ES2534903T3

ES2534903T3 - Variantes de galactanasas

Info

Publication number: ES2534903T3
Application number: ES03813542.2T
Authority: ES
Inventors: Leonardo De Maria; Allan Svendsen; Torben Vedel Borchert; Lars Lehmann Hylling Christensen; Sine Larsen; Carsten Ryttersgaard
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2015-04-30
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: AU2003303215A1; US20090203106A1; US8367390B2; WO2004056988A3; US7537921B2; EP1578963A2; EP1578963B1; WO2004056988A2; US20070128180A1

Abstract

Variante de una galactanasa de la familia glicósido hidrolasa 53 original que tiene un cambio en el perfil de la actividad de pH en comparación con la original; dicha variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones: H91 N,L,D; A90S+H91D; D181N; donde la variante tiene actividad de galactanasa; donde la galactanasa original tiene cualquiera de las SEC ID nº: 1-4; donde la variante tiene al menos 80% de identidad con la galactanasa original; y donde la numeración se define por el alineamiento con SEC ID n: 1 utilizando el programa ClustalW con la opción alineamiento de perfil con alineamiento múltiple de la figura 5 como perfil 1, y cualquier secuencia no presente en la fig. 5 como perfil 2 para ser alineado con el primer perfil, usando los parámetros: Parámetros de alineamiento múltiple >= Lento/Exacto; Penalización por apertura de espacio >= 10,00; Penalización por extensión de espacio >= 0,20; Secuencias divergentes de retraso >= 30%; Peso de transiciones de ADN: 0,50; Matriz de peso de proteína >=series Gonnet; Matriz de peso de ADN >=IUB; Uso matriz negativa >= OFF; Parámetros de espacio de proteína: Alternar sanciones específicas de residuos >= ON; Alternar sanciones hidrofílicas >= ON; Residuos hidrofílicos >= GPSNDQEKR; Distancia de separación del espacio >= 4; Alternar separación de espacio final >= OFF.

Description

E03813542

14-04-2015

DESCRIPCIÓN

Variantes de galactanasas

5 Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a variantes de galactanasas de la familia glicósido hidrolasa 53, su producción y su uso en la industria láctea. Antecedentes de la invención

10 Estado de la técnica

[0002] La cristalización y estudios de rayos X preliminares de la galactanasa de Aspergillus aculeatus son descritos por Ryttersgaard et al en Acta.Cryst. (1999), 055, 929930.

15 [0003] La WO 97/32014 A divulga una galactanasa de M. thermophila y una galactanasa de H. insoles.

[0004] La WO 00/47711 A divulga una galactanasa de B. licheniformis.

Resumen de la invención

20 [0005] La invención proporciona una variante de una galactanasa de la familia glicósido hidrolasa 53 original que tiene un cambio en el perfil de la actividad del pH en comparación con la original; dicha variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones: H91 N,L;D; A9OS+H91 D; DI8IN; donde la variante tiene actividad de galactanasa;

25 donde la galactanasa original tiene cualquiera de las SEC ID nº: 1-4; donde la variante tiene al menos 80% de identidad con la galactanasa original; y donde la numeración se define por alineamiento con SEC ID nº: 1 utilizando el programa Clus-talw con la opción alineamiento de perfil con el alineamiento múltiple de la figura 5 como perfil 1, y cualquier secuencia no presente en la fig. 5 como perfil 2 para ser alineado con el primer perfil," usando los parámetros: Parámetros de alineamiento múltiple =

30 Lento/Exacto; Penalización por apertura de espacio = 10,00; Penalización por extensión de espacio = 0,20; Secuencias divergentes de retraso = 30%; Peso de transiciones de ADN: 0,50; Matriz de peso de proteína = series Gonnet; Matriz de peso de ADN = IUB; Uso matriz negativa = OFF; Parámetros de espacio de proteína: Alternar sanciones específicas de residuos = ON; Alternar sanciones hidrofílicas = ON; Residuos hidrofílicos = GPSNDQEKR; Distancia de separación de espacio = 4; Alternar separación de espacio final = OFF.

35 Breve descripción de dibujos

[0006]

40 La fig. 1 muestra las coordenadas para la estructura 3D de una galactanasa de familia GH 53 de Myceliophthora thermophila con SEC ID nº: 1; La fig. 2 muestra las coordenadas para la estructura 3D de una galactanasa de la familia GH 53 de Humicola insolens con SEC ID nº: 2; La fig. 3 muestra las coordenadas para la estructura 3D de una galactanasa de la familia GH 53 de Aspergillus

45 aculeatus con SEC ID nº: 3; La fig. 4 muestra las coordenadas para la estructura 3D de una galactanasa de la familia GH 53 de Bacillus licheniformis con SEC ID nº: 4; La fig. 5 muestra un alineamiento múltiple de SEC ID nº: 1-4; y La fig. 6 muestra el alineamiento de la figura 5 con tres secuencias de galactanasa adicionales añadidas.

50 Descripción detallada de la invención

Determinación de la estructura 3D

55 [0007] La cristalización y los estudios de rayos X preliminares de la galactanasa de Aspergillus aculeatus (AAGAL) son descritos por Ryttersgaard et al. en Acta. Cryst. (1999), 055, 929930. Las galactanasas de Myceliophthora thermophila (MTGAL) y Humicola insolens (HIGAL) (WO 97/32014), y la galactanasa de Bacillus licheniformis (BLGAL) (WO 00/47711) fueron cristalizadas utilizando principios similares.

60 [0008] Las estructuras 3D se resolvieron conforme a los principios para métodos cristalográficos de rayos X como se dan, por ejemplo, en XRay Structure Determination, Stout, G.K. y Jensen, L.H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989. Las coordenadas estructurales para la estructura cristalina de la galactanasa de Aspergillus aculeatus (AAGAL), como se determina por sustitución isomorfa múltiple a 1,8 A resolución en 100 K se dan en la fig. 1 en formato de PDB estándar (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT).

65

15

25

35

45

55

65

E03813542

14-04-2015

[0009] Las estructuras de las otras tres galactanasas se resolvieron por sustitución molecular, usando la estructura AAGAL293 (a 2,3 A resolución en 293K) como modelo de búsqueda. Datos de 20-2,55 A, 18-2,14 A y 19,67-2,60 A se usaron para HIGAL, MTGAL y BLGAL, respectivamente, dentro de AMoRe (J. Navaza: AMoRe: an Automated package for Molecular Replacement. Acta Crystallogr., A50:157163, 1994). Las coordenadas respectivas se dan en las figuras 24 en formato de PDB estándar.

Variante

[0010] El término "variante de galactanasa" o simplemente "variante" se refiere a galactanasa que comprende una o más alteración(es), tal como sustitución(es), inserción(es), deleción(es) y/o truncamiento(s) de uno o varios residuos de aminoácidos específicos de una o más posiciones específicas en una galactanasa original.

[0011] El número total de tales alteraciones es típicamente no mayor de treinta, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diez, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro, veinticinco, veintiséis, veintisiete, veintiocho, veintinueve, o treinta de dichas alteraciones. Además, la variante de la invención puede incluir otras modificaciones de la enzima original, típicamente no mayor de 10, por ejemplo no mayor de 5 de tales modificaciones.

Nomenclatura y convenios para la designación de variantes

[0012] Una sustitución en una variante se indica como "aminoácido original – posición – aminoácido sustituido". Se usa preferiblemente el código de una letra, pero por supuesto se puede traducir en el código de tres letras como se desee. Los códigos X (o Xaa) se pueden utilizar para indicar cualquier residuo de aminoácido. Por consiguiente, la notación "D1 82N" o significa que la variante comprende una sustitución de ácido aspártico con ácido de asparagina en la posición de aminoácido variante que corresponde al aminoácido de la posición 182 en MTGAL, cuando los dos se alinean como se indica en la fig. 5.

[0013] Donde el residuo de aminoácido original puede ser cualquier residuo de aminoácido, una notación a mano corta se puede usar a veces indicando sólo la posición, y el aminoácido sustituido, por ejemplo: "Posición -aminoácido sustituido" o "182N". Esta notación es particularmente importante en relación con la modificación(es) de una serie de polipéptidos homólogos, tales como las galactanasas de la familia GH 53. De forma similar, cuando la identidad de los residuos de aminoácidos de substitución es irrelevante: "aminoácido original -posición" o "D182".

[0014] Cuando tanto los aminoácidos originales como los aminoácidos sustituidos pueden ser cualquier aminoácido, entonces sólo se indica la posición, por ejemplo "182".

[0015] Cuando los aminoácidos originales y/o aminoácidos sustituidos pueden comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, entonces los aminoácidos se catalogan, separados por comas: "aminoácido original -número de posición -aminoácido sustituido"; por ejemplo "H9ID,L,N".

[0016] Varios ejemplos de esta nomenclatura se enumeran a continuación:

La sustitución de ácido aspártico por asparagina en la posición 182 se designa como D182N.

[0017] La sustitución de cualquier residuo de aminoácido por serina en la posición 131 se designa como S131X o S131.

[0018] La sustitución de prolina por cualquier residuo de aminoácido en la posición 29 se denominaría así X29P o 29P.

[0019] Para una modificación donde el o los aminoácidos originales y/o aminoácidos sustituidos pueden comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, la sustitución de ácido aspártico, leucina o asparagina por histidina en la posición 91 se indicaría por H91 D,L,N lo que indica las variantes específicas H91 D, H91 L o H91 N.

[0020] Una eliminación de ácido glutámico en la posición 288a se indicará por E288a*. Correspondientemente, la eliminación de más de un residuo de aminoácido, tal como la eliminación de ácido glutámico y ácido aspártico en las posiciones 252a y 252b será designará “E252a*+D252b*”.

[0021] Un truncamiento se refiere a un encogimiento N o C-terminal de la secuencia de aminoácidos completa, es decir una eliminación de uno, o normalmente más, aminoácidos y el extremo N o C-terminal del péptido. En cuanto a la designación de variantes truncadas, se puede utilizar la regla general para deleciones.

[0022] La inserción de un residuo de aminoácido adicional tal como por ejemplo una valina después de F216 se indica por "F216FV"; o, cuando más de un residuo de aminoácido se inserta, tal como por ejemplo una valina, alanina, serina, treonina y una glicina después de F216 se indicará como: "F216FVASTG".

[0023] En tales casos el o los residuos de aminoácido insertados se numeran por la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido precedente al residuo o residuos de aminoácido insertados.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

E03813542

14-04-2015

En el ejemplo anterior las secuencias serían entonces:

Original: Variante:

216 216 216a 216b 216c 216d 216e 217

F F VAST GY

[0024] Una vez que se han utilizado todas las letras minúsculas de la a a la z (a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, x, y, z) para este propósito, se utilizan letras dobles aa, bb, cc, etc. hasta zz, véase por ejemplo el alineamiento de la figura 5, entre las posiciones 302 y 303.

[0025] En los casos donde se inserta un residuo de aminoácido idéntico al residuo de aminoácido existente, está claro que se produce degeneración en la nomenclatura. Si por ejemplo una fenilalanina se insertara después de la fenilalanina en el ejemplo anterior esto se indicaría por "F216FF'.

[0026] Suponiendo que una prolina esté presente en la posición 215, el mismo cambio actual podría también indicarse como "P215PF":

Original: Variante:

Numeración I: 215 216 215 216 216a

Secuencia: P F P F F

Numeración II: 215 215a 216

[0027] Tales casos serán aparentes para el experto en la materia, y la indicación "F216FF" y las correspondientes indicaciones para este tipo de inserciones se entiende de este modo que comprenden tales equivalentes indicaciones degeneradas.

