracteriza por la acumulacion del glicolipido glucocerebrosidasa (tambien conocido como glucosilceramida). Los smtomas de la enfermedad de Gaucher incluyen bazo e tngado agrandados, disfuncion hepatica, trastornos del esqueleto y lesiones de los huesos que pueden ser dolorosas, complicaciones neurologicas graves, inflamacion de los ganglios linfaticos y (ocasionalmente) las articulaciones adyacentes, abdomen distendido, un tono parduzco de la piel, anemia, bajo nivel de plaquetas sangumeas y depositos de grasa de color amarillo en la esclerotica. Ademas, las personas afectadas con la enfermedad de Gaucher tambien pueden ser mas susceptibles a la infeccion.

Existe la necesidad de metodos para prevenir y/o tratar trastornos del almacenamiento lisosomal que proporcionen a los pacientes una mayor calidad de vida y logren un mejor resultado clmico. En particular, existe la necesidad de metodos para prevenir y/o tratar la enfermedad de Gaucher que proporcionen a los pacientes una mayor calidad de vida y logren un mejor resultado clmico.

El documento WO 2008/134628 se refiere a regfmenes de dosificacion para administrar chaperonas farmacologicas espedficas para el tratamiento de trastornos del almacenamiento lisosomal. En particular, el documento ensena regfmenes de dosificacion para la administracion de isofagomina o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma a un paciente que padece la enfermedad de Gaucher.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona 5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol, 5-(clorometil)piperidina-3,4-diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos, o cualquier combinacion de dos o mas de los mismos, para uso en prevenir y/o tratar trastornos del almacenamiento lisosomal en un paciente en riesgo de desarrollar o diagnosticado con los mismos. En una realizacion, la invencion comprende el uso de 5-(fluorometil)piperidina-3,4- diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo. En una realizacion, la invencion comprende el uso de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo. En una realizacion, la invencion comprende el uso de hidrocloruro de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol. En una realizacion, la invencion comprende el uso de 5-(clorometil)piperidina-3,4-diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo. En una realizacion, la invencion comprende el uso de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4- diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo. En una realizacion, la invencion comprende el uso de (3R, 4R, 5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol. En una realizacion, el trastorno de almacenamiento lisosomal se asocia con la acumulacion de al menos un glicolipido. En una realizacion, el trastorno del almacenamiento lisosomal se asocia con la acumulacion de al menos un glicoesfingolipido. En una realizacion, el trastorno del almacenamiento lisosomal se asocia con la acumulacion de glucocerebrosido. En una realizacion, el trastorno del almacenamiento lisosomal se asocia con una deficiencia en glucocerebrosidasa. En una realizacion, el trastorno del almacenamiento lisosomal se asocia con una mutacion en glucocerebrosidasa. En una realizacion, la enfermedad por

almacenamiento lisosomal es la enfermedad de Niemann-Pick. En una realizacion, la enfermedad por

almacenamiento lisosomal es la enfermedad de Gaucher. En una realizacion, la invencion comprende, ademas, el uso de una cantidad eficaz de al menos otro agente terapeutico. En una realizacion, el al menos otro agente terapeutico es imiglucerasa o 1,5-(butilimino)-1,5-didesoxi-D-glucitol.

La presente invencion tambien proporciona el uso de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol, (3R,4R,5S)-5- (clorometil)piperidina-3,4-diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos, o cualquier

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combinacion de dos o mas de los mismos para uso en prevenir y/o tratar la enfermedad de Gaucher en un paciente en riesgo de desarrollar o diagnosticado con la misma. En una realizacion, la invencion comprende el uso de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo. En una realizacion, la invencion comprende el uso de hidrocloruro de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol. En una realizacion, la invencion comprende el uso de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo. En una realizacion, la invencion comprende el uso de (3R,4R,5S)-5- (clorometil)piperidina-3,4-diol. En una realizacion, la invencion comprende, ademas, el uso de al menos otro agente terapeutico. En una realizacion, al menos otro agente terapeutico es imiglucerasa o 1,5-(butilimino)-1,5-didesoxi-D- glucitol.

La presente invencion tambien proporciona kits que comprenden:

• un recipiente que tiene una cantidad eficaz de 5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol, 5- (clorometil)piperidina-3,4-diol, o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, o cualquier combinacion de dos o mas de los mismos;

• instrucciones de uso de los mismos para prevenir y/o tratar un trastorno de almacenamiento lisosomal.

En una realizacion, el trastorno de almacenamiento lisosomal es la enfermedad de Gaucher.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1A ilustra los niveles en plasma de compuesto de referencia, IFG, y compuesto de ensayo, (3R,4R,5S)-5- (fluorometil)piperidina-3,4-diol (al que se alude en esta memoria como Compuesto A), en ratones a los que se

administra p. o. una dosis unica de 30 mg/kg (equivalente de base libre) de tartrato de IFG o la forma de sal

hidrocloruro de Compuesto A.

La Figura 1B ilustra los niveles en cerebro de compuesto de referencia, IFG, y compuesto de ensayo, Compuesto A, en ratones a los que se administra p. o. una dosis unica de 30 mg/kg (equivalente de base libre) de tartrato de IFG o la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A.

La Figura 1C ilustra la relacion de los niveles de cerebro a plasma de compuesto de referencia, IFG, y compuesto de ensayo, Compuesto A, en ratones a los que se administra p. o. una dosis unica de 30 mg/kg (equivalente de base libre) de tartrato de IFG o la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A.

La Figura 2 ilustra los niveles en cerebro de compuesto de referencia, IFG, y compuesto de ensayo, (3R,4R,5S)-5- (clorometil)piperidina-3,4-diol (al que se alude en esta memoria como Compuesto B), en ratones a los que se

administra p. o. una dosis unica de 30 mg/kg (equivalente de base libre) de tartrato de IFG o la base libre de

Compuesto B.

Las Figuras 3A-D ilustran el nivel de GCasa en el cerebro, bazo, tugado y pulmon, respectivamente, de ratones C57BL/6 a los que se administra un regimen de dosificacion de 2 semanas que consiste en nueve dosis de (i) vetuculo control; (ii) 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de referencia, tartrato de IFG; o (iii) 10 o 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de ensayo, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A. Observese que los valores que aparecen por encima de las barras en estas figuras representan las veces de incremento por encima de control. Asimismo, en estas figuras, el sfmbolo "*" representa p < 0,05 test t comparado con el control, y el sfmbolo "#" representa p < 0,05 test t comparado con los ratones tratados con el compuesto de referencia, tartrato de IFG.

Las Figuras 4A-D ilustran el nivel de GCasa en el cerebro, bazo, tugado y pulmon, respectivamente, de ratones C57BL/6 a los que se administra un regimen de dosificacion de 2 semanas que consiste en nueve dosis de (i) vetuculo control; (ii) 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de referencia, tartrato de IFG; o (iii) 1, 3, 10, 30 o 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de ensayo, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A. Observese que los valores que aparecen por encima de las barras en estas figuras representan las veces de incremento por encima de control. Asimismo, en estas figuras, el sfmbolo "*" representa p < 0,05 test t comparado con el control, y el sfmbolo "#" representa p < 0,05 test t comparado con los ratones tratados con el compuesto de referencia, tartrato de IFG.

Las Figuras 5A-D ilustran el nivel de GCasa en el cerebro, bazo, tugado y pulmon, respectivamente, de ratones C57BL/6 a los que se administra un regimen de dosificacion de 2 semanas que consiste en nueve dosis de (i)

vetnculo control; (ii) 10 o 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de referencia, tartrato de IFG; o (iii) 10 o 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de ensayo, Compuesto B. Observese que los valores que aparecen por encima de las barras en estas figuras representan las veces de incremento por encima de control. Asimismo, en estas figuras, el sfmbolo "*" representa p < 0,05 test t comparado con el control, y el sfmbolo "#" 5 representa p < 0,05 test t comparado con los ratones tratados con el compuesto de referencia, tartrato de IFG.

La Figura 6A ilustra el nivel en plasma del compuesto de ensayo, Compuesto A, en ratas a las que se administra una dosis unica intravenosa de 3 mg/kg (equivalente de base libre) de la forma sal hidrocloruro de Compuesto A.

La Figura 6B ilustra el nivel en plasma de Compuesto A en ratas a las que se administra p. o. una dosis unica de 10, 30 o 300 mg/kg (equivalente de base libre) de la forma sal hidrocloruro de Compuesto A.

10 DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Tal como se utiliza en esta memoria, los siguientes terminos y expresiones tendran las definiciones recogidas a continuacion.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "tratar" significa mejorar uno o mas smtomas asociados con el trastorno referenciado.

15 Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "prevenir" significa mitigar un smtoma del trastorno referenciado.

Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "una cantidad eficaz" significa una cantidad eficaz para prevenir y/o tratar a un paciente en riesgo de desarrollar o diagnosticado con el trastorno de referencia y, por lo tanto, productora del efecto terapeutico deseado.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "paciente" significa un mairnfero (p. ej., un ser humano).

20 Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "trastorno del almacenamiento lisosomal" se refiere a cualquiera de un grupo de enfermedades que resultan de un metabolismo anormal que resulta en la acumulacion de un sustrato en el lisosoma. La Tabla 1 contiene una lista no limitativa de trastornos del almacenamiento lisosomal a modo de ejemplo y su enzima defectuosa asociada.

