ES2554821T3 - Aplicación tópica y liberación transdérmica de toxinas botulínicas - Google Patents

Abstract

Una composición tópica que comprende una toxina botulínica y un vehículo cargado positivamente, comprendiendo dicho vehículo un esqueleto polimérico de peptidilo o distinto de peptidilo cargado positivamente que tiene unidos al mismo uno o más grupos de eficacia cargados positivamente seleccionados de -(gly)n1-(arg)n2, donde el subíndice n1 es un número entero de 0 a 20, y el subíndice n2 es, independientemente, un número entero impar de 5 a 25; PTD de Antennapedia y fragmentos de la misma que retienen la actividad de PTD de Antennapedia; VIHTAT; y fragmentos de VIH-TAT que tienen las secuencias de aminoácidos (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p- YGRKKRRQRRR-(gly)q, o (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q, donde los subíndices p y q son cada uno, independientemente, un número entero seleccionado de un intervalo de 0 a 20, un intervalo de 0 a 8, o un intervalo de 2 a 5; donde el vehículo cargado positivamente y la toxina botulínica están en contacto directamente para formar un complejo no covalente, y donde la toxina botulínica no está modificada covalentemente, para su uso para tratar el dolor neurológico; prevenir o reducir el dolor de cabeza tipo migraña u otro dolor de cabeza; o aliviar dolor relacionado con espasmos musculares.

Description

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es una poliglicina en la que la cadena lateral está unida a los átomos de nitrógeno del esqueleto en lugar de a los átomos de carbono . Como anteriormente, una parte de las cadenas laterales típicamente terminará en un grupo cargado positivamente para proporcionar un componente de esqueleto cargado positivamente. Se describe la síntesis de peptoides, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.877.278. Como se usa el término en el

5 presente documento, los esqueletos cargados positivamente que tienen una construcción de esqueleto peptoide se consideran “no peptídicos” ya que no están compuestos de aminoácidos que tienen cadenas laterales naturales en las localizaciones de carbono .

Puede emplearse una diversidad de esqueletos distintos, por ejemplo, miméticos estéricos o electrónicos de polipéptidos donde los enlaces amida del péptido se reemplazan con sustitutos tales como enlaces éster, tioamidas (-CSNH-), tioamidas invertido (-NHCS-), aminometileno (-NHCH2-) o el metilenamino invertido (-CH2NH-), grupos ceto-metileno (-COCH2-) fosfinato (-PO2RCH2-fosfonamidato y éster de fosfonamidato (-PO2-RNH) péptido inverso (-NHCO-), trans-alqueno (-CR = CH-), fluoroalqueno (-CF = CH-), dimetileno (-CH2CH2-), tioéter (-CH2-S), hidroxietileno (-CH(OH)CH2-), metilenoxi (-CH2O-) tetrazol (CN4), sulfonamido (-SO2NH-), metilenosulfonamido

15 (CHRSO-2-NH) sulfonamida invertida (-NHSO2-) y esqueletos con subunidades malonato y/o gem-diamino-alquilo, por ejemplo, como se revisa por Fletcher et al. ((1998) Chem. Rev. 98: 763) y se detalla en las referencias citadas en el presente documento. Muchas de las sustituciones anteriores dan como resultado esqueletos poliméricos aproximadamente isostéricos con respecto a los esqueletos formados a partir de  aminoácidos.

En cada uno de los esqueletos proporcionados anteriormente, pueden adjuntarse grupos de cadena lateral que llevan un grupo cargado positivamente. Por ejemplo, los esqueletos unidos a sulfonamida (-SO2NH y -NHSO2-) pueden tener grupos de cadena lateral unidos a los átomos de nitrógeno. De forma similar, el enlace hidroetileno (-CH(OH)CH2-) puede llevar un grupo de cadena lateral unido al sustituyente hidroxi. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente las otras químicas de enlace para proporcionar grupos de cadena lateral cargados positivamente

25 usando métodos sintéticos convencionales.

