ES2529734T3 - Anticuerpo PcrV humanizado con actividad anti-pseudomonas - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humanizado contra PcrV o una parte de dicho anticuerpo, que tiene 1) en una región variable de la cadena pesada, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15) para CDR-H1, INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) para CDR-H2 e YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) para CDR-H3 y 2) en una región variable de la cadena ligera, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) para CDR-L1, TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) para CDR-L2 y HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20) para CDR-L3; y que tiene al menos una característica seleccionada de (A) a (C): (A) inhibe 50% o más de citotoxicidad a células de leucocitos de Pseudomonas aeruginosa a una concentración de 1 nM a 200 nM in vitro; (B) inhibe 50% o más de citotoxicidad a células de mieloma de Pseudomonas aeruginosa a una concentración de 1 nM a 50 nM in vitro; y (C) tiene una constante de disociación (Kd) con PcrV de 2 x 10-9 (M) o menor.

Description

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scFv es un péptido VH-P-VL o VL-P-VH, en el que una cadena VH y una cadena VL están conectadas utilizando un enlazador peptídico apropiado (aquí en lo sucesivo, designado por P), y es un fragmento de anticuerpo que tiene actividad de antígeno. VH y VL contenidas en scFv, utilizadas en la presente invención, pueden derivarse a partir del anticuerpo monoclonal de la presente invención. scFv utilizado en la presente invención se puede producir mediante la adquisición de ADNc que codifica VH y VL de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la presente invención, la construcción de un vector de expresión de scFv y provocando la expresión mediante la introducción del vector de expresión en E. coli, levadura o célula animal.

dsFv se refiere a uno obtenido por polipéptidos de unión, en que cada uno de los residuos aminoácido está sustituido con un residuo cisteína en VH y VL, a través de enlace S-S. El aminoácido a ser sustituido con residuo de cisteína puede seleccionarse basándose en la predicción de estructura terciaria de anticuerpo de acuerdo con el método indicado por Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). VH o VL, contenida en dsFv utilizado en la presente invención, puede derivarse del anticuerpo monoclonal de la presente invención. dsFv utilizado en la presente invención se puede producir mediante adquiriendo ADNc que codifica VH y VL de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la presente invención, construyendo un vector de expresión de dsFv insertándolo en un vector de expresión apropiado, y provocando la expresión mediante la introducción del vector de expresión en E. coli, levadura o célula animal.

Diacuerpo es un fragmento de anticuerpo, en donde se forma un dímero de scFv que tiene la misma o diferente especificidad de unión al antígeno, y es un fragmento de anticuerpo que tiene actividad de unión al antígeno bivalente para el mismo antígeno o dos actividades de unión a antígeno específicos para diferentes antígenos. Por ejemplo, el diacuerpo bivalente que reacciona específicamente con el anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede producir adquiriendo ADNc que codifica VH y VL de un anticuerpo monoclonal de la presente invención, construyendo ADN que codifica scFv que tiene un enlazador peptídico de 3 a 10 residuos, insertando el ADN en un vector de expresión para la célula y provocando la expresión de diacuerpo al introducir el vector de expresión resultante en E. coli, levadura o célula animal.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención o una parte del mismo puede ser modificado en la medida en que se utiliza adecuadamente en la presente invención. Como una sustancia modificada, se pueden utilizar anticuerpos unidos a diversas moléculas, incluido polietilenglicol (PEG) o similares. La modificación realizada en el anticuerpo puede ser una modificación por introducción de enlace químico, o puede ser una modificación realizada en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Un anticuerpo monoclonal de la presente invención o una parte del mismo también abarca estas sustancias modificadas en anticuerpo. Para la obtención de sustancias modificadas en anticuerpo, el anticuerpo obtenido puede ser modificado. Estas técnicas han sido ya establecidas en la técnica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica la región variable pesada o la región variable ligera de un anticuerpo monoclonal humanizado (h1F3) de la presente invención. Preferiblemente, el polinucleótido de la presente invención tiene la secuencia de bases de cualquiera de SEQ ID: 29 ó 30. La presente invención también abarca polinucleótidos que se pueden hibridar con dicho polinucleótido en una condición rigurosa, y codifica un anticuerpo que tiene actividad equivalente con el anticuerpo de la presente invención.