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TABLA 1 Trastornos del almacenamiento lisosomal

Trastorno del almacenamiento lisosomal Emfermedad de Pompe Enfermedad de Gaucher Enfermedad de Fabry Gangliosidosis Gm1 Enfermedad de Tay-Sachs Enfermedad de Sandhoff Enfermedad de Niemann-Pick Enfermedad de Krabbe Enfermedad de Farber Leucodistrofia metacromatica Enfermedad de Hurler-Scheie Enfermedad de Hunter Enfermedad de Sanfilippo A Enfermedad de Sanfilippo B Enfermedad de Sanfilippo C

Enfermedad de Sanfilippo D Enfermedad de Morquio A Enfermedad de Morquio B Enfermedades de Maroteaux-Lamy Enfermedad de Sly alfa.-manosidosis beta.-manosidosis acida Fucosidosis Sialidosis

Enfermedad de Schindler-Kanzaki

Enzima defectuosa a-glucosidasa acida

p-glucosidasa acida o glucocerebrosidasa a-galactosidasa A p-galactosidasa acida p-hexosaminidasa A p-hexosaminidasa B Esfingomielinasa acida Galactocerebrosidasa Ceramidasa acida Arilsulfatasa A a-L-iduronidasa Iduronato-2-sulfatasa Heparan N-sulfatasa a-N-acetilglucosaminidasa Acetil-CoA: a-glucosaminida N-acetiltransferasa

N-acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa p-galactosidasa acida Arilsulfatasa B p-glucuronidasa a-manosidasa acida p-manosidasa a-L-fucosidasa acida Sialidasa

a-N-acetilgalactosaminidasa

El trastorno de almacenamiento lisosomal mas comun, la enfermedad de Gaucher, se caracteriza por la acumulacion del glicolipido glucocerebrosidasa (tambien conocido como glucosilceramida). Se han descrito tres fenotipos para la enfermedad de Gaucher que se designan por la ausencia (tipo 1) o presencia de afectacion neurologica durante la infancia (tipo 2) o la adolescencia (tipo 3). Por ejemplo, vease Grabowski, Gaucher's disease. Adv Hum Genet. 1993; 21: 377-441.

Los tres tipos de la enfermedad de Gaucher se heredan de forma autosomica recesiva. Ambos padres deben ser portadores para que un nino se vea afectado. Si ambos padres son portadores, hay una de cada cuatro, o 25%, de oportunidad con cada embarazo de que un nino se vea afectado. Se recomienda la asesona genetica y pruebas geneticas para las familias que puedan ser portadoras de mutaciones. Cada uno de los tipos se ha relacionado con mutaciones particulares. En total, existen aproximadamente 80 mutaciones conocidas que conducen a la enfermedad de Gaucher (vease, p. ej., McKusick, V.A.: Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1998 (12a edicion)).

La enfermedad de Gaucher de tipo 1 es panetnica, pero es especialmente frecuente entre las personas de ascendencia judfa asquenazf, con una tasa de portadores de 1 en 17 Judfos Asquenazi. Las mutaciones N370S y 84GG son las mutaciones mas frecuentes en el gen de la glucocerebrosidasa entre los Judfos Asquenazi, con tasas de 1 en 17,5 para N370S y de 1 en 400 para 84GG en la poblacion asquenazi general sana, y se asocian con la enfermedad de Gaucher leve y grave, respectivamente. La mutacion 84GG se produce casi exclusivamente entre los Judfos Asquenazi. Otras variantes raras del gen de la glucocerebrosidasa identificadas en pacientes de ascendencia asquenazi con la enfermedad de Gaucher incluyen L444P, IVS2+1G^A, V394L y R496H. En contraposicion con la presentacion de la enfermedad de Gaucher de tipo 1 en Judfos Asquenazi, la enfermedad de Gaucher de tipo 1 tiende a ser grave y progresiva en pacientes japoneses (vease, Ida et al., Type 1 Gaucher Disease Patients: Phenotypic Expression and Natural History in Japanese Patients, Blood Cells, Molecules and Diseases, 1984, 24(5):73-81). Ademas, la enfermedad de Gaucher de tipo 3, asociada con una o dos copias de la variante de gen de la glucocerebrosidasa L444P es frecuente en pacientes suecos de la region de Norrbotten.

Un diagnostico definitivo de la enfermedad de Gaucher se hace con las pruebas geneticas. Dado que existen numerosas mutaciones diferentes, es a veces necesaria la secuenciacion del gen de la glucocerebrosidasa para

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confirmar el diagnostico. El diagnostico prenatal esta disponible, y es util cuando existe un factor de riesgo genetico conocido. Sin embargo, un diagnostico de la enfermedad de Gaucher tambien puede inferirse de anomaKas bioqmmicas tales como elevados niveles de fosfatasa alcalina, de enzima convertidora de angiotensina (ACE) y de inmunoglobulina, o mediante analisis celular que muestra un citoplasma de "papel arrugado" y macrofagos cargados con glucoKpidos. En particular, la enfermedad de Niemann-Pick es similar, debido a que se caracteriza por la acumulacion de gangliosidos Gm2, gangliosidos Gmi, ademas de glucocerebrosidasa (Vanier et al., Brain Pathology. 1998; 8: 163-74).

Smtomas de la enfermedad de Gaucher incluyen los siguientes:

• Hepatomegalia y esplenomegalia indoloras (el tamano del bazo puede ser de 1500-3000 ml, en oposicion al tamano normal de 50-200 ml)

• Hiperesplenismo: la destruction rapida y prematura de las celulas de la sangre, que conduce a anemia, neutropenia y trombocitopenia (con un riesgo incrementado de infection y sangrado)

• Cirrosis del hlgado, aunque poco frecuente

• Smtomas neurologicos se producen solo en algunos tipos de la enfermedad de Gaucher (vease mas abajo):

o Tipo II: convulsiones graves, hipertoma, retraso mental, apnea. o Tipo III: espasmos musculares conocidos como mioclonos, convulsiones, demencia, apraxia del musculo ocular.

• Osteoporosis: 75% desarrollan anomaKas oseas visibles debido a la glucosilceramida acumulada. Se describe habitualmente una deformidad del femur distal en forma de un matraz Erlenmeyer.

• Pigmentation de color marron amarillento de la piel

Sintesis quimicas

a. Isofagomina (IFG; (3R, 4R, 5R)-5-(hidroximetil)-3,4-piperidinadiol))

Isofagomina (IFG; (3R,4R,5R)-5-(hidroximetil)-3,4-piperidinadiol)) se refiere a un compuesto que tiene la siguiente estructura:

imagen1

La smtesis de isofagomina se describe en las patentes de EE.UU. N°s. 5.844.102 expedida a Sierks et al. en la columna 17, lmea 53 a la columna 20, lmea 6, y 5.863.903 expedida a Lundgren et al. en el Ejemplo 1, en la columna 5, lmea 20 a la columna 7, lmea 33. Al tartrato de isofagomina, tambien conocido como AT2101 y Plicera™, se le ha asignado el numero CAS 919364-56-0. La preparation de tartrato de isofagomina se describe en el documento US2007/02819751 en los parrafos [0046] a [0050], y la purification de tartrato de isofagomina se describe en los parrafos [0051] a [0053].

b. Smtesis de hidrocloruro de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol

imagen2

1. NaH; BnCI

1. BnCI; KjCQ-j

2 MeOH H

2. isOH: 2-metoxi

propeno

OBn OH

NaH: BnCI

OBn F

HCI: EtOH

DAST

■Cl

Pd(OH)3; h5

(4aR,8R,8aR)-6-bencM-2,2-dimetMhexahidro-4H-[1,3]dioxmo[5,4,c]piridm-8-ol (2).

A una disolucion de (3R,4R,5R)-5-(hidroximetil)piperidina-3,4-diol (1) (5,9 g, 40,0 mmol) en DMF seca (75 mL) se anadio K2CO3 (6,4 g, 46,0 mmol) seguido de cloruro de bencilo (4,8 mL, 42,0 mmol) y la mezcla resultante se calento 5 a 70 °C durante 14 h, en cuyo punto el material de partida no podfa ser detectado mediante tlc (cromatograffa en capa fina). El disolvente se evaporo en vado y el residuo se volvio a disolver en una cantidad minima de agua. La disolucion se extrajo 10-12 veces con EtOAc y los extractos reunidos se secaron sobre Na2SO4 y se filtro. El filtrado se evaporo en vado para dar el compuesto del tttulo (7,5 g, 79%) en forma de un solido de color tostado que podna ser utilizado sin purificacion adicional. El solido de color tostado se disolvio en DMF (75 mL) y se anadio acido 10 toluenosulfonico (6,7 g, 35,0 mmol) seguido de 2-metoxi propeno (7,2 mL, 75,0 mmol) y la mezcla se agito durante la noche a temperatura ambiente. Despues de agitar durante la noche, se anadieron 7,2 mL adicionales de 2-metoxi propeno y la mezcla se agito de nuevo durante la noche a temperatura ambiente.

En este punto no puede detectarse mediante tlc material de partida alguno. Se anadio hidroxido sodico (al 50% ac., 5 mL) a la mezcla de reaccion y el disolvente se evaporo en vado. El residuo se disolvio en EtOAc y se lavo con 15 agua. Los lfquidos de lavado acuosos se reunieron y se lavaron 1 vez con EtOAc. Esto se reunio con extractos originales, se lavo con salmuera y se seco sobre MgSO4. La disolucion se filtro y el disolvente se evaporo para dar un solido cereo. Este solido se puede utilizar directamente en la siguiente etapa. Se puede obtener una muestra analttica a partir de cromatograffa (0 a 5% (9/1 MeOH/NH4OH) en CHCh) para obtener el compuesto del tttulo. 1H RMN (CDCl3) 1,35 (s, 3H), 1,39 (s, 3H), 1,66 (t, 1H), 1,83 (m, 1H), 1,95 (t, 1H), 2,56 (ddd, 1H), 3,03 (ddd, 1H), 3,30 20 (t, 1H), 3,6-3,8 (m, 5H), 7,27 (m, 5H).

