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ES2413557T3 - Procedimiento y disposición de electrodos para tratar células adherentes - Google Patents

Procedimiento y disposición de electrodos para tratar células adherentes Download PDF

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ES2413557T3
ES2413557T3 ES10006458T ES10006458T ES2413557T3 ES 2413557 T3 ES2413557 T3 ES 2413557T3 ES 10006458 T ES10006458 T ES 10006458T ES 10006458 T ES10006458 T ES 10006458T ES 2413557 T3 ES2413557 T3 ES 2413557T3
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ES
Spain
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electrodes
cells
electrode arrangement
electrode
electric field
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ES10006458T
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Herbert MÜLLER-HARTMANN
Andreas Wirth
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Lonza Cologne GmbH
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Lonza Cologne GmbH
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Abstract

Disposición de electrodos (10, 17, 20), especialmente para solicitar células adherentes con al menos un campoeléctrico, que comprende al menos dos electrodos (12, 18, 21) que presentan cada uno de ellos al menos unasuperficie (16, 32) que está dispuesta enfrente de la superficie correspondiente (16, 32) del respectivo otro electrodo(12, 18, 21), estando dispuesto al menos parcialmente un material eléctricamente aislante (11, 19, 26) entre lassuperficies (16, 32) de los electrodos (12, 18, 21), caracterizada por que las superficies (16, 32) estáncompletamente separadas una de otra por el material aislante (11, 19, 26).

Description

Procedimiento y disposición de electrodos para tratar células adherentes.
La invención concierne a una disposición de electrodos, especialmente para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, que comprende al menos dos electrodos que presentan cada uno de ellos al menos una superficie que está dispuesta enfrente de la superficie correspondiente del respectivo otro electrodo, estando dispuesto al menos parcialmente entre la superficie de los electrodos un material eléctricamente aislante. La invención concierne también a un procedimiento para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, en el que se genera el campo eléctrico por la aplicación de una tensión a al menos dos electrodos.
La solicitación de células vivas con un campo eléctrico o un impulso de tensión, la llamada electroporación o electrotransfección, se emplea desde hace años en células en los más diferentes estados. Estas células se presentan como células individuales en suspensión en una solución tampón, en el estado adherente en un recipiente de cultivo, casi siempre en el fondo de un receptáculo de material sintético y en vivo, en donde las células están incrustadas, generalmente en un estructura tisular, dentro de una matriz extracelular. En principio, en la electroporación se introducen en las células las moléculas extrañas de una solución tampón adaptada a las células o un medio de cultivo celular mediante un flujo de corriente de corta duración, haciéndose la membrana celular permeable para las moléculas extrañas por el efecto de los impulsos de tensión eléctrica o del campo eléctrico y el flujo de corriente así producido. La suspensión celular se encuentra aquí frecuentemente en una llamada cubeta, es decir, un pequeño recipiente abierto cuyo espacio para las muestras presenta en las paredes laterales dos electros paralelos opuestos que sirven para aplicar la tensión eléctrica. A través de los “poros” de la membrana celular producidos en breve tiempo llegan primero las moléculas biológicamente activas al citoplasma, en el que pueden ejercer eventualmente ya su función a examinar, y a continuación, en determinadas condiciones, alcanzan también el núcleo de las células. Mediante la aplicación de corta duración de un fuerte campo eléctrico, es decir, un corto impulso de tensión con alta densidad de corriente, se pueden fusionar también células, derivados celulares, partículas subcelulares y/o vesículas. En esta llamada electrofusión se ponen las células en estrecho contacto con la membrana, por ejemplo primeramente por medio de un campo eléctrico alterno no homogéneo. Gracias a la aplicación subsiguiente de un impulso de campo eléctrico se produce entonces la interacción de partes de la membrana que conduce finalmente a la fusión. Para la electrofusión se pueden emplear aquí dispositivos y aparatos comparables, como para la electroporación. Además, las células vivas pueden ser estimuladas también por campos eléctricos de una manera que varía sus propiedades.
Se conoce por el documento WO 2005/056788 A1, por ejemplo, un procedimiento de electroporación en el que crecen células sobre una membrana microporosa que se encuentra entre dos superficies de electrodo paralelamente dispuestas.
El documento US-A-5 134 070 describe aplicaciones y dispositivos de electroporación de células que crecen sobre una superficie eléctricamente conductora que sirve de electrodo. El recipiente de cultivo se cubre desde arriba con un contraelectrodo de forma de placa, formándose una rendija a través de la cual son posibles descargas eléctricas.
Se conoce también por el documento WO 2008/104086 A1 un dispositivo en el que las células crecen sobre superficies de electrodo coplanarias. El contacto eléctrico entre los electrodos se establece a través del medio de cultivo celular dispuesto sobre las células, estando las dos zonas de electrodo separadas por una barrera aislanteque, no obstante, admite un puente de electrolito entre los electrodos. Éstos pueden consistir, por ejemplo, en óxido de indio-estaño que hace posible, como semiconductor transparente, un análisis microscópico de las células.
Se conoce por el documento WO 2009/131972 A1 un dispositivo de electroporación de células que crecen de manera adherente sobre una placa redonda de forma de disco. El dispositivo presenta dos electrodos dispuestos paralelos uno a otro, encontrándose un electrodo sobre la superficie cóncava de un cilindro exterior y encontrándose el otro electrodo sobre la superficie convexa de un cilindro interior.
