ES2394261T3 - Materiales y métodos relacionados con terapias basadas en células - Google Patents

Abstract

Población de células multipotentes aisladas producida mediante:(a) proporcionar tejido de conducto pancreático de adulto que comprende conductos completos,(b) triturar dicho tejido de conducto,(c) cultivar dicho tejido triturado, y(d) recoger una monocapa de población de células emergentes del cultivo de la etapa (c);población que:(i) es positiva para GFAP y NCAM,(ii) es negativa para PDX-1, y(iii) comprende tanto células positivas para nestina como negativas para nestina tal como se determina medianteanálisis de citometría de flujo;para uso en un método de estimulación de la regeneración de células beta pancreáticas del huésped en un sujetodiabético.

Description

Materiales y métodos relacionados con terapias basadas en células

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a la provisión de una terapia basada en células para la regeneración de tejido y el tratamiento del envejecimiento y estados patológicos asociados con la degeneración celular o cambios tisulares relacionados con la edad. Esta terapia presenta células de origen adulto que pueden usarse en trasplante. La invención se refiere además a preparaciones para uso en trasplante y la regeneración de tejido para paliar daño celular y orgánico, y todavía adicionalmente, a métodos de evaluación y a la idoneidad de agentes terapéuticos basados en células para trasplante.

Antecedentes de la invención

15 Las células madre son células no especializadas que tienen la capacidad para proliferar durante largos periodos en cultivo y que pueden inducirse para convertirse en tipos de células especializadas. Pueden aislarse células madre principalmente del embrión o adulto aunque éstas parecen tener un carácter y función distintos.

Se han aislado células madre de los embriones (células madre embrionarias/del embrión, CME) de numerosas especies de mamíferos. Las procedentes del ratón han sido objeto de un intenso estudio durante los últimos veinte años y han allanado el terreno para el aislamiento de CME humanas que se han aislado y con las que se trabaja desde 1998 (1,2).

25 Las CME se derivan normalmente del blastocisto embrionario en el que, in vivo, continúan para dar lugar a tipos de células de desarrollo posteriores. Las células madre de adulto (CMA) por otra parte, están presentes en numerosos tejidos en los que permiten la sustitución de células perdidas por una agresión y, o, el deterioro natural.

Estas células tienen el potencial de proporcionar terapias de base celular para el tratamiento de enfermedades tales como diabetes y enfermedad de Parkinson, en las que existen daño y pérdida celular que conducen a la patología específica. También tienen un gran potencial para seleccionar fármacos, investigaciones toxocológicas, investigar programas de desarrollo, tratar la degeneración y pérdida de tejido relacionadas con la edad. También tienen un potencial para la regeneración de tejido tras extirpación quirúrgica, agresión o como parte de intervenciones de cirugía estética.

35 En la actualidad, sólo existen tratamientos limitados basados en terapias con células madre en uso clínico. Uno de los factores complejos que limitan el traslado de una terapia basada en células o terapia con CMA no hematopoyéticas de este tipo, es una incapacidad para controlar definitivamente la diferenciación de las células madre para generar un único tipo de célula y controlar el riesgo de neoplasia por el uso de una fuente de células de este tipo. La pertinencia de esto último con respecto a las CMA está sin determinar. No se dispone de datos de seguimiento a largo plazo para ningún trasplante de células madre no hematopoyéticas humanas.

Las células madre tienen tres propiedades generales que las distinguen de otras células en el organismo:

45 (i) No están especializadas y no tienen una función de desarrollo específica aparente.

(ii) Pueden producir autoproliferación durante largos periodos en cultivo, a diferencia de otros tipos de células primarias que experimentan senescencia o estasis. Las células madre, sin embargo, pueden autorrenovarse.

(iii) Pueden dar lugar a tipos de células especializadas con funciones específicas (por ejemplo; neuronas, células beta, cardiomiocitos).

Las células madre embrionarias se derivan normalmente de la masa de células internas del blastocisto de embriones fertilizados, un grupo de aproximadamente 30 células en un extremo del blastocele. Esto ha conducido a un

55 importante debate ético y moral que rodea el uso de tales células derivadas de embriones humanos. Las CME se aíslan normalmente a través de la transferencia de la masa de células internas a medio de cultivo apropiado en presencia de una capa de alimentación de queratinocitos murinos. Se realizan pases en serie posteriormente del cultivo resultante durante varios meses para establecer una línea celular. Las CME así cultivadas, se consideran normalmente como una línea celular pluripotente tras seis meses o más en cultivo sin diferenciación

No hay una prueba convencional definida existente para caracterizar células de manera inequívoca como CME. La caracterización típica se basa en un periodo prolongado de crecimiento no diferenciado en cultivo y la expresión de un marcador denominado Oct 4, en combinación con una variedad de marcadores de superficie (véase la tabla 1) que se requiere para el mantenimiento de características de autorrenovación. Esto se correlaciona con un análisis

65 de cariotipo para garantizar la integridad genética macroscópica de las células y una determinación de si las células pueden volver a cultivarse tras ciclos de congelación/descongelación.

Una correlación adicional es una determinación de pluripotencia in vitro y la capacidad para formar teratomas tras la inyección en un ratón inmunosuprimido. Los teratomas son tumores benignos que contienen de manera rutinaria múltiples tipos de células, demostrando por tanto que las CME pueden diferenciarse en múltiples tipos de células

5 (1,2)

El control del crecimiento de CME no diferenciadas está bien establecido por los expertos en la técnica. Cuando, en condiciones de cultivo definidas, se permite que las CME formen cuerpos embrioides, se diferencian espontáneamente para formar múltiples tipos de células. Esto puede comprometer la producción de poblaciones puras de tipos de células definidos para terapias de base celular.

La diferenciación dirigida de las CME, utilizando el crecimiento en medios de cultivo específico, puede enriquecerse para tipos de células particulares. Se ilustran ejemplos en (3,4). Las poblaciones de células puras derivadas de este procedimiento son posibles terapias para diabetes, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, distrofia

15 muscular de Duchenne, enfermedad cardiaca, ceguera y muchos otros estados.

Sin embargo, el sistema hematopoyético ha proporcionado un paradigma para las CMA. Basándose en esto, se cree que las CMA normalmente generan los tipos de células del tejido en que residen, aunque se ha mostrado que presentan plasticidad in vitro (5,6). Se ha demostrado que las células madre hematopoyéticas (CMH), por ejemplo dan lugar a neuronas y cardiomiocitos y demuestran un injerto de múltiples órganos, múltiples linajes (7). Esto hace que las CMA salgan de las dianas para terapias basadas en células. El término plasticidad, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una célula madre de un tejido para generar los tipos de células diferenciadas de otro tejido. Esto también se denomina “diferenciación heterodoxa” (8) o “transdiferenciación” (9,10) en la bibliografía del campo.

25 Las CMA son células no diferenciadas que se encuentran entre células diferenciadas en un tejido u órgano de adulto, no están especializadas y pueden autorrenovarse por sí mismas y mantener una capacidad para diferenciarse, para producir los principales tipos de células de un tejido u órgano. Se considera que las CMA mantienen y efectúan la reparación de tejido. Se desconoce el origen de las células madre de adulto en tejidos maduros y aún está por determinar el grado de su plasticidad. Su uso en trasplante se conoce ampliamente. Se han usado CMA de médula ósea en trasplantes durante 30 años. El uso de CMH que no son de adulto, su eficacia, plasticidad y seguridad en el seguimiento a largo plazo sigue sin demostrarse. Los informes de CMA no estromales siguen debatiéndose en el campo, aunque las células madre neurales están ahora establecidas y aceptadas como un tipo de CMA de buena fe. Para una revisión detallada del campo, véase (6).

35 Los números de las CMA en cualquier tejido parecen ser limitados. La caracterización de tales células es todavía imprecisa entre los expertos en la técnica. Normalmente, esto se logra a través de pruebas similares a las usadas para las CME, complementadas con estos ensayos. Éstos incluyen marcar las células en un tejido vivo con marcadores moleculares y luego determinar qué tipos de células generan (30) o tomar las células y marcarlas ex vivo, y seguir su destino tras el trasplante en un segundo animal. Alternativamente, las CMA pueden someterse a cultivo in vitro, para determinar qué tipos de células diferenciadas pueden dar lugar. El aislamiento clonal y la propagación de células individuales seguido por trasplante para la determinación del estado multipotencial del tipo de célula cuando se trata tejido dañado in vivo, también se usa (11).

45 Las hipótesis actuales sobre la diferenciación de CMA postulan que las CMA pueden presentar multipotencia y plasticidad. Cuando proliferan en las condiciones de crecimiento correctas, generan las células y los tejidos de órganos que ocupan normalmente.

Pueden ejemplificarse mediante:

(i)

Células madre hematopoyéticas, que dan lugar a todos los tipos de células sanguíneas

(ii)

Células estromales de la médula ósea, que dan lugar a osteocitos, condrocitos, adipocitos y otras clases de

células de tejido conjuntivo tales como las de los tendones. 55

(iii) Células madre neurales dan lugar a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

(iv)

Células madre del epitelio intestinal que generan células de absorción, células caliciformes, células de Paneth y células enteroendocrinas en las criptas del intestino.

(v)

Células madre de la piel que generan queratinocitos, folículo piloso y epidermis.

También se ha postulado que las CMA se transdiferencian en células de tejidos aparte de aquéllos en los que residen (10,11). Los ejemplos de transdiferenciación incluyen la generación de tipos de células neurales a partir de

65 las CMH, así como cardiomiocitos y hepatocitos. También se han derivado cardiomiocitos de células estromales de la médula ósea, mientras que se han usado células madre neuronales para generar células sanguíneas y de músculo esquelético. El mecanismo de transdiferenciación y los factores que lo dirigen, siguen estando sin determinar. Esta es sólo una de varias cuestiones clave todavía sin responder en el campo. Todavía está sin determinar si tal plasticidad es normal, o un artefacto de la de manipulación experimental. Además, todavía es un punto de debate en el campo en cuanto a si uno o más de tales tipos de CMA existen realmente in vivo. Todavía

5 debe abordarse el número y los tipos de CMA, dónde existen, si hay CME restantes, cómo mantener la autoproliferación en tejido diferenciado y cómo se diferencian eventualmente.

