ES2425997A1 - Biocatalizador con actividad nucléosido desoxirribosiltransferasa inmovilizado sobre partículas magnéticas de quitosano - Google Patents

Abstract

Biocatalizador con actividad nucléosido desoxirribosiltransferasa inmovilizado sobre partículas magnéticas de quitosano. La invención se refiere a un nuevo biocatalizador basado en la inmovilización covalente de la nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa de Lactobacillus reuteri en partículas magnéticas obtenidas a partir de quitosano y Fe3O4 (magnetita). Asimismo, la invención se refiere al procedimiento para elaborar dicho biocatalizador y al procedimiento para utilizarlo en la síntesis de distintos nucleósidos de interés terapéutico como ara-A, ara-C, 2'-fluoro-2'-desoxiadenosina y 2'-fluoro-2'-desoxicitidina.

Description

Biocatalizador conYactividad nucléosido desoxirribosiltransferasa inmovilizado

sobre partículas magnéticas de quitosano.

Sector de la técnica La presente invención se encuadra en el sector de la Biotecnología. Más concretamente, se refiere a la síntesis de nucleósidos naturales y no naturales con actividad terapéutica mediante métodos biotecnológicos. Dicha síntesis se puede realizar mediante la utilización de un nuevo biocatalizador enzimático, cuya preparación incluye la inmovilización covalente de la nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa en partículas magnéticas obtenidas a partir de quitosano y Fe304 (magnetita).

Estado de la técnica Los nucleósidos modificados son moléculas de gran interés en la industria farmacéutica ya que presentan actividad antiviral y antitumoral, y pueden ser utilizados como sustratos de partida en la síntesis de oligonuc1eótidos antisentido [Robak T. et al., Purine nucleoside analogs as immunosuppressive and antineoplastic agents: mechanism of action and, clinical activity. Curro Med. Chem. 13, 3165-3189, 2006; de Clercq E. Highlights in the discovery ofantiviral drugs: a personal retrospective. J. Med. Chem. 53, 1438-1450,2010]. Los efectos adversos de los análogos de nucleósidos disponibles en la actualidad, así como la aparición de resistencias debido a su utilización prolongada, ha suscitado el interés por el desarrollo de nuevos análogos de nucleósidos con propiedades terapéuticas mejoradas. Estos análogos tradicionalmente se han sintetizado mediante métodos químicos que suponen con frecuencia muchas etapas de protección y desprotección de grupos funcionales, tanto en la base como en el azúcar del nucleósido natural de partida. En este sentido, cualquier proceso enzimático de síntesis de dichos análogos de nuc1eósidos es una alternativa interesante al proceso químico descrito, ya que supondría una tecnología respetuosa con el medio ambiente, utilizando enzimas como biocatalizadores con una elevada enantioespecificidad y regioselectividad en condiciones muy suaves de reacción [Lewkowicz E.S., Iribarren A.M., Nucleoside phosphorylases. Curro Org. Chem. 10, 11971215,2006; Li N. et al., Biocatalytic transformation ofnucleoside derivatives. Biotechnol. Adv. 28, 348-366, 2010; Mikhailopulo I.A. Biotechnology of nucleic acid constituents: state of the art and perspectives. Curro Org. Chem. 11, 317-333, 2007]. Para la síntesis enzimática de nucleósidos se pueden utilizar nuc1eósido fosforilasas o nucleósido desoxirribosiltransferasas, enzimas procedentes de microorganismos que catalizan la reacción de transferencia de residuos glicosilados a bases nitrogenadas aceptoras. A diferencia de las nucleósido fosforilasas, las nucleósido desoxirribosiltransferasas (EC 2.4.2.6) presentan como ventaja su capacidad de catalizar, en el mismo proceso enzimático, la ruptura del enlace glucosídico de un desoxirribonucleósido y la posterior transferencia del resto glicosilado a una base púrica o pirimidínica que actúa como aceptor. Dicha reacción enzimática es regioselectiva (ya que la transferencia ocurre en la posición N-1 de la base pirimidínica o en la posición N-9 de la base púrica) y enantioselectiva (ya que sólo se sintetizan los anómeros con conformación ~). A diferencia de las purina desoxirribosiltransferasas (PDTs) que catalizan exclusivamente la transferencia de la 2'desoxirribosa entre bases púricas, las nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasas (NDTs) son capaces de catalizar dicha transferencia entre bases púricas y/o pirimidínicas [Kaminsiki