En una realización, el esqueleto cargado positivamente es un polipéptido que tiene grupos de ramificación (también denominados grupos de eficacia). Como se usa en el presente documento, un grupo de eficacia o grupo de ramificación es cualquier agente que tiene el efecto de promover la translocación del esqueleto cargado positivamente a través de un tejido o membrana celular y son como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Los grupos de ramificación o de eficacia incluyen -(gly)n1 -(arg)n2 , VIH-TAT o fragmentos de los mismos, o el dominio de transducción de proteínas de Antennapedia, o un fragmento del mismo, donde el subíndice n1 es un número entero de 0 a 20, más preferentemente de 0 a 8, aún más preferentemente de 2 a 5, y el subíndice n2 es, independientemente, un número entero impar de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, más preferentemente 35 de aproximadamente 7 a aproximadamente 17, y aún más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 13 . Todavía más preferidas son las realizaciones en las que el fragmento VIH-TAT tiene la fórmula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q o (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q donde los subíndices p y q son cada uno, independientemente, un número entero de 0 a 20 y el fragmento está unido al esqueleto a través del extremo C o el extremo N del fragmento. Son fragmentos VIH-TAT preferidos aquellos en los que los subíndices p y q son cada uno, independientemente, números enteros de 0 a 8, más preferentemente de 2 a

5. En otra realización preferida, la cadena lateral cargada positivamente o grupo de ramificación es el dominio de transducción de la proteína de Antennapedia (Antp) (PTD), o un fragmento del mismo que retiene actividad. Preferentemente, el vehículo cargado positivamente incluye grupos de ramificación cargados positivamente de cadena lateral en una cantidad de al menos aproximadamente un 0,05 %, como porcentaje del peso total del

45 vehículo, preferentemente de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 45 % en peso, y aún más preferentemente de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 30 % en peso. En el caso de grupos de ramificación cargados positivamente que tienen la fórmula -(gly)n1-(arg)n2, la cantidad más preferida es de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 25 %.

En otra realización, la parte de esqueleto es una polilisina y los grupos de ramificación cargados positivamente están unidos a los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. La polilisina puede tener un peso molecular de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 1.500.000, preferentemente de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 1.200.000, aún más preferentemente de aproximadamente 100.000 a aproximadamente

1.000.000. Puede ser cualquiera de las polilisinas disponibles en el mercado (Sigma Chemical Company, St. Louis,

55 Missouri, USA), tales como, por ejemplo, polilisina que tiene PM > 70.000, polilisina que tiene PM de 70.000 a 150.000, polilisina que tiene PM de 150.000 a 300.000 y polilisina que tiene PM > 300 000. La selección de una polilisina apropiada dependerá de los demás componentes de la composición y será suficiente para proporcionar una carga positiva neta global a la composición y proporcionar una longitud que sea preferentemente de una a cuatro veces la longitud combinada de los componentes cargados negativamente. Los grupos de ramificación cargados positivamente o grupos de eficacia preferidos incluyen, por ejemplo, -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-argarg (Gly-3Arg7) o VIH-TAT. En otra realización preferida, el esqueleto cargado positivamente es una polialquilenimina de cadena larga tal como una polietilenimina, por ejemplo, una que tiene un peso molecular de aproximadamente

1.000.000.

65 Los esqueletos cargados positivamente o moléculas de vehículo que comprenden polipéptidos o polialquileniminas, que tienen los grupos de ramificación descritos anteriormente, son compuestos que forman un aspecto de esta

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de división” es cualquier sustancia o aditivo que tiene la propiedad de prevenir o minimizar la agregación indeseada

o incontrolada de la toxina botulínica con los vehículos de esta divulgación. Los agentes de división pueden ser útiles, por ejemplo, cuando tiene que emplearse una solución de toxina botulínica concentrada debido a limitaciones del volumen. En estos casos, el agente de división mantiene la toxina botulínica dispersada, con lo que se impide la

5 agregación de la toxina que en caso contrario se produciría sin el agente de división. En general, un agente de división es (1) no irritante, (2) no destruye la toxina botulínica, (3) no confiere ningún aumento de permeabilidad, (4) produce tamaños de partículas fiables y estables, (5) carece de carga y (6) no interfiere con complejos de la toxina y el vehículo transdérmico. Un ejemplo de un agente de división adecuado es etanol (EtOH). En realizaciones preferidas, el EtOH constituye menos del 20% de la composición, y más preferentemente, menos del 5% de la composición.

A modo de ejemplo, si las limitaciones de volumen requieren reconstituir 100 U de toxina botulínica en 0,5 ml de solución, en lugar de 2,5 ml, típicamente se observa que la toxina botulínica presentará una agregación indeseable, y por lo tanto menor actividad. Sin embargo, al añadir EtOH al 1 % como agente de dispersión, se mantiene la

15 actividad completa incluso después de 24 horas a esta concentración. Como otro ejemplo, el Bótox® a una reconstitución en 1,0 ml de NaCl al 0,9 % tiene actividad completa, mientras que la reconstitución a 0,5 ml en EtOH al 1 % y 5 % más NaCl al 0,9% produce soluciones con actividad completa.