(3R,4R,5R)-1-bencil-3-(benciloxi)-5-(hidroximetil)piperidin-4-ol (3).

A una disolucion de 2 (4,4 g, 15,9 mmol) en DMF (50 mL) se anadio NaH al 95% (0,43 g, 17,9 mmol) y la mezcla resultante se agito durante 1 h bajo N2. A continuacion, se anadio cloruro de bencilo (1,9 mL, 16,3 mmol) y la mezcla

se agito durante la noche a temperatura ambiente. Despues de aproximadamente 14 h, la DMF se evaporo en vacfo. El residuo se disolvio en EtOAc y se lavo con agua y despues con salmuera y despues se seco sobre MgSO4. La disolucion se filtro y el filtrado se evaporo a vacfo para dar el producto bruto. La cromatograffa sobre gel de sflice eluyendo con EtOAc al 0-25%/hexano dio 2,1 g de una espuma blanca. 1H RMN (CDCl3) 1,15 (m, 1H), 1,19 (s, 3H), 5 1,39 (s, 3H), 1,9-2,5 (m, 4H), 2,53 (ddd, 1H), 3,04 (ddd, 1H ), 3,3 (s, 1H), 3,45-3,8 (m, 4H), 7,2 (m, 10H). Esto se

disolvio en MeOH (100 mL) y se anadieron 1,5 mL de HCl 6N en 2-PrOH y la mezcla se agito a temperatura ambiente. Despues de 1 h, el material de partida habia desaparecido tal como se juzgo mediante tlc. El disolvente se evaporo y el residuo se disolvio en Na2Co3 al 10% y se extrajo con EtOAc (2 veces). Los extractos reunidos se lavaron con una pequena portion de agua y despues con salmuera y se secaron sobre MgSO4. La disolucion se filtro 10 y el filtrado se evaporo para dar el compuesto del fftulo (1,7 g, 33%). 1H RMN (CDCl3) 1,6-1,95 (m, 3H), 2,63 (ddd, 1H), 3,00 (ddd, 1H), 3,25-3,65 (m, 5H), 4,35 (d, 1H), 4,5 (d, 1H), 7,2 (m, 10H).

((3R,4R,5S)-1-bencil-4,5-bis(benciloxi)piperidin-3-il)metanol (4b).

A una disolucion de 3 (1,1 g, 3,36 mmol) en DMF (10 mL) se anadio NaH (0,10 g, 4,0 mmol) y la reaction se agito durante 30 minutos a temperatura ambiente, punto en el cual se anadio cloruro de bencilo (0,38 mL, 3,3 mmol) y la 15 reaccion se agito durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se evaporo en vacio y el residuo se disolvio en EtOAc y se lavo con agua y despues con salmuera y se seco sobre Na2SO4. La disolucion se filtro y el filtrado se evaporo para dar una mezcla de 4a y 4b (aproximadamente una mezcla 2/1). La mezcla se sometio a cromatograffa sobre gel de sflice eluyendo con EtOAc al 0-50%/hexano. Las fracciones correspondientes al regioisomero principal se reunieron para dar 4a (0,49 g, 35%) en forma de un aceite incoloro. 1H RMN (CDCU) 1,81 20 (t, 2H), 1,96 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 3,05 (ddd, 1H), 3,3-3,6 (m, 6H), 4,41 (s, 2H), 4,55 (q, 2H), 7,2 (m, 15H). Las

fracciones del regioisomero secundario se reunieron para dar 4b (0,23 g, 16%) en forma de un aceite incoloro. 1H RMN (CDCl3) 1,8-2,0 (m, 3H), 2,72 (dd, 1H), 3,05 (ddd, 1H), 3,27 (t, 1H), 3,4-3,6 (m, 4H), 3,65 (m, 1H), 4,56 (s, 2H), 4,60 (d, 1H), 4,90 (d, 1H), 7,2 (m, 15H).

(3R,4R,5S)-1-bencil-3,4-bis(benciloxi)-5-(fluorometil)piperidin-4-ol (5).

25 Una disolucion de 4b (0,32 g, 0,77 mmol) en CH2Cl2 (40 mL) se enfrio a -15 hasta -20 °C en un bano de hielo/agua salina. A este se anadio trifluoruro de (dietilamino)azufre (0,15 mL, 1,15 mmol) y la reaccion se dejo en agitation durante aproximadamente 20 minutos, momento en el que el material de partida se habia consumido, tal como se juzgo mediante tlc. La reaccion se enfrio bruscamente mediante la adicion de NaHCO3 y la mezcla se extrajo con EtOAc (2 veces). Los extractos reunidos se lavaron con salmuera y despues se secaron sobre Na2sO4. La 30 disolucion se filtro y el filtrado se evaporo para dar el producto bruto. La cromatograffa en gel de sflice (EtOAc al 0- 25%/hexano) proporciono el producto deseado (0,2 g, 63%) en forma de un aceite incoloro. 1H RMN (CDCh) 1,92,15 (m, 3H), 2,88 (dd, 1H), 3,12 (ddd, 1H), 3,36 (t, 1H), 3,55 (d, 1H), 3,65 (m, 1H), 4,3-4,6 (m, 3H), 4,63-4,65 (m, 3H), 4,95 (d, 1H), 7,2 (m, 15H).

Hidrocloruro de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol (6).

35 A una disolucion de 5 (0,24 g, 0,57 mmol) en EtOH (40 mL) se anadieron 0,5 mL de HCl 6N en 2-PrOH. El disolvente se evaporo en vacio y luego se co-evaporo 2 veces mas con EtOH. El residuo se disolvio en EtOH y se hidrogeno a 55 psi (3,87 kg/cm2) utilizando Pd(OH)2 como catalizador. Despues de 14 h, el material de partida ya no podia ser detectado y la disolucion se filtro y el filtrado se evaporo en vacio. El residuo se trituro con acetona y luego se filtro para dar un solido blanquecino (0,09 g, 85%) en forma del compuesto del fftulo. 1H RMN (DMSO-d6) 1,95-2,05 (m, 40 1H), 2,65 (t, 1H), 2,85 (t, 1H) 3,15-3,4 (m, 3H), 3,55 (m, 1H), 4,55 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 5,45-5,6 (dd, 2H), 9,05 (s

ancho, 2H).

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A una disolucion de 3 (26,0 g, 79,5 mmol) disuelta en piridina (300 mL) y enfriada en un bano de hielo se anadio TsCI (16,6 g, 87,5 mmol) en porciones. Despues de completar la adicion, la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperature ambiente y se agito durante la noche. El disolvente se evaporo en vado y el residuo se disolvio en EtOAc. La disolucion se lavo con agua (2 veces) y despues salmuera y luego se seco sobre MgSO4. La disolucion se filtro y el filtrado se evaporo en vado para dar el producto bruto que se seco en alto vado. El residuo se disolvio en THF (400 mL) y Bu4NF 1,0 M (100 mmol), se anadieron 100 mL y la mezcla se calento a reflujo. Despues de 2 h, no habfa material de partida restante. La mezcla de reaccion se diluyo con EtOAc y se lavo con agua (2 veces) y despues con salmuera y se seco sobre MgSO4. La disolucion se filtro y el filtrado se evaporo en vado. El producto bruto se purifico mediante cromatograffa en gel de silice (EtOAc al 25%/hexano) para dar el compuesto del titulo (7,5 g, 29% para 2 etapas).

Hidrocloruro de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol (6).

A una disolucion de 7 (7,5 g, 22,8 mmol) en EtOH (150 mL) se anadio HCl 5N en 2-PrOH (7 mL). La disolucion se evaporo en vado y despues se co-evaporo 2 veces mas con EtOH. El material resultante se disolvio en EtOH (100 mL) y la disolucion resultante se hidrogeno durante una noche con Pd(OH)2 a 50 psi (3,5 kg/cm2). El catalizador se separo mediante filtracion y el filtrado se evaporo en vado. El residuo se trituro con acetona y se recogio un solido de color amarillo palido. El solido resultante se recristalizo en EtOH para dar el compuesto del fftulo en forma de un solido blanquecino p.f. 200-202 °C. La 1H RMN DMSO d6 era consistente con espectros previos.

c. Sintesis de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol

Un enfoque para la obtencion de la base libre de (3R,4R,5R)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol es sintetizar hidrocloruro de (3R,4R,5R)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol tal como se describe en la seccion "b" anterior, seguido de cromatograffa de hidrocloruro de (3R,4R,5R)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol utilizando MeOH al 5-15%/NH4OH (9:1) en CHCh que convierte la forma de sal HCl de (3R,4R,5R)-5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol en su base libre.

d. Sintesis de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol

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(2S,3S,4aR,8S,8aR)-6-bencil-8-(clorometil)-2,3-dimetoxi-2,3-dimetiloctahidro-[1,4]dioxino[2,3-c]piridina (2).