[0028] Por analogía, si segmentos de secuencia de aminoácidos se repiten en la galactanasa original y/o en la variante, será aparente para el experto en la materia que las indicaciones degeneradas equivalente están comprendidas, también cuando otras alteraciones diferentes de las inserciones se enumeran tal como deleciones y/o sustituciones. Por ejemplo, la eliminación de dos aminoácidos consecutivos "DG" en la secuencia “DGDG” de la posición 252b-252e, se puede escribir como “D252b*+G252c*” o “D252d*+G252e*” o “G252c*+D252d*”:

Original: Variante:

Numeración I: 252b 252c 252d 252e 252b 252c

Secuencia:D G D G D G

Numeración II: 252d 252e

Numeración III: 252b 252e

[0029] Variantes que comprenden modificaciones múltiples se separan con el signo más, por ejemplo "A9OS+H91 D" representa modificaciones en las posiciones 90 y 91 sustituyendo tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina, respectivamente. Así, "A9OS+H91 D,N,L" designa las siguientes variantes: A90S+H91D, A90S+H91 N y A90S+H91 L. Asimismo, N303D,H+N305D,H,P designa las siguientes variantes: N303D+N305D; N303D+N305H; N303D+N305P; N303H+N305D; N303H+N305H y N303H+N305P.

[0030] Esta nomenclatura es especialmente pertinente en relación con las modificaciones dirigidas a substituir, insertar o borrar residuos de aminoácidos que tienen propiedades comunes específicas, tales modificaciones se denominan modificación(es) de aminoácidos conservadoras. Ejemplos de modificaciones conservadoras están en el grupo de los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Modificaciones de aminoácidos que generalmente no alterar la actividad específica se conocen en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que se producen más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly al igual que a la inversa.

[0031] Para los fines presentes, la secuencia de MTGAL (SEC ID nº: 1) se ha seleccionado como marco de referencia, lo que significa que todas las variantes serán definidas basándose en la secuencia de aminoácidos de MTGAL. En particular, a cada residuo de aminoácido en una secuencia de galactanasa se le asigna un número, una posición o un número de posición, por referencia a la fig. 5 presente, es decir, el número del residuo de aminoácido correspondiente en la estructura de galactanasa de Myceliophthora thermophila (MT; la línea superior del alineamiento de la figura 5). En

15

25

35

45

55

65

E03813542

14-04-2015

este contexto, el término "correspondiente" se refiere al aminoácido que, según el alineamiento, está en la misma columna que el residuo de aminoácido en cuestión, pero en la primera fila designada "MT".

[0032] Por ejemplo, la variante de la galactanasa de Bacillus licheniformis (BL) que por referencia a SEC ID nº: 4 quizá se puede designar S39C se designará, para los fines presentes, SI8C, porque S39 de BL corresponde a A18 de MT. Como otro ejemplo, la variante de la galactanasa de Aspergillus aculeatus que por referencia a SEC ID nº: 3 se puede designar D1 82N se designará, para los fines presentes, 0181 N, porque D182 de AA corresponde a N181 de MT. Como otro ejemplo más, la variante K16P de BL se puede designar *-6p porque K16P de BL corresponde a un aminoácido que falta o eliminado en la posición -6 de MT, todavía por referencia formal estricta a la fig. 5.

[0033] No obstante, si se desea, las variantes de la invención también se pueden definir por referencia a sus respectivas estructuras "propias", por ejemplo con referencia a SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 3 o SEC ID nº: 4. Los números de la posición correspondiente se deducen fácilmente, de la misma manera que se ha descrito anteriormente, de las figuras 5-6 o, para secuencias de galactanasa adicionales, de una figura que se puede preparar según los principios aquí descritos.

Dinámica Molecular (MD)

[0034] Las simulaciones de Dinámica Molecular (MD) son indicativas de la movilidad de los aminoácidos en una estructura de proteína (véase McCammon, JA y Harvey, SC., (1987), "Dynamics of proteins and nucleic acids", Cambridge University Press). Tales dinámicas de proteína se comparan frecuentemente con los B-factores cristalográficos (véase Stout, GH y Jensen, LH, (1989), "Xray structure determination", Wiley). Al llevar a cabo la de MD en, por ejemplo, temperaturas diferentes, la movilidad relacionada con la temperatura de los residuos se simula. Regiones que tienen la máxima movilidad o flexibilidad (aquí fluctuaciones isotrópicas) se pueden sugerir para mutagénesis aleatoria. Se entiende aquí que la alta movilidad encontrada en áreas determinadas de la proteína puede ser térmicamente mejorada por substitución de estos residuos.

Variantes de propiedades enmendadas

[0035] Basadas en la estructura 3D de la galactanasa de Myceliophthora thermophila de SEC ID nº: 1, las siguientes variantes se contemplan, donde al menos uno de los residuos abajo mencionados se ha enmendados y/o al menos una de las alteraciones abajo mencionadas se han introducido:

i) variantes de una actividad específica enmendada, dentro de 10A del sitio activo: Y4, G6, V7, D8, W9, SI 0, R45, 046, R47, W49, Y77, 079, F80, H81, Y82, W86, A87, D88, P89, A90, H91, 092, T93, S131,1132, G133, N134, E135,1136, R137,A138, G139, L140, L141, W142, G145, R146, T147, I153, L157, M176,1177, H178, L179, D180, N181, G182, W183, T187, Q188, W191, Y192, M209, G210, V211, S212, F213, Y214, P215, F216, Y217, A221, L226, 1241, A242, V243, V244, E245, T246, N247, W248, F276, I277, V280, V284, G292, L293, F294, Y295, W296, E297, P298, W300, L306, G307, F329;

ii) variantes de una actividad enmendada en la lactosa, dentro de 10A del sitio activo: Y214S,N+N247Y+L306Q; Y214A; F216FVASTGY217; P89W+W86N;

iii) variantes de un perfil de actividad de pH enmendado: H91 N,L,D; N313D; N303D,H; N305D,H; A9OS+H91 D;

iv) variantes de una termoestabilidad enmendada, por inserción de prolinas: Y22P, N24P, T25P, A29P, A53P, N56P, T93P, DIOIP, W142P, T147P, Q1 98P, L203P, S204P, S219P; S258P, S288P, A304P, A3I1P, Q318P, A322P, S324P, S325P, S327P;

v) variantes de una termoestabilidad enmendada, mediante el aumento de la hidrofobicidad de superficie: W1O7S,H;

vi) variantes de una termoestabilidad enmendada, por enmendado del potencial electroestático de superficie: Q126E;

vii) variantes de una termoestabilidad enmendada, por puentes disulfuro (mutaciones dobles a cisteínas): V2OC+G320C, N39C+L326C, Yl I OC+G I 63C, WI 50C+N1 94C, T274C+V328C, 1301 C+F31 6C

viii) variantes de termoestabilidad enmendada, por empaquetado de cadena lateral mejorado: 9F,Y,W; 12V, 80F, 82Y, 191Y,W; 213F; 9W+12V; 80F+82Y.

[0036] Basadas en la estructura 3D de la galactanasa de Humicola insolens, las siguientes variantes se contemplan, donde al menos uno de los residuos abajo mencionados se han enmendado y/o al menos una de las alteraciones abajo mencionadas se han introducido:

i) variantes de una termoestabilidad enmendada, por inserción de prolinas: V20P, V25P, E29P, V41P, V50P, W53P, N56P, T94P, A96P, W142P, L169P, W185P, Q198P, M203P, A219P, A221P, T222P, Q258P, A261P, D262P, S288P, N305P, A311P, A322P, S324P, S325P.

15

25

35

45

55

65

E03813542

14-04-2015

ii) variantes de una termoestabilidad enmendada, por puentes disulfuro (mutaciones dobles a cisteínas): T113C+G163C, W185C+S229C, S218C+A221C, R227C+V283C.

[0037] Basadas en la estructura 3D de la galactanasa de Aspergillus aculeatus, las siguientes variantes son contempladas, donde al menos uno de los residuos abajo mencionados se ha enmendado y/o al menos una de las alteraciones abajo mencionadas se ha introducido:

i) variantes de un perfil de actividad de pH enmendado: D18IN;

ii) variantes de una termoestabilidad enmendada, por inserción de prolinas: T3P, Y20P, N24P, L25P, T29P, A31 P, V50P, S53P, S56P, T93P, T94P, S96P, W142P, L144P, E146P, T147P, T172 P, E200P, S203P, A219P, A256P, A258P, S261 P, S264P, I266P, T288P, 1301P, A304P, Y318P, E324P;

iii) variantes de una termoestabilidad enmendada, por puentes disulfuro (mutaciones dobles a cisteínas): L13C+L65C, N24C+Q300, S218C+A221C, A304C+Y318C.

[0038] Basadas en la estructura 3D de la galactanasa de Bacillus licheniformis, las siguientes variantes son contempladas, donde al menos uno de los residuos abajo mencionados ha sido enmendado y/o al menos una de las alteraciones abajo mencionadas ha sido introducida:

i) variantes de una termoestabilidad enmendada, por inserción de prolinas: K6P, S4P, L2P, K1P, V20P, S26P, K29P, D31P, A54aP, G54eP, N57P, K93P, A97P, N101P, S171P, S185P, T256P, N260P, N266P, D286P, E288aP, A289P, A302dP, S302yP, Y302zP, A302bbP, E302ccP, E302ggP, F305P, 0311 F, F318P;

ii) variantes de una termoestabilidad enmendada, por puentes disulfuro (mutaciones dobles a cisteínas): S18C+Y302qC, G40C+Q330C, V44C+A69C, 148C+A62C, N5OC+D84C, G54gC+T302xC, N56C+G302rC, A62C+G146C, K106C+A159C, K114C+A163C, E183C+G221C, T227C+A283C, A234C+V241C, Y250C+Q273C, A302aaC+A302iiC.

[0039] Variantes adicionales descritas aquí que pueden mostrar propiedades enmendadas con respecto a la unión de sustrato y/o la especificidad de sustrato se enumeran por debajo.

[0040] Según "Nomenclature for sugarbinding subsites in glycosyl hydrolases", G.J. Davis, KS. Wilson and B. Henrissart, Biochemical Journal, Volume 321, páginas 557 a 559 (1997), los llamados subsitios se pueden determinar. Tales subsitios se pueden marcar desde -N a +N (donde N es un número entero). -N representa el extremo de no reducción y +N el extremo de reducción del polisacárido. La escisión tiene lugar entre los subsitios -1 y +1. El constituyente principal de un subsitio de unión de azúcar también se denomina una plataforma aromática. Esto es un residuo aromático, es decir, uno de los siguientes: W, H, Y o F.

[0041] Basado en las figuras 1-4 los inventores identificaron subsitios de la siguiente manera:

Para MTGAL, HIGAI y AAGAL los siguientes subsitios fueron identificados, haciendo referencia aquí a la numeración de posición de SEC ID nº: 1, 2 y 3, respectivamente (no al residuo correspondiente en SEC ID nº: 1):

Subsitio -4: MTGAL ninguno; HIGAL W53; AAGAL ninguno. Subsitio -2: MTGAL W86; W300; HIGAL W86; W300; AAGAL W86; W301. Subsitio -1: MTGAL W296; HIGAL W296; AAGAL W297. Subsitio +1: MTGALY2I7,Y214; HIGALY2I7,Y214;AAGALY2I8,Y215. Subsitio +2: MT WI83; HIGAL W183; AAGALWI84.