Se conoce también por el documento US 2009/0305380 A1 un dispositivo de electroporación de células que están inmovilizadas sobre una superficie fija. El campo eléctrico con el que se solicitan las células es generado por una disposición de pares de electrodos que, dispuestos muy juntos uno a otro, se encuentran sobre una superficie dispuesta por encima de la superficie fija. Los electrodos están formados por trazas eléctricas que están aplicadas como un chapado sobre la superficie. Los dos electrodos de un par de electrodos están dispuestos aquí tan juntos uno a otro que no puede encontrarse más de una células dentro de la distancia mas pequeña entre los dos electrodos.
El documento US-A-6 352 853 describe disposiciones de electrodos de forma de peine para la electrotransfección de células que se disponen en forma de una matriz que comprende un gran número de pares de electrodos. Cada par de electrodos individual, que está formado por dos electrodos yuxtapuestos de disposiciones de electrodos contiguas, penetra entonces en una cavidad de una placa multipocillo. Los dos electrodos de un par de electrodos se separan parcialmente uno de otro por medio de un distanciador de material no conductor.
La firma BTX comercializa con el PetriPulser® una disposición de placas de electrodo planoparalelas de polaridades alternas que pueden aplicarse perpendicularmente sobre células que crecen de forma adherente en un recipiente de cultivo. Los electrodos se sumergen aquí en el sobrante del cultivo, llenándose con el medio de cultivo los espacios intermedios entre las distintas placas de electrodo. Un inconveniente esencial de esta disposición reside en que la mayor parte de la corriente escapa por el medio de cultivo exento de células que se encuentra sobre las células. Sin embargo, el campo es operativo solamente en el campo de borde del fondo del recipiente, en donde se encuentra las células, de modo que se tienen que aportar corrientes innecesariamente altas. Asimismo, se tiene que partir de una alta mortalidad de las células debido a variaciones del valor del pH y a la alta corriente. Además, se tiene que diseñar muy grande el suministro de tensión para impulsos de tensión de larga duración a fin de aportar estas grandes corrientes y, por tanto, estas grandes cantidades de carga y potencias. Por otro lado, se tiene que aplicar un volumen grande que sea adecuado para la electroporación y que contenga el sustrato a transfeccionar en concentración suficientemente alta, con lo que la cantidad de sustrato es correspondientemente también más alta.
La invención se basa en el problema de crear una disposición de electrodos y un procedimiento que hagan posible un tratamiento eficiente de células adherentes con un campo eléctrico sin que se necesiten densidades de corriente demasiado altas.
El problema se resuelve según la invención con la disposición de electrodos de la clase citada al principio en la que las superficies de los electrodos están completamente separadas una de otra por el material eléctricamente aislante. Gracias a esta solución según la invención se consigue que el campo eléctrico pueda concentrarse en la zona de las células a tratar, con lo que fluye a través de las células un impulso de tensión o la corriente producida por éste, sin que se descargue como no utilizada una parte principal de la misma en el electrolito dispuesto sobre las células. De este modo, por un lado, se puede dimensionar moderadamente el dispositivo de generación de impulsos y, por otro lado, se pueden evitar fuertes variaciones del valor del pH en el medio que se generarían en caso contrario a consecuencia de la electrolisis por efecto de grandes cantidades de cargas circulantes. Se garantiza también con el dispositivo según la invención que el tratamiento eléctrico distribuido espacialmente del modo más uniforme posible se efectúe a través de la superficie de cultivo y se minimicen zonas con células no tratadas. La proporción porcentual de células exitosamente tratadas (por ejemplo transfeccionadas) y la tasa de supervivencia, así como, en caso de que se emplee ADN o ARNm, el nivel de expresión por célula, son comparables con los valores correspondientes para la electroporación de células en suspensión. Por tanto, por medio de la disposición de electrodos según la invención se hace posible un tratamiento eficiente de células adherentes con un campo eléctrico.
En una ejecución ventajosa de la disposición de electrodos según la invención se ha previsto que ésta comprenda al menos tres, preferiblemente al menos 4 ó 5 y especialmente 6 a 12 electrodos.
Cuando los electrodos están configurados en forma de placas o clavijas, se puede disponer el mayor número posible de electrodos en un estrecho espacio, con lo que se puede generar un campo eléctrico especialmente homogéneo. Por tanto, en una ejecución alternativa de la invención se pueden sustituir electrodos de placa por filas de clavijas metálicas. Cuando estas filas de clavijas eléctricamente acopladas están dispuestas de manera suficientemente compacta, éstas pueden sustituir a placas de electrodo continuas en lo que respecta al campo eléctrico generado. “Suficientemente compacto” significa en este contexto que la distancia de clavijas contiguas de igual polaridad es más pequeña o como máximo igual que la distancia de las filas de clavijas de polaridad opuesta. El empleo de tal disposición es especialmente ventajosa, ya que la fabricación de disposiciones de electrodos por inserción de clavijas metálicas o alambres o trozos de alambre en un útil de fundición inyectada y subsiguiente revestimiento por inyección, por ejemplo con un polímero termoplástico, está ampliamente difundida y, por tanto, el procedimiento de producción puede ser bien dominado por muchos fabricantes.
En otra ejecución ventajosa de la disposición de electrodos según la invención se ha previsto que las superficies sean superficies laterales de placas de electrodo dispuestas en forma planoparalela.
