ES2432013T3 - Composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de la infección por Streptococcus Pyogenes - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende: (a) un polipéptido seleccionado de (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos almenos un 95% idéntica con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2; y (ii) un polipéptidoque comprende un fragmento polipeptídico inmunógeno constituido por al menos aminoácidoscontiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2, siendo el polipéptido capaz de aumentar los anticuerpos que se unen específicamente a una proteínaconstituida por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2 y siendo el polipéptido capaz deprovocar una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pyogenes, y (b) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, siendo la composición farmacéutica para usar en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección porStreptococcus pyogenes.
Description
Composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de la infección por Streptococcus Pyogenes
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los polipéptidos SHB-GAS-102, SHB-GAS-103 y SHB-GAS-104 de S. pyogenes (Streptococcus del grupo A) y a los correspondientes fragmentos de ADN, que pueden usarse para prevenir, diagnosticar y/o tratar infecciones por S. pyogenes.
Antecedentes de la invención
Los estreptococos son bacterias Gram (+) que se diferencian por los antígenos carbohidratos específicos de grupos A a O que se encuentran en la superficie celular. Los aislados de S. pyogenes se distinguen además por los antígenos de proteína M de tipo específico. Las proteínas M son factores de virulencia importantes que son muy variables tanto en pesos moleculares como en secuencias. De hecho, se han identificado más de 100 tipos de proteína M basándose en las diferencias antigénicas.
El S. pyogenes es responsable de muchos tipos de infecciones, incluyendo faringitis, erisipela e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como bacteriemia y fascitis necrotizante. En los últimos años se ha documentado en muchos países un resurgimiento de la enfermedad invasiva, incluyendo en los de América del Norte y Europa. Aunque el organismo es sensible a antibióticos, la alta tasa de ataques y la rápida aparición de septicemias dan como resultado una alta morbosidad y mortalidad.
Para desarrollar una vacuna que proteja a los huéspedes frente a la infección por S. pyogenes, los esfuerzos se han centrado en factores de virulencia tales como las proteínas M de tipo específico. Sin embargo, se ha encontrado que la parte carboxi terminal de las proteínas M induce anticuerpos de reactividad cruzada que reaccionan con miocardio, tropomiosina, miosina y vimentina humanos, lo cual puede estar implicado en enfermedades autoinmunitarias. Otros han usado técnicas recombinantes para producir proteínas híbridas complejas que contengan péptidos aminoterminales de las proteínas M de diferentes serotipos. Sin embargo, sería muy complejo producir y estandarizar una vacuna segura que contenga serotipos de S. pyogenes.
Además de los antígenos específicos de serotipo, otras proteínas de S. pyogenes han generado interés como potenciales candidatos para vacunas. Se ha mostrado que la peptidasa C5a, que es expresada por al menos 40 serotipos de S. pyogenes es inmunógena en ratones, pero su capacidad para reducir el nivel de colonización nasofaríngea estaba limitada. Otros investigadores también se han centrado en las exotoxinas pirógenas estreptocócicas que parece que tienen una función importante en la patogénesis de la infección. La inmunización con estas proteínas prevenía los síntomas letales del choque tóxico, pero no prevenía la colonización.
En el documento WO 2002/034771 se describen ácidos nucleicos y proteínas de estreptococos de los grupos A y B.
Por tanto, existe una necesidad no satisfecha de polipéptidos de S. pyogenes que se puedan usar como componentes de vacuna para la profilaxis y/o terapia de la infección por S. pyogenes.
Sumario de la invención
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, usos de la misma y procedimientos como se define en las reivindicaciones.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2 (Fig. 2), 4 (Fig. 4), 6(Fig. 6), 22(Fig. 8), 24(Fig. 10), 26(Fig. 12), 28 (Fig. 14), 30(Fig. 16), 32 (Fig. 18), 34 (Fig. 20), 36 (Fig. 22), 38 (Fig. 24), 40 (Fig. 26), 42 (Fig. 28), 44 (Fig. 30) o fragmentos o análogos del mismo.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación se refiere a polipéptidos que comprenden la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo.
En otros aspectos se dan a conocer polipéptidos codificados por polinucleótidos de la divulgación, composiciones farmacéuticas, vectores que comprenden polinucleótidos de la divulgación unidos operativamente a una región de control de la expresión, así como células huésped transfectadas con dichos vectores y procedimientos para producir polipéptidos que comprenden cultivar dichas células huésped en condiciones adecuadas para la expresión.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-102 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; SEC ID Nº: 1. La Figura 2 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido SHB-GAS-102 del serotipo M1 de la cepa 2
de S. pyogenes ATCC700294; SEC ID Nº: 2.
La Figura 3 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-103 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; SEC ID Nº: 3. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 4 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido SHB-GAS-103 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; SEC ID Nº: 4. La secuencia subrayada representa los 27 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 5 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-104 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; SEC ID Nº: 5. La secuencia subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 6 representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido SHB-GAS-104 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; SEC ID Nº: 6. La secuencia subrayada representa los 19 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 7 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-102 del serotipo M13 de la cepa de S. pyogenes MGAS315; SEC ID Nº: 21.
La Figura 8 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-102 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes MGAS315; SEC ID Nº: 22.
La Figura 9 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-102 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes SSI-1; SEC ID Nº: 23.
La Figura 10 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-102 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes SSI-1; SEC ID Nº: 24.
La Figura 11 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-102 del serotipo M5 de la cepa de S. pyogenes Manfredo; SEC ID Nº: 25.
La Figura 12 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-102 del serotipo M5 de la cepa de S. pyogenes Manfredo; SEC ID Nº: 26.
La Figura 13 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-102 del serotipo M18 de la cepa de S. pyogenes MGAS8232; SEC ID Nº: 27.
La Figura 14 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-102 del serotipo M18 de la cepa de S. pyogenes MGAS8232; SEC ID Nº: 28.
La Figura 15 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-103 del serotipo M13 de la cepa de S. pyogenes MGAS315; SEC ID Nº: 29. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 16 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-103 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes MGAS315; SEC ID Nº: 30. La secuencia subrayada representa los 27 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 17 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-103 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes SSI-1; SEC ID Nº: 31. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 18 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-103 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes SSI-1; SEC ID Nº: 32. La secuencia subrayada representa los 27 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 19 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-103 del serotipo M5 de la cepa de S. pyogenes Manfredo; SEC ID Nº: 33. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 20 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-103 del serotipo M5 de la cepa de S. pyogenes Manfredo; SEC ID Nº: 34. La secuencia subrayada representa los 27 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 21 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-103 del serotipo M18 de la cepa de S. pyogenes MGAS8232; SEC ID Nº: 35. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 22 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-103 del serotipo M18 de la cepa de S. pyogenes MGAS8232; SEC ID Nº: 36. La secuencia subrayada representa los 27 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 23 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-104 del serotipo M13 de la cepa de S. pyogenes MGAS315; SEC ID Nº: 37. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 24 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-104 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes MGAS315; SEC ID Nº: 38. La secuencia subrayada representa los 19 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 25 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-104 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes SSI-1; SEC ID Nº: 39. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 26 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-104 del serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes SSI-1; SEC ID Nº: 40. La secuencia subrayada representa los 19 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 27 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-104 del serotipo M5 de la cepa de S. pyogenes Manfredo; SEC ID Nº: 41. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 28 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-104 del serotipo M5 de la cepa de S. pyogenes Manfredo; SEC ID Nº: 42. La secuencia subrayada representa los 19 residuos de aminoácidos del péptido líder.
La Figura 29 representa la secuencia de ADN del gen SHB-GAS-104 del serotipo M18 de la cepa de S. pyogenes MGAS8232; SEC ID Nº: 43. La porción subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder.
La Figura 30 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SHB-GAS-104 del serotipo M18 de la cepa de S. pyogenes MGAS8232; SEC ID Nº: 44. La secuencia subrayada representa los 19 residuos de aminoácidos del péptido líder.
la Figura 31 representa la comparación de las secuencias de nucleótidos de los genes SHB-GAS-102 de las cepas de S. pyogenes serotipo M1 ATCC700294 (SEC ID Nº: 1), serotipo M3 MGAS315 (SEC ID Nº: 21), serotipo M3 SSI-1 (SEC ID Nº: 23), serotipo M5 Manfredo (SEC ID Nº: 25) y serotipo M18 MGAS8232 (SEC ID Nº: 27) usando el programa Clustal W de software de análisis de secuencia NTI.
la Figura 32 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos previstas de los marcos de lectura abiertos de SHB-GAS-102 de las cepas de S. pyogenes serotipo M1 ATCC700294 (SEC ID Nº: 2), serotipo M3 MGAS315 (SEC ID Nº: 22), serotipo M3 SSI-1 (SEC ID Nº: 24), serotipo M5 Manfredo (SEC ID Nº: 26) y serotipo M18 MGAS8232 (SEC ID Nº: 28) usando el programa Clustal W de software de análisis de secuencia NTI.
la Figura 33 representa la comparación de las secuencias de nucleótidos de los genes SHB-GAS-103 de las cepas de S. pyogenes serotipo M1 ATCC700294 (SEC ID Nº: 3), serotipo M3 MGAS315 (SEC ID Nº: 29), serotipo M3 SSI-1 (SEC ID Nº: 31), serotipo M5 Manfredo (SEC ID Nº: 33) y serotipo M18 MGAS8232 (SEC ID Nº: 35) usando el programa Clustal W de software de análisis de secuencia NTI.
la Figura 34 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos previstas de los marcos de lectura abiertos de SHB-GAS-103 de las cepas de S. pyogenes serotipo M1 ATCC700294 (SEC ID Nº: 4), serotipo M3 MGAS315 (SEC ID Nº: 30), serotipo M3 SSI-1 (SEC ID Nº: 32), serotipo M5 Manfredo (SEC ID Nº: 34) y serotipo M18 MGAS8232 (SEC ID Nº: 36) usando el programa Clustal W de software de análisis de secuencia NTI.
la Figura 35 representa la comparación de las secuencias de nucleótidos de los genes SHB-GAS-104 de las cepas de S. pyogenes serotipo M1 ATCC700294 (SEC ID Nº: 5), serotipo M3 MGAS315 (SEC ID Nº: 37), serotipo M3 SSI-1 (SEC ID Nº: 39), serotipo M5 Manfredo (SEC ID Nº: 41) y serotipo M18 MGAS8232 (SEC ID Nº: 13) usando el programa Clustal W de software de análisis de secuencia NTI.
la Figura 36 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos previstas de los marcos de lectura abiertos de SHB-GAS-104 de las cepas de S. pyogenes serotipo M1 ATCC700294 (SEC ID Nº: 6), serotipo M3 MGAS315 (SEC ID Nº: 38), serotipo M3 SSI-1 (SEC ID Nº: 40), serotipo M5 Manfredo (SEC ID Nº: 42) y serotipo M18 MGAS8232 (SEC ID Nº: 44) usando el programa Clustal W de software de análisis de secuencia NTI.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona polinucleótidos purificados y aislados que codifican polipéptidos de S. pyogenes que se pueden usar para prevenir, diagnosticar y/o tratar la infección producida por S. pyogenes.