El polinucleótido de la presente invención es un polímero que consiste en nucleótidos tales como varios ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN), en la medida en que codifiquen el anticuerpo de la presente invención. Éstos pueden incluir bases distintas de productos naturales. El polinucleótido de la invención puede estar disponible para la producción de anticuerpos de una manera de la tecnología genética. El polinucleótido de la invención puede ser también útil como sonda para el tamizado de anticuerpos que tienen actividad equivalente con el anticuerpo de la presente invención. Así, utilizando como sonda un polinucleótido que codifica el anticuerpo de la presente invención o una parte del mismo, se puede obtener una técnica de aplicación tal como la técnica de hibridación o amplificación de genes, por ejemplo, PCR, ADN que puede hibridarse con dicho polinucleótido en la condición rigurosa y codifica el anticuerpo que tiene actividad de equivalencia con el anticuerpo de la presente invención. Estos ADNs también están abarcados en el polinucleótido de la presente invención.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención y una parte del mismo es útil como una composición farmacéutica. Por lo tanto, una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo monoclonal de la presente invención y una parte del mismo se pueden administrar de modo sistémico o tópico por una vía oral o parenteral. Para la administración parenteral, se puede seleccionar, por ejemplo, inyección intravenosa tal como infusión por goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, administración intranasal, inhalación

o similares. Sin embargo, dado que es conocido que Pseudomonas aeruginosa se infligirá daños, particularmente a células del epitelio pulmonar y macrófagos de los alvéolos pulmonares por infección del tracto respiratorio (T. Sawa et al., Nature Medicine, 1999, vol. 5, pág. 392), se desean la administración intranasal y la inhalación.

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Marcaje con biotina de antígeno

Proteína PcrV, expresada y purificada como se ha descrito arriba, se dejó que reaccionara en una disolución de mercapto-etilamina de una concentración final de 10 mM a 37 °C durante 150 minutos para reducir el residuo cisteína. Biotina activada con PEO-maleimida (disponible de PIERCE) se añadió en una cantidad de 20 veces por relación molar con respecto a grupos SH reducidos, y se dejó que reaccionara durante la noche a 4 °C, y luego se llevó a cabo una diálisis para separar la biotina que no había reaccionado.

Inmunización con antígeno

En cada caso 20 µg de antígeno de PcrV purificado fueron inmunizados por vía intraperitoneal con adyuvante completo de Freund a siete ratones Balb/c hembras de 4 semanas de edad. Se realizó una inmunización de refuerzo administrando 20 µg de PcrV con adyuvante incompleto de Freund después de 14 días y 35 días. Además, inmunización final se llevó a cabo después de 77 días mediante administración intraperitoneal de 20 µg de PcrV y administración en la vena de la cola de 10 µg de PcrV

Preparación de hibridoma

El bazo fue extirpado después de 3 días a partir de la inmunización final, y se recogieron células del bazo. Una célula de bazo y una célula de mieloma de ratón (P3 x 63 Ag8.U1, Tokyo mass research laboratory) se fusionaron utilizando polietilenglicol 4000 al 50%, y se seleccionaron en un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina.

Selección de anticuerpo de PcrV

Después de 8 días desde la fusión celular, se rastrearon células productoras de anticuerpos específicos. El inmunoensayo utilizado en el tamizado era como sigue. A cada uno de los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos (disponible de Nunc) se añadieron 200 µL de tampón tris (Tris-HCl50 mM, pH 7,5) que contiene 2 µg de anticuerpo IgG anti-ratón (disponible de Shibayagi) y se inmovilizaron durante 16 horas a 4°C. Estos pocillos se lavaron dos veces con 300 µl de disolución de lavado (solución salina que contiene Tween 20 al 0,1%), luego se añadieron 300 µl de BlockAce (disponible de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) y se dejó durante dos horas a temperatura ambiente. Después de lavar cada uno de los pocillos dos veces con 300 µl de disolución de lavado, 50 µl de sobrenadante de cultivo de hibridoma se diluyeron con 150 µl de tampón C (tampón tris 50 mM, pH 7,6 que contiene cloruro sódico al 0,9%, azida de sodio al 0,05%, albúmina de suero bovino al 0,5%, Tween 80 al 0,01% y ácido dietilentriamina-N,N,N',N",N"-penta-acético 50 µM) y se añadieron a cada pocillo, y se dejó que reaccionara durante la noche a 4°C. Después de lavar tres veces con 300 µl de disolución de lavado, se añadieron 200 µl de tampón C que contenía 10 ng de estreptavidina marcada con Eu (disponible de PERKIN ELMER) y 25 ng de PcrV marcada con biotina, y se dejó que reaccionara durante 1 hora a la temperatura ambiente. Después de la reacción, lavando tres veces con 300 µl de disolución de lavado, y se añadieron 200 µl de reactivo de potenciación (1,39 g/l de ftalato de potasio, 19,3 mg/l de óxido de tri-n-octilfosfina, 4,59 mg/l de 2-naftoiltrifluoroacetona, 1,0 g/l de Triton-X100, 6,0 g/l de ácido acético) y se midió la fluorescencia de resolución temporal.