El carácter pluripotente probado de las CME y la capacidad para hacerlas crecer en grandes números hace que sean candidatos atractivos para una terapia basada en células. Esto es una grave limitación para el uso de las CMA en este contexto, en el que tales células se consideran poco comunes y sus condiciones de crecimiento no definidas suficientemente como para producir células adecuadas en números suficientes para posibles terapias.

Las CMA sí que tienen la ventaja crítica, sin embargo, porque pueden derivarse de “uno mismo”, así cualquier paciente recibiría sus propias células y no se requeriría que experimentase los efectos secundarios perjudiciales de

15 la inmunosupresión para prevenir el rechazo, incluyendo un aumento significativo del riesgo de cáncer. La potencia/plasticidad limitada también se considera que es un factor de seguridad potenciada, porque se limitaría la diferenciación celular aberrante y se reduciría el riesgo de neoplasia.

Se han propuesto terapias basadas en CMA para tratar estados tales como diabetes tipo 1, enfermedad neurodegenerativa (incluyendo enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer), enfermedad cardiovascular, y osteoporosis. Sin embargo, sigue habiendo muchos obstáculos. Éstos incluyen la capacidad para generar cantidades suficientes de células para trasplante y la capacidad para diferenciar éstas en el/los tipo(s) de célula deseado(s) tipo(s). Éstas no han mostrado aún que se integren y sobrevivan en el receptor tras el trasplante. Tampoco se ha demostrado aún que haya eficacia a largo plazo tras el trasplante de ninguna terapia basada en

25 células y no haya problemas de seguridad. Además, siguen sin abordarse cuestiones relacionadas con el rechazo de injertos y el daño celular (antes y después del trasplante).

El uso de trasplantes celulares para combatir la enfermedad parece ser muy prometedor para el tratamiento de estados tales como diabetes y enfermedad de Parkinson. A pesar de ser prometedor, existe mucha controversia en cuando a dónde aislar células adecuadas, qué tipo de células pueden usarse en realidad y cuáles de estas células se usarán realmente. Todavía sigue habiendo cuestiones relacionadas con la seguridad de trasplantes celulares usando células pluripotentes con el potential de carcinogénesis.

El uso de células madre embrionarias y fetales, por ejemplo, está atenazado por consideraciones éticas y morales,

35 pero todavía ha conseguido proporcionar una profusión de información sobre las características de las células madre y su posible utilización (1,2).

Las células de origen adulto proporcionan un enfoque alternativo que se escapa de las cuestiones éticas y ofrece la perspectiva de células derivadas de “uno mismo” para trasplante.

Tales células se han denominado o bien células progenitoras o bien células madre (3) y presentan varias características definidas para células madre ME. Estas células pueden autorrenovarse en cultivo indefinidamente sin diferenciarse en tipos de células especializadas. Además, cuando se hacen crecer en medio adecuado con morfógenos o factores de crecimiento apropiados y pueden usarse para derivar tipos de células especializadas. Se

45 han aislado células madre de adulto de la mayoría de los tejidos, pero el grado de plasticidad de desarrollo presentado por estas células es objeto de debate (3).

Sumario de la invención

La insulina en el páncreas la fabrican células beta secretoras de insulina. In vivo, se cree que el recambio de células beta tiene lugar durante toda la vida, aunque existe controversia en cuanto al origen de las células de sustitución. Melton et al (30) han propocionado datos que indican que las células beta experimentan en realidad autorrenovación. Las observaciones en modelos con animales y experimentación in vitro indican que las células de conducto pancreático pueden proporcionar todavía una fuente de células capaces que son análogas a las células

55 beta porque pueden producir insulina y dan lugar a agrupaciones similares a islote (4). También existe la evidencia de que estas células expresan el marcador de células madre neurales, nestina (4,12)

Los inventores han determinado que una población de células de páncreas de adulto puede funcionar como las CMA. Por consiguiente, en su forma más general, la presente invención proporciona una población de células multipotentes aisladas tal como se define en las reivindicaciones adjuntas al presente documento.

Se han depositado CP derivadas de páncreas de rata adulta según el Tratado de Budapest de 1977 en la Colección Europea de Cultivos Celulares, Porton Down, Salisbury Wiltshire, R.U., SP4 OJG el 12 de mayo de 2005 por el Tribunal Universitario de la Universidad de Glasgow según el n.º ECACC Q6203.

65 Los inventores también han derivado una población análoga de células a partir de mama humana y riñón humano.

Además, los inventores han demostrado la presencia de una población de células funcionalmente análoga procedente de la médula ósea de roedor.

Los inventores han determinado sorprendentemente que las células productoras de insulina pueden derivarse de la

5 población de células adultas multipotentes que podría usarse para trasplante en pacientes diabéticos. La población de células expresa nestina cuando se analizan mediante RT-PCR y pueden crecer en ausencia de matriz extracelular, tal como el sistema de cultivo libre Matrigel(™), en presencia de suero en el medio de crecimiento.

Los inventores han determinado además que, tras el trasplante, las CP pueden inducir que se regeneren células del

10 huésped para regenerar el tejido pancreático dañado. Por tanto, parece que esta población de células novedosa no sólo puede madurar en células productoras de insulina, sino que también pueden estimular que se regeneren células del huésped. Este hallazgo tiene una importancia considerable en el campo de terapias basadas en células.

El tejido pancreático de adulto es preferiblemente humano. Sin embargo, puede derivarse de otras especies de 15 mamíferos, por ejemplo rata, ratón, primates, cerdo, etc.

Preferiblemente, la población de células comprende células depositadas con el número de registro Q6203 en la ECACC el 12 de mayo de 2005.

20 Preferiblemente, se cultiva el tejido en medio CMRL-1066 que está disponible comercialmente (Sigma - C-0422). Sin embargo, el experto en la técnica conocerá otros medios.

El tejido obtenido a partir de conductos pancreáticos de adulto puede comprender conductos completos que se han triturado para ayudar en la etapa de cultivo. 25 Las células, etc. se administran preferiblemente por vía intravenosa o pueden trasplantarse al sitio enfermo.

La enfermedad está asociada con degeneración de las células pancreáticas.

30 El estado patológico que va a tratarse puede incluir diabetes (tipo I y II).

Se apreciará que una realización preferida de la invención es en la que el donante de las células y el receptor son de la misma especie, de manera ideal seres humanos. Sin embargo, los inventores han determinado sorprendentemente que las células actúan a través de la barrera entre especies con pocos o ningún problema

35 inmunológico. Por consiguiente, una realización de la presente invención incluye el uso de CP de rata en el tratamiento de pacientes humanos.

Ahora se ilustrarán aspectos y realizaciones de la presente invención, a modo de ejemplo, con referencia a las figuras que se acompañan. Aspectos y realizaciones adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica. 40 Figura 1. Fotomicrografía óptica de CP hechas crecer en CMRL.

Figura 2. Caracterización de marcadores de CP.

45 Figura 2.2 Caracterización mediante RT-PCR de CP.

Figura 3 Ensayo TRAP para CP.

Figura 4. 50 Figura 5.1.

Figura 5.2.

55 Figura 6. Autopsia de ratones diabéticos por STZ tratados con CP.

Figura 7. Tinción inmunohistoquímica para insulina y glucagón en ratones diabéticos por STZ tratados con CP.

Figura 8A. PCR-RFLP con Hin F1 para insulina. 60 Figura 8b. RFLP con Hin F1 para insulina.

Figura 8.1 Islotes derivados de CP.

65 Figura 8.2 Célula similar a célula neuronal derivada de CP.

Figura 8.2A Tinción mediante ICH de agrupación similar a islote derivado de CP.

Figura 8.2B TEM de agrupación de islote derivado de CP. Los ejemplos de vesículas nucleares densas con halo de electrones translúcido se marcan con flechas. 5 Figura 9. Análisis de SA-β-Gal de cultivos de CP con pases realizados en serie.

Figura 10. Análisis de RT-PCR de marcadores de islotes.

10 Figura 11. Análisis de FACS de CP para determinar la expresión de Thy-1.

Figura 12. Características de crecimiento de CP en cultivo.

Figura 13. Determinación del contenido en lipofuscina en las CP con pases realizados en serie. 15 Figura 14. Análisis mediante WST de células exploradoras (pathfinder cells) con agresión oxidante creciente.

Figura 15. Expresión en porcentaje de SA-β-Gal en CP con pases en serie.

20 Figura 16. Expresión en porcentaje de SA-β-Gal en CP tras tratamiento con peróxido de hidrógeno.

Figura 17. Expresión en porcentaje de SA-β-Gal en CP tras pases en serie con exposición aguda a oxidante.

Figura 18. Ensayo de citotoxicidad con LDH para CP con exposición a H2O2. 25 Figura 19. Expresión relativa de p21, SIRT2 y XRCC5 en CP tras tratamiento con peróxido de hidrógeno 25 μM.

Figura 20. Micrografía óptica (X100) de aislado clonal diferenciado de una CP para generar una célula progenitora neural.

30 Figura 21. CP hechas crecer en células con diferenciación de hepatocitos definida CD90+ (panel A) y CD90- (panel B) y células no diferenciadas (panel C).

Figura 22. Células con diferenciación CD90 + en proceso de formar agrupaciones de islote (indicadas mediante 35 flechas).

Figura 23. Células exploradoras derivadas de mama humana (x100).

Figura 24. Secreción de insulina estimulada por glucosa (pg) por mg de proteína por minuto en CP no diferenciadas 40 (UD, undifferentiated) e islotes derivados de CP (DIFF, differentiated), estimulados con glucosa 3 mM (G3),10 (G10) y 20 (g20).

Ejemplo 1

45 Paliación de diabetes inducida por STZ por células exploradoras derivadas de páncreas de adulto en un modelo de xenoinjerto en roedores

Introducción

50 En todo el mundo, 150 millones de personas padecen diabetes. A pesar de la terapia con insulina, no son poco comunes las complicaciones tardías tales como retinopatía, nefropatía y neuropatía.

El trasplante de islotes procedentes de cadáveres ofrece un medio para tratar el problema de la diabetes tipo I, pero está comprometido por la falta de órganos disponibles. Las terapias con células madre ofrecen un posible medio 55 para enfrentarse a estos problemas. Aún no está claro si esta tecnología podrá generar células beta totalmente funcionales.

