ES2562818T3 - Procedimiento de inactivación del virus de la gripe - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de inactivación de un virus de la gripe propagado en cultivo celular y de inactivación de virus adventicios contaminantes, que comprende al menos las etapas siguientes: (a) tratar un fluido que contiene virus de la gripe con beta-propiolactona, y (b) irradiar el fluido que contiene virus de la gripe con luz UV.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de inactivacion del virus de la gripe Campo tecnico

La presente invention se refiere a un procedimiento de inactivacion de virus de la gripe y virus adventicios contaminantes producidos en cultivo celular. El procedimiento de la invencion es simple y facil de implementar. En particular, puede ser insertado adecuadamente en cualquier procedimiento de purification de virus.

Antecedentes tecnicos

Debido a la gran cantidad de enfermedades causadas por virus, la virologfa ha sido un campo estudiado intensamente. Siempre ha existido una demanda para producir virus de manera eficiente con el fin de aislar y purificar protemas virales, para generar vacunas, para preparar herramientas de analisis o para proporcionar virus para estudios de laboratorio.

Recientemente, se han desarrollado tecnologfas, basadas en cultivo celular como una alternativa a los sistemas de production derivados del huevo, tradicionales.

Los sistemas de cultivo celular aparecen como un modo alternativo adecuado de preparation de vacunas, en particular, mas simple, flexible, consistente, permitiendo mejorar las posibilidades de aumentar la escala de las capacidades de produccion de vacunas y, de esta manera, abarcar grandes cantidades de virus, si es necesario, en particular, en el caso de una amenaza de pandemia o un ataque terrorista.

Independientemente del modo de produccion, el virus, en particular, si esta destinado a ser usado para la vacunacion, debe ser seguro y por lo tanto es necesario reducir o eliminar la infectividad. Esto puede requerir que el virus sea atenuado. De manera alternativa esto puede requerir que el virus sea purificado e inactivado. Aunque es necesario reducir de manera irreversible, tanto como sea posible, la infectividad del virus, sin embargo debe preservarse su inmunogenicidad. Tambien es esencial que las vacunas esten libres de agentes adventicios, ya que el anfitrion para la produccion del virus, tal como huevos o cultivos de celulas, puede haber sido contaminado con los virus durante su cultivo. En la tecnica se conocen diferentes agentes de inactivacion, tales como detergentes, o agentes qmmicos, tales como formaldeddo y beta-propiolactona (BPL). Sin embargo, puede haber problemas asociados con respecto al uso de dichos agentes: (i) muy frecuentemente, el uso de estos agentes no permite una inactivacion completa de la suspension de virus a tratar, ya que frecuentemente se ha informado acerca de una infectividad residual significativa; (ii) los detergentes deben ser usados con precaution ya que pueden tener un impacto perjudicial sobre la estructura de las protemas virales, que puede ser esencial para la inmunogenicidad del virus, su desnaturalizacion inducida por detergente, lo que conduce, finalmente, a una eficacia deteriorada de la vacuna, debido a la perdida de inmunogenicidad; (iii) los agentes qmmicos, tales como BPL y formaldeddo, deben ser manipulados con cuidado y requieren equipos espedficos para su manipulation, ya que frecuentemente son productos nocivos y presentan riesgos para la salud de las personas que los manipulan; (iv) el formaldeddo, en particular, una manera estandar de inactivacion de virus, generalmente requiere tiempos de incubation prolongados para la inactivacion de un virus, de 1 a varios dfas, y se conoce que es responsable tambien de la agregacion de protemas, agregacion que puede afectar negativamente a las etapas subsiguientes requeridas para la purificacion de virus; (iv) los detergentes y los agentes qmmicos deben ser eliminados de la suspension de virus despues de su uso, anadiendo de esta manera complejidad a los procedimientos de purificacion de virus. La implementation de estas tecnicas de inactivacion de un ortomixovirus puede conducir ademas a que todavfa haya presente una infectividad residual significativa.

La luz UV se conoce tambien en la tecnica como un medio para la inactivacion de virus infecciosos. Por ejemplo, el documento WO 2008/039494 divulga un dispositivo y procedimientos de inactivacion de virus infecciosos, tales como virus de la gripe, y agentes de inactivacion adventicios potenciales, tales como virus adventicios, con luz ultravioleta (UV). Sin embargo, el documento WO 2008/039494 ensena tambien que el tratamiento UV no proporciono una inactivacion significativa de los virus adventicios que ensayaron realmente.

Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de proporcionar procedimientos alternativos de inactivacion de virus de la gripe, que sean simples de implementar y que permitan conseguir una inactivacion completa del virus, ya que la infectividad residual no es aceptable o seguridad de la vacuna, cuyo procedimiento debena ser util tambien para inactivar posibles virus adventicios, que pueden contaminar el fluido que comprende el virus de interes.

Sumario de la invencion

El procedimiento segun la presente invencion proporciona un procedimiento de inactivacion de un virus de la gripe que supere los inconvenientes indicados anteriormente. En particular, el procedimiento de la invencion permite conseguir un alto nivel de inactivacion de virus, mientras se conserva la antigenicidad del virus.

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En un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un procedimiento de inactivacion de un virus de la gripe propagado en cultivo celular y de inactivacion de virus contaminantes adventicios que comprende al menos las siguientes etapas:

(a) tratar un fluido que contiene virus de la gripe con beta-propiolactona, y

(b) irradiar el fluido que contiene virus de la gripe con la luz UV.

En un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un procedimiento para la preparacion de una vacuna que comprende un virus de la gripe propagado en cultivo celular que comprende las siguientes etapas:

(a) tratar un fluido que contiene virus de la gripe y virus contaminantes adventicios con beta-propiolactona,

(b) irradiar el fluido que contiene virus de la gripe y virus contaminantes adventicios con luz UV, y

(c) formular el virus de la gripe tratado con beta-propiolactona e irradiado con UV en una vacuna.

La presente divulgacion describe tambien un virus obtenible segun el procedimiento de la invencion.

La presente divulgacion describe ademas una composicion inmunogenica que comprende un virus obtenido segun la presente invencion mezclado con un vedculo farmaceutico adecuado.

La presente divulgacion describe ademas una composicion inmunogenica que comprende un virus obtenido segun la presente invencion para uso en medicina. En particular, se describe una composicion inmunogenica para su uso en la prevencion o el tratamiento de infecciones asociadas con ortomixovirus.

Descripcion detallada

La presente divulgacion se refiere a un procedimiento mejorado de inactivacion de virus que puede ser aplicado a la produccion de virus tanto a pequena como a gran escala. El procedimiento descrito en la presente memoria es aplicable, en particular, a virus derivado de huevos y virus derivado de cultivo celular. El procedimiento implica la implementacion de al menos una etapa de inactivacion, con al menos dos agentes de inactivacion distintos. Mas espedficamente, el procedimiento descrito en la presente memoria se basa en la combinacion de un tratamiento ffsico, tal como irradiacion UV, y un tratamiento qmmico, en particular un tratamiento que implica una etapa de alquilacion, tal como con BPL, con el fin de inactivar los virus. Opcionalmente, dicho procedimiento comprende ademas una etapa de division basada en detergente.

Los presentes inventores encontraron que la combinacion espedfica de medios de inactivacion tal como se divulga en la presente memoria, combinando un tratamiento ffsico y un tratamiento qmmico, permiffa conseguir una inactivacion de virus mas completa, es decir, la eliminacion de la infectividad residual que puede estar asociada con los tratamientos de la tecnica anterior. Los presentes inventores observaron sorprendentemente que esta combinacion, ademas de proporcionar una inactivacion completa del virus, no afecta a la integridad de las protemas virales producidas, ni a su antigenicidad. El virus resultante, independientemente de si es purificado adicionalmente o no, es adecuado para su uso en una composicion inmunogenica, tal como una composicion de vacuna.

El procedimiento reivindicado tiene una o mas de las siguientes ventajas: (i) optimiza la accesibilidad del virus para el tratamiento, independientemente de si el virus esta agregado o no, si esta atrapado o no dentro de los restos celulares, si la conformacion o las condiciones ambientales son optimas o no para una etapa de inactivacion de virus; (ii) reduce el riesgo de que una fraccion de virus pueda escapar de la inactivacion cuando solo se realiza una etapa de inactivacion consiguiendo de esta manera una inactivacion mas completa del virus; (iii) reduce el riesgo de inactivacion incompleta asociado con la resistencia que el virus pueda exhibir contra un tratamiento espedfico, independientemente de si esta resistencia esta vinculada a la naturaleza del virus o las condiciones experimentales/ambientales del tratamiento. Este puede ser el caso cuando, por ejemplo, solo una fraccion de los virus dentro de una suspension de virus puede ser inactivada por un agente qmmico a una concentracion determinada pero, por razones de seguridad o por razones de inmunogenicidad, en particular, puede ser imposible aumentar adicionalmente la concentracion del agente de inactivacion. Una ventaja adicional del procedimiento reivindicado es que la implementacion de la irradiacion UV puede permitir disminuir la cantidad de agente qmmico que se usa, en comparacion con la situacion en la que la inactivacion se realiza solo usando el agente qmmico; (iv) reduce el tiempo requerido para inactivar el virus producido, en comparacion con los tratamientos de la tecnica anterior, en particular el tratamiento basado en formaldeddo.

Cualquier agente qmmico conocido por tener un efecto inactivador de virus puede ser usado en el procedimiento descrito en la presente divulgacion, tal como por ejemplo un agente de alquilacion (por ejemplo, BPL). Se usa BPL en el procedimiento de la invencion, ya que, ademas de su capacidad de inactivacion, presenta la ventaja de degradar acidos nucleicos, tales como ADN. Esta capacidad adicional es de particular importancia si el virus producido en cultivos de celulas tal como se describe en la presente memoria va a ser incluido en una vacuna. En efecto, por razones de

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seguridad, el contenido de ADN residual, que se origina a partir de la celula huesped usada para propagar el virus, debe mantenerse lo mas bajo posible y su tamano, lo mas pequeno posible. BPL es un agente de mono-alquilacion que reacciona con diversas moleculas biologicas, en particular, modifica las bases nucleicas del genoma viral y bloquea su replicacion. Puede ser inactivado rapidamente alentando a 37°C durante 2 horas ya que se hidroliza completamente a productos no toxicos acido beta-hidroxipropionico y un isomero de lactato. El procedimiento de inactivacion de un virus de la gripe de la presente invention comprende al menos una etapa de tratar un fluido que contiene el virus con BPL (tratamiento BPL) y una etapa de irradiar el fluido que contiene el virus con luz UV (irradiation UV). En una realization, el tratamiento BPL y la irradiacion UV se realizan secuencialmente, en cualquier orden. Por ejemplo, el tratamiento BPL puede preceder a la irradiacion UV, o puede seguirla. De manera alternativa, en el procedimiento descrito en la presente description, las etapas de tratamiento BPL y de irradiacion UV pueden ser implementadas de manera simultanea. Esto presenta la ventaja adicional de simplificar y acortar el procedimiento gracias al ahorro de una etapa extra. Ademas, las etapas de tratamiento BPL y de irradiacion UV pueden estar separadas por otras etapas de purification, o pueden ser implementadas de una manera sucesiva, en el sentido de que el tratamiento BPL es seguido inmediatamente por el tratamiento UV o el tratamiento UV es seguido inmediatamente por el tratamiento BPL, sin ninguna etapa de purificacion adicional entre los mismos.

Las expresiones "fluido que contiene el virus", tal como un fluido que contiene ortomixovirus, "fluido que comprende un virus" son sinonimas y deben entenderse como cualquier preparation lfquida que comprende un virus, independientemente de su estado de purificacion. El fluido puede no haber sido purificado en absoluto. Por ejemplo, el fluido puede ser el sobrenadante del cultivo celular recogido despues de que las celulas se infectaron con un virus y el virus se replico y se libero en el medio. De manera alternativa, el fluido puede haber sido parcialmente purificado. Por ejemplo, el fluido que contiene el virus puede haber sido clarificado previamente, mediante filtration o mediante centrifugation, antes de ser sometido a inactivacion mediante un tratamiento de BPL y una irradiacion UV.