Para BLGAL los siguientes subsitios fueron identificados, haciendo referencia aquí a la numeración de posición de SEC ID nº: 4 (no al residuo correspondiente en SEC ID nº: 1):

Subsitio -4: W363. Subsitio -3: W347. Subsitio -2: W115. Subsitio -1: W320. Subsitio +1: W237; Y234.

[0042] También los residuos en la proximidad (5 A) de los residuos anteriores se pueden alterar y pueden proporcionar una especificidad de sustrato enmendado y/o unión de sustrato. Estos residuos son los siguiente, haciendo referencia aquí a la numeración de posición de SEC ID nº: 1, 2, 3 y 4, respectivamente (no al residuo correspondiente en SEC ID nº: 1):

MTGAL (SEC ID nº: 1): G6, V7, D8, W9, SlO, S1 1, V12, V13, V14, E15, E16, A18, V20, Y22, L32, L36, T43, V44, R45, Q46, R47, V48, W49, V50, N51, P52, D54, N56, Y57, Y61, Y77, D79, F80, H81, Y82, S83, D84, T85, W86, A87, D88, 6 15

25

35

45

55

65

E03813542

14-04-2015

P89, A90, H91, 092, T93, M94, P95, G133, N134, E135,1136, R137, G139, L140, L141, W142, H178, L179, D180, N181, 0182, W183, D184, W185, G186, T187, 0188, Nl89, 0210, V211, S212, F213, Y214, P215, F216, Y217, S218, S219, S220, A221, T222, L223, S224, A225, L226, K227, S228, S229, L230, D231, N232, M233, 1241, A242, V243, V244, E245, T246, N247, W248, P249,1250, C252, P255, R256, Y257, S258, F259, P260, 0262, V263, Q273, F276,1277, V280,1283, L293, F294, Y295, W296, E297, P298, A299, W300,1301, H302, N303, A304, N305, L306, G307, S308, S309, C310, A311, D312, N313, T314, M315, F316, S317, Q318, S319, G320, 0321, L326, F329.

HIGAL (SEC ID nº: 2): G6, V7, D8, W9, S10, S11, V12, M13, V14, E15, E16, Ai8, V20, Y22, L32, L36, M43, V44, R45, 046, R47, V48, W49, V50, N51, P52, W53, D54, G55, N56, Y57, N58, Y61, Y77, N79, F80, H81, Y82, S83, D84, T85, W86, A87, D88, P89, A90, H91, Q92, T93, T94, A96, G133, N134, El 35, 1136, T137, Gi39, L141, W142, H178, L179, 0180, N181, G182, W183, N184, W185, D186, T187, Q188, N189, G210, V211, S212, F213, Y214,P215,F216,Y217,5218,A219,S220,A221,T222,L223, D224,S225,L226, R227,R228,S229,L230, N231, N232, M233, V241, A242, V243, V244, E245, T246, N247, W248, P249, C252, P255, R256, Y257, 0258, F259, P260, 0262, V263, 0273, Y276, 1277, V280, V283, L293, F294, Y295, W296, E297, P298, A299, W300, I301, H302, N303, A304, N305, L306, G307, S308, S309, C310, A311, D312, N313, T314, M315, F316, T317, P318, S319, G320, Q321, L326, F329.

AAGAL (SEC ID nº: 3): R5, G6, A7, D8, 19, S10, S11, L12, L13, L14, L15, E16, E18, Y20, Y22, L32, L36, S43, 144, R45, 046, R47, V48, W49, V50, N51, P52, 054, S56, Y57, Y61, Y77, 079, L80, H81, L82, S83, 084, T85, W86, A87, 088, P89, S90, D91, 092, T93, T94, P95, G134, N135, E136,1137, R138, G140, L142, W143, H179, L180, D181, D182, G183, W184, S185, W186, D187, 0188, 0189, N190, G211, V212, S213, Y214, Y215, P216, F217, Y218, S219, A220, S221, A222, T223, L224, A225, S226, L227, K228, T229, S230, L231, A232, N233, L234, V243, V244, V245, E246, 1247, N248, W249, P250, C253, P256, A257, Y258, A259, F260, P261, 0263, L264, 0274, F277, L278, L281, V284, V294, Y295, Y296, W297, E298, P299, A300, W301, 302, G303, N304, A305, G306, L307, G308, S309, S310, C311, A312, D313, N314, L315, M316, V317, D318, Y319, T320, D322, V324, Y325, 1328, L331.

BLGAL (SEC ID nº: 4): K26, G27, V28, 029, V30, S31, S32, A35, L36, Y64, V65, R66, V67, R68,169, W70, N71, D72, P73, Y74, G80, Y81, G82, G83, G84, N85, N86, L106, 0108, F109, H110, Y111, S112, 0113, F114, W115, A116, Q117, P118, A119, k120, 0121, k122, A123, P124, 0161, G163, N164, E165, T166, G169, A171, 0172, H202, F203, T204, N205, P206, E207, T208, R211, Y212, S231, S232, Y233, Y234, P235, F236, W237, H238, G239, T240, L241, N243, L244, V261, A262, E263, T264, S265, Y266, T267, 0274, G275, H276, G277, N278, T279, A280, P281, K282, N283, G284, 0285, T286, L287, N288, 0296, A299, V300, V303, V317, F318, Y319, W320, E321, P322, A323, W324,1325, V327, N336, K337, L339, W340, E341, Y343, G344, S345, G346, W347, A348, T349, S350, Y351, A352, A353, Y355, 0356, P357, E358, 0359, A360, G361, K362, W363, F364, G365, G366, S367, A368, V369, D370, N371, Q372, A373, L374, F375, F388.

[0043] Los aminoácidos anteriores se pueden sustituir con cualquier otro aminoácido, por ejemplo cualquiera de los 19 aminoácidos naturales restantes. En las variantes descritas aquí, al menos uno de los residuos anteriormente mencionados se han enmendado para introducir cualquiera de los otros diecinueves residuos de aminoácidos.

Alineamientos

[0044] El programa ClustaIW (CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice." Julie D. Thompson, Desmond G. Higgins, and Toby J. Gibson, Nucleic Acids Research, 22(22):46734680 (1994)) se usa para los fines de la presente invención para alineaciones de secuencia de proteína de pares, alineaciones de secuencia de proteína múltiple y alineaciones de perfil de proteína (versión 1.82, parámetros predeterminados).

[0045] Para comparación de secuencia de pares y cálculo de identidad de porcentaje, los parámetros de alineamiento de pares fueron: Lento/Preciso; Penalización por apertura de espacio = 10,00; Penalización por extensión de espacio = 0,10; Matriz de peso de proteína = Gonnet serie; Matriz de peso de ADN = IUB.

[0046] La longitud de consenso es calculada automáticamente por el programa. El número de residuos idénticos (identificados con un asterisco) se cuenta. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula de la siguiente manera: el número de residuos idénticos se divide por la longitud de consenso y se multiplica por 100.

[0047] El alineamiento múltiple de la figura 5 se basa en un alineamiento múltiple de las cuatro secuencias usando ClustalW, pero, de manera importante, se combina con información derivada de las estructuras 3D, cada posición de cada estructura se evalúa cuidadosamente, y el alineamiento es modificado por los presentes inventores. En otras palabras, el alineamiento múltiple de la figura 5 no es un simple alineamiento múltiple de ClustaIW que refleja sólo las homologías de secuencia, también refleja las similitudes estructurales.

[0048] El alineamiento de la figura 5 se puede usar por lo tanto para deducir las variantes correspondientes en otras estructuras, y estas variantes es posible que también muestren la propiedad enmendada en cuestión. Por ejemplo, la variante anteriormente mencionada A90S+H91 D de MT es transferible a las otras galactanasas originales o estructuras mostradas en la fig. 5 de la siguiente manera: según el alineamiento de la fig. 5, esta variante correspondería a: A90S+H91 D de HI; y A90S+K91 D de BL. Debido a que AA ya tiene la secuencia de S90D91, esta variante no es 7 15

25

35

45

55

65

E03813542

14-04-2015

pertinente para AA. Otro ejemplo es la variante T288P de AA, que, usando el alineamiento de la figura 5, traduce en S288P en MT y HI, y G288P en BL.

[0049] Otras estructuras de galactanasa de la familia de glicósido 53 se conocen (véase más abajo en originales), y se pueden añadir al alineamiento de la figura 5 como se describe abajo, y así variantes correspondientes se pueden deducir también para estas estructuras, como se acaba de describir anteriormente.

[0050] Para alinear una nueva secuencia al alineamiento múltiple de la figura 5, la opción de ClustalW denominada alineamiento de perfil se usa de la siguiente manera: el alineamiento múltiple de la fig. 5 se usa como perfil 1, y luego la nueva secuencia como perfil 2. Luego el programa pide "alinear secuencia a primer perfil" usando los siguientes parámetros:

Parámetros de alineamiento múltiple = Lento/Preciso; Penalización por apertura de espacio = 10,00; Penalización por extensión de espacio = 0,20; Secuencias divergentes de retraso = 30%; Peso de transiciones de ADN: 0,50; Matriz de peso de proteína = Gonnet series; Matriz de peso de ADN = lUB; Usar matriz negativa = OFF; Parámetros de espacio de proteína: Alternar penalizaciones específicas de residuo = ON; Alternar penalizaciones hidrofílicas = ON; Residuos hidrofílicos = GPSNDQEKR; Distancia de separación de espacio = 4; Alternar separación de espacio final = OFF.

[0051] En la fig. 6, como un ejemplo, tres secuencias de galactanasa nuevas se han añadido al alineamiento de la fig. 5. Las muevas galactanasas se añaden a la parte inferior del alineamiento, como las filas número 5, 6 y 7. Las galactanasas son: AT (la galactanasa de Aspergillus tubigensis, (SEC ID nº: 7)); BS (la galactanasa de Bacillus subtilis (SEC ID nº: 8)); y PF (la galactanasa de Pseudomonas fluorescens (SEC ID nº: 9)). Así, usando la fig. 6, la variante anteriormente mencionada A90S+H91 D de MT traduce en A9OS+K91 D de BS y E9OS+K91 D de PR. Debido a que AT ya tiene la secuencia de S90D91, esta variante no es importante para AT. Otro ejemplo es la variante T288P de AA, que, usando el alineamiento de la figura 6, traduce en las variantes T288P de AT, G288P de BS y G288P de PF.

[0052] Alternativamente, los alineamientos de secuencias y el cálculo de grado de % de identidad se pueden realizar usando un alineamiento de Smith-Waterman completo, útil tanto para alineamientos de proteína como de ADN. Las matrices de puntuación por defecto BLOSUM5O y la matriz de identidad se usan para alineamientos de proteína y ADN respectivamente. La penalización para el primer residuo en un espacio es 12 para proteínas y 16 para ADN, mientras que la penalización para residuos adicionales en un espacio es 2 para proteínas y 4 para ADN. El alineamiento se puede hacer con el paquete FASTA versión v20u6 (W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:24442448, and W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183:6398).

Original

[0053] El término "galactanasa original" o simplemente "original" se refiere a la galactanasa en la que la variante estaba basada, y también a la galactanasa con la que la variante es comparada y alineada.