La separación completa de las superficies por el material aislante se consigue preferiblemente de manera ventajosa haciendo que el espacio entre los electrodos delimitado por las superficies de estos últimos quede completamente lleno del material aislante.
El material aislante es, en una ejecución ventajosa de la invención, un polímero termoplástico, preferiblemente policloruro de vinilo, poliestireno, polipropileno, polietileno y/o policarbonato. Los electrodos consisten preferiblemente en metal y/o un material sintético eléctricamente conductor.
En una ejecución ventajosa de la disposición de electrodos según la invención se ha previsto que la disposición de electrodos presente en al menos un lado vuelto hacia las células al menos un distanciador que impida que los electrodos entren en contacto directo con las células. Gracias al distanciador o los distanciadores se garantiza que se mantenga una distancia mínima entre los electrodos y las células y/o que se pueda ajustar una distancia definida entre los electrodos y las células.
En una ejecución especialmente ventajosa de la disposición de electrodos según la invención se contempla que la disposición de electrodos esté prevista para su inserción en al menos un recipiente al menos parcialmente lleno de líquido, preferiblemente un recipiente a cuya superficie de fondo se adhieren células vivas, y que el material aislante desaloje al menos una parte del líquido al insertarlo en el recipiente. De este modo, los electrodos pueden aproximarse a las células a tratar y se puede minimizar el volumen del líquido que se encuentra sobre las células.
Los electrodos están dispuestos preferiblemente al menos en parte en el lado inferior de un sujetador. Este sujetador puede estar configurado, por ejemplo, de tal manera que pueda ser insertado en un recipiente de reacción o asentado sobre éste, con lo que los electrodos están en contacto con el recinto interior del recipiente de reacción. El recipiente de reacción puede ser en este caso, por ejemplo, una cubeta o cuenco de cultivo celular individual o bien preferiblemente parte de una placa multipocillo. La disposición de electrodos según la invención se emplea preferiblemente para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, especialmente para la electroporación de células adherentes, preferiblemente en forma de al menos un dispositivo de electrodos sumergibles. La disposición de electrodos según la invención en forma de un dispositivo de electrodos sumergibles hace posible de manera ventajosa la transfección de células que crecen en forma adherente, pudiendo retirarse del medio el dispositivo de electrodos antes y después de la transfección. Se puede asegurar así de manera sencilla la máxima flexibilidad con respecto al sistema de cultivo celular empleado, especialmente la compatibilidad con el mayor número posible de sistemas de cultivo.
El problema se resuelve también según la invención con un procedimiento de la clase citada al principio en el que el campo eléctrico se concentra en el lado de los electrodos vuelto hacia las células y/o se limita al espacio comprendido entre las células y el lado de los electrodos vuelto hacia las células debido a que se coloca entre los electrodos un material eléctricamente aislante que separa completamente una de otra las superficies mutuamente opuestas de los electrodos. Gracias a esta solución según la invención se consigue que un impulso de tensión o la corriente producida por éste circule por las células sin que una parte principal del mismo se descargue como no utilizada en el electrolito dispuesto sobre las células. De este modo, por un lado, se puede dimensionar moderadamente el dispositivo de generación de impulsos y, por otro lado, se pueden evitar en el medio fuertes variaciones del valor del pH que se generarían en caso contrario por efecto de grandes cantidades de cargas circulantes a consecuencia de una electrolisis. Con el dispositivo según la invención se garantiza también que se efectúe una transfección espacialmente distribuida del modo más uniforme posible a través de la superficie de cultivo y se minimicen zonas con células no transfeccionadas. En este caso, la proporción porcentual de células transfeccionadas y la tasa de supervivencia, así como, en caso de que se empleen ADN, ARNm, ARNsi y otros ácidos nucleicos expresables, el grado de influenciación de la expresión por célula, son comparables con los valores correspondientes para la electroporación de células en suspensión. Por tanto, por medio del procedimiento según la invención se hace posible un tratamiento eficiente de células adherentes con un campo eléctrico.
En una ejecución ventajosa del procedimiento según la invención se ha previsto que el campo eléctrico se limite al espacio comprendido entre las células y un lado frontal descubierto de los electrodos.
En una ejecución ventajosa del procedimiento según la invención se ha previsto también que los electrodos se introduzcan con un lado frontal descubierto en al menos un recipiente a cuya superficie de fondo se adhieren las células.
En una ejecución especialmente ventajosa del procedimiento según la invención se ha previsto que la acción del campo eléctrico sobre las células se optimice por ajuste de la distancia entre las células y los electrodos. De este modo, se produce a través de las células a tratar un campo eléctrico homogéneo y suficientemente fuerte, lo que repercute muy positivamente sobre la eficiencia del tratamiento. Así, por ejemplo, se puede optimizar la eficiencia de transfección durante la electrotransfección de células por ajuste de la distancia entre los electrodos y las células.
En lo que sigue se explica la invención con más detalle a modo de ejemplo ayudándose de los dibujos.
La figura 1 muestra (a) una vista lateral esquemática de una disposición de electrodos según el estado de la técnica,
(b) una vista lateral esquemática a modo de ejemplo de una disposición de electrodos según la invención y (c) una vista en planta esquemática del lado inferior de otra forma de realización a modo de ejemplo de una disposición de electrodos según la invención.
