ES2537426T3

ES2537426T3 - Vacuna recombinante para la rinitis infecciosa aviar y método para producirla

Info

Publication number: ES2537426T3
Application number: ES09834924.4T
Authority: ES
Inventors: Ryuichi Sakamoto; Susumu Baba; Masashi Sakaguchi; Hiroshi Mizokami
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 2008-12-25
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2015-06-08
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: US8647634B2; KR20110114600A; WO2010074126A1; JP5568017B2; MX2011006903A; CN102333539B; US20130183330A1; ES2616533T3; JPWO2010074126A1; EP2382985A1; KR101652060B1; EP2382985B1; EP2853270A1; CN102333539A; US20120003257A1; BRPI0924068A2; EP2853270B1; EP2382985A4

Abstract

Un proceso para preparar una vacuna recombinante de rinitis infecciosa aviar que comprende una etapa de construir un hospedador que puede producir como cuerpo de inclusión un péptido de fusión que consiste en un fragmento peptídico (Péptido A) derivado de la proteína HMTp210 de Avibacterium paragallinarum serotipo A y un fragmento peptídico (Péptido C) derivado de la proteína HMTp210 de Avibacterium paragallinarum serotipo C, una etapa de cultivar dicho hospedador y de recoger y purificar una fracción del cuerpo de inclusión del cultivo, y una etapa de preparar una preparación que comprende dicha fracción purificada del cuerpo de inclusión, donde el péptido A y el péptido C consiste en 600 restos de aminoácidos o menos, donde el péptido A comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 35 mientras que el Péptido C comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 56.

Description

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se sustituyen uno o varios aminoácidos. Un "mutante del anterior péptido donde se eliminan, añaden o sustituyen uno o varios aminoácidos" tal como se usa en el presente documento se refiere al anterior péptido donde se eliminan, añaden o sustituyen 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos. Se puede obtener un fragmento de ADN que codifica dicho péptido mutante mediante hibridación con un fragmento de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del anterior péptido en condiciones restrictivas o un método para introducir una mutación tal como una mutagénesis dirigida al emplazamiento. Esto puede llevarse a cabo utilizando kits comercialmente disponibles.

Se puede utilizar cualquier combinación de un fragmento de ADN derivado del gen HMTp210A y un fragmento de ADN derivado del gen HMTp210C siempre que un péptido resultante pueda formar un cuerpo de inclusión. Por ejemplo, un fragmento de ADN que codifica un péptido de fusión puede ser un fragmento de ADN derivado del gen HMTp210A en la dirección 3' al cual se une un fragmento de ADN derivado del gen HMTp210C o viceversa. Pueden combinarse también fragmentos de ADN de un péptido de fusión entre sí en tándem. Asimismo, se pueden unir entre sí dos o más fragmentos de ADN derivados del gen HMTp210A y se pueden unir en la dirección 3' de dos o más fragmentos de ADN derivados del gen HMTp210C. Un ADN que codifica un péptido de fusión puede consistir en un fragmento de ADN derivado del gen HMTp210A y un fragmento de ADN derivado del gen HMTp210C en una relación de 1 del anterior a de 1 a 3 del posterior. Preferentemente, dicha relación es 1:1. Se puede determinar una secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN obtenido, tras clonar en pBluescript II SK+ (Stratagene) o pCR2.1-TOPO (Invitrogen), con un secuenciador de ADN (ABI Prism 377 Applied Biosystems).

Se pueden incorporar los fragmentos de ADN obtenidos de esta manera de A.pg-A y A.pg-C o el fragmento de ADN que codifica un péptido de fusión en un vector de expresión adecuado, que se puede introducir a continuación en un hospedador para la expresión de cada uno de los fragmentos de ADN. Se pueden usar de forma usual para la expresión de una proteína o péptido heterólogo, bacterias, levaduras, células animales, células vegetales, células de insectos, y similares, entre los cuales, se puede utilizar cualquier hospedador siempre que se pueda producir un cuerpo de inclusión. Para la transformación de una célula hospedadora, se pueden usar métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, se puede usar una solución que utiliza liposomas tales como lipofectina, polietilenglicol para fusión de protoplastos, electroporación, choque térmico, y similares, según se selecciona de manera adecuada dependiendo de qué célula hospedadora se use. Preferentemente, Se puede usar