Un enfoque para facilitar la generación de células beta ha implicado la expansión y diferenciación de células progenitoras pancreáticas humanas de adulto, que están estrechamente relacionadas con el linaje de células beta y

60 que evitarían la controversia y los problemas técnicos asociados con el uso de células madre pluripotentes (13). Se ha proporcionado la evidencia de que las células madre residen en los conductos pancreáticos mediante modelos con roedores de regeneración del páncreas (14,15,16), aunque el estado de las células madre en el páncreas de adulto no está claro.

65 Se ha demostrado que las células ductales de ratón in vitro proporcionan una fuente de progenitores pancreáticos (17,18). También se ha notificado la diferenciación endocrina en cultivos enriquecidos para células de conducto pancreático humanas (19).

Todavía es controvertida la naturaleza exacta de cualquier célula progenitora/madre pancreática. Además de la

5 célula epitelial ductal, se ha descrito una célula progenitora de islote candidata adicional, basándose en la expresión del marcador de células madre neurales, nestina, y la carencia de marcadores de células ductales y de islote conocidos (12,20).

Se ha notificado que tales células positivas para nestina se diferencian in vitro en fenotipos pancreático endocrino,

10 exocrino y hepático (12). También se ha descrito la diferenciación de células productoras de insulina de CME de ratón como que implican un tipo de célula intermedia que expresa nestina (21). Esto va en contra de los análisis descriptivos establecidos de desarrollo de páncreas humano y de ratón, que descartan un papel para cualquier célula que expresa nestina en la diferenciación de islotes (22).

15 Un punto de vista aceptado de manera más tradicional es que células progenitoras/madre endocrinas pancreáticas expresan PDX-1, un marcador conocido para células productoras de insulina. (19) Se ha demostrado que tal tipo de célula puede ser apropiado para la manipulación in vitro y cuando se hacen crecer en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos-7 (FGF-7) para estimular la proliferación de células ductales. Se ha notificado que el crecimiento adicional sobre Matrigel, complementado con nicotinamida (NIC) inicia y estimula la diferenciación

20 endocrina (23-25).

Estos datos han estado respaldados por la identificación de una población de células humanas similar. Se ha notificado que estas células requieren condiciones de crecimiento libres de suero y el uso de Matrigel como lo más esencial. Se han inducido in vitro para producir estructuras similares a islotes, que producen insulina en respuesta a

25 la estimulación con glucosa. De forma crítica, no se encontró evidencia para el desarrollo de células endocrinas a partir de células madre positivas para nestina (26)

Los inventores han aislado células madre de adulto multipotentes del páncreas desde las que derivar células productoras de insulina que podrían usarse para trasplante. Se buscaron células de adulto para eludir los dilemas

30 éticos y morales asociados con los tipos de células embrionarias y fetales. De forma crítica, los inventores han tratado de demostrar que esto puede lograrse con el uso de células positivas para nestina y la presencia de crecimiento en un sistema de cultivo libre de Matrigel con la presencia de suero en el medio de crecimiento.

Una característica significativa de esta línea de experimentación, es que se diseñó para determinar los destinos de

35 la célula trasplantada con respecto a cualquier regeneración de tejido. Así, se determinaría si las CP indujeron que las células del huésped regenerasen el tejido pancreático dañado, o si ellas mismas proliferaron y regeneraron el tejido, o si hubo una combinación de ambos. Esto es un aspecto crítico de la actual solicitud ya que no se considera obvio en el campo que pudieras regenerarse el tejido del huésped mediante la estimulación de células de otra especie, o de hecho que una combinación de células de ambas especies pudiera efectuar la reparación del tejido.

40 Materiales y métodos

Se aislaron conductos pancreáticos de ratas Albino Swiss de 12 meses y se trituraron, antes de sembrarse en medio CMRL. Las células exploradoras emergieron como una monocapa confluente tras aproximadamente 5 semanas en

45 cultivo. Entonces se recogieron éstas y se lavaron con PBS.

Mantenimiento de CP

Se mantienen las CP en cultivo en 20 ml de medio CMRL 1066 (Invitrogen, Paisley, R.U.) complementado con suero

50 bovino fetal al 10% (Sigma, Poole, R.U.), Glutamax 2 mM, anfotericina B 1,25 ug/ml, y penicilina/estreptomicina 100 u/ml/100 ug/ml, (todos de Invitrogen, Paisley, R.U.) en matraces de cultivo T75 con tapas de filtro de 0,2 um (Corning, R.U.) a 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO2.

Se realizan pases de cultivos subconfluentes mediante la retirada total del medio de cultivo mediante pipeta y el

55 lavado de las células adherentes mediante la adición de 10 ml de solución salina equilibrada de Hanks libre de calcio y magnesio (HBSS), (Cambrex Bio-Science, Wokingham, R.U.) al matraz durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tras la retirada del HBSS del matraz mediante pipeta, se añaden al matraz 2 ml de disolución de tripsina-Versene (Versene 200 mg/l, tripsina 500 mg/l). Se examina periódicamente el matraz microscópicamente hasta que puede confirmarse la disociación de la monocapa celular. Entonces se retiran las células mediante pipeta y vuelven a

60 cultivarse como anteriormente a una densidad de 1/5 - 1/10 según se desee mediante la adición de 20 ml de medio de cultivo nuevo. Debe sustituirse el medio dos veces a la semana por 20 ml de medio nuevo. Tras varios pases para establecer la población de células, se mantienen las CP en 20 ml de medio CMRL 1066 (Invitrogen, Paisley, R.U.) complementado con suero bovino fetal al 5% (Sigma, Poole, R.U.), Glutamax 2 mM, anfotericina B 1,25 ug/ml y penicilina/estreptomicina 100 μ/ml (todos de Invitrogen, Paisley) en matraces T75 o T160 con tapas de filtro de 0,2

65 um a 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO2.

Citometría de flujo

Se lavan las células cultivadas y se tripsinizan como anteriormente. Entonces se centrifugan a 1000 x rpm durante 10 minutos y se resuspende el sedimento celular resultante en PBS. Entonces se realiza un recuento de viabilidad

5 con azul trípano (Invitrogen, Paisley, R.U.) y entonces se marcan 100.000 - 1.000.000 células/ml con 100 ul de una anticuerpo de ratón anti-CD90 de rata a una dilución 1/75 (Serotec, Kidlington, R.U.) en BSA al 0,2%/PBS durante 45 minutos a 4ºC en la oscuridad. Entonces se lavan y se centrifugan tres veces a 1000 x rpm en BSA al 0,2%/PBS antes de marcarse mediante la adición de 100ul de una dilución 1/15 dilución de fragmento (Fab)2 conjugado con FITC de inmunoglobulinas de conejo anti-ratón (Dako Cytomation, Ely, R.U.) en BSA al 0,2% complementado con suero de bloqueo al 5% durante 45 minutos a 4ºC en la oscuridad. También se preparó un control de segundo anticuerpo solo. Tras lavarse y centrifugarse como anteriormente, se resuspende el sedimento celular resultante en 1 ml de PBS y se determina el porcentaje de células positivas usando un citómetro de flujo Beckman Coulter XL (Beckman Coulter, High Wycombe, R.U.).

15 Serie de trasplantes 1

Se hicieron diabéticos ratones C57BL/6 (n=5) mediante inyección de estreptotozocina (STZ, 250 mg/kg) en el día 0. Se inyectaron 750.000 CP en la vena de la cola en el día 3. Los animales control reciben una inyección de solución salina o un número equivalente de células de médula ósea de C57BL/6. Se monitorizó la glucosa en sangre cada 3 días.

Serie de trasplantes 2

Se hicieron diabéticos ratones C57BL/6 (n=4) mediante inyección de estreptotozocina (STZ 250 mg/kg) en el día 0. 25 La glucosa en sangre

Medición de la expresión de lipofuscina

Se evaluó el contenido en lipofuscina celular usando citometría de flujo con emisión azul en la región de 560590 nm. Se calcularon las lecturas como valores medios de los picos de emisión y se expresaron en unidades arbitrarias.

Metodología de ensayo con WST

35 Se sometieron células exploradoras a agresión oxidante tal como se describe a continuación y se evaluaron para determinar la capacidad proliferativa mediante el ensayo con WST (Roche, Suiza) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ensayo con LDH

Se realizaron ensayos de citotoxicidad con LDH usando un kit de detección de citotoxicidad (Roche, Nonnenwald, Alemania), siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Cultivo de tejido de mama humana

45 Muestra de tejido de mama en trozos de 1 cm de pacientes que se someten a mamoplastia de reducción. Se transporta en 5 ml de medios CMRL 1066 complementados con suero bovino fetal al 10% (Sigma, Poole, R.U.), Glutamax 2 mM, anfotericina B 1,25 ug/ml y penicilina/estreptomicina 100 u/ml (todos de Invitrogen, Paisley). Se trituró el tejido en condiciones estériles usando hojas de bisturí y luego se trató con colagenasa IV (0,05 g en 10 ml de HBSS) durante 5-12 horas. Se aspiraron éstos con jeringa usando una aguja de calibre 16 y se sembraron en matraces de cultivo tisular T25 en los medios anteriores a 37ºC en una atmósfera con el 5% de CO2.

Medios y experimentos de diferenciación

55 Se sembraron las células en placas a 0,25 y 0,5 x106 células por T75 y a 0,1 x 105 células

Medios de hepatocitos

DMEM:F12 ( ) complementado con factor de crecimiento de fibroblastos 4 10 ng/ml (Sigma), 1 x ITS (Gibco), penicilina/estreptomicina 100 u/ml y albúmina sérica bovina al 0,2%.

Clasificación celular

Anticuerpo primario – de ratón anti-CD90 de rata (Serotec)

65 Anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón en perlas Dynabeads (Dynal Biotech) Tampón 1: PBS (sin Ca2+ ni Mg2+ con BSA al 0,1% y EDTA 2 mM pH 7,4.

Según el protocolo del fabricante, brevemente:

5 Procedimiento de lavado de Dynabeads: se transfiere el volumen deseado de Dynabeads resuspendidas a un tubo Eppendorf, se añade el mismo volumen o al menos 1 ml de tampón 1. Se pone el tubo en un imán durante 1 min. y se desecha el sobrenadante. Se retira del imán y resuspende en el volumen original de tampón 1.

10 Se añade 1 ug de anticuerpo primario por 106 células diana. Se incuba durante 10 minutos a 2-8ºC.

Se lavan las células añadiendo 2 ml de tampón 1 por 1x 107 células y se centrifuga a 300 x g durante 8 min. Se desecha el sobrenadante.

