ES2355047T3

ES2355047T3 - Oligonucleótidos, utilización, método de detección y kit que permite diagnosticar la presencia de los genes h5 y n1 del virus de la gripe a.

Info

Publication number: ES2355047T3
Application number: ES06842029T
Authority: ES
Inventors: Guy Vernet; Jean-Noel Telles; Aurelie Lefeuvre
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2005-07-30
Filing date: 2006-11-23
Publication date: 2011-03-22
Anticipated expiration: 2026-11-23
Also published as: CN1905555B; US7987503B2; WO2007014507A1; ATE454781T1; CN101160774A; EP1802023B1; DE602006011569D1; EP1802023A4; EP1802023A1; US20070234414A1; CN1905555A; CN101160774B

Abstract

Doble par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de dos secuencias diana localizadas respectivamente en el gen H5 y en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen H5 constituido por: - un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA o su secuencia complementaria, y - un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria, mientras que el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen N1 está constituido por: - un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y - un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento de marcado de ácidos nucleicos en presencia de al menos un soporte sólido. 5

La presente invención se refiere a oligonucleótidos que permitirán la amplificación y la detección de dos secuencias diana localizadas respectivamente en los genes H5 y N1 del genoma del virus de la gripe A.

La invención también se refiere a la utilización de estos oligonucleótidos, un método de detección y un kit que permite diagnosticar la presencia de los genes H5 y N1 del virus de la gripe A.

Entre las técnicas convencionales utilizadas de forma rutinaria para el diagnóstico de la gripe, pueden 10 mencionarse la aglutinación, la inhibición de aglutinación o la difusión en gel de agar. Estos métodos se emplean habitualmente y permite la caracterización del virus A de la gripe.

Una posible alternativa a estos métodos es el cultivo viral en huevos en fase de embrión o en células MDCK, de acuerdo con el protocolo del manual de la OIE (Oficina Internacional de las Epizootias). Sin embargo, se necesitan varios días para obtener los resultados de caracterización, plazo a veces incompatible con las necesidades o urgencias 15 clínicas.

También se han desarrollado masivamente técnicas de ELISA para la detección de anticuerpos o de antígenos o ensayos de inmunofluorescencia, pero estos métodos de detección, llamados inmunológicos, a menudo son menos sensibles y menos específicos que el cultivo viral convencional.

La reciente aparición de una forma altamente patógena del virus de la gripe aviar, el subtipo H5N1, ha 20 relazando, por lo tanto, fuertemente la necesidad de un ensayo de diagnóstico rápido, específico y muy sensible. Por esta razón, los diferentes métodos listados anteriormente han sido reemplazados progresivamente por técnicas llamadas moleculares, tales como la técnica de RT-PCR (transcripción inversa asociada a una reacción en cadena de la polimerasa). La RT-PCR, más sensible, no necesita la presencia de virus “viable” en las muestras, y de este modo ha permitido el tipado y sub-tipado de las diferentes formas del virus de la gripe. El desarrollo de esta técnica en tiempo real 25 (“real time RT-PCR”) también ha favorecido enormemente su utilización para el diagnóstico del virus de tipo A.

Por ejemplo, Whiley D. M. et al., describen en una reciente publicación (Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases (2005), en prensa), un ensayo para la detección de un amplio espectro de subtipos de la gripe en muestras clínicas, basado en una reacción de RT-PCR que hace intervenir una 5' nucleasa. Dos oligonucleótidos y una sonda se seleccionaron para ser homólogos al gen que codifica la proteína M (matriz) de 23 subtipos del virus A. Este ensayo 30 permite, por lo tanto, la detección del virus de la gripe A en muestras clínicas pero no permite, por el contrario, el sub-tipado preciso de la forma implicada.

Ng E.K.O. et al., divulgaron recientemente (Emerging Infectious Diseases (2005) vol. 11 (8), p. 1303-1305) un ensayo basado en una reacción de RT-PCR múltiple que comprende dos etapas, utilizando dos juegos de oligonucleótidos y de sondas marcadas para fijar como objetivo específicamente dos regiones del gen HA de H5N1. 35 Esto ha permitido, de este modo, desarrollar un ensayo rápido y sensible para detectar directamente el subtipo H5 en muestras humanas. Este ensayo se validó en muestras clínicas procedentes de pacientes infectados en Hong Kong y en Vietnam por el subtipo H5N1 del virus, pero no permite diagnosticar directamente qué subtipo de virus está implicado en la infección.