En el presente documento se divulgan: un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 70% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 80% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 90% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 95% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 98% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo; y
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 99% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo.
En el presente documento también se divulgan: un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 70% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44;
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 80% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44;
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 90% con un segundo polipéptido que comprende las SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44;
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 95% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44;
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 98% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44; y
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 99% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación se refiere a polipéptidos que comprenden la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación se refiere a polipéptidos que comprenden la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44.
En la presente memoria descriptiva también se describen: un polinucleótido que codifica un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
un polinucleótido que codifica un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo; y
un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44.
La presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido escogido de:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 95% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 98% con la SEC ID 5
Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (c)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 99% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (d)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (e)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de aumentar los anticuerpos que tienen una especificidad de unión por un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (f)
- un polinucleótido que codifica un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (g)
- un polinucleótido que comprende la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 o fragmentos o análogos del mismo;
(h) un polinucleótido que es complementario de un polinucleótido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f). La presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido escogido de:
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 95% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 98% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (c)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 99% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (d)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (e)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de aumentar los anticuerpos que tienen una especificidad de unión por un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (f)
- un polinucleótido que codifica un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (g)
- un polinucleótido que comprende la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43;
- (h)
- un polinucleótido que es complementario de un polinucleótido en (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
La presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado constituido esencialmente por un polinucleótido escogido de:
a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 95% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 98% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 99% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
e) un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de producir anticuerpos que tienen una especificidad de unión por un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
f) un polinucleótido que codifica un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
g) un polinucleótido que tiene SEC ID Nº: 1, 3, 5, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 o fragmentos o análogos del mismo;
h) un polinucleótido que es complementario de un polinucleótido en (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
codificando dicho polinucleótido un polipéptido que es inmunogénico.
La presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado constituido esencialmente por un polinucleótido
escogido de:
a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 95% con la SEC ID
Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 98% con la SEC ID
Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 99% con la SEC ID
Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,
38, 40, 42 o 44;
e) un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de aumentar los anticuerpos que tienen una
especificidad de unión por un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40,
42 o 44;
f) un polinucleótido que codifica un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2,
4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
g) un polinucleótido que tiene la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 43;
h) un polinucleótido que es complementario de un polinucleótido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
codificando dicho polinucleótido un polipéptido que es inmunogénico.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación proporciona un polipéptido aislado que comprende un
polipéptido escogido de:
- (a)
- un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 95% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (b)
- un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 98% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
c) un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 99% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (d)
- un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (e)
- un polipéptido capaz de aumentar los anticuerpos que tienen una especificidad de unión por un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (f)
- un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
- (g)
- el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f), en el que el residuo Met en el extremo N se ha eliminado;
- (h)
- el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f), en el que la secuencia de aminoácidos secretores se ha eliminado.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación proporciona un polipéptido aislado que comprende un polipéptido escogido de:
- (a)
- un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 95% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (b)
- un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 98% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
c) un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 99% con la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (d)
- un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (e)
- un polipéptido capaz de aumentar los anticuerpos que tienen una especificidad de unión por un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (f)
- un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
- (g)
- el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que el residuo Met en el extremo N se ha eliminado,
- (h)
- el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que la secuencia de aminoácidos secretores se ha eliminado.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación proporciona un polipéptido aislado constituido esencialmente por un polipéptido escogido de:
a) un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos que tiene la SEC ID Nº 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
b) un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 98% con la secuencia de aminoácidos que tiene la SEC ID Nº 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
c) un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos que tiene la SEC ID Nº 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
d) un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
e) un polipéptido capaz de aumntar los anticuerpos que tienen una especificidad de unión por un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
f) un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
g) el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que el residuo Met en el extremo N se ha eliminado,
h) el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que la secuencia de aminoácidos secretores se ha eliminado.
siendo dicho polipéptido inmunogénico.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación proporciona un polipéptido aislado que comprende un polipéptido escogido de:
a) un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos que tiene la SEC ID Nº 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
b) un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 98% con la secuencia de aminoácidos que tiene la SEC ID Nº 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
c) un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos que tiene la SEC ID Nº 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
d) un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
e) un polipéptido capaz de producir anticuerpos que tienen una especificidad de unión por un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
f) un epítopo que lleva una porción de un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
g) el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que el residuo Met en el extremo N se ha eliminado,
h) el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que la secuencia de aminoácidos secretores se ha eliminado.
Los expertos en la técnica apreciarán que la divulgación incluye moléculas de ADN, es decir polinucleótidos y sus secuencias complementarias, que codifican análogos tales como mutantes, variantes, homólogos y derivados de tales polipéptidos, como se describe en la presente solicitud de patente. La divulgación también incluye moléculas de ARN correspondientes a las moléculas de ADN. La divulgación incluye los correspondientes polipéptidos y anticuerpos monoespecíficos que se unen específicamente a dichos polipéptidos.
De acuerdo con la presente divulgación, todos los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la presente divulgación entran dentro del alcance de la presente divulgación.
En un caso adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención son antigénicos, es decir pueden unirse específicamente a componentes de la respuesta inmunitaria, tal como anticuerpos y linfocitos.
En un caso adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente divulgación son inmunogénicos o pueden provocar una respuesta inmunitaria en un huésped.
En un caso adicional, la presente divulgación también se refiere a polipéptidos que son capaces de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión con los polipéptidos de la presente invención, como se ha definido antes.
Un anticuerpo que “posee especificidad de unión” es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido seleccionado pero que no reconoce sustancialmente y se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo una muestra biológica, que incluye de forma natural el péptido seleccionado. La unión específica se puede medir usando un ensayo ELISA en el que el polipéptido seleccionado se usa como antígeno.
En un caso adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente divulgación pueden provocar una respuesta de linfocitos B en un huésped.
En un caso adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente divulgación pueden provocar una respuesta de linfocitos T en un huésped.
De acuerdo con la presente invención, los polipéptidos de la divulgación también pueden ser eficaces cuando se administran a un huésped para protegerlo contra las bacterias. En los estudios biológicas “protección” se define por un incremento significativo en la curva, tasa o periodo de supervivencia. El análisis estadístico usando la prueba del orden logarítmico para comparar curvas de supervivencia y la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas de supervivencia y el número de días hasta la muerte, respectivamente, puede ser útil para calcular los valores P y determinar si la diferencia entre los dos grupos es estadísticamente significativa. Valores P superiores a 0,05 se consideran no significativos.
En un aspecto adicional se proporcionan fragmentos antigénicos/inmunogénicos de los polipéptidos de la divulgación o de análogos de los mismos.
La presente divulgación también se refiere a fragmentos que son específicos de o para la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44. Un fragmento específico contiene un orden definido de aminoácidos que se produce en un polipéptido diana y que es característico de dicho polipéptido diana, pero sustancialmente ningún otro polipéptido que no es diana. Dichos fragmentos polipeptídicos pueden ser de cualquier tamaño que sea necesario para conferir especificidad, por ejemplo que comprende o constituido por al menos o 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 aminoácidos, etc.
Fragmentos específicos también se pueden describir como específicos de Streptococcus pyogenes, lo que indica que se producen en dichas bacterias pero no en otros organismos, especialmente no en GBS ni otras bacterias.
Los fragmentos de la presente divulgación deberían incluir una o más de tales regiones epitópicas o ser suficientemente similares a dichas regiones para conservar sustancialmente sus propiedades antigénicas/inmunogénicas. Por tanto, para fragmentos de acuerdo con la presente invención el grado de identidad es, quizá, irrelevante, ya que pueden ser idénticos en un 100% a una parte concreta de un polipéptido o análogo del mismo como se describe en la presente memoria descriptiva.
La presente invención proporciona además fragmentos que tienen una secuencia menor que las que se describen en las figuras.
La presente invención además proporciona fragmentos que tienen al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de las secuencias polipeptídicas de la presente invención.
En una forma de realización, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 30 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 35 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 45 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 55 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 65 residuos de aminoácidos contiguos.
5 En una forma de realización, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 75 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 85 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos.
10 En una forma de realización, al menos 95 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 105 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 110 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 115 residuos de aminoácidos contiguos.
15 En una forma de realización, al menos 120 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 130 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 135 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 140 residuos de aminoácidos contiguos.
20 En una forma de realización, al menos 145 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 155 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 160 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 165 residuos de aminoácidos contiguos.
25 En una forma de realización, al menos 170 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 180 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 185 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 190 residuos de aminoácidos contiguos.
30 En una forma de realización, al menos 195 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 205 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 210 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 215 residuos de aminoácidos contiguos.
35 En una forma de realización, al menos 220 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 225 residuos de aminoácidos contiguos. En una forma de realización, al menos 230 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 235 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 240 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 245 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos.
5 En una forma de realización, al menos 255 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 260 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 265 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 270 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 275 residuos de aminoácidos contiguos.
10 En una forma de realización, al menos 280 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 285 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 290 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 295 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 300 residuos de aminoácidos contiguos.
15 En una forma de realización, al menos 305 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 310 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 315 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 320 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 325 residuos de aminoácidos contiguos.
20 En una forma de realización, al menos 330 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 335 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 340 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 345 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 350 residuos de aminoácidos contiguos.
25 En una forma de realización, al menos 355 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 360 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 365 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 370 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 375 residuos de aminoácidos contiguos.
30 En una forma de realización, al menos 380 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 385 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 390 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 395 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 400 residuos de aminoácidos contiguos.
35 En una forma de realización, al menos 405 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 410 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 415 residuos de aminoácidos contiguos.
En una forma de realización, al menos 420 residuos de aminoácidos contiguos.
Los fragmentos polipeptídicos divulgados en la presente pueden ser de cualquier tamaño compatible con la invención. Pueden tener un tamaño variable desde el epítopo específico más pequeño (p. ej., de aproximadamente 6 aminoácidos) a un producto génico de casi longitud completa (p. ej., un único aminoácido más corto que las SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44).
El experto apreciará que los análogos de los polipéptidos divulgados en el presente documento también serán útiles en el contexto de la presente invención, es decir como material antigénico/inmunogénico. Por tanto, por ejemplo, proteínas o polipéptidos que incluyen una o más adiciones, deleciones, sustituciones o similares están dentro de la presente invención, pueden usarse en la presente invención, en cuanto a que están abarcadas en las reivindicaciones adjuntas.