A partir del resultado del tamizado, se seleccionaron 20 clones de hibridoma que exhibían una fuerte afinidad con PcrV recombinante, y la actividad inhibidora de citotoxicidad por Pseudomonas aeruginosa se examinó de acuerdo con el Ejemplo de referencia 5. Como resultado, la actividad inhibidora de citotoxicidad se observó en 10 clones, y estos clones fueron luego clonados dos veces por el método de dilución limitante, y de este modo se seleccionaron células de hibridoma. De los 10 clones obtenidos, se seleccionaron 4 clones que exhibían una alta actividad de inhibición de citotoxicidad, y se denominaron 1F3, 2A4, 6F5 y 7A7, respectivamente. Para estos anticuerpos, la subclase de anticuerpo se determinó utilizando el kit ELISA de isotipado por anticuerpo monoclonal de ratón (disponible de BD Biosciences), y se encontró que era 1F3 era IgG2a, 2A4 era IgG2b, 6F5 era IgG2a, 7A7 era IgG2a.

Células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales 1F3 y 2A4 se depositaron en el Instituto Nacional de Ciencia Industrial Avanzada y Tecnología, International Patent Organism Depositary (Center Nº 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, IBARAGI, JAPÓN) el 15 de enero de 2009, bajo los números de acceso de FERM ABP-11805 y FERM ABP-11806, respectivamente.

Ejemplo de referencia 3

Actividad de unión del anticuerpo

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Para medir la actividad de unión de anticuerpos (1F3, 2A4, 6F5, 7A7) se realizó un inmunoensayo competitivo. A cada uno de los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos (disponible de Nunc) se añadieron 100 µl de tampón de tris (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) que contienen 1,5 µg de anticuerpo Fc anti-ratón (disponible de Jackson ImmunoResearch) y se inmovilizan durante 16 horas a 4°C. Estos pocillos se lavaron dos veces con 300 µl de disolución de lavado, a continuación se añadieron 300 µl de BlockAce (disponible de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) que incluye sacarosa al 10% y se dejaron durante dos horas a temperatura ambiente para lograr el bloqueo (placa en fase sólida de anticuerpo IgG anti-ratón). Después de lavar dos veces con 300 µl de disolución de lavado, se añadieron 2 ng/pocillo de cada uno de anticuerpo y PcrV no marcada a cinco concentraciones en series de dilución de 10 veces a partir de 500 ng/pocillo. Después, se añadieron 5 ng/pocillo de PcrV biotinilada y se dejó reaccionar durante una noche. Después de lavar cuatro veces con 300 µl de líquido de lavado y de añadir 100 µl/pocillo de Reactivo de Potenciación (disponible de Wallac), la fluorescencia de resolución temporal se midió después de agitar durante 1 minuto. Como resultado, 1F3, 2A4, 7A7 y 6F5 mostraron fuerte actividad de unión frente a PcrV que Mab166 (Fig. 1).

Seguidamente, se determinó la afinidad de 1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166 con PcrV mediante análisis de resonancia de plasmón superficial. Anticuerpo anti-ratón se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 utilizando el kit de captura de anticuerpos de ratón (disponible de BIACORE). Secuencialmente, se capturó cada uno de los anticuerpos de PcrV. La PcrV recombinante se cargó en el instrumento BIAcore T100 con el chip sensor para determinar la afinidad.

Como resultado, cada clon mostró mayor afinidad que Mab166, según se evidencia a partir de la afinidad de 3,7 × 10-10 para 1F3, la afinidad de 3,5 × 10-10 para 2A4, la afinidad de 1,1 × 10-10 para 6F5 y la afinidad de 1,1 × 10-9 para 7A7, en contraposición con la afinidad de 3,0 × 10-9 para Mab166 (Fig. 2).

Ejemplo de referencia 4

Inmunoensayo de sándwich con Mab166

Con el fin de demostrar que 1F3, 2A4, 6F5 y 7A7 tienen un epítopo diferente del de Mab166, se examinó inmunoensayo de tipo sándwich entre cada uno de los anticuerpos y Mab166.

En primer lugar, Mab166 se marcó con biotina. Cien µg de Mab166 y 7,853 µg de NHS-PEO4 Biotina (disponible de PIERCE) se mezclaron en PBS 0,1M (pH 7,4) y se dejó que reaccionara durante 2 horas en hielo. Después de ello, se llevó a cabo una cromatografía en gel (columna G2000SW (disponible de TOSOH)) para separar la biotina que no había reaccionado de la disolución de reacción.

