ES2553457T3 - Inactivación de un patógeno en una muestra mediante un tratamiento con formalina y luz UV - Google Patents
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Abstract
Un método para inactivar un virus contenido en una muestra, que comprende las etapas de: (i) tratar la muestra con una concentración eficaz de formalina y (ii) someter la muestra a una dosis eficaz de luz UV en un aparato de flujo continuo, en el que el aparato de flujo continuo comprende (1) una lámpara UV y (2) una cámara de capa delgada, teniendo la capa delgada de la cámara de capa delgada un espesor no mayor que 1 cm y en el que la muestra se hace pasar a través de la cámara de capa delgada del aparato de una manera cíclica o en serie, repitiendo 2 a 10 veces, en el que la etapa (i) se realiza previamente a la etapa (ii) o viceversa y en el que el caudal de la muestra a través del aparato es de 50 litros por hora a 1.000 litros por hora.
Description
Tabla 1 Características de la cámara de inactivación UV.
- Lámpara de UV
- 110 v
- longitud de la lámpara
- 950 mm
- Lámpara de UV Ø
- 30 mm
- cámara que rodea a la lámpara de UV Ø
- 32 mm
- capa delgada
- 1 mm
- volumen total/cámara
- 92 ml
- tiempo de contacto/cámara
- 1,4 segundos
La recolección monovalente se expone a 10 ciclos UV. Después de cada ciclo se retiran 20 litros de la recolección
5 monovalente tratada con UV y se purifica además por purificación en gradiente de sacarosa usando condiciones de ultracentrifugación continuas con un gradiente de sacarosa al 42% extendido en tampón Tris 20 mM y una recolección monovalente purificada definida (PMVH, por sus siglas en inglés) de 48% a 36% de sacarosa usando una centrífuga Sorvall CC40 sin preclarificador (Hitachi Koki Co, LTD., Tokio, Japón).
Tabla 2
10 Resumen de realizaciones de ultracentrifugación de formalina e Influenza Panamá tratada con UV.
- Realización de ultracentrifugación
- Condiciones de inactivación
- UZ-INF-45-03
- no UV
- UZ-INF-48-03
- 240 l/hora, 1 ciclo
- UZ-INF-52-03
- 240 l/hora, 2 ciclos
- UZ-INF-51-03
- 240 l/hora, 3 ciclos
- UZ-INF-50-03
- 240 l/hora, 4 ciclos
- UZ-INF-49-03
- 240 l/hora, 5 ciclos
- UZ-INF-58-03
- 240 l/hora, 7 ciclos
- UZ-INF-57-03
- 240 l/hora, 10 ciclos
(A) Rendimiento de antígeno y pureza.
Se comparan el rendimiento y la pureza de antígeno de influenza basándose en contenido en hemaglutinina (HA), proteína total y proteína Vero (proteína de células huésped). Se compara el virus purificado sobre la base de la 15 relación HA/proteína, relación de proteína de células huésped/HA y seguridad del virus (cf. Tabla 3). Para todas las recolecciones tratadas con UV no se pudo detectar crecimiento vírico. Por el contrario, se puede multiplicar el virus purificado procedente del procedimiento de inactivación con formalina estándar (no radiación UV aplicada) en cultivo de células Vero. Aunque se puede observar una ligera reducción en la relación HA /proteína después del ciclo 7 y 10, no se detecta una diferencia significativa de producto inactivado con formalina e inactivado doble con respecto a
20 la pureza de antígeno medida como HA/proteína y la relación proteína de células huésped/HA.
8
Tabla 5
Virus Panamá purificado con gradiente de sacarosa después de tratamiento con formalina y UV (0 a 10 ciclos). Comparación de la inmunogenicidad ensayada en conejillos de indias y ratones. A) después de 3 semanas, B) después de 6 semanas. HAI con antígeno de la Influenza procedente de huevo y Vero.