Como se usa en el presente documento, “fragmentos", “análogos” o “derivados” de los polipéptidos incluyen los polipéptidos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente conservado) y que puede ser natural o no natural.
Estas sustituciones son aquéllas que tienen una influencia mínima sobre la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Las sustituciones preferidas son las conocidas en la técnica como conservadas, es decir, los residuos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas, tales como hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales. Estas incluyen sustituciones tales como las descritas por Dayhoff, M. en Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978 y por Argos, P. en EMBO J. 8, 779-785, 1989. Por ejemplo, los aminoácidos, bien naturales o no naturales, pertenecientes a uno de los grupos siguientes representan cambios conservadores:
ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val;
cys, ser, tyr, thr;
val, ile, leu, met, ala, phe;
lys, arg, orn, his;
y phe, tyr, trp, his.
Las sustituciones preferidas también incluyen sustituciones de D-enantiómeros para los correspondientes Laminoácidos.
En un caso, las sustituciones de bases preferidas se encuentran donde hay menos homología de secuencia en las Figuras 31, 33 o 35.
En un caso, las sustituciones de aminoácidos preferidas se encuentran donde hay menos homología de secuencia en las Figuras 32, 34 o 36.
Los residuos de aminoácidos adicionales pueden proceder de una fuente heteróloga o pueden ser endógenos del gen natural.
En un abordaje alternativo, los análogos podrían ser polipéptidos de fusión que incorporen fracciones que hagan que la purificación sea más fácil mediante, por ejemplo, marcaje del polipéptido deseado. Puede ser necesario eliminar el “marcador” o puede ser el caso de que el polipéptido de fusión conserve la suficiente antigenicidad para ser útil.
El porcentaje de homología se define como la suma del porcentaje de identidad más el porcentaje de similitud o conservación de los tipos de aminoácidos.
En un caso, los análogos de polipéptidos de la invención tendrán una identidad de aproximadamente 70% con las secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de las mismas. Es decir, el 70% de los residuos son los mismos. En una realización, los polipéptidos para usar en la invención tendrán una identidad mayor del 95%. En otra forma de realización, los polipéptidos tendrán una identidad mayor del 98%. En otra forma de realización, los polipéptidos tendrán una identidad mayor del 99%. En otro caso, los análogos de los polipéptidos tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos de aminoácidos, y más preferentemente menos de 10.
En un caso, los análogos de polipéptidos tendrán una similitud de aproximadamente 70% con las secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de las mismas. Es decir, el 70% de los residuos son los mismos. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una similitud mayor del 80%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una similitud mayor del 85%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una similitud mayor del 90%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una similitud mayor del 95%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una similitud mayor del 98%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una similitud mayor del 99%. En otro caso, los análogos de los polipéptidos tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos de aminoácidos, y más preferentemente menos de 10.
En un caso, los análogos de poliisómeros tendrán una homología de aproximadamente 70% con las secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de las mismas. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una identidad mayor del 80%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una identidad mayor del 85%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una identidad mayor del 90%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una identidad mayor del 95%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una identidad mayor del 98%. En otro ejemplo, los polipéptidos tendrán una identidad mayor del 99%. En otro caso, los análogos de los polipéptidos tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de residuos de aminoácidos, y más preferentemente menos de 10.
Se puede usar un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara las secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima mediante la inserción de espacios en cualquier secuencia que sea adecuada. Es posible calcular la identidad u homología de aminoácidos para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará la parte más larga de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Por tanto, es posible obtener una comparación en la que se encuentran varias regiones de similitud, cada una con una puntuación diferente. Ambos tipos de análisis de identidad se contemplan en la presente invención.
En un procedimiento alternativo, los análogos o derivados podrían ser polipéptidos de fusión que incorporan restos que hacen que la purificación sea más fácil, por ejemplo por marcado eficaz del polipéptido o proteína deseados. Puede ser necesario quitar el “marcador” o puede darse que el propio polipéptido de fusión retenga suficiente antigenicidad para ser útil.
Es bien sabido que es posible seleccionar un polipéptido antigénico para identificar regiones epitópicas, es decir las regiones que son responsables de la antigenicidad o inmunogenicidad del polipéptido. Los procedimientos para llevar a cabo tal detección selectiva son bien conocidos en la técnica. Por tanto, los fragmentos divulgados en el presente documento deberían incluir una o más de tales regiones epitópicas o ser suficientemente similares a tales regiones para conservar sus propiedades antigénicas/inmunogénicas.
La divulgación también abarca polipéptidos que tienen un menor grado de identidad de secuencia pero que tienen una similitud suficiente para realizar una o más de las funciones o actividades exhibidas por los polipéptidos nativos.
Por tanto, lo que es importante para los análogos, derivados y fragmentos, es que poseen al menos un grado de la antigenicidad/inmunogenicidad de la proteína o polipéptido del que derivan.
También están incluidos los polipéptidos en los que uno o más de los residuos aminoácidos incluyen un grupo sustituyente. Estos polipéptidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos modificados. Modificaciones conocidas en los polipéptidos incluyen, entre otras, glucosilación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glucosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación y ubiquitinación.
Dichas modificaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica y se han descrito con gran detalle en la literatura científica. Varias modificaciones particularmente frecuentes, por ejemplo glucosilación, unión a lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación se describen en muchos textos básicos tales como Proteins--Structure and Molecular Properties, 2ª ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993). Se dispone de muchas revisiones detalladas sobre este tema, tales como la de Wold, F., Posttranslationail Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 112 (1983); Seifter et al. (1990) Meth. Enzymol. 182:626-646 y Rattan et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62.
También se incluyen polipéptidos en los que se han condensado otros compuestos que alteran las propiedades biológicas o farmacológicas de los polipéptidos, es decir polietilenglicol (PEG) para incrementar su semivida; secuencias de aminoácidos líder o secretoras para facilidad de purificación; secuencias prepro y pro; y (poli)sacáridos.
Además, en las situaciones en las que se encuentra que las regiones de aminoácidos son polimórficas, puede ser deseable variar uno o más aminoácidos concretos para simular con más eficacia los diferentes epítopos de las diferentes cepas de S. pyogenes.
Además, los polipéptidos se pueden modificar mediante acilación del NH2 terminal (p. ej., mediante acetilación, amidación de ácido tioglicólico, amidación carboxi terminal, por ejemplo con amoniaco o metilamina) para proporcionar estabilidad, mayor hidrofobicidad para la unión o unión a un soporte o a otra molécula.
También se contemplan multímeros de hetero y homopolipéptidos de los fragmentos y análogos polipeptídicos. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos que se han reticulado con reticuladores tal como avidina/biotina, glutaraldehído o dimetilsuperimidato. Dichas formas poliméricas también incluyen polipéptidos
que contienen dos o más secuencias contiguas en tándem o invertidas, producidas a partir de ARN multicistrónicos generados mediante tecnología de ADN recombinante.
En un caso adicional, la presente divulgación también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden uno o más polipéptidos o fragmentos o análogos de los mismos como se define en las figuras de la presente solicitud.
En un caso adicional, la presente divulgación también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que comprenden la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo; siempre que los polipéptidos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.
En un caso adicional, la presente divulgación también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que comprenden la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 siempre que los polipéptidos estén unidos formando un polipéptido quimérico.
Preferentemente, un fragmento, análogo o derivado de un polipéptido comprenderá al menos una región antigénica, es decir al menos un epítopo.
Con el fin de conseguir la formación de polímeros antigénicos (es decir, multímeros sintéticos), se pueden utilizar los polipéptidos que posean grupos bishaloacetilo, nitroarilhaluros, o similares, en los que los reactivos son específicos para los grupos tio. Por tanto, el enlace entre dos grupos mercapto de los diferentes polipéptidos puede ser un enlace sencillo o puede estar compuesto por un grupo de unión de al menos dos, normalmente al menos cuatro, y no más de 16, pero habitualmente no más de aproximadamente 14 átomos de carbono.
En una realización concreta, fragmentos y análogos polipeptídicos de la invención no contienen un residuo inicial de metionina (Met) o valina (Val). Preferentemente, los polipéptidos no incorporarán una secuencia líder o secretora (secuencia señal). La porción de señal de un polipéptido puede determinarse de acuerdo con técnicas de biología molecular establecidas. En general, el polipéptido de interés se puede aislar de un cultivo de S. pyogenes y secuenciarse posteriormente para determinar el residuo inicial de la proteína madura y, por tanto, la secuencia del polipéptido maduro.
Cabe entender que los polipéptidos se pueden producir y/o usar sin su codón inicial (metionina o valina) y/o sin su péptido líder para favorecer la producción y purificación de polipéptidos recombinantes. Se sabe que clonar genes sin secuencias que codifiquen péptidos líder restringirá los polipéptidos al citoplasma de E. coli y facilitará su recuperación (Glick, B.R. y Pasternak, J.J. (1998) Manipulation of gene expression in prokaryotes. En "Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA", 2ª edición, ASM Press, Washington DC, pág. 109143).
En otra realización, los polipéptidos para usar en la invención pueden carecer de un péptido líder en N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje en C-terminal.
La presente divulgación además proporciona un fragmento del polipéptido que comprende sustancialmente todos los dominios celulares extraordinarios de un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 70%, preferentemente una identidad del 80%, más preferentemente una identidad del 95%, con una secuencia escogida de las SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo, en toda la longitud de dicha secuencia.
De acuerdo con otro aspecto de la divulgación, también se proporciona (i) una composición de materia que contiene un polipéptido de la divulgación junto con un vehículo, diluyente o adyuvante, (ii) una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la divulgación y un vehículo, diluyente o adyuvante, (iii) una vacuna que comprende un polipéptido de la divulgación y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iv) un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra S. pyogenes en un huésped mediante la administración al huésped de una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido de la divulgación para provocar una respuesta inmunitaria, por ejemplo una respuesta inmunitaria protectora frente a S. pyogenes; y, particularmente (v) un procedimiento para prevenir y/o tratar una infección producida por S. pyogenes mediante la administración a un huésped que lo necesite de una cantidad profiláctica o terapéutica de un polipéptido de la divulgación.
De acuerdo con otro aspecto de la divulgación, también se proporciona (i) una composición de materia que contiene un polinucleótido de la divulgación junto con un vehículo, diluyente o adyuvante, (ii) una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido de la divulgación y un vehículo, diluyente o adyuvante, (iii) un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra S. pyogenes en un huésped mediante la administración al huésped de una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polinucleótido de la divulgación para provocar una respuesta inmunitaria, por ejemplo una respuesta inmunitaria protectora frente a S. pyogenes; y, particularmente (iv) un procedimiento para prevenir y/o tratar una infección producida por S. pyogenes mediante la administración a un huésped que lo necesite de una cantidad profiláctica o terapéutica de un polinucleótido de la divulgación.