La figura 2 muestra imágenes microscópicas por fluorescencia de la expresión de una proteína fluorescente en verde (GFP) en células HeLa que se han tratado (a), por un lado, con una disposición de electrodos según el estado de la técnica y (b), por otro lado, por medio de una disposición de electrodos según la invención.
La figura 3 muestra un diagrama de barras de la comparación de una disposición de electrodos según el estado de la técnica (E. d. T.) con una disposición de electrodos según la invención (Disp. inv.), en donde se representan (a), por un lado, la proporción de células transfeccionadas y, (b), por otro lado, la tasa de supervivencia de las células, en cada caso en porcentaje (AD-035 = número de los parámetros eléctricos para células adherentes, Nucleofector®, Lonza).
La figura 4 muestra una vista en perspectiva del lado inferior de una forma de realización a modo de ejemplo de una disposición de electrodos según la invención.
La figura 5 muestra otra vista en perspectiva de la disposición de electrodos según la figura 4, siendo visibles en esta representación las partes interiores de los electrodos y los elementos de contacto.
La figura 6 muestra una vista en perspectiva del lado superior de la disposición de electrodos según la figura 4.
La figura 7 muestra una sección longitudinal a través de la disposición de electrodos según las figuras 4 a 6.
La figura 8 muestra en un diagrama de barras la dependencia de la eficiencia de transfección respecto de la distancia de los electrodos de una disposición de electrodos según la invención a las células adheridas sobre la superficie de cultivo con tres impulsos de tensión de diferente intensidad (eje x: distancia [mm], eje y: eficiencia de transfección [%], A-5 = impulso de tensión débil, K-19 = impulso de tensión de intensidad media, AX-19 = impulso de tensión fuerte).
La figura 1 muestra (a) una vista lateral esquemática de una disposición de electrodos 1 según el estado de la técnica con electrodos 2 descubiertos y (b) una vista lateral esquemática a modo de ejemplo de una disposición de electrodos 10 según la invención con un material eléctricamente aislante 11 entre los electrodos 12. La disposición de electrodos 1 según el estado de la técnica, que corresponde en principio al PetriPulser® de la firma BTX, consta de tres electrodos 2 dispuestos en forma planoparalela que penetran en el recinto interior 3 de un recipiente 4 y descansan sobre la superficie 5 del fondo del recipiente 4 (figura 1a). Sobre la superficie 5 del fondo pueden adherirse y crecer células vivas (células adherentes). El recinto interior 3 está lleno de un líquido, por ejemplo un medio de cultivo celular u otra solución adaptada a las células, llenando este líquido también el espacio libre 6 entre los electrodos 2. Por tanto, cada electrodo 2 está completamente rodeado por el líquido. Dado que el líquido es eléctricamente conductor, al aplicar una tensión a los electrodos 2 se escapa una gran parte de la corriente a través del líquido entre los electrodos 2 (véanse las flechas), con lo que, al emplear una fuente de tensión no permanente, es decir, por ejemplo, al descargarse un condensador, cae la tensión muy rápidamente y, por tanto, se debilita elcampo eléctrico con el tiempo. Únicamente una parte de la corriente circula por la superficie 5 del fondo, por lo que es pequeña la acción biológica del flujo de corriente.
La disposición de electrodos 10 según la invención comprende tres electrodos 12 dispuestos en forma planoparalela que penetran en el recinto interior 13 del recipiente 14 (figura 1b). El recipiente 14 comprende una superficie de fondo 15 sobre la cual pueden adherirse y crecer células vivas (células adherentes). El recinto interior 13 está lleno de un líquido, por ejemplo un medio de cultivo celular u otra solución adaptada a las células. El espacio comprendido entre los electrodos 12 está completamente lleno de un material eléctricamente aislante 11, con lo que, al aplicar una tensión a los electrodos 12, no puede escaparse corriente alguna a través del espacio situado entre los electrodos 12. En la disposición de electrodos 10 según la invención la corriente total circula por el espacio entre los electrodos 12 y la superficie de fondo 15 de modo que aquí, al emplear una fuente de tensión no permanente (por ejemplo, un condensador), la tensión cae más lentamente y, por tanto, la intensidad de campo para el tratamiento de las células es más alta con el tiempo. De este modo, por un lado, el dispositivo de generación de impulsos puede dimensionarse con un tamaño moderado y, por otro lado, se pueden evitar en el líquido fuertes variaciones del valor del pH que se generarían en caso contrario por efecto de grandes cantidades de cargas circulantes a consecuencia de una electrolisis.