El inmunoensayo de tipo sándwich se realizó como sigue. A cada uno de los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos (disponible de Nunc) se añadieron 100 µl de disolución de PBS (-) que contiene en cada caso 500 µg de anticuerpo de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7) y se inmovilizó durante 16 horas a 4°C. Estos pocillos se lavaron una vez con 300 µl de una disolución de lavado (solución salina que contiene Tween 20 al 0,01%), y luego se añadieron 300 µl de BlockAce (disponible de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) y se dejó durante dos horas a temperatura ambiente para lograr el bloqueo. Después de lavar cada uno de los pocillos dos veces con 300 µl de disolución de lavado, se añadieron 100 µl de tampón de ensayo (disponible de Wallac) que contiene 50 µg de PcrV y 50 ng de Mab166 marcado con biotina y se dejó que reaccionara durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con disolución de lavado, se añadieron 100 µl de tampón de ensayo que contenía 50 ng de estreptavidina marcada con Eu (disponible de Wallac), y se dejó que reaccionara durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con disolución de lavado y de añadir 100 µl de reactivo de potenciación, de agitar durante 1 minuto, y luego se midió la fluorescencia de resolución temporal.

Como resultado, el inmunoensayo de tipo sándwich era posible entre cualquiera de 1F3, 2A4, 6F5 y 7A7 y Mab166, de modo que se reveló que los presentes anticuerpos tenían epítopos diferentes del de Mab166 (Fig. 3).

Ejemplo de referencia 5

Medición de la actividad inhibidora de citotoxicidad

Para 1F3, 2A4, 6F5 y 7A7 se midió la actividad inhibidora de citotoxicidad. El método es el siguiente.

En primer lugar, 1F3, 2A4, 6F5, 7A7 se diluyeron en serie de dilución doble de 32 µg/ml, y se dispensaron 10 µl a cada uno de los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. A continuación, células de mieloma de ratón P3U1 (de ATCC) se ajustaron a 5 × 106 células/ml o la línea celular U937 de leucocitos humana U937 (de ATCC) se ajustó a 1 × 106 células/ml en un medio de cultivo celular (RPMI1640 que contiene hidrógeno-carbonato de sodio, y que no contiene L-glutamina y rojo fenol (disponible de Sigma)), y en cada caso se añadieron 100 µl de suspensión celular a

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la microplaca de 96 pocillos. Además, la cepa SR24 de Pseudomonas aeruginosa cultivada durante la noche en caldo de Mueller Hinton ajustado en cationes (Difco) se ajustó a 1 × 108 ufc/ml en un medio de cultivo celular, y se añadió en una cantidad de 10 µl/pocillo, y se cultivó durante 3 horas a 37°C en presencia de 5% de CO2. Después de agitar durante 3 horas, se añadieron en cada caso 10 µl de WST-8 (disponible de Kishida Chemical Co., Ltd.) y se cultivaron a 37°C en presencia de 5% de CO2 durante 3 horas para el caso de células de mieloma P3U1, o durante 1 hora para el caso de células U937. Después de la compleción del cultivo, la absorbancia se midió a 450 nm.

Como resultado, cuando se utilizaron células U937 de leucocitos, la actividad inhibidora de citotoxicidad (CI50) era de 5,3 nM para 1F3, de 20,7 nM para 2A4, de 12,7 nM para 6F5 y de 14,7 nM para 7A7, en contraposición con más de 213 nM para Mab166, y cuando se utilizaron células de mieloma U3P1, la actividad inhibidora de citotoxicidad (CI50) era de 4,0 nM para 1F3, de 16 nM para 2A4, de 7,3 nM para 6F5 y de 6,0 nM para 7A7 en contraposición con 54 nM para Mab166. Es decir, 1F3, 2A4, 6F5 y 7A7 tenían mayor actividad inhibidora de citotoxicidad para ambas células que Mab 166 que se ha descrito previamente (Frank et al., The Journal of Infectious Diseases, 2002, vol. 186, pág. 66) (Fig. 4 y Fig. 5).

Ejemplo de referencia 6

Preparación de PcrV truncada

PcrV truncada (136-233) se preparó de la siguiente manera.

Un fragmento amplificado por PCR con cebador en el lado 5' GCTCGAGGATCCCAAGGCGCTGACCGC (SEQ ID NO: 5) y cebador en el lado 3’ GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC (SEQ ID NO: 6) utilizando pQE30-PcrV que es un plásmido de expresión de proteína del antígeno de PcrV como molde se trató con enzimas de restricción BamHI y HindIII, y se insertó en pET32b (disponible de Novagen). Después de la secuenciación, el vector se introdujo en la cepa BL21-DE3 de E. coli para obtener E. coli recombinante (PcrV-BL21 truncada). Esta cepa de expresión se precultivó durante todo un día y la noche a 37°C en 2 ml de medio de cultivo líquido de LB/ampicilina. Dos ml de líquido de pre-cultivo se añadieron a 500 ml de medio de cultivo líquido de LB/ampicilina y se cultivaron a 37°C, y cuando la DO600 alcanzó 0,5, el líquido de cultivo se mantuvo todavía durante 30 minutos en hielo. Se añadió IPTG a una concentración final de 0,75 mM, y se cultivaron a 160 rpm en una incubadora con agitador rotatorio a 15°C durante todo un día y la noche. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación del líquido de cultivo a 4°C, × 5000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se separó, y al sedimento se añadieron 10 ml de Tampón X (Tris-HCl 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM) que contenía lisozima al 0,1% (disponible de Sigma), y se suspendió, se dejó todavía en hielo durante 1 hora y, a continuación, se sometió a ultrasonidos bajo enfriamiento en hielo. A continuación, una fracción soluble se aplicó a una columna de Ni-NTA rellena de agarosa (Quiagen), y se eluyó con Tampón Y (Tris-HCl 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, imidazol 200 mM). La fracción eluida se dializó con tampón fosfato 10 mM (pH 7,4).