La inactivacion del virus puede conseguirse con menos del 1% de BPL. En una realizacion de la invencion, BPL se usa a una concentration que vana del 0,01% al 0,1%, o del 0,03% al 0,8%, o es del 0,05%. La BPL se anade apropiadamente a una solution tamponada y el pH de la solution se mantiene entre 6 y 10. Debido a que se conoce que la actividad de BPL es particularmente sensible al pH, el pH de la solucion tampon se mantiene entre 6 y 9, adecuadamente entre 7 y 8, y mas adecuadamente entre 7,4 y 8. En un aspecto de la divulgation, puede anadirse BPL a una solucion tampon fosfato 66 mM - citrato 125 mM pH 7,4. La BPL es activa a una temperatura comprendida entre 4°C y la temperatura ambiente. En un aspecto de la divulgacion, la temperatura de incubation de BPL puede ser de 4°C. En un aspecto distinto de la divulgacion, la temperatura de incubacion de BPL puede ser la temperatura ambiente. En el sentido de la presente divulgacion, temperatura ambiente debe entenderse como una temperatura comprendida entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 24°C. El tiempo de incubacion puede variar entre una hora y unos pocos dfas. En un aspecto de la divulgacion, la BPL puede ser anadida durante la noche. En el sentido de la presente divulgacion, una incubacion durante la noche significa un tiempo de incubacion de al menos 8 horas, posiblemente de 12-16 horas. En un aspecto de la divulgacion, la BPL puede ser anadida a una concentracion del 0,05% a 4°C durante la noche. En un aspecto distinto de la divulgacion, la BPL puede ser anadida a una concentracion del 0,05% a temperatura ambiente durante la noche. Despues de anadir BPL y dejarla reposar durante el penodo de tiempo apropiado a temperatura ambiente, la suspension de virus tratada con BPL puede ser almacenada a 4°C durante unos pocos dfas, tal como por ejemplo tres dfas, antes de una purificacion adicional de la suspension de virus, si es necesaria.

La irradiacion UV adecuada se produce mediante una luz tipo C, es decir, luz con una longitud de onda de 100 a 280, adecuadamente de 200 y 270 nm, y mas adecuadamente de 254 nm que es el area de absorcion maxima por los acidos nucleicos de los virus tratados. Durante la inactivacion UV, la energfa de excitation de la radiation de longitud de onda UV altera los enlaces covalentes de las bases purina y pirimidina, lo que resulta en danos al virus objetivo, asf como agentes extranos y carga biologica bacteriana. La dosis o fluencia de UV puede variar, en particular, de 50 a 500 J/m2. La presente invencion contempla cualquier dosis UV que conduce a la inactivacion de virus. Segun una realizacion del procedimiento de la presente invencion, la fluencia UV oscila de 50 a 500 J/m2, de 100 a 400 J/m2 o es de 200 julios/m2 o es de 100 julios/m2. En un aspecto de la divulgacion, la fluencia UV puede ser de 60 julios/m2. Los dispositivos comerciales disponibles para la irradiacion UV permiten gestionar de volumenes pequenos a volumenes muy grandes de lfquido. Solo como una ilustracion, puede citarse el dispositivo siguiente: UVIVATEC™ (De Bayer).

Las condiciones BPL y las fluencias UV se determinaran con el fin de lograr las condiciones optimas para la inactivacion de virus, segun la cantidad y el tipo de virus que debe ser inactivado. La persona con conocimientos en la materia puede usar cualquier ensayo conocido en la tecnica para evaluar la inactivacion viral, tal como midiendo la dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50/ml), que representa la cantidad de un virus capaz de infectar el 50% de las celulas. En este ensayo, un cultivo de celulas se califica como infectado o no, permitiendo determinar una titulacion del virus, como la medida de la infectividad del virus. Se realizan una serie de diluciones sucesivas de las muestras infecciosas a ensayar y parte de cada dilution se usa para inocular celulas infectables adecuadas. Despues de incubar las celulas durante unos pocos dfas, de manera que el virus, si es infeccioso, pueda replicarse, la presencia del virus puede ser detectada mediante dos procedimientos de lectura conocidos por la persona con conocimientos en la materia, el analisis del efecto citopatico

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(CPE) en celulas y/o el ensayo de hemaglutinacion con globulos rojos de pollo realizados sobre el sobrenadante del cultivo. A continuacion, el tftulo viral se calcula segun el procedimiento de Reed y Muench (Reed, L. J. y Muench, H., 1938, The American Journal of Hygiene 27: 493-497). Si se desea conservar la antigenicidad y la inmunogenicidad, la persona con conocimientos en la materia adaptara las condiciones de inactivacion del virus con el fin de no alterar la conformacion o la estructura de las protemas vmcas. En paralelo con los ensayos de inactivacion, controlara la integridad del virus, o de sus protemas espedficas, mediante cualquier tecnica conocida en la materia. Las tecnicas que pueden citarse como ejemplos ilustrativos son cualquier tecnica de deteccion de protemas, tal como analisis de transferencia Western con anticuerpos espedficos o ensayos de umbral. En el caso particular del virus de la gripe, el contenido de la protema HA, conocida como inmunogenica, puede ser supervisado espedficamente mediante el ensayo SRD (ensayo de inmunodifusion radial simple), que es una tecnica familiar para una persona con conocimientos en la materia (J. M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)). Debido a que el ensayo SRD se basa en la formacion de complejos anticuerpo/antfgeno, dicho ensayo, cuando se evalua el nivel de HA a partir de una suspension de virus de la gripe, permite analizar si el tratamiento de inactivacion de esa suspension afecta negativamente a la antigenicidad del virus.

Ademas de inactivar el virus de la gripe, el procedimiento de inactivacion de la presente invention permite tambien la inactivacion de posibles virus adventicios que pueden contaminar el fluido que contiene virus de la gripe. En particular, estos virus pueden haber estado presentes en el huesped que produce el virus de la gripe, o pueden haber contaminado el fluido que contiene virus de la gripe durante su purification, en cualquier etapa. Las autoridades reguladoras, por ejemplo en el campo de la vacunacion, son cada vez mas estrictas e imponen que las vacunas sean ensayadas contra numerosos virus potenciales contaminantes. A modo de ejemplos de dichos virus, pueden citarse PPV (parvovirus porcino), MuLV (virus de leucemia murina), PRV (virus de la pseudorrabia porcina) y HAV (virus de Hepatitis A). Los parvovirus son virus de ADN pequenos, sin envoltura, que infectan a una gran cantidad de especies animales. Son extremadamente resistentes, en particular, a tratamientos qmmicos. El procedimiento segun la invencion permite inactivar una amplia gama de virus adventicios, tales como, pero sin limitarse a, MuLV, PRV, HAV y PPV. En particular, el procedimiento de la presente invencion se usa para inactivar al menos uno entre los MuLV, PRV, HAV y PPV contaminantes, o cualquier combination de los mismos a partir de virus de la gripe producido en cultivo celular. En un aspecto de la divulgation, el procedimiento descrito en la presente memoria puede ser usado para inactivar todos ellos. La elimination de virus adventicios, cuando esta relacionado con virus contaminantes, se denomina frecuentemente eliminacion vmca. Por consiguiente, en el sentido de la presente divulgacion, "eliminacion vmca" debe entenderse como la capacidad de eliminar virus adventicios que puedan contaminar la suspension del virus de interes. La eliminacion vmca puede ser supervisada y evaluada mediante cualquier procedimiento adecuado que permita detectar la presencia de un virus determinado. Por ejemplo, la evaluation puede ser directa, es decir, la presencia del virus endogeno, si esta presente como un contaminante, puede ser detectada directamente a partir de la suspension de virus a ser ensayada, mediante PCR, por ejemplo, usando cebadores especficos para el genoma del virus contaminante de interes. Sin embargo, por razones de sensibilidad, debido a se espera que los virus contaminantes esten presentes solo a un nivel muy bajo, si existe, puede ser mas adecuado el uso de una evaluacion indirecta que depende, por ejemplo, de la adicion de virus exogeno. En ese caso, la suspension de virus a ser inactivada se enriquece con el virus adventicio de interes, es decir, con una cantidad conocida del virus adventicio para el cual debe determinarse la eliminacion vmca. El enriquecimiento ocurre antes de la implementation de cualquier etapa de inactivacion de virus, de manera que se tenga una cantidad suficiente de virus para servir de referencia antes de la inactivacion y posiblemente purificacion. A continuacion, la etapa de inactivacion de interes se lleva a cabo sobre la suspension de virus enriquecida, por ejemplo, el procedimiento de inactivacion descrito en la presente memoria. La titulacion de virus se determina antes y despues de la implementacion del procedimiento de inactivacion sobre la suspension de virus enriquecida, de manera que la infectividad del virus adventicio usado para el enriquecimiento pueda ser evaluada y, de esta manera, la eficacia del procedimiento de inactivacion pueda ser evaluada. Las etapas de purificacion pueden estar asociadas con las etapas de inactivacion y, de esta manera, la combinacion de las mismas puede ser evaluada tambien sobre la infectividad de un virus adventicio de interes.

El virus obtenido usando el procedimiento de la presente invencion puede ser usado para cualquier proposito; incluyendo, por ejemplo, la purificacion de protemas virales, ensayos de analisis, infection de celulas huesped, propositos de diagnostico o usos terapeuticos o profilacticos, tales como vacunacion y administration clmica. En particular, el virus obtenido usando el procedimiento de la presente invencion puede ser adecuado para su uso en una composition inmunogenica, tal como en una vacuna.

Segun un aspecto de la divulgacion, el procedimiento descrito en la presente memoria puede ser aplicado a otros virus, en particular, a cualquier virus que es capaz de infectar celulas y usarlas para su replication, incluyendo, pero sin limitarse a, adenovirus, hepadnavirus, virus del herpes, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, picornavirus, poxvirus, reovirus y retrovirus. En particular, el procedimiento descrito en la presente memoria es adecuado para los virus con envoltura, tales como mixovirus.

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Por consiguiente, los virus o antigenos virales pueden ser derivados de un ortomixovirus, tales como el virus de la gripe. Los antigenos de ortomixovirus pueden ser seleccionados entre una o mas protemas virales, incluyendo hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleoprotema (NP), protema de matriz (M1), protema de membrana (M2), una o mas de la transcriptasa (PB1, PB2 y PA). Los antigenos particularmente adecuados incluyen HA y NA, las dos glicoprotemas de superficie que determinan la especificidad antigenica de los subtipos de gripe.

El virus de la gripe se selecciona del grupo que consiste en virus de gripe humana, virus de gripe aviar, virus de gripe equina, virus de gripe porcina (por ejemplo, cerdos), virus de la gripe felina. El virus de la gripe se selecciona mas particularmente entre las cepas A, B y C, preferiblemente entre las cepas A y B.

El virus de la gripe o sus antfgenos pueden ser derivados de cepas de gripe interpandemicas (anuales o estacionales). De manera alternativa, el virus de la gripe o sus antfgenos pueden ser derivados a partir de cepas con potencial para causar un brote pandemico (es decir, cepas de la gripe con nueva hemaglutinina en comparacion con la hemaglutinina en las cepas que circulan actualmente, o cepas de la gripe que son patogenicas en sujetos aviares y que tienen el potencial de ser transmitidos horizontalmente en la poblacion humana, o cepas de la gripe que son patogenicas para los seres humanos). Dependiendo de la estacion particular y de la naturaleza del antfgeno incluido en la vacuna, el virus de la gripe o sus antfgenos pueden derivarse de uno o mas de los siguientes subtipos de hemaglutinina: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. Preferiblemente, el virus de la gripe o sus antfgenos son de los subtipos H1, H2, H3, H5, H7 o H9.

Las celulas que pueden sr usadas en el procedimiento descrito en la presente memoria puede ser, en principio, cualquier tipo de celula deseado entre celulas que pueden ser cultivadas en cultivo celular y que pueden soportar la replicacion del virus. Pueden ser tanto celulas de crecimiento adherente como celulas de crecimiento en suspension. Pueden ser celulas primarias o lmeas celulares continuas. Se prefieren las lmeas celulares geneticamente estables.

Las celulas de mairnfero son particularmente adecuadas, por ejemplo, celulas humanas, de hamster, de ganado vacuno, de mono o de perro.

Una serie de lmeas celulares de mamnfero son conocidas en la tecnica e incluyen PER.C6, celulas HEK, celulas de rinon embrionario humano (celulas 293), celulas HeLa, celulas CHO, celulas Vero y celulas MDCK.

Las celulas de mono adecuadas son, por ejemplo, celulas de mono verde africano, tales como celulas de rinon como en la lmea celular Vero. Las celulas de perro adecuadas son, por ejemplo, celulas de rinon como en la lmea celular MDCK.

Las lmeas celulares de mamffero adecuadas para el cultivo de virus de la gripe incluyen celulas MDCK, celulas Vero o celulas PER.C6. Todas estas lmeas celulares estan ampliamente disponibles, por ejemplo, de la coleccion American Type Cell Culture (ATCC).

En un aspecto de la divulgacion, el procedimiento descrito en la presente memoria puede usar celulas MDCK. La lmea celular MDCK original esta disponible en la ATCC como CCL-34, pero pueden usarse tambien derivados de esta lmea celular, tales como las celulas MDCK adaptadas al crecimiento en suspension (WO 1997/37000).