E. coli lo que permite la expresión en grandes cantidades.

Para la expresión en E. coli se han desarrollado varios vectores de expresión que tienen el promotor trp, promotor T7, promotor cspA, y están comercialmente disponibles y se pueden usar según sea adecuado. Dicho vector de expresión incluye, por ejemplo, pET-11d (Merck) y pQE30(Quiagen). Dependiendo del vector de expresión, se pueden seleccionar E. coli adecuados, tales como BL21, HMS174, DH5Δ, HB101, JM109, y similares, como un hospedador. Se puede llevar a cabo la transformación de E. coli utilizando células competentes comercialmente disponibles de acuerdo con el protocolo vinculado a la anterior. De esta manera, se puede obtener un E. coli recombinante que produce el polipéptido deseado. Para el medio de cultivo (por ejemplo LB, SOC, SOB, y similares) utilizados para el cultivo de E. coli, los reactivos utilizados para la selección del transformante (por ejemplo ampicilina) y los reactivos utilizados para la inducción de la expresión (por ejemplo, ácido indol acético (IAA), isopropiltio-Δ-D-galactosida (IPTG), y similares), son reactivos comercialmente disponibles que se pueden usar. Un pH de un medio de cultivo puede estar comprendido en un intervalo adecuado para el crecimiento de E. coli (pH 6 a 8).

Se puede llevar a cabo la selección de E. coli recombinante que expresa un péptido deseado (el objeto) como se describe a continuación. Se recogieron células cultivadas y que crecían en presencia de un inductor de la expresión (se usó IPTG en un sistema de expresión en la presente invención) mediante centrifugación (9.100 g, 5 minutos), se suspendieron en un volumen fijo de agua destilada o PBS, se rompieron mediante sonicación o mediante un homogeneizador tal como una prensa French o un Monton Golin y se sometieron a centrifugación (por ejemplo,

17.800 g, 15 minutos) para la separación y la recuperación en el precipitado y el sobrenadante. Se puede añadir al agua adecuadamente destilada un tensioactivo (por ejemplo, Triton X-100), un agente quelante (por ejemplo, EDTA), una lisozima, y similares. Se puede someter una cantidad fija de sobrenadante y precipitado recuperados a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, y tras la tinción con azul brillante de Coomasie, se puede confirmar la expresión del objeto mediante formación de imágenes teñidas y el tamaño molecular. Para la confirmación (o detección) del objeto, se pueden usar soluciones basadas en una reacción de antígeno-anticuerpo tales como ELISA, transferencia Western, inmunotransferencia, y similares, además de la solución basada en el tamaño molecular como se ha descrito anteriormente. Se usan comúnmente todas estas soluciones para detectar una proteína o polipéptido heterólogo expresado en E.coli y se pueden seleccionar según sea adecuado. De esta manera, se pueden seleccionar los clones recuperados en el precipitado, es decir, los clones que producen un péptido de fusión que puede formar un cuerpo de inclusión.

Se puede realizar la recuperación de un cuerpo de inclusión a partir de los clones que producen un péptido de fusión como se ha descrito anteriormente. En primer lugar, se pueden recoger las células usando centrifugación o una membrana de MF de un tamaño adecuado (Asahi Kasei Corporation). Las células recogidas se pueden romper de una manera adecuada con el fin de liberar los cuerpos de inclusión que consisten en un péptido de fusión fuera de

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Tabla 7

Fragmento de ADN: cebador 5' cebador 3'

CΔ5-1 (SEC ID Nº: 3): CΔ5-1-P5 (SEC ID Nº: 18) CΔ4-5-P3 (SEQ ID Nº: 17)

CΔ5-2 (SEC ID Nº: 50): CΔ5-1-P5 (SEC ID Nº: 18) CΔ2-P3 (SEC ID NO: 58)

CΔ5-4 (SEC ID Nº: 51): CΔ5-1-P5 (SEC ID Nº: 18) CΔ4-P3 (SEC ID NO: 59)

CΔ9-0 (SEC ID Nº: 52): CΔ9-P5 (SEC ID Nº: 57) CΔ0-P3 (SEC ID NO: 60)

CΔ9-2 (SEC ID Nº: 53): CΔ9-P5 (SEC ID Nº: 57) CΔ2-P3 (SEC ID NO: 58)