[0054] La original puede ser una galactanasa de origen natural (tipo salvaje) o puede sucesivamente incluso ser una variante de la misma preparada por cualquiera de los medios adecuados. Por ejemplo, la galactanasa original puede ser una variante de una galactanasa de origen natural que haya sido modificada o alterada en la secuencia de aminoácidos. Una original también puede ser una variante alélica que es cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones como bien se describa en la técnica. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por la variante alélica correspondiente de un gen.

Galactanasa

[0055] Esta sección es aplicable a las galactanasas originales, al igual que las galactanasas variantes de la invención.

[0056] Las galactanasas catalizan la endohidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-galactosídicos en arabinogalactanos de tipo I y/o galactanos (véase la estructura de ramnogalacturonano I como se describe en Carpita et al. in Plant J:, 3:130, 1993).

[0057] En el presente contexto, una galactanasa es un polipéptido que tiene actividad de galactanasa. La actividad de galactanasa se puede medir utilizando un sustrato que incluye enlaces 1,4-beta-D-galactosídicos. Ejemplos de sustratos de galactanasa son los arabinogalactanos de tipo I y galactanos. Sustratos especialmente adecuados son i) galactano de altramuz y galactano de patata (disponible comercialmente de, por ejemplo, MegaZyme, Australia); al igual que ii) sustratos de galactano AWL tal como galactano de patata AZCL y galactano de altramuz AWL (también disponible comercialmente de, MegaZyme Australia). Para los sustratos abajo mencionados i) por encima, la actividad de galactanasa se puede medir como liberación de azúcares reductores, mientras que para los sustratos AWL, la actividad de galactanasa se mide espectrofotométricamente (formación de un color azul). En una forma de realización particular, el ensayo de galactanasa se basa en el galactano AWL de altramuces de sustrato.

E03813542

14-04-2015

[0058] El experto en la técnica sabrá adaptar el pH de ensayo y la temperatura de ensayo a la galactanasa en cuestión. Ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o 90°C.

5 [0059] Un ensayo de galactanasa preferido se describe en el ejemplo 2 aquí.

[0060] En una forma de realización particular, la galactanasa es una enzima clasificada como EC 3.2.1.89, cuyo nombre oficial es arabinogalactano-endo-1,4-beta-galactosidasa. Nombres alternativos son endo-1,4-betagalactanasa, 10 galactanasa o arabinogalactanasa. EC se refiere para Clase de Enzima como se describe en a) http:Ilwww.chem.amul.ac.uk/iubmblenzvmel y/o en b) Enzyme Nomenclature 1992 from NCIUBMB, Academic Press, San Diego, California, publicado por Academic Press para IUBMB en 1992 (ISBN 0122271645), según se ha suplementado y actualizado regularmente. Para suplementos y actualizaciones, por favor consulte http:l/www.chem.cimul.ac.uk/iubmb/enzyme/supplements/ que da detalles con respecto a los suplementos siguientes:

15 Supplement 1(1993) (Eur. J. Biochem., 1994 223,115); Supplement 2 (1994) (Eur. J. Biochem., 1995 232, 16); Supplement 3 (1995) (Eur. J. Biochem., 1996 237, 15); Supplement 4 (1997) (Eur. J. Biochem., 1997, 250, 16); Supplement 5 (1999). (Eur. J. Biochem., 1999, 264, 610650): Supplement 6 (2000); Supplement 7 (2001) y Supplement 8 (2002).

20 Familia glicósido hidrolasa (GH) 53

[0061] El clasificación EC clasificación anteriormente mencionada se basa principalmente en la especificidad de sustrato de las enzimas, y por lo tanto no refleja las características estructurales de estas enzimas. Una clasificación de glicósido hidrolasas en familias basada en similitudes de secuencia de aminoácidos se propuso hace años; véase el sitio

25 CAZy(ModO) en Internet:

Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate Active Enzymes server at URL: hfto://afmb.cnrs-mrs.fr/cazy/CAZY/index.htmL and/or Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrateactive enzymes: an integrated database approach. In "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. 30 Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 312; Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) The modular structure of cellulases and other carbohydrateactive enzymes: an integrated database approach. In "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 1523; Henrissat B., A classification of glycosyl hydrolases based on aminoacid sequence similarities. Biochem. J. 280:309316(1991); Henrissat B., Bairoch A. New families in the

35 classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293:781788(1993); Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695696(1996); and/or Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3:853859(1995).

40 [0062] La familia glicósido hidrolasa 53 se encuentra bajo la entrada acerca de las glicosidasas y las transglicosidasas (o glicósido hidrolasas).

[0063] Estas son formas de realización particulares de la galactanasa de la familia GH 53,

45 i) es una endo-1,4-beta-galactanasa (EC 3.2.1.89); ii) tiene un mecanismo catalítico de retención; iii) tiene Glu como un nucleófilo catalítico o base; iv) tiene Glu como un donante de protón catalítico; v) su estructura 3D tiene un pliegue (beta/alfa)8; y/o

50 vi) pertenece a GHA del clan GH.

[0064] Para los fines de la presente divulgación, las glicósido hidrolasas más abajo de la familia 53 son ejemplos no limitativos de una galactanasa original:

55

E03813542

14-04-2015 E03813542

Proteína: Organismo GenBank GenPept SwissProt Publicación

galactanasa I: Aspergillus aculeatus L34599 AAA32692.1 P48842 Christgau et al, Curr. Genet. 27:135-141(1995)

endo-1,4-betagalactanasa (GalA): Aspergillus niger AJ305303 CAC83735.1 Q8X168 -

galactanasa GalA: Aspergillus tubingensis AJ01231 6 CAB40555. 1 Q9Y7F8 Van der Vlugt-Bergmans et al, Biotechnol. Tech. 13:87-92(1999)

ORF 1: Bacillus circulans L03425 AAA22259.1 P48843 SEC ID nº:10 de WO 00/47711

ORF BH2023: Bacillus halodurans AP001514 NC_002570 8AB05742.1 NP_242889.1 Q9KBA5 Takami et al, Extremophiles 3(1), 21-28 (1999)

ORF yvfO: Bacillus subtilis Z94043 Z99121 CABO8009.1 CAB15417.1 007013 007013 032260 SEQ ID NO: 14 of WO 00/47711

YvfO: Bifidobacterium longum AE014643 NC_004307 AAN24099.1 NP_695463.1 Schell et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14422-14427 (2002)

galactanasa: Cellvibrio japonicus (Pseudomonas cellulosa) X91885 CAA62990.1 P48841 Braithwaite et al, Biochemistry 36:1548915500(1997)

ORF CAC2570: Clostridium acetobutylicum AE007755 AAK80519.1 Q97G04 Nolling et al, J. Bacterial. 183 (16), 48234838(2001)

ORF TM1201: Thermotoga maritima AE001777 NC_000853 AAD36276.1 NP_229006.1 Q9XOS8 Nelson et al, Nature 399:323329(1999)

Secuencia 2 de la patente US 6242237: Myceliophthora thermophila AAE73520 AAE73520.1 US 6242237

Secuencia 4 de la patente US6242237: Humicola insolens AAE73521 AAE73521.1 US 6242237

ORF GalA: Xanthomonas axonopodis pv. citri AE011762 NC_003919 AAM36180.1 NP_641644.1 da Silva et al, Nature 417 (6887), 459-463 (2002)

ORF XAC0575: Xanthomonas axonopodis pv. citri AEO11684 NC_003919 AAM35464.1 NP_640928.1 da Silva et al, Nature 417 (6887), 459-463 (2002)

ORF GalA: Xanthomonas campestris pv. campestris AEO12224 NC_003902 AAM40555.1 NP_636631.1 da Silva et al, Nature 417 (6887), 459-463 (2002)

ORF GalA: Xanthomonas campestris pv. campestris AE012483 NC_003902 AAM42894.1 NP_638970.1 da Silva et al, Nature 417 (6887), 459-463 (2002)

ORF YP00853: Yersinia pestis AJ414145 NC_003143 CAC89700.1 NP_404474. 1 Q8ZHN7 Parkhill et al, Nature 413:523527(2001)

ORF Y3238: Yersinia pestis AEO13925 NC_004088 AAM86788.1 NP_670537.1 Deng et al J. Bacteriol. 184 (16), 4601-4611 (2002)

14-04-2015

[0065] Ejemplos adicionales de una galactanasa original de la invención son las galactanasas derivadas de Meripilus giganteus (SEC ID nº: 2 de WO 97/32013), Pseudomonas fluorescens, Bacillus agaradhaerens (SEC ID nº: 12 de WO 00/47711) y Bacillus licheniformis (SEC ID nº: 8 de WO 00/47711).

5 [0066] La presente divulgación específicamente incluye variantes de cada una de las galactanasas originales específicas anteriores de la familia GH 53 que corresponden a las variantes reivindicadas de MTGAL, HIGAL, AAGAL y BLGAL, tales variantes son derivables por adición de la secuencia de galactanasa original en cuestión al alineamiento de la fig. 5 como se ha descrito anteriormente para la construcción de la figura 6, y traducción de cada variante MTGAL,

10 HIGAL, AAGAL o BLGAL en la galactanasa original en cuestión, usando el concepto del residuo de aminoácido correspondiente tal como se ha definido anteriormente.

[0067] En una primera divulgación, la galactanasa de la familia GH original 53 es una galactanasa fúngica. La galactanasa fúngica se puede derivar a partir de una levadura o de un hongo filamentoso. La galactanasa de levadura

15 se puede derivar de Yersinia, por ejemplo de Yersinia pestis. La galactanasa fúngica filamentosa se puede derivar a partir de una cepa de Aspergillus, Humicola, Meripilus, Myceliophthora o Thermomyces. Ejemplos de estas cepas son Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus tubingensis, Humicola insolens, Meripilus giganteus y Myceliophthora thermophila.

20 [0068] En una segunda divulgación, la galactanasa de la familia GH 53 original es una galactanasa bacteriana. La galactanasa bacteriana se puede derivar a partir de una cepa de Bifidobacterium, Cellvibrio, Clostridium, Pseudomonas, Thermotoga o Xanthomonas. Ejemplos de tales cepas son Bacillus agaradhaerens, Bacillus circulans, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium Iongum, Cellvibrio japonicus, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cellulosa, Thermotoga maritime, Xanthomonas axonopodis

25 pv. citri y Xanthomonas campestris pv. campestris.

[0069] Galactanasas originales particularmente preferidas son aquellas con los números de registro del GenBank, GenPept o SwissProt anteriormente mencionados y aquellas con los números de SEC ID anteriormente mencionados.

30 [0070] Además, galactanasas originales de familia GH 53 particularmente preferidas son las siguientes:

Cepa de origen: Número de secuencia (aquí) Abreviaturas usadas aquí

Myceliophthora thermophila Humicola insolens Aspergillus aculeatus Bacillus licheniformis: SEC ID nº: 1 SEC ID nº: 2 SEC ID nº: 3 SEC ID nº: 4 MTGAL o MT HIGAL o HI AAGAL o AA BLGAL o BL

[0071] Subgrupos preferidos de lo anterior son a) MTGAL, HIGAL, AAGAL; b) MTGAL, HIGAL, BLGAL; y c) MTGAL, 35 HIGAL.

[0072] En una tercera divulgación, la galactanasa original tiene un porcentaje de identidad con SEC ID nº: 1 de al menos 25%, utilizando el programa ClustaIW y los ajustes mencionados anteriormente. En otras descripciones particulares, el porcentaje de identidad es al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o al menos 95%.