15 Se resuspenden las células en tampón 1 a 1 x 107 células por ml.

Procedimiento de aislamiento

Se añaden Dynabeads 25 ul por 1x107 células /ml de muestra. 20 Se incuban durante 20 minutos a 2-8ºC con inclinación y rotación suaves.

Se duplica el volumen con tampón 1 para limitar el atrapamiento de células no unidas.

25 Se pone el tubo en un imán durante 2 minutos.

Se desecha el sobrenadante y se lavan suavemente las células unidas a las perlas 4 veces usando el siguiente procedimiento: 1) se añade 1 ml de tampón 1 por 1x107 Dynabeads 2) Se pone el tubo en un imán durante 1 minuto y se desecha el sobrenadante.

30 Se resuspenden células en medios de cultivo de mantenimiento y se siembran en placa en matraces de cultivo tisular.

Procedimiento de agotamiento 35 Se añaden Dynabeads 50 ul por 1x107células /ml de muestra.

Se incuban durante 30 minutos a 2-8ºC con inclinación y rotación suaves.

40 Se duplica el volumen con tampón 1 para limitar el atrapamiento de células no unidas

Se pone el tubo en un imán durante 2 minutos.

Se transfiere el sobrenadante que contienen las células no unidas a un tubo nuevo. 45 Se vuelve a poner en el imán durante un minuto adicional.

Se transfiere el sobrenadante que contienen las células no unidas y se añade a medios de cultivo de mantenimiento y se siembran en placa en matraces de cultivo tisular. 50 Se realizó MACS en cada población clasificada, dos veces antes de su uso en los experimentos.

Se comprobaron todas las poblaciones clasificadas con citometría de flujo activada por fluorescencia antes de su uso en los experimentos. 55 Ensayo de beta-galactosidasa asociada a senescencia

Se hicieron crecer células sobre placas de 6 pocillos a una densidad de 105 células por pocillo. A aproximadamente 72 - 96 horas tras la siembre (y una vez confluentes), se lavaron las células con PBS, se fijaron durante diez minutos

60 a temperatura ambiente en 1 ml de formaldehído al 2%/glutaraldehído al 0,2%. Se aclararon dos veces con PBS estéril y se incubaron a 37ºC (sin CO2) y se envolvieron en película Parafilm para impedir la deshidratación de la disolución de tinción de SA-β-Gal nueva, preparada tal como sigue (se expresan las concentraciones finales): por ml de disolución

65 • 1 mg de X-gal

• ferricianuro de potasio 5 mM

•

ferrocianuro de potasio 5 mM 5 • MgCl2 2 mM

• NaCl 150 mM

•

ácido cítrico 40 mM y fosfato de sodio a pH 6 (se usó pH 4 como control positivo para garantizar la eficacia de la 10 tinción en uno de los seis pocillos).

Se dejó la disolución sobre las células durante hasta 4 días para lograr la máxima tinción, el análisis microscópico en última instancia mostró un precipitado azul dentro de las células control. Tras completarse, se eliminó la tinción; se lavaron las células con PBS, y se almacenaron con 3 ml de glicerol al 70% a 4ºC.

15 El aumento visualizó todo el campo para el recuento. Se contó el área bajo el ocular tanto para células positivas como negativas. Se expresaron las células senescentes, positivas como un porcentaje del recuento celular total. Esto se repitió en seis campos, asignados aleatoriamente. Se calculó un valor medio para la expresión de SA-β-Gal para cada tratamiento con peróxido de hidrógeno, a partir de los valores obtenidos para los seis campos

20 independientes.

Cuantificación de ARN mediante espectrofotometría

Se cuantificó el ARN usando el espectrofotómetro capilar GeneQuant (Pharmacia Biotech) siguiendo los parámetros 25 por defecto para ARN. Se midió la concentración a 260 nm y se estimó la pureza como la razón de absorbancia a 260/280 nm.

Síntesis de ADNc (transcripción inversa de ARN total)

30 Se logró la síntesis de ADNc de primera hebra para PCR en tiempo real (Taqman) usando el sistema de síntesis de primera hebra SuperScriptTM (Invitrogen).

PCR cuantitativa en tiempo real (Taqman)

35 Se usó la PCR cuantitativa en tiempo real para el análisis de cuantificación de ADNc con el fin de monitorizar los patrones de expresión de ARNm de los genes de interés. Se realizó el análisis usando el sistema de detección de secuencias ABI Prism® 7700. Se midió la expresión génica asociada a senescencia en todos los casos con relación a un control de gen de ARN 18S.

40 Se diseñaron los cebadores TaqManTM y las sondas conjugadas a FAM-TAMRA usando el software Primer Express y se fabricaron por Biosource UK Ltd.

Secuencias de RT-PCR de rata

45 Secuencias de cebadores y sonda (5’-3’)

18s:

Cebador directo acctggttgatcctgccagtag 50 Cebador inverso agccattcgcagtttcactgtac

Sonda: FAM-tcaaagattaagccatgcatgtctaagtacgcac-TAMRA

55 XRCC5:

Cebador directo tttcagcggttgtaccagtgtct

Cebador inverso catattcaaaatgtgctgctgaatt 60 Sonda: FAM-ctccaggagcggctgcccc-TAMRA

p21:

65 Cebador directo gagccacaggcaccatgtc

Cebador inverso cggcatactttgctcctgtgt

Sonda FAM-cctggtgatgtccgacct-TAMRA 5 SIRT2-sim:

Cebador directo tccctcatcagcaaggca

10 Cebador inverso gatccgtctggcctgtctt

Sonda FAM - tagccaccccacgactgc-TAMRA

PRUEBA DE SECRECIÓN DE INSULINA ESTÁTICA (SIST, por sus siglas en inglés “Static Insulin Secretion Test”)

15 Se usó una prueba de estimulación estática como modelo in vitro para evaluar la capacidad de las agrupaciones similares a islotes para secretar insulina en respuesta a concentraciones variables de glucosa.

2.2.1 Preparación de reactivos

20 Se requirieron cuatro disoluciones madre para el experimento:

Se preparó la disolución madre 1 disolviendo 13,44 g de cloruro de sodio (ANALR BDH) en 500 ml de agua desionizada.

25 Se preparó la disolución madre 2 disolviendo 4,03 g de bicarbonato de sodio (SIGMA), 0,75 g de cloruro de potasio (SIGMA) y 0,41 g de cloruro de magnesio (SIGMA) en 500 ml de agua desionizada.

Se preparó la disolución madre 3 disolviendo 0,74 g de cloruro de calcio (SIGMA) en 500 ml de agua desionizada y.

30 Se preparó la disolución madre 4 disolviendo 59,5 g de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N’-2-etanosulfónico (SIGMA)) en 500 ml de agua desionizada y se corrigió el pH a pH 7,4.

Se almacenaron las 4 disoluciones madre a 4ºC hasta que se requirió preparar 800 ml de disolución de trabajo A

35 (KRB G0). Para preparar la disolución de trabajo KRB G0, se mezclaron juntos 200 ml de las disoluciones madre 1, 2 y 3, 40 ml de disolución madre 4 y 160 ml de agua desionizada. Se añadieron 800 mg de albúmina sérica (SIGMA) y se ajustó la disolución a pH 7,4. Se añadieron diversas cantidades de glucosa a KRB G0 para preparar disoluciones de glucosa 0,003 M, 0,01 M y 0,02 M denominadas G3, G10 y G20, respectivamente.

40 2.2.2 Procedimiento

Se retiraron las placas del incubador con el 5% de CO2 y el 95% de aire a 37ºC, se desecharon los medios y se lavaron 3 veces con G3 (que no contenía carbacol). Para inducir niveles similares de actividad metabólica entre todos los grupos de células, se añadieron 2 ml de G3 a todos los pocillos y se incubaron las placas a 37ºC durante

45 60 min. en condiciones del 5% de CO2 y el 95% de aire. Entonces se desechó la disolución G3 y se añadieron 2 ml de las concentraciones de glucosa G3, G10 y G20 por duplicado a los pocillos apropiados

Se incubaron las placas en un incubador con el 5% de CO2 y el 95% de aire durante 2 horas a 37ºC. Después de eso, se retiró el sobrenadante de cada pocillo y se almacenó junto con las placas a -70ºC para el análisis bioquímico. 50 ELISA PARA INSULINA DE RATA

Se usó un kit de ELISA para insulina de rata (Mercodia) para determinar las concentraciones de insulina dentro de los sobrenadantes. El kit es una técnica de inmunoensayo de tipo sándwich dirigido por enzimas, de dos sitios, de 55 fase sólida en la que se dirigen dos anticuerpos monoclonales frente a determinantes antigénicos independientes en la molécula de insulina. Se realizó el ensayo siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Análisis de datos

60 La cantidad de insulina liberada en el sobrenadante en cada pocillo depende de la masa de células presentes dentro de cada pocillo. Con el fin de normalizar la insulina liberada dentro de cada pocillo, se dividieron las concentraciones de insulina en el sobrenadante entre la concentración de proteína para cada pocillo individual. Entonces se expresó la concentración de insulina concentración como la cantidad de insulina liberada (pg) por mg de proteína por minuto.

65 Resultados Los conductos triturados cultivados en CMRL durante cinco semanas dieron como resultado la formación de una monocapa de CP. Puede valorarse la morfología celular de estas mediante la fotomicrografía óptica mostrada en la figura 1. Estas células fueron objeto de caracterización mediante inmunocitoquímica (ICC) y RT-PCR.

5 Las CP se tiñeron positivas para los marcadores neurales, nestina y GFAP mediante ICC (figura 2.1) y RT-PCR y para NCAM, cMet Oct 4 y nestina (figura 2.2). Aparecieron negativas para el factor de transcripción de insulina PDX1 y la expresión de insulina, somatostatina, polipéptido pancreático y glucagón mediante RT-PCR (tabla 1). Las CP no parecen expresar marcadores de células neurales diferenciadas tales como, EX2, CYCc, MBPF, AA3 y GTX, de acuerdo con un estado no especializado. Se ha descrito una población de células no idéntica, similar, para páncreas de ratón adulto (27)

Estas células y aislados de células individuales, se han propagado posteriormente de manera continua en cultivo durante 18 y 24 meses sin signos de detención del crecimiento ni cambio manifiesto en el fenotipo. Se han realizado ensayos con el protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas (TRAP, telomere repeat amplification protocol)

15 con ellos y demuestran que los cultivos son positivos para telomerasa (figura 3). De manera tradicional, se cree que las supuestas células madre son negativas para telomerasa y sólo reactivan la telomerasa durante la proliferación. La observación de los inventores concuerda con este punto de vista.