CΔ9-4 (SEC ID Nº: 54): CΔ9-P5 (SEC ID Nº: 57) CΔ4-P3 (SEC ID NO: 59)

CΔ6-2 (SEC ID Nº: 55): CΔ6b-1b-P5 (SEC ID Nº: 19) CΔ2-P3 (SEC ID NO: 58)

CΔ6-4 (SEC ID Nº: 56): CΔ6b-1b-P5 (SEC ID Nº: 19) CΔ4-P3 (SEC ID NO: 59)

A continuación, tal como se describe en el Ejemplo 1, CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 y CΔ6-4 se digirieron con BamH1 y, tras la separación mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, los fragmentos de 5 ADN se eluyeron y recuperaron usando el Gel Wizard SV y el Sistema PCR Clean-Up (Promega). Los fragmentos obtenidos se unieron en una orientación directa a pET-11d-AΔ5-1 previamente digerido con BamH1 para dar los plásmidos de expresión pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1, pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-2, pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-4, pET-11d-AΔ5-1CΔ9-0, pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-2, pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-4, pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-2 y pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-4. En cada

uno de los plásmidos de expresión construidos, CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 y CΔ6-4 se 10 insertaron directamente en la dirección 3' de AΔ5-1 en una orientación directa que produce los péptidos de fusión que se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8

Plásmido: Péptido de fusión

pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1: ACΔ5-1 (SEC ID Nº: 12)

pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-2: AΔ5-1/CΔ5-2 (SEC ID Nº: 61)

pET-11d-AΔ5-1-C05-4: AΔ5-1/CΔ5-4 (SEC ID Nº: 62)

pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-0: AΔ5-1/CΔ9-0 (SEC ID Nº: 63)

pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-2: AΔ5-1/CΔ9-2 (SEC ID Nº: 64)

pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-4: AΔ5-1/CΔ9-4 (SEC ID Nº: 65)

pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-2: AΔ5-1/CΔ6-2 (SEC ID Nº: 66)

pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-4: AΔ5-1/CΔ6-4 (SEC ID Nº: 67)

15 Ejemplo 5: Construcción de plásmidos para la expresión del péptido C

Se prepararon bibliotecas de ADN genómico de la cepa A.pg-C 53-47 como se describe en el Ejemplo 1 para dar los fragmentos de ADN similares a los que se muestran en la Tabla 7. Las condiciones de la PCR fueron las descritas en el Ejemplo 3. Los nombres y los números de identidad de la secuencia de los respectivos fragmentos de ADN y

20 los cebadores de la PCR utilizados en la reacción de amplificación fueron los mismos que en la Tabla 7 con la excepción de que se cambió la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción en el cebador 3' a partir de la secuencia de reconocimiento de BamHI a la secuencia de reconocimiento de HindIII a fin de que los fragmentos amplificados se puedan insertar en el vector de expresión pQE30 (QIAGEN) más eficazmente.

25 A continuación, CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 y CΔ6-4 se digirieron con BamHI e HindIII y, tras la separación mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, los fragmentos de ADN se eluyeron y recuperaron usando el Gel Wizard SV y el Sistema PCR Clean-Up (Promega). Los fragmentos obtenidos se unieron el vector de expresión pQE30 digerido con BamHI y HindIII. Los plásmidos de expresión resultantes se usaron para transformar la cepa E. coli JM109 (QIAGEN) para dar plásmidos que expresan CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4,

30 CΔ6-2 y CΔ6-4. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos obtenidos a partir de estos plásmidos de expresión son las codificadas por los fragmentos de ADN respectivos que se muestran en la Tabla 7 con la adición en su extremo N de la secuencia de la etiqueta de histidina (MRGSHHHHHHGS) derivada de los vectores.

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Ejemplo 8: Eficacia del péptido de fusión para la cepa heteróloga

Para confirmar la eficacia de los péptidos de fusión de la vacuna para las otras cepas (cepas heterólogas), se usaron la cepa A.pg-A 221 y la cepa A.pg-C 53-47 para preparar el péptido de fusión, el ensayo del estímulo se realizó

5 como en el Ejemplo 7. Se repitieron los procedimientos del Ejemplo 7 excepto que se empleó una cantidad diferente de antígeno para la inmunización y diferentes cepas virulentas, es decir, se utilizaron la cepa A.pg-A 083 (1,0 x 109 UFC/ml), la cepa A.pg-A W (4,1 x 109 UFC/ml) y la cepa A.pg-C Modesto (2.8 x 109 UFC/ml), para el estímulo.