Payungporn S. et al., describen (Viral Immunology (2004) vol. 17 (4), p. 588-593 y Journal of Virological 40 Methods (2005), en prensa) un método de detección simultánea de las secuencias M, H5 y N1 del subtipo H5N1, basado en un ensayo de RT-PCR múltiple en tiempo real y en una sola etapa. Oligonucleótidos correspondientes a las secuencias M, H5 y N1, así como diferentes sondas TaqMan marcadas se seleccionaron y utilizaron en el ensayo, para detectar simultáneamente tres señales fluorescentes. Los oligonucleótidos H5 y N1 se seleccionaron a partir de regiones invariables que abarcan más de 50 secuencias conocidas específicas del virus H5N1. Sin embargo, debe 45 observarse que este método de RT-PCR, no isotérmico, está sometido a contaminaciones.

Otro método molecular que puede emplearse para detectar la presencia de agentes infecciosos es la técnica NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification [Amplificación Basada en la Secuencia de Ácido Nucleico]). Por ejemplo, Collins R.A et al., describen (Journal of Virological Methods (2002) vol. 103, p. 213-225 y Avian Diseases (2003) vol. 47 (3), p. 1069-1074) la detección del subtipo H5 de la gripe aviar (detección del subtipo altamente patógeno 50 y débilmente patógeno) utilizando la técnica NASBA acoplada a un sistema de detección ECL (electroquimioluminiscencia). La técnica NASBA es un método de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que hace intervenir a varias actividades enzimáticas, que permite una detección rápida del virus H5. La amplificación de ácidos nucleicos por esta vía es muy adecuada para los genomas en ARN, como el genoma del virus de la gripe, gracias a la introducción de la etapa transcripción inversa directamente en la reacción de amplificación. Sin embargo, incluso 55 aunque el método descrito en esta publicación permite detectar y distinguir las cepas débilmente patógenas de las cepas altamente patógenas, no permiten identificar específicamente la forma H5N1 del virus. El documento WO 2005/121367 (publicado el 22-12-2005 que tiene una fecha de depósito del 10-06-2005) describe la secuencia de ácido nucleico cattggagtttgacacttggtgtt como cebador de amplificación para la detección del virus H5N1.

Un ensayo de identificación del virus de la gripe A en su forma H5N1 utilizando una técnica de amplificación 60 transcripcional, particularmente adaptada a la amplificación y a la detección de virus de ARN, sigue siendo, por lo tanto, esperado. Además un ensayo múltiple, es decir que permite la amplificación y la detección simultáneamente de los dos genes H5 y N1, siendo la técnica de amplificación una técnica de amplificación transcripcional tal como NASBA, es particularmente ventajoso.

La presente invención se refiere, por lo tanto, a un doble par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de dos secuencias diana localizadas respectivamente en el gen H5 y en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen H5 constituido por:

: - un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 5

SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA, o su secuencia complementaria, y

: - un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria, mientras que el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen N1 está constituido por: 10

: - un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y

: - un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 15

SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria.

La invención también puede referirse a un par de oligonucleótidos para permitir la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen H5 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos constituido por:

: - un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un 20 fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA, o su secuencia complementaria, y

SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria. 25

De la misma manera, la invención también puede abarcar un par de oligonucleótidos para permitir la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos constituido por:

: - un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 30

SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y

SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria.

En los tres casos particulares anteriores, en el (o los) par(es) de oligonucleótidos, el primer oligonucleótido 35 comprende adicionalmente una secuencia promotora que puede ser reconocida por una enzima ARN polimerasa dependiente de ADN.

Más exactamente, la secuencia promotora que puede ser reconocida por una enzima ARN polimerasa dependiente de ADN es una polimerasa T7.

En relación con los dos casos anteriores, cuando este oligonucleótido, al que se le añade la secuencia 40 promotora, permite la amplificación de la secuencia diana localizada en el gen H5, está constituido esencialmente por la siguiente secuencia:

SEC ID Nº 5: aattctaatacgactcactataggggTGTATGTTGTGGAATGGCA, o su secuencia complementaria. La parte de la secuencia en letras minúsculas corresponde a la secuencia promotora T7.

De la misma manera que anteriormente, cuando este oligonucleótido permite la amplificación de la secuencia 45 diana localizada en el gen N1, ésta constituido esencialmente por la secuencia siguiente:

SEC ID Nº 6: aattctaatacgactcactataggggCGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria.