Los puentes de oligo-o polianiones divulgados pueden añadirse a las composiciones de toxina botulínica para mejorar la formación de complejos de la toxina con el vehículo de esqueleto cargado positivamente. Como es bien conocido en este campo, la toxina botulínica realmente es un complejo de diferentes proteínas, de las que algunas están cargadas positivamente, y otras están cargadas negativamente. Debido a que la distribución exacta de los componentes de la toxina varía dependiendo de la fuente de la toxina, es posible que la toxina botulínica de ciertas fuentes tenga menor propensión a formar complejos con los esqueletos cargados positivamente descritos en el

25 presente documento. Sin embargo, se divulga el descubrimiento de que mediante la adición de un puente de oligo o polianión a dichas toxinas botulínicas, aumenta espectacularmente la eficacia y la eficiencia de la administración tópica. Los ejemplos adecuados de dichos puentes de oligo/polianión incluyen fosfato sódico (5 %), PBS o poli-Laspartato al 5 % (por ejemplo, con un PM de 3000).

Las composiciones de acuerdo con esta divulgación pueden estar en forma de composiciones de liberación controlada o de liberación sostenida, donde la toxina botulínica y el vehículo están encapsulados o contenidos de otra manera dentro de un material de tal forma que se liberan en la piel de una manera controlada a lo largo del tiempo. La toxina botulínica y el vehículo pueden estar contenidos dentro de matrices, liposomas, vesículas, microcápsulas, microesferas y similares, o dentro de un material sólido en forma de partículas, seleccionándose y/o

35 construyéndose todas ellas para proporcionar la liberación de la toxina botulínica a lo largo del tiempo. La toxina botulínica y el vehículo pueden encapsularse conjuntamente (por ejemplo, en la misma cápsula) o por separado (en cápsulas separadas).

Usando las composiciones descritas en el presente documento, la toxina botulínica puede liberarse en músculos subyacentes a la piel, o en estructuras glandulares dentro de la piel, en una cantidad eficaz para producir parálisis, producir relajación, aliviar contracciones, prevenir o aliviar espasmos, reducir la producción glandular u otros efectos deseados. De esta manera, la liberación local de la toxina botulínica podría permitir reducciones de la dosificación, reducir la toxicidad y permitir una optimización de la dosificación más precisa para los efectos deseados con respecto a los materiales inyectables o implantables.

45 Las composiciones se aplican para administrar una cantidad eficaz de la toxina botulínica. La expresión “cantidad eficaz” como se usa en el presente documento, significa una cantidad de una toxina botulínica como se ha definido anteriormente que es suficiente para producir la parálisis muscular deseada u otro efecto biológico o estético, pero que implícitamente es una cantidad segura, es decir, una que es suficientemente baja como para evitar efectos secundarios graves. Los efectos deseados incluyen la relajación de ciertos músculos con la intención de, por ejemplo, reducir la aparición de líneas y/o arrugas finas, especialmente en la cara, o ajustar el aspecto facial de otras formas tal como aumentando los ojos, elevando las comisuras de la boca o suavizando líneas que se despliegan en abanico desde el labio superior, o el alivio general de la tensión muscular. El efecto mencionado en último lugar, el alivio general de la tensión muscular, puede realizarse en la cara o en otros sitios. Las composiciones pueden

55 contener una cantidad eficaz apropiada de la toxina botulínica para aplicación como un tratamiento de una sola dosis, o pueden estar más concentradas, para diluirse en el sitio de administración o para usarse en múltiples aplicaciones. Mediante el uso de los vehículos cargados positivamente de esta invención, una toxina botulínica puede administrarse transdérmicamente a un sujeto para tratar afecciones tales como espasmos indeseables del músculo facial u otros espasmos musculares, hiperhidosis, acné o afecciones en cualquier parte del cuerpo en el que se desee el alivio del dolor o de los espasmos musculares. La toxina botulínica se administra tópicamente para la liberación transdérmica en músculos o en otras estructuras asociadas con la piel. La administración puede realizarse, por ejemplo, en las piernas, hombros, espalda (incluyendo zona lumbar), axila, palmas, pies, cuello, ingle, dorso de las manos o pies, tobillos, parte superior del brazo, rodillas, parte superior de las piernas, nalgas, torso, pelvis o cualquier otra parte del cuerpo en la que se desee la administración de la toxina botulínica.