Como resultado, como se muestra en la Tabla 10, el pollo al que se administraron péptidos de fusión presentó

10 excelente eficacia protectora frente al estímulo de todas las cepas de A.pg-A 083, A.pg-A W y A.pg-C Modesto. De esta manera, los péptidos de fusión demostraron ser útiles como vacuna para otras cepas virulentas a partir de las cuales no se derivaron los péptidos de fusión.

Tabla 10

Vacuna: Cepa estímulo Cantidad de antígeno Tasa de protección

Péptido A (AΔ5-1): A.pg-A 083 3 µg/dosis 100 %

0,3 µg/dosis: 100 %

0,03 µg/dosis: 40 %

A.pg-A W: 3 µg/dosis 100 %

0,3 µg/dosis: 100 %

0,03 µg/dosis: 40 %

Péptido de fusión (ACΔ5-1): A. µg-C Modesto 6 µg/dosis 100 %

0,6 µg/dosis: 100 %

0,06 µg/dosis: 100 %

OILVAX NB2AC: A.pg-A 083 1/10 veces 100 %

1/100 veces: 100 %

1/1.000 veces: 20 %

A.pg-A W: 1/10 veces 100 %

1/100 veces: 80 %

1/1.000 veces: 0 %

A.pg-C Modesto: 1/10 veces 100 %

1/100 veces: 80 %

1/1.000 veces: 20 %

Control no inmunizado: A.pg-A 083 - 0 %

A.pg-A W: - 0 %

A.pg-C Modesto: - 0 %

15 Se analizaron las respectivas cepas utilizadas en el ensayo del estímulo para su secuencia de nucleótidos de la región 2. Como resultado, para A.pg-A, se observaron identidades completas entre la cepa 083 y la cepa W y la mutación del nucleótido 1 (A/G; ácido glutámico en el Nº 1227 de la SEC ID Nº: 25 se sustituyó) entre la cepa 221 y la cepa 0,83 y entre la cepa 221 y la cepa W. Para A.pg-C, se observó la deleción de 3 nucleótidos AAG (ácido

20 glutámico en el Nº 1144 de la SEC ID Nº: 26) en la cepa Modesto en comparación con la cepa 53-47.

Ejemplo 9: Comparación de la eficacia entre el péptido de fusión ACΔ5-1 y los respectivos péptidos

Para comparar la eficacia de la vacuna entre el péptido de fusión ACΔ5-1 y el Péptido A o el Péptido C antes de la 25 fusión, se realizó un ensayo de inmunización. Los análogos sintéticos se prepararon como se describe en el Ejemplo

7. Una vacuna preparada emulsionando ACΔ5-1, Se administraron una vez por vía intramuscular el Péptido A o el Péptido C a la cantidad de antígeno que se muestra en la Tabla 11 en 0,5 ml por dosis con un aceite adyuvante a la pata de pollos SPF de 4 semanas de edad para la inmunización. Como control, se configuró el grupo sin administración. Cuatro semanas después de la inmunización, se determinó el título de anticuerpos como describe

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Ushijima et al. (Solicitud de patente japonesa Nº 2008-29589). Específicamente, se realizó la medida de los anticuerpos mediante ELISA.