P.A. Functional cloning, heterologous expression, and purification of two different Ndeoxyribosyltransferases from Lactobacillus helveticus. J. BioI. Chem. 277, 14400-14407, 2002]. Desde un punto de vista industrial, las transglicosilaciones en un solo paso catalizadas por las NDTs son más ventajosas que las basadas en la utilización de fosforilasas microbianas ya que, estas últimas, requieren la participación de una purina nucleósido fosforilasa y una pirimidina nucleósido fosforilasa [Lewkowicz E.S., Iribarren A.M., Nucleoside phosphorylases. Curro Org. Chem. 10, 1197-1215,2006]. Las principales NDTs bacterianas descritas para estos procesos proceden de Lactobacillus fermentum, Lactobacillus leichmannii [Kaminsiki P.A. et al., In vivo reshaping the catalytic site of nucleoside 2'-deoxyribosyltransferase for dideoxy-and didehydronucleosides via a single amino acid substitution J. BioI. Chem. 283, 20053-20059, 2008], Lactobacillus helveticus [Kaminsiki P.A. Functional cloning, heterologous expression, and purification of two different N-deoxyribosyltransferases from Lactobacillus helveticus. J. BioI. Chem. 277, 14400-14407,2002], Lactobacillus reuteri [Femández-Lucas J. et al., Lactobacillus reuteri 2'-deoxyribosyltransferase, a novel biocatalyst for tailoring of nucleosides. AppI. Environ. MicrobioI. 76, 1462-1470, 2010], y Lactococcus lactis subsp. lactis [Miyamoto et al., Characterization of N-deoxyribosyltransferase from Lactococcus lactis subsp. lactis. Biochim. Biophys. Acta 1774, 1323-1330,2007].

La clonación e hiperexpresión del gen ndt que codifica la nucléosido 2'desoxirribosiltransferasa de Lactobacillus reuteri ha permitido la caracterización funcional

y estructural de la enzima ,()oluble, así como poner de manifiesto su potencial como biocatalizador en la síntesis de diferentes nucleósidos naturales y no naturales de interés terapéutico. Además, esta nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa presenta una actividad inesperada para este tipo de enzimas, que consiste en su capacidad para sintetizar arabinonucleósidos, capacidad que no comparte con las otras enzimas nucléosido 2'desoxirribosiltransferasa conocidas [Femández-Lucas J. et al., Lactobacillus reuteri 2'deoxyribosyltransferase, a novel biocatalyst for tailoring of nucleosides. Appl. Environ. Microbiol. 76, 1462-1470,2010]. Sin embargo, la inmovilización de la NDT de L. reuteri es un requisito previo fundamental para que un posible proceso industrial de síntesis enzimática de nucleósidos sea factible económicamente ya que permitiría su reutilización en múltiples ciclos así como su estabilización en un amplio rango de condiciones experimentales. En la literatura científica sólo aparecen descritos dos biocatalizadores inmovilizados a partir de nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasas. El primero está preparado a partir de la enzima nativa y semipurificada de Lactobacillus leichmannii inmovilizada sobre un copolímero sintético [Hicks N., Hutchinson D.W. Synthesis of nucleoside analogs using immobilized N-deoxyribosyltransferases. Biocatalysis 11, 1-7, 1994] y, como ya se ha comentado, no presenta actividad arabinosiltransferasa, mientras que el segundo está preparado con la enzima recombinante pura de L. reuteri unida covalentemente al soporte comercial Sepabeads® [Femández-Lucas J. et al., Enzymatic synthesis of nucleoside analogues using immobilized 2'-deoxyribosyltransferase from Lactobacillus reuteri. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91, 317-327, 2011]. En este segundo caso, al ser inmovilizada, la enzima pierde su capacidad para sintetizar arabinosilnucleósidos, y los autores del trabajo especulan sobre la posibilidad de que esa pérdida de actividad se deba a la unión de tipo covalente que tiene lugar para la inmovilización.

Explicación de la invención La presente invención se refiere a un biocatalizador que comprende la enzima nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa inmovilizada en un soporte biodegradable que incluye partículas magnéticas obtenidas a partir de quitosano y Fe304 (magnetita). En la inmovilización de enzimas, los soportes biodegradables presentan la ventaja de ser menos contaminantes que los soportes sintéticos. Esta característica, unida al hecho de que la reacción catalizada por la enzima inmovilizada transcurre en condiciones suaves y en medio acuoso de reacción, permite la obtención de nucleósidos de interés terapéutico a través de un proceso biosostenible. En una realización de la invención la enzima es de origen procariota y, preferentemente, es la nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa de Lactobacillus reuteri (LrNDT), caracterizada por SEQ ID NO: 2. La invención también incluye biocatalizadores que tienen inmovilizados polipéptidos con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 2 y que conservan la actividad nucleósido 2'desoxirribosiltransferasa. Se entiende por "porcentaje de identidad" de la secuencia aminoacídica el porcentaje de coincidencias de los mismos aminoácidos entre dos secuencias alineadas, a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias.

La enzima nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa se puede obtener recombinante mediante la expresión del gen ndt de L. reuteri, caracterizado por SEQ ID NO: 1, en una bacteria fácilmente manipulable como, por ejemplo, Escherichia coli. La enzima recombinante se puede obtener, así mismo, partiendo de secuencias con, al menos, un 70% de identidad con el gen ndt, cuya expresión da lugar a polipéptidos que conservan la actividad nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa, entendiendo por "porcentaje de identidad" de la secuencia el porcentaje de coincidencias de los mismos nucleótidos entre dos secuencias alineadas, a lo largo de toda la longitud de ambas secuencias.