En todos los casos particulares, cada oligonucleótido puede ser de una longitud comprendida entre 12 y 30 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 16 nucleótidos consecutivos, y preferentemente de una longitud comprendida entre 15 y 26 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 18 nucleótidos consecutivos. 50

La invención también se refiere a un par de oligonucleótidos que se utilizará como sonda de detección de dos secuencias diana localizadas respectivamente en los genes H5 y N1 del genoma del virus de la gripe A, estando la sonda para la detección del gen H5 constituida por:

SEC ID Nº 7: ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, o su secuencia complementaria,

mientras que la sonda para la detección del gen N1 está constituida por:

SEC ID Nº 8: GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, o su secuencia complementaria,

comprendiendo cada secuencia al menos un medio de marcado.

La invención también puede referirse a un oligonucleótido, que se utilizará como sonda de detección de una secuencia de ácidos nucleicos amplificada resultante de la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen H5 5 del genoma del virus de la gripe A, realizándose dicha amplificación por medio de un par de oligonucleótidos tal como se ha descrito anteriormente, siendo la sonda de detección de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y comprendiendo al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 7: ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, o su secuencia complementaria, comprendiendo la secuencia al menos un medio de marcado. 10

Cuando se desea detectar el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, la invención recomienda un oligonucleótido, que se utilizará como sonda de detección de una secuencia de ácidos nucleicos amplificada resultante de la amplificación de una secuencia diana localizada en este gen N1, realizándose dicha amplificación por medio de un par de oligonucleótidos tal como se ha descrito anteriormente, siendo la sonda de detección de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y comprendiendo al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos 15 obtenidos de:

SEC ID Nº 8: GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, o su secuencia complementaria, comprendiendo la secuencia al menos un medio de marcado.

En una realización interesante de la invención, la sonda de detección está constituida por una “molecular beacon” denominada en lo sucesivo sonda molecular. Las sondas moleculares son sondas de detección en forma de 20 oligonucleótidos de cadena sencilla, que tienen una estructura en horquilla con tallo y bucle (stem loop structure) bien conocida por el experto en la materia. El bucle contiene una secuencia sonda complementaria de la secuencia diana (amplicón en general), y el tallo está formado por la hibridación de dos secuencias que forman brazos, que están localizadas cada una en cada extremo de la sonda. Un fluoróforo está unido de forma covalente al extremo de uno de los dos brazos y un absorbedor de fluorescencia (quencher) está unido de forma covalente al extremo del otro brazo. 25 Las sondas moleculares no emiten fluorescencia cuando están libres en solución. Sin embargo, en presencia de amplicones complementarios, cuando hibridan con estas dianas, sufren un cambio conformacional que les permite emitir fluorescencia. En ausencia de dianas, el tallo conserva el fluoróforo muy próximo al absorbedor de fluorescencia, lo que conlleva la transferencia de la fluorescencia del fluoróforo al absorbedor. Dicho absorbedor de fluorescencia es un cromóforo no fluorescente que disipa la energía recibida desde el fluoróforo en forma de calor. Cuando la sonda 30 encuentra una diana molecular, se produce la formación de un híbrido sonda-diana que es más largo y más estable que el híbrido creado por los dos brazos del tallo. La rigidez y la longitud del híbrido sonda-híbrido impiden la existencia simultáneamente del híbrido del tallo. Por consiguiente, la sonda molecular sufre una reorganización conformacional espontánea que fuerza al híbrido del tallo a disociarse y al fluoróforo y al absorbedor a alejarse uno del otro, lo que restaura la fluorescencia. 35

Más exactamente la sonda de detección está constituida por una sonda molecular constituida preferentemente por:

SEC ID Nº 9: [6-FAM]-cgatcgACACCAAGTGTCAAACTCCAATcgatcg-[DabSyl], para la detección del gen H5,

SEC ID Nº 10: [6-FAM]-cgatcgGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGAcgatcg-[DabSyl], para la detección del gen N1. 40

Cuando el ensayo que se desea realizar es un ensayo múltiple en el que la detección de los genes H5 y N1 es simultánea y se realiza en un único recipiente, es conveniente utilizar dos marcadores diferentes. Entre los marcadores fluorescentes posibles, se mencionan de manera no limitante:

:  fluoresceína (FAM),

:  tetracloro-6-carboxifluoresceína (TET), 45

:  tetrametilrrodamina (TMR),

:  5-carboxirrodamina 6G (RHD),

:  carboxirrodamina (ROX), y

:  cianina 5 (CY5).

Cada una de las dos secuencias SEC ID Nº 9 y 10 anteriores estará provista, por lo tanto, de uno de estos 50 marcadores, siendo los dos marcadores utilizados diferentes entre sí para permitir una diferenciación de las señales detectadas.