Por tanto, se cumple según la invención que unos electrodos 12, por ejemplo planoparalelos, pueden estar separados por un material aislante 11, con lo que las superficies conductoras de los electrodos 12 están libres solamente hacia abajo (en dirección a la superficie 15 del fondo o a las células adheridas sobre ésta) y están en contacto eléctrico con el entorno. Debido a la plena extensión del material aislante 11 en la zona comprendida entre las respectivas superficies opuestas 16 de los electrodos planoparalelos 12 o al menos en la zona abierta para el líquido entre electrodos, en la que éstos describen líneas paralelas, se puede enfocar el campo eléctrico o se puede limitar la corriente a la zona activa pretendida. Asimismo, es especialmente ventajoso el hecho de que un enfoque del campo eléctrico en la zona de las células direccionadas o una limitación de la corriente eléctrica a la zona activa es posible ahora también empleando electrodos planoparalelos 12, lo que hace posible intensidades de campo y densidades de corriente constantes y más estables con el tiempo en la zona direccionada entre los electrodos 12 y la superficie 15 del fondo. Materiales aislantes adecuados para esto son, por ejemplo, placas o cuerpos moldeados por inyección de materiales sintéticos corrientes, preferiblemente termoplásticos, tales como, por ejemplo, policloruro de vinilo, poliestireno, polipropileno, polietileno o policarbonato. Gracias a la constitución según la invención se puede impedir el escape de corriente a través de las respectivas superficies opuestas 16 de las porciones planoparalelas de los electrodos 12 y, por tanto, se pueden generar impulsos de tensión con corriente constante. Por tanto, una disposición según la invención puede cargarse, por ejemplo, por cada reacción, según la superficie del suelo de cultivo con las células a tratar, con una o varias descargas de impulsos consecutivas de menor energía/corrientes a fin de limitar las potencias necesarias por cada descarga.
Se puede emplear, por ejemplo, un emparedado de electrodos-aislador en el que los electrodos tengan polaridad alterna. En esta disposición el campo no está prácticamente presente en las zonas de por debajo de los electrodos activos y, por tanto, no actúa sobre las células que allí puedan encontrarse y que están situadas por debajo de los electrodos activos. Estas zonas se encuentran en la proximidad inmediata de un conductor eléctrico (los electrodos) y, por tanto, están fuera de un campo apreciable. Por tanto, los electrodos deberán ser lo más delgados posibles (por ejemplo, 50 pm) y aproximadamente toda la superficie del suelo poblada de células deberá estar cubierta por la disposición de electrodos con zonas activas de combinaciones de electrodos-aislador. Las zonas activas son aquí las zonas situadas por debajo del material aislante entre electrodos de polaridad contraria. De este modo, son ventajosas especialmente geometrías redondas en sección transversal de la disposición de electrodos que estén dimensionadas de modo que se acomoden a recipientes de cultivo celular corrientes según el estándar ANSI-SBS (American National Standards Institute – Society for Biomolecular Sciences).
La figura 1c muestra una vista en planta esquemática del lado inferior de otra forma de realización a modo de ejemplo de una disposición de electrodos 17 según la invención con electrodos 18 de forma de clavijas. Dado que los electrodos 18 presentan cada uno de ellos una sección transversal redonda, prácticamente su respectiva superficie periférica completa comprende superficies que están dispuestas enfrente de las superficies correspondientes de los otros electrodos 18. Por tanto, en esta forma de realización el espacio entre los electrodos 18 de forma de clavijas está completamente lleno de un material eléctricamente aislante 19, de modo que solamente las superficies frontales de los electrodos 18 quedan descubiertas en su lado inferior y están en contacto eléctrico con el entorno. En consecuencia, todos los electrodos 10 están eléctricamente aislados uno respecto de otro en su respectiva superficie periférica completa, con lo que no puede escapar corriente alguna a través del espacio entre los electrodos 18. Por tanto, en la disposición de electrodos 17 según la invención la corriente completa circula también a través del espacio entre los electrodos 18 y las células (no visibles aquí), de modo que, cuando se emplea una fuente de tensión no permanente (por ejemplo, un condensador), la tensión cae tan solo lentamente y, por tanto, la intensidad de campo para el tratamiento de las células es muy alta con el tiempo.
Para fines de ensayo se construyó un dispositivo o una disposición de electrodos según la invención a base de capas alternantes de películas de aluminio y material aislante de 2 mm. El dispositivo pegado se pulió para adaptarlo a las geometrías redondas de los recipientes de cultivo (6 pocillos, 12 pocillos, 24 pocillos) y se le conexionó en el extremo superior a dos terminales eléctricos mediante una unión eléctrica de cada segundo electrodo respectivo. A continuación, se fijó el dispositivo a un carril lineal horizontal o bien se le introdujo directamente a mano en una cavidad de cultivo en la que crecen células en forma adherente (aquí células HeLa). En aras de una mayor sencillez, se asentó el dispositivo de ensayo en este caso con los electrodos sobre el suelo de cultivo, con lo que se puede partir de una distancia de <1 mm entre las células y la estructura de electrodos. El medio de cultivo en el recipiente fue sustituido previamente por 1 ml de una mezcla de soluciones (Nucleofector® Cell Line Solution R, Lonza) con ADN plasmídico (pmaxGFP®, Lonza, 2 1g/100 1c). Las pecículas de electrodo conectadas una a otra en forma alternante se cargaron seguidamente, a través de un Nucleofector® de la firma Lonza, con diferentes impulsos de ensayo que están en el intervalo de impulsos que se utilizan también cuando se emplean cubetas individuales de 100 1c de vocumen. A continuaci se sustituyó el
ón, se retiró nuevamente el dispositivo de la cavidad de cultivo yelectrolito nuevamente por un medio para poder seguir cultivando las células. En aras de una mayor sencillez, se empleó nuevamente la mezcla de solución-ADN en cavidades diferentes. Análogamente, se procedió con el PetriPulser® de la firma BTX, solo que, debido a la falta de aisladores entre los electrodos, se cargaron 2 ml de la misma mezcla de solución-ADN después de la introducción del dispositivo de electrodos 2 para generar un nivel de llenado comparable. Se analizaron las células después de un día por medio de citometría de flujo. Cuando se emplea el PetriPulser® de la firma BTX con aproximadamente la misma distancia entre electrodos, es decir, las mismas premisas para la generación del campo eléctrico, tan solo se pueden encontrar en general muy esporádicamente células transfeccionadas (figura 2a). Además, se observaron aquí avisos de error para la desconexión de sobreintensidades de corriente, lo que proporciona una indicación de que el PetriPulser® no es adecuado para la generación de campos eléctricos suficientemente altos debido al flujo de corriente no limitado a través de espacios intermedios abiertos entre las placas de electrodo. Por el contrario, empleando el dispositivo según la invención se pudo transfeccionar un 30-45% de las células expresión de GFP, (figura 2b). Por tanto, se aprecia claramente que la estructura según la invención puede transfeccionar eficientemente células adherentes.