Así mismo, la presente invención se refiere al procedimiento de preparación de dicho biocatalizador. El gen ndt de L. reuteri, caracterizado por SEQ ID NO: 1, que codifica la nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa, caracterizada por SEQ ID NO: 2, o secuencias nucleotídicas con, al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1 y cuya expresión da lugar a polipéptidos que conservan la actividad nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa, se pueden clonar en un vehículo de expresión procariota que, insertado en una bacteria de fácil manipulación en el laboratorio, como Escherichia coli, permite la hiperexpresión y purificación a homogeneidad de la proteína. Una vez purificada la proteína, se une a partículas magnéticas que comprenden magnetita atrapada en quitosano. Este tipo de partículas magnéticas ha sido utilizado para la inmovilización de determinadas enzimas y para su posterior utilización como biocatalizadores (CN101748113A, CN1904043A, CNI01270352A). La obtención de las partículas magnéticas para la inmovilización enzimática se divide en tres fases, explicadas con más detalle en los ejemplos:

(a)

el atrapamiento de la magnetita en la matriz polimérica del quitosano. Para ello, se prepara una solución de quitosano (1-3%) en ácido acético diluido (0,5-3%), en la que se dispersa homogéneamente una cantidad variable de magnetita que puede estar comprendida entre el 25% y el 50% con respecto al quitosano. La suspensión resultante se añade mediante goteo sobre una solución de NaOH permitiendo la obtención de unas primeras partículas que se mantienen en agitación durante 0,5-3 horas en la mencionada solución de sosa.

(b)

el entrecruzamiento de las cadenas poliméricas del quitosano, lo que permite una estabilización de las partículas y el mantenimiento permanente de la magnetita atrapada en el quitosano. Este proceso se consigue mediante incubación de las partículas de la fase anterior, una vez lavadas con agua destilada, en una solución que incluya un agente entrecruzante. Dicho agente entrecruzante puede ser, por ejemplo, epiclorhidrina (2-5% a 50°C) o glutaraldehído (0,0025-2,5%, a 25°C).

(c)

la activación de las partículas magnéticas, que favorece la formación de enlaces covalentes de tipo base de Schiff con los grupos €-amino de las lisinas situadas en la superficie de la enzima. Para ello, se incuban las partículas de la etapa anterior, y lavadas con agua destilada, en una solución tamponada de glutaraldehído (al 2,5% preferentemente) a 25°C. Si el quitosano ha sido entrecruzado con glutaraldehído al 1-2,5% en la fase anterior, no es necesaria esta etapa ya que el soporte se encontraría ya activado.

Para obtener el biocatalizador inmovilizado, se realiza un cuarto paso:

(d) la unión de la enzima nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa. Se consigue poniendo en contacto la enzima purificada con las partículas magnéticas de quitosano funcionalizadas con grupos aldehído. Para ello, una cantidad variable de enzima (11-70 ¡..tg) se pone en contacto con las partículas magnéticas (17-50 mg) en un tampón fosfato de pH 7,0 durante 2-5 horas a temperatura ambiente.

Tal y como aparece descrito en los ejemplos de la presente memoria descriptiva, el biocatalizador obtenido es eficaz en la síntesis de distintos nucleósidos naturales y no naturales y, dentro de estos últimos, arabinosil-nucleósidos como el arabinósido de adenina (ara-A) y arabinósido de citosina (ara-C), así como diferentes 2'-fluoro-2'desoxiribonucleósidos como la 2 '-fluoro-2'-desoxiadenosina y la 2'-fluoro-2'desoxicitidina (Figura 1). El arabinósido de adenina (ara-A), también conocido como vidarabina, es un fármaco indicado en el tratamiento de la queratoconjuntivitis aguda y queratitis epitelial recurrente causada por los virus del herpes simple tipos 1 y 2 [Superti,

M.G. et al. New advances in anti-HSV chemotherapy. Curro Med. Chem. 15, 900-911, 2008].

El ara-A obtenido sirve, además, como intermediario en la síntesis de la fludarabina (2Fara-A) y su fosfato (Fludara®), análogo utilizado como fármaco antineoplásico en el tratamiento de la leucemia 'linfocítica crónica y en terapias de rescate para linfoma no Hodgkin y leucemias agudas [Robak T. et al., Purine nucleoside analogs as immunosuppressive and antineoplastic agents: mechanism of action and, clinical activity. Curro Med. Chem. 13, 3165-3189, 2006]. A partir de ara-A se puede obtener otro arabinosil-nucleósido de interés como la clofarabina (2-cloro-2'-arabino-fluoro-2'deoxiadenosina, CAFdA, Cl-F-ara-A), recientemente aprobado para tratar leucemias en pacientes pediátricos (Clolar®, Evolta®) [Zhenchuk A. et al. Mechanisms of anti-cancer action and pharmacology of clofarabine. Biochem Pharmacol 78, 1351-1359, 2009]. En cuanto al arabinósido de citosina (ara-C), conocido como citarabina, ha sido el agente terapéutico utilizado desde finales de la década de 1950 para el tratamiento de la leucemia linfoide aguda [Robak T, Wierbowska A. Current and emerging therapies for acute myeloid leukemia. Clin. Ther. 31,2349-2370, 2009]. Otro de los compuestos sintetizados por la enzima inmovilizada es la 2'-fluoro-2' -desoxicitidina, nucleósido sintético que exhibe una actividad antiviral muy potente frente a la replicación del virus Borna, sin presentar prácticamente citotoxicidad [Bajramovic J.1. et al. 2'-Fluoro-2'-deoxycytidine inhibits Borna disease virus replication and spread. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 1422-1425,2004].