A una disolucion de ((2S,3S,4aR,8R,8aR)-6-bencil-2,3-dimetoxi-2,3-dimetiloctahidro-[1,4]dioxino[2,3-c]piridina-8- il)metanol (1) (2,5 g, 7,1 mmol) en cloroformo (35 mL) se anadio cloruro de tionilo (1,3 mL, 18 mmol). La mezcla resultante se calento a reflujo durante 4-8 horas hasta que se juzgo que la reaccion era completa mediante TLC (98:2 CH2Cl2/2-PrOH). Disolvente y reactivo en exceso se evaporaron en vado y el residuo se cromatografio (98:2 CH2Cl2/2-PrOH) para dar el compuesto del titulo (2,2 g, 85%). El producto se caracterizo por HPLC/MS (MH+ = 369). La pureza fue juzgada como > 95%.

(3R,4R,5S)-1-bencil-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol (3).

A una disolucion de (2S,3S,4aR,8S,8aR)-6-bencil-8-(clorometil)-2,3-dimetoxi-2,3-dimetiloctahidro-[1,4]dioxino[2,3- c]piridina (2) (2,2 g, 5,9 mmol) en diclorometano (15 mL) se anadio acido trifluoroacetico (0,35 mol, 26 mL). La mezcla de reaccion se calento a reflujo durante aproximadamente 1 hora, momento en el que se juzgo que la 5 reaccion era completa mediante TLC. El disolvente en exceso y TFA se evaporaron en vado y el residuo se cromatografio utilizando gel de silice (MeOH al 2-8% en CHCh). Las fracciones se reunieron y se evaporaron para dar (1,3 g, 87%) en forma del compuesto del tttulo. El producto se caracterizo mediante HPLC/MS (MH+ = 255) y se juzgo que era > 95% puro.

(3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol (4).

10 HCl 5 N (4,7 mmol, 0,94 mL) se anadio a (3R,4R,5S)-1-bencil-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol (3) (5,1 mmol, 1,3 g) disuelto en EtOH. La disolucion se evaporo en vado y despues se co-evaporo 2-3 veces con EtOH. El residuo se volvio a disolver en EtOH y se reunio con Pd(OH)2 (0,27 g) y se hidrogena a 55 psi (3,87 kg/cm2) durante 12 h. El catalizador se filtro subsiguientemente a traves de dicalite y el filtrado se evaporo para obtener (4) bruto en forma de una sal de HCl. A continuacion, esta se cromatografio (MeOH al 5-15%/NH4Oh (9:1) en CHCh) para dar 0,4 g de (4) 15 en forma de un solido blanco con. MH+ de 165 y 1H RMN (DMSO-da) 1,6 (m, 1H), 2,2 (m, 3H), 2,9 (m, 3H), 3,15 (m, 1H), 3,6 (m, 1H), 3,8 (dd, 1H), 4,68 (d, 1H), 4,88 (d, 1H).

e. S/'ntesis de hidrocloruro de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol

Un enfoque para obtener la sal hidrocloruro de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol es sintetizar (3R,4R,5S)- 5-(clorometil)piperidina-3,4-diol tal como se describe en la seccion "d" anterior, seguido de reacidificacion con HCl 20 (ya sea como una disolucion acuosa o en 2-PrOH, tal como a menudo se vende), con lo que la base libre se convierte en la forma de sal HCl de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol y el subsiguiente aislamiento de hidrocloruro de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol.

Alternativamente, la smtesis de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol puede ser seguida tal como se describe en la seccion "d" anterior, con la excepcion de la ultima etapa cromatografica, con lo que la sal HCl se cromatograffa 25 utilizando MeOH al 5-15%/NH4OH (9:1) en CHCh, dado que esta etapa resulta en la conversion de la forma de sal HCl bruta de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4 diol en la base libre. Mas bien, la forma de sal HCl bruta de (3R,4R,5S)-5-(clorometil)piperidina-3,4-diol se puede purificar mediante cristalizacion.

Sales y solvatos

Compuestos de la presente invencion incluyen sales farmaceuticamente aceptables, solvatos de (3R,4R,5S)-5- 30 (fluorometil)piperidina-3,4-diol (al que tambien se alude en esta memoria como Compuesto A) y (3R,4R,5S)-5- (clorometil)piperidina-3,4-diol (al que tambien se alude en esta memoria como Compuesto B). Sales farmaceuticamente aceptables incluyen sales derivadas de bases inorganicas tales como Li, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn; sales de bases organicas tales como N,N'-diacetiletilendiamina, glucamina, trietilamina, colina, hidroxido, diciclohexilamina, metformina, bencilamina, trialquilamina, tiamina; bases quirales tales como alquilfenilamina, 35 glicinol, fenil-glicinol, sales de aminoacidos naturales tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, norleucina, tirosina, cistina, cistema, metionina, prolina, hidroxi-prolina, histidina, ornitina, lisina, arginina, serina; aminoacidos no naturales tales como isomeros D o aminoacidos sustituidos; guanidina, guanidina sustituida, en donde los sustituyentes se seleccionan entre nitro, amino, alquilo, alquenilo, alquinilo, sales de amonio o amonio sustituido y sales de aluminio. Las sales pueden incluir sales por adicion de acidos en caso apropiado, que son 40 hidrocloruros, sulfatos, nitratos, fosfatos, percloratos, boratos, hidrohaluros, acetatos, tartratos, maleatos, citratos, succinatos, palmoatos, metanosulfonatos, benzoatos, salicilatos, bencenosulfonatos, ascorbatos, glicerofosfatos, cetoglutaratos . En una realizacion, la sal farmaceuticamente aceptable de (3R,4R,5S)-5-(fluorometil)piperidina-3,4- diol es la sal hidrocloruro (a la que tambien se alude en esta memoria como la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A).

45 "Solvato" designa una asociacion ffsica de un compuesto con una o mas moleculas de disolvente. Esta asociacion ffsica implica grados variables de enlace ionico y covalente, incluyendo enlaces hidrogeno. En determinados casos, el solvato sera capaz de aislamiento, por ejemplo cuando una o mas moleculas de disolvente se incorporan en la red cristalina del solido cristalino. "Solvato" abarca tanto solvatos en fase de disolucion como solvatos aislables. "Hidrato" es un solvato en el que la molecula de disolvente es H2O. Otros ejemplos no limitantes de solvatos 50 adecuados incluyen alcoholes (p. ej., etanolatos, metanolatos y similares).

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Estan contemplados dentro del alcance de esta invencion todos los estereoisomeros (por ejemplo, isomeros geometricos, isomeros opticos y similares) de 5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol y 5-(clorometil)piperidina-3,4-diol (incluyendo los de las sales, solvatos y profarmacos de estos compuestos, as^ como las sales y solvatos de los profarmacos) tales como los que pueden existir debido a carbonos asimetricos en diversos sustituyentes, incluyendo formas enantiomericas (que pueden existir incluso en ausencia de carbonos asimetricos), rotamericas, atropisomeros y formas diastereomericas. Estereoisomeros individuales de estos compuestos pueden, por ejemplo, estar sustancialmente libres de otros isomeros, o pueden estar mezclados, por ejemplo, como racematos o con todos los demas, u otros estereoisomeros seleccionados. Los centros quirales de los compuestos anteriormente mencionados pueden tener la configuracion S o R tal como se define por las Recomendaciones de la IUPAC de 1974. El uso de los terminos "sal", "solvato", "profarmaco" y similares pretende aplicarse igualmente a la sal, solvato y profarmaco de enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, racematos o profarmacos de 5- (fluorometil)piperidina-3,4-diol y 5-(clorometil)piperidina-3,4-diol.

Formulaciones

El o los agentes terapeuticos se pueden formular para que sean adecuados para cualquier via de administracion, incluyendo, por ejemplo, la via oral en forma de comprimidos o capsulas o lfquidos, o en disolucion acuosa esteril para inyeccion. Cuando el o los agentes terapeuticos se formulan para administracion por via oral, los comprimidos o capsulas se pueden preparar por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (p. ej., almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrogeno-fosfato de calcio); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco o s^lice); disgregantes (p. ej., fecula de patata o glicolato sodico de almidon); o agentes humectantes (p. ej., lauril-sulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por metodos bien conocidos en la tecnica. Preparados lfquidos para administracion oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para constitucion con agua u otro vehfculo adecuado antes de su uso. Preparados lfquidos de este tipo pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o acacia); vehfculos no acuosos (p. ej., aceite de almendras, esteres oleosos, alcohol etilico o aceites vegetales fraccionados); o conservantes (p. ej., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o acido sorbico). Los preparados lfquidos tambien pueden contener sales tampon, agentes aromatizantes, colorantes o edulcorantes segun sea apropiado. Los preparados para administracion oral se pueden formular adecuadamente para proporcionar una liberacion controlada o sostenida del o de los agentes terapeuticos.

En determinadas realizaciones de la presente invencion, el o los agentes terapeuticos se administran en una forma de dosificacion que permita la absorcion sistemica, de modo que el o los agentes terapeuticos pueden cruzar la barrera hematoencefalica a fin de ejercer efectos sobre las celulas neuronales. Por ejemplo, formulaciones farmaceuticas del o de los agentes terapeuticos, adecuadas para uso parenteral/inyectable generalmente incluyen disoluciones acuosas esteriles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista una facil inyectabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe conservarse contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El soporte puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos puede ser provocada por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, alcohol bendlico, acido sorbico y similares. En muchos casos, sera razonable incluir agentes isotonicos, por ejemplo azucares o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina.