65 La administración de toxina botulínica también puede realizarse para tratar otras afecciones, incluyendo el

tratamiento del dolor neurológico, prevención o reducción de migrañas u otro dolor de cabeza, prevención o reducción del acné, prevención o reducción de la distonía o contracciones distónicas (subjetivas o clínicas), prevención o reducción de síntomas asociados con la hiperhidosis subjetiva o clínica, la reducción de la hipersecreción o sudoración, la reducción o potenciación de la respuesta inmunitaria, o el tratamiento de otras

5 afecciones para las que se ha sugerido o realizado la administración de toxina botulínica por inyección.

La administración de toxina botulínica u otras proteínas terapéuticas descritas en el presente documento también puede realizarse con fines relacionados con la inmunización. Sorprendentemente, la administración de toxina botulínica descrita en el presente documento puede realizarse para reducir respuestas inmunitarias. Más específicamente, esta invención permite liberar una toxina botulínica por una vía de administración alterada, cambiando de este modo la presentación del antígeno complejo del agente. De esta forma, la divulgación puede ser útil para reducir una respuesta inmunitaria contra antígenos de la toxina botulínica, y para facilitar la administración repetida sin una reducción de actividad relacionada con el sistema inmunitario. Como alternativa, el complejo puede prepararse y aplicarse tópicamente para aumentar una respuesta inmunitaria, por ejemplo para proporcionar

15 inmunizaciones con respecto a diversas proteínas, por ejemplo, para inmunizaciones de niños sin inyecciones. Para uso en relación con la actividad relacionada con el sistema inmunitario, una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad de la toxina botulínica suficiente para permitir que un sujeto cree una respuesta inmunitaria a la toxina botulínica después de la aplicación o de una serie de aplicaciones de la misma.

Más preferentemente, las composiciones se administran por o bajo la dirección de un médico u otro profesional sanitario. Pueden administrarse en un único tratamiento o en una serie de tratamientos periódicos a lo largo del tiempo. Para la liberación transdérmica de la toxina botulínica para los fines mencionados anteriormente, una composición como se ha descrito anteriormente se aplica tópicamente en la piel en una localización o localizaciones en las que se desea el efecto. En realizaciones donde se aplica directamente en la piel una solución acuosa de

25 vehículo/toxina botulínica, es preferible cubrir el área tratada (por ejemplo, con hidratante Cetaphil®) para ocluir el área tratada con una barrera (por ejemplo, Telfa) para impedir que se seque la solución, lo cual conduciría a una reducción de la actividad de la toxina. Debido a su naturaleza, más preferentemente, la cantidad de toxina botulínica aplicada debe aplicarse con cuidado, a una proporción y frecuencia de aplicación que produzca el resultado deseado sin producir ningún resultado adverso o indeseado. Por consiguiente, por ejemplo, las composiciones tópicas de la invención deben aplicarse en una proporción de aproximadamente 1 U a aproximadamente 20.000 U, preferentemente de aproximadamente 1 U a aproximadamente 10.000 U de toxina botulínica por cm2 de superficie de la piel. Preferentemente podrían emplearse, por ejemplo, dosificaciones superiores dentro de estos intervalos junto con materiales de liberación controlada o permitir un tiempo de permanencia más corto en la piel antes de la eliminación.

35 La preparación apropiada de la superficie de la piel antes de la aplicación de la composición de toxina botulínica /vehículo es importante para mantener la eficacia de la solución. Por ejemplo, la introducción de tensioactivos en la superficie de la piel con el fin de eliminar los aceites de la superficie presentes en la piel antes de la aplicación, sorprendentemente, es contraproducente, porque los tensioactivos parecen destruir la actividad de la toxina botulínica. Esto tiene lugar incluso si la piel se lava posteriormente con agua varias veces antes de la aplicación de la solución de toxina botulínica/vehículo. Incluso tensioactivos extremadamente suaves, tales como los que se encuentran en las toallitas para los bebés, parecen producir este fenómeno. Por consiguiente, en métodos preferidos de administración de las composiciones de esta invención, la piel se limpia previamente usando únicamente agua. El lavado únicamente con agua también parece mejorar moderadamente el transporte transdérmico de la toxina

45 botulínica.