Otro aspecto de la invención, por lo tanto, se refiere al método para sintetizar nucleósidos naturales y/o no naturales mediante la utilización del biocatalizador inmovilizado de la presente invención a través de una reacción enzimática de transferencia, entre un nucleósido donador de residuos glicosilados (que contiene una base púrica y/o pirimidínica) y una base nitrogenada aceptora de residuos glicosilados. De este modo, y empleando dicho biocatalizador, se puede sintetizar enzimáticamente en un solo paso nucleósidos como los que se indican a continuación (Figura 1): 2'-desoxiadenosina a partir

de 2'-desoxiuridina y adenina, ara-C a partir de ara-U y citosina, ara-A a partir de ara-U y adenina, 2'-fluoro-2'-desoxicitidina a partir de 2'-fluoro-2'-desoxiuridina y citosina, y 2' fluoro-2'-adenosina a partir de 2'-fluoro-2'-desoxiuridina y adenina. La síntesis de dichos compuestos se describe con mayor detalle en los ejemplos que se dan posteriormente. El biocatalizador permite realizar dichas reacciones de transferencia a distintas temperaturas (20-80° C) y diferentes valores de pH (4,5-8,5), Y con agitación de tipo orbital o magnética. En una realización preferida de la invención, las condiciones que se utilizan son 40°C y pH 6,5 en las cuales la enzima inmovilizada presenta una mayor termoestabilidad. Tras completar la reacción de transferencia, la separación del biocatalizador es sencilla (por ejemplo, mediante filtración, aplicación de un campo magnético, decantación o centrifugación), y permite que el mismo biocatalizador se reutilice en ciclos sucesivos de reacción.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. Estructuras químicas de varios nucleósidos no naturales descritos en la presente patente.

Figura 2. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la LrNDT inmovilizada en partículas magnéticas de quitosano. Se midió la actividad estándar del biocatalizador inmovilizado a las diferentes temperaturas indicadas.

Figura 3. Desactivación térmica de la LrNDT inmovilizada en partículas magnéticas de quitosano a 40 oC (O) y 60 oC (e). Se midió la actividad estándar del biocatalizador inmovilizado después de su incubación en tampón MES pH 6,5 a los distintos tiempos de incubación y temperaturas indicados.

Modo de realización de la invención Habiendo descrito la presente invención, se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1. Producción y purificación de la enzima LrNDT La enzima se produjo y se purificó a homogeneidad siguiendo el protocolo descrito por Fernández-Lucas et al. [Fernández-Lucas J. et al., Lactobacillus reuteri 2' deoxyribosyltransferase, a novel biocatalyst for tailoring of nucleosides. Appl. Environ.

Microbiol. 76, 1462-1470,2010] Y utilizando para ello la cepa de E. coli CECT 7435, que contiene el plásmido pT28ndt, que produce la proteína con actividad enzimática nuc1eótido 2'-desoxirribosiltransferasa recombinante de Lactobacillus reuteri (LrNDT), caracterizada por SEQ ID NO: 2 [Fernández-Lucas J. et al., Lactobacillus reuteri 2'deoxyribosyltransferase, a novel biocatalyst for tailoring of nucleosides. Appl. Environ. Microbiol. 76, 1462-1470,2010]. Para ello, E. coli CECT 7435 se incubó a 37°C en medio líquido LB al que se había añadido kanamicina (50 ~g/l). Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica de 0,8 a 600nm (D0600), se indujo la expresión del gen ndt mediante la adición de 0,4 mM IPTG (isopropil-f3-D-tiogalactósido) y se mantuvo durante 2,5 horas. A continuación, se recogieron las células por centrifugación a 3500 xg durante 15 minutos, se re suspendieron en tampón fosfato potásico 10mM, pH 7 (tampón A) y se lisaron mediante sonicación. La proteína se purificó por cromatografía utilizando cartuchos Econo-Pac High Q (Bio-Rad) equilibrados con tampón A. La columna se lavó con el mismo tampón A y la proteína se eluyó en un gradiente linear de Oa 0,5 M NaCI en tampón A. Se juntaron las fracciones que contenían la nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa realizando el correspondiente perfil cromatográfico de proteína a 280 nm, junto con un control electroforético en geles de poliacrilamida al 12,5% en presencia de SDS (SDS-PAGE) [Laemmli U.K. Claveage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685, 1970] para comprobar que cada una de las fracciones seleccionadas contenía la enzima parcialmente purificada. Una vez juntadas las fracciones, y comprobada la actividad nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa, se concentraron empleando polietilen glicol 35000 (Sigma), para realizar posteriormente una cromatografía de penetrabilidad en una columna Superose 12 Fast Flow (Amersham Biosciences), equilibrada con tampón fosfato potásico 50mM a pH 7 (tampón B). Se realizó el correspondiente perfil cromatográfico de proteína a 280 nm, junto con un control electroforético, para comprobar que cada una de las fracciones seleccionadas contenía la enzima pura a homogeneidad. Finalmente, las fracciones que contenían la enzima pura se juntaron en un mismo volumen final, y se comprobó la actividad nucleósido 2'desoxirribosiltransferasa de dicho volumen, así como su concentración de proteína mediante el método colorimétrico de Bradford [Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principIe of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72,248-252, 1976].