Determinación de la región de epítopo

A cada uno de los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos (disponible de Nunc) se añadieron 150 µl de tampón tris (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) que contenía 1,5 µg de anticuerpo Fc IgG anti-ratón (disponible de Jackson ImmunoResearch) y se inmovilizó durante 16 horas a 4°C. Estos pocillos se lavaron dos veces con 300 µl de una disolución de lavado (solución salina que contiene Tween 20 al 0,01%), a continuación se añadieron 300 µl de disolución de bloqueo (Tris-HCl 500 mM pH 7,5, BlockAce al 2% (disponible de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.), 10% de sacarosa) y se dejaron durante dos horas a temperatura ambiente para bloquear a cada uno de los pocillos (placa inmovilizada con anticuerpo IgG anti-ratón). Después de lavar cada uno de los pocillos pocillo una vez con 300 µl de líquido de lavado, a cada uno de los pocillos se añadieron 50 µl de solución de anticuerpo de PcrV diluido en una concentración de 80 ng/ml con Tampón C (tampón tris 50 mM que contenía cloruro sódico al 0,9%, azida de sodio al 0,05%, albúmina de suero bovino al 0,5%, Tween 80 al 0,01% y 25 µM de ácido dietilentriaminaN,N,N',N",N"-penta-acético, pH 7,6), seguido de 50 µl de disolución de estreptavidina marcada con Eu (disponible de PERKIN ELMER) diluida en una concentración de 200 ng/ml con tampón C, 100 µl de proteína PcrV truncada diluida en una concentración dada con tampón de ensayo DELFIA y se dejó que reaccionara a 4°C durante la noche. Después de lavar tres veces con 300 µl de disolución de lavado, se añadieron 200 µl de un reactivo de potenciación (1,39 g/l de ftalato de potasio, 19.3mg/l de óxido de tri-n-octilfosfina, 4,59 mg/l de 2-naftioiltrifluoroacetona, 1,0 g/l de Triton X100, 6,0 g/l de ácido acético), y se midió la fluorescencia de resolución temporal (Fig. 6).

Como resultado, los anticuerpos de PcrV 1F3, 2A4, 9D12, 12H9 y m166 de KaloBios Pharmaceuticals, Inc. utilizados como un ejemplo de referencia, exhibían reactividad con PcrV de longitud completa (1-294). Por otro lado, mientras que 1F3 y 2A4 mostraron reactividad con PcrV (136-233), m166, así como 9D12 y 12H9 que carecen de actividad neutralizante, no mostraron reactividad.

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También se realizó el análisis de unión por transferencia Western. Proteína PcrV purificada recombinante se aplicó a SDS-PAGE, y luego se transfirió a una membrana de PVDF. La membrana transferida se bloqueó con Block Ace (disponible de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a temperatura ambiente durante 2 horas bajo agitación. Disolución de anticuerpo de PcrV diluida en 1 µg/mL se añadió a la membrana, se dejó que reaccionara durante la noche a 4°C, y después se lavó con tampón de lavado B (tampón fosfato 10 mM (pH 7,4), Tween 20 al 0,05%). Como anticuerpo secundario se añadió a la membrana, anticuerpo IgG anti-ratón marcado (disponible de GE Healthcare), y se dejó que reaccionara durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de ello, la membrana se lavó con tampón de lavado B, y la señal se detectó mediante el sistema ECL Plus Western Blot Detection System (disponible de GE Healthcare) y se visualizó mediante LAS-1000 (disponible de FUJIFILM) (Fig. 7). Mientras que los anticuerpos de neutralización de PcrV 1F3 y 2A4 reaccionaban tanto con PcrV de longitud completa y como con PcrV truncada, m166, así como 9D12 y 12H9 reaccionaban sólo con PcrV de longitud completa, y no reaccionaban con PcrV truncada.

Esto demostró que la región de epítopo de anticuerpos de neutralización de PcrV 1F3 y 2A4 era una región correspondiente a los residuos de aminoácidos 136-233, y m166, 9D12 y 12H9 no tienen exclusivamente una región de epítopo correspondiente a los residuos aminoácidos 136-233.