Disoluciones inyectables esteriles se preparan incorporando el o los agentes terapeuticos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes arriba enumerados, segun se requiera, seguido por esterilizacion de filtro o terminal. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado en vacfo y la tecnica de liofilizacion que proporciona un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolucion previamente esterilizada por filtracion del mismo.

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La formulacion puede contener un excipiente. Excipientes farmaceuticamente aceptables que pueden incluirse en la formulacion son tampones tales como tampon citrato, tampon fosfato, tampon acetato y tampon bicarbonato, aminoacidos, urea, alcoholes, acido ascorbico, fosfolfpidos; protemas, tales como albumina de suero, colageno y gelatina; sales tales como EDTA o EGTA, y cloruro sodico; liposomas; polivinilpirrolidona; azucares, tales como dextrano, manitol, sorbitol y glicerol; propilenglicol y polietilenglicol (p. ej., PEG-4000, PEG-6000); glicerol; glicina u otros aminoacidos; y Kpidos. Los sistemas tampon para uso con las formulaciones incluyen citrato; acetato; bicarbonato; y tampones fosfato. Tampon fosfato es una realizacion preferida.

La formulacion tambien puede contener un detergente no ionico. Detergentes no ionicos preferidos incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, octil a-glucosido, octil p-glucosido, Brij 35, Pluronic y Tween 20.

Vias de administracion

El o los agentes terapeuticos se pueden administrar por via oral o parenteral, incluyendo intravenosa, subcutanea, intra-arterial, intraperitoneal, oftalmica, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradermica, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, intranasal, transmucosal, transdermica o mediante inhalacion. En una realizacion preferida, el o los agentes terapeuticos se administran por via oral.

La administracion del o de los agentes terapeuticos puede ser mediante inyecciones periodicas de un bolo de la formulacion, o pueden ser administrados mediante administracion intravenosa o intraperitoneal desde un deposito que es externo (p. ej., una bolsa i.v.) o interno (p. ej., un implante bioerosionable). Veanse, p. ej., las Patente de EE.UU. N°s. 4.407.957 y 5.798.113. Metodos y aparatos de suministro intrapulmonar se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N°s. 5.654.007, 5.780.014 y 5.814.607. Otros sistemas de administracion parenteral utiles incluyen partfculas de copolfmero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmoticas, sistemas de infusion implantables, suministro de bombas, suministro de celulas encapsuladas, administracion liposomal, inyeccion suministrada por aguja, inyeccion sin aguja, nebulizador, aerosol, electroporacion y parche transdermico. Dispositivos de inyector sin aguja se describen en las patentes de EE.UU. N°s. 5.879.327; 5.520.639; 5.846.233 y 5.704.911. Cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente se puede administrar utilizando estos metodos.

Las inyecciones subcutaneas tienen las ventajas que permiten la auto-administracion, mientras que tambien resultan en una semivida plasmatica prolongada en comparacion con la administracion intravenosa. Ademas, una diversidad de dispositivos disenados para la conveniencia del paciente, tales como plumas de inyeccion recargables y dispositivos de inyeccion sin aguja, se puede utilizar con las formulaciones de la presente invencion como se discute en esta memoria.

Dosificacion

Un preparado farmaceutico adecuado esta en una forma de dosificacion unitaria. En una forma de este tipo, el preparado se subdivide en dosis unitarias de tamano adecuado que contienen cantidades apropiadas del componente activo, p. ej., una cantidad eficaz para lograr el proposito deseado. En determinadas realizaciones, el o los agentes terapeuticos se administran en una o mas dosis diarias (p. ej., una vez al dfa, dos veces al dfa, tres veces al dfa). En determinadas realizaciones, el o los agentes terapeuticos se administran de forma intermitente.

Regfmenes de dosificacion a modo de ejemplo se describen en la solicitud de patente internacional PCT/US08/61764 publicada como WO 2008/134628 e 11 de junio de 2008 y la solicitud de patente de EE.UU. provisional N° 61/108.192, presentada el 24 de octubre de 2008 (correspondiente a los documentos US2010/0106473 y WO 2010/048532). En una realizacion, el o los agentes terapeuticos se administran en un regimen de dosificacion intermitente que incluye una "dosis de carga" inicial dada diariamente, seguido por un penodo de dosificacion de intervalo no diario.

La cantidad de agente o agentes terapeuticos efectivos para prevenir o tratar el trastorno de referencia puede determinarse sobre una base de caso por caso por los expertos en la tecnica. La cantidad y frecuencia de administracion del o de los agentes terapeuticos se regularan de acuerdo con el juicio del medico que lo atienda (medico) considerando factores tales como edad, estado y tamano del paciente, asf como riesgo de desarrollar un trastorno o gravedad de la smtomas del trastorno referenciado que se este tratando.

Terapia con farmacos de combinacion

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El o los agentes terapeuticos de la presente invencion se pueden administrar en combinacion con al menos otro agente terapeutico. Se entiende que la administracion del o de los agentes terapeuticos de la presente invencion con al menos otro agente terapeutico abarca la administracion que es secuencial o concurrente. En una realizacion, los

agentes terapeuticos se administran en formas de dosificacion separadas. En otra realizacion, dos o mas agentes

terapeuticos se administran simultaneamente en la misma forma de dosificacion.

En determinadas realizaciones, el o los agentes terapeuticos de la presente invencion se administran en

combinacion con al menos otro agente terapeutico que es un agente anti-disquinesia (p. ej., carbidopa, levodopa), un agente anti-infeccioso (p. ej., miglustat), un agente antineoplasico (p. ej., busulfan, ciclofosfamida), un agente gastrointestinal (p. ej., metilprednisolona), un micronutriente (p. ej., calcitriol, colecalciferol, ergocalciferoles, vitamina D), un agente vasoconstrictor (p. ej., calcitriol). En una realizacion preferida, los otros agentes terapeuticos antes mencionados se administran cuando el trastorno es la enfermedad de Gaucher.

combinacion con alopregnanolona, una dieta baja en colesterol, o agentes reductores del colesterol tales como estatinas (p. ej., Lipitor®); fibratos tales como fenofibrato (Lipidil®); niacina; y/o resinas de union tales como colestiramina (Questran®).

En una realizacion, el o los agentes terapeuticos de la presente invencion se administran en combinacion con una terapia genica. La terapia genica se contempla tanto con genes de reemplazo tales como glucocerebrosidasa o con ARN inhibidor (siARN) para el gen SNCA. La terapia genica se describe con mas detalle en la patente de EE.UU. N° 7.446.098, presentada el 17 de febrero de 2004.

En una realizacion, el o los agentes terapeuticos de la presente invencion se administran en combinacion con al menos otro agente terapeutico que es un agente anti-inflamatorio (p. ej., ibuprofeno u otro NSAID).

En una realizacion, el o los agentes terapeuticos de la presente invencion se administran en combinacion con un inhibidor del sustrato para la glucocerebrosidasa tal como N-butil-desoxinojirimicina (Zavesca®; miglustat disponible de Actelion Pharmaceuticals, US, Inc., South San Francisco, CA, EE.UU.).

Tambien se contemplan combinaciones del o de los agentes terapeuticos de la presente invencion con al menos otro agente terapeutico que es un agente terapeutico para una o mas de otras enzimas lisosomales. La Tabla 2 contiene una lista no limitativa de agentes terapeuticos para enzimas lisosomales.

Tabla 2

ENZIMA LISOSOMAL: AGENTE TERAPEUTICO

a-glucosidasa N° de Acceso a GenBank Y00839: 1-desoxinojirimicina (DNJ) a-homonojirimicina castanospermina

p-glucosidasa acida (p-glucocerebrosidasa) N° de Acceso a GenBank J03059: isofagomina C-bencil-isofagomina y derivados N-alquil (C9-12)-DNJ Glucoimidazol (y derivados) C-alquil-IFG (y derivados) N-alquil-p-valeinaminas Flufenozina calisteginas A3, B1, B2y C1

a-galactosidasa A N° de Acceso a GenBank NM000169: 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ) a-a//o-homonojirimicina a-ga/acfo-homonojirimicina p-1-C-butil-desoxinojirimicina calisteginas A2 y B2 N-metil calisteginas A2 y B2

p-galactosidasa acida N° de Acceso a GenBank M34423: 4-epi-isofagomina 1-desoxigalactonojirimiicina

ENZIMA LISOSOMAL: AGENTE TERAPEUTICO

Galactocerebrosidasa (p-galactosidasa acida) N° de Acceso a GenBank D25283: 4-ep/-isofagomina 1-desoxigalactonojirimicina

a-manosidasa acida N° de Acceso a GenBank U68567: 1-desoximannojirimicina Swainsonina Manostatina A

p-manosidasa N° de Acceso a GenBank U60337: 2-hidroxi-isofagomina

a-L-fucosidasa acida N° de Acceso a GenBank NM_000147: 1-desoxifuconojirimicina p-homofuconojirimicina 2.5- imino-1,2,5-tridesoxi-L-glucitol 2.5- desoxi-2,5-imino-D-fucitol 2.5- imino-1,2,5-tridesoxi-D-altritol

a-N-acetilglucosaminidasa N° de Acceso a GenBank U40846: 1,2-didesoxi-2-N-acetamido-nojirimicina

a-N-acetilgalactosaminidasa N° de Acceso a GenBank M62783: 1,2-didesoxi-2-N-acetamido-galactonojirimicina

p-hexosaminidasa A N° de Acceso a GenBank NM_000520: 2-N-acetilamino-isofagomina 1,2-didesoxi-2-acetamido-nojirimicina Nagstatina

p-hexosaminidasa B N° de Acceso a GenBank NM_000521: 2-N-acetamido-isofagomina 1,2-didesoxi-2-acetamido-nojirimicina Nagstatina

a-L-iduronidasa N° de Acceso a GenBank NM_000203: 1- desoxiiduronojirimicina 2- carboxi-3,4,5-tridesoxipiperidina

p-glucuronidasa N° de Acceso a GenBank NMR_000181: 6-carboxi-isofagomina 2-carboxi-3,4,5-tridesoxipiperidina