Además, la piel puede exfoliarse para reducir la capa de estrato córneo antes de la aplicación del complejo de toxina botulínica/vehículo. En principio, el proceso de exfoliación de la piel debe mejorar la eficacia del transporte transdérmico de toxina botulínica. Sin embargo, el método usado para exfoliar la piel es importante. Por ejemplo, la reducción de la capa córnea mediada por acetona en seres humanos o animales parece reducir la actividad de la toxina botulínica aplicada posteriormente. Por el contrario, la exfoliación con cinta adhesiva (es decir, la aplicación de una cinta adhesiva en la superficie de la piel y después retirada de la cinta) parece permitir una penetración más profunda de la toxina botulínica y la reducción de la dosificación tanto en modelos de ratón como en seres humanos. Se supone que la abrasión de la superficie de la piel (por ejemplo, mediante el uso de almohadillas abrasivas)

55 causaría un efecto similar la exfoliación con cinta adhesiva.

Esta divulgación también comprende dispositivos para la transmisión transdérmica de una composición que contiene toxina botulínica y un vehículo que tiene un esqueleto cargado positivamente con grupos de ramificación unidos como se define en el presente documento. Dichos dispositivos pueden ser de construcción sencilla tal como un parche cutáneo, o pueden ser dispositivos más complicados que incluyen medios para distribuir y controlar la distribución de la composición, y opcionalmente medios para controlar el estado del sujeto (por ejemplo, controlar la reacción del sujeto a las sustancias que se están distribuyendo).

Debe indicarse que la elección de materiales para la construcción del dispositivo es importante. Son materiales

65 preferidos para la construcción de dispositivos de liberación los que no conducen a una pérdida de actividad de la solución de toxina botulínica/vehículo mediante degradación o adsorción indeseada de la toxina botulínica en una

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liberación funcional estadísticamente significativa de la toxina botulínica a través de la piel con respecto a los dos controles, que fueron comparables entre sí. Otras repeticiones independientes adicionales (un total de tres experimentos independientes, todos con conclusiones idénticas en parálisis estadísticamente significativa por toxina botulínica tópica con KNR pero sin controles) del presente experimento confirmaron los presentes hallazgos y no

5 revelaron diferencias significativas entre la toxina botulínica tópica con o sin K (es decir, los dos controles). Es interesante destacar que los ratones ambulaban constantemente hacia un miembro paralizado (lo cual ocurrió en el 100 % de los animales tratados y en el 0 % de los controles de cualquier grupo de control). Como se muestra en la Figura 2, un miembro tratado con toxina botulínica más el policatión de control polilisina o con toxina botulínica sin policatión (“Botox solo”) puede movilizar los dedos (como un mecanismo de defensa cuando se agarra), pero los miembros tratados con toxina botulínica más el vehículo peptidílico KNR (“Loción Essentia Botox”) no podían moverse.

Tabla 2: Puntuaciones de abducción digital 30 minutos después de una única aplicación tópica de toxina botulínica con el vehículo peptidílico KNR (“JMW-9”), con un policatión de control K (“JMW-10”), o sola (“JMW-11”). 15

Grupo

Media Error típico

JMW-9

3,333 0,333

JMW-10

0,333 0,333

JMW-11

0,793 0,300

P = 0,0351 (significativo a 95 %)

Conclusiones:

Este experimento sirve para demostrar que el vehículo transdérmico peptidílico puede transportar una cantidad terapéuticamente eficaz de botulinum terapéutico a través de la piel sin la modificación covalente del agente terapéutico. El experimento también confirma que la toxina botulínica no funciona cuando se aplica tópicamente en los controles.

Ejemplo 3.

25 Eficacia terapéutica de una preparación tópica de toxina botulínica con un vehículo no peptidílico.

Este experimento demuestra el comportamiento de un vehículo no peptidílico en la invención.

Métodos:

Selección del esqueleto:

El esqueleto cargado positivamente se ensambló conjugando -Gly3Arg7 con polietilenimina (PEI) PM 1.000.000 a través del carboxilo de la glicina terminal con aminas libres de las cadenas laterales de PEI a un grado de saturación

35 del 30 % (es decir, 30 de cada 100 restos de lisina se conjugan con un -Gly3Arg7). El esqueleto modificado se denominó “PEIR” para indicar el vehículo no peptidílico grande. El policatión de control era PEI no modificado (denominado “PEI”, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. Se usó el mismo agente terapéutico de toxina botulínica en el Ejemplo 1.