La invención también propone la utilización de uno o dos pares de oligonucleótidos, tal como se han descrito anteriormente, en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos o como sonda de detección del genoma del virus de la gripe A que se sospecha que esta presente en una muestra biológica. 55

La invención también se refiere a un método de detección de ácidos nucleicos del virus de la gripe A que pueden estar presentes en una muestra, en el que la muestra se somete a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos utilizando un par de oligonucleótidos, tal como se ha descrito anteriormente, en presencia de los reactivos de amplificación necesarios para dicha amplificación y se detecta la presencia de amplicones de interés. Este método de

detección puede estar basado en una reacción de amplificación RT-PCR.

Como alternativa, este método de detección puede estar basado en una técnica de amplificación transcripcional. Preferentemente esta técnica es la técnica NASBA.

La invención también se refiere a un método de amplificación de dos genes H5 y N1 del virus de la gripe A que puede estar presente en una muestra, que comprende las siguientes etapas: 5

: - incubar la muestra en un tampón de amplificación en presencia:

:  de dos cebadores de amplificación, teniendo cada uno una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo uno adicionalmente una secuencia promotora, el otro de polaridad opuesta al cebador asociado a la secuencia promotora, para hibridar respectivamente cadena arriba y cadena abajo de una zona de interés localizada en el gen H5 del virus de la gripe A, 10

:  de dos cebadores de amplificación, teniendo cada uno una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo uno adicionalmente una secuencia promotora, el otro de polaridad opuesta al cebador asociado a la secuencia promotora, para hibridar respectivamente cadena arriba y cadena abajo de una zona de interés localizada en el gen N1 del virus de la gripe A,

: - añadir los siguientes reactivos a la muestra: 15

:  una enzima que tiene una actividad ADN polimerasa dependiente de ARN,

:  una enzima que tiene una actividad ADN polimerasa dependiente de ADN,

:  una enzima que tiene una actividad ARNasa H,

:  una enzima que tiene una actividad ARN polimerasa dependiente de ADN, y

: - mantener a la mezcla de reacción creada de este modo en condiciones apropiadas y durante un periodo de 20 tiempo suficiente para que tenga lugar una amplificación.

Las enzimas enumeradas anteriormente están en número de cuatro, pero es perfectamente posible recurrir a una enzima que tenga dos, incluso tres de las actividades mencionadas anteriormente, en este caso la utilización de tres o incluso de dos enzimas sigue siendo posible y es abarcada por la invención. Además, son necesarios otros elementos necesarios para el establecimiento de una amplificación, tales como nucleótidos. Dichos elementos son bien 25 conocidos por el experto en la materia.

Finalmente, la invención propone un kit de detección de los genes H5 y N1 del virus de la gripe A que puede estar presente en una muestra, que contiene:

: - dos pares de oligonucleótidos o cebadores de amplificación tal como se han descrito anteriormente para realizar la amplificación de las dos regiones de interés H5 y N1, 30

: - dos oligonucleótidos marcados o que pueden ser marcados, tal como se han descrito anteriormente, y que tienen una secuencia de ácido nucleico sustancialmente complementaria con al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico amplificada H5 o N1,

: - los reactivos necesarios para la realización de una reacción de amplificación.

Por “sustancialmente complementaria” se entiende que se realiza una hibridación entre un oligonucleótido 35 marcado o que puede ser marcado, llamado de otro modo sonda de detección, y al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico amplificada o amplicón, siendo esta hibridación específica y selectiva de manera suficiente para permitir la detección del amplicón de interés.

Por otro lado, los reactivos necesarios para la realización de una reacción de amplificación son reactivos que permiten una amplificación NASBA. 40

Por “marcador detectable”, se entiende al menos un marcador capaz de generar directamente una señal detectable. Por ejemplo, la presencia de biotina se considera como un marcado directo, ya que es detectable, incluso aunque sea posible asociarla posteriormente con estreptavidina marcada. A continuación se proporciona una lista no limitante de estos marcadores:

:  enzimas que producen una señal detectable por ejemplo por colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, como 45 peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, -galactosidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,

:  cromóforos como compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes,

:  grupos con densidad electrónica detectable mediante microscopía electrónica o por su propiedad eléctrica como la conductividad, amperometría, voltimetría, impedancia,

:  grupos detectables, por ejemplo cuyas moléculas son de tamaños suficientes para inducir modificaciones 50 detectables de sus características físicas y/o químicas, este detección puede realizarse mediante métodos ópticos como