Antes de la inmunización, los polipéptidos también se pueden acoplar o conjugar a proteínas portadoras, tales como la toxina del tétanos la toxina diftérica, el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, el antígeno VP1 del virus de la poliomielitis o cualquier otra toxina o antígeno vírico o bacteriano o cualquier proteína adecuada para estimular el desarrollo de una respuesta inmunitaria más fuerte. Este acoplamiento o conjugación se puede realizar química o
genéticamente. Una descripción más detallada de la conjugación péptido-portador está disponible en Van Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller S., Plaué S., «Synthetic Polypetides as antigens» en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 19 (ed.) Burdou, R.H. & Van Knippenberg P.H. (1988), Blsevier New York.
De acuerdo con otro aspecto se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de S. pyogenes o polipéptidos quiméricos como se define en las reivindicaciones en una mezcla con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con otro aspecto se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de S. pyogenes o polipéptidos quiméricos en una mezcla con un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen (1) formulaciones de emulsión de aceite en agua tales como MP59™, SAF™, Ribi™; (2) adyuvante completo o incompleto de Freund; (3) sales, es decir AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, Al(OH)3, AlPO4, sílice, caolín; (4) derivados de saponina tales como Stimulon™ o partículas generadas a partir del mismo, tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores); (5) citocinas tales como interleucinas, interferones, factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF); (6) otras sustancias, tales como polinucleótidos de carbono, es decir poli IC y poli AU, toxina del cólera destoxificada (CTB) y toxina termolábil de E. coli para la inducción de de inmunidad mucosa; (7) liposomas. Una descripción más detallada de los adyuvantes está disponible en una recapitulación de M.Z, I Khan y col. en Pharmaceutical Research, vol. 11, Nº 1 (1994) pág. 2-11, así como en otra recapitulación realizada por Gupta y col., en Vaccine, Vol. 13, Nº 14, pág. 1263-1276 (1995) y el en documento WO 99/24578. Entre los adyuvantes preferidos se incluyen QuilA™, QS21™, Alhydrogel™ y Adjuphos™.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u oral.
Con el término “composición farmacéutica” también se quiere incluir anticuerpos. De acuerdo con la presente invención, también se proporciona el uso de uno o más anticuerpos que tienen especificidad de unión para los polipéptidos de la presente invención para el tratamiento o profilaxis de la infección producida por estreptococos y/o enfermedades y síntomas mediados por la infección producida por estreptococos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para la profilaxis de la infección producida por S. pyogenes y/o enfermedades y síntomas mediados por la infección producida por S. pyogenes , como se describe en Manual of Clinical Microbiology, P.R. Murray (Editor en jefe), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover y R.H. Yolken. ASM Press, Washington, D.C. séptima edición, 1999, pág. 1773.
Las composiciones farmacéuticas son para usar en el tratamiento profiláctico o terapéutico o de muchos tipos de infecciones diversas, incluyendo faringitis, erisipela e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como bacteriemia y fascitis necrotizante.
Las composiciones farmacéuticas se pueden usar para la profilaxis o tratamiento de una infección por Streptococcus y/o enfermedades y síntomas mediados por una infección por Streptococcus, en particular el grupo A de Streptococcus (Streptococcus pyogenes), grupo B de Streptococcus (GBS o S. agalactiae), S. pneumoniae, S. dysgalactiae, S. uberis, S. nocardia así como Staphylococcus aureus.
En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección por S. pyogenes. En una realización adicional, la infección por S. pyogenes está producida por S. pyogenes no tipificable.
Las composiciones farmacéuticas también pueden ser específicas o selectivas de una o más de las bacterias mencionadas. Por ejemplo, una composición puede ser selectiva o específica de estreptococos del grupo A (Streptococcus pyogenes) y no reaccionar con estreptococos del grupo B (GBS o S. agalactiae), S. pneumoniae, S. dysgalactiae, S. uberis, S. nocardia y Staphylococcus aureus.
La divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección producida por estreptococos en un huésped susceptible a la infección producida por estreptococos que comprende administrar al huésped una cantidad profiláctica o terapéutica de una composición farmacéutica de la invención.
También se divulga en el presente documento un procedimiento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección producida por S. pyogenes en un huésped propenso a la infección producida por S. pyogenes que comprende administrar al huésped una cantidad profiláctica o terapéutica de una composición farmacéutica de la invención.
Como se usa en la presente solicitud, el término “huésped” incluye mamíferos. En otra forma de realización, el mamífero es humano.
En una forma de realización concreta, las composiciones farmacéuticas se administran a los huéspedes en riesgo de
- sufrir
- infección por S. pyogenes, tales como neonatos, lactantes niños, ancianos y huéspedes
- inmunocomprometidos.
- 15
En una forma de realización concreta, las composiciones farmacéuticas se administran a los huéspedes en riesgo de sufrir infección por S. pyogenes, tales como adultos.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas están en forma de monodosis de aproximadamente 0,001 a 100 !g/kg (antígeno/peso corporal) y, más preferentemente, de 0,01 a 10 !g/kg y más preferentemente de 0,1 a 1 !g/kg de 1 a 3 veces, con un intervalo de intervalos de aproximadamente 1 a 6 semanas entre inmunizaciones.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas están en forma de monodosis de aproximadamente 0,1 !g a 10 mg y, más preferentemente, de 1 !g a 1 mg y más preferentemente de 10 a 100 !g de 1 a 3 veces, con un intervalo de intervalos de aproximadamente 1 a 6 semanas entre inmunizaciones.
También se divulgan en el presente documento polinucleótidos que codifican polipéptidos que se caracterizan por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo.
En un caso, los polinucleótidos son los que se ilustran en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, que pueden incluir marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican los polipéptidos divulgados en el presente documento.
Muchos tipos de variantes de polinucleótidos están abarcados por la divulgación, incluyendo, por ejemplo, (i) uno en el que uno o más de los nucleótidos está sustituido por otro nucleótido o que, por otro lado, está mutado; o (ii) uno en el que uno o más de los nucleótidos está modificado, por ejemplo incluye un grupo sustituyente; o (iii) uno en el que el polinucleótido está condensado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polinucleótido; o (iv) uno en el que nucleótidos adicionales están unidos de forma covalente al polinucleótido, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora o una secuencia que se usa para purificación del polipéptido. Los nucleótidos adicionales pueden proceder de una fuente heteróloga o pueden ser endógenos del gen natural.
Las variantes polinucleotídicas pertenecientes al tipo (i) anterior incluyen, por ejemplo, polimorfismos, incluyendo polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y mutantes. Los polinucleótidos variantes pueden comprender, por ejemplo, una o más adiciones, inserciones, deleciones, sustituciones, transiciones, transversiones, inversiones o similares, o cualquier combinación de las mismas.
Variantes polinucleotídicas pertenecientes al tipo (ii) anterior incluyen, por ejemplo, modificaciones tales como la unión de marcadores detectables (avidina, biotina, elementos radioactivos, marcadores fluorescentes y pigmentos, marcadores de transferencia de energía, marcadores de emisión de energía, etc.) o restos que mejoran la expresión, captación, catálogo, marcaje, hibridación, detección y/o estabilidad. Los polinucleótidos también se pueden unir a soportes sólidos, por ejemplo nitrocelulosa, microesferas magnéticas o paramagnéticas (p. ej., como se describe en la patente de EE.UU. nº 5,411,663; la patente de EE.UU. nº 5,543,289, por ejemplo, que comprende microesferas ferromagnéticas, supermagnéticas, paramagnéticas, superparamagnéticas, óxido de hierro y polisacárido), nailon, agarosa, celulosa diazotada, microesferas sólidas en látex, poliacrilamidas etc., de acuerdo con un procedimiento deseado. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.70.67; 5.476.925; 5.478.893.
Las variantes polinucleotídicas pertenecientes al tipo (iii) anterior son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, varias longitudes de cola de poliA*, estructuras de capuchón en 5’ y análogos nucleotídicos, por ejemplo inopina, tionucleótidos o similares.
Las variantes polinucleotídicas pertenecientes al tipo (iv) anterior incluyen, por ejemplo, una variedad de polinucleótidos quiméricos, híbridos o de fusión. Por ejemplo, un polinucleótido puede comprender una secuencia de codificación y una secuencia de codificación adicional no natural o heteróloga (p. ej., secuencias que codifican péptidos líder, señal, secretores, dirigidos, enzimáticos, fluorescentes, de resistencia a antibióticos y otros funcionales o diagnósticos); o una secuencia de codificación y secuencias de no codificación, por ejemplo secuencias no traducidas en los extremos 5' o 3' o dispersos en la secuencia de codificación.
Se apreciará que las secuencias polinucleotídicas ilustradas en las figuras se pueden alterar con codones degenerados, aunque siguen codificando los polipéptidos de la divulgación. En consecuencia, la presente divulgación proporciona además polinucleótidos que hibridan con las secuencias polinucleotídicas descritas en la presente memoria descriptiva en lo que antecede (o las secuencias complementarias de las mismas), que tiene una identidad de un 70% entre secuencias. En un caso, una identidad entre secuencias de al menos el 80%. En un caso, una identidad entre secuencias de al menos el 85%. En un caso, una identidad entre secuencias de al menos el 90%. En un caso adicional los polinucleótidos son hibridables en condiciones estrictas, es decir con una identidad de al menos un 95%. En un caso adicional, una identidad de más del 97%. En un caso adicional, una identidad de más del 98%. En un caso adicional, una identidad de más del 99%. En un caso adicional los polinucleótidos son hibridables en condiciones estrictas
Un experto en la técnica puede determinar con facilidad las condiciones estrictas adecuadas para la hibridación (véase, por ejemplo, Sambrook y col., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) Editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.).
“Condiciones estrictas adecuadas”, como se usa en el presente documento, significa, por ejemplo, incubar una transferencia durante la noche (p. ej., al menos 12 horas) con una sonda polinucleotídica larga en una solución de hibridación que contiene, por ejemplo, aproximadamente 5X SSC, 0,5% de SDS, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 50% de formamida, a 42° C. Las transferencias se pueden lavar en condiciones muy estrictas que permitan, por ejemplo, para un error de apareamiento inferior al 5% de pb (p. ej., lavar dos veces en 0,1X SSC y 0,1% de SDS durante 30 min a 65° C), de modo que se seleccionan secuencias que tienen, por ejemplo, una identidad de secuencia del 95% o mayor.