Estudios previos sobre el aislamiento de células estrellada de páncreas de rata produjeron cultivos negativos para telomerasa (28)

Las CP hechas crecer en cultivo durante más de doce meses retienen todavía la capacidad para diferenciarse en otros tipos de células cuando se hacen crecer en un medio de crecimiento apropiado. Esto es de nuevo una característica típica de las células madre.

25 El aislamiento de cultivos que expresan nestina que podría usarse para derivar grandes números de células, y facilita el desarrollo de estudios de trasplantes limitados previamente por el número de células disponibles.

Los inventores han empleado la administración de las CP para combatir la diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) en un modelo de xenoinjerto concordante en roedores, con vistas a seguir la pista a cualquier célula funcionalmente eficaz a través de la barrera entre especies. Se hicieron diabéticos ratones C57BL/6 mediante inyección de STZ en el día 0, mientras que se inyectaron 750.000 CP en la vena de la cola de animales tratados en el día 3. Los animales control recibieron una inyección de solución salina o un número equivalente de células de médula ósea de C57BL/6. Se monitorizó la glucosa en sangre cada 3 días. La elección de médula ósea (MO)

35 autóloga como control extra era para evaluar observaciones previas que indican que las células derivadas de MO podían; tras el trasplante, dar lugar a la producción de insulina en animales tratados con STZ (4).

Los animales tratados con CP sobrevivieron al tratamiento con STZ a diferencia de los grupos control (figura 4). Tras la administración de STZ, la glucosa en sangre en todos los grupos se elevó desde una media de 7 hasta 45 mM/l. Esta situación persistió con los controles tratados con solución salina probando ser no viables en el día 19, con niveles de glucosa en sangre que alcanzan un máximo a 50 mM/l. El grupo control de MO sobrevivió hasta el día 21 antes de que los niveles de glucosa en sangre descartaran viabilidad. Los animales tratados con CP sobrevivieron en todo el transcurso temporal y más allá del día 33, cuando tuvieron que sacrificarse los animales según las condiciones de autorización para animales

45 La supervivencia de los animales tratados con CP es altamente significativa (tabla 2). Aunque no se logró una glucemia normal, los niveles de glucosa en sangre se estabilizaron en el día 6 a un valor medio de 20 mM/l. Los animales tratados con MO sí que presentaron una ventaja de superviviencia significativa frente a los controles con solución salina (tabla 2). Esta observación está de acuerdo con los informes que indican que las células derivadas de médula ósea tienen la capacidad para generar la producción de insulina tras el trasplante.

Con el fin de establecer si la carencia de normoglucemia se debía a la pérdida de células por un ataque inmunitario,

o se debía a números insuficientes suministrados por vía i.v., se realizaron experimentos de trasplante duplicados en presencia y ausencia de tratamiento con ciclosporina (CsA) y con 1.500.000 células o una inyección repetida de

55 750.000 CP en el día 10 tras la inyección de tratamiento con STZ. Se muestran los resultados de este protocolo particular en la figura 5.

El tratamiento con CsA no pareció tener ningún efecto sobre los niveles de glucosa en sangre, indicando que las CP no son inmunogénicas. Esto está de acuerdo con las observaciones sobre células precursoras de islotes (CPI) con nestina humanas (12). La duplicación del número de células de las CP no mejoró significativamente los niveles de glucosa en sangre hasta cerca de la normolglucemia (figura 5), lográndose una media de glucosa en sangre de ∼20 mM/l, aunque animales individuales lograron 12 mM/l.

La inyección repetida con 1.500.000 células en el día 10 mejoró el nivel medio de glucosa en sangre hasta ∼15 mM/l

65 en el día 33 cuando terminó el experimento. Esto es indicativo de que el aumento del número de células es más eficaz en la paliación de los efectos de STZ. Se requiere que se determine un número de trasplante de células óptimo. De manera similar, es necesario realizar una determinación del momento y el régimen de administración óptimos.

La autopsia de los grupos control y de animales tratados respectivos revela que el tratamiento con CP regenera las

5 células beta pancreáticas (figura 6). La estructura de células beta pancreáticas se destruye en controles tratados con STZ mientras que se recupera sustancialmente en los ratones a los que se trasplantan células. Esto tiene importantes implicaciones para el desarrollo de cualquier estrategia futura usando terapias celulares para tratar la diabetes. La supervivencia de estos ratones indica que se ha logrado una recuperación sustancial de la producción de insulina. Esto se corrobora mediante ICC que indica que el páncreas regenerado produce insulina y glucagón (figura 7).

De manera significativa, las CP parecen no ser inmunogénicas, lo que hace que el amplio uso de esta sencilla administración i.v. de tales células para corregir la diabetes tipo 1 sea una proposición atractiva.

15 El análisis de RT-PCR e ICC de los animales tratados indica que la producción de insulina que resulta del tratamiento con CP es de origen tanto de rata como de ratón. Una PCR para Ins II de rata (Seq ID 5) produce un amplicón de 208 pb común que se digiere con Hin fI para producir fragmentos de 105 pb y 103 pb (figura 8A) para rata y un fragmento de 191 pb y uno de 17 pb para ratón. De manera significativa, también se produce la forma embrionaria de la insulina de ratón (figura 8B). La RT-PCR-RFLP indica que en animales tratados con CP, puede detectarse tanto un transcrito de insulina de rata maduro (marcado como r en ambas figuras 8A y 8B), uno de ratón maduro (marcado como m) y una forma embrionaria correspondiente al producto génico de Ins 1 (marcado como U). Esto se ha confirmado mediante secuenciación y clonación de los fragmentos relevantes. El amplicón de rata de 243 pb, puede digerirse con Hinf I para producir fragmentos de 140 pb y 103 pb. En ratón, el amplicón equivalente, generado con los mismos cebadores de Ins II de rata, se digiere para proporcionar bandas de 191 pb y 52 pb

25 (marcadas como m1 y m2 en la figura 8B). Los animales diabéticos por STZ, a los que se les administró las CP también tienen una banda adicional (marcada como U en la figura 8B) de tamaño equivalente al amplicón no digerido. Esto corresponde a un transcrito de Ins I, normalmente observado durante el desarrollo embrionario. Los informes de su presencia en adultos son ambiguos.

Esto sigue siendo una observación inusual y proporciona un conocimiento sobre el mecanismo de acción de las células CP. La presencia de ambos transcritos indica que las CP se han diferenciado para generar células productoras de insulina y han estimulado que el murino haga lo mismo. Si CP murinas funcionalmente análogas se estimulan está sin determinar. La presencia de transcripción de Ins I y II, sugiere que está teniendo lugar la reprogramación del desarrollo en el tejido murino, aunque no puede excluirse formalmente que persista una

35 población de células similares a ME murinas en el adulto y se estimule en los animales con CP. No se ha observado previamente una evidencia para esto. En efecto, Melton et al (30) han producido datos que indican que la única fuente de regeneración de células beta, incluso tras lesión, son las células beta existentes y que no hay implicación de células madre murinas en la generación del páncreas de ratón tras el daño. Nuestros datos no son totalmente incongruentes con esta observación. En efecto, son compatibles con una estimulación de tejido no dañado para que sirva como sustrato para regenerar el tejido dañado.

Este escenario se ve respaldado adicionalmente por el examen del páncreas de ratones tratados. La tinción de secciones pancreáticas de estos animales con antisuero anti-rata policlonal, no puede detectar ningún antígeno de rata de superficie celular. Las secciones de rata control se tiñen de forma brillante, mientras que el ratón control y los

45 ratones diabéticos tratados son negativos para la presencia de antígenos de rata. Estas observaciones respaldan la observación de que se regenera el páncreas murino endógeno y que esto no es una consecuencia de la fusión celular generalizada con las células exploradoras de rata.

La hibridación in situ sin embargo, con el cromosoma 10 de rata y el cromosoma Y de rata, sí que detecta la presencia de cromosomas de rata en el páncreas de animales tratados. Éstos se detectan rara vez y comprenden menos del 1% de células de islotes pancreáticos en los animales tratados. Su presencia respalda la detección de la insulina de rata en los animales tratados. No se detectaron células que contuvieran el cromosoma Y de rata ni una señal murina. También se detectaron a bajos niveles (<1%) células que contenían una señal triple para el cromosoma 10 de rata y ratón diploide, indicativo de fusiones celulares. Esto está de acuerdo con informes previos

55 sobre acontecimientos de fusión de células madre tras el trasplante.

Ejemplo 2

Derivación de islotes a partir de CP

Pueden cultivarse CP para producir islotes in vitro, a través del crecimiento en el medio apropiado. Se diferenciaron células CP mediante la eliminación completa del medio CMRL del matraz mediante pipeta y la adición de 10 ml de HBSS (véase anteriormente) durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier cantidad de suero en exceso. Tras la retirada del HBSS, se añaden 20 ml de medio DMEM/F12 (Invitrogen, Paisley, R.U.) 65 complementado con penicilina/estreptomicina (como anteriormente), anfotericina (como anteriormente), BSA al 0,2%, niacinamida 10 mM, factor de crecimiento de queratinocitos 10 ng/ml (todos de Sigma, Poole, R.U.) e ITS-X:

(insulina 10 mg/l, transferrina 5,5 mg/l, selenito de sodio 6,7 ug/l) (Invitrogen, Paisley, R.U.) al matraz de cultivo T75. Entonces se mantienen las células a 37ºC en un incubador de CO2 y se sustituye el medio de cultivo dos veces a la semana por 20 ml de medio nuevo. Éstas producen agrupaciones de islotes (figura 8.1) o neuronas, en presencia o ausencia de suero.

5 Las agrupaciones de islotes, derivadas tal como se describió anteriormente, se tiñen positivamente para la presencia de insulina (figura 8.2A) y contienen vesículas nucleares densas con un halo electrónico translúcido, típico de las vesículas que contienen insulina (figura 8.2B). Las agrupaciones son positivas para la presencia de insulina, somatostatina, polipéptido pancreático y glucagón, tal como se valora mediante análisis de RT-PCR. De forma crítica, también expresan Pdx-1, tal como se valora mediante RT-PCR (tabla 1) e insulina y glucagones (figura 10). Se enumeran las identidades de secuencia en el apéndice.

