ES2563763T3 - Método para la purificación de un glicano y/o un glicoconjugado mediante cromatografía usando un algodón que comprende la fase estacionaria - Google Patents
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Abstract
Un método de purificación de un glicano y/o glicoconjugado que comprende los pasos de: (a) proporcionar una fase estacionaria que comprende algodón; (b) aplicar una muestra que contiene un glicano y/o glicoconjugado a la fase estacionaria; (c) lavar la fase estacionaria con un primer disolvente; y (d) eluir el glicano y/o glicoconjugado de la fase estacionaria con un segundo disolvente.
Description
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Purificación de los glicopéptidos usando micropuntas con algodón para HILIC SPE
Se evaluó el potencial del algodón como fase estacionaria en la HILIC SPE de los glicopéptidos de IgG. Con este fin, un pequeño trozo de un disco de lana de algodón (aproximadamente 500 g) se envasó en el extremo de una punta de pipeta (Figura 1). Del disco de algodón (A), se toman aproximadamente 500 g (B) y se empujan en una punta de pipeta de 10 l utilizando una aguja metálica roma (C). El algodón se empuja hacia abajo hasta la parte final de la punta (D).
Las micropuntas de SPE obtenidas se probaron para el modo de enriquecimiento HILIC de los glicopéptidos de IgG. Específicamente, se añadió acetonitrilo a una alícuota de una digestión tríptica de IgG de plasma humano, y los glicopéptidos se adsorbieron a la fase estacionaria de HILIC SPE. Tras tres lavados con 10 l de acetonitrilo al 83% que contenían un 0,1% de TFA, los glicopéptidos retenidos se eluyeron directamente sobre una placa MALDI con 2 l de agua, seguido de la realización del perfil en MALDI-TOF-MS de los N-glicopéptidos del Fc de IgG.
Ejemplos de los perfiles de glicopéptidos registrados por MALDI-TOF MS en modo reflectrón y en modo lineal se muestran en la Figura 2. Los perfiles de N-glicosilación de IgG1 e IgG2 obtenidos fueron muy similares a los obtenidos previamente tras la preparación de los glicopéptidos de IgG en placas de muestras de 96 pocillos usando un desalado de SPE de fase inversa o una purificación con Sepharose HILIC SPE (Figura 3).
La Figura 2 muestra los perfiles de espectrometría de masas MALDI-TOF de los glicopéptidos de IgG preparados usando micropuntas con algodón para HILIC SPE. Los espectros de masas se registraron en modo reflectrón utilizando como matriz CHCA (A) y en modo lineal usando como matriz DHB (B). Los glicopéptidos de IgG1 e IgG2 están representados por flechas continuas y discontinuas, respectivamente: cuadrado, N-acetilglucosamina; triángulo, fucosa; círculo oscuro, manosa; círculo claro, galactosa; rombo, ácido N-acetilneuramínico; pep, porción peptídica.
Los perfiles de MALDI-TOF-MS obtenidos a partir de eluciones en blanco utilizando las micropuntas con algodón para HILIC SPE se encontró que eran prácticamente idénticos a los controles de matriz MALDI (solamente matriz, sin muestra añadida), y no se detectaron picos contaminantes relacionados con la lana de algodón en el perfil de MALDI-TOF-MS (datos no mostrados).
Validación de algodón para HILIC SPE
Una micropunta con algodón para HILIC SPE se utilizó 8 veces para la purificación de glicopéptidos de una agrupación de digestiones trípticas de IgG seguido de un MALDI-TOF-MS en modo reflectrón de los glicopéptidos eluidos (como se muestra en las Figuras 4A y 4B).