Otros ejemplos no limitantes de condiciones estrictas adecuadas incluyen un lavado final a 65 ºC en tampón acuoso que contiene NaCl 30 mM y 0,5% de SDS. Otro ejemplo de condiciones estrictas adecuadas es hibridación en 7% de SDS, NaPO4 0,5 M, pH 7, EDTA 1 mM a 50° C, por ejemplo durante la noche, seguido de uno o más lavados con una solución al 1% de SDS al 42 ºC. Mientras que los lavados en condiciones muy estrictas pueden permitir un error de apareamiento menor del 5%, las condiciones de rigurosidad reducida o baja pueden permitir un error de apareamiento de nucleótidos de hasta un 20%. La hibridación a rigurosidad baja puede conseguirse como se ha indicado anteriormente, pero usando condiciones de formamida más bajas, temperaturas más bajas y/o concentraciones de sales más bajas, así como periodos de incubación más largos.
De acuerdo con otro aspecto de la divulgación también se proporcionan polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con:
a) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
b) la complementaria de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido; comprendiendo dicho polipéptido la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo;
Polinucléotidos que hibridan en condiciones rigurosas con:
(a) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
(b) la complementaria de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido; en el que dicho polipéptido comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44; Polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con
a) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o b) la complementaria de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido; teniendo dicho polipéptido la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo; Polinucléotidos que hibridan en condiciones rigurosas con:
(a) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
(b) la complementaria de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido; teniendo dicho polipéptido la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44; Polinucléotidos que hibridan en condiciones rigurosas con:
- (a)
- una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
- (b)
- la complementaria de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;
comprendiendo dicho polipéptido al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo; Polinucléotidos que hibridan en condiciones rigurosas con:
- (a)
- una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
- (b)
- la complementaria de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;
comprendiendo dicho polipéptido al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende
la SEC ID Nº: 2, 4, 6 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44;
Polinucléotidos que hibridan en condiciones rigurosas con:
a) una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
b) la complementaria de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;
teniendo dicho polipéptido al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o fragmentos o análogos del mismo; y
Polinucléotidos que hibridan en condiciones rigurosas con:
- (a)
- una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
- (b)
- la complementaria de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;
teniendo dicho polipéptido al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que tiene la SEC ID Nº: 2, 4, 6 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44.
En un caso adicional, los polinucleótidos son los que se ilustran en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 o fragmentos o análogos de los mismos que codifican polipéptidos de la invención.
En un caso adicional, los polinucleótidos son los que se ilustran en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 que codifican polipéptidos de la invención.
Como un experto en la técnica apreciará con facilidad, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.
La presente divulgación también incluye polinucleótidos complementarios a los polinucleótidos descritos en la presente solicitud.
Los polinucleótidos que codifican polipéptidos como se divulga en el presente documento, fragmentos, análogos o derivados de los mismos, se pueden usar en un procedimiento de inmunización con ADN. Es decir, se pueden incorporar en un vector que es replicable y expresable tras la inyección en el mismo, produciendo el polipéptido antigénico in vivo. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden incorporarse en un vector plasmídico bajo el control del promotor de CMV, que es funcional en células eucarióticas. Preferentemente, el vector se inyecta por vía intramuscular.
También se divulga un procedimiento para producir polipéptidos para usar en la invención mediante técnicas recombinantes a través de la expresión de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en una célula huésped y la recuperación del producto polipeptídico expresado.
Como alternativa, los polipéptidos se pueden producir de acuerdo con técnicas químicas sintéticas establecidas, es decir síntesis en fase de solución o en fase sólida de oligopéptidos que se ligan para producir el polipéptido completo (ligación en bloque).
En las referencias siguientes se describen procedimientos generales para la obtención y la evaluación de polinucleótidos y polipéptidos: Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley and Sons, Inc. New York; PCR Cloning Protocols, de Molecular Cloning to Genetic Engineering, Editado por White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 páginas; Protein Purification, Principles and Practices, Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, 3ª Edition, 1993, 380 páginas; Current Protocols in Immunology, Editado por Coligan J.E. y col., John Wiley & Sons Inc., New Cork.
La presente divulgación proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la divulgación, en el que dicho ADN está unido operativamente a una región de control de la expresión.
La presente divulgación proporciona una célula huésped transfeccionada con el vector de la divulgación.
La presente divulgación proporciona un procedimiento para producir un polipéptido que comprende cultivar una célula huésped de la divulgación en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido.
Para la producción recombinante, las células huésped se transfectan con vectores que codifican los polipéptidos de la invención y, después, se cultivan en un medio nutritivo modificado según sea adecuado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes. Vectores adecuados son aquéllos que son viables y replicables en el huésped escogido e incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos. La secuencia polipeptídica puede estar incorporada en el vector en el lugar adecuado usando enzimas de restricción de modo que esté unida de forma operable a una región de control de la expresión que comprende un promotor, un lugar de unión al ribosoma (región consenso o secuencia de Shine-Dalgarno) y, opcionalmente, un operador (elemento de control). Se pueden seleccionar componentes individuales de la región de control de la expresión que sean adecuados para un huésped y un vector dados de acuerdo con los principios de biología molecular establecidos (Sambrook y col, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley & Sons, Inc., N.Y.). Entre los promotores adecuados se incluyen el promotor de LTR o SV40, promotores lac, tac o trp de E. coli y el promotor PL del fago lambda. Preferentemente, los vectores incorporarán un origen de replicación, así como marcadores de selección, es decir un gen de resistencia a ampicilina. Entre los vectores bacterianos se incluyen
pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pD10 phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, y los vectores eucarióticos pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células huésped pueden ser bacterianas, es decir E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; fúngicas, es decir Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; de levaduras, es decir Saccharomyces o eucarióticas, es decir CHO, COS.
Tras la expresión del polipéptido en cultivo, las células se cosechan normalmente mediante centrifugación, después se rompen por medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no se secreta al medio) y el extracto bruto resultante se conserva para aislar el polipéptido de interés. La purificación del polipéptido del medio de cultivo o del lisado se puede llevar a cabo mediante técnicas establecidas dependiendo de las propiedades del polipéptido, es decir usando sulfato amónico o precipitación con etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico
o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectina. La purificación final se puede llevar a cabo usando HPLC.
Los polipéptidos se pueden expresar con o sin una secuencia líder o de secreción. En el primer caso, el líder se puede eliminar usando procesamiento postraduccional (véanse los documentos US 4.431.739; US 4.425.437; y US 4.338.397) o se puede eliminar químicamente después de purificar el polipéptido expresado.
De acuerdo con un aspecto adicional, los polipéptidos de S. pyogenes de la invención se pueden usar en una prueba diagnóstica para la infección producida por estreptococos, en particular la infección producida por S. pyogenes.
Son posibles varios procedimientos diagnósticos, como se define en las reivindicaciones.
Un procedimiento para la detección de anticuerpos específicos de un antígeno de S. pyogenes en una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene dicho anticuerpo, que comprende:
a) obtención de una muestra biológica de un huésped;
b) incubar uno o más polipéptidos de S. pyogenes de la invención o fragmentos de los mismos con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c) detectar el antígeno unido específicamente o fragmento unido en la mezcla, lo que indica la presencia de anticuerpo específico del antígeno de S. pyogenes.
Un experto en la técnica apreciará que esta prueba diagnóstica puede tomar varias formas, incluida una prueba inmunológica tal como un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación con látex, esencialmente para destinar si hay anticuerpos específicos del polipéptido presentes en un organismo.
Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de la invención también se pueden usar para diseñar sondas de ADN para usar en la detección de la presencia de S. pyogenes en una muestra biológica de la que se sospecha que contiene tal bacteria. El procedimiento de detección de la presente divulgación comprende:
a) obtención de la muestra biológica de un huésped;
b) incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o fragmento del mismo con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c) detectar la sonda de ADN específicamente unida en la mezcla, lo que indica la presencia de la bacteria S. pyogenes.
Las sondas de ADN de esta divulgación también se pueden usar para detectar S. pyogenes circulante, es decir ácidos nucleicos de S. pyogenes en una muestra, por ejemplo usando una reacción en cadena de la polimerasa, como procedimiento diagnóstico de infecciones producidas por S. pyogenes. La sonda se puede sintetizar usando técnicas convencionales y se puede inmovilizar en una fase sólida, o puede marcarse con un marcador detectable. Una sonda de ADN preferida para esta aplicación es un oligómero que tiene una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de S. pyogenes se proporciona en el presente documento. En otro ejemplo, la sonda de ADN preferida será un oligómero que tiene una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de S. pyogenes divulgados en el presente documento. En otro ejemplo, la sonda de ADN preferida será un oligómero que tiene una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 30 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de S. pyogenes divulgados en el presente documento. En otro ejemplo, la sonda de ADN preferida será un oligómero que tiene una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de S. pyogenes divulgados en el presente documento.
Otro procedimiento diagnóstico para la detección de S. pyogenes en un huésped comprende:
a) marcar un anticuerpo reactivo con un polipéptido de la invención o fragmento del mismo con un marcador
detectable;
b) administrar al huésped el anticuerpo marcado o fragmento marcado; y
c) detectar anticuerpo específicamente unido o fragmento marcado en el huésped, lo que indica la presencia de S. pyogenes.
Otro aspecto de la divulgación es el uso de los polipéptidos de S. pyogenes de la invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para el diagnóstico y, en particular, el tratamiento de la infección producida por S. pyogenes. Los anticuerpos adecuados se pueden determinar usando procedimientos de detección selectiva adecuados mediante, por ejemplo, medición de la capacidad de un anticuerpo concreto para proteger de forma pasiva contra la infección producida por S. pyogenes en un modelo de prueba. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratones descrito en los ejemplos de el presente documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un fragmento del mismo de unión al antígeno, y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen mamífero, y, más específicamente, de origen murino, de rata o ser humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo, o, si se desea, un anticuerpo recombinante o un fragmento de anticuerpo. El término anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante quiere decir anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha producido usando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo pueden ser policlonales, o, preferentemente, monoclonales. Puede ser específico para un número de epítopos asociados con los polipéptidos de S. pyogenes, pero es, preferentemente, específico para uno.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo para usar en el tratamiento y/o profilaxis de las infecciones producidas por S. pyogenes, en cuanto a que están dentro de las reivindicaciones adjuntas,
Un aspecto adicional de la invención es anticuerpos para usar en inmunización pasiva, en cuanto a que está abarcado por las reivindicaciones adjuntas. Se podrían usar los anticuerpos descritos en la presente solicitud.
Asimismo, en el presente documento se divulga un procedimiento de inmunización en el que un anticuerpo aumentado por un polipéptido de la invención se administra a un huésped en una cantidad suficiente para proporcionar inmunización pasiva.