Sialidasa N° de Acceso a GenBank U84246: Acido 2,6-didesoxi-2,6, imino-sialico Siastatina B

Iduronato sulfatasa N° de Acceso a GenBank AF_011889: 2,5-anhidromanitol-6-sulfato

Esfingomielinasa acida N° de Acceso a GenBank M59916: desipramina, fosfatidilinositol-4,5-difosfato

En determinadas realizaciones, el o los agentes terapeuticos de la presente invencion se administran en combinacion con al menos un agente terapeutico que es un agente anti-disquinesia (p. ej., carbidopa, levodopa), un agente anti-infeccioso (p. ej., ciclosporina, miglustat, pirimetamina), un agente antineoplasico (p. ej., alemtuzumab, azatioprina, busulfan, clofarabina, ciclofosfamida, melfalan, metotrexato, rituximab), un agente antirreumatico (p. ej., 5 rituximab) un agente gastrointestinal (p. ej., metilprednisolona), un micronutriente (p. ej., calcitriol, colecalciferol, ergocalciferoles, acido folico, vitamina D), un agente de control de la reproduccion (p. ej., metotrexato), un agente del sistema respiratorio (p. ej., tetrahidrozolina), un agente vasoconstrictor (p. ej., calcitriol, tetrahidrozolina).

En determinadas realizaciones, el o los agentes terapeuticos de la presente invencion se administran en combinacion con al menos un agente terapeutico que es un agente terapeutico para la p-hexosaminidasa A y/o un 10 agente terapeutico para la p-galactosidasa acida. En determinadas realizaciones, el o los agentes terapeuticos de la presente invencion se administran en combinacion con al menos un agente terapeutico que es un agente anti- infeccioso (p. ej., miglustat), un agente antineoplasico (p. ej., alemtuzumab, busulfan, ciclofosfamida), un agente gastrointestinal (p. ej., metilprednisolona). En una realizacion, la combinacion antes mencionada se administra a

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sujetos en riesgo de o diagnosticados con la enfermedad de Niemann-Pick (p. ej., la enfermedad de Niemann-Pick tipo C).

EJEMPLOS

La presente invencion se describe adicionalmente por medio de los ejemplos que se presentan a continuacion. EJEMPLO 1 Determinacion de Constantes de Inhibicion

La afinidad de union (definida aqu por la constante de union Ki) de la GCasa para chaperonas farmacologicas de moleculas pequenas descritas en este documento se determino empmcamente utilizando ensayos de inhibicion enzimatica. En smtesis, los ensayos de inhibicion enzimatica utilizaban monitorizada la capacidad del compuesto de ensayo de unirse y evitar la hidrolisis de un sustrato fluorogenico de una manera dependiente de la concentracion. Espedficamente, la actividad enzimatica de la GCasa humana recombinante (rhGCasa Cerezyme®, Genzyme Corp.) se midio utilizando el sustrato fluorogenico 4-metilumbeliferil-p-D-glucopiranosido (4-MU-p-D-Glc) en ausencia o en presencia de cantidades variables de cada uno de los compuestos de ensayo. Los datos resultantes se analizaron mediante la comparacion de todas las muestras de ensayo con la muestra de control sin inhibicion (sin compuesto; correspondiente a la actividad enzimatica de 100%) para determinar la actividad enzimatica residual en presencia de compuesto de ensayo. Los datos de actividad residual normalizados se representaron graficamente con posterioridad (en el eje y) con respecto a la concentracion de compuesto de ensayo (en el eje x) para extrapolar la concentracion de compuesto de ensayo que conduce a una inhibicion del 50% de la actividad enzimatica (definido como CI50). A continuacion, se inserto el valor de CI50 para cada uno de los compuestos de ensayo en la ecuacion de Cheng-Prusoff (detallados a continuacion) para derivar la constante de inhibicion Ki absoluta que refleja con exactitud la afinidad de union de GCasa para el compuesto de ensayo. Los ensayos de inhibicion enzimatica se realizaron tanto a pH 7,0 (pH del retfculo endoplasmico) como a pH 5,2 (pH lisosomal) para profundizar en la afinidad de union (es decir, potencia) de compuestos para GCasa en el retfculo endoplasmico y en las lisososomas.

Ensayo in vitro

Diversas concentraciones de compuestos de ensayo se prepararon en tampon "M" que consiste en tampon fosfato de sodio 50 mM con taurocolato de sodio al 0,25% a pH 7,0 y pH 5,2. La enzima (Cerezyme®, una forma recombinante de la enzima p-glucocerebrosidasa humana) tambien se diluyo en el mismo tampon "M" a pH 7,0 y pH 5,2. La disolucion de sustrato constaba de 4-metilumbeliferona p-D-glucopiranosido 3 mM en tampon "M" con Triton X-100 al 0,15% en ambos valores de pH. Cinco pl de enzima diluida se anadieron a 15 pl de las diversas concentraciones de inhibidor o tampon "M" por sf solo y se incubaron a 37 °C durante 1 hora con 50 pl de la preparacion del sustrato para evaluar la actividad de p-glucosidasa a pH 7,0 y pH 5,2. Las reacciones se detuvieron mediante la adicion de un volumen igual de glicina 0,4 M, pH 10,6. Se midio la fluorescencia en un lector de placas durante 1 s/pocillo utilizando excitacion a 355 nm y emision a 460 nm. Las incubaciones sin enzima anadida o sin inhibidores anadidos se utilizaron para definir ninguna actividad enzimatica y actividad maxima, respectivamente, y normalizar el % de inhibicion para un ensayo dado. Los resultados de este ensayo de inhibicion para el compuesto de referencia AT2101 y los compuestos de ensayo, la forma de sal clorhidrato del Compuesto A y AT 3365, se resumen a continuacion en la Tabla 2A.

Tabla 2A Determinacion in vitro de Constantes de Inhibicion

Compuesto: CI50 (mM) pH 5,2 Ki (pM) pH 5,2 CI50 (pM) pH 7 Ki (pM) pH 7

Tartrato de IFG: 0,0437 ± 0,0018 0,023 ± 0,001 0,00626 ± 0,00018 0,0033 ± 0,00013

Compuesto A-HCl: 0,014±0,006 0,006±0,003 0,006±0,0005 0,003±0,0003

Compuesto A-HCl*: 0,014±0,001 0,006±0,0004 0,007±0,0004 0,004±0,0002

Compuesto B: 0,0729±0,004 0,384±0,0021 0,0098±0,0005 0,0051±0,0003

* smtesis independiente de la forma de sal hidrocloruro del Compuesto A

Ensayo in situ

El efecto de IFG y sus derivados sobre la actividad de GCasa lisosomal se sometio a ensayo in situ utilizando fibroblastos establecidas de un sujeto normal. Las celulas sembradas en placas de 48 pocillos se incubaron con las concentraciones indicadas de compuesto durante 16-24 horas. Para los ensayos de dosis-respuesta, las celulas se incubaron con el sustrato 5-(pentafluorobenzoilamino)fluorescema di-p-D-glucopiranosido (PFBFDpGlu) in situ 5 durante 1 hora y subsiguientemente se lisaron para determinar el grado de hidrolisis del sustrato en presencia del compuesto. El ensayo empleo una gama de 12 concentraciones que abarcan 5 ordenes de magnitud, centrada en la CI50. Espedficamente, se emplearon los siguientes intervalos de concentracion: Compuesto A: 1 x 10-5 a 3,33 x 10'

-i -i 1 ^ c; 44 1

; AT2101: 3,33 x 10 a 1 x 10 ; Compuesto B: 3 x 10 a 9 x 10 ; en donde el compuesto se diluyo en serie 1:3 a partir de la concentracion mas alta en los intervalos especificados. La inhibicion se determino como la relacion de la 10 actividad en presencia de compuesto a la de en ausencia de compuesto. Para los ensayos de separacion por lavado, las celulas fueron tratadas con el compuesto durante 16-24 horas a una concentracion igual a la CI90. Las celulas se lavaron exhaustivamente y se incubaron en medio libre de farmacos para permitir el eflujo de compuesto neto de las celulas. Las celulas se sometieron entonces a ensayo en cuanto a la actividad de GCasa lisosomal a intervalos de 2 horas a lo largo de un periodo total de 8 horas despues de la separacion del compuesto. El aumento 15 de la actividad con el tiempo fue ajustado con una funcion exponencial sencilla para determinar el tiempo de separacion por lavado del compuesto. Los resultados de estos ensayos de inhibicion se resumen a continuacion en la Tabla 2B.