Las CP pueden clasificarse mediante FACS, usando el marcador de rata Thy-1, para producir dos poblaciones distintas basándose en la presencia o ausencia de expresión de este marcador (figura 11)

15 El crecimiento prolongado en cultivo da como resultado la acumulación de beta-galactosidase asociada a senescencia (SA-β-Gal), indicativa del inicio de senescencia en el cultivo. Esto refleja normalmente una acumulación de daño celular. Esto es un hallazgo novedoso, ya que las células ME son normalmente resistentes a la acumulación de este marcador con el cultivo prolongado (29). No se observó tal acumulación con pases crecientes con un marcador establecido de daño oxidante, lipofuscina. Esto tiene implicaciones en el campo, relativas a la elucidación de supuestas células madre cancerosas y la seguridad de células dañadas cuando se usan en experimentos de trasplante o en otras estrategias de la medicina regenerativa, tales como reconstrucción de mama.

Ejemplo 3

25 Las células exploradoras presentan características de células madre, pero muestran diferencias en su respuesta a la agresión oxidativa.

Características de crecimiento de las CP

Las células exploradoras demuestran un crecimiento exponencial y no muestran un aumento en los tiempos de duplicación de la población y la ausencia de una meseta de crecimiento. (Figura 12).

Esto está de acuerdo con observaciones sobre células ME, que indican que estas células pueden permanecer no

35 diferenciadas in vitro durante periodos prolongados. La figura 1 ilustra dos cultivos de CP de rata individuales (A y B) de los que se realizan pases en serie en cultivo durante 172 días, sin presentar senescencia. El número total de células obtenidas a partir del aislamiento inicial hasta el punto de tiempo del día 172 es del orden de 1 x 1034. Esto ilustra la utilidad de estas células en la producción de números adecuados de células para trasplante.

Determinación del contenido en lipofuscina en CP con pases realizados en serie

La lipofuscina es un pigmento no degradable, de autofluorescencia que se acumula progresivamente con la edad en los lisosomas de células en replicación. Se notifica que se acelera su acumulación en condiciones de agresión oxidativa aumentada. Las células más grandes, con elevado contenido en lipofuscina son normalmente senescentes

45 (Figura 13. El contenido medio en lipofuscina en la población de células exploradoras demostró una reducción con pases en serie. Sin embargo, cuando se usó un protocolo de regulación mediante FACS que selecciona una población de células uniforme por tamaño y granularidad, no hubo un cambio significativo en el contenido en lipofuscina. Estos datos demuestran que existe una subpoblación aparente de CP que tienen un alto contenido en lipofuscina, y presentan las características de tamaño de las células senescentes. Esta subpoblación se pierde con los pases en serie, ya que las células restantes no muestran un cambio en el contenido en lipofuscina a lo largo del tiempo en cultivo.

Proliferación de CP en presencia de niveles elevados de estrés oxidante

55 A diferencia de las células ME (31), las células exploradoras sí que muestran una sensibilidad a la agresión oxidativa tal como se determina mediante el ensayo con WST. El ensayo con WST se basa en la escisión de la sal de tetrazolio WST-1 en formazano por deshidrogenasas celulares mitocondriales. La expansión en el número de células viables da como resultado un aumento en la actividad global de las deshidrogenasas mitocondriales en la muestra. El aumento en la actividad enzimática conduce a un aumento en la cantidad de colorante formazano formado. Se cuantificó el colorante formazano producido por células viables mediante un espectrofotómetro de múltiples pocillos midiendo la absorbancia de la disolución de colorante a 440 nm.

Se muestran los datos procedentes de estos análisis en la figura 14. Una concentración de 100 μM es suficiente para reducir la proliferación de CP en un 50%.

65 Análisis de SA-β-Gal SA-β-Gal es un biomarcador clásico para el estrés oxidante en células de mamífero, que se acumula con daño oxidativo creciente. Se ha propuesto como biomarcador para el envejecimiento biológico y se ha observado que aumenta en tejidos humanos con el aumento de la edad cronológica. Los inventores han observado un aumento en

5 la expresión de SA-β-Gal en CP con pases crecientes en cultivo. (Figura 15). Este porcentaje de expresión de SA-β-Gal se redujo de manera significativa con los pases en serie prolongados (figura 15). Además, desde el pase 16 en adelante, el porcentaje de células que expresan SA-β-Gal ha permanecido por debajo del 10%.(figura 15). Esto es una característica típica de células no senescentes o aquéllas con defensas antioxidantes superiores.

10 A la inversa, las células exploradoras sí que presentan sensibilidad al estrés oxidante agudo. Se observó un aumento significativo en la expresión de SA-β-Gal con concentraciones crecientes de peróxido de hidrógeno. (Figura 16). Esto está de acuerdo con las observaciones tras exposición oxidante en el ensayo con WST.

Los datos obtenidos por los inventores indican que las células exploradoras, a diferencia de las células madre

15 típicas, presentan una sensibilidad diferencial al estrés oxidante. A diferencia de las CMM, no parecen mostrar senescencia replicativa y pueden hacerse crecer durante periodos de tiempo prolongados en cultivo (años). Por consiguiente, la expresión de lipofusicina y SA-β-Gal disminuye en pases posteriores de estas células. El análisis de lipofuscina indica que los pases tempranos de células exploradoras contienen una subpoblación de células que muestran características de que son senescentes (figura 13). Esto se ve respaldado por el análisis de SA-β-Gal, con

20 evidencia de que sólo una pequeña proporción (<10%) de células de pases posteriores expresan SA-β-Gal. Esto es congruente con una subpoblación del aislado inicial de células exploradoras que experimenta senescencia, mientras que las células supervivientes crecen. La población de células resultante desarrolla un fenotipo sensible a oxidante, a diferencia de las células ME.

25 De nuevo, a diferencia de las células ME, esta situación puede revertirse tras la agresión oxidante con peróxido de hidrógeno. Las células expuestas a una concentración leve de peróxido de hidrógeno (25 μM) presentan una elevación en la expresión de SA-β-Gal. Además, el nivel de expresión de SA-β-Gal es elevado con relación al tiempo que han pasado las células en cultivo. Esto se ilustra en (figura 17).

30 Las CP mostraron una elevación dependiente de la dosis en la expresión de SA-β-Gal en respuesta a la exposición a H2O2 con o bien 11,25 o bien 25 μM. Dos pases (NP 27 y NP 28) correspondientes a una diferencia de 8 divisiones celulares, tuvieron de manera significativa mayor expresión de SA-β-Gal (p<0,001) (figura 17), tras la exposición a oxidante subletal (tal como se determina mediante el ensayo con WST). A pesar de que las células se sometieron a una exposición a oxidante leve, todavía mostraron una sensibilidad a oxidante sustancial, mostrando hasta el 40%

35 de las células expresión de SA-β-Gal.

Ensayo de citotoxicidad con LDH

El ensayo con LDH proporciona un método para cuantificar la citotoxicidad basado en la medición de actividad de

40 lactato deshidrogenasa (LDH) liberada desde las células dañadas. La LDH es una oxidorreductasa que cataliza la interconversión de lactato y piruvato. Es estable y es una enzima citoplasmática presente en todas las células. El daño a la membrana plasmática de la célula da como resultado la rápida liberación de LDH en el sobrenadante del cultivo celular. El ensayo se basa en la reducción de la sal de tetrazolio INT en una reacción enzimática acoplada a NADH para dar formazano, que es soluble en agua y presenta un máximo de absorción a 492 nm. La intensidad del

45 color rojo formado aumenta en presencia de actividad LDH aumentada. La figura 18 muestra el nivel medio de actividad LDH en las CP tras exposición a concentraciones crecientes de H2O2 a lo largo del intervalo de 0-300 μM.

Los datos (figura 18) indican que la exposición a H2O2 da como resultado efectos citotóxicos, incluso a bajos niveles, dando como resultado una concentración de 25 μM una toxicidad próxima al 30%. Estas observaciones respandan

50 los datos de WST y SA-β-Gal, ilustrando la naturaleza sensible de estas células a la exposición a oxidante aguda, a diferencia de las células madre. La aparente reducción en la actividad LDH a mayores concentraciones de H2O2 refleja la pérdida celular en estos cultivos.

Análisis de genes asociados a senescencia en CP bajo estrés oxidante agudo

55 Los análisis moleculares de CP tratadas con H2O2 25 μM proporcionan datos de respaldo para los estudios con WST, LDH , SA-β-Gal y lipofuscina.

Los datos proporcionados por los inventores indican que las células exploradoras, a diferencia de las células madre

60 típicas, muestran una sensibilidad diferencial al estrés oxidante. A diferencia de las CMM, no parecen mostrar senescencia replicativa y pueden hacerse crecer durante periodos de tiempo prolongados en cultivo (años). Sin embargo, aumenta la expresión de lipofusicina y SA-β-Gal en células exploradoras tras agresión oxidativa con peróxido de hidrógeno. A pesar de que las células se someten a una exposición a oxidante leve, tal como se determina mediante el ensayo con WST, todavía mostraron una sensibilidad a oxidante sustancial, mostrando ∼30%

de las células expresión de SA-β-Gal.

Estas observaciones estuvieron respaldadas por la expresión de genes asociados a senescencia. Se usó PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para estimar los niveles de ARNm correspondientes a los genes asociados a 5 senescencia candidatos. Éstos comprendían p21 como marcador de respuestas a daño celular agudo; SIRT 2 como regulador del ciclo celular y XRCC5 como marcador del daño de ADN. La evaluación de la expresión de genes asociados a senescencia y estrés relativos demostró una disminución estadísticamente significativa (p<0,001) en los tres genes tras el tratamiento con H2O2 (figura 19). Esto sugiere el inicio de la respuesta al daño de p53 y el cebado en última instancia para apoptosis tras daño oxidativo. La activación de P21 facilita la fosforilación de pRb por los complejos de ciclina A-Cdk2, ciclina E-Cdk2 y ciclina D1-cdk4 y se ha encontrado que se sobreexpresa en fibroblastos senescentes replicativos y en células que se han sometido a senescencia prematura inducida por estrés oxidativo. La disminución observada en XRCC5 concuerda con la senescencia inducida por estrés, ya que se ha mostrado que su producto está regulado por disminución en células dañadas o senescentes tras agresión aguda. Y sirtuína 2 (SIRT 2) es un miembro de la familia de genes reguladores de información silenciosos y están implicados

15 en procesos celulares esenciales, que relacionan la biología de telómeros con la función mitocondrial y la producción ribosómica. SIRT2 es un regulador del ciclo celular que responde a cambios redox intracelulares. Se ha mostrado que interacciona con y desacetila la subunidad de α-tubulina de los microtúbulos y se cree que participa en un punto de comprobación mitótico tardío para garantizar la segregación cromosómica correcta durante la citocinesis.