El uso de un polinucleótido en la inmunización genética empleará, preferentemente, un procedimiento o sistema de liberación adecuado, tal como inyección directa de ADN plasmídico en los músculos [Wolf y col. H M G (1992) 1: 363; Turnes y col., Vaccine (1999), 17: 2089; Le y col., Vaccine (2000) 18: 1893 Alves et al., Vaccine (2001) 19 : 788], inyección de ADN plasmídico con o sin adyuvantes [Ulmer y col., Vaccine (1999) 18: 18; MacLaughlin y col., J. Control Release (1998) 56: 259; Hartikka y col., Gene Ther. (2000) 7: 1171 -82; Benvenisty y Reshef, PNAS USA (1986) 83:9551; Singh y col., PNAS USA (2000) 97: 811], dirigido a las células mediante la liberación de ADN en complejo con portadores específicos [Wa y col., J Biol Chem (1989) 264: 15985; Chaplin y col., Infect. Immun. (1999)
67: 6434], inyección de plásmido en complejo o encapsulado en diversas formas de liposomas [Ishii y col., AIDS Research and Human Retroviruses (1997) 13: 242; Perrie y col., Vaccine (2001) 29: 3301], administración de ADN con diferentes procedimientos de bombardeo [Tang y col., Nature (1992) 356: 152; Bisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791; Chen y col., Vaccine (2001) 19: 2908], y administración de ADN con vectores vivos [Tubulekas y col., Gene (1997) 190: 191; Pushko y col., Virology (1997) 239: 389; Spreng y col. FEMS (2000) 27: 299; Dietrich y col., Vaccine (2001) 19: 2506].
En otra forma de realización, la invención proporciona el uso de una composición farmacéutica de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección producida por S. pyogenes, en cuanto a que está abarcado por las reivindicaciones adjuntas.
En otro caso más, la divulgación proporciona un kit que comprende un polipéptido de la invención para la detección
o el diagnóstico de la infección producida por S. pyogenes.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la técnica a la que esta invención pertenece entiende habitualmente. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones, tendrá prioridad. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no están destinados a ser limitantes.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra la clonación y las características moleculares del gen SHB-GAS-102 y el correspondiente polipéptido.
La región codificadora del gen SHB-GAS-102 de S. pyogenes (SEC ID Nº: 1) se amplificó mediante PCR (ciclador térmico Robocycler Gradient 96, Stratagene, La Jolla, CA) del ADN genómico de la cepa ATCC700294 de S. pyogenes serotipo M1 usando los siguientes cebadores oligonucleotídicos que contenían extensiones de bases para la adición de sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG): DMAR2174 y DMAR2175, que se presentan en la Tabla 1. Los productos de la PCR se purificaron del gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick
de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen, Chatsworth, CA) y se digirieron con NdeI y NotI (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Baie d’Urfé, Canadá). El vector pET21b(+) Novagen, Madison WI) se digirió con Ndel y NotI y se purificó en gel de azarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick (Chatsworth, CA). Los productos de la PCR NdeI-NotI se ligaron al vector de expresión NdeI-XhoI pET-19b(+). Los productos ligados se 5 transformaron en la cepa de E. coli DH5 ∀ [ФsodlaczΔM15 Δ (lacZYA-argF)_U169 endA1 recA1 hsdR17_(rK-mK+) deoR thi-1 supE44 λ-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed) pág. 109-135). El plásmido recombinante pET19b(+)(rpET19b(+)) que contenía el gen SHB-GAS-102 se purificó usando el kit de plásmido GenElute (Sigma-Aldrich Company Ltd, MO) y se secuenció el inserto de ADN (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI,
10 Foster City, CA).
Tabla 1. Cebadores oligonucleotídicos usados para amplificaciones por PCR de genes de S. pyogenes
(continuación) (continuación)
1El residuo aminoácido subrayado representa la modificación en la secuencia del ADN.
2Conjuntos de cebadores oligonucleotídicos para PCR usados para eliminar el sitio de restricción BamHI presente en 5 el gen SHB-GAS-102.
Se determinó que el marco de lectura abierta (ORF) de 537 pb que incluye un codón de terminación (TAA) del SHBGAS-102 codifica un polipéptido de 178 residuos de aminoácidos con un pl previsto de 9,55 y una masa molecular predicha de 19.431,0 Da. Análisis de la secuencia de residuos aminoácidos previstos (SEC ID Nº: 2) usando el software Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) no reveló la existencia de un
10 péptido señal.
Para confirmar la presencia del gen SHB-GAS-102 (SEC ID Nº:1) se usaron las siguientes 4 cepas de S. pyogenes serológicamente distintas. El serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294, el serotipo M3 de la cepa de S. pyogenes ATCC12384 y el serotipo M18 de la cepa de S. pyogenes ATCC12357 se obtuvieron en la Colección Americana de cultivos Tipo ((Rockville, MD) y el serotipo M6 de la cepa de S. pyogenes SPY67 proporcionó el 15 aislado proporcionado por el Centre de recherche en infectiologie du Centre hospitalier de l'Université Laval, Sainte-Foy, Canadá. El ADN cromosómica se aisló de cada cepa que se ha descrito anteriormente (Jayarao BM et al. 1991.
J. Clin. Microbiol. 29:2774-2778). El gen SHB-GAS-102 (SEC ID Nº 1) se amplificó por PCR (ciclador térmico Robocycler Gradient 96) a partir de ADN genómico purificado de las 4 cepas de S. pyogenes usando los cebadores oligonucleótidos DMAR2174 y DMAR2175 (Tabla 1). La PCR se realizó con 35 ciclos de 45 segundos a 95 ºC, 45 20 segundos a 45ºC y 75 segundos a 72ºC, y un periodo de elongación final de 10 min a 72ºC. Los productos de la PCR se fraccionaron por tamaño en geles de agarosa al 1% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los resultados de estas amplificaciones por PCR se presentan en la Tabla 2. El análisis de los productos de amplificación reveló que el gen SHB-GAS-102 (SEC ID Nº:1) estaba presente en el genoma de las 4 cepas de S. pyogenes analizadas. Estos datos sobre la PCR presentados en los párrafos anteriores demostraron claramente que
25 el gen SHB-GAS-102 está muy conservado entre las cepas de estreptococos.
Tabla 2. Identificación de genes de S. pyogenes mediante amplificación por PCR
- Identificación de la cepa
- Identificación PCR de mediante amplificación por
- SHB-GAS-102 SHB-GAS-103 SHB-GAS-104
- ATCC700294 (M1)
- + + +
- ATCC12384 (M3)
- + + +
- SPY67 (M6)
- + + +
- ATCC12357 (M18)
- + + +
Con el fin de evaluar la distribución del polipéptido SHB-GAS-102 entre aislados de S. pyogenes se analizó la
5 reactividad de sueros combinados de ratón anti-SHB-GAS-102 frente a un conjunto de 13 cepas de S. pyogenes que representan 13 serotipos M (Tabla 3) mediante inmunotransferencias. Estos sueros se obtuvieron de ratones inmunizados tres veces a intervalos de dos semanas con 20 μg de polipéptidos SHB-GAS-102 recombinantes purificados mezclados con adyuvante Quil A. El polipéptido SHB-GAS-102 recombinante se produjo y purificó como se describe en el ejemplo 6. Las células de pyogenes usadas para este estudio se prepararon siguiendo este
10 protocolo: se cultivaron las bacterias en caldo de Todd Hewitt (TH) con 0,5% de extracto de levadura, 1% de peptona, durante la noche a 37 ºC en una atmósfera de 8% de CO2. La suspensión de bacterias se ajustó a una DO600nm de 1,0 y las células de S. pyogenes se fijaron con 0,3% de formaldehído en tampón PBS durante 18 horas a 4ºC. Tras la incubación, esta solución se trató con mutanolisina (7,5 U/500μl) durante 30 minutos a 37 ºC y se llevó a ebullición durante 5 minutos en tampón de muestra SDS-PAGE. Los anticuerpos presentes en los sueros
15 combinados de ratón reconocieron la banda del polipéptido SHB-GAS-102 (≈22 kDa) en las 13 preparaciones de S. pyogenes analizadas (Tabla 3). Con el fin de confirmar la naturaleza de la banda del polipéptido, los sueros antiSHB-GAS-102 se adsorbieron con 12,5 μg de los polipéptidos SHB-GAS-102 recombinantes purificados (durante la noche, 4 ºC). Como cabía esperar, este suero adsorbido no reconoció, en el extracto de células enteras de S. pyogenes sobre el gel, la banda del polipéptido a ≈22 kDa, lo que confirma que esta banda polipeptídica era el
20 polipéptido SHB-GAS-102.
Estos datos, así como los datos presentados en los párrafos anteriores, demostraron claramente que el gen SHBGAS-102 y el polipéptido SHB-GAS-102 están muy conservados entre las cepas de estreptococos.
Tabla 3. Identificación de polipéptidos de S. pyogenes de inmunotransferencias con anti-sueros combinados de ratón producidos contra los polipéptidos SHB-GAS-102, SHB-GAS-103 and SHB-104 recombinantes1.
- Identificación de la cepa (serotipo M)
- Identificación mediante inmunotransferencia de
- SHB-GAS-102 SHB-GAS-103 SHB-GAS-104
- ATCC700294 (M1)
- + + +
- Spy68 (M2)
- + + +
- ATCC12384 (M3)
- + + +
- Spy71 (M4)
- + + +
- Spy70 (M5)
- + + +
- Spy67 (M6)
- + + +
- Spy88 (M11)
- + + +
(continuación)
- Spy95 (M12)
- + + +
- ATCC12357 (M18)
- + + +
- Spy73 (M22)
- + + +
- Spy91 (M28)
- + + +
- Spy99 (M58)
- + + +
- Spy87 (M77)
- + + +
- 1Los sueros se obtuvieron de ratones inmunizados tres veces a intervalos de dos semanas con 20 μg de polipéptidos recombinantes purificados mezclados con adyuvante Quil A. Los sueros se diluyeron a 1/1.000 para realizar las inmunotransferencias.
Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra la clonación y las características moleculares del gen SHB-GAS-103 y el correspondiente polipéptido.
La región codificadora del gen SHB-GAS-103 de S. pyogenes (SEC ID Nº: 3) se amplificó mediante PCR (ciclador térmico Robocycler Gradient 96, Stratagene, La Jolla, CA) del ADN genómico de la cepa ATCC700294 de S. pyogenes serotipo M1 usando los siguientes oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición de sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG): DMAR1878 y DMAR1879, que se presentan en la Tabla 1. Los procedimientos usados para clonar y secuenciar el gen SHB-GAS-1 en un vector de expresión son similares a los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.