Ejemplo de referencia 7

Correlación entre la región específica de la proteína PcrV y la fuerza de la citotoxicidad

Utilizando la proteína PcrV de longitud completa (SEQ ID NO: 1) y la proteína PcrV truncada (que tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 136 a 233 en SEQ ID NO: 1), el ensayo de supresión de la actividad inhibidora de citotoxicidad en 1F3, 2A4 y m166 se llevó a cabo de la siguiente manera.

En primer lugar, 1F3, 2A4 y m166 se diluyeron mediante dilución doble en serie partiendo de 200 nM, 200 nM y 400 nM, respectivamente, y 10 µl de estos anticuerpos se añadieron a la placa de 96 pocillos. En este ensayo, el intervalo de concentración de ensayo de 1F3, 2A4 y m166 se ajustó a 1,56-6,25 nM, 6,25-25 nM y 50-200 nM, respectivamente. Para cada uno de los intervalos de concentración de ensayo, en cada caso 10 µl de proteína PcrV de longitud completa o proteína PcrV truncada se añadieron en relaciones molares de 30, 10, 3, 1 y 0,3 veces a la placa de 96 pocillos, y se dejaron reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se prepararon células de mieloma P3U1 en 5 × 106 células/ml en medio de cultivo celular (RPMI1640 que contiene hidrógeno-carbonato de sodio, y que no contenía L glutamina ni rojo fenol (disponible de Sigma)), y en cada caso 70 µl se añadieron a la microplaca de 96 pocillos. Además, un líquido bacteriano de la cepa SR24 de Pseudomonas aeruginosa, cultivado durante la noche en caldo de Mueller Hinton (Difco) ajustado a 1 × 108 ufc/mL con un medio de cultivo celular se añadió en una cantidad de 10 µl/pocillo, y se cultivó durante 3 horas a 37°C en presencia de 5% de CO2. Después de un lapso de 3 horas, se añadieron en cada caso 10 µl de WST-8 (disponible de Kishida Chemical Co., Ltd.), y se cultivaron a 37°C en presencia de 5% de CO2 durante 3 horas. Después de la compleción del cultivo, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm.

Como resultado, cuando no se añadió proteína PcrV, 1F3 y 2A4 exhibían mayor actividad inhibidora de citotoxicidad que m166. Por otro lado, cuando se añadió proteína PcrV de longitud completa, los efectos de inhibición de todos los anticuerpos anti-PcrV fueron suprimidos de una manera dependiente de la dosis de PcrV (Fig. 8). Cuando se añadió proteína PcrV truncada, aunque las actividades inhibidoras de 1F3 y 2A4 también fueron suprimidas de una manera dependiente de la dosis, la actividad inhibidora de m166, que no tiene el epítopo, no cambió (Fig. 9).

A partir de estos resultados, se puede considerar que anticuerpos que reconocen un epítopo en los residuos aminoácidos 136-233 (1F3 y 2A4) tienen una mayor actividad inhibidora de citotoxicidad que los anticuerpos que no reconocen el epítopo (m166). En otras palabras, se puede concluir que la actividad inhibidora de citotoxicidad depende de la región del epítopo reconocida por el anticuerpo de PcrV, y el anticuerpo que reacciona solamente con la región 136-233 de la proteína PcrV tiene una fuerte actividad neutralizante.

Ejemplo de referencia 8

Análisis de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal de ratón contra PcrV humana (1F3 y 2A4)

A partir de las células de hibridoma establecidas, el ARN se extrajo utilizando el Mini Kit RNeasy (disponible de QIAGEN). A partir de 1 µg de ARN extraído, el fragmento de ADN se amplificó utilizando el Sistema 5'RACE para la Amplificación Rápida de extremos de ADNc, Versión 2.0 (disponible de Invitrogen). En este momento, los cebadores utilizados para la síntesis de ADNc eran TAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTGT (SEQ ID NO: 7) para 1F3 y TCCAGAGTTCCAAGTCACAGTCAC (SEQ ID NO: 8) para 2A4. Los cebadores utilizados en el método 5 'RACE eran AGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGT (SEQ ID NO: 9) para 1F3 y

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AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGT (SEQ ID NO: 10) para 2A4. Los fragmentos amplificados se clonaron mediante el Kit de Clonación TOPO TA (disponible de Invitrogen), y se secuenciaron mediante el Analizador Genético Applied Biosystems 3130 (disponible de Applied Biosystems). El resultado del análisis se muestra en la Fig. 10 para 1F3 y en la Fig. 11 para 2A4. Como resultado del rastreo de homología de la secuencia de aminoácidos de una región variable utilizando la base de datos de aminoácidos del anticuerpo, la Secuencia de Proteínas de Interés Inmunológico (Depto. de EE.UU. de Salud y Servicios Humanos, 1983) producido por Kabat, la región determinante de complementariedad en la región variable pesada de 1F3 es SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15), INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) e YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17): aquella en la región variable ligera es SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18), TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) y HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20). Como resultado del rastreo de una manera similar, la región determinante de complementariedad en la región variable pesada de 2A4 es SITSDYAWN (SEQ ID NO: 21), YITYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 22) y SRNYYGAWFAY (SEQ ID NO: 23): aquella en la región variable ligera es KASQYVGTTVA (SEQ ID NO: 24), RASTRHT (SEQ ID NO: 25) y QQYCSSPLT (SEQ ID NO: 26).