La toxina botulínica se reconstituyó a partir del producto Botox de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En todos los casos se empleó un exceso de policatión para ensamblar un complejo final que tiene un exceso de carga positiva como en la liberación de complejos nucleotídicos grandes altamente negativos. Una carga neta neutra o positiva impide la repulsión del complejo de los proteoglicanos de la superficie celular altamente negativos y la matriz extracelular. La dosis de toxina botulínica se estandarizó entre todos los grupos así como el volumen total y el pH

45 final de la composición a aplicar tópicamente. Las muestras se prepararon como se indica a continuación:

Grupo etiquetado como “AZ”: se mezclaron 2,0 unidades de toxina botulínica por alícuota (es decir, 60 U en total) y el vehículo no peptidílico PEIR en forma ultrapura a una relación de PM calculada de 5:1, se mezclaron hasta la homogeneidad y se diluyeron hasta 600 microlitros con solución salina tamponada con fosfato. La composición resultante se mezcló hasta la homogeneidad con 5,4 ml de Cetaphil y se dividió en alícuotas de 200 microlitros.

Grupo etiquetado como “BA”: se mezclaron 2,0 unidades de toxina botulínica por alícuota (es decir, 60 U en total) y PEI a una relación de carga de 5:1, se mezclaron hasta la homogeneidad y se diluyeron hasta 600 microlitros con solución salina tamponada con fosfato. La composición resultante se mezcló hasta la homogeneidad con 5,4 ml de

55 Cetaphil y se dividió en alícuotas de 200 microlitros.

Experimento en animales para determinar la eficacia terapéutica después de un único tratamiento:

Los animales se anestesiaron por inhalación de isoflurano durante la aplicación de los tratamientos. Después de anestesiarse, 6 ratones C57 negros (n = 3 por grupo) se sometieron a la aplicación tópica de una dosis medida de

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o tortícolis así como al alivio del dolor relacionado con espasmos musculares tales como el dolor lumbar.

Ejemplo 5

5 Eficacia terapéutica de una preparación de toxina botulínica tópica con vehículo peptidílico para la hiperhidrosis axilar.

Este experimento demuestra si la toxina botulínica puede liberarse terapéuticamente a través de la piel intacta como un agente tópico usando este vehículo peptidílico para el tratamiento de la hiperhidrosis axilar en sujetos humanos (n = 10 axilas por grupo, con una axila tratada y un control por paciente con un diseño de doble enmascaramiento aleatorio).

Criterios de inclusión para el estudio de hiperhidrosis axilar:

15 • Edad: 18 años o más

•

Voluntarios sanos

•

Consentimiento informado proporcionado y firmado por el voluntario

•

Intención del sujeto de seguir las instrucciones y volver para las visitas de seguimiento

•

El sujeto tiene hiperhidrosis subjetiva preexistente

•

El sujeto es una mujer no embarazada o que no planea quedarse embarazada en los 3 meses siguientes

•

El sujeto vive y/o trabaja en San Francisco o cerca del área de estudio

•

El sujeto no se ha sometido a un tratamiento para la sudoración axilar en los últimos 6 meses

•

El sujeto no planea someterse a un tratamiento para la sudoración axilar en los 3 meses siguientes

25 Procedimientos de medición gravimétrica:

Como parte del procedimiento de medición gravimétrica, los sujetos primero se aclimataron al área de ensayo. Específicamente, cada sujeto permaneció durante 15 minutos a una temperatura ambiente de 22,22 -25 °C en la posición de reposo.

Preparación Axilar: (Para los siguientes procedimientos se utilizaron guantes de nitrilo sin polvo). El sujeto se puso una capa desechable y un sujetador (si era una mujer) o se quitó todas las prensas corporales superiores (si era un hombre) para exponer las dos axilas completamente. Se predeterminó que el área de dosificación era el área cubierta por piel que tenía vello, más un área que se extendía un 1 cm más allá de la piel con vello en cada axila. El

35 área de dosificación se limpió con una gasa estéril prehumedecida procedente de un tubo cónico de 50 ml limpiando con 5 pases largos desde la parte superior a la parte inferior en la misma dirección usando un lado de la gasa. Esta etapa se repitió tres veces más con una gasa prehumedecida limpia cada vez mientras se tenía cuidado de no irritar

o erosionar la piel. Las gasas se tiraron a la basura. Se repitió el mismo procedimiento de lavado para la otra axila. La axila se secó con gasa estéril seca usando un movimiento firme desde la parte superior a la inferior de la axila mientras se tenía cuidado de no irritar o erosionar la piel. Después, la axila se secó adicionalmente poniendo un papel de filtro bajo el pliegue axilar y dejando que el filtro permaneciera en el sitio de ensayo durante 5 minutos después del procedimiento para la evaluación gravimétrica. El paciente permaneció con sus brazos contra su cuerpo en una posición de reposo. Los papeles de filtro se tiraron a la basura. Se dejó que el sujeto permaneciera en reposo durante 1 minuto sin manipulación de la axila antes de la primera evaluación gravimétrica.