De manera alternativa, las lmeas celulares para su uso en la invention pueden ser derivadas a partir de fuentes aviares, tales como pollo, pato, ganso, codorniz o faisan. Las lmeas celulares aviares pueden ser derivadas a partir de una diversidad de etapas de desarrollo incluyendo las de embrion, polluelo y adulto. En particular, las lmeas celulares pueden ser derivadas a partir de las celulas embrionarias, tales como fibroblastos de embriones, celulas germinales u organos individuales, incluyendo tejidos neuronal, cerebral, de retina, renal, hepatico, cardfaco, muscular o extraembrionarios y membranas que protegen el embrion. Pueden usarse fibroblastos de embrion de pollo (CEF). Los ejemplos de lmeas celulares aviares incluyen celulas madre embrionarias aviares (WO01/85938) y celulas de retina de pato (WO05/042728). En particular, la lmea celular EB66® derivada de celulas madre embrionarias de pato se contempla en la presente invencion (WO 2008/129058). Otras celulas madre embrionarias aviares adecuadas incluyen la lmea celular EBx derivada a partir de celulas madre embrionarias de pollo, EB45, EB14 y EB14-074 (WO2006/108846). Esta lmea celular EBx presenta la ventaja de ser una lmea celular geneticamente estable cuya creation se ha producido de manera natural y no requiere ninguna modification genetica, qmmica o viral. Estas celulas aviares son particularmente adecuados para el cultivo de virus de la gripe.

Segun una realization particular, el procedimiento de la invencion usa celulas EB66®.

Las condiciones de cultivo celular (temperatura, densidad celular, valor del pH, etc.) son variables en un amplio rango debido a la idoneidad de las celulas empleadas y pueden adaptarse a los requisitos de condiciones de crecimiento de virus particulares. La determination de las condiciones de cultivo apropiadas esta dentro de las capacidades de la persona con conocimientos en la materia, ya que el cultivo de celulas esta ampliamente documentado en la tecnica (vease, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973), y R. I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, 4a edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

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En un aspecto de la divulgacion, las celulas huesped usadas en el procedimiento descrito en la presente divulgacion pueden ser cultivadas en medios libres de suero y/o libres de protemas. Un "medio libre de suero" (SFM) significa un medio de cultivo celular preparado para ser usado que no requiere la adicion de suero, que permite la supervivencia celular y el crecimiento celular. No es necesario que este medio este qmmicamente definido y puede contener hidrolizados de diverso orfgenes, de plantas, por ejemplo. Dicho medio libre de suero presentan la ventaja de que puede descartarse la contaminacion con virus, micoplasmas o agentes infecciosos desconocidos. Se entiende que "libre de protemas" significa cultivos en los que la multiplicacion celular se produce con exclusion de protemas, factores de crecimiento, otros aditivos de protemas y protemas no sericas, pero puede incluir opcionalmente protemas tales como tripsina u otras proteasas que puedan ser necesarias para el crecimiento viral. Las celulas que crecen en dichos cultivos contienen de manera natural protemas ellas mismas.

Los medios libres de suero estan disponibles comercialmente en numerosas fuentes, por ejemplo, VP SFM (Invitrogen Ref 11681-020), Opti-Pro (Invitrogen, Ref 12309-019) o EX-CELL (JHR Bioscience).

Las celulas pueden ser cultivadas de diversas maneras, por ejemplo, en suspension, o adhiriendose a superficies, incluyendo crecimiento sobre microportadores, o sus combinaciones. El cultivo puede ser realizado en platos, matraces, botellas de cultivo rotatorias o en biorreactores, usando sistemas por lotes, de flujo discontinuo, semi-continuo o continuo, tales como sistemas de perfusion. Tfpicamente, las celulas se aumentan a partir de un vial de banco de celulas principal o de trabajo pasando por diversos tamanos de matraces o botellas de cultivo rotatorias y finalmente a los biorreactores. En un aspecto de la divulgacion, las celulas empleadas en el procedimiento descrito en la presente memoria pueden ser cultivadas sobre perlas microportadoras en un medio libre de suero en un biorreactor agitado y el medio de cultivo es proporcionado mediante perfusion.

En un aspecto distinto de la divulgacion, las celulas pueden ser cultivadas en suspension en un modo por lotes, en particular, Celulas EB66®.

Antes de la infeccion con el virus, las celulas pueden ser cultivadas a aproximadamente 37°C, mas adecuadamente a 36,5°C, a un pH que oscila desde 6,7 hasta 7,8, adecuadamente de aproximadamente 6,8 a 7,5, y mas adecuadamente de aproximadamente 7,2.

Segun la presente divulgacion, la produccion de virus basada en el cultivo de celulas incluye generalmente las etapas de inocular las celulas cultivadas con la cepa viral a ser producida y cultivar las celulas infectadas durante un penodo de tiempo deseado para permitir la replicacion del virus.

Con el fin de producir grandes cantidades de virus producido con celulas, es preferible inocular las celulas con la cepa de virus deseada una vez que las celulas han alcanzado una densidad elevada. Normalmente, la inoculacion se realiza cuando la densidad celular es al menos de aproximadamente 1,5 x 106 celulas/ml, de manera adecuada, aproximadamente de 3 x 108 celulas/ml, mas adecuadamente, de aproximadamente 5 x 108 celulas/ml, incluso mas adecuadamente 7 x 108 celulas/ml, o incluso mas alta. La densidad celular optima para obtener la produccion de virus mas alta puede variar segun el tipo de celula usada para la propagacion de virus.

La inoculacion puede ser llevada a cabo a una MOI (multiplicidad de infeccion) de aproximadamente 10-1 a 10-7, de manera adecuada de aproximadamente 10-2 a 10-6, y de manera mas adecuada, de aproximadamente 10-5.

Las condiciones de temperatura y pH para la infeccion por virus pueden variar. La temperatura puede variar de 32°C a 39°C dependiendo del tipo de virus. Para la produccion de virus de la gripe, la infeccion del cultivo celular puede variar dependiendo de la cepa que se produce. La infeccion por el virus de la gripe puede ser realizada de manera adecuada a una temperatura que vana de 32°C a 35°C, de manera adecuada a 33°C. En un aspecto de la divulgacion, la infeccion por el virus puede ocurrir a 33°C. En un aspecto distinto de la divulgacion, la infeccion por el virus puede tener lugar a 35°C. Las proteasas, tfpicamente tripsina, pueden ser anadidas al cultivo celular dependiendo de la cepa del virus, para permitir la replicacion viral. La proteasa puede ser anadida en cualquier etapa adecuada durante el cultivo. La tripsina es preferiblemente de origen no animal, es decir, la proteasa no es purificada a partir de una fuente animal. Es produce adecuadamente de manera recombinante en un microorganismo, tal como bacteria, levadura o planta. Los ejemplos adecuados de tripsina recombinante son Trypzean, una tripsina recombinante producida en mafz (Prodigen, 101 Gateway Blvd, Suite 100 College Station, Texas 77845. Codigo del fabricante: TRY), o TrpLE (Invitrogen), que es una enzima similar a tripsina expresada en hongos (WO2004/020612).

Una vez infectadas, las celulas pueden liberar al medio de cultivo partmulas de virus recien formadas, debido a una lisis espontanea de las celulas huesped, denominada tambien lisis pasiva. Por lo tanto, en un aspecto de la divulgacion, puede proporcionarse una cosecha de virus basado en celulas en cualquier momento despues de la inoculacion del virus mediante la recogida de medio de cultivo celular o sobrenadante. En un aspecto de la divulgacion, el medio de cultivo celular puede ser recogido mediante perfusion. Este modo de cosecha es especialmente adecuado cuando se desea recolectar virus derivado de celulas en diferentes puntos temporales despues de la inoculacion del virus, y combinar

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diferentes cosechas, si es necesario.

De manera alternativa, despues de la infeccion por virus, el virus basado en celulas puede ser cosechado empleando un factor externo para lisar las celulas huesped, denominado tambien lisis activa. Sin embargo, contrariamente al procedimiento anterior, dicho un modo de cosecha requiere que la cosecha viral basada en celulas sea recogida en un solo punto temporal, ya que una lisis activa de las celulas terminara inmediatamente el cultivo celular.

Se conocen procedimientos que pueden ser usados para la lisis celular activa. Los procedimientos utiles en este sentido son, por ejemplo, congelacion-descongelacion, cizalladura solida, lisis hipertonica y/o hipotonica, cizalladura ffquida, extrusion a alta presion, lisis con detergente o cualquier combinacion de los mismos.

En un aspecto de la divulgacion, puede proporcionarse una cosecha viral basada en celulas en cualquier momento despues de la inoculacion del virus recogiendo el medio de cultivo celular o sobrenadante, lisando las celulas inoculadas o ambos.

Antes de la cosecha, la infeccion de celulas puede durar de 2 a 10 dfas. En un aspecto de la divulgacion, los sobrenadantes de cultivo de los dfas 3, 4 y 5 despues de la inoculacion pueden ser cosechados y agrupados para su procesamiento posterior adicional (aislamiento del virus). En un aspecto distinto de la divulgacion, el sobrenadante del cultivo celular puede ser recogido de dfa 5 despues de la inoculacion. El momento optimo para cosechar el virus producido por celulas se basa normalmente en la determinacion del pico de la infeccion. Por ejemplo, el CPE (efecto citopatico) se mide supervisando los cambios morfologicos que ocurren en las celulas huesped despues de la inoculacion del virus, incluyendo redondeo, desorientacion, hinchazon o contraccion, muerte, desprendimiento celular de la superficie. La deteccion de un anffgeno viral espedfico puede ser supervisada tambien mediante tecnicas estandar de deteccion de protemas, tales como un analisis Western-blot. A continuacion, la cosecha puede ser recogida cuando se consigue el nivel de deteccion deseado. En el caso particular de virus de la gripe, el contenido de HA puede ser supervisado cualquier momento despues de la inoculacion de las celulas con el virus, mediante el ensayo de SRD (Wood, JM, et al. (1977). J. Biol. Estandar. 5, 237-247), que es una tecnica familiar para una persona con conocimientos en la materia. Ademas, el ensayo SRD puede ser usado tambien para determinar el intervalo de densidad celular optimo requerido para obtener un rendimiento vffico optimizado.

En el contexto de la presente divulgacion, debe entenderse que la fase de cultivo celular abarca cualquier etapa que precede a la etapa de cosecha de virus, mientras que debe entenderse que la fase de purificacion de virus abarca cualquier etapa despues de dicha etapa de cosecha. Por ejemplo, la fase de purificacion de virus de los virus basados en cultivo de celulas puede incluir una serie de diferentes etapas de filtracion, concentracion y/u otras etapas de separacion tales como ultrafiltracion, ultracentrifugacion (incluyendo ultracentrifugacion en gradiente), cromatograffa (tal como cromatograffa de intercambio ionico) y etapas de adsorcion en una diversidad de combinaciones. El procedimiento de inactivacion de virus de la presente invention puede estar asociado convenientemente con cualquier procedimiento de purificacion de virus mediante la implementation de la inactivacion qmmica y la etapa de irradiation UV en cualquier etapa adecuada.

En una realization, el procedimiento de inactivacion de la invencion comprende al menos una etapa adicional seleccionada del grupo de: clarification, mediante centrifugation o filtracion, ultrafiltracion/diafiltracion, degradation acidos nucleicos, ultracentrifugacion, en particular, ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa y cromatograffa, o cualquier combinacion de los mismos.

De manera adecuada, puede implementarse una combinacion de tratamiento BPL e irradiacion UV, en cualquier orden, despues de cualquiera de las etapas anteriores. A modo de ejemplo, puede implementarse un tratamiento BPL al principio de un procedimiento de purificacion de virus, en particular, despues de la clarificacion de la cosecha viral obtenida recogiendo el medio de cultivo celular que contiene el virus. Este tratamiento puede ser seguido inmediatamente por irradiacion UV. De manera alternativa, el tratamiento BPL y la irradiacion UV pueden estar separados por otras etapas de purificacion. La implementacion de una primera etapa de inactivacion de virus tan temprana en el procedimiento, es decir, en la cosecha clarificada, proporciona, en particular, una ventaja de seguridad en lo que se refiere a los trabajadores. De hecho, debido a que el virus del fluido que tiene que ser purificado es inactivo y de esta manera, no es infeccioso, al principio del procedimiento, los trabajadores estan protegidos de una posible infeccion por el virus. Sin embargo, una etapa tan temprana para la inactivacion proporciona tambien el inconveniente de tener que lidiar con grandes volumenes. Por lo tanto, el coste asociado con la etapa de inactivacion, en particular, la etapa BPL, podrfa ser bastante significativo, debido al gran volumen de la suspension de virus a ser inactivada. Por consiguiente, los presentes inventores ensayaron tambien si una inactivacion mas tardfa del virus en el procedimiento de purificacion, tal como, por ejemplo, despues de ultrafiltration y la concentracion de la cosecha clarificada y/o despues de una etapa de ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa todavfa proporcionana buenos resultados de inactivacion. Observaron que la implementacion de las etapas de inactivacion BPL y UV sobre una suspension de virus purificado proporciono resultados de inactivacion, al menos tan buenos como cuando la inactivacion es implementada antes de purificar el virus y, posiblemente, mejores.