La presente invención se explicará concretamente por medio de los siguientes Ejemplos no limitativos.

Como una técnica de preparación de anticuerpo, se utilizaron métodos descritos en Inmunoquímica en la práctica (Blackwell Scientific Publications) a menos que se especifique lo contrario.

Como una técnica de ingeniería genética, métodos descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory) se usaron a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplo 1

(1) Humanización del anticuerpo monoclonal de ratón 1F3

Para la humanización del anticuerpo monoclonal de ratón (1F3), preparado como se describe arriba, CDRs de un anticuerpo de ratón se injertaron en las secuencias aceptoras de línea germinal humana.

Específicamente, se utilizó el programa IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) para rastrear una secuencia aceptora de la línea germinal humana que muestra la mayor homología con la secuencia de aminoácidos de la región V del gen de cada una de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de ratón. Para la región J del gen, se seleccionó a partir de IMGT (http://imgt.cines.fr/) una secuencia altamente homóloga a la secuencia de ADN del anticuerpo de ratón.

Como resultado del rastreo, el nombre de gen de IMGT; IGHV1-46*01 se obtuvo como la secuencia del gen de anticuerpo que se deriva de una secuencia aceptora de la línea germinal humana y muestra la mayor homología con la región V del gen de la cadena pesada del anticuerpo de ratón, y el nombre de gen de IMGT; IGHJ6*01 como la secuencia de gen de anticuerpo que se deriva de una secuencia aceptora de la línea germinal humana y muestra la mayor homología con la región J del gen; estas secuencias se utilizaron como la secuencia de marco humana para injertar la cadena pesada. De una manera similar, el nombre de gen de IMGT; IGKV1-9*01 se obtuvo como la secuencia del gen de anticuerpo que se deriva de una secuencia aceptora de la línea germinal humana y muestra la mayor homología con la región V del gen de la cadena ligera del anticuerpo de ratón, y el nombre del gen de IMGT; IGKJ2*02 como la secuencia de gen de anticuerpo que se deriva de una secuencia aceptora de la línea germinal humana y muestra la mayor homología con la región J del gen; estas secuencias se utilizaron como la secuencia de marco humana para injertar la cadena ligera.

Subsiguientemente, las cadenas pesadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3, y las cadenas ligeras CDRL1, CDRL2 y CDRL3 del anticuerpo de ratón se definieron por la numeración de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Numeración de Kabat (Wu, T.T. y Kabat, E.A., J. Exp. Med. Ago1; 132 (2): 211-50. (1970)). Estas regiones CDR se injertaron en las secuencias de marco humanas, que luego fueron diseñadas como un anticuerpo humanizado molde. La diferencia entre el anticuerpo humanizado molde así diseñado y la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de ratón se confirmó en el número de secuencia de aminoácidos

H5, H7, H11, H12, H20, H38, H40, H48, H66, H67, H69, H71, H75 , H78, H81, H83, H87, H93, H94, H108, L1, L3, L9, L10, L11, L15, L17, L18, L19, L21, L40, L42, L43, L46, L70, L71, L72, L78, L79, L80, L83, L85 y L100 de acuerdo con la numeración de Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196:901-917, Chothia, C. et al., Nature, 342:877-883. (1989)).

Para identificar los sitios de mutación somática en el anticuerpo de ratón, se rastreó la secuencia de aminoácidos de la región V del gen de cada una de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de ratón utilizando IgBLAST y, como resultado, se obtuvieron el nombre de Gen; J558.33 y el nombre de Gen; IGKV4-80*01 como las secuencias de

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El valor KD del anticuerpo quimérico de ratón-ser humano, obtenido mediante el análisis de afinidad, era 2,6 × 10-10