40 [0073] En una cuarta divulgación, la variante de galactanasa tiene un porcentaje de identidad con SEC ID nº: 1 de al menos 50%, usando el programa ClustaIW y los ajustes mencionados anteriormente. En otras descripciones particulares, el porcentaje de identidad es al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 o al menos 99%.

45 [0074] En una quinta divulgación, la galactanasa original tiene un porcentaje de identidad con SEC ID nº: 2 de al menos 25%, usando el programa ClustaIW y los ajustes mencionados anteriormente. En otras descripciones particulares, el porcentaje de identidad es al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o al menos 95%.

[0075] En una sexta divulgación, la variante de galactanasa tiene un porcentaje de identidad con SEC ID nº: 2 de al 50 menos 50%, usando el programa ClustaIW y los ajustes mencionados anteriormente. En otras descripciones particulares, el porcentaje de identidad es al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 o al menos 99%.

[0076] En una séptima divulgación, la galactanasa original tiene un porcentaje de identidad con SEC ID nº: 3 de al menos 25%, usando el programa ClustaIW y los ajustes mencionados anteriormente. En otras descripciones 55 particulares, el porcentaje de identidad es al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o al menos 95%.

15

25

35

45

55

65

E03813542

14-04-2015

[0077] En una octava divulgación, la variante de galactanasa tiene un porcentaje de identidad con SEC ID nº: 3 de al menos 50%, usando el programa ClustaIW y los ajustes mencionados anteriormente. En otras descripciones particulares, el porcentaje de identidad es al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 o al menos 99%.

[0078] En una novena divulgación, la galactanasa original tiene un porcentaje de identidad con SEC ID nº: 4 de al menos 25%, usando el programa ClustaIW y los ajustes mencionados anteriormente. En otras descripciones particulares, el porcentaje de identidad es al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o al menos 95%.

[0079] En una décima divulgación, la variante de galactanasa tiene un porcentaje de identidad con SEC ID nº: 4 de al menos 50%, usando el programa ClustaIW y los ajustes mencionados anteriormente. En otras descripciones particulares, el porcentaje de identidad es al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 o al menos 99%.

[0080] En otras descripciones particulares, de cada una de las anteriores primera a décima descripciones, el alineamiento es un alineamiento de Smith-Waterman completo con los ajustes mencionados anteriormente, preferiblemente hecho con el paquete FASTA también mencionado anteriormente.

[0081] Debe entenderse que también las variantes de galactanasas se contemplan como la enzima original.

Preparación de variantes de galactanasa

[0082] Las variantes de galactanasa se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica, véase por ejemplo el ejemplo 1 de la presente. Típicamente, se prepara una biblioteca de variantes de galactanasa. El término "biblioteca aleatorizada", "biblioteca de variantes" o simplemente "biblioteca" se refiere a tal biblioteca de variantes de galactanasa. La diversidad en la biblioteca de variantes se puede generar a través de mutagénesis de los genes que codifican las variantes en el nivel de triplete de ADN, de manera que los codones individuales se diversifiquen, por ejemplo, usando cebadores de secuencia parcialmente aleatorizada en una reacción por PCR. Diferentes técnicas se han descrito, por las que uno puede crear una biblioteca combinatoria diversa diversificando diferentes posiciones de nucleótidos en un gen y recombinando éstos, por ejemplo donde estas posiciones están demasiado separadas para ser cubiertas por un único cebador oligonucleótido (enriquecido o dopado). Estas técnicas incluyen el uso de recombinación in vivo de los segmentos génicos individualmente diversificados tal y como se describe en la WO 97/07205 en la página 3, líneas 8 a 29 (Novozymes A/S). También incluyen el uso de técnicas de redistribución de ADN para crear una biblioteca de genes de longitud total, donde diferentes segmentos génicos son combinados, y donde cada segmento se puede diversificar por ejemplo por mutagénesis enriquecida (Stemmer, Nature 370, pp. 389391, 1994 y US 5.811.238; US 5.605.793; y US 5.830.721). Uno puede usar un gen que codifica una "estructura" de galactanasa (galactanasa original de tipo salvaje) como un polinucleótido modelo, y combinar éste con uno o varios oligonucleótidos mono o bicatenarios tal y como se describe en la WO 98/41623 y en la WO 98/41622 (Novozymes A/S). Los oligonucleótidos monocatenarios se podrían aleatorizar parcialmente durante la síntesis. Los oligonucleótidos bicatenarios podrían ser productos de PCR que incorporan diversidad en una zona específica. En ambos casos, uno puede diluir la diversidad con los segmentos correspondientes que codifican la secuencia de la galactanasa de estructura para limitar el número medio de cambios que son introducidos.

[0083] También se han establecido métodos para el diseño de las proporciones de mezclas de nucleótidos (A; C; T; G) que se van a insertar en las posiciones de codón específicas durante la síntesis de oligo o polinucleótidos, para introducir un margen de error para aproximar una distribución de frecuencia deseada hacia un conjunto de uno o varios aminoácidos deseados que serán codificados por los codones particulares. Puede ser de interés producir una biblioteca de variantes que comprenda permutaciones de un número de modificaciones de aminoácidos conocidas en diferentes ubicaciones de la secuencia primaria del polipéptido. Estos podrían ser introducidos de forma post traduccional o por sitios de modificación química, o podrían ser introducidos a través de mutaciones en los genes de codificación. Las modificaciones en sí mismas pueden haberse probado previamente como beneficiosas para una razón u otra (por ejemplo, disminución de antigenicidad o mejora de actividad específica, rendimiento, estabilidad u otras características). En tales casos, puede ser deseable primero crear una biblioteca de combinaciones diversas de secuencias conocidas. Por ejemplo, si doce mutaciones individuales se conocen, se podría combinar (al menos) doce segmentos del gen de codificación de la proteína original, donde cada segmento está presente en dos formas: una con y una sin la mutación deseada. Mediante la variación de las cantidades relativas de esos segmentos, se podría diseñar una biblioteca (de tamaño 212) para que el número medio de mutaciones por gen se pueda predecir. Esta puede ser una forma útil de combinar mutaciones, que por ellas mismas den algo, pero no suficiente efecto, sin recurrir a mu bibliotecas y grandes, como suele ser el caso cuando se usa "mutagénesis enriquecida". Otra forma de combinar estas "mutaciones conocidas" podría ser el uso de la redistribución de familia de ADN oligomérico que codifica las mutaciones conocidas con fragmentos de la secuencia de tipo salvaje de longitud total.

[0084] El ADN mutado se puede expresar por cualquier método conocido en la técnica, véase, por ejemplo, el ejemplo

1. Generalmente, la célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.

[0085] Células unicelulares útiles son bacterias tales como Bacillus, Streptomyces, E. coli, Pseudomonas sp., Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus y Enterococcus.

15

25

35

45

55

65

E03813542

14-04-2015

[0086] Ejemplos de células eucariotas son células animales no humanas, células de insecto, células vegetales o células fúngicas. Ejemplos de células fúngicas son Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Fusariurn, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma.

Aplicaciones

[0087] Las variantes de galactanasa de la invención son útiles en piensos para animales, véase, por ejemplo, la WO 97116982. Ejemplos no limitativos de características deseables de variantes de galactanasa para aplicaciones de alimentación son: estabilidad a altas temperaturas, estabilidad ácida y alta actividad específica.

[0088] Las variantes de galactanasa de la invención también se puede usar para preparar galactooligosacáridos y para la hidrólisis de lactosa, ambos pertinentes para, por ejemplo, la industria láctea. Por ejemplo, el método del ejemplo 5 se puede usar para selección de variantes de galactanasa para actividad mejorada en la lactosa, en particular para transglicosilación mejorada y/o actividad hidrolítica en la lactosa.

[0089] Las reacciones de transglicosilación observadas con ONPG (ejemplo 4) se pueden usar para selección de variantes de galactanasa para afinidades de aceptor adecuadas. La selección puede ser una selección de alto rendimiento. Esto proporciona conocimiento valioso de las afinidades de los subsitios individuales (tales como los subsitios +1, +2, +3, +4) para varios aceptores, por ejemplo galactosa (Gal), β-1,4-galactobiosa (Gal2) (Megazyme), β1,4-galactotriosa (Gal3), β-1,4-galactotetraosa (Gal4), glucosa (Glu), arabinosa (Ara), ácido galacturónico (GalA), maltosa (Mal) o maltotriosa (Mal3).

[0090] Los resultados de ejemplo 3 proporcionan conocimiento de subsitios individuales para galactosa (-3 a +3), al igual que conocimiento de las tendencias para transglicosilato en vez de hidrolizar sustratos. Este conocimiento es útil para el diseño de variantes de galactanasa de propiedades deseadas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de variantes de galactanasa

[0091] La mutación D181N se introdujo en el gen de codificación AAGAL por el uso del oligonucleótido mutagénico 5'-CAT TTG GAC AAC GGC TGG AGC -3' (SEC ID nº: 5) y el método de megacebado descrito por Sarkar, G. y Sommer, S.S., 1990. The "Megaprimer" Method of Site Directed Mutagenesis. BioTechniques, 8: 404407. Las mutaciones D181N+S9OA+D91H fueron introducidas de manera similar.

[0092] Los genes de variantes resultantes fueron clonados en el plásmido pHD464 como se describe en Dalbøge H., Heldt-Hansen H. 1994. A novel method for efficient expression cloning of fungal enzyme genes. Mol. Gen. Genet. 243: 253260, y la introducción correcta de las mutaciones se verificó por secuenciación del ADN.

[0093] La doble mutación A90S+H91 D fue introducida en el gen de codificación MTGAL esencialmente como se ha descrito anteriormente por el uso del oligonucleótido mutagénico 5'-GCC GAT CCT TCT GAT CAG ACC ATG CC -3' (SEC ID nº: 6).

[0094] Las proteínas fueron expresadas en, y segregadas a partir de Aspergillus oryzae esencialmente como se describe en Christensen, T., Wöldike, H., Boel, E., Mortensen, SR, Hjortshøj, K., Thim, L., Hansen, MT., 1988. High level expression of recombinant genes in Aspergillus oryzae. Bio/Technology 6, 14191422_.

Ejemplo 2: Purificación y caracterización de variantes de galactanasa

Purificación de variantes de galactanasa de Aspergillus aculeatus

[0095] El sobrenadante del cultivo de una fermentación de la cepa de Aspergillus oryzae que expresa la variante de galactanasa de Aspergillus aculeatus recombinante dirigida al sitio D181N (descrita en el ejemplo 1) fue filtrado a través de un filtro de 0,22 m para eliminar los micelios. Al filtrado de 1200 ml se añadió sulfato de amonio a una concentración de 1,6 M, cargado sobre una columna de 50 ml de butilo equilibrada con 25 mM de acetato sódico, 1,6 M de sulfato de amonio pH 5,0 y eluido utilizando un sulfato de amonio lineal decreciente de 1,6 M a 0 M sobre 10 volúmenes de columna. La actividad de galactanasa se midió mediante la mezcla de 40 μl de fracciones con 200 μl 10 mg/ml de AWLgalactano de altramuces (Megazyme, Australia) en 0,5 M de MES pH 6,5. Después de aproximadamente 30 mm de incubación a temperatura ambiente, el sustrato insoluble se retiró por centrifugado y se midió la absorbancia del sobrenadante a 590 nm. Fracciones que contienen actividad de galactanasa eluidas alrededor de 1 M de sulfato de amonio fueron agrupadas y dializadas contra 10 mM de citrato sódico pH 3,5. El dialisato (400 ml) se diluyó a 2000 ml con agua y se cargó sobre una columna de 50 ml de S-Sefarosa equilibrada con 10 mM de citrato sódico pH 3,5. La actividad de galactanasa no se enlazó con esta columna y se concentró a 80 ml en un dispositivo de ultrafiltración de Amicon con un 10 kDa de filtro de corte. El concentrado fue al menos 95% puro estimado a partir de SDS-PAGE.