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En un aspecto de la divulgacion, el medio de cultivo celular que contiene virus de la gripe producido en celulas MDCK de mairnferos o celulas EB66® aviares, puede ser sucesivamente, clarificado mediante filtracion o mediante centrifugacion, inactivado mediante un tratamiento de BPL, concentrado se ultrafiltracion y sometido a irradiacion UV.

De manera alternativa, el tratamiento BPL puede ser implementado despues de que la cosecha de virus clarificada ha sido concentrada, por ejemplo mediante ultrafiltracion. La concentracion de la cosecha de virus primero permite usar menos cantidad de BPL, lo cual no solo representa una ventaja de costes, tal como se ha indicado anteriormente, sino que permite tambien que los manipuladores manipulen menores cantidades de BPL. La irradiacion UV puede ocurrir inmediatamente despues del tratamiento BPL, o mas tarde, despues de etapas de purificacion adicionales implementadas despues de dicho tratamiento BPL.

Despues de la inactivacion, el virus obtenido puede ser purificado adicionalmente. Por consiguiente, el medio de cultivo celular que contiene virus de la gripe, que ha sido sometido, sucesivamente, a clarificacion mediante centrifugacion y/o filtracion, inactivacion mediante un tratamiento de BPL, concentracion mediante ultrafiltracion y a irradiacion UV puede ser sometido ademas a una ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa.

De manera alternativa, las etapas de inactivacion segun la presente invention pueden ocurrir mas tarde en el procedimiento de purificacion. Por ejemplo, la cosecha de virus puede ser pre-clarificada mediante centrifugacion, clarificada mediante microfiltracion, sometida a ultrafiltracion y a concentracion, y sometida a una ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa. A continuation, las fracciones que contienen el virus completo recogidas de la ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa son sometidas a inactivacion. En un aspecto de la divulgacion, primero puede realizarse una irradiacion UV en un intervalo de 50 a 200 J/m2 sobre las fracciones y, a continuacion, puede anadirse BPL, en particular, BPL al 0,05%, a las fracciones de virus recogidas irradiadas. La BPL puede dejarse reposar durante la noche, en particular entre 12 a 16 horas a temperatura ambiente. En un aspecto distinto de la divulgacion, primero puede anadirse BPL directamente a las fracciones de virus recogidas, en particular, BPL al 0,05%, y puede dejarse reposar al menos durante la noche a temperatura ambiente. Al dfa siguiente, la suspension de virus tratada con BPL puede ser sometida a irradiacion UV, tal como por ejemplo UV 100 J/m2. Aunque la sacarosa residual presente dentro de las fracciones de virus recogidas podrfa tener un impacto sobre la eficacia de BPL en la inactivacion del virus, debido a su efecto estabilizador conocido en los virus, los presentes inventores observaron sorprendentemente que la sacarosa residual, si la hay, dentro de un fluido que contiene un virus a ser inactivado no afecto el efecto de inactivacion producido por BPL. Por lo tanto, el procedimiento de inactivacion de la presente invencion basado en la combination de tratamiento BPL e irradiacion UV, tiene una amplia aplicacion en las etapas de inactivacion que pueden ser implementadas en diferentes etapas de la production y la purificacion de virus de la gripe, incluyendo inmediatamente despues de una etapa de ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa.

El procedimiento de inactivacion del, virus segun se describe en la presente memoria, puede estar asociado tambien con una etapa adicional para degradar el ADN contaminante residual desde el huesped que produjo el virus. Por ejemplo, una etapa de degradation de ADN con una nucleasa, tal como, pero sin limitarse a, Benzonase™, puede ser implementada, ademas de la combinacion de una inactivacion qmmica e irradiacion UV.

El procedimiento segun la presente invencion contempla ademas una posible etapa de division. Por ejemplo, puede ser posible combinar una etapa de purificacion, tal como ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa, con una etapa de division de virus. En particular, puede anadirse un agente de escision al gradiente de sacarosa. Esto es particularmente adecuado, cuando se desea minimizar el numero total de etapas del procedimiento de la invencion, ya que permite, dentro de una unica operation, purificar y dividir el virus. Por lo tanto, en un aspecto de la divulgacion, cuando se implementa al menos una ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa, el gradiente de sacarosa puede comprender ademas un agente de division.

De manera alternativa, la etapa de division de virus del procedimiento de la presente invencion puede ser realizada por lotes.

Los procedimientos de division de virus, tal como el virus de la gripe, son bien conocidos en la tecnica (documento WO02/28422). La division del virus puede realizarse alterando o fragmentando el virus completo tanto si es infeccioso (de tipo salvaje o atenuado) como si no es infeccioso (inactivado) con una concentracion de alteration de un agente separador. Los agentes de division incluyen generalmente agentes capaces de romper y disolver las membranas lipfdicas. Tradicionalmente, la division del virus de la gripe se ha producido usando un tratamiento con disolvente/detergente, tal como fosfato de tri-n-butilo o dietileter en combinacion con Tween™ (conocido como division "Tween-eter") y este procedimiento se usa todavfa en algunas instalaciones de produccion. Otros agentes de division empleados en la actualidad incluyen detergentes o enzimas proteolfticas o sales biliares, por ejemplo, desoxicolato sodico. Los detergentes que pueden usarse como agentes de division incluyen detergentes cationicos, por ejemplo, bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB), otros detergentes ionicos, por ejemplo, lauril sulfato de sodio (SLS), taurodesoxicolato o detergentes no ionicos tales como Tween™ o Triton X-100 o combinaciones de dos o mas detergentes cualquiera.

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En un aspecto de la divulgacion, el agente de division puede ser desoxicolato. En otro aspecto de la divulgacion, el agente de division puede ser Triton X-100. Triton X-100 puede ser usado adecuadamente a una concentracion que varfa del 0,5% al 3%, en particular, del 1% al 2%. En un aspecto adicional de la divulgacion, el procedimiento descrito en la presente memoria puede usar una combinacion de Triton X-100 y lauril sulfato de sodio como agentes de division. En un aspecto de la divulgacion, despues de un tratamiento BPL y una irradiacion UV, en cualquier orden, el fluido que contiene el virus, tal como un fluido que contienen virus de la gripe, puede ser dividido en lotes con Triton X-100, en particular Triton X-100 al 2%.

El procedimiento de separacion puede llevarse a cabo como un procedimiento por lotes, continuo o semi-continuo. Cuando se implementa por lotes, el virus dividido puede requerir una etapa adicional de purificacion para eliminar el detergente, tal como una etapa de cromatograffa.

En un aspecto de la divulgacion, la cosecha vmca puede ser clarificada, mediante centrifugacion y/o filtracion, opcionalmente concentrada mediante ultrafiltracion, purificada mediante una etapa de ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa, inactivada mediante un tratamiento de BPL y una etapa de irradiacion UV, secuencialmente, en cualquier orden, y el fluido de virus inactivado puede ser dividido en lotes mediante la adicion de un detergente, adecuadamente Triton X- 100.

Las composiciones inmunogenicas de la presente divulgacion, incluyendo las vacunas, pueden contener opcionalmente los aditivos habituales para las vacunas, en particular, sustancias que aumentan la respuesta inmune provocada en un paciente que recibe la composicion, es decir, los denominados adyuvantes.

En un aspecto de la divulgacion, las composiciones inmunogenicas pueden comprender un virus o un antfgeno viral del mismo obtenibles segun la presente invention mezclados con un vehfculo farmaceutico adecuado. En un aspecto de la divulgacion, pueden comprender ademas un adyuvante.

Las composiciones adyuvantes pueden comprender una emulsion de aceite en agua que comprende un aceite metabolizable y un agente emulsionante. Con el proposito de que cualquier composicion de aceite en agua sea adecuada para la administration humana, la fase oleosa del sistema de emulsion debe comprender un aceite metabolizable. El significado de la expresion aceite metabolizable es bien conocido en la tecnica. Metabolizable puede definirse como "que es capaz de ser transformado por el metabolismo” (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25a edition (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite sintetico, que no es toxico para el receptor y es capaz de ser transformado por el metabolismo. Los frutos secos, semillas y granos son fuentes comunes de aceites vegetales. Los aceites sinteticos son tambien parte de la presente divulgacion y pueden incluir aceites disponibles comercialmente, tales como NEOBEE® y otros.

Un aceite metabolizable particularmente adecuado es el escualeno. El escualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil- 2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno) es un aceite insaturado que se encuentra en grandes cantidades en el aceite de trfgado de tiburon, y en cantidades mas bajas en el aceite de oliva, aceite de germen de trigo, aceite de salvado de arroz y levadura, y es un aceite particularmente preferido. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del hecho de que es un intermedio en la biosmtesis de colesterol (fndice Merck, 10a Edicion, no. Entrada 8619). En un aspecto adicional de la divulgacion, el aceite metabolizable puede estar presente en la composicion inmunogenica en una cantidad del 0,5% al 10% (v/v) del volumen total de la composicion.

La emulsion de aceite en agua puede comprender ademas un agente emulsionante. El agente emulsionante puede ser adecuadamente monooleato de polioxietileno sorbitan. Ademas, dicho agente emulsionante puede estar presente adecuadamente en la vacuna o composicion inmunogenica del 0,125 al 4% (v/v) del volumen total de la composicion.

La emulsion de aceite en agua de la presente divulgacion puede comprender opcionalmente un tocol. Los tocoles son bien conocidos en la tecnica y se describen en el documento EP0382271. De manera adecuada, es posible que un tocol sea alfa-tocoferol o un derivado del mismo, tal como succinato de alfa-tocoferol (conocido tambien como succinato de vitamina E). De manera adecuada, dicho tocol puede estar presente en la composicion adyuvante en una cantidad del 0,25% al 10% (v/v) del volumen total de la composicion inmunogenica.

El procedimiento de production de emulsiones de aceite en agua es bien conocido por la persona con conocimientos en la materia. Comunmente, el procedimiento comprende mezclar la fase oleosa (que comprende opcionalmente un tocol) con un tensioactivo tal como una solution de PBS/Tween80™, seguido de homogeneizacion usando un homogeneizador, es evidente para una persona con conocimientos en la materia que un procedimiento que comprende hacer pasar la mezcla dos veces a traves de una aguja de jeringa serfa adecuado para homogeneizar pequenos volumenes de lfquido. Igualmente, el procedimiento de emulsification en microfluidizador (maquina M110S Microfluidics, maximo 50 pases, durante un perfodo de 2 minutos a la presion de entrada maxima de 6 bar (presion de salida de aproximadamente 850 bar)) podrfa ser adaptado por la persona con conocimientos en la materia para producir volumenes de emulsion mas pequenos o mas grandes. La adaptation podrfa conseguirse mediante experimentation rutinaria que comprende la

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medicion de la emulsion resultante hasta que se consigue una preparacion con gotitas de aceite del diametro requerido.

En una emulsion de aceite en agua, el aceite y el emulsionante estan en un vehmulo acuoso. El vehmulo acuoso puede ser, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato.

En particular, los sistemas de emulsion de aceite en agua de la presente divulgacion pueden tener un tamano de gotitas de aceite pequeno en el rango sub-micrometrico. De manera adecuada, los tamanos de gota pueden estar comprendidos en el rango de 120 a 750 nm, mas particularmente tamanos de 120 a 600 nm de diametro. Todavfa mas particularmente, la emulsion de aceite en agua puede contener gotitas de aceite de las cuales al menos el 70% en intensidad tienen menos de 500 nm de diametro, mas particularmente al menos el 80% en intensidad son de menos de 300 nm de diametro, mas especialmente al menos el 90% en intensidad esta comprendido en el intervalo de 120 a 200 nm de diametro.