Tabla 2B Determinacion in situ de las Constantes de Inhibicion

Compuesto: CI50 In Situ (pM) Separacion por lavado In Situ (h) CE50 (pM) Emax (%)

Tartrato de IFG: 0,271±0,012 8,2±0,04 0,9±0,2 93,6±2,5

Compuesto A-HCl: 0,017±0,008 6,6±0,12 0,00138±0,00063 96,8±7,7

Compuesto A-HCl*: 0,0056±0,0015 104±4,58

Compuesto B: 0,121±0,007 2,9±0,22 0,0096±0,001 104,2±3,4

Notas: * sintesis independiente de compuesto la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A Ecuacion de Cheng-Prusoff: Ki = CI50 / (1 + [S]/Km) en que [S] = concentracion del sustrato; se utilizo 4-MU-p-D-Glc 2,5 mM Km = constante de Michaelis que define la afinidad del sustrato; 1,8 ± 0,6 mM para 4-MU-p-D-Glc (Liou et al., (2006) J Biol. Chem. 281 (7), 4242-53)

En particular, se encontro que los compuestos de ensayo, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A y AT 3365, 20 provocan un aumento dependiente de la concentracion de la actividad de GCasa. Por otra parte, cuando se compara con tartrato de IFG, los compuestos de ensayo, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A y Compuesto B, potenciaban la actividad enzimatica al mismo nivel maximo a una concentracion mucho menor.

EJEMPLO 2: Penetracion de la barrera hematoencefalica

La penetracion de la barrera hematoencefalica (BBB) del compuesto de referencia (tartrato de IFG) y los 25 compuestos de ensayo (derivados de IFG, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A y Compuesto B) se sometieron a ensayo despues de la administracion oral a ratones. Para este fin, a ratones machos de tipo salvaje (C57BL/6) de 8 semanas de edad se les administro p.o. una dosis unica de 30 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de referencia o de ensayo mediante sonda esofagica (n = 3 ratones por instante). Disoluciones de dosificacion se prepararon en agua. Despues de la dosificacion, los ratones fueron sacrificados con CO2 en los 30 siguientes instantes: 0, 0,5, 1 y 4 horas post-dosis. Despues de la eutanasia, la sangre entera se recogio de la vena cava inferior en tubos de heparina de litio. De manera similar, los cerebros fueron recogidos de cada uno de los ratones. El plasma se derivo centrifugando sangre entera a 2700g durante 10 minutos a 4 °C, seguido por almacenamiento en hielo seco. Los cerebros enteros se lavaron en PBS fno para separar la sangre contaminante, se secaron con papel secante, se congelaron de forma instantanea en hielo seco y finalmente se almacenaron a -80 35 °C hasta su analisis. Para preparar muestras de cerebro para el analisis, 50-100 mg de tejido se homogeneizaron en 400 |jl de agua/mg de tejido. Las muestras fueron luego aclaradas mediante centrifugacion. A continuacion, 25 jl del sobrenadante homogeneizado de cerebro o 25 jl de plasma se combinaron con 25 jl de acetonitrilo:agua (95/5). Esto se complemento con 25 jl de acetonitrilo y 50 jL de patron interno (100 ng/mL de IFG 13C2-15N en acido formico al 0,5% en (70:30) de acetonitrilo:metanol. Las muestras se aclararon de nuevo mediante centrifugacion y 75

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|j| del sobrenadante se combinaron con 75 jl de acetonitrilo. Las muestras fueron luego analizadas en cuanto a los niveles de compuestos mediante LC-MS/mS en PPD Inc. (3230 Deming Way, Middleton, WI 53562). En smtesis, se empleo una columna Thermo Betasil, Silica-100, 50 x 3 mm, 5 p, equilibrada con una mezcla de fase movil que consiste en formiato de amonio 5 mM y acido formico al 0,05% en (A) 95:5 acetonitrilo:agua o (B) 70:20:10 metanol:agua:acetonitrilo. Entre 20 y 30 jl de muestra se inyectaron para su analisis. En particular, los tiempos de retencion para IFG, Compuesto A y Compuesto B son 4,91,4,33 y 4,32 minutos, respectivamente. Para MS/Ms, los analitos se vigilaron mediante MRM con las siguientes masas de iones (Q1/Q3, amu): patron interno marcado isotopicamente con IFG 13C2-15N (151,1/115,1), IFG (148,1/112,1), Compuesto A (150,1/103,1), Compuesto B (166,2/130,1). Cuando se analizo el Compuesto B, el Compuesto A se utilizo como patron interno (150,1/130,1). Para el calculo de las concentraciones de farmaco, los datos en bruto para el plasma (ng/mL) y cerebro (ng/g) se convirtio en nM utilizando el peso molecular de compuestos respectivos y asumiendo que 1 g de tejido es equivalente a 1 mL de volumen. La concentracion como una funcion del tiempo se represento graficamente en GraphPad Prism version 4.02.

Los niveles en plasma y los niveles en cerebro de compuesto de referencia, IFG, y compuesto de ensayo, Compuesto A, detectado en ratones a los que se administro p.o. una dosis unica de 30 mg/kg (equivalente de base libre) de tartrato de IFG o la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A se ilustra en las Figuras. 1A y 1B, respectivamente. De manera similar, la relacion de niveles en cerebro a plasma de Compuesto A e IFG detectada en estos ratones se ilustra en la Figura 1C. Sorprendentemente, estos resultados reflejan que el Compuesto A cruzo la barrera hematoencefalica mas facilmente en comparacion con IFG.

Los niveles en cerebro de compuesto de referencia, IFG, y compuesto de ensayo, Compuesto B, detectados en ratones a los que se administro p.o. una dosis unica de 30 mg/kg (equivalente de base libre) de tartrato de IFG o la forma de Compuesto B se ilustra en la Figura 2. En particular, se detectaron niveles incluso mas altos de Compuesto B en el cerebro que los observados tras la administracion de la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A.

EJEMPLO 3: Potenciacion de GCasa

Se evaluo en ratones la capacidad de los compuestos de ensayo administrados por via oral (la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A y Compuesto B) para elevar los niveles de GCasa en comparacion con el compuesto de referencia, tartrato de IFG. Para este fin, se administro p.o. a ratones machos de tipo salvaje (C57/BL6) de 8 semanas de edad una dosis unica (sonda esofagica) (detallado en las Figuras 3A-D, 4A-D y 5A-D) de control, compuesto de referencia (tartrato de IFG) o compuesto de ensayo (la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A o Compuesto B). Se utilizaron siete animales por dosis. Las disoluciones de dosificacion se prepararon en agua. Los compuestos se administraron a lo largo de 2 semanas de la siguiente manera: semana 1, de lunes a viernes (encendido), sabados y domingos (apagado); semana 2, de lunes a jueves (encendido); necropsia el viernes. Asf, se administro a cada uno de los ratones un total de 9 dosis (disoluciones de dosificacion preparadas nuevas todos los dfas), con una separacion por lavado de 24 horas entre la ultima dosis y la necropsia.

Despues de completarse la dosificacion, los ratones fueron sacrificados con CO2 y la sangre entera se elaboro en tubos de heparina de litio de la vena cava inferior. El plasma se recogio mediante centrifugacion de sangre a 2700g durante 10 minutos a 4 °C. Se separaron tejidos de hngado, bazo, pulmon y cerebro, se lavaron en PBS frio, se secaron con papel secante, se congelaron de forma instantanea en hielo seco y finalmente se almacenaron a -80 °C hasta su analisis. Los niveles de GCasa se midieron mediante homogeneizacion de aproximadamente 50 mg de tejido en 500 jL de tampon McIlvane (MI) (citrato de sodio 100 mM, fosfato de sodio dibasico 200 mM, taurocolato de sodio al 0,25% y Triton X-100 al 0,1%, pH 5,2) a pH 5,2 durante 3-5 segundos en hielo con un micro- homogeneizador Los productos homogeneizados se incubaron a continuacion a temperatura ambiente sin y con conduritol-B-epoxido (CBE) 2,5 mM durante 30 min. Finalmente, se anadio sustrato 4-metilumbeliferil-p-glucosido (4- MUG) 3,7 mM y se incubo a 37 °C durante 60 min. Las reacciones se detuvieron mediante la adicion de glicina 0,4 M, pH 10,6. Se midio la fluorescencia en un lector de placas durante 1 s/pocillo utilizando excitacion a 355 nm y emision a 460 nm. La protema total se determino en los lisados utilizando el kit MicroBCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizo una curva estandar de 4-metilumbeliferona (4-MU) que oscila entre 1,0 nM y 50 jM en paralelo para la conversion de datos de fluorescencia en bruto a la actividad absoluta de GCasa (en presencia y ausencia de CBE) y se expreso como nanomoles de 4-MU liberados por miligramo de protema por hora (nmol/mg de protema/h). Los niveles GCasa y los niveles de protema se calcularon utilizando Microsoft Excel (Redmond, WA) y GraphPad Prism version 4.02.

Las Figuras 3A-D ilustran el nivel de GCasa en el cerebro, el bazo, el tngado y el pulmon, respectivamente, de ratones C57BL/6 a los que se administro un regimen de dosificacion de 2 semanas que consiste en nueve dosis de (i) vehnculo control; (ii) 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de referencia, tartrato de IFG; o (iii) 10 o

100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de ensayo, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A. Ademas de ello, las Tablas 3A-C detallan el nivel de potenciamiento de GCasa en el cerebro, el bazo y el plasma, respectivamente, de ratones tratados tal como se describe arriba.