M. El valor KD del anticuerpo, incluidas las cadenas pesada y ligera del anticuerpo humanizado molde era 2,2 × 10-7 M; y el del anticuerpo que incluye la cadena pesada del anticuerpo humanizado molde y la cadena ligera del anticuerpo humanizado mutante era 6,5 × 10-7 M, confirmando que la afinidad se redujo significativamente. En contraposición, el valor KD del anticuerpo, incluida la cadena pesada del anticuerpo humanizado mutante y la cadena ligera del anticuerpo humanizado molde, era 3,3 × 10-10 M, y la del anticuerpo, incluidas las cadenas pesada y ligera del anticuerpo humanizado mutante, era 3,4 × 10-10 M, lo que indica que estos anticuerpos retienen la afinidad próxima a la del anticuerpo quimérico de ratón-ser humano. A partir de estos resultados, los autores de la invención concluyeron que la cadena pesada del anticuerpo humanizado mutante es crítica para la retención de la afinidad y que la cadena ligera del anticuerpo humanizado molde o el anticuerpo humanizado mutante se puede utilizar sin alterar la afinidad. Por lo tanto, para la cadena ligera, los autores de la invención seleccionaron la cadena ligera del anticuerpo humanizado molde, que está más estrechamente relacionada con la secuencia derivada de la línea germinal humana. Para la cadena pesada, se preparó un anticuerpo humanizado en el que cada una de las retromutaciones de las cadenas laterales de aminoácidos en H48, H67, H69, H71, H78, H93 y H94 revirtieron a las de la secuencia derivada de la línea germinal humana, respectivamente, y la afinidad con el antígeno se evaluó mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (Fig. 14). Como resultado, el anticuerpo humanizado en el que Val en H93 está reemplazado por Ala mostró el valor KD de 1,0 × 10-9 M, y el anticuerpo humanizado en el que Leu en H94 está reemplazado por Arg mostró el valor KD de 3,2 × 10-7 M. A pesar de que estos anticuerpos mostraron una afinidad reducida, no se observó reducción significativa alguna en la afinidad en los otros anticuerpos humanizados retro-mutados a los de la secuencia derivada de la línea germinal humana.

Estos resultados han verificado la secuencia del anticuerpo humanizado utilizando la secuencia derivada de anticuerpo de ratón para H93 y H94, y la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana para H48, H67, H69, H71 y H78 (Figs. 15 y 16). Un anticuerpo que tiene esta secuencia se preparó de acuerdo con el método descrito a continuación en (3), y su afinidad se confirmó mediante análisis de resonancia de plasmón superficial. Como resultado, se ha confirmado que este anticuerpo tiene la misma afinidad que el anticuerpo de ratón (Fig. 17).

(3) Preparación de anticuerpo recombinante

Los genes de las cadenas pesada y ligera, preparados como el método arriba descrito, se transfectaron en células HEK293F utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen). Después de 72 horas, se recogió el sobrenadante celular. El anticuerpo recombinante se purificó mediante columna de afinidad de Proteína G (PIERCE) a partir del sobrenadante celular recogido.

Ejemplo 2

Un ensayo de actividad inhibidora citotóxica se realizó en m1F3 (anticuerpo de ratón), h1F3 (anticuerpo humanizado) y m166. El método es el siguiente:

Inicialmente, m1F3, h1F3 y m166 se diluyeron mediante dilución doble en serie partiendo con 200 nM, 200 nM y 800 nM, respectivamente. Cada una de las diluciones (10 µl) se dispensó en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. A continuación, las células de mieloma U3P1 o células U937 se prepararon a una densidad celular de 5 x 106 ó 1 × 106 células/ml, respectivamente, mediante el uso de un medio de cultivo celular (PRMI1640 (producido por Sigma Corporation), que contiene hidrógeno-carbonato de sodio y que no contiene L-glutamina ni rojo de fenol) y en cada caso 70 µl de la suspensión se añadieron a la microplaca de 96 pocillos. Subsiguientemente, la cepa SR24 de Pseudomonas aeruginosa, cultivada durante la noche en Caldo de Mueller Hinton Broth (Difco) ajustado en cationes se preparó en la densidad celular de 1 × 108 ufc/ml en el medio de cultivo celular, se añadió al pocillo en una cantidad de 10 µl/pocillo, y se cultivó durante 3 horas a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2.Tres horas más tarde, se añadieron en cada caso 10 µl de WST-8 (producido por Kishida Chemical Co., Ltd.), y se continuó el cultivo durante 1 hora a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2. Después de haberse completado el cultivo, se determinó la absorbancia en la longitud de onda de 450 nm. Los resultados demostraron que la actividad citotóxica (CI50) de m166 era 98,4 nM, mientras que m1F3 y h1F3 mostraron 1,4 nM y 1,5 nM, respectivamente, cuando se utilizaron células U937 (Fig. 18), y m166 mostró 85,4 nM, mientras que m1F3 y h1F3 mostraron 1,5 nM y 1,3 nM, respectivamente, cuando se utilizaron las células de mieloma (Fig. 19). Por lo tanto, las actividades inhibidoras citotóxicas de m1F3 y h1F3 eran casi las mismas, y mostraron mayor actividad que m166.

Aplicabilidad industrial

El anticuerpo monoclonal humanizado de la presente invención o una parte del mismo no sólo tenía una alta afinidad con PcrV, sino que también exhibía una fuerte actividad inhibidora sobre la citotoxicidad a células eucariotas de Pseudomonas aeruginosa. Por lo tanto, la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo monoclonal o una

Claims (1)

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