45 Medición de la producción del sudor (medición gravimétrica): (Antes de estas mediciones la persona encargada se puso un nuevo par de guantes de nitrilo sin polvo). El sujeto mantuvo sus manos juntas en la parte posterior de la cabeza para exponer las axilas completamente, mientras estaba parcialmente reclinado (aproximadamente 45 grados). Se retiró un papel de filtro pesado previamente de un tubo cónico de almacenamiento y se puso bajo la axila del sujeto alineando el borde del filtro con el centro de la línea del pliegue axilar. El papel de filtro se mantuvo en su sitio usando los dedos mientras que el sujeto relajaba los brazos hasta el costado del cuerpo. El sujeto mantuvo ambos brazos firmemente contra su tronco durante cinco minutos. La medición del tiempo se inició cuando los papeles de filtro estaban colocados de forma segura bajo las dos axilas. Las dos axilas se midieron simultáneamente. Después de 5 minutos, se retiraron los papeles de filtro de las axilas y se pusieron de nuevo en

55 los mismos tubos cónicos respectivos. El papel de filtro que se puso primero se retiró primero. Las tapas de los tubos cónicos se pusieron firmemente rosca para prevenir la evaporación del sudor del tubo. La producción de sudor se repitió dos veces más a intervalos de un minuto.

Ensayo de almidón/yodo de Minor:

El sujeto permaneció con sus manos juntas en la parte posterior de la cabeza para exponer las axilas completamente. La solución de yodo se pintó sobre el área predeterminada de la axila como se ha indicado anteriormente con una gasa estéril y se dejó secar al aire. Cuando el yodo se hubo secado completamente, se aplicó una capa fina de almidón en el área cubierta por yodo con bolas de algodón. El yodo se dejó secar al aire antes de

65 la aplicación de almidón para reducir los falsos positivos y el efecto de fondo. El sujeto después mantuvo ambos brazos firmemente contra su tronco. Después de 5 minutos, el sujeto elevó sus brazos y mantuvo las manos juntas

en la parte posterior de la cabeza para exponer las axilas completamente. Se tomaron fotografías de cada axila, tanto de la axila izquierda como de la derecha con la fecha claramente etiquetada. Las axilas se limpiaron con EtOH al 70 % y después con agua desionizada estéril.

5 Preparación Tratamiento:

Se preparó Kn21pr a una concentración de 1 mg/ml con solución salina más EtOH al 5 % (es decir, se prepararon alícuotas de 500 microlitros de Kn21pr y se añadieron 25 microlitros de EtOH al 100 %). Como se usa en el presente documento, Kn21pr se refiere a un esqueleto de polilisina cargado positivamente con un peso molecular de 21.000 y grupos de ramificación que comprenden oligoarginina protegida. Se reconstituyeron 100 unidades de Botox® (Allergan, Irvine, CA) con 0,75 mililitros de cloruro sódico al 0,9% (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) usando una jeringa látex de estéril 3 ml con 18G 11/2 (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey). El Botox® reconstituido se mezcló cuidadosamente por inversión 8 veces. Se usaron 200 unidades de Botox® para cada sujeto. La solución de tratamiento se preparó con 200 unidades de Botox® y Kn21pr más EtOH al

15 5 % de (es decir, se añadieron 1,5 mililitros de Botox® a 500 microlitros de Kn21pr más 25 microlitros de EtOH al 100 %) y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que se formaran los complejos. Después de un período de incubación de 5 minutos, se añadieron aproximadamente 1,0 mililitros de HPC (hidroxipropilcelulosa) al 4 % (con EtOH al 1 %) y se mezclaron suavemente y minuciosamente con una pequeña espátula metálica. La solución de tratamiento homogénea se transfirió a una jeringa de 3 ml y se tapó la punta de la jeringa. (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey).