Los diferentes péptidos en la Región 2 de A.pg-A y A.pg-C se diluyeron con tampón bicarbonato 50 mM a 1 µg/ml y cada 50 µl de la solución se añadió a una placa de 96 pocillos para la inmovilización. Tras la adsorción a 4 ºC durante la noche, se descartó la solución, y se lavó la placa con 300 µl de PBS-T (hidrogenofosfato disódico 8,1 mM, dihidrogenofosfato de potasio 1,5 mM, cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM, Tween 20 al 0,1 %) y se añadieron a 300 µl de PBS-T suplementado con leche desnatada al 5 % para el bloqueo. Se descartó la solución de bloqueo. Se diluyó suero con PBS-T suplementado con leche desnatada al 10 % a 100 veces y cada 50 µl de la solución se añadieron para la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras eliminar la solución de reacción, se lavó la placa con PBS-T tres veces. Un anticuerpo dirigido contra IgG de pollo marcada con HRP se diluyó con PBS-T suplementado con leche en polvo al 5 % a 20.000 veces y cada 50 µl de la solución se añadieron a cada pocillo para la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Tras eliminar la solución de reacción, se lavó la placa con PBS-T tres veces. Cada 100 µl de la solución sustrato (TMB + sustrato-cromógeno: DAKO) se añadieron para la reacción a temperatura ambiente durante 15 minutos. Cada 100 µl de ácido sulfúrico 3M se añadieron a la detención de la reacción. Se midió la absorbancia a la longitud de onda de 450 nm con un lector de placas de 96 pocillos (Molecular device Japón).

Como resultado, como se muestra en la Tabla 11, el pollo inmunizado con el péptido de fusión ACΔ5-1 presentó un título de anticuerpos alto a 0,6 µg/dosis y un 100 % de una tasa de conversión positiva para A.pg-A y A.pg-C. A 0,06 µg/dosis del péptido de fusión, se observaron un 80 % y un 40 % de tasas de conversión positivas para A.pg-A y A.pg-C, respectivamente. Sin embargo, a 0,03 µg/dosis de Péptido A o Péptido C, una tasa de conversión positiva fue un 60 % y un 0 % paraA.pg-A and A.pg-C, respectivamente. De esta manera, se demostró que el péptido de fusión ACΔ5-1 tenía una eficacia mayor que el Péptido A o el Péptido C antes de la fusión.

Tabla 11

Vacuna: Cantidad de antígeno Título promedio de anticuerpos (tasa de conversión positiva)

A.pg-A: A.pg-C

Péptido de fusión (ACΔ5-1): 6 µg/dosis 2,152 (100 %) 1,649 (100 %)

0,6 µg/dosis: 1,924 (100 %) 1,177 (100 %)

0,06 µg/dosis: 1,175 (80 %) 0,565 (40 %)

0,006 µg/dosis: 0,514 (60 %) 0,112 (0 %)

Péptido A (AΔ5-1): 3 µg/dosis 2,051 (100 %) 0,163 (0 %)

0,3 µg/dosis: 2,197 (100 %) 0,146 (0 %)

0,03 µg/dosis: 1,209 (60 %) 0,086 (0 %)

0,003 µg/dosis: 0,080 (0 %) 0,127 (0 %)

Péptido C (CΔ5-1): 3 µg/dosis 0,153 (0 %) 1,749 (100 %)

0,3 µg/dosis: 0,176 (0 %) 1,865 (100 %)

0,03 µg/dosis: 0,072 (0 %) 0,089 (0 %)

0,003 µg/dosis: 0,072 (0 %) 0,084 (0 %)

Control no inmunizado: - 0,092 (0 %) 0,099 (0 %)

Ejemplo 10: Expresión del péptido de fusión (2)

Se sometió la cepa E. coli BL21 (DE3) (Merck) que poseía los plásmidos de expresión respectivos obtenidos en los Ejemplos 3 y 4 a la expresión como se ha descrito en el Ejemplo 6 y se determinó el nivel de expresión. Las Figs. 6 y 7 muestran los respectivos modelos de expresión. Para el péptido A, AΔ5-4, AΔ9-2, AΔ9-4, AΔ6-2 y AΔ6-4, cuando se expresaron solos, se expresaron en una fracción soluble pero, tras la fusión con CΔ5-1, los péptidos de fusión resultantes formaron de manera estable un cuerpo de inclusión excepto para AΔ6-4. AΔ6-4/CΔ5-1, que se considera que forman principalmente un cuerpo de inclusión, pueden algunas veces expresarse en una fracción soluble y por

tanto, su expresión fue inestable. Todos los péptidos de fusión tenían el mismo y excelente nivel de expresión. Por otra parte, el péptido C, cuando se expresa solo, se expresó en una fracción soluble excepto para CΔ6-2 pero, tras la fusión con AΔ5-1, los péptidos de fusión resultantes formaron de manera estable un cuerpo de inclusión. Todos los péptidos de fusión tenían el mismo y excelente nivel de expresión.

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