E03813542

14-04-2015

[0096] El sobrenadante del cultivo de una fermentación de la cepa de Aspergillus oryzae que expresa la variante de galactanasa de Aspergillus aculeatus recombinante dirigida al sitio D181N+S90A+D91H fue filtrado como se ha descrito anteriormente. A 900 ml de filtrado se añadió sulfato de amonio a una concentración de 1,6 M, y se eluyó a partir de una 5 columna de 50 ml de butilo como se ha descrito anteriormente. La actividad de galactanasa fue medida como se ha descrito anteriormente. Las fracciones que contenían actividad de galactanasa se eluyeron aproximadamente 0,35 M de sulfato de amonio y fueron agrupadas y dializadas contra 25 mM de acetato sódico pH 5,5. El dialisato (200 ml) se diluyó a 275 ml con agua, se cargó sobre una columna de 50 ml de Q-Sefarosa equilibrada con 25 mM de acetato sódico pH 5,5, y se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCI sobre 10 volúmenes de columna. Las fracciones

10 que contenían actividad de galactanasa (alrededor de 0,8 M de NaCI) fueron agrupadas y concentradas a 10 ml en un dispositivo de ultrafiltración de Amicon con un filtro de corte de 10 kDa. El concentrado fue al menos 95% puro estimado a partir de SDS-PAGE.

Purificación de variantes de galactanasa de Myceliophthora thermophila

15 [0097] El sobrenadante del cultivo de una fermentación de la cepa de Aspergillus oryzae que expresa la variante de galactanasa de Myceliophthora thermophila recombinante dirigida al sitio A90S+H91D (descrito en el ejemplo 1) fue filtrado a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar los micelios. Al filtrado de 1200 ml se añadió sulfato de amonio a una concentración de 1,6 M, se cargó sobre una columna de 50 ml de butilo equilibrada con 25 mM de acetato sódico,

20 1,6 M de sulfato de amonio pH 5,0 y se eluyó utilizando un sulfato de amonio lineal decreciente de 1,6 M a 0 M sobre 10 volúmenes de columna. La actividad de galactanasa fue medida mediante la mezcla de 40 μl de fracciones con 200 μl 10mg/ml AWL-galactano de altramuz (Megazyme, Australia) en 0,5 M de MES pH 6,5. Después de aproximadamente 30 mm de incubación a temperatura ambiente, el sustrato insoluble se eliminó por centrifugado, y la absorbancia del sobrenadante se midió en 590 nm. Fracciones que contienen actividad de galactanasa eluidas alrededor de 1 M de

25 sulfato de amonio fueron agrupadas y dializadas contra 10 mM de citrato sódico pH 3,5. El dialisato (400 ml) fue diluido a 2000 ml con agua y cargado sobre una columna de 50 ml de S-Sefarosa equilibrada con 10 mM de citrato sódico pH 3,5. La actividad de galactanasa no enlazaba con esta columna y fue concentrada a 80 ml en un dispositivo de ultrafiltración de Amicon con un filtro de corte de 10 kDa. El concentrado fue al menos 95% puro estimado a partir de SDS-PAGE.

30 Caracterización de las variantes purificadas

[0098] Los perfiles de pH de las variantes purificadas anteriormente descritas fueron establecidos de la siguiente manera: la actividad de galactanasa en varios pH se midió mediante la mezcla 500 μl 4 mg/ml de AWL-galactano de

35 altramuz (Megazyme, Australia) en agua con 500 μl de tampón (50 mM de acetato sódico, 50 mM de dihidrogenfosfato de potasio, 50 mM de ácido bórico, 1 mM de CaCI2, 0,01% de Tritón X100 ajustado a pH 2,5, 3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,5, 8,5

o 9,5 con HCI/NaOH) y 25 μl de enzima purificada diluida a aproximadamente 0,5-2 μg/ml en agua. La mezcla fue incubada 15 mm a 37°C, el material insoluble se retiró por centrifugado, y la absorbancia en el sobrenadante se midió a 590 nm.

40 [0099] De los resultados mostrados en la tabla 1 por debajo, aparece que los perfiles de pH han cambiado (el perfil de las variantes de AAGAL D181N y D181N+S90A+D91H han sido desplazados al lado alcalino; y el perfil de pH de la variante MTGAL A9OS+H91D ha sido desplazado al lado ácido, en comparación con los tipos salvajes).

45 Tabla 1

Galactanasa/pH: 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

AAGAL: 73 100 83 47 32 0 2 0

AAGALD181N: 74 99 100 87 74 35 7 0

AAGALD181N+S9OA+091H: 55 59 71 83 100 90 21 0

MTGAL: 0 12 41 63 90 100 54 7

MTGALA90S+H911D: 0 8 51 75 100 95 35 4

50 Ejemplo comparativo 3: Actividad en galactooligosacáridos

Preparación de galactotriosa (Gal3), galactotetraosa (Gal4), metil-galactotriósido (MeGal3) y metil-galactotetraósido (MeGal4)

55 [0100] Galactano (altramuz) se compró de Megazyme. Todos los solventes, reactivos y placas de TLC (gel de sílice 60 F254) se compraron de Merck. Espectros de 1H-RMN fueron registrados en un Varian Mercury 400 MHz a 30°C. Como

15

25

35

45

55

65

E03813542

14-04-2015

valores de referencia CHCI3 en COCI3 (7,27 ppm) y HDO en D20 (4,67 ppm) fueron usados. Cromatografía en columna rápida fue realizada utilizando un módulo de cromatografía FLASH 40i de Biotage.

[0101] Undeca-O-acetil galactotriosa: galactano de altramuz tratado con arabinofuranosidasa (0,50 g) fue disuelto en 10 mM de tampón Bis-Tris pH 6,5 (50 mL) por agitación durante 1 h a 37°C. BLGAL se añadió (250 GaIU/mL) y la solución se agitó durante 3 h a 37°C y luego 5 mm a 100°C. TLC (eluyente: propanol/etanol/H2O (7:1:2)) mostró un producto mayor (Gal3) y menor (Gal4) ambos eluyendo bajo galactobiosa comercial. Tras el enfriamiento, la solución se concentró, secó y acetiló y se elaboró por procedimientos estándar (Ac2O/piridina, 48 h a temperatura ambiente (rt)). El producto bruto fue purificado por cromatografía en columna rápida (eluyente: EtOAc/heptano 5:2) para dar 0,20 g de Gal3 peracetato puro (mezcla de alfa y beta-anómero (1:2)). 1H RMN (datos seleccionados, CDCI3): 6,29 ppm (d, J1,2 = 3,5 Hz, H-1alfa), 5,63 ppm (d, J1,2 = 8,4 Hz, H-1β).

[0102] Galactotriosa (Gal3): la desacetilación de la triosa acetilada se realizó por agitación durante toda la noche en metanol/NaOCH3 (1 mL 1M de NaOCH3 en 3 ml de metanol) y luego se neutralizó por adición de Dowex 50 Wx8. Se añadió agua (2 mL) y la resina se retiró por filtración. La solución limpia se concentró (liofilización) para dar 0,10 g de sólido G3. MS (MALDITOF): 527 (M+23, Na). 1H RMN (datos seleccionados, D2O): 5,20 ppm (d, J = 3,6 Hz, H-1alfa), 4,5-4,6 (3 x d, H-1β, H-1', H1").

[0103] Metil deca-O-acetil galactotriósido. La galactotriosa acetilada (0,24 g) se convirtió en bromuro por tratamiento (5 h) con 30% HBr en ácido acético (2,5 mL) y CH2CI2 (2 mL) a 0°C rt. La reacción se elaboró por procedimientos estándar y se concentró para dar un jarabe amarillento (194 mg) del compuesto de alfa-bromo, que se usó sin purificación adicional. 1H RMN (datos seleccionados, CDCI3): 6,57 ppm (d, 1 H, J1,2 = 3,8 Hz, H-1). El bromo-glicósido (0,19 g, 0,20 mmol) fue convertido en glicósido de metilo por tratamiento durante toda la noche con Ag2CO3 (60 mg, 22 mmol) en el metanol seco (10 mL) (bajo nitrógeno). Después de la elaboración, el glicósido de metilo fue purificado por cromatografía en columna rápida (eluyente: EtOAc/heptano (3:1)) para dar 30 mg de compuesto puro (aceite incoloro). 1H RMN (datos seleccionados, CDCI3): 4,48 ppm, 4,39 ppm y 4,35 ppm (3xd, 3H, J1,2 = 8,0 Hz, H-1; H-1' y H-1"), 3,47 ppm (3H, s, OCH3).

[0104] Metil galactotriósido (MeGal3). El glicósido de metilo acetilado (30 mg) fue desacetilado como se ha descrito anteriormente para dar 10 mg de material espeso.

[0105] Galactotetraosa (Gal4). Esta se preparó como se describe para Gal3 usando 100 GaIU/mL. Rendimiento de producto desacetilado final: 17 mg.

[0106] Metil galactotetraósido (MeGal4). Este compuesto se preparó en la analogía con MeGal3 y 41 mg de MeGal4 se obtuvieron a partir de 1 g de galactano. MS (MALDITOF): 704 (M+23, Na).

Actividad de HIGAL, MTGAL, AAGAL y BLGAL en galactooligosacáridos

[0107] La actividad en los sustratos de galactooligosacárido preparada como se ha descrito anteriormente y en la galactobiosa disponible comercialmente (Gal2, Megazyme) fue estudiada para las cuatro galactanasas purificadas HIGAL, MTGAL, AAGAL y BLGAL. Los tampones y las temperaturas usados fueron: 25mM de acetato sódico, 0,5mM de CaCI2, 0,005% de Tritón X100, pH 6,5 a 37°C para HIGAL y MTGAL, 50 mM de acetato sódico, 1 mM de CaCI2, pH 4 a 30°C para AAGAL y 50 mM de Mes, 1 mM de CaCI2, pH 6,5 a 30°C para BLGAL. Las concentraciones enzimáticas usadas fueron 0,8 μg/ml para HIGAL, 0,2 μg/ml para MTGAL, y 10 μg/ml para AAGAL y BLGAL. Con HIGAL y MTGAL, las concentraciones de sustrato fueron todas 0,25 mg/ml, mientras que 0,34 mg/ml de Gal2, 0,050 mg/ml de Gal3 y 0,067 mg/ml de Gal4 fueron usados para AAGAL y BLGAL. La actividad enzimática en las muestras retiradas después de varios tiempos de incubación fue inactivada por calentamiento a 95°C durante 10 mm. Las composiciones de los productos reactivos fueron analizadas usando HPAE-PAD (Dionex) aplicando una columna PA100 y un gradiente lineal de acetato sódico (0-0,18 M) en 0,15 M de NaOH. Los factores de respuesta de los carbohidratos individuales fueron estimados a partir de las ejecuciones de referencia con MeGal3, MeGal4, Gal, Gal2, Gal3 y Gal4. Los resultados seleccionados se muestran en las tablas 2-8 más adelante (las figuras indican porcentaje en peso de galactooligosacáridos).