5 A.
- Número de ciclos UV
- Tiempo de contacto (s) Título de HAI de conejillos de indias después de 3 semanas Título de HAI de ratones después de 3 semanas
- Huevo
- Vero Huevo Vero
- 0
- 0 (no UV) 160 320 320 1.280
- 1
- 1,4 160 320 320 1.280
- 2
- 2,8 160 640 320 1.280
- 3
- 4,2 160 320 320 1.280
- 5
- 7,0 160 320 320 1.280
- 7
- 9,8 160 320 320 1.280
- 10
- 14 160 640 320 1.280
- control
- - 40 20 80 80
B
- Número de ciclos UV
- Tiempo de contacto (s) Título de HAI de conejillos de indias después de 6 semanas (Refuerzo) Título de HAI de ratones después de 6 semanas (Refuerzo)
- Huevo
- Vero Huevo Vero
- 0
- 0 (no UV) 1.280 1.280 1.280 2.560
- 1
- 1,4 1.280 2.560 640 1.280
- 2
- 2,8 1.280 1.280 640 1.280
- 3
- 4,2 640 1.280 1.280 2.560
- 5
- 7,0 1.280 2.560 1.280 2.560
- 7
- 9,8 640 1.280 1.280 2.560
- 10
- 14 1.280 2.560 1.280 2.560
- control
- - 160 80 160 40
Los resultados resumidos en la Tabla 4 y la Tabla 5 muestran que el tratamiento con UV no da como resultado
10 diferencias significativas en los títulos de HAI que demuestran que la antigenicidad y así la inmunogenicidad del producto no se ve afectada.
En todos los experimentos de doble inactivación se puede demostrar la seguridad total incluso después de 1 ciclo de tratamiento UV. Las investigaciones detalladas en laboratorio y escala final demostraron la eficacia de la etapa de irradiación con UV cuando se combina con tratamiento con formalina. La caracterización inmunológica del antígeno
15 de virus purificado después de tratamiento con UV proporciona resultados comparables a los obtenidos sin producto no tratado con UV. No se puede detectar efecto negativo sobre las características bioquímicas ni la inmunogenicidad del producto vírico.
Ejemplos 6: Reducción del título de virus con inactivación con formalina y/o UV.
La reducción del título de virus por el tratamiento combinado de la muestra con una concentración eficaz de
20 formalina y una concentración eficaz de luz UV en un aparato de flujo continuo se ensaya con diferentes virus. La inactivación con formalina se llevó a cabo a 32 °C durante 24 horas con una concentración final de formalina de 0,025% (p/v). La inactivación UV en el aparato de flujo continuo se lleva a cabo durante 3 ciclos a un caudal de 240 l/hora. El tiempo de contacto de la muestra con la luz UV por ciclo es 1,4 segundos.
10
(C) Inactivación UV de RRV infeccioso.
Para las consideraciones mencionadas anteriormente, se llevaron a cabo experimentos a pequeña escala para inactivar RRV por irradiación UV. Los sobrenadantes de RRV PV fueron irradiados con UV durante diferentes cantidades de tiempo con dos intensidades UV: 2,1 mv/cm2 (muestras 1-10) y 3,3 mv/cm2 (muestras 11-20). Con
5 posterioridad, estas muestras se sometieron a titulación de virus, titulación de antígeno (EIA) y se determinó el título de hemaglutinación. Las muestras, que fueron irradiadas durante más de 3 minutos (Nos. 6-10 y 14-19), también fueron sometidas a ensayo de seguridad en células C6-36 (Tabla 9).
Los títulos de virus cayeron después de 10 minutos de irradiación UV de 7,4 log TCID50/ml (control, muestra 1) a 1,5 log TCID50/ml con ambas intensidades de UV. La hemaglutinación permaneció estable durante 15 minutos a una 10 intensidad UV de 2,1 mv/cm2 con un título de HA de 9, pero descendió a 8 a una intensidad de UV de 3,3 mv/cm2. Los títulos de antígeno (EIA) también permanecieron estables durante 15 minutos de irradiación, dentro de un intervalo entre 640-1.280. Los ensayos de seguridad, llevados a cabo con muestras irradiadas durante 3 y 5 minutos a una intensidad de UV de 2,1 mv/cm2 (muestra Nº 6 y 7), aún mostraron CPE en cultivo celular y proporcionaron títulos de virus de 8,2 y 8,6 log TCID50/ml, respectivamente. Los ensayos de seguridad, llevados a cabo con
15 muestras irradiadas durante 2, 3 y 5 minutos a la mayor intensidad UV de 3,3 mv/cm2 (muestra Nº 6 y 7), aún mostraron CPE en cultivo celular y dieron como resultado títulos de virus de 8,2, 8,6 y 8,7 log TCID50/ml, respectivamente. Después de 10 minutos de irradiación, todos los ensayos de seguridad fueron negativos.
La irradiación con UV a las intensidades de tanto 2,1 mv/cm2 como 3,3 mv/cm2 durante más de 10 minutos inactivó las preparaciones de RRV completamente. La antigenicidad, como se muestra en los ensayos de HA y EIA,
20 permaneció no dañada a las dos intensidades de irradiación durante 15 minutos. Después de 30 minutos, la antigenicidad se vio afectada.
15
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