Tabla 3A Muestras de cerebro del estudio de potenciamiento de GCasa

Compuesto: Dosis (mg/kg) Disolucion de dosificacion Incremento de GCasa (- veces) Concentracion (nM) CI50 pH 5,2 (nM)

Compuesto A: 10 Agua 2,5 124±11 (0,5) 10±1

Compuesto A: 100 Agua 3,5 726±51 (3)

IFG: 100 Agua 2,2 182±13 (0,7) 50±3

Notas: BLQ < 5 ng/g Los valores entre parentesis indican concentraciones en ensayos de GCasa despues de dilucion Los datos de CI50 son la media de tres experimentos independientes

5

Tabla 3B Muestras de bazo del estudio de potenciamiento de GCasa

Compuesto A: 10 Agua 1,9 69±6 (0,3) 10±1

Compuesto A: 100 Agua 2,8 304±63 (1,1)

IFG: 100 Agua 1,9 711±100 (2,6) 50±3

Notas: BLQ < 8 ng/g Los valores entre parentesis indican concentraciones en ensayos de GCasa despues de dilucion Los datos de CI50 son la media de tres experimentos independientes

Tabla 3C Muestras de plasma del estudio de potenciamiento de GCasa

Compuesto: Dosis (mg/kg) Disolucion de dosificacion Concentracion (nM)

Compuesto A: 10 Agua 32±2,4

Compuesto A: 100 Agua 254±73,5

IFG: 100 Agua 330±36

Nota:

BLQ< 1ng/mL

De manera similar, las Figuras 4A-D ilustran el nivel de GCasa en el cerebro, el bazo, el hngado y el pulmon, respectivamente, de ratones C57BL/6 a los que se administro un regimen de dosificacion durante 2-semanas que 10 consiste en nueve dosis de (i) vehnculo control; (ii) 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de referencia, tartrato de IFG; o (ii) 1, 3, 10, 30 o 100 mg/kg (equivalente de base libre) de compuesto de ensayo, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A.

Tal como se refleja en las Figuras 3A-D y 4A-D, asf como en las Tablas 3A-3C, ratones a los que se administro la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A demostraron un potenciamiento de la GCasa mayor estadfsticamente 15 significativo en el cerebro, el bazo, el hngado y el pulmon en comparacion con ratones a los que se administro control

o tartrato de IFG. Ademas de ello, el potenciamiento de la GCasa en ratones a los que se administro la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A era inesperadamente mayor que el observado con tartrato de IFG, incluso cuando se administraron dosis mucho mas bajas de la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A que tartrato de IFG.

Del mismo modo, las Figuras 5A-D ilustran el nivel de GCasa detectado en el cerebro, el bazo, el hngado y el 5 pulmon, respectivamente, de ratones tratados con Compuesto B y tartrato de IFG como se ha descrito anteriormente. Ademas de ello, las Tablas 4A-4C detallan el nivel de potenciamiento de la GCasa en el cerebro, el bazo y plasma, respectivamente, de ratones tratados como se describe arriba.

Tabla 4A Muestras en cerebro del estudio de potenciamiento de GCasa

Compuesto B: 10 Agua 2,3 246±42 (0,9) 73±9

Compuesto B: 100 Agua 3,5 2066±231 (7,6)

IFG: 10 Agua 1,5 49±2,4 (0,2) 50±3

IFG: 100 Agua 2,1 287±74 (1,1)

Notas:

BLQ < 5 ng/g

Los valores entre parentesis indican concentraciones en ensayos de GCasa despues de dilucion Los datos de CI50 son la media de tres experimentos independientes

Tabla 4B Muestras en bazo del estudio de potenciamiento de GCasa

Compuesto B: 10 Agua 1,4 645±214 (2,4) 73±9

Compuesto B: 100 Agua 2,2 2156±464 (8)

IFG: 10 Agua 1,6 150±12 (0,5) 50±3

IFG: 100 Agua 2,0 1139±220 (1,1)

Notas:

BLQ < 5 ng/g

10

Tabla 4C Muestras de plasma del estudio de potenciamiento de GCasa

Compuesto: Dosis (mg/kg) Disolucion de dosificacion Concentracion (nM)

Compuesto B: 10 Agua 104,3±15

Compuesto B: 100 Agua 1529±601

IFG: 10 Agua 67±10

IFG: 100 Agua 852±134

Nota: BLQ < 1 ng/mL

5

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30

Tal como se refleja en las Figuras 5A-D, asi como en las Tablas 4A-4C, ratones a los que se administro Compuesto B demostraron un potenciamiento de la GCasa mayor estad^sticamente significativo en el cerebro, el bazo, el higado y el pulmon en comparacion con ratones a los que se administro control o tartrato de IFG. Ademas de ello, el potenciamiento de la GCasa en ratones a los que se administro Compuesto B era inesperadamente mayor que el observado con tartrato de IFG, incluso cuando se administraron dosis mucho mas bajas de Compuesto B que tartrato de IFG.

EJEMPLO 4: Farmacocinetica de ratas

Se obtuvieron datos farmacocineticos (PK) en ratas para evaluar la biodisponibilidad del compuesto de ensayo. En particular, se midieron los siguientes parametros PK: biodisponibilidad medida por el area bajo la curva de Concentracion/Tiempo (AUC), la fraccion de dosis disponible (% de F; definida mas adelante), aclaramiento (CL), volumen de distribution (Vd), y semivida (t%). Para este fin, a ratas Sprague-Dawley machos de 8 semanas de edad se las administro una unica dosis intravenosa (IV) equivalente a 3 mg/kg de base libre o dosis p.o. unicas escalantes (sonda esofagica) de compuesto de ensayo equivalentes a 10, 30 y 100 mg/kg de base libre. Se utilizaron tres ratas por cada uno de los grupos de dosificacion. La sangre se recogio a lo largo de un periodo de 24 horas. Los instantes para la recogida de sangre despues de la administration intravenosa fueron: 0, 2,5, 5, 10, 15, 30, 45 min, 1,2, 4, 8, 12 y 24 h; instantes para la recogida de sangre despues de administraciones p.o. fueron: 0, 5, 15, 30, 45 min, 1,2,3, 4, 8, 12 y 24 h. Se analizaron muestras de plasma para los niveles de compuestos mediante LC-MS/MS en PPD. Los datos en bruto se analizaron mediante analisis no compartimental en Win-nonLin para calcular Vd,% de F, CL y t1/2.

Los niveles en plasma en ratas tras una unica dosis intravenosa de 3 mg/kg (equivalente de base libre) de la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A se ilustran en la Figura. 6A. De manera similar, en la Figura 6B se ilustran los niveles en plasma en ratas a las que se administro p.o. una dosis unica de 10, 30 y 300 mg/kg (equivalente de base libre) de la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A. Diversos parametros farmacocineticos para el Compuesto A sobre la base del estudio antes mencionado se detallan en la Tabla 5 que figura a continuation.

Tabla 5 Datos PK en ratas para el Compuesto A

Dosis (mg/kg): Via AUClast (h*ng/mL) % de F t1/2 (h) Cmax (ng/mL) CL (mL/h/kg) Vd (mL/kg)

Sal: Base Libre

3,72: 3 IV 1798 ±42,7 N/A 1,4 ± 0,1 7274 ±139 1666 ±38,5 3481 ± 232

12,4: 10 PO 2982 ± 228 50 ± 3,8 1,2 ± 0,4 1289±271 3387 ± 277 13283±1929

37,2: 30 PO 8251 ± 388 46 ± 2,5 2,3 ± 0,3 2870 ± 355 4009 ±509 13532±3291

124: 100 PO 29606±1748 49 ± 2,7 2,6 ± 0,1 9393 ± 742 3393 ± 209 13101 ±1518

Notas: Valores medios para el analisis no compartimental (N=3 ratas) BLD Debajo del L'lmite de Deteccion (<0,5nglmL) BLQ Debajo del Limite de Cuantificacion

%de F -AUC PO X 100 dosis normalizada AUC IV AUClast = Area bajo la curva de Concentracion/Tiempo en el ultimo dato de punto

Tal como se refleja en las Figuras 6A y 6B, asi como en la Tabla 5, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A tiene un perfil farmacocinetico favorable para el desarrollo de farmacos como una chaperona farmacologica. En particular, la forma de sal hidrocloruro de Compuesto A muestra una buena biodisponibilidad oral (~ 50%) y proporcionalidad de la dosis, una semivida de 1,0 a 2,5 horas y un volumen de distribucion que sugiere una penetration adecuada en los tejidos perifericos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado de 5-(fluorometil)piperidina-3,4-diol, 5-(clorometil)piperidina-3,4-diol, o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos, o cualquier combinacion de dos o mas de los mismos, para uso en prevenir y/o tratar trastornos del almacenamiento lisosomal en un paciente en riesgo de desarrollar o

5 diagnosticado con el mismo.
2. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el compuesto es (3R,4R,5S)-5- (fluorometil)piperidina-3,4-diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo.
3. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el compuesto es (3R,4R,5S)-5- (clorometil)piperidina-3,4-diol o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo.

10 4. Un compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el trastorno del

almacenamiento lisosomal esta asociado con la acumulacion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en glicolfpido, glicoesfingolfpido y glucocerebrosido.
5. Un compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el trastorno del almacenamiento lisosomal esta asociado con una deficiencia en la glucocerebrosidasa.

15 6. Un compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el trastorno del

almacenamiento lisosomal esta asociado con una mutacion en la glucocerebrosidasa.
7. Un compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el trastorno del almacenamiento lisosomal es la enfermedad de Niemann-Pick o la enfermedad de Gaucher.
8. Un compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el compuesto se 20 administra en combinacion con al menos otro agente terapeutico.
9. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde el compuesto se administra en combinacion con imiglucerasa o 1,5-(butilimino)-1,5-didesoxi-D-glucitol.