Se determinó que el marco de lectura abierta (ORF) de 1269 pb que incluye un codón de terminación (TAA) del SHB-GAS-103 codifica un polipéptido de 422 residuos de aminoácidos con un pl previsto de 9,11 y una masa molecular predicha de 46.605,3 Da. Análisis de la secuencia de residuos aminoácidos previstos (SEC ID Nº: 4) usando el software Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) sugirió la existencia de un péptido señal de 27 residuos aminoácidos (MFQLRKKMTRKQLALLSAGVLTCVVGG).
Se mostró que el gen SHB-GAS-103 estaba presente tras amplificación por PCR usando los cebadores oligonucleotídicos DMAR1878 y DMAR1879 en las 4 cepas de S. pyogenes analizadas serológicamente (Tabla 2). Además, se demostró que el polipéptido SHB-GAS-103 estaba presente en los 13 aislados de S. pyogenes analizados mediante inmunotransferencias como se describe en el ejemplo 1 (Tabla 3). De hecho, los anticuerpos presentes en los sueros combinados de ratón reconocieron la banda del polipéptido SHB-GAS-103 (≈52 kDa) en las 13 preparaciones de S. pyogenes analizadas (Tabla 3). Con el fin de confirmar la naturaleza de la banda del polipéptido, los sueros anti-SHB-GAS-103 se adsorbieron con 12,5 μg de los polipéptidos SHB-GAS-103 recombinantes purificados (durante la noche, 4 ºC). Como cabía esperar, este suero adsorbido no reconoció, en el extracto de células enteras de S. pyogenes sobre el gel, la banda del polipéptido a ≈52 kDa, lo que confirma que esta banda polipeptídica era el polipéptido SHB-GAS-103.
Estos datos presentados en los párrafos anteriores, demostraron claramente que el gen SHB-GAS-103 y el polipéptido SHB-GAS-103 están muy conservados entre las cepas de estreptococos.
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra la clonación y las características moleculares del gen SHB-GAS-104 y el correspondiente polipéptido.
La región codificadora del gen SHB-GAS-104 de S. pyogenes (SEC ID Nº: 5) se amplificó mediante PCR (ciclador térmico Robocycler Gradient 96, Stratagene, La Jolla, CA) del ADN genómico de la cepa ATCC700294 de S. pyogenes serotipo M1 usando los siguientes oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición de sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG): DMAR1976 y DMAR1977, que se presentan en la Tabla 1. Los procedimientos usados para clonar y secuenciar el gen SHB-GAS-104 en un vector de expresión son similares a los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.
molecular predicha de 33.381,9 Da. Análisis de la secuencia de residuos aminoácidos previstos (SEC ID Nº: 6) usando el software Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) sugirió la existencia de un péptido señal de 19 residuos aminoácidos (MIKRCKGIGLALMAFFLVA).
Se mostró que el gen SHB-GAS-104 estaba presente tras amplificación por PCR usando los cebadores oligonucleotídicos DMAR1976 y DMAR1977 en las 4 cepas de S. pyogenes analizadas serológicamente (Tabla 2). Los procedimientos usados para la amplificación por PCR del gen SHB-GAS-104 fueron similares a los procedimientos presentados en el ejemplo 1.
Además, se ha evaluado la distribución del polipéptido SHB-GAS-104 entre los aislados de S. pyogenes como se describe en el ejemplo 1 usando un extracto de S. pyogenes preparado mediante el procedimiento siguiente: se cultivaron las bacterias en caldo TH con 0,5% de extracto de levadura, 1% de peptona, durante la noche a 37 ºC en una atmósfera de 8% de CO2. La suspensión bacteriana se ajustó hasta una DO600nm de 0,8. Tras la centrifugación, el sedimento bacteriano se resuspendió en 500 μl del tampón de extracción (Tris-HCl 0,1M, pH 7,6) y se sedimentó mediante centrifugación. El sedimento se congeló durante 10 minutos a -80 ºC y se descongeló a 37ºC durante 5 minutos. El ciclo de congelación-descongelación se repitió tres veces. El sedimento bacteriano se resuspendió en 500 μl del tampón de extracción y se sometió a ultrasonidos 8 x 15 segundos. Las muestras se centrifugaron (14.000 x g) a 4 ºC durante 15 minutos y el sobrenadante se llevó a ebullición durante 5 minutos en tampón de muestra SDS-PAGE. Los anticuerpos presentes en los sueros combinados de ratón anti-SHB-GAS-104 reconocieron la banda del polipéptido SHB-GAS-104 (≈37,5 kDa) en las 13 preparaciones de S. pyogenes analizadas (Tabla 3). Con el fin de confirmar la naturaleza de la banda del polipéptido, los sueros anti-SHB-GAS-104 se adsorbieron con 12,5 μg del polipéptido SHB-GAS-104 recombinante purificado (durante la noche, 4 ºC). Como cabía esperar, este suero adsorbido no reconoció, en el extracto de S. pyogenes sobre el gel, la banda del polipéptido a ≈37,5 kDa, lo que confirma que esta banda polipeptídica era el polipéptido SHB-GAS-104.
Estos datos sobre la PCR presentados en los párrafos anteriores demostraron claramente que el gen SHB-GAS-104 está muy conservado entre las cepas de estreptococos.
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra la clonación de genes de S. pyogenes en el plásmido de CMV pCMV-GH.
Las regiones de ADN codificadoras de polipéptidos de S. pyogenes se insertaron en fase en dirección 5’ de un gen de la hormona de crecimiento humana (Hg.) que estaba bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) en el vector plasmídico pCMV-GH (Tang y col., Nature, 1992, 356:152). El promotor de CMV es un plásmido no funcional en las células de E. coli, pero activo tras la administración del plásmido en células eucarióticas. El vector también incorporó el gen de resistencia a ampicilina.
Con el fin de eliminar el sitio BamHI en el gen SHB-GAS-102 se realizaron experimentos de mutagénesis usando el kit de mutagénesis dirigida a sitio Quickchange de Stratagene de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los oligonucleótidos DMAR2841 y DMAR2842 (Tabla 1) y el gen SHB-GAS-102 clonado en el vector pET como molde de ADN se usaron para realizar los experimentos de mutagénesis. La modificación del gen SHB-GAS-102 generada mediante mutagénesis dirigida a sitio se presenta en la Tabla 1.
Las regiones codificadoras de los genes SHB-GAS-102, SHB-GAS-103 (SEC ID Nº: 3) y SHB-GAS-104 (SEC ID Nº; 5) se amplificaron mediante PCR (sistema para PCR con ciclador térmico de ADN GeneAmp 96 Perkin Elmer) del vector pET que contiene el gen SHB-GAS-102 modificado o el ADN genómico de la cepa ATCC700294 de S. pyogenes, serotipo M1 (para los genes SHB-GAS-103 y SHB-GAS-104) usando cebadores oligonucleotídicos que contenían extensiones de bases para la adición de sitios de restricción BamHI (GGATCC) y SalI (GTCGAC), que se describen en la Tabla 1. Los productos de la PCR se purificaron del gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de Qiagen (Chatsworth, CA) y se digirieron con enzimas de restricción (Amersham Biosciences Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pCMV-GH (Laboratorio del Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, The University of Texas, Dallas, Texas) se digirió con BamHI y SalI, y se purificó del gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de Qiagen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN digeridos con BamHI-SalI se ligaron en el vector pCMV-GH digerido con BamHI-SalI para crear los polipéptidos de fusión hGH-SHB-GAS-102, hGH-SHB-GAS-103 y hGH-SHB-GAS-104 bajo el control del promotor de CMV. Los productos ligados se transformaron en la cepa de E. coli DH5α [φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 hsdR17_(rK-mK+) deoR thi-1 supE44 λ-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de of Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed) pág. 109-135). Los plásmidos pCMV recombinantes se purificaron usando el kit de plásmido GenElute (Sigma-Aldrich company Ltd, MO) y las secuencias nucleotídicas de los insertos de ADN se verificaron mediante secuenciación de ADN.
Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra el uso de ADN para provocar una respuesta inmunitaria a antígenos polipeptídicos de S. pyogenes.
Grupos de 8 ratones hembra BALB/c (Charles River, St-Constant, Québec, Canadá) se inmunizaron mediante
inyección intramuscular de 100 !l tres veces a intervalos de dos o tres semanas con 50 !g de genes SHB-MC100 (SEC ID Nº 1) y SHB-MC101 (SEC ID Nº: 3) codificadores de pCMV-GH recombinante. 3) y SHB-GAS-104 (SEC ID Nº; 5) en presencia de 50 !g del plásmido que expresa el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) pCMV-GH-GM-CSF (Laboratorio del Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, The University of Texas, Dallas, Texas). Como control se inyectó a grupos de ratones 50 !g de pCMV-GH en presencia de 50 !g de pCMV-GH-GM-CSF. Las muestras de sangre se obtuvieron del seno orbital antes de cada inmunización y siete días después de la tercera inyección y se determinaron las respuestas de anticuerpos en suero mediante ELISA usando los correspondientes polipéptidos recombinantes de S. pyogenes marcados con cola de His como antígenos de recubrimiento. La producción y purificación de estos polipéptidos recombinantes de S. pyogenes marcados con cola de His se presentan en el Ejemplo 6.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra la producción y purificación de polipéptidos recombinantes de S. pyogenes.
Los plásmidos pET-19b(+)recombinantes con los genes SHB-GAS-102 (SEC ID Nº: 1), SHB-GAS-103 (SEC ID Nº: 3) y SHB-GAS-104 (SEC ID Nº; 5) se usaron para transformar mediante electroporación (Gene Pulser II apparatus, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) las cepas BL21 de EBL21 (DE3) (F-ompT hsdSB (r-Bm-B) gal dcm (DE3)) o BL21 (DE3) (F-ompT hsdSB (r-Bm7B) gal dcm rne131 (DE3)) (Novagen, Madison, WI). En estas cepas de E. coli, el promotor T7 que controla la expresión del polipéptido recombinante es reconocido específicamente por la T7 ARN polimerasa (presente en el profago λDE3) cuyo gen está bajo el control del promotor lac que es inducible por isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG). Los transformantes BL21(DE3)/rpET o BL21 star (Des)/rpET se cultivaron a 37 ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (peptona 10g/l, 5g/l de extracto de levadura, 10g/l de NaCl) que contiene 100 μg de carbenicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canadá) por ml hasta que la A600 alcanzó un valor de 0,6. Con el fin de inducir la producción de los polipéptidos recombinantes de S. pyogenes marcados con His, las células se incubaron durante 2 horas adicionales en presencia de IPTG a una concentración final de 1 mM. Las células inducidas en un cultivo de 500 ml se sedimentaron mediante centrifugación y se congelaron a -70° C.