El tamano de las gotitas de aceite, es decir, el diametro, segun la presente divulgacion se proporciona por medio de la intensidad. Hay diversas maneras de determinar el diametro del tamano de la gotita de aceite por la intensidad. La intensidad se mide usando un instrumento calibrador, de manera adecuada mediante dispersion de luz dinamica tal como el dispositivo Malvern Zetasizer 4000 o de manera adecuada el dispositivo Malvern Zetasizer 3000HS. Un procedimiento detallado se proporciona en el Ejemplo II. 2. Una primera posibilidad es determinar el diametro medio z ZAD mediante dispersion de luz dinamica (espectroscopia de correlacion de fotones, PCS); este procedimiento, proporciona ademas dar el mdice de polidispersidad (PDI), y tanto el ZAD como el PDI se calculan con el algoritmo de cumulantes. Estos valores no requieren el conocimiento del mdice de refraccion de las partmulas. Un segundo medio consiste en calcular el diametro de la gotita de aceite mediante la determinacion de toda la distribucion de tamanos de partmula mediante otro algoritmo, el Contin o NNLS o el algoritmo "Malvern" automatico (el algoritmo por defecto proporciona por el instrumento calibrador). La mayor parte del tiempo, debido a que el mdice de refraccion de las partmulas de una composicion compleja es desconocido, solamente solo se tiene en cuenta la distribucion de intensidad y, si es necesario, la intensidad media originada a partir de esta distribucion.

Las composiciones adyuvantes pueden comprender ademas un agonista receptor de tipo Toll 4 (TLR). "Agonista TLR4" hace referencia a un componente que es capaz de causar una respuesta de senalizacion a traves de una via de senalizacion TLR4, bien como un ligando directo o bien indirectamente a traves de la generacion de un ligando endogeno o exogeno (Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). El TLR 4 puede ser un derivado de lfpido A, particularmente monofosforil lfpidos A o mas particularmente monofosforil lfpido A 3 desacilado (3 D - MPL).

3D-MPL esta disponible bajo la marca comercial MPL® en GlaxoSmithKline Biologicals America del Norte y promueve principalmente respuestas de celulas T CD4+ con un fenotipo IFN-g (Th1). Puede ser producido segun los procedimientos divulgados en el documento GB 2 220 211 A. Qmmicamente, es una mezcla de monofosforil lfpido A 3 desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. En particular, en las composiciones adyuvantes de la presente divulgacion se usa la pequena partmula 3 D- MPL. La pequena partmula 3 D -MPL tiene un tamano de partmula tal que puede ser esterilizada mediante filtracion a traves de un filtro de 0,22 pm. Dichas preparaciones se describen en la solicitud de patente internacional No. WO 94/21292. Los derivados sinteticos de lfpido A son conocidos y se cree que son agonistas de TLR 4 incluyendo, pero sin limitarse a:

OM174 (2-deoxi-6-o-[2-deoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosildihidrogenfosfato), (WO 95/14026)

OM 294 DP (3S, 9 R) -3--[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoil amino]decan-1,10-diol,1,10-bis(dihidrogenofosfato) (WO99/64301 y WO 00/0462)

OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoil amino]decan-1,10-diol,1-dihidrogenofosfato 10-(6-aminohexanoato) (WO 01/46127)

Otros ligandos de TLR4 que pueden usarse son fosfatos de alquil glucosaminida (AGPs), tales como los descritos en los documentos WO9850399 o US6303347 (tambien se divulgan procedimientos de preparacion de AGPs), o sales farmaceuticamente aceptables de AGPs, tal como se divulga en el documento US6764840. Algunos AGPs son agonistas de TLR4 y algunos son antagonistas de TLR4. Se cree que ambos son utiles como adyuvantes. Ademas, en los documentos US2003/0153532 y US2205/0164988 se divulgan agonistas de TLR-4 adicionales.

La invention es particularmente adecuada para preparar composiciones inmunogenicas de virus de la gripe, incluyendo vacunas. Actualmente, hay disponibles diversas formas de virus de la gripe. Generalmente, se basan en virus vivo o virus inactivado. Las vacunas inactivadas pueden estar basadas en viriones completos, viriones divididos o antfgenos de superficie purificados (incluyendo HA). Los antfgenos de la gripe pueden presentarse tambien en forma de virosomas (partmula liposomal similar a virus sin acido nucleico).

Las cepas de virus de la gripe para uso en vacunas cambian de estacion a estacion. En el penodo interpandemico actual, tfpicamente las vacunas incluyen dos cepas de la gripe A y una cepa de la gripe B. Las vacunas trivalentes son tfpicas,

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pero en la presente divulgacion se describen tambien valencias superiores, tales como una vacuna tetravalente. La presente divulgacion puede usar tambien HA de cepas pandemicas (es decir, cepas a las que el receptor de la vacuna y la poblacion humana en general son inmunologicamente desprotegidos), y las vacunas contra la gripe para cepas pandemicas pueden ser monovalentes o pueden estar basadas en una vacuna trivalente normal, complementada por una cepa pandemica.

Las composiciones de la presente divulgacion pueden incluir antfgeno o antfgenos de una o mas cepas de virus de la gripe, incluyendo virus de la gripe A y/o virus de la gripe B. En particular, en la presente divulgacion, se describe una vacuna trivalente que incluye antfgenos de dos cepas de virus de la gripe A y una cepa de virus de la gripe B.

Las composiciones de la divulgacion no se limitan a composiciones monovalentes, es decir, que incluyen solo un tipo de cepa, es decir, solo las cepas estacionales o solo cepas pandemicas. La divulgacion se refiere tambien a composiciones multivalentes que comprenden una combinacion de cepas estacionales y/o cepas pandemicas. En particular, en la presente divulgacion se describe tambien una composicion tetravalente, que puede ser adyuvada, que comprende tres cepas estacionales y una cepa pandemica. Otras composiciones descritas en la presente divulgacion son una composicion trivalente que comprende dos cepas A y una cepa B, tales como las cepas H1N1, H3N2 y B, y una composicion tetravalente que comprende dos cepas A y dos B cepas de un linaje diferente, tales como H1N1, H3N2, B/Victoria y B/Yamagata.

HA es el inmunogeno principal en las vacunas antigripales inactivadas actuales, y las dosis de vacuna estan estandarizadas en funcion de los niveles de HA, tfpicamente medidos mediante SRD. Tfpicamente, las vacunas existentes contienen aproximadamente 15 |jg de HA por cepa, aunque pueden usarse dosis mas bajas, por ejemplo, para los ninos, o en situaciones de pandemia, o cuando se usa un adyuvante. Se han usado dosis fraccionadas, tales como un medio (es decir, 7,5 g de HA por cepa) o un cuarto, asf como dosis mas altas, en particular, dosis 3x o 9x. De esta manera, las composiciones inmunogenicas de la presente divulgacion pueden incluir entre 0,1 y 150 jg de HA por cepa de gripe, particularmente, entre 0,1 y 50 jg, por ejemplo 0,1-20 jg, 0,1-15 jg, 0,1-10 jg, 0,1-7,5 jg, 0,5-5 jg, etc. Las dosis particulares incluyen aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5 y aproximadamente 5 jg por cepa.

Una vez purificado un virus de la gripe para una cepa particular, puede ser combinado con virus de otras cepas para preparar una vacuna trivalente, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente. Es mas adecuado tratar cada cepa por separado y mezclar graneles monovalentes para dar una mezcla multivalente final, en lugar de mezclar los virus y degradar el ADN y purificarlo a partir de una mezcla multivalente.

La invencion se describira adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1: Inactivacion inducida por BPL del virus de la gripe producido en celulas MDCK (NCP124 - Cepa A Nueva Caledonia, NCP127 - Cepa A Nueva Caledonia, JP125 - Cepa B Jiangsu, JP128 - Cepa B Jiangsu, NCP134 - Cepa A Nueva Caledonia y JP129 - Cepa B Jiangsu)

Las celulas adherentes MDCK se cultivaron sobre microportadores en un modo de cultivo de perfusion a 36,5°C. Despues de la fase de crecimiento, una vez alcanzada la densidad celular apropiada (en el intervalo de 4,5 x 106 celulas/ml a 7,5 x 106 celulas/ml), las celulas se inocularon con cepas diferentes de virus de la gripe (multiplicidad de infeccion de 1 x 10"5) en un modo de perfusion y la temperatura se cambio a 33°C. El virus fue cosechado mediante perfusion unos pocos dfas mas tarde. Las cosechas mediante perfusion se agruparon y la cosecha de virus completo fue:

a) clarificada en un tren de filtracion compuesto por tres filtros de profundidad diferentes con las siguientes porosidades nominales: 5 jm - 0,5 jm - 0,2 jm. En el experimento NCP127, se anadio Tween 80 a la cosecha viral a una concentracion final del 0,02% antes de la clarificacion.

b) a continuacion, las cosechas clarificadas se concentraron 10 veces (NCP124), 20 veces (JP128) o 30 veces (NCP127, JP125, NCP134 y JP129) mediante ultrafiltracion con una membrana de fibra hueca de 750 kD, para obtener un volumen final de aproximadamente 2 litros, diafiltrado contra 5 volumenes de PBS que conteman citrato 125 mM y 0,01% de Triton X-100 y contra 4 volumenes de Tris 10 mM, MgCh 2 mM, CaCh 0,1 jM, 0,01% de Triton X-100,

c) las fracciones retenidas se retiraron del sistema de ultrafiltracion y se calentaron hasta 37°C en un bano de agua. La degradacion del ADN se realizo mediante la adicion de Benzonase™ (Merck) a las fracciones retenidas a una concentracion final de 100 unidades/ml (NCP124), 200 unidades/ml (JP125, NCP134 y JP129) o 135 unidades/ml (NCP127 y JP128) y la mezcla se incubo 1 hora a 37°C.

d) en los experimentos JP128 y JP129 solo, las fracciones retenidas tratadas con Benzonase™ se homogeneizaron mediante homogeneizacion a alta presion a 1.000 bares.

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e) a continuacion, las fracciones retenidos de la ultrafiltracion (homogeneizadas o no) se sometieron a una ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa (0-55%), en la que virus y los contaminantes migran en el gradiente hasta que llegan a su densidad respectiva. Una vez cargadas todas las fracciones retenidas en el gradiente, un tiempo de formacion de bandas de 60 minutos permitio que la mayor parte del virus llegara a su densidad en el gradiente. Las partmulas virales se concentraron dentro de unas pocas fracciones. Las fracciones del producto estan en PBS pH 7,4 que contiene citrato y sacarosa 125 mM. El virion entero purificado se agrupo a partir del porcentaje de sacarosa que oscila desde aproximadamente el 26 al 51%. Este rango se ha determinado en base a los perfiles de SDS-PAGE y de analisis de transferencia Western usando anticuerpos anti-HA y anti-MDCK. Las fracciones agrupadas de virion entero se almacenaron a una temperatura comprendida entre 4°C a 8°C.

f) se realizo una segunda ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa (5-55%) para purificar adicionalmente el virus, al mismo tiempo que se dividfa. Se anadio 2% de Triton X-100 - 0,5 mM de hidrogeno succinato de alfa-tocoferilo (NCP127, JP125, JP128, NCP134 y JP129) o 1,5% de Triton X-100 -1% de lauril sarcosinato de sodio - 0,5 mM de hidrogeno succinato de alfa-tocoferilo (NCP124) a las capas de sacarosa para conseguir una barrera de micelas de detergente. El virus entero que entro en esta barrera de detergente fue dividido. Los fragmentos de virus que conteman las protemas de membrana viral hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) migraron a la densidad de las micelas. Los viriones restantes, algunos de los contaminantes de protemas de la celula huesped y el ADN migran a las fracciones de concentracion de sacarosa superiores que no se agruparon con las protemas virales. Se agruparon las protemas virales presentes en las fracciones que van desde aproximadamente el 13 al 55% de sacarosa. Esta gama se ha determinado en base a perfiles de SDS-PAGE y de analisis de transferencia Western usando anticuerpos anti-HA y anti-MDCK. La coleccion de fracciones que conteman las protemas virales estaba en PBS pH 7,4. A continuacion, esta coleccion se ensayo para determinar el contenido total de protemas y se diluyo a 250 |jg de protema/ml con PBS que contema 0,01% de Tween 80 - 0,3% de Triton X-100 - hidrogeno succinato de alfa- tocoferilo 0,1 mM pH 7,4.

Se implemento al menos una etapa de inactivacion de virus con BPL durante el procedimiento descrito anteriormente, tal como se indica a continuacion:

- En el experimento NCP124, se anadio BPL despues de la clarificacion de la etapa a) a concentraciones variables: 0,02, 0,04, 0,05, 0,06 y 0,1% y se incubo durante la noche a 4°C.

- En el experimento JP125, se anadio BPL despues de la primera ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa de la etapa d) a las fracciones que contienen viriones enteros recogidos y agrupados a una concentracion del 0,1% y se incubo durante la noche a 4°C.