[0108] Ninguna de las enzimas HIGAL, MTGAL, AAGAL o BLGAL tuvo ninguna actividad detectable en Gal2 en 24 horas. HIGAL, MTGAL y AAGAL degradaron Gal3 a Gal2 y Gal, mientras que BLGAL no tuvo ninguna actividad visible en Gal3 después de 24 horas. La incubación de HIGAL y MTGAL con MeGal3 (véase tablas 2 y 3) dio una liberación mucho más alta de MeGal que de MeGal2, lo que indica que Gal se libera a partir del extremo reductor de Gal3 con ambas enzimas. HIGAL y MTGAL degradó Gal4 (también conteniendo aproximadamente 40% de Gal3) (tablas 4 y 5) principalmente a Gal y Gal2, mientras que Gal3 no se acumuló. Resultados para HIGAL y MTGAL con MeGal4 (tablas 6 y 7) dieron liberación inicial principalmente de MeGal, MeGal2 y Gal3 y algo de Gal2 pero poco Gal, nuevamente indicando que Gal se libera principalmente a partir del extremo reductor de Gal4. La producción de Gal a partir de MeGal4 en los últimos estadios de la hidrólisis se puede deber principalmente a la hidrólisis de productos de transglicosilación sin grupo metilo en el extremo reductor. BLGAL degrada galactotetraosa principalmente a galactosa y galactotriosa. Con MeGal4 los productos principales de BLGAL fueron MeGal y Gal3, indicando que Gal se libera a partir del extremo reductor de Gal4. Con AAGAL los productos iniciales de galactotetraosa son aproximadamente

E03813542

14-04-2015

cantidades equimolares de galactosa, galactobiosa y galactotriosa, pero posteriormente la galactotriosa se degrada a galactobiosa y galactosa.

Tabla 2: Degradación de MeGal3 con HIGAL

Tiempo de incubación (horas): 0,0 0,5 2,2 5,0 72,0

Gal: 0,0 0,0 2,3 3,0 17,1

Gal2: 0,0 3,9 12,5 20,2 36,2

Gal3: 0,0 1,2 3,3 10,6 8,0

MeGal: 0,0 11,4 18,4 36,8 34,6

MeGal2: 0,0 3,3 3,7 5,2 4,2

MeGal3: 100,0 80,3 59,7 24,2 0,0

Tabla 3: Degradación de MeGal3 con MTGAL

Tiempo de incubación (horas): 0,0 0,5 2,2 5,0 72,0

Gal: 0,0 0,0 14,1 2,2 6,5

Gal2: 0,0 0,0 8,5 10,9 37,2

Gal3: 0,0 0,0 0,4 15,7 23,2

MeGal: 0,0 10,1 27,6 17,4 28,3

MeGal2: 0,0 2,7 1,9 3,2 3,5

MeGal3: 100,0 87,2 47,5 50,6 1,3

10 Tabla 4: Degradación de Gal4 con HIGAL

Tiempo de incubación (horas): 0,0 0,5 2,2 5,0 72,0

Gal: 0,0 5,8 16,7 35,6 65,2

Gal2: 0,0 8,1 21,9 34,8 33,6

Gal3: 42,0 43,2 39,8 23,9 0,9

Gal4: 58,0 42,9 21,6 5,7 0,2

Tabla 5: Degradación de Gal4 con MTGAL

Tiempo de incubación (horas): 0,0 0,5 2,2 5,0 72,0

Gal: 0,0 11,6 14,9 29,2 54,9

Gal2: 0,0 9,9 17,4 29,1 43,5

Gal3: 42,0 27,7 45,5 29,5 1,5

Gal4: 58,0 50,8 22,3 12,1 0,0

Tabla 6: Degradación de MeGal4 con HIGAL

Tiempo de incubación (horas): 0,0 0,5 2,0 5,0 24,0

Gal: 0,0 2,3 1,6 7,4 26,4

Gal2: 0,0 6,3 5,0 13,8 25,3

Gal3: 0,0 20,6 16,0 19,7 9,1

Gal4: 0,0 3,3 3,2 3,2 1,7

MeGal: 1,6 12,1 10,5 16,6 19,1

MeGal2: 4,7 12,6 13,2 16,1 13,4

MeGal3: 14,8 17,2 18,4 15,5 5,0

MeGal4: 79,0 24,5 32,1 7,6 0,0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

E03813542

14-04-2015

Tabla 7: Degradación de MeGal4 con MTGAL

Tiempo de incubación (horas): 0,0 0,5 2,0 5,0 24,0

Gal: 0,0 0,9 4,8 12,4 24,2

Gal2: 0,0 3,3 10,9 20,1 32,7

Gal3: 0,0 13,7 23,9 17,9 3,4

Gal4: 0,0 2,5 3,7 2,9 1,1

MeGal: 1,6 8,9 16,2 19,3 20,1

MeGal2: 4,7 9,6 13,6 13,9 13,3

MeGal3: 14,8 17,1 16,0 9,9 2,3

MeGal4: 79,0 43,9 10,9 3,5 2,9

Ejemplo comparativo 4: Actividad con o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG)

[0109] La actividad de HIGAL y MTGAL con ONPG se evaluó mediante la mezcla de 200 μl (normalmente 5,5 mg/ml) de ONPG en 50mM de acetato sódico, 1 mM de CaCI2, 0,01% de Tritón X1 00, pH 6,5 con 25 μl de galactanasa (normalmente 1 mg/ml) en el pocillo de una placa de microtitulación. La liberación de o-nitrofenol (ONP) se midió a temperatura ambiente a 405 nm cada 10 segundos normalmente durante 30 mm en un SpectraMaxPlus (Molecular Devices). Los efectos en la liberación observada de ONP se estudiaron con concentración enzimática variada, concentración de ONPG y con adición de galactosa (Gal), β-1,4-galactobiosa (Gal2) (Megazyme), β-1,4-galactotriosa (Gal3), β-1,4-galactotetraosa (Gal4), glucosa (Glu), arabinosa (Ara), ácido galacturónico (fiesta), maltosa (Mal) o maltotriosa (Mal3).

[0110] En las tablas 8-11 por debajo, se enumeran los tiempos de incubación requeridos para aumentar la absorbancia observada a 405 nm por cantidades dadas. Células marcadas 'n.a.' indican que el aumento en la absorbancia no se alcanzó en el experimento. En general, el aumento inicial en la absorbancia a 405 nm fue muy lento, pero después de que una fase de latencia el índice de liberación de ONP frecuentemente aumentó drásticamente frecuentemente aproximadamente exponencialmente. La explicación más probable para la cinética observada es que ONPG reacciona con la enzima para dar un intermedio de enzima-galactosil que hidroliza muy lentamente. En cambio, el Gal del intermedio se libera por transglicosilación, inicialmente con ONPG o azúcar añadido como aceptor. En casos donde el índice de liberación de ONP aumenta, estos productos de transglicosilación son aún mejores aceptadores que los iniciales. Como se ha visto en la tabla 8, el índice de liberación de ONP es aproximadamente proporcional a la cantidad de enzima añadida. HIGAL libera ONP más rápido que MTGAL a dosificación de enzima idéntica. La adición de Gal (5 mg/ml) se ve que ralentiza la liberación de ONP por aproximadamente un factor de dos para MTGAL y un factor de tres para HIGAL. Probablemente, Gal no ralentiza significativamente la formación del intermedio enzima-galactosil, que se acumularía incluso si Gal tuviera alta afinidad para el subsitio -1 o +1. Más posiblemente, Gal inhibe la transglicosilación posterior, que requiere la unión de ONFG a los subsitios +1 y +2, por ejemplo por unión al subsitio +2. Con 50 mg/ml de Gal añadido (resultados no mostrados) la liberación de ONP fue incluso más lenta con sólo aumento insignificante de absorbancia a 405 nm en 30 mm.

[0111] Los resultados en la tabla 9 muestran que el índice de liberación de ONP es similar con 5 y 10 mg/ml de ONPG pero más lento a 2,5 y especialmente 1,25 mg/ml de ONPG. Esto indica que el índice que limita la reacción de transglicosilación con ONPG como aceptor tiene un Km de aproximadamente 3 mg/ml.

[0112] En la tabla 10 se dan los efectos de adición de 0,5 o 0,05 mg/ml de Gal2, Gal3 o Gal4. A diferencia de Gal, cada uno de estos tres galactooligosacáridos aumenta el índice de liberación de ONP. Los índices de liberación de ONP iniciales indican que Gal4 es más eficaz que Gal3 como aceptor, y que Gal3 es más eficaz que Gal2. Con Gal2 y Gal3, el índice de liberación de ONP aumenta significativamente con el tiempo de incubación, indicando que los productos de transglicosilación (inicialmente Gal3 y Gal4, respectivamente) son aceptores más eficaces que los azúcares añadidos, mientras que el índice de liberación es relativamente constante con Gal4. Estos resultados indican que HIGAL posee cuatro subsitios significativos (+1,+2, +3, +4) en el lado de reducción del enlace dividido.

[0113] En la tabla 11 se dan los resultados sobre la adición de Glu, Ara, Mal, Mal3 y GalA. Como se llevaron a cabo experimentos en tres días diferentes, y el índice de liberación de ONP incluso en experimentos idénticos se vio que variaba ligeramente (posiblemente debido a variaciones en la temperatura), se muestran los resultados con solo ONPG e HIGAL añadido realizado en los mismos tres experimentos. Se puede observar que 5 mg/ml de Ara inhibe la transglicosilación, dando como resultado liberación de ONP aproximadamente tres veces más lenta. 5 mg/ml de Glu también tiene un ligero efecto inhibitorio, mientras que 50 mg/ml de Glu (resultados no mostrados) dio como resultado muy poca liberación de ONP (<0,02) en 30 mm. Como con Gal, esto indica unión de estos azúcares a subsitios en el intermedio enzima-galactosil, lo que impide que ONPG actúe como aceptor y donde los azúcares en sí también tienen función aceptora pequeña o ninguna. Con 5 mg/ml de Mal o Mal3 no se observan efectos significativos en la liberación ONP. 5 mg/ml de GalA tienen débil efecto inhibitorio, mientras que 50 mg/ml de GalA ralentiza la liberación de ONP en

E03813542

14-04-2015

aproximadamente un factor de dos. De estos resultados la clasificación del efecto inhibitorio de los azúcares evaluados es: Gal -Ara > Glu > GalA> Mal = Mal3 = 0.

[0114] Usando cromatografía HPAE-PAD (Dionex LC500 System, columna PA100, gradiente lineal de 0-0,6 M de

5 acetato sódico en 100 mM de NaOH), la producción de oligosacáridos mayores a partir de transglicosilación con incubación de HIGAL (110 μg/ml) a temperatura ambiente (0,5 a 14 mm seguido de inactivación térmica durante 10 mm a 95°C da como resultado A405: 0,15-0,67) en 50 mM de acetato sódico, 1 mM de CaCI2, 0,01% de Tritón X100, pH 6,5 con ONPG (5 mg/ml) con y sin Gal2 (0,05 mg/ml) o Gal3 (0,05 mg/ml) como aceptor fue verificada.

10 Tabla 8: Índice de liberación de ONP MTGAL e HIGAL al variar las dosis y +1 azúcar

Enzima: μg/ml: MTGAL 110 MTGAL 55 MTGAL 28 MTGAL 110 MTGAL 55 HIGAL 110 HIGAL 55 HIGAL 28 HIGAL 110 HIGAL 55

ONPG (5 mg/ml)

Azúcar: mg/ml: Gal: 5 Gal: 5 Gal: 5 Gal: 5

Tiempo (min) para aumentar A405 por:: 0,025 14,0 29,9 40,4 26,9 40,2 9,0 20,4 41,4 32,0 57,0

0,05: 20,5 42,5 n.a. 44,5 n.a. 10,3 22,9 46,5 35,7 n.a.