Ejemplo 2. Producción de las partículas magnéticas Las partículas magnéticas se obtuvieron a partir de un quitosano suministrado por la casa comercial Primex (Islandia) con un peso molecular de 644 kDa y un grado de desacetilación del 90%, y magnetita (Fe304) suministrada por la casa Sigma. La preparación de las partículas magnéticas de quitosano, y su posterior activación con el fin de favorecer la unión covalente de la enzima, se detallan a continuación. A 10 mL de solución de quitosano al 3% (P/v) en ácido acético al 2% (v/v), se le añadieron 150 mg de magnetita (50% p/p respecto al polímero), y posteriormente se dejó agitar a temperatura ambiente hasta que se consiguió la dispersión total de la magnetita en la solución de quitosano. A continuación, se añadieron 3 mL de la suspensión resultante mediante goteo a una solución de NaOH 2M (50 mL). Las partículas formadas (de aproximadamente l.5 mm de diámetro) se mantuvieron en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. Transcurrido este tiempo, las partículas se recogieron mediante filtrado en placa de vidrio poroso y se lavaron dos veces con 50 mL de agua destilada sobre la misma placa. A continuación, se procedió al reticulado del quitosano con el fin de aumentar su estabilidad física y química. Para ello, se dispusieron 2,5 g de partículas en 25 mL de una solución de epiclorhidrina (Sigma) al 2% (v/v) disuelta en NaOH 1M. Transcurridas 2 horas de incubación a 50°C y 200 r.p.m. de agitación en la solución de epiclorhidrina, las partículas reticuladas se filtraron en placa de vidrio poroso y posteriormente se incubaron en 50 mL de etanol frío (80% v/v) durante 30 minutos a 4° C con el fin de eliminar restos de epiclorhidrina. Tras retirar el etanol, se procedió a lavar las partículas magnéticas con 50 mL de agua destilada sobre la placa de vidrio poroso con el fin de eliminar los restos de alcohol y otras impurezas. Una vez preparadas, las partículas se activaron con glutaraldehído de tal manera que uno de sus dos grupos aldehído se unió a los grupos amino del quitosano, mientras que el otro quedó libre para unir mediante enlace covalente

moléculas de enzima a través de sus grupos E-amino de la cadena lateral de los restos de lisina presentes en su superficie. Dicha activación se realizó de la siguiente manera: 1 g de partículas magnéticas de quitosano se sumergió en 4 mL de una solución de glutaraldehído (Sigma) al 2,5% (v/v) en tampón fosfato potásico 0.1 M pH 7,0, Y se dejó en agitación en dicha solución durante 2 horas a 25°C. Una vez transcurrido este tiempo de activación, las partículas se filtraron sobre placa de vidrio poroso y se lavaron tres veces con 10 mL de agua destilada sobre la misma placa con el fin de eliminar restos de glutaraldehído.

Ejemplo 3. Inmovilización de la enzima LrNDT en las partículas magnéticas de quitosano Se utilizaron las partículas magnéticas de quitosano obtenidas en el ejemplo 2 para la inmovilización de la LrNDT purificada como se describe en el ejemplo 1. En este sentido, se adicionaron 50 mg de partículas magnéticas de quitosano a 170 ¡..tL de una solución de LrNDT (0,4 mg/mL) en tampón fosfato potásico 100 mM pH 7,0 Y se mantuvieron en agitación orbital de 350 r.p.m. durante 5 horas a 25°C. Finalmente, las partículas se lavaron 5 veces con 500 Jll de tampón fosfato potásico 10 mM pH 7,0, retirando el volumen de lavado después de 5 minutos de contacto. En estas condiciones de inmovilización, se consiguió unir prácticamente toda la enzima al soporte, hecho que se determinó al comprobar que la enzima estaba ausente en los tampones de filtrado y lavado. La eficacia de unión de la enzima LrNDT al soporte se determinó valorando la presencia de proteína mediante el método de Bradford [Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principIe of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-252, 1976] en cada uno de los tampones de filtrado y lavado utilizados. Finalmente, el biocatalizador obtenido se puede mantener a 4°C hasta su utilización en la síntesis de los distintos nucleósidos.