- En el experimento NCP127, se anadio BPL despues de que las fracciones retenidas obtenidas en la etapa b) se incubaron con Benzonase™ en la etapa c) a concentraciones variables: 0,02, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08 y 0,1% y se incubaron durante la noche a 4°C.

- En el experimento JP128, se anadio BPL en las mismas condiciones que JP125, excepto que se usaron concentraciones variables: 0,05, 0,04, 0,03, 0,02 y 0,1%.

- En el experimento JP129, BPL se anadio BPL en las mismas condiciones que NCP127, excepto que las concentraciones usadas fueron: 0,03, 0,04 y 0,05%

- En el experimento NCP134, se anadio BPL en las mismas condiciones que NCP127, excepto que las concentraciones usadas fueron 0,05% y 0,1% y la incubacion fue durante la noche a temperatura ambiente (RT).

La inactivacion del virus se evaluo mediante la medicion de la titulacion viral mediante el ensayo TCID50 (Tissue-Culture- Infectious-Dose). Al final de la incubacion durante la noche, se recogio una muestra de cada condicion BPL dentro de cada experimento para ensayar su capacidad de infeccion con el fin de evaluar la eficacia de la inactivacion BPL. Se realizan una serie de diluciones sucesivas de las muestras a ensayar. Se inoculan 50 jl de cada dilucion en 10 replicas en una microplaca de 96 pocillos que contiene celulas MDCK, inoculandose 8 diluciones para cada muestra a ensayar. A continuacion, las placas se incuban durante 5-7 dfas a 35°C, de manera que el virus, si es infeccioso, pueda replicarse en las celulas. La presencia de virus infecciosos en las celulas se detecta mediante supervisando el efecto citopatico (CPE) en las celulas mediante microscopfa. Se usa una suspension de virus infeccioso como control positivo para demostrar la susceptibilidad celular y se usan cultivos no inoculados como control negativo. El numero de pozos en los que se detecta CPE se anota para cada dilucion como celulas infectadas y el tftulo viral se calcula segun el procedimiento de Reed y Muench (Reed, L. J. y Muench, H., 1938, The American Journal of Hygiene 27: 493-497). Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 1 y se expresan como log TCID50/ml. Los controles en los que no se anadio BPL (0) corresponden al valor de titulacion evaluado en una muestra recogida de la cosecha del virus indicado antes de ser sometida a ninguna etapa de purificacion.

Tabla 1 - Efecto de BPL sobre la titulacion del virus de la gripe

% BPL Titulacion log TCID50/1T1I

NCP124 (4°C)

0 8,93

0,02

4,47

0,04

< 1,8

0,05

< 1,8

0,06

< 1,8

0,1

< 1,8

JP125

0 11,3

(4°C)

0,1 < 1,8

NCP127 (4°C)

0 8,87

0,05

< 1,8

0,02

3,75

0,04

< 1,6

0,06

< 1,8

0,08

< 1,8

0,1

< 1,8

JP128 (4°C)

0 10,13

0,05

4,8

0,04

4,8

0,03

6,93

0,02

7,93

0,01

8,13

JP129 (4°C)

0 9,98

0,03

3,86

0,04

5,8

0,05

4,8

NCP134 (RT)

0 9,02

0,05

< 1,8

0,1

< 1,8

RT: Temperature ambiente 1,8 es el Ifmite de cuantificacion del ensayo

- Resultados-Conclusiones

La Tabla 1 indica que BPL, cuando se anade a un fluido de virus, es eficaz en la inactivacion de virus, en comparacion con los controles en los que no se anadio BPL. La mayorfa de las concentraciones de BPL usadas resulto en un tftulo viral igual o menor del ftmite de cuantificacion del ensayo y permiten conseguir una reduccion de titulacion viral de 5 aproximadamente 8 logs, en comparacion con los controles en los que no se anadio BPL. El efecto inactivador de BPL se observa independientemente de la temperatura de incubacion (4°C o RT). Se observo una infectividad residual en ciertos experimentos, ya que algunos tftulos virales vanan de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, y la reduccion de tftulo de virus vana entre 2 y 6 logs.

Ejemplo 2: Inactivacion inducida por UV del virus de la gripe producido en celulas MDCK (JP128 - Cepa B 10 Jiangsu)

Las condiciones experimentales de cultivo de celulas de JP128 eran tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. La cosecha viral se clarifico, tal como se describe en la etapa a) del Ejemplo 1. Despues de la clarificacion, la cosecha viral clarificada es sometida a diferentes dosis de UV: 200, 300 y 400. La irradiacion UV se llevo a cabo con un dispositivo de laboratorio UVivatec™ de Bayer Technical Services que comprende una lampara UV-C de mercurio de baja presion de 254 nm y 15 segun las recomendaciones del fabricante. La dosis o fluencia UV es una funcion de la intensidad de la lampara y de la densidad optica (OD) de la muestra a irradiar medida a 254 nm. El valor de OD a 254 nm, asf como el valor de la fluencia deseada, se introduce en una hoja de calculo Master Calculation proporcionada por Bayer con el fin de calcular el caudal necesario para conseguir dicha fluencia. La Tabla 2 indica los parametros usados para la irradiacion UV con el dispositivo de laboratorio UVivatec™ en el experimento JP128.

20 Tabla 2 -Parametros

JP128

UV254 nm (OD)

2,58

Fluencia (J/m)

200 300 400

Caudal (l/h)

16,3 10,9 8,2

Despues de someter las muestras a las diferentes dosis de irradiacion UV, la inactivacion de virus se evaluo midiendo la titulacion viral mediante el ensayo TCID50 tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se midio en la cosecha clarificada, es decir, antes de la irradiacion (Fluencia 0), para obtener el tftulo inicial del fluido de virus y despues de la irradiacion UV, 25 para obtener el tftulo residual del fluido de virus despues de la irradiacion. El efecto de inactivacion UV se ilustra mediante

el calculo de la LVR (reduccion viral Log) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 3. Para evaluar si un tratamiento UV tiene un impacto sobre la antigenicidad del virus, la concentracion de HA se determino tambien despues de cada tratamiento UV mediante SRD.

Tabla 3 - Efecto de UV sobre la titulacion del virus y el contenido de HA

JP128

2 Fluencia (J/m)

0 200 300 400

Log TCIDa/ml

8,0 2,6 2,8 2,8

LVR

- 5,4 5,2 5,2

SRD (yg HA/ml)

11,3 11,2 8,7 11,7

30

- Resultados-Conclusiones

La Tabla 3 indica que la HA medida mediante SRD no se vio afectada por ninguna de las dosis de UV ensayadas. Se observo una disminucion en el tftulo de virus de 5,4 log para una fluencia tan baja como 200 J/m2. Ninguna de las dosis UV ensayadas proporciono un tftulo de virus igual o menor que la cuantificacion del ensayo, lo que sugiere que la 35 infectividad residual persistio despues de la irradiacion UV.

- Procedimiento SRD usado para medir el contenido de HA

5

10

15

20

25

30

35

Las placas de vidrio (12,4 a 10 cm) se revistieron con un gel de agarosa que conterna una concentracion de suero HA antigripal recomendada por NIBSC. Una vez endurecido el gel, se introdujeron 72 pocillos de muestra (diametro 3 mm) en la agarosa. Se cargaron 10 jl de diluciones apropiadas de la referencia y la muestra en los pocillos. Las placas se incubaron durante 24 horas a temperature ambiente (20 a 25°C) en una camara humeda. A continuacion, las placas se empaparon durante la noche con solucion de NaCl y se lavaron brevemente en agua destilada. A continuacion, el gel se prenso y se seco. Cuando estaban completamente secas, las placas se tineron en solucion de Coomassie Brillant Blue durante 10 minutos y se destineron dos veces en una mezcla de metanol y acido acetico hasta que las zonas tenidas definidas claramente se hacen visibles. Despues de secar las placas, se midio el diametro de las zonas tenidas que rodean los pocillos de antfgeno en dos direcciones en angulos rectos. De manera alternativa, puede usarse equipo para medir la superficie. Se construyeron curvas de dosis-respuesta de diluciones de antfgeno contra la superficie y se calcularon los resultados segun los procedimientos de ensayo de relacion de pendiente estandar (Finney, D. J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin, Quoted in: Wood, JM, et al (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247).

Ejemplo 3: Inactivacion del virus de la gripe producido en celulas MDCK inducida por una combinacion de BPL y UV (MAP140 - Cepa B Malasia, WiP144 - Cepa A Wisconsin y SOP138 - Cepa A Solomon)

Las celulas MDCK adherentes se cultivaron sobre microportadores en modo de cultivo de perfusion a 36,5°C. Despues de la fase de crecimiento, una vez que se alcanzo la densidad celular apropiada (por encima de 6 x 108 celulas/ml), las celulas se inocularon con virus de la gripe (multiplicidad de infeccion de 1 x 10-5) en el modo de perfusion y la temperatura se cambio a 33°C. El virus se cosecho mediante perfusion en el dfa 5 despues de la inoculacion. Las cosechas de perfusion se clarificaron tal como se ha descrito en la etapa a) del Ejemplo 1. Despues de la clarificacion, las cosechas de virus se sometieron a los siguientes tratamientos de inactivacion que combinan rayos UV y BPL: se ensayaron dos dosis diferentes de UV (200 y 500 J/m2) y se combinaron con dos concentraciones BPL (0,05% y 0,1%) en cualquier combinacion.

La irradiacion UV se realizo tal como se ha descrito en el Ejemplo 2 con el mismo dispositivo de laboratorio UVivatec™ y siguiendo las recomendaciones del fabricante del mismo. Se anadio BPL durante la noche a 4°C. Los tratamientos UV y BPL eran secuenciales, realizandose la irradiacion UV antes que la incubacion con BPL.

Despues de cada tratamiento de inactivacion, tal como se indica en las tablas siguientes, se determino la titulacion del virus segun el ensayo TCID50, como se ha descrito en el Ejemplo 1. La antigenicidad de HA se superviso midiendo su contenido despues de las etapas indicadas mediante el ensayo SRD, tal como se ha descrito en Ejemplo 2. Los resultados se presentan en la Tabla 4 (SOP138), la Tabla 5 (MAP140) y la Tabla 6 (WiP144). Los resultados de HA se presentan en forma de porcentajes a ser comparados con el valor de control 100% que representa la cantidad de HA total presente en el material de partida, es decir presente en la cosecha de virus antes de la clarificacion (columnas HA), o bien con la cantidad de HA total presente antes de realizar la etapa indicada (columnas de la etapa de recuperacion de HA).

Tabla 4 - Efecto de UV/BPL sobre la titulacion del virus y el contenido de HA

Cepa A Solomon - SOP1138

HA (%) Log TCID50/ml Etapa de recuperacion de HA (%)

Cosecha clarificada

93 10,02 93

UV200J/mr

80 < 0,8 86

UV 500 J/m2

84 7,8 90

UV200 J/m2 - BPL 0,05%

96 < 0,8 120

UV200 J/m2-BPL 0,1%

78 < 1,8 97

UV 500 J/m2 - BPL 0,05%

74 < 0,8 88

UV500 J/m2-BPL 0,1%

68 < 1,8 82

1,8 y 0,8 son los lnmites de cuantificacion del ensayo

5

10

15

20

25

Tabla 5 - efecto de UV/BPL sobre la titulacion del virus y el contenido de HA

Cepa B Malasia - MAP140

HA (%) Log TCID50/ml Etapa de recuperacion de HA (%)

Cosecha clarificada

102 9,02 102

UV200J/mr

76 8,12 75

UV 500 J/m2

79 5,22 78

UV200 J/m2 - BPL 0,05%

74 < 1,8 97

UV200 J/m2-BPL 0,1%

91 < 1,8 119

UV 500 J/m2 - BPL 0,05%

71 < 1,8 90

UV500 J/m2-BPL 0,1%

75 < 1,8 95

1,8 es el ftmite de cuantificacion del ensayo

Tabla 6 - Efecto de UV/BPL sobre la titulacion del virus y el contenido de HA

Cepa A Wisconsin - WiP144

HA (%) Log TCID50/ml Etapa de recuperacion de HA (%)

Cosecha clarificada

70 8,87 70

UV 200 J/m2

81 < 1,8 116

UV200 J/m2 - BPL 0,05%

74 < 0,8 92

1,8 y 0,8 son los ftmites de cuantificacion del ensayo

- Resultados-Conclusiones

Se ha observado una reduccion del tftulo viral despues del tratamiento UV para las 3 cepas de la gripe ensayadas. Esta reduccion viral se ha completado mediante la accion BPL para conseguir un tftulo de virus que es igual o menor que el ftmite de cuantificacion. No se ha observado ningun impacto importante sobre la actividad antigenica de HA despues de un tratamiento combinado de UV y BPL. Por lo tanto, la combinacion de un tratamiento ffsico, tal como irradiacion UV, y un tratamiento qmmico asegura la inactivacion del virus de la gripe a lo largo del procedimiento de purificacion y permite conseguir una inactivacion de virus mas completa, en comparacion con la ejecucion de cada etapa de manera individual.