0,1: 26,4 54,5 n.a. n.a. n.a. 11,5 25,4 51,0 41,5 n.a.

0,2: 31,4 n.a. n.a. n.a. n.a. 12,7 28,0 56,5 46,7 n.a.

0,4: 34,5 n.a. n.a. n.a. n.a. 13,8 30,9 n.a. 52,7 n.a.

0,8: 39,2 n.a. n.a. n.a. n.a. 15,0 32,0 n.a. 59,0 n.a.

1,6: 43,9 n.a. n.a. n.a. n.a. 15,0 35,0 n.a. n.a. n.a.

3,2: 46,7 n.a. n.a. n.a. n.a. 17,7 37,9 n.a. n.a. n.a.

Tabla 9: Índice de liberación de ONP al variar concentraciones de ONPG

Enzima: g/ml: HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110

ONPG (mg/ml): 10 5 2,5 1,25

Azúcar: mg/ml

Tiempo (min) para aumentar A405 por:: 0,025 6,3 6,0 9,7 28,7

0,05: 7,7 8,0 11,3 n.a.

0,1: 8,8 9,2 12,7 n.a.

0,2: 10,0 10,2 14,0 n.a.

0,4: 11,2 11,3 15,5 n.a.

0,8: 12,3 12,5 17,3 n.a.

1,6: 13,5 13,8 19,5 n.a.

3,2: 14,7 15,3 22,8 n.a.

15

20

E03813542

14-04-2015

Tabla 10: Índice de adición de liberación de ONP de varias cantidades de varios galactooligosacáridos

Enzima: g/ml: HIGAL: 110 HIGAL: 100 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110

ONPG (mg/ml): 5 5 5 5 5 5 5

Azúcar: mg/ml: Gal2: 0,5 Gal2: 0,05 Gal3: 0,5 Gal3: 0,05 Gal4: 0,5 Ga14: 0,05

Índice inicial (modo/min): 0,9 6 2 200 40 700 80

Tiempo (mm) para aumentar A405 por:: 0,025 10,0 2,7 5,5 0,0 0,5 0,0 0,2

0,05: 11,3 3,5 6,8 0,2 1,0 0,0 0,5

0,1: 12,8 4,8 8,2 0,3 1,7 0,0 0,8

0,2: 14,2 6,0 9,5 0,5 2,3 0,2 1,5

0,4: 15,7 7,2 10,7 0,8 3,3 0,5 2,5

0,8: 17,0 8,3 11,8 1,5 4,8 1,0 3,7

1,6: 18,5 9,7 13,3 2,5 6,3 2,2 5,2

3,2: 20,0 11,0 15,2 3,8 7,7 5,3 7,5

Tabla 11: Índice de inhibición de liberación de ONP por azúcares

Enzima: g/ml: HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110 HIGAL: 110

ONPG(mg/ml): 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Azúcar: mg/ml: Glu: 5 Ara: 5 Mal: 5 Ma13: 5 GalA: 50 GalA: 5

Tiempo (mm) para aumentar A405 por:: 0,025 8,5 12,8 26,5 11,0 11,5 11,0 8,7 13,7 9,5

0,05: 9,5 14,8 n.a. 12,5 13,0 12,3 9,8 16,7 11,2

0,1: 10,8 17,0 n.a. 13,8 14,3 13,8 11,0 20,0 12,7

0,2: 12,0 19,3 n.a. 15,2 15,7 15,2 12,2 23,3 14,3

0,4: 13,3 21,8 n.a. 16,5 17,2 16,5 13,3 26,8 15,8

0,8: 14,5 24,3 n.a. 18,0 18,7 18,0 14,7 n.a. 17,5

1,6: 15,8 27,0 n.a. 19,5 20,2 19,3 16,0 n.a. 19,3

3,2: 17,3 n.a. n.a. 21,3 22,0 21,3 17,3 n.a. 22,5

Ejemplo comparativo 5: Actividad en la lactosa

10 [0115] HIGAL (60 μg/ml) y MTGAL (750 μg/ml) fueron incubados a 50°C con lactosa (Lac) (100 mg/ml) a pH 4,8 (25 mM de citrato sódico), 6,45 (25 mM de acetato sódico, 0,5 mM de CaCI2, 0,005% de Tritón X100) y 8,6 (50 mM de Tris, 0,01% Brij 35). Muestras de 20 μl fueron retiradas después de 2, 23 y 120 horas, 980 de agua se añadió y la enzima se inactivó por calentamiento a 95°C durante 10 min. Después de otros 20 de tiempo de dilución con agua, las muestras

15 fueron analizadas usando HPAE-PAD (Dionex LC500 System, columna PA100, 0-3 mm: 150mM de NaOH, 3-19 mm: gradiente lineal 0-0,18 M de acetato sódico en 150mM de NaOH). Los factores de respuesta para los picos individuales fueron estimados a partir de estándares de Gal, Glu, Lac, Gal2, Gal3 y Gal4.

[0116] Bajo estas condiciones solo MTGAL a pH 4,5 y 6,5 dio conversión significativa de Lac. En las tablas 12 y 13 se

20 dan las fracciones de peso de los productos analizados con MTGAL a pH 4,5 y 6,45. Las figuras indican % en peso de los productos que resultan de la incubación. El término DP3 indica producto de transglicosilación que consiste en tres unidades de azúcar, y el término DP4+ productos de transglicosilación que consisten en cuatro o más unidades de azúcar. Desafortunadamente, el método de análisis usado no fue capaz de separar Glu y Gal.

25 [0117] Con transglicosilación ocurriendo según la reacción:

E03813542

14-04-2015

2 Lac -> DP3 (=Gal2Glu) + Glu

la fracción de peso de DP3 debería ser aproximadamente tres veces superior al peso del monómero. Después de 2 horas la proporción es aproximadamente 1.5 en ambos pH lo que indica que esta no es la única reacción que tiene 5 lugar. La producción de oligosacáridos mayores (DP4+) es un resultado del producto de transglicosilación inicial que funciona como aceptor para transglicosilación adicional:

Lac + DP3 -> DP4 + Glu

10 [0118] También, de la creciente cantidad de Gal/Glu sin aumento correspondiente en los productos de transglicosilación (DP3 y DP4+) después de 23 y 120 horas, es evidente que la hidrólisis de productos de transglicosilación tiene lugar. Estas reacciones de hidrólisis parecen ser más lentas a pH 6,45 que a pH 4,5.

Tabla 12: Actividad de MTGAL en la lactosa (pH 4,5) 15

Tiempo de incubación (horas): 2 23 120

Glu/Gal: 1,4 12,5 38,8

Lac/Ga12: 96,0 78,7 51,2

DP3: 2,0 7,0 8,9

DP4+: 0,5 1,8 1,1

Tabla 13: Actividad de MTGAL en la lactosa (pH 6,45)

Tiempo de incubación (horas): 2 23 120

Glu/Gal: 1,0 6,5 21,0

Lac/Ga12: 95,7 85,3 62,6

DP3: 1,4 6,3 11,7

DP4+: 1,9 1,9 4,7

20 Ejemplo comparativo 6: Actividad en el galactano

[0119] Galactano de altramuz (Megazyme) se incubó con BLGAL (0,1-10 μg/ml) a pH 6,5 (50 mM de MES, 1mM de CaCI2) y con AAGAL (0,1-10 μg/ml) a pH 4,0 (50 mM de acetato sódico, 1 mM de CaCI2) a 30°C. Las muestras fueron

25 retiradas después 45 mm a 24 horas y la enzima se inactivó por calentamiento a 95°C durante 10 mm. Los productos de reacción fueron analizados usando HPAEC-PAD en un sistema cromatográfico de Dionex utilizando una columna CarboPac PA100 y un gradiente lineal 0 a 0,3 M de acetato sódico en 0,15 M de NaOH. Galactooligosacáridos purificados se usaron para identificar productos.

30 [0120] Con BLGAL el producto principal inicial es galactotetraosa con ambos oligómeros menores y mayores también presentes. Con incubación más larga las fracciones de galactosa, galactobiosa y galactotriosa aumentan y después de incubación prolongada sólo estos tres oligómeros se ven en proporciones molares de aproximadamente 1:0,4:0,9.

[0121] AAGAL inicialmente produce una mezcla más homogénea de galactooligómeros. Degradación adicional produce

35 principalmente galactosa, galactobiosa y galactotriosa, y finalmente casi exclusivamente galactosa y galactobiosa se ven en una proporción molar de aproximadamente 2:1. Pequeños picos probablemente correspondientes a galactobiosas y galactotriosas que resultan de reacciones de transglicosilación con enlaces glucosídicos diferente de β1,4 están también presentes.

40

Claims

REIVINDICACIONES

1. Variante de una galactanasa de la familia glicósido hidrolasa 53 original que tiene un cambio en el perfil de la actividad de pH en comparación con la original; dicha variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones:

5 H91 N,L,D; A90S+H91D; D181N; donde la variante tiene actividad de galactanasa; donde la galactanasa original tiene cualquiera de las SEC ID nº: 1-4; donde la variante tiene al menos 80% de identidad con la galactanasa original; y donde la numeración se define por el alineamiento con SEC ID n: 1 utilizando el programa ClustalW con la opción

10 alineamiento de perfil con alineamiento múltiple de la figura 5 como perfil 1, y cualquier secuencia no presente en la fig. 5 como perfil 2 para ser alineado con el primer perfil, usando los parámetros: Parámetros de alineamiento múltiple = Lento/Exacto; Penalización por apertura de espacio = 10,00; Penalización por extensión de espacio = 0,20; Secuencias divergentes de retraso = 30%; Peso de transiciones de ADN: 0,50; Matriz de peso de proteína =series Gonnet; Matriz de peso de ADN =IUB; Uso matriz negativa = OFF; Parámetros de espacio de proteína: Alternar sanciones específicas de

15 residuos = ON; Alternar sanciones hidrofílicas = ON; Residuos hidrofílicos = GPSNDQEKR; Distancia de separación del espacio = 4; Alternar separación de espacio final = OFF.
2. Variante según la reivindicación 1, donde la variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones:

H91N,L,D. 20
3.

Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la variante comprende al menos las siguientes sustituciones: A90S+H91 D.
4.

Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la galactanasa original tiene cualquiera de SEC ID nº: 1

25 2.
5. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la galactanasa original tiene SEC ID nº: 1.
6.

Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es una variante de una galactanasa de Myceliophfhora 30 thermofila.
7. Variante según la reivindicación 1, donde la variante comprende al menos la siguiente sustitución: D181N.
8.

Variante según la reivindicación 7, donde la galactanasa original tiene SEC ID nº: 3. 35
9.

Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante de galactanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10.

Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 9

40 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la variante de galactanasa en un huésped de expresión adecuado.
11. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 10.

45 12. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la reivindicación 10 o el vector de la reivindicación 11.
13. Método para producir una variante de galactanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el método comprende

(a) cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 1-2; y (b) recuperación del polipéptido. 50
14.

Uso de al menos una variante de galactanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en la industria láctea.
15.

Uso de al menos una variante de galactanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para preparar

galactooligosacáridos y/o para la hidrólisis de lactosa. 55

21