Ejemplo 4

Se han identificado CP y se han caracterizado basándose en la expresión de nestina (tal como se determina mediante RT-PCR) y otros varios marcadores (tablas 3 y 4). El estado de expresión de nestina de la población de células exploradoras es mixto, sin embargo, cuando se evalúa mediante citometría de flujo, siendo hasta el 50% de

25 las células negativas para nestina. Se proporcionan a continuación los perfiles de marcadores para tomarse en el contexto de la presencia o ausencia de nestina y los demás marcadores documentados en la tabla 1.

Las CP no clasificadas pueden dividirse en distintas subpoblaciones basándose en la expresión de marcadores de superficie celular. La composición de este panel de marcadores de superficie celular varía con el tiempo pasado en cultivo.

Los pases tempranos de células no clasificadas expresan el siguiente perfil de marcadores, tal como se ilustra mediante las células del pase 4:

35 CD90 ~50%+

CD49f ~90%+

CD24 bajo

CD147 ~90%+

CD45 Negativo

45 CD44 bajo

CD71 Negativo

CD31 Negativo

CD117 (también conocido como c-Kit) Negativo

Vimentin muy bajo

55 ABCG2 Negativo

CK19 Negativo

Bajo = ~menos o igual al 5% de células expresan marcador

Muy bajo = -menos o igual al 2,5% expresan marcador

Pases posteriores de la misma población expresan el siguiente perfil, tal como se ilustra mediante las células del pase 28 (~200 días en cultivo, 200 duplicaciones de población).

65 CD90 ~15%+

CD49f ~95%+ CD24 ~60%+

5 CD147 ~90%+ CD45 Negativo CD44 bajo CD71 bajo CD31 Negativo

15 CD117 Negativo ABCG2 bajo

CK19 muy bajo Pueden clasificarse pases individuales en poblaciones CD90 + y CD90 - mediante FACS. Éstas parecen ser morfológicamente distintas bajo microscopía óptica

25 Ejemplo 5 Pueden usarse células aisladas mediante dilución en serie a partir de la población sin clasificar para producir otros

varios tipos de células incluyendo células progenitoras neurales. Esto es sorprendente para una célula derivada de páncreas de adulto. Esto se ilustra en la figura 20 que muestra la producción de una población de células puras de células progenitoras

neurales.

Ejemplo 6

35 Pueden hacerse crecer células exploradoras en medios de diferenciación de hepatocitos. Tanto las células CD90 + como CD90 – presentan un cambio de morfología cuando se hacen crecer en medios de diferenciación de hepatocitos definidos (figura 21) (véase Materiales y Métodos) y expresan el marcador hepatobiliar citoqueratina 19, tal como se determina mediante RT-PCR. La morfología de las células CD90- hechas crecer en medio de diferenciación es normalmente hepática.

La población de células CD90- expresa el siguiente perfil de marcadores de superficie celular:

CD90 Negativo 45 CD49f ~95%+

CD24 ~80%+

CD147 ~80%+

CD45 Negativo

CD44 ~60%+ 55 CD71 bajo

CD31 Negativo

Las células CD90 + expresan el siguiente perfil de marcadores de superficie celular:

CD90 +

CD49f ~95%+ 65 CD24 Negativo

CD147 ~90%+

CD45 Negativo 5 CD44 ~85%+

CD71 bajo

CD31 Negativo

C-KIT Negativo

Se considera que estos dos perfiles de marcadores se expresan con todas las combinaciones posibles de nestina y 15 los marcadores enumerados en la tabla 1.

El crecimiento de poblaciones de células clasificadas en medios definidos (véase el ejemplo 2) para producir islotes indica que sólo las células CD90+ tienen la capacidad para producir estructuras de islotes. Esto se ilustra en la figura 22, en la que se muestran grupos de islotes en el panel B, desarrollados a partir de las CP.

Las células CD90 + se acumulan para producir estructuras de islotes en medio de crecimiento definido, mientras que las células CD90- permanecen inalteradas cuando se visualizan bajo el microscopio óptico.

Ejemplo 7

25 Se han procesado varios tejidos humanos para aislar CP mediante la misma metodología general empleada para el procesamiento de páncreas de rata (véase Materiales y Métodos). Esto puede ponerse como ejemplo mediante el aislamiento de células a partir de mama humana de adulto.

También se han aislado CP humanas de biopsias renales corticales humanas trituradas, usando la misma metodología general. Se ilustran las CP de mama en la figura 23.

Ejemplo 8

35 Las CP pueden diferenciarse en islotes cuando se hacen crecer en medios de diferenciación apropiados (véase Materiales y Métodos). Los islotes producidos liberan insulina cuando se estimulan para hacerlo in vitro mediante la exposición a glucosa. La figura 24 ilustra el perfil de liberación de insulina para tales islotes en presencia de concentraciones crecientes de glucosa (3-20 mM). Los datos ilustran un nivel estadísticamente superior de liberación de insulina (p<0,001) a partir de los islotes en comparación con las células no diferenciadas.

Depósito de material

Se ha depositado el siguiente material en la Colección Europea de Cultivos Celulares, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, R.U., SP4 OJG: 45 Material N.º ECACC Fecha de depósito

CP de rata adulta Q6203 12 de mayo de 2005

Se realizó este depósito según las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los fines de Procedimiento de Patentes y los reglamentos en el mismo (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha de depósito. El depósito se pondrá a disposición por la ECACC según los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre el Tribunal Universitario de la Universidad de Glasgow y la ECACC, que garantiza la disponibilidad permanente e ilimitada del material biológico del depósito para el público tras la emisión de la pertinente patente o tras disponerse abierta para la consulta por el público cualquier solicitud de patente, lo que se produzca en primer lugar, y garantiza la disponibilidad del material biológico a alguien determinado por la Oficina de Patentes respectiva

55 para que tenga derecho a ello según R. 28 (4) CPE o el equivalente en otras jurisdicciones.

A este respecto, el solicitante de la presente declara según R. 28 (4) CPE, o regla equivalente en otras jurisdicciones, que la disponibilidad del material biológico al que se hizo referencia anteriormente y en el presente documento se efectuará sólo mediante la entrega de una muestra a un experto.

El solicitante de la presente solicitud ha estado de acuerdo en que si un cultivo de los materiales en depósito va a morir o perderse o destruirse cuando se cultiva en condiciones adecuadas, los materiales se sustituirán puntualmente tras su notificación por otro igual. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una autorización para poner en práctica la invención contraviniendo los derechos concedidos por la autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patentes.

Apéndice

5 ID de secuencias

Seq. ID 1

A. cebador directo de nestina 5’-CTAGAGCTGTTTCCAGGTGCCA-3’

B. cebador inverso de nestina 5’-CCAGCCATTTCCTTACCTGT-3’

Seq. ID 2 15

A. cebador directo de NCAM 5’-CAGCGTTGGAGAGTCCAAAT-3’

B. cebador inverso de NCAM 5’-TTAAACTCCTGTGGGGTTGG-3’ Seq. ID 3

A. cebador directo de cMET 5’-CATTCTGCTGCTGCTGCTGA-3’

B. cebador inverso de cMET 5’-TCACTACACAGTCGGGACAC-3’

25 Seq. ID 4

A. cebador directo de GFAP 5’- CCCTGTCTCGAATGACTCCTCCA-3’

B. cebador inverso de GFAP 5’- GGAGTTCTCGAACTTCCTCCTCA-3’ Seq ID 5

A. cebador directo de Ins II 5’-ATGGCCCTGTGGATCCGCTT-3’ 35

B. cebador inverso de Ins II 5’-TGCCAAGGTCTGAAGGTCAC-3’

C. cebador anidado de Ins II 5’-5’-CCTGCTCATCCTCTGGGAGCC-3’ Seq ID 6

A. cebador directo de Ins II 5’-

B. cebador inverso de Ins II 5’

45 Seq ID 7

A. cebador directo de somatostatina 5’-CTAGAGCTGTTTCCAGGTGCCA-3’

B. cebador inverso de somatostatina 5’-CCCAGCCATTTCCTTACCTGT-3’ Seq ID 8

A. cebador directo de polipéptido pancreático 5’AGTCCAGCAGAAGGTAGGTGTC-3’ 55

B. cebador inverso de polipéptido pancreático 5’-AGTTGTTGCAAGAGCTGGGC-3’ Seq ID 9 A cebador directo de glucagón 5’-GACCGTTTACGTGGCTGG-3’ B cebador inverso de glucagón 5’-CGGTTCCTCTTGGTGTTCATCAAC-3’ Seq ID 10

65 cebador directo de PDX-1 5’-ATCACTGGAGCAGGGAAGGT-3’

cebador inverso de PDX-1 5’-GCTACTACGTTTCTTATCT-3’ Seq ID 11

cebador directo de CycC 5’ -ACCCCACCGTGTTCTTCGAC-3’ cebador inverso de CycG 5/-CATTTGCCATGGACAAGATG-3’

10 Seq ID 12 cebador directo de Ex2 5’-GCTCTCACTGGTACAGAA-3’ cebador inverso de Ex2 5’-TACATTCTGGCATCAGCGCAGAGACTGC-3’

Seq ID 13 cebador directo de Mbp 5’-ATAACCATTCCCTGCCTC-3’