A continuación, se examinaron las células en cuanto a supervivencia, morfología y la expresión de la información genética introducida. La figura 3 muestra una comparación de células que se transfeccionan, por una parte, por medio del dispositivo según la invención descrito con relación a la figura 2b y, por otro lado, con el PetriPulser® de la firma BTX según el procedimiento descrito en relación con la figura 2a. Se pudo demostrar que las células podían ser transfeccionadas con la disposición de electrodos según la invención con una alta eficiencia y preservando una alta viabilidad e integridad morfológica (figuras 3a y 3b). Los resultados estaban en el mismo intervalo en cuanto a orden de magnitud que los datos comparativos con protocolos existentes para estas células en la transfección en suspensión. Después del tratamiento con el PetriPulser® se pudo constatar ciertamente una tasa de supervivencia algo más alta, pero no ninguna transfección apreciable (figuras 3a y 3b).
La figura 4 muestra una vista en perspectiva del lado inferior de una forma de realización a modo de ejemplo de una disposición de electrodos 20 según la invención. La disposición de electrodos 20 comprende siete electrodos 21 que en lo que sigue se describen aún con más detalle con referencia a las figuras 5 y 7. Los electrodos 21 están dispuestos en un sujetador 22 que es de configuración sustancialmente cilíndrica. El sujetador 22 comprende un cuerpo de base 23 y una zona de borde 24 dispuesta en el extremo superior del cuerpo de base 23, siendo el diámetro exterior de la zona de borde 24 más grande que el diámetro exterior del cuerpo de base 23, de modo que la zona de borde 24 sobresale del cuerpo de base 23 hacia fuera. Los electrodos 21 están dispuestos en su mayor parte dentro del cuerpo de base 23 y están al descubierto con sus superficies frontales inferiores 33 en el lado inferior 25 del sujetador 22, de modo que dichos electrodos están en contacto con el entorno. Los distintos electrodos 21 están eléctricamente separados uno de otro por medio de un respectivo material aislante 26, llenando completamente el material aislante 26, en este ejemplo de realización, el espacio comprendido entre los distintos electrodos 21. El material aislante 26 entre las respectivas superficies opuestas de los electrodos 21 garantiza que, al aplicar una tensión a los electrodos, no pueda escapar corriente alguna a través del espacio entre los electrodos 21 cuando estos electrodos 21 están sumergidos en un líquido eléctricamente conductor. Por el contrario, el material aislante 26 hace que, al aplicar una tensión a los electrodos 21, circule corriente a través de las superficies frontales 33 de los electrodos 21 y se forme un campo eléctrico por debajo del lado inferior 25 del sujetador 22. Dado que no pueden escapar corrientes apreciables a través del espacio entre los electrodos 21, la tensión cae tan solo lentamente durante la descarga de un condensador u otro fuente de tensión no permanente, de modo que circulan con el tiempo corrientes constantes y estables que generan durante el tiempo de la descarga un campo eléctrico suficientemente fuerte para la mayoría de los procedimientos biológicos, por ejemplo la electrotransfección. La disposición de electrodos 20 está prevista especialmente para insertarse en un recipiente al menos parcialmente lleno de líquido, por ejemplo un receptáculo de reacción, un cuenco de cultivo celular o un “pocillo” de una placa multipocillo, presentando este recipiente una superficie de fondo a la que pueden adherirse células vivas. Las células adherentes sobre la superficie del fondo del recipiente están cubiertas usualmente con un líquido adecuado, por ejemplo un medio de cultivo celular o una solución adaptada al tratamiento eléctrico deseado, desalojando la disposición de electrodos 20, al insertarse en el recipiente, al menos una parte de este líquido. Para que los electrodos 21 no descansen directamente con sus superficies frontales 33 sobre la superficie del fondo del recipiente ni, por tanto, sobre las células, el lado inferior 25 del sujetador 22 presenta cuatro distanciadores 27 que garantizan una distancia suficiente de los electrodos 21 a la superficie del fondo del recipiente.