La solución de control se preparó con cloruro sódico al 0,9 % y Kn21pr más EtOH al 5% (es decir, se añadieron 1,5 mililitros de cloruro sódico al 0,9 % a 500 microlitros de Kn21pr más 25 microlitros de EtOH al 100 %) y se mantuvo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, se añadieron aproximadamente 1,0

25 mililitros de HPC al 4% (con EtOH al 1 %) y se mezclaron suavemente y minuciosamente con una pequeña espátula metálica. La solución de control homogénea se transfirió a una jeringa de 3 ml y se tapó la punta de la jeringa.

Aplicación de tratamiento (usando guantes de nitrilo sin polvo):

El sujeto mantuvo sus manos juntas con los dedos entrelazados y puestos en la parte posterior de la cabeza para exponer completamente sus axilas. Después, el sujeto se reclinó en una silla formando un ángulo de aproximadamente 45 grados. Como se muestra en la Figura 7, el área de dosificación se localizó visualmente (es decir, 1 cm más allá de la piel con vello) para la aplicación. Se comprobó que el área de dosificación estaba seca. Se retiró la tapa de la punta de la jeringa de la jeringa etiquetada con la marca “L” en el caso de la axila izquierda y con

35 una “R” en el caso de la axila derecha, y se preparó para la aplicación en la axila del sujeto. La solución de tratamiento se extendió uniformemente alrededor del área de dosificación con una jeringa y se masajeó en la piel con los dedos durante 1 minuto. El sujeto después puso sus brazos a lo largo del costado del cuerpo y permaneció en esta posición durante 60 minutos. Después de la incubación de 60 minutos, el tratamiento se limpió con gasas estériles. Las gasas y los guantes se tiraron en una bolsa de contaminantes biológicos. Se dejó marchar al sujeto.

Resultados:

La BT tópica Essentia redujo la sudoración en un 65 % y se ilustra en la Figura 8a. La producción de sudor 4 semanas después del tratamiento (aleatorizado por costado) con esqueleto Kn21pr solo (control) o esqueleto kn21pr

45 más 200 U de Botox (relación con el punto inicial). Análisis estadísticos por rangos con signos de Wilcoxon usando NPSS siendo P como se ha indicado anteriormente y significación de p < 0,05. [n = 10 sujetos].

Segunda comparación: Punto inicial frente a 4 semanas (véase la Figura 8b). La producción de sudor (mg por 5 minutos) 4 semanas después del tratamiento axilar (aleatorizado por costado) con esqueleto kn21pr solo (control) o esqueleto kn21pr más 200 U de Botox (relación de tratamiento con respecto al control) se presenta en la Tabla 6. Análisis estadísticos por rangos con signos de Wilcoxon usando NPSS, siendo P como se ha indicado y significado a p < 0,05. (Pr T p = 0,0217) [n = 10].

La Figura 9 muestra fotografías que representan el ensayo de almidón/yodo de Minor antes y después del

55 tratamiento con “Loción Essentia Botox” tópicamente para el tratamiento de la hiperhidrosis axilar. Se muestra el ensayo de almidón/yodo en el punto inicial frente a 2 semanas donde la axila derecha se trató con “Loción Essentia Botox” (a y c) y a la axila izquierda se le aplicó el control (b y d) para el sujeto Nº 12. Estas fotografías ilustran los efectos beneficiosos típicos observados después del tratamiento con vehículo + bótox en almidón yodo. Aunque se observa algún dato cruzado en el lado de control (coherente con una reducción del 25 % en los datos gravimétricos), se producen reducciones significativas con el tratamiento (coherente con una reducción del 65 % en los datos gravimétricos en el lado tratado). Conclusiones:

Este ejemplo confirma que la aplicación tópica de complejos de toxina botulínica formados de acuerdo con la

65 invención, desvelados en el presente documento, produce rápidamente un efecto terapéutico beneficioso en la reducción de la sudoración en una cohorte de pacientes con hiperhidrosis -subjetiva o cuantitativa. Este efecto en la

reducción de la sudoración también se ha producido en el caso de la frente presentada anteriormente y en la aplicación palmar/plantar cuando se combina con un guante para limitar la extensión de la formulación durante el tiempo de permanencia. Esta liberación transepitelial de complejos de toxina botulínica para obtener efectos terapéuticos beneficiosos confirma adicionalmente que el enfoque puede ampliarse a otros casos en los que la

5 función de SNAP o las señales de acetilcolina son cruciales tales como el espasmo o disfunción de vejiga, aplicaciones gastrointestinales o secreciones de glándulas sebáceas para la reducción del olor o la prevención/tratamiento del acné.

Claims (1)

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