20 cebador inverso de Mbp 5’-CTTTTTCTCTTACCCCCAC-3’ Seq ID 14 cebador directo de Mobp 5’-ACAGACAGTATTACGGTGGC-3’

cebador inverso de Mobp 5’-GTTACCGTAGTCGAGAAGGA-3’ Seq ID 15

30 cebador directo de Gtx 5’-GCTCCTGGATAAGGATGGCAA-3’ cebador inverso de Gtx 5’-CTTTTTGAGAAGCCGCGTGA-3’ Seq ID 16

cebador directo de Myt1 (5’-GCGAGACCAACCCACAGGACA-3’ cebador inverso de Myt1 (5’-TTACGTGGCCGGTTCCATCACA-3’ 40 TABLA 1 Marcador expresado por las CP Marcador CP Agrupaciones similares a islotes Nestina + -cMet + + NCAM + -GFAP + -EX2 --NF68 --CYCc + -MBFP --GTX--PDX-1 -+ Insulina -+ Glucagón -+ Somatostatina -+ PP -+

TABLA 2

Análisis estadístico de datos de supervivencia Grupo Tiempo de supervivencia medio (N=6) Valor de P

Solución salina 15,0±2,683

Médula ósea 19,2±2,4 0,0439* Células madre >30 0,0025* 0,0034#

*en comparación con solución salina, # en comparación con MO 5 TABLA 3 Marcadores para la caracterización de CP 10 Nestina Nucleostemina Sox 1ABCG2 CD133 CXCR4 FABP7 Glut 1 Frizzled 9 Musashi 1,2 Oct 4, Oct 3, Nanog, ABCG2 Fosfatasa alcalina STAT3 SOX 2 SSEA 1PODXL Integrina alfa 6, beta1 CD9,24,133, CCR4 15

Integrina alfa 1 Sca1 Stro 1 VCAM 1 Nucleostemina c-Kit BMP-R5 Pases tempranos de células no clasificadas expresan el siguiente perfil de marcadores, tal como se ilustra mediante las células del pase 4:

20 CD90 ∼50%+ CD49f ∼90%+ 25 CD24 bajo CD147 ∼90%+ CD45 Negativo 30 CD44 bajo CD71 Negativo 35 CD31 Negativo CD117 (también conocido como c-Kit) Negativo Vimentin muy bajo 40 ABCG2 Negativo CK19 Negativo 45 Bajo = ∼menos o igual al 5% de células expresan marcador Muy bajo = ∼menos o igual al 2,5% expresan marcador Pases posteriores de la misma población expresan el siguiente perfil, tal como se ilustra mediante las células del 50 pase 28 (∼200 días en cultivo, 200 duplicaciones de población). CD90 ∼15%+ CD49f ∼95%+ 55 CD24 ∼60%+

CD147 ∼90%+ CD45 Negativo

5 CD44 bajo CD71 bajo CD31 Negativo

CD117 Negativo

ABCG2 bajo

15 CK19 muy bajo La población de células CD90- expresa el siguiente perfil de marcadores de superficie celular: CD90 Negativo

CD49f ∼95%+

CD24 ∼80%+

25 CD147 ∼80%+ CD45 Negativo CD44 ∼60%+

CD71 bajo

CD31 Negativo

35 Las células CD90 + expresan el siguiente perfil de marcadores de superficie celular: CD90 + CD49f ∼95%+

CD24 Negativo

CD147 ∼90%+

45 CD45 Negativo CD44 ∼85%+ CD71 bajo

CD31 Negativo

C-KIT Negativo

55 TABLA 4 Ejemplos de marcadores de senescencia y daño para uso en la evaluación de las CP Rif1, Rif2, Rap1,

SIRTs1,2,3,4,56,7,; Est1, Est2; TLG1, cdc13, A26, ATM, HDAC1, hSEP1, hTEP1, Hu Cds1, MYC,

65 NEK2, p21, PIN2, TNKS, TERC, hTERT, TOP2A, TOP2B, TP53, TRF1, TRF2, WRN, G22P1, XRCC5, POT1, colagenasa, caveolina-1, p16, p21, gamma

H2AX, Chk1, Chk2, Rad 17, BRCA1 MRE11, ATR, ATRIP. 5

Referencias

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Lista de secuencias

<110> El Tribunal Universitario de la Universidad de Glasgow

<120> Materiales y métodos relacionados con terapias basadas en células

<130> JEC/BP6519177 45 <140> Documento EP 06727122.1

<141>

<150> Documento PCT/GB2006/001789

<151> 0

<150> Documento GB 0509748.0

<151>

<160> 45

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 55 <211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de nestina

<400> 1 ctagagctgt ttccaggtgc ca 22

<210> 2

<211> 20 65 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de NCAM

<400> 2 cagcgttgga gagtccaaat 20 5

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de cMET

<400> 3 cattctgctg ctgctgctga 20

15 <210> 4

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de GFAP

<400> 4 ccctgtctcg aatgactcct cca 23

<210> 5 25 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de Ins II

<400> 5 atggccctgt ggatccgctt 20

<210> 6

<400> 6 35 000

<210> 7

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de somatostatina

<400> 7 ctagagctgt ttccaggtgc ca 22 45

<210> 8

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de polipéptido pancreático

<400> 8 agtccagcag aaggtaggtg tc 22

55 <210> 9

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de glucagón

<400> 9 gaccgtttac gtggctgg 18

<210> 10 65 <211> 20

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de PDX-1

<400> 10 5 atcactggag cagggaaggt 20

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de CycC

<400> 11

accccaccgt gttcttcgac 20 15

<210> 12

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de Ex2

<400> 12 gctctcactg gtacagaa 18

25 <210> 13

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de Mbp

<400> 13 ataaccattc cctgcctc 18

<210> 14 35 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de Mobp

<400> 14 acagacagta ttacggtggc 20

<210> 15

<211> 21 45 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de Gtx

<400> 15 gctcctggat aaggatggca a 21

<210> 16

<211> 21

<212> ADN 55 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador directo de Myt1

<400> 16 gcgagaccaa cccacaggac a 21

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 65 <220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de nestina

<400> 17 ccagccattt ccttacctgt 20

<210> 18 5 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de NCAM

<400> 18 ttaaactcct gtggggttgg 20

<210> 19

<211> 20 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de cMET

<400> 19 tcactacaca gtcgggacac 20

<210> 20

<211> 23

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de GFAP

<400> 20 ggagttctcg aacttcctcc tca 23

<210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35 <220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de Ins II

<400> 21 tgccaaggtc tgaaggtcac 20

<210> 22

<400> 22 000

<210> 23 45 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de somatostatina

<400> 23 cccagccatt tccttacctg t 21

<210> 24

<211> 20 55 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de polipéptido pancreático

<400> 24 agttgttgca agagctgggc 20

<210> 25

<211> 24

<212> ADN 65 <213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia sintética: cebador inverso de glucagón

<400> 25 cggttcctct tggtgttcat caac 24

5 <210> 26

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de PDX-1

<400> 26 gctactacgt ttcttatct 19

<210> 27 15 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de CycG

<400> 27 catttgccat ggacaagatg 20

<210> 28

<211> 28 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de Ex2

<400> 28 tacattctgg catcagcgca gagactgc 28

<210> 29

<211> 19

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de Mbp

<400> 29 ctttttctct tacccccac 19

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 45 <220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de Mobp

<400> 30 gttaccgtag tcgagaagga 20

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 55 <223> Secuencia sintética: cebador inverso de Gtx

<400> 31 ctttttgaga agccgcgtga 20

<210> 32

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador inverso de Myt1

65 <400> 32 ttacgtggcc ggttccatca ca 22

<210> 33

<211> 21

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: cebador anidado de Ins II

<400> 33 cctgctcatc ctctgggagc c 21

<210> 34

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Secuencia sintética: Cebador directo

<400> 34 acctggttga tcctgccagt ag 22

<210> 35

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Secuencia sintética: Cebador inverso

<400> 35 agccattcgc agtttcactg tac 23

<210> 36

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Sonda 35 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Unido a FAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Unido a TAMRA

<400> 36

tcaaagatta agccatgcat gtctaagtac gcac 34 45

<210> 37

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Cebador directo

<400> 37 tttcagcggt tgtaccagtg tct 23

55 <210> 38

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Cebador inverso

<400> 38 catattcaaa atgtgctgct gaatt 25

<210> 39 65 <211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Sonda

<220>

5

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Unido a FAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> Unido a TAMRA

<400> 39

ctccaggagc ggctgcccc

19

15

<210> 40

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Cebador directo

<400> 40

gagccacagg caccatgtc

19

<210> 41

25

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Cebador inverso

<400> 41

cggcatactt tgctcctgtg t

21

<210> 42

<211> 18

35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Sonda

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Unido a FAM

<220>

<221> misc_feature

45

<222> (18)..(18)

<223> Unido a TAMRA

<400> 42

cctggtgatg tccgacct

18

<210> 43

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

55

<223> Secuencia sintética: Cebador directo

<400> 43

tccctcatca gcaaggca

18

<210> 44

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Cebador inverso

65

<400> 44

gatccgtctg gcctgtctt

19

<210> 45

<211> 18

<212> ADN

5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética: Sonda

<220>

<221> misc_feature

10

<222> (1)..(1)

<223> Unido a FAM

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

15

<223> Unido a TAMRA

<400> 45

tagccacccc acgactgc

18

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Población de células multipotentes aisladas producida mediante: 5 (a) proporcionar tejido de conducto pancreático de adulto que comprende conductos completos,

   (b) triturar dicho tejido de conducto,

   (c) cultivar dicho tejido triturado, y 10

   (d) recoger una monocapa de población de células emergentes del cultivo de la etapa (c);

   población que: 15 (i) es positiva para GFAP y NCAM,

   (ii) es negativa para PDX-1, y

   (iii) comprende tanto células positivas para nestina como negativas para nestina tal como se determina mediante 20 análisis de citometría de flujo;

   para uso en un método de estimulación de la regeneración de células beta pancreáticas del huésped en un sujeto diabético.

   25 2. Población de células para uso según la reivindicación 1, en la que las células no son inmunogénicas.

2. 3. Población de células para uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el método comprende el tratamiento de una enfermedad asociada con degeneración de las células pancreáticas.

   30 4. Población de células para uso según la reivindicación 3, en la que la enfermedad se selecciona de diabetes tipo I y diabetes tipo II.

3. 5. Población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el método

   comprende además la administración intravenosa de dicha población de células. 35
4. 6. Población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la población de células y el sujeto son de la misma especie.
5. 7. Población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sujeto es 40 humano.
6. 8. Población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que en la etapa (a) el tejido de conducto pancreático es tejido de conducto pancreático de adulto humano que comprende conductos completos.