La figura 5 muestra una vista en perspectiva de la disposición de electrodos 20 según la figura 4, estando representadas visiblemente en esta representación las partes interiores de los electrodos 21. En esta representación se pone claramente de manifiesto que los electrodos 21 están configurados sustancialmente en forma de placas, reduciéndose el espesor de las placas de electrodo en dirección al lado inferior 25 del sujetador 22. Por tanto, las superficies frontales descubiertas 33 de los electrodos 21 que están en contacto con el líquido en el recipiente son sensiblemente más estrechas que las partes de los electrodos 21 dispuestas dentro del cuerpo de base 23. Esto tiene la ventaja de que se minimiza la zona situada debajo del respectivo electrodo 21 dentro de la cual no es posible un tratamiento eléctrico efectivo de las células debido al campo eléctrico demasiado débil. Por el contrario, en el extremo opuesto los electrodos 21 tienen que presentar un espesor mayor, ya que tienen que ser contactados aquí efectivamente para el establecimiento de un contacto eléctrico suficiente. El contacto eléctrico con la respectiva fuente de tensión empleada se establece en el presente ejemplo de realización a través de unos elementos de contacto 28 de forma de clavijas que están insertos en zonas engrosadas 29 de los electrodos 21. Los elementos de contacto 28 se unen eléctricamente con una fuente de tensión en su respectivo extremo opuesto a la zona 29 por medio de un dispositivo de contacto adecuado. La fuente de tensión puede consistir, por ejemplo, en uno o varios condensadores que hagan posible la emisión controlada de impulsos de tensión. Los impulsos de tensión generados son retransmitidos a los electrodos 21 a través de los elementos de contacto 28, de modo que en el lado inferior de los electrodos 21, es decir, por debajo del lado inferior 25 del sujetador 22, se obtiene un campo eléctrico que, debido al material aislante 26 existente entre los electrodos 21, se limita o se enfoca hacia el espacio entre las células y el lado de los electrodos 21 vuelto hacia las células.
La disposición de electrodos 20 según la invención se fabrica preferiblemente por el procedimiento de fundición inyectada. En este caso, se colocan primero los elementos de contacto 28 dentro de un útil de fundición inyectada adecuado y luego se les reviste por inyección con un polímero eléctricamente aislante. En un segundo paso se inyecta después un polímero eléctricamente conductor que forma los electrodos 21. Como alternativa, los electrodos pueden consistir también en un metal, preferiblemente aluminio. En esta forma de realización se colocan primero los electrodos metálicos dentro del útil de fundición inyectada y se les reviste luego por inyección con un polímero eléctricamente aislante. En esta forma de realización los electrodos metálicos presentan preferiblemente unas prolongaciones sobresalientes hacia arriba, a través de las cuales se pueden contactar eléctricamente los electrodos.
La figura 6 muestra una vista en perspectiva del lado superior 30 de la disposición de electrodos 20 de la invención según la figura 4. Se pone aquí claramente de manifiesto que los elementos de contacto 28 sobresalen del cuerpo de base 23 hacia arriba. Por tanto, con excepción de los extremos descubiertos 31, los elementos de contacto 28 están rodeados completamente por el material eléctricamente aislante del cuerpo de base 23. A través de los extremos descubiertos 31 se pueden unir eléctricamente los elementos de contacto 28 con una fuente de tensión por medio de un dispositivo adecuado.
La figura 7 muestra una sección longitudinal a través de la disposición de electrodos 20 según las figuras 4 a 6. En esta representación se pone claramente de manifiesto que el diámetro de los electrodos 21 se estrecha en dirección al lado inferior 25 del cuerpo de base 23, de modo que se minimiza la superficie situada por debajo de los electrodos 21 dentro de la cual se forma solamente un campo eléctrico insuficiente. En el extremo opuesto de los electrodos 21 se encuentra la zona 29 de espesor agrandado, en la que están insertados o inyectados los respectivos elementos de contacto 28. Esta ejecución especialmente ventajosa garantiza un contacto eléctrico suficiente entre los elementos de contacto 28 y los electrodos 21, de modo que se asegura una retransmisión efectiva de los impulsos de tensión desde la fuente de tensión hasta los electrodos 21. Cuando la disposición de electrodos 20 se inserta en un recipiente lleno de líquido, a cuya superficie de fondo se adhieren células vivas, los distanciadores 27 cuidan de que se ajuste una distancia óptima entre el lado inferior de los electrodos 21 y las células que se deben tratar. Dado que el espacio entre las respectivas superficies mutuamente opuestas 32 de los electrodos 21 está lleno completamente del material aislante 26, no penetra líquido alguno entre las superficies 32 de los electrodos 21, de modo que no puede escapar corriente alguna a través de la zona comprendida entre las superficies 32 de los electrodos 21. De esta manera, al aplicar una tensión a los electrodos 21 se concentra el campo eléctrico en el lado de los electrodos 21 vuelto hacia las células y se limita o enfoca dicho campo al espacio comprendido entre las células y los electrodos 21. De este modo, se pueden tratar células con mucha efectividad y con un consumo de energía relativamente pequeño. Otra ventaja de la invención reside en que la disposición de electrodos 20 desaloja una parte del líquido al insertarla en el recipiente, ya que no están presentes espacios intermedios entre los electrodos 21. Por este motivo, el recipiente tiene que llenarse tan solo con una pequeña cantidad de líquido, con lo que se pueden ahorrar soluciones y sustancias necesarias para el tratamiento y se pueden reducir así los costes.