Este experimento se repitió en cuatro días diferentes, utilizando una nueva punta de HILIC SPE de algodón para cada experimento. En otro conjunto de experimentos, se utilizaron 8 puntas diferentes para realizar los perfiles de Nglicosilación del Fc de IgG de la agrupación de digestiones trípticas de IgG mencionada (como se muestra en las Figuras 4C y 4D). Este experimento se repitió en cuatro días diferentes utilizando puntas nuevas para cada experimento. Se obtuvieron perfiles de N-glicosilación del Fc de IgG altamente reproducibles con HILIC SPE de algodón, independientemente de la utilización de la misma punta varias veces o de si se usaron diferentes puntas para la purificación y enriquecimiento a escala micro.
La figura 4 muestra la repetibilidad de las micropuntas con algodón para HILIC SPE para la desalinización y purificación de glicopéptidos de IgG. El análisis se realizó por MALDI-TOF-MS en modo reflectrón con una matriz de CHCA. Una agrupación de digestiones trípticas de IgG se desaló 8 veces, con una sola micropunta HILIC de algodón (A y B) o con ocho micropuntas HILIC de algodón diferentes (C y D). El experimento se repitió en cuatro días diferentes.
Validación del método completo
Los perfiles de N-glicosilación del Fc de las IgG se llevaron a cabo en paralelo en ocho alícuotas de plasma de un individuo control. Esto implicó la captura en proteína A, la neutralización del eluato, la escisión usando TPCKtripsina, HILIC SPE con algodón, y el análisis de MALDI-TOF-MS. Este procedimiento se repitió en tres días diferentes. Se realizaron análisis de espectrometría de masas en modo reflectrón y modo lineal, y se demostró que los perfiles de N-glicosilación del Fc tanto de la IgG1 (como se muestra en las figuras 3A y 3B) como de IgG2 (como se muestra en las figuras 5A, 5B, 6A y 6B) pudieron registrarse con una baja variabilidad intradía e interdía.
Junto al material de algodón que se ha mencionado anteriormente, se utilizaron otras dos marcas de discos de lana de algodón para la preparación de las micropuntas de HILIC SPE y la realización de los perfiles de N-glicosilación del Fc de las IgG. Las tres marcas de discos de algodón proporcionaron resultados muy similares tanto para IgG1 (Figuras 3A y 3B) como para IgG2 (como se muestra en las figuras 5A, 5B, 6A y 6B).
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(R72PTGEVYDIEIDTLETTCHVLDPTPLANCSVR103); (B) ~, péptido de la fetuina H313TFSGVASVESSSGEAFHVG K333; *, aducto de sodio; ¥, aducto de potasio; cuadrado, N-acetilglucosamina; triángulo, fucosa; círculo oscuro, manosa; círculo claro, galactosa; rombo, ácido N-acetilneuramínico.
5 La Figura 12 (espectros A y B) muestra los espectros de MALDI-TOF-MS en el modo de ion negativo lineal de los glicopéptidos trípticos (A) y los N-glicanos liberados con PNGasa F (B) de los glicopéptidos de la apo-transferrina humana (número de registro SwissProt: P02787). Los glicopéptidos y glicanos se purificaron mediante micropuntas con algodón para HILIC SPE y se midieron en una placa para la diana AnchorChip con DHB. (A) flechas continuas, glicopéptido de masa molecular pequeña (C421GLVPVLAENYNK433); flechas discontinuas, glicopéptido de masa
10 molecular grande (Q622 (QQHLFGSNVTDCSGNFCLFR642); ¥, productos de desintegración post-fuente; *, pérdida de amoníaco por la degradación peptídica en N-terminal durante la digestión proteolítica (B) *, aducto de sodio; ¥, aducto de potasio; cuadrado, n-acetilglucosamina; triángulo, fucosa; círculo oscuro, manosa; círculo claro, galactosa, rombo, ácido N-acetilneuramínico.
15 Por lo tanto, estos experimentos demostraron el éxito de la limpieza de las muestras de N-glicano liberadas meiiante HILIC SPE con algodón para el análisis MALDI-TOF-MS, eliminándose los detergentes y las sales.
El listado o la discusión en esta especificación de un documento claramente publicado previamente no necesariamente debe tomarse como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o que
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