Ejemplo 4. Preparación de diferentes nucleósidos catalizada por la enzIma LrNDT inmovilizada en partículas magnéticas de quitosano. A continuación, se incluyen varios ejemplos del procedimiento para la síntesis de diferentes nucleósidos mediante el empleo como biocatalizador de la LrNDT inmovilizada en las partículas magnéticas de quitosano. En los diferentes ejemplos que se presentan, los productos de reacción se pueden cuantificar mediante HPLC utilizando las siguientes condiciones: columna ACE 5 C18-PFP (250 x 4,6 mm); fase móvil: (1) gradiente lineal durante 10 minutos de acetato de trimetilamonio 0.1 M hasta alcanzar 90/10 (v/v) acetato de trimetilamonio 0.1 M /acetonitrilo, (2) 10 minutos con 90/10 (v/v) acetato de trimetilamonio 0.1 M /acetonitrilo. El flujo se fija a 1 ml/min (180 bares de presión) y el detector UV se ajusta a 260 nm. En estas condiciones, los tiempos de retención de las bases y nucleósidos detectados son: adenina (Ade), 10.14 min; uracilo (Ura), 5.41 min; citosina (Cyt), 4.14 min; 2'-desoxiadenosina (dAdo), 15.50 min; 2'-desoxiuridina (dUrd), 9.16 min; 2'-desoxicitidina (dCyd), 8.22 min; 2'-fluoro-2'-desoxiuridina (2'-FdUrd), 10.3 min; 2'fluoro-2' -desoxiadenosina (2' -FdAde): 16.07 min; 2'-fluoro-2' -desoxicitidina (2' -FdCyd),

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8.7 min; ara-Uracilo (ara U), 8.68; ara-Adenina (ara-A): 13.9 min; ara-Citosina (ara-C): 7.78 mino

Síntesis de 2'-desoxiadenosina (medida de actividad estándar) Antes de utilizar el biocatalizador para la síntesis de otros nucleósidos no naturales, se determinó su actividad en una reacción estándar de síntesis de 2'-desoxiadenosina a partir de 2'-desoxiuridina y adenina. Para ello, se añadieron 17 mg de biocatalizador inmovilizado (que contenían 11.7 ¡..tg de LrNDT inmovilizada) a 174 ¡..tL de una solución de 2'-desoxiuridina 16 mM y adenina 16 mM en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico) 50 mM pH 6.5. La reacción se mantuvo en agitación a 40°C y 350 r.p.m. durante 10 minutos. Una vez finalizado el tiempo de reacción, se tomó un alícuota de 50 ¡..tL del medio de reacción a la cual se añadió 50 ¡..tL de etanol frío a 4°C. La mezcla se calentó a 95°C durante 5 minutos y, tras su posterior centrifugación a 9.000xg durante 2 minutos, se procedió a analizar cuantitativamente los productos de síntesis (2'desoxiadenosina y uracilo), localizados en el sobrenadante, mediante HPLC. En estas condiciones de reacción, una unidad internacional de actividad (UI) se define como la cantidad de biocatalizador que produce 1 ¡..tmol de 2'-desoxiadenosina por minuto. Atendiendo a lo indicado anteriormente, la enzima inmovilizada poseía una actividad de

3.14 UIIg de biocatalizador. Empleando la misma reacción estándar, se determinó la temperatura a la cual la enzima inmovilizada presenta una mayor actividad. De esta manera, la LrNDT inmovilizada en las partículas de quitosano magnético presenta una actividad máxima a 60°C y pH 6.5 (4.57 UIIg, Figura 2), veinte grados superior a la que presenta la enzima soluble [que se describe en J. Fernández-Lucas el al., Appl. Environ. Microbiol. 76, 1462 (2010)]. Este aumento en la estabilidad térmica de la enzima debido a la inmovilización, se comprobó también mediante la incubación a 40°C y 60°C del biocatalizador a diferentes tiempos de almacenamiento y posterior medida de su actividad residual mediante la reacción estándar. De esta manera, se constató que la enzima inmovilizada mantiene el 100% de su actividad después de su almacenamiento en un tampón fosfato 10 mM pH 7.0 a 40°C durante al menos 148 horas, mientras que a 60°C pierde el 50% de actividad al cabo de 60 horas de incubación (Figura 3). Finalmente, se comprobó que el biocatalizador inmovilizado se puede utilizar en sucesivas reacciones estándar durante al menos 40 ciclos, conservando el 100% de la actividad detectada en el primer ciclo de actividad.

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Síntesis de ara-C Para la síntesis de ara-C se procedió de la siguiente manera: se añadieron 32 mg de biocatalizador inmovilizado (con una actividad de 3.14 UI/g en la reacción estándar) a 350 f..tL de una solución de ara-U 0.5 mM y citosina 0.5 mM en tampón MES 50 mM pH 6.5. La reacción se mantuvo en agitación a 40°C y 350 r.p.m. en un intervalo comprendido entre O y 96 horas, alcanzando un rendimiento máximo del 17% a las 72 horas.