La purificación de los polipéptidos recombinantes de la fracción soluble de BL21 (DE3)/rpET19b(+) or BL21 star(DE3)/rpETl9b(+) inducidas por IPTG se realizó mediante cromatografía de afinidad basada en las propiedades de la secuencia de His●Tag (10 residuos consecutivos de histidina) para unirse a cationes divalentes (Ni2+) inmovilizados sobre la resina de quelación de metales de His●Bind. Brevemente, las células sedimentadas obtenidas de un cultivo de 400 ml inducidas con IPTG se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,9) se sometieron a sonicación y se centrifugaron a 12.000 X g durante 20 min para eliminar los residuos. El sobrenadante se incubó con una resina de agarosa Ni-NTA (QIAgen) durante 45 minutos a 4 ºC. Los polipéptidos recombinantes de S. pyogenes eluyeron de la resina con una solución de imidazol 250 mM-NaCl 500 mM-Tris 20 mM, pH 7,9. La eliminación de la sal y el imidazol de las muestras se realizó mediante diálisis contra tampón PBS durante la noche a 4 ºC. La cantidad de polipéptido recombinante se estimó mediante MicroBCA (Pierce, Rockford, Ill.).
Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra la accesibilidad a los anticuerpos de los polipéptidos recombinantes de S. pyogenes en la superficie de las células intactas de estreptococos.
Las bacterias se cultivaron en caldo de Todd Hewitt (TH) )Difco Laboratories, Detroit, MI) con 0,5% de extracto de levadura (Difco Laboratories) y 1% de peptona (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37 ºC en una atmósfera de 8% de CO2 para dar una DO600 m de 0,600 (# 109 UFC/ml). Las diluciones de sueros anti-SHB-GAS-102, anti-SHB-GAS-103, anti-SHB-GAS-104 o control se añadieron después y se dejó que se unieran a las células, que se incubaron durante 2 horas a 4 ºC. Las muestras se lavaron 2 veces en tampón de bloqueo [solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 2% de seroalbúmina bovina (BSA)] y, después, se añadieron 0,5 ml de IgG + IgM anti-ratón de cabra conjugada con fluoresceína (FITC) diluida en tampón de bloqueo. Tras una incubación adicional de 60 minutos a temperatura ambiente, las muestras se lavaron 2 veces en tampón de bloqueo y se fijaron con 0,3 % de formaldehído en tampón PBS durante 18-24 horas a 4ºC. Las células se mantuvieron en oscuridad a 4ºC hasta que se analizaron mediante citometría de flujo (Epics® XL; Beckman Coulter, Inc.). Se analizaron diez mil células intactas de S. pyogenes por muestra.
Ejemplo 8
Este ejemplo ilustra la protección contra la infección producida por S. pyogenes inducida mediante inmunización pasiva de los ratones con sueros de conejo hiperinmunes.
Conejos New Zealand (Charles River) se inmunizaron por vía subcutánea tres veces a intervalos de 3 semanas en múltiples sitios con 100 μg de la proteína SHB-GAS-102 recombinante marcada con His en presencia de adyuvante incompleto de Freund (Gibco-BRL). Las muestras de sangre se recibieron tres semanas después de la tercera inyección. Los anticuerpos presentes en el suero se purificaron parcialmente mediante precipitación usando una solución al 40% de sulfato amónico saturado. Grupos de 6 ratones Balb/c hembra (Charles River) se inyectaron por vía intravenosa con 500 μl de suero purificado parcialmente recogidos de un conejo inmunizado con la proteína SHB-GAS-102 recombinante o un conejo inmunizado con una proteína recombinante control no relacionada. Dieciocho horas después se expuso a los ratones a aproximadamente 2x107 UFC de la cepa de tipo 3 de S. pyogenes ATCC12384. Las muestras del inóculo de exposición de S. pyogenes se sembraron en placas de agar sangre para determinar las UFC y para verificar la dosis de exposición. Las muertes se registraron durante un
5 periodo de 8 días.
Como se presenta en la Tabla 4, el 67% (4/6) de los ratones inmunizados con suero parcialmente purificado recogido de conejos inmunizados con la proteína SHB-GAS-102 recombinante se protegieron contra una exposición letal. Por el contrario, la inmunización de ratones con suero recogido de conejos inmunizados con una proteína irrelevante no confirió dicha protección (Tabla 4).
10 Tabla 4. Capacidad de los anticuerpos específicos de SHB-GAS-102 para provocar una protección pasiva contra la cepa ATCC12384 (M3) de S. pyogenes
- Grupo
- Nº de ratones supervivientes % de supervivencia
- Anticuerpos específicos de SHB-GAS-102
- 4/6 67 %
- Anticuerpos específicos de la proteína no relacionada
- 0/6 0 %
Ejemplo 9
Este ejemplo ilustra la protección de los ratones contra la infección mortal producida por S. pyogenes inducida 15 mediante inmunización con polipéptidos recombinantes.
Grupos de ratones hembra BALB/c (Charles River) se inmunizaron por vía subcutánea tres veces a intervalos de dos semanas con 20 !g de polipéptidos recombinantes SHB-GAS-102, SHB-GAS-103, or SHB-GAS-104 marcados con His purificados por afinidad en presencia de 10 ug de adyuvante QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) o, como control, con adyuvante QuilA solo en PBS o con 20 !g de polipéptido irrelevante en presencia de
20 QuilA. Las muestras de sangre se recogieron del seno orbital los días 1, 14 y 28, antes de cada inmunización y 14 días (día 42) tras la tercera inyección. Una semana después se expuso a los ratones a aproximadamente 4-8x106 UFC de la cepa de tipo 3 de S. pyogenes ATCC12384. Las muestras del inóculo de exposición de S. pyogenes se sembraron en placas de agar sangre para determinar las UFC y para verificar la dosis de exposición. Las muertes se registraron durante un periodo de 7 días.
25 Como se presenta en la Tabla 5, más del 83% (10/12) de los ratones inmunizados con el polipéptido SHB-GAS-102 se protegieron contra una exposición letal. Los ratones inmunizados con SHB-GAS-103 y SHB-GAS-104 también se protegieron contra una exposición letal (7/12). Por el contrario, la inmunización de ratones solo con adyuvantes o con una proteína irrelevante no confirió dicha protección (Tabla 5).
Tabla 5. Capacidad de los polipéptidos SHB-GAS-102, SHB-GAS-103 y SHB-GAS-104 recombinantes para 30 provocar protección contra la cepa ATCC12384 (M3) de S. pyogenes
- Grupos
- Nº de ratones supervivientes % de supervivencia
- 20 μg del polipéptido SHB-GAS-102 + 10 μg de QuilA
- 10/12 83
- 20 μg del polipéptido SHB-GAS-103 + 10 μg de QuilA
- 7/12 58
- 20 μg del polipéptido SHB-GAS-104 + 10 μg de QuilA
- 7/12 58
- 20 μg del polipéptido irrelevante + 10 μg de QuilA
- 2/12 17
- 810 μg de QuilA en PBS
- 3/12 25
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Una composición farmacéutica que comprende:(a) un polipéptido seleccionado de (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2; y (ii) un polipéptido5 que comprende un fragmento polipeptídico inmunógeno constituido por al menos 10 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2,siendo el polipéptido capaz de aumentar los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2 y siendo el polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pyogenes, y10 (b) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable,siendo la composición farmacéutica para usar en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección por Streptococcus pyogenes.
- 2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2.15 3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el polipéptido carece del residuo de metionina en el extremo N.
-
- 4.
- La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo la composición además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
-
- 5.
- La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en la que el
20 polipéptido se ha producido de forma recombinante mediante un procedimiento que comprende cultivar una célula huésped transfectada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido, estando el polinucleótido unido operativamente a una región de control de la expresión. - 6. Una composición farmacéutica que comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido constituido porconstituido por la secuencia expuesta en la Figura25 2, siendo el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de proteger a un huésped de una infección por Streptococcus pyogenes; y (b) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para usar en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección por Streptococcus pyogenes.
- 7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o anticuerpo policlonal.30 8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo murino, de rata o humano.
-
- 9.
- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es recombinante.
-
- 10.
- Una composición farmacéutica que comprende (a) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y (b)
35 un polipéptido quimérico que comprende dos o más fragmentos del polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2, en el que los dos o más fragmentos constan cada uno de ellos de al menos 10 aminoácidos contiguos de la Figura 2 y en el que los dos o más fragmentos están unidos formando un polipéptido quimérico, siendo el polipéptido quimérico capaz de aumentar los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2, y siendo40 el polipéptido quimérico capaz de producir una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pyogenes, para usar en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección por Streptococcus pyogenes. -
- 11.
- La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
-
- 12.
- Uso de la composición farmacéutica seleccionada del grupo constituido por:
45 (a) una composición farmacéutica que comprende:- (i)
- un polipéptido seleccionado de (A) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2;
- (B)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2; y (C) un
polipéptido que comprende un fragmento polipeptídico inmunógeno constituido por al menos 10 50 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2,siendo el polipéptido es capaz de aumentar los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2 y siendo el polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pyogenes, y(ii) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable;(b) una composición farmacéutica que comprende (i) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del5 mismo, que se une específicamente a un polipéptido constituido por la secuencia expuesta en la Figura 2, siendo el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de proteger a un huésped de una infección por Streptococcus pyogenes; y (ii) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable; y(c) una composición farmacéutica que comprende (i) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y (ii) un polipéptido quimérico que comprende dos o más fragmentos del polipéptido constituido 10 por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2, en el que los dos o más fragmentos constan cada uno de ellos de al menos 10 aminoácidos contiguos de la Figura 2 y en el que los dos o más fragmentos están unidos formando un polipéptido quimérico, siendo el polipéptido quimérico capaz de aumentar los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2, y siendo el polipéptido quimérico capaz de producir una respuesta15 inmunitaria contra Streptococcus pyogenes.en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus pyogenes. - 13. Un procedimiento para el diagnóstico de infección por Streptococcus pyogenes en un huésped propenso a sufrir una infección por Streptococcus pyogenes, que comprende:20 (a) incubar una muestra biológica obtenida previamente del huésped con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, reactivo con un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2, para formar una mezcla; y(b) detectar anticuerpo unido específicamente o fragmento de unión a antígeno unido en la mezcla que indique la presencia de S. pyogenes en el huésped.25 14. Un procedimiento para detectar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de S. pyogenes, comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 2, en una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene dicho anticuerpo, que comprende:a) incubar la muestra biológica con el polipéptido, para formar una mezcla; yb) detectar el polipéptido unido específicamente en la mezcla, lo que indica la presencia del anticuerpo en 30 la muestra.Figura 20Figura 21Figura 22(SEC ID Nº: 36) Figura 23Figura 24Figura 25Figura 2615 (SEC ID Nº: 40)Figura 33
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