Ejemplo 4: Inactivacion inducida por BPL del virus de la gripe producido en celulas EB66®

Se cultivaron celulas 4.1 EB66® en suspension en un modo por lotes. Se inocularon con H5N1 y el virus se cosecho recogiendo el medio de cultivo celular unos pocos dfas mas tarde. La cosecha viral se clarifico usando un tren de filtracion compuesto de tres filtros de profundidad diferentes con las siguientes porosidades nominales: 5 pm - 0,5 pm - 0,2 pm (EB66_26, EB66_28, EB66_33 y EB66_42) o mediante la combinacion sucesiva de centrifugacion a 4.500 g y de una filtracion 0,2 pm (EB66_29 y EB66_30). Despues de la clarificacion, la cosecha viral clarificada se concentro 10 veces mediante ultrafiltracion con un filtro de fibra hueca 750 kD y se diafiltro con una solucion de PBS que contema citrato 125 mM.

Se anadio BPL al 0,05% durante la noche a temperatura ambiente, antes de la etapa de ultrafiltracion (EB66_26, EB66_28, EB66_29, EB66_30 y EB66_31) o despues de la ultrafiltracion, es decir, BPL se anadio a los materiales retenidos obtenidos despues de la ultrafiltracion (EB66_42 y EB66_33). La titulacion se midio segun el ensayo TCID50, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se midio en la cosecha clarificada (Tabla 7) o en las fracciones retenidas despues de la ultrafiltracion (Tabla 8), para obtener el tftulo inicial de la preparacion de virus antes de que fuera inactivada, y despues del tratamiento BPL, para obtener el tftulo residual del fluido virus despues de la inactivacion. El efecto inactivador de BPL se ilustra mediante el calculo de la LVR (reduccion viral logarftmica) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 7 y la Tabla 8 que muestran el efecto inactivador de BPL cuando se implementa antes de la etapa de ultrafiltracion o despues de la etapa de ultrafiltracion,

5

10

15

20

25

30

respectivamente. Los tftulos de virus se expresan como log TCID50/1T1L La ultima columna representa la LVR media basada en 5 experimented diferentes. Ademas, el contenido de HA se midio mediante SRD tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Los resultados de HA se presentan en forma de porcentajes a ser comparados con el valor de control 100% que representa la cantidad total de HA presente antes de anadir BPL, es decir, presente en la cosecha clarificada.

Tabla 7 - Efecto de BPL sobre la titulacion del virus, cuando se anade BPL a la cosecha viral clarificada

EB66_26 EB66_28 EB66_29 EB66_30 EB66_31 LVR media

Cosecha clarificada (log TCID5o/ml)

7,3 7,2 7,9 7,8 7,5

BPL 0,05% (log TCID^ml)

< 2,2 < 1,6 < 1,6 < 1,6 < 1,6

LVR

> 5,1 > 5,6 > 6,3 > 6,2 > 5,9 > 5,8

Etapa de recuperacion de HA (%)

118 100 97 130 106

2,2 y 1,6 son los ftmites de cuantificacion del ensayo

Tabla 8 - Efecto de BPL sobre la titulacion del virus cuando se anade BPL a la cosecha viral clarificada

concentrada

EB66_42 EB66_33

Fracciones retenidas UF (log TCIDOml)

8,1 8,0

EPL 0,05%, (log TCDa/ml)

< 2,2 3,4

LVR

> 5,9 4,6

* UF es para ultrafiltracion 2,2 es el ftmite de cuantificacion del ensayo

- Resultados-Conclusiones

La Tabla 7 indica que el tratamiento de la cosecha viral clarificada con BPL fue eficaz en la inactivacion de los virus, en comparacion con los controles en los que no se anadio BPL. BPL al 0,05% resulto en un tftulo viral que es igual o menor que el ftmite de cuantificacion del ensayo y permitio conseguir una LVR de aproximadamente 5,8 logs, en comparacion con los controles en los que no se anadio BPL. La Tabla 8 muestra que el tratamiento de la cosecha viral clarificada despues de ser concentrada mediante ultrafiltracion con BPL al 0,05% proporciona un tftulo, por una parte, igual o menor que el ftmite de cuantificacion del ensayo (vease EB66_42) y, por otra parte, mayor que el ftmite de cuantificacion (vease EB66_33 que muestra un nivel residual de virus infeccioso, ya que el tftulo obtenido es superior al ftmite de cuantificacion), que presenta una LVR > 5,9 y de 4,6, respectivamente.

4.2 En un experimento separado, celulas EB66® se inocularon con H5N1 y el virus se cosecho unos pocos dfas mas tarde recogiendo el medio de cultivo celular. La cosecha viral se clarifico mediante la combinacion sucesiva de una centrifugacion a 8. 500 rpm y una filtracion 0,45 pm (EB66_65 y 69). A continuacion, la cosecha viral clarificada se concentro aproximadamente 10 veces mediante ultrafiltracion y se diafiltro con una solucion de PBS (EB66_69) o una solucion de PBS que contema citrato 125 mM, pH 7,4. A continuacion, las fracciones retenidas de la ultrafiltracion se sometieron a una etapa de ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa (0-55%) tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. A continuacion, las fracciones de virion reunidas se anadieron directamente con BPL al 0,05%. La titulacion se midio segun el ensayo TCID50, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se midio antes de anadir BPL, para obtener el tftulo inicial del fluido con virus antes de ser inactivo, y despues del tratamiento BPL, para obtener el tftulo residual de la preparacion de virus despues de la inactivacion. El efecto inactivador de BPL se ilustra mediante el calculo de la LVR. Los resultados se presentan en la Tabla 9.

Tabla 9 - efecto BPL en la titulacion del virus, cuando se anade a las fracciones BPL conjunto de viriones

purificadas en gradiente de sacarosa.

EB66_65 EB66_69

Antes de adicion de BPL al 0,05% (log TCID^ml)

9,0 8,8

Despues de adicion de BPL al 0,05% (log TCIDs/ml)

< 2,8 < 1,6

LVR

> 6,2 > 7,2

2,2 es el ftmite de cuantificacion del ensayo

- Resultados-Conclusiones

5 La Tabla 9 indica que BPL al 0,05% fue eficaz en la inactivacion de los virus, permitiendo conseguir una LVR de mas de 6 logs. Estos resultados indican que la implementacion de un tratamiento de BPL inmediatamente despues de una etapa de ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa proporciona buenos resultados de inactivacion, lo que sugiere que la sacarosa residual no afecta negativamente el efecto inactivador de BPL. La LVR conseguida en esas condiciones BPL es ligeramente superior a las obtenidas en las Tablas 7 y 8.

10 Ejemplo 5: Inactivacion inducida por UV de virus de la gripe producido en celulas EB66®

Las celulas EB66® se cultivaron e infectaron con H5N1 tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. La cosecha viral se clarifico mediante una centrifugacion a 4.500 g y una filtracion en un filtro de 0,2 pm, sucesivamente. A continuacion, la cosecha viral clarificada se concentro mediante ultrafiltracion tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. No se anadio BPL en esos experimentos.

15 Despues de la ultrafiltracion, las fracciones retenidas se sometieron a un gama de irradiaciones UV (100 J/m2, 150 J/m2 y 200 J/m2), tal como se ha descrito en el Ejemplo 2, con el mismo dispositivo UVivatec™ Lab y siguiendo las mismas recomendaciones del fabricante. Despues de la irradiacion, la titulacion del virus se determino segun el ensayo TCID50, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se midio antes de la irradiacion UV en una muestra recogida de las fracciones retenidas de la ultrafiltracion, para obtener el tftulo inicial del fluido con virus, y despues de la irradiacion UV, para obtener

20 el tftulo residual del fluido con virus despues de la inactivacion. El efecto inactivador de UV se ilustra mediante el calculo

de la LVR (reduccion viral logarftmica) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 10. Los tftulos de virus se expresan como log TCID50/ml.

Tabla 10 - Efecto de UV sobre la titulacion del virus, cuando la irradiacion UV es implementado en la cosecha

clarificada concentrada

EB66_25

Log TCID5t/ml LVR

Fracciones retenidas UF*

7,8

UV 100 J/m2

< 2,2 > 5,6

UV 150 J/m2

< 2,2 > 5,6

UV 200 J/m2

< 2,2 > 5,6

* UF es para ultracentrifugacion, 2,2 es el lmite de la cuantiUcacion del ensayo

25

- Resultados-Conclusiones

La Tabla 10 indica que una dosis UV de 100 a 200 J/m2 era eficaz en la inactivacion de virus de la gripe producido en celulas EB66®, ya que el tftulo de virus era igual o menor del ftmite de cuantificacion del ensayo.

Ejemplo 6: Inactivacion inducida por BPL y UV del virus de la gripe producido en celulas EB66®

30 6.1 Las celulas EB66® se cultivaron e infectaron con H5N1 tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. La cosecha viral se

clarifico mediante centrifugacion a 10.500 rpm y microfiltracion en un filtro de 0,45 pm, sucesivamente.

5

10

15

20

25

30

La cosecha clarificada se sometio de (i) un tratamiento con BPL al 0,01%, (ii) una irradiacion UV 20 J/m2, o (iii) un tratamiento con BPL al 0,01% y una irradiacion UV 60 J/m2. La BPL al 0,01% se dejo durante la noche a temperature ambiente. La irradiacion UV fue tal como se ha descrito en el Ejemplo 2, usando el mismo dispositivo UVivatec™Lab y siguiendo las mismas recomendaciones del fabricante. En la condicion (iii), la cosecha clarificada se trato primero con BPL al 0,01% durante la noche a temperatura ambiente y, a continuacion, al dfa siguiente, se irradio con una dosis UV de 60 J/m2. La titulacion del virus se determino segun el ensayo TCID50, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, antes de anadir la BPL o irradiar con UV, para obtener el tftulo inicial del fluido con virus y despues del tratamiento BPL y/o irradiacion UV, para obtener el tftulo residual del fluido con virus despues de la inactivacion. El efecto inactivador de BPL y/o UV se ilustra mediante el calculo de la LVR (reduccion viral logarftmica) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 11. Los tftulos de virus se expresan como log TCID50/ml.

Tabla 11 - Efecto de BPL/UV sobre la titulacion del virus, cuando se implementa sobre la cosecha clarificada

Log TCID0ml LVR

Cosecha clarificada

7,9 -

BPL al 0,01%

5,8 2,1

~Uv20J/m2

5,4 2,5

BPL al 0,01% UV60 J/m2

< 2,2 > 5,7

2,2 es el Imite de la cuantificacion del ensayo

- Resultados-Conclusiones

La Tabla 11 indica que BPL a una concentracion del 0,01% inactiva parcialmente la cosecha clarificada que contiene gripe, ya que se midio una infectividad residual (LVR es de 2,1 log), mientras que la Tabla 9 proporciono resultados en los que BPL al 0,05% permitio conseguir una inactivacion de virus mas completa, ya que el tftulo obtenido era igual o menor que el ftmite de cuantificacion del ensayo. Sin embargo, cuando se combino la concentracion suboptima de BPL al 0,01% con un etapa de irradiacion UV 60 J/m2, entonces el tftulo obtenido era igual o menor que el ftmite de cuantificacion del ensayo, lo que sugiere que la combinacion de un tratamiento ffsico, tal como UV, y un tratamiento qmmico, tal como BPL, asegura la inactivacion del virus de la gripe a lo largo del procedimiento de purificacion, permitiendo conseguir una inactivacion mas completa de los virus, limitando al mismo tiempo la cantidad de BPL que debe usarse para ese efecto.

6. 2 En un experimento separado, las celulas EB66® se cultivaron e infectaron con H5N1, tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se recogio la cosecha viral y clarifico tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se anadio BPL al 0,05% durante la noche a temperatura ambiente a la cosecha viral clarificada. A continuacion, la cosecha viral tratada con BPL se concentro 10 veces mediante ultrafiltracion con un filtro de fibra hueca 750 kD y se diafiltro con una solucion de PBS que conterna citrato 125 mM. Despues de la concentracion, la cosecha viral tratada con BPL se irradio con una dosis UV 200 J/m2. La titulacion del virus se midio antes de anadir BPL en una muestra recogida de la cosecha clarificada indicada, para obtener el tftulo inicial del fluido con virus, despues de la adicion de BPL, y despues de la irradiacion UV, para obtener el tftulo residual de la preparation de virus despues de la inactivacion. El efecto inactivador de BPL y BPL/UV se ilustra mediante el calculo de la LVR (reduccion viral logarftmica) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 13. Los tftulos de virus se expresan como log TCID50/ml.