Síntesis de ara-A Para la síntesis de ara-A se procedió de la siguiente manera: se añadieron 32 mg de biocatalizador inmovilizado (con una actividad de 3.14 UI/g en la reacción estándar) a 350 f..tL de una solución de ara-U 0.5 mM y adenina 0.5 mM en tampón MES 50 mM pH 6.5. La reacción se mantuvo en agitación a 40°C y 350 r.p.m. en un intervalo comprendido entre O y 96 horas, alcanzando un rendimiento máximo del 14% a las 72 horas.

Síntesis de 2'-fluoro-2' -desoxicitidina Para la síntesis de 2'-fluoro-2' -desoxicitidina se procedió de la siguiente manera: se añadieron 32 mg de biocatalizador inmovilizado (con una actividad de 3.14 UIIg en la reacción estándar) a 350 f..tL de una solución de 2'-fluoro-2'-desoxiuridina 0.5 mM y citosina 0.5 mM en tampón MES 50 mM pH 6.5. La reacción se mantuvo en agitación a 40°C y 350 r.p.m. en un intervalo comprendido entre O y 72 horas, alcanzando un rendimiento máximo del 67% a las 24 horas.

Síntesis de 2'-fluoro-2' -desoxiadenosina Para la síntesis de 2'-fl uoro-2'-desoxiadenosina se procedió de la siguiente manera: se añadieron 32 mg de biocatalizador inmovilizado (con una actividad de 3.14 UIIg en la reacción estándar) a 350 f..tL de una solución de 2'-fluoro-2'-desoxiuridina 0.5 mM y adenina 0.5 mM en tampón MES 50 mM pH 6.5. La reacción se mantuvo en agitación a 40°C y 350 r.p.m. en un intervalo comprendido entre O y 72 horas, alcanzando un rendimiento máximo del 10% a las 24 horas.

Claims (18)

1. Reivindicaciones

   1.

   Biocatalizador inmovilizado que comprende la enzima nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa inmovilizada covalentemente en partículas sólidas elaboradas a partir de magnetita (Fe304) atrapada en quitosano.

2. 2.

   Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 1 en el que las partículas sólidas elaboradas a partir de magnetita (Fe304) atrapada en quitosano están activadas con glutaraldehído.

3. 3.

   Biocatalizador inmovilizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en que la nucleósido 2'-desoxirribosil-transferasa es de origen procariota.

4. 4.

   Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 3 en que la enzima inmovilizada es la nucleósido 2'-desoxirribosil-transferasa de Lactobacillus reuteri, caracterizada por SEQ ID NO: 2, o un polipéptido cuya secuencia tiene, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 2 y conserva su actividad nucleósido 2'-desoxirribosil-transferasa.

5. 5.

   Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 4 en que la nucleósido 2'desoxirribosil-transferasa es una enzima recombinante.

6. 6.

   Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 5 en que la nucleósido 2'desoxirribosil-transferasa recombinante procede de la expresión del gen ndt de L. reuteri, caracterizado por SEQ ID NO: 1, o de una secuencia con, al menos, un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1, recombinante en Escherichia coli.

7. 7.

   Procedimiento para la preparación del biocatalizador inmovilizado definido en las reivindicaciones anteriores que comprende: (a) el atrapamiento de magnetita en una matriz polimérica de quitosano, (b) el entrecruzamiento de las cadenas poliméricas de quitosano,

   (c) la activación de las partículas magnéticas, (d) la unión de la enzima nucleósido 2'desoxirribosil-transferasa a las partículas magnéticas obtenidas en el paso (c).

8. 8.

   Procedimiento según la reivindicación 7 en el que el paso (a) incluye la preparación de una solución de quitosano al 3% en ácido acético en la que se dispersa homogéneamente un 25-50% de magnetita, con respecto a la cantidad de quitosano; la adición de la suspensión resultante a una solución de NaOH mediante goteo; y la agitación de las partículas obtenidas durante 0,5-3 horas en la solución de NaOH.

9. 9.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 en que el paso (b) se realiza con epiclorhidrina al 2-5% a 50°C.

10. 10.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en e! que e! paso (c) incluye la incubación de las partículas magnéticas en una solución tamponada de glutaraldehído a 25°C.

11. 11.

    Procedimiento según la reivindicación lOen que la concentración de glutaraldehído en solución tamponada es del 2,5%.

12. 12.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-11 en el que el paso (d) incluye poner en contacto 11-70 Ilg de nucleósido 2'-desoxirribosil-transferasa purificada con 17-50 mg de las partículas magnéticas del paso (c).

13. 13.

    Procedimiento según la reivindicación 12 en e! que la nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa se pone en contacto con las partículas magnéticas del paso (c) a pH 7 Y durante 2-5 horas a 25°C.

14. 14.