La figura 8 muestra la dependencia de la eficiencia de transducción respecto de la distancia de los electrodos a las células a tratar, en cada caso con impulsos de tensión de diferente intensidad. Transfección significa en este contexto la introducción de moléculas de ácido nucleico (aquí ADN) en células vivas por medio de impulsos de tensión eléctrica. Mientras que a tensiones relativamente bajas (AX-19) se presenta tan solo una pequeña dependencia de la eficiencia de transfección respecto de la distancia entre los electrodos y las células, se manifiesta con impulsos de tensión débiles (A-5) que la eficiencia de transfección es tanto mayor cuanto más pequeña sea la distancia entre los electrodos y las células. Por el contrario, los impulsos de tensión de intensidad media (K-19) muestran un óptimo a distancias de medio tamaño. Por tanto, se pone claramente de manifiesto que la distancia entre los electrodos y las células tiene una influencia sobre la eficiencia de transfección que es más o menos grande en función de la intensidad de los impulsos de tensión.
Lista de símbolos de referencia
1 Disposición de electrodos 2 Electrodos 3 Recinto interior 4 Recipiente 5 Superficie de fondo 6 Recinto 10 Disposición de electrodos 11 Material aislante 12 Electrodos 13 Recinto interior 14 Recipiente 15 Superficie de fondo 16 Superficie 17 Disposición de electrodos 18 Electrodos 19 Material aislante 20 Disposición de electrodos 21 Electrodos 22 Sujetador 23 Cuerpo de base 24 Zona de borde 25 Lado inferior 26 Material aislante 27 Distanciador 28 Elementos de contacto 29 Zona 30 Lado superior 31 Extremo 32 Superficie 33 Superficie frontal

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Disposición de electrodos (10, 17, 20), especialmente para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, que comprende al menos dos electrodos (12, 18, 21) que presentan cada uno de ellos al menos una superficie (16, 32) que está dispuesta enfrente de la superficie correspondiente (16, 32) del respectivo otro electrodo (12, 18, 21), estando dispuesto al menos parcialmente un material eléctricamente aislante (11, 19, 26) entre las superficies (16, 32) de los electrodos (12, 18, 21), caracterizada por que las superficies (16, 32) están completamente separadas una de otra por el material aislante (11, 19, 26).
  2. 2.
    Disposición de electrodos según la reivindicación 1, caracterizada por que están previstos al menos tres, preferiblemente al menos 4 ó 5 y especialmente 6-12 electrodos (12, 18, 21).
  3. 3.
    Disposición de electrodos según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada por que los electrodos (12, 18, 21) están configurados en forma de placas o de clavijas.
  4. 4.
    Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que las superficies (16, 32) son superficies laterales de placas de electrodo dispuestas en forma planoparalela.
  5. 5.
    Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que el espacio entre los electrodos (12, 18, 21) delimitado por las superficies (16, 32) de los electrodos (12, 18, 21) está completamente lleno del material aislante (11, 19, 26).
  6. 6.
    Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que el material aislante (11, 19, 26) es un polímero termoplástico, preferiblemente policloruro de vinilo, poliestireno, polipropileno, polietileno y/o policarbonato.
  7. 7.
    Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que los electrodos (12, 18, 21) consisten en metal y/o en un material sintético eléctricamente conductor.
  8. 8.
    Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que la disposición de electrodos (10, 17, 20) presenta al menos un distanciador (27) en al menos un lado vuelto hacia las células.
  9. 9.
    Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por que la disposición de electrodos (10, 17, 20) está prevista para insertarse en al menos un recipiente (14) al menos parcialmente lleno de líquido, preferiblemente un recipiente (14) a cuya superficie de fondo (15) se adhieren células vivas, y por que el material aislante (11, 19, 26) desaloja al menos una parte del líquido durante la inserción en el recipiente (14).
  10. 10.
    Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por que los electrodos (12, 18, 21) están dispuestos al menos parcialmente en el lado inferior (25) de un sujetador (22).
  11. 11.
    Disposición de electrodos según la reivindicación 10, caracterizada por que el sujetador (22) está configurado de tal manera que puede insertarse en un recipiente de reacción o asentarse sobre éste, de modo que los electrodos (12, 18, 21) están en contacto con el recinto interior del recipiente de reacción.
  12. 12.
    Disposición de electrodos según la reivindicación 11, caracterizada por que el recipiente de reacción es parte de una placa multipocillo.
  13. 13.
    Uso de la disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, especialmente para la electroporación de células adherentes, preferiblemente en forma de al menos un dispositivo de electrodos sumergibles.
  14. 14.
    Procedimiento para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, en el que se genera el campo eléctrico por la aplicación de una tensión a al menos dos electrodos (12, 18, 21), caracterizado por que el campo eléctrico se concentra en el lado de los electrodos (12, 18, 21) vuelto hacia las células y/o se limita al espacio entre las células y el lado de los electrodos (12, 18, 21) vuelto hacia las células debido a que se coloca entre los electrodos (12, 18, 21) un material eléctricamente aislante (11, 19, 26) que separa completamente una de otra las superficies mutuamente opuestas (16, 32) de los electrodos (12, 18, 21).
  15. 15.
    Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado por que se limita el campo eléctrico al espacio entre las células y un lado frontal descubierto de los electrodos (12, 18, 21).
  16. 16.
    Procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, caracterizado por que se introducen los electrodos (12, 18, 21) con un lado frontal descubierto en al menos un recipiente (14) a cuya superficie de fondo (15) se adhieren las células.
  17. 17.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado por que se optimiza la acción del campo eléctrico sobre las células ajustando la distancia entre las células y los electrodos (12, 18, 21).
    Figura 1
    Figura 2
    Figura 4
    Figura 5
    Figura 6
    Figura 7
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