Tabla 12 - Efecto de BPL/UV sobre la titulacion del virus

EB66_30 EB66_ 31

log TCID50/ml

LVR log TCIDsc/ml LVR

Cosecha clarificada

7,8 - 7,5 -

BPL al 0,05%

< 1,6 > 6,2 < 1,6 > 5,9

UV 200 J/m2

< 1,6 > 6,2 < 1,6 > 5,9

1,6 es el ftmite de la cuantificacion del ensayo

5

10

15

20

25

30

35

- Resultados-Conclusiones

La adicion de BPL a la cosecha de virus clarificada y la subsiguiente irradiacion UV son eficaces en la inactivacion de virus de la gripe, ya que dicha una combinacion de tratamientos resulta en un tftulo de virus que es igual o menor que el ftmite de cuantificacion del ensayo.

Ejemplo 7: Inactivacion inducida por Triton X-100 del virus de la gripe producido en celulas EB66®

Las celulas EB66® se cultivaron e infectaron con H5N1 tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. La cosecha viral se recogio, se clarifico y se concentro mediante ultrafiltracion tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. No se anadio BPL, ni se implemento irradiacion UV durante el procedimiento. A continuacion, la cosecha viral concentrada se sometio a ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa (0-55%), en la que los virus y los contaminantes migraron al interior del gradiente hasta que llegaron a su densidad respectiva. Una vez cargadas todas las fracciones retenidas en el gradiente, un tiempo de formacion de bandas de 60 minutos permitio que la mayor parte del virus llegara a su densidad dentro del gradiente. Las partfculas virales se concentraron dentro de unas pocas fracciones. Las fracciones de producto estaban en PBS pH 7,4 que contema citrato y sacarosa 125 mM. El virion entero purificado se agrupo a partir del porcentaje de sacarosa de aproximadamente el 30 al 48%. Este intervalo se ha determinado en base a los perfiles de SDS-PAGE y de un analisis de transferencia Western usando anticuerpos anti-HA y anti-MDCK. A continuacion, las fracciones de virus entero agrupadas se concentraron mediante ultrafiltracion con un filtro de fibra hueca 750 kD y se diafiltraron con una solucion de PBS.

Se anadio Triton-X 100 al 2% a temperatura ambiente a las fracciones que conteman virus enteros recogidas y agrupadas despues de la centrifugacion en gradiente de sacarosa con el fin de dividir el virus. La titulacion del virus se midio antes de la adicion de Triton X-100, para obtener el tftulo inicial del fluido con virus y en diferentes puntos de tiempo (tal como se indica en la Tabla 12) despues de la adicion de Triton X-100, para obtener el tftulo residual de la preparation de virus despues de la division. El efecto inactivador de Triton X-100 se ilustra mediante el calculo de la LVR (reduction viral logarftmica) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 13. Los tftulos de virus se expresan como log TCID50/ml.

Tabla 13 - Efecto de Triton X-100 sobre la titulacion del virus

EB66_33 EB66_ 39

Triton X-100 al 2%

log TCID50/ml LVR log TCID0ml LVR

Fracciones retenidas UF

8,4 8,8

t = 30 min

5,2 3,2

t = 2 h

5,0 3,8

* UF es para ultrafiltracion

- Resultados-Conclusiones

Triton X-100 al 2% es eficaz en la inactivacion del virus de la gripe despues de un tiempo de tratamiento tan corto como 30 minutos. Se observo una LVR de 3,2 logs y 3,8 logs despues de 30 minutos y 2 horas de tratamiento, respectivamente.

Ejemplo 8: Efecto acumulativo de inactivacion inducida por BPL, UV y Triton X-100 del virus de la gripe producido en celulas EB66

Con el fin de evaluar el efecto acumulativo de la implementation de las etapas BPL, UV y Triton X-100 dentro del mismo procedimiento, se sumaron las LVRs obtenidas en los Ejemplos 4, 5 y 7 para las etapas BPL, UV y Triton, individuales respectivamente. Los resultados se presentan en la Tabla 14.

Tabla 14 - Efecto acumulativo de BPL, UV y Triton X-100 sobre la titulacion del virus

LVR

BPL al 0,05%

> 5,8*

UV 200 J/m2

> 5,6**

5

10

15

20

25

30

(Cont.)

Triton X-100 al 2% 3,8***

LVR acumulativo > 15,2

* Este valor corresponde a la LVR media presentada en la Tabla 7, donde la BPL al 0,05% se anadio despues de la clarificacion

** Este valor corresponde al valor presentado en la Tabla 10, donde UV se implemento sobre las fracciones retenidas de la UF

*** Este valor corresponde al valor presentado en la Tabla 13, donde Triton-X100 se anadio durante 2 horas

- Resultados-Conclusiones

La combinacion de 3 etapas de inactivacion individuales dentro del mismo procedimiento (BPL; UV y Triton X-100) resulta en una LVR superior a 15,2

Ejemplo 9: Efecto acumulativo de la inactivacion inducida por UV y BPL de virus adventicios

El uso de celulas animales para la produccion de gripe, en particular, para su inclusion en una vacuna, implica el cultivo de celulas en condiciones que son adecuadas para el crecimiento y la replicacion viral. Por lo tanto, estas condiciones incrementan el riesgo de que otros patogenos distintos del virus de la gripe crezcan en el cultivo celular, conduciendo de esta manera a una contaminacion potencial del producto final de la vacuna con virus adventicios. La preparacion de virus obtenida segun el procedimiento de la invencion se ensayo contra 4 virus adventicios modelo: virus de la pseudorrabia porcina (PRV), el virus de la leucemia murina (MuLV), parvovirus porcino (PPV) y virus de la hepatitis A (HAV). Antes de proceder a la etapa de inactivacion indicada (UV o BPL), los fluidos con virus de la gripe se enriquecieron con el virus adventicio indicado.

9.1 El virus de la gripe se produjo en celulas MDCK tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. El fluido con virus, se enriquecio por separado con MuLV y PPV. Se anadieron BPL al 0,05% y BPL al 0,1% durante la noche a temperatura ambiente a cada preparacion de virus de la gripe enriquecida. La titulacion se midio segun el ensayo TCID50, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se midio antes de la adicion de BPL, para obtener el tftulo inicial del fluido con virus antes de que fuera inactivado, y despues del tratamiento BPL, para obtener el tftulo residual del fluido de virus despues de la inactivacion. El efecto inactivador de BPL se ilustra mediante el calculo de la LVR (reduccion viral logarftmica) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Independientemente, la preparacion de virus de la gripe enriquecida por separado con MuLV y PPV se irradio tambien con una dosis UV de 200 J/m2 La titulacion se midio antes de la irradiacion con UV, para obtener el tftulo inicial de la preparacion de virus antes de que fuera inactivada y despues de la irradiacion UV, para obtener el tftulo residual de la preparacion de virus despues de la inactivacion. El efecto inactivador de BPL y UV se ilustra mediante el calculo de la LVR (reduccion viral logarftmica) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 15. Los tftulos de virus se expresan como log TCIDsg/ml.

Tabla 15 - Efecto de BPL y UV sobre la titulacion del virus MuLV y PPV

MuLV PPV

log TCID50/ml

LVR log TCID50/ml LVR

Sin BPL

6,0 8,1

BPL al 0,05%

3,3 2,7 3,9 4,2

Sin BPL

6,5 8,1

BPL al 0,01%

3,7 2,8 2,4 5,7

Sin UV

6,1 8,3

UV 200 J/m2

3,5 2,6 0,1 8,2

- Resultados-Conclusiones

5

10

15

20

25

El tratamiento BPL resulto en una reduccion en el tftulo de virus con respecto tanto a MuLV como a PPV a las dos concentraciones ensayadas. El tratamiento UV resulto tambien en una reduccion en el tftulo de virus tanto de MuLV como de PPV, con un efecto particularmente fuerte sobre PPV, ya que la LVR observada fue de 8,2 logs. El tratamiento de combinacion de BPL y UV asegura el procedimiento de purificacion de virus de la gripe producido en cultivo celular contra la contaminacion con virus adventicios, en su caso, mediante la inactivacion de dichos virus.

9.2 El virus de la gripe producido en celulas EB66® tal como se ha descrito en el Ejemplo 4 se enriquecio por separado con PPV, PRV, HAV y MuLV. Despues del enriquecimiento, cada fluido con virus de la gripe se inactivo con BPL al 0,05% anadido durante la noche a temperatura ambiente o mediante irradiacion UV con una dosis de 200 J/m2, tal como se indica en la Tabla 16. La titulacion del virus se midio segun el ensayo TCID50, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se midio antes de la adicion de BPL o la irradiacion con UV, para obtener el tftulo inicial del fluido con virus antes de ser inactivado, y despues del tratamiento BPL o despues de la irradiacion UV, para obtener el tftulo residual del fluido de virus despues de la inactivacion. El efecto inactivador de BPL y UV se ilustra mediante el calculo de la LVR (reduccion viral logarftmica) que consiste en restar el tftulo residual anterior del tftulo inicial anterior. Los resultados se presentan en las Tablas 16 y 17. Los tftulos de virus se expresan como log TCID50/ml.

Tabla 16 - Efecto de BPL y UV sobre la titulacion de virus MuLV y PPV

MuLV PPV

log TCID50/ml

LVR log TCID50/ml LVR

Sin BPL

5,8 8,1

BPL 0,05

4,2 1,6 6,0 2,1

Sin UV

8,2

~Uv200J/m2

< 1 1,4 6,8

Tabla 17 - Efecto de BPL y UV sobre la titulacion de virus HAV y PRV

HAV PRV

log TCID50/ml

LVR log TCID50/ml LVR

Sin BPL

5,3 6,0

BPL al 0,05%

1,5 3,8 2,6 3,4

Sin UV

5,4

UV 200 J/m2

< 1,4 > 4 3,67

- Resultados-Conclusiones

El tratamiento BPL resulto en una reduccion del tftulo de virus con respecto a todos los virus ensayados, MuLV, PPV, HAV y PRV. El tratamiento UV resulto en una reduccion en el tftulo de virus de PRV, VPP y HAV con un efecto particularmente fuerte sobre PPV, ya que la LVR observada fue de 6,8 logs. Por lo tanto, el tratamiento de combinacion de BPL y UV asegura el procedimiento de purificacion de virus de la gripe producido en cultivo celular contra la contaminacion con virus adventicios, en su caso, mediante la inactivacion de dichos virus.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de inactivacion de un virus de la gripe propagado en cultivo celular y de inactivacion de virus adventicios contaminantes, que comprende al menos las etapas siguientes:

   (a) tratar un fluido que contiene virus de la gripe con beta-propiolactona, y

   (b) irradiar el fluido que contiene virus de la gripe con luz UV.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que las etapas (a) y (b) se realizan secuencialmente, en cualquier orden.
3. 3. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 y 2, en el que la beta-propiolactona se usa a una concentracion que vana del 0,01% al 0,1%, o del 0,03% al 0,8%, o a una concentracion del 0,05%.
4. 4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la dosis de UV vana de 50 a 500 J/m2, de 100 a 400 J/m2 o es de 200 J/m2, o es 100 J/m2.
5. 5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas al menos una etapa de purificacion de virus seleccionada del grupo que consiste en: clarificacion, ultrafiltracion, degradacion de acidos nucleicos, ultracentrifugacion y cromatograffa.
6. 6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que el virus se purifica mediante clarificacion.
7. 7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que las etapas (a) y (b) se implementan despues de la clarificacion.
8. 8. Procedimiento segun las reivindicaciones 5 y 6, en el que el virus se purifica mediante ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa.
9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 8, en el que las etapas (a) y (b) se implementan despues de la ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa.
10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que la etapa (a) se implementa antes de la etapa (b).
11. 11. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 10, que comprende ademas una etapa de division.
12. 12. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 11, en el que el virus de la gripe se propaga en celulas EB66®.
13. 13. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 12, en el que los virus adventicios se seleccionan entre: virus de la leucemia murina, virus de hepatitis A, parvovirus porcino, virus de la pseudorrabia porcina, o cualquier combinacion de los mismos.
14. 14. Un procedimiento de preparacion de una vacuna que comprende un virus de la gripe propagado en cultivo celular que comprende las siguientes etapas:

    (a) tratar un fluido que contiene virus de la gripe y virus adventicios contaminantes con beta-propiolactona,

    (b) irradiar el fluido que contiene virus de la gripe y virus adventicios contaminantes con luz UV, y

    (c) formular el virus de la gripe tratado con beta-propiolactona e irradiado con UV en una vacuna.