    Procedimiento para la producción de nucleósidos naturales y no naturales mediante una reacción enzimática de transglicosilación en un solo paso, entre un nucleósido donador de residuos glicosilados (que contiene una base púrica y/o pirimidínica) y una base nitrogenada aceptora de residuos glicosilados, que comprende e! uso del biocatalizador definido en las reivindicaciones 1-6.

15. 15.

    Procedimiento según la reivindicación 14 en que el residuo glicosilado de! nucleósido donador es p-D-arabinosa, 2'-desoxi-p-D-ribosa o 2'-fluoro-2'-desoxi-p-D-ribosa, y la base aceptora es citosina o adenina.

16. 16.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-15 en que la reacción se realiza a 40°C.

    5 17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-16 en que la reacción se realiza a pH 6,5.
17. 18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-17 en que, tras la conclusión de la reacción, el biocatalizador inmovilizado se separa de la mezcla de

    10 reacción mediante aplicación de un campo magnético, filtración, decantación o centrifugación, y es reutilizable en reacciones de transglicosilación sucesivas.
18. 19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-18 en que el nucleósido producido está incluido en el siguiente grupo: 2'-desoxiadenosina; arabinosil-nucleósidos

    15 como el arabinósido de adenina (ara-A) y el arabinósido de citosina (ara-C); 2'-fluoro-2'desoxiribonucleósidos como la 2'-fluoro-2' -desoxiadenosina y la 2'-fluoro-2' desoxicitidina.

    SEQUENCE LISTING

    <110> Universidad Complutense de Madrid

    <120> Biocatalizador con actividad nucleósido desoxriribosiltransferasa inmovilizado sobre partículas magnéticas de quitosano

    <130> 01_2012

    <160> 2

    <170> BiSSAP 1.0

    <210> 1

    <211> 483

    <212> DNA

    <213> Lactobacillus reuteri

    <220>

    <221> source

    <222> 1..483

    <223> /mol_type="DNA" /organism="Lactobacillus reuteri"

    <220>

    <221> CDS

    <222> 1..480

    <223> /transl_table=11

    /translation="MINQKSKTVYFCAGWFTDKQNKAYEDAMNAIKANPTVDVENSYVPLQHQYK

    GLRVDEHPELLQDREWSTATYNGDRVGVSTSDMLLAVYIPEEEDVGMGVELGMARALGKYIMVVI PDEDFGKPINLMSWGIADNFIKMSELPNDYFNKPSYNFYDGGVY"

    <400> 1 atgataaatc aaaaaagtaa gacagtatat ttctgtgccg ggtggtttac tgacaagcaa 60

    aataaagctt atgaggatgc aatgaatgca attaaggcta accctacagt agatgtagag 120

    aattcttatg tgccattaca acaccaatat aaaggattac gggttgatga acatccagag 180

    cttttgcaag atcgcgaatg gagtacagca acttacaatg gtgatcgagt aggcgtttca 240

    acttctgata tgcttttagc agtctacatt cctgaagaag aagatgtagg aatgggtgtt 300

    gaattaggaa tggcacgcgc actaggtaaa tatattatgg tagtgattcc tgatgaggac 360

    tttggtaaac caattaattt aatgagttgg ggaattgcag ataatttcat taaaatgtca 420

    gaacttccta atgattactt taataaacca tcttataatt tctacgatgg tggagtatat 480

    taa 483

    <210> 2

    <211> 160

    <212> PRT

    <213> Lactobacillus reuteri

    <220>

    <221> SOURCE

    <222> 1..160

    <223> /mol_type="protein" /note="[CDS]:1..480 from SEQ ID NO 1" /organism="Lactobacillus reuteri"

    <400> 2 Met Ile Asn Gln Lys Ser Lys Thr Val Tyr Phe Cys Ala Gly Trp Phe 15 10 15 Thr Asp Lys Gln Asn Lys Ala Tyr Glu Asp Ala Met Asn Ala Ile Lys

    20 25 30 Ala Asn Pro Thr Val Asp Val Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Gln His 35 40 45 Gln Tyr Lys Gly Leu Arg Val Asp Glu His Pro Glu Leu Leu Gln Asp

    50 55 60

    Arg Glu Trp Ser Thr Ala Thr Tyr Asn Gly Asp Arg Val Gly Val Ser

    65 70 75 80

    Thr Ser Asp Met Leu Leu Ala Val Tyr Ile Pro Glu Glu Glu Asp Val

    85 90 95 Gly Met Gly Val Glu Leu Gly Met Ala Arg Ala Leu Gly Lys Tyr Ile 100 105 110 Met Val Val Ile Pro Asp Glu Asp Phe Gly Lys Pro Ile Asn Leu Met 115 120 125 Ser Trp Gly Ile Ala Asp Asn Phe Ile Lys Met Ser Glu Leu Pro Asn

    130 135 140 Asp Tyr Phe Asn Lys Pro Ser Tyr Asn Phe Tyr Asp Gly Gly Val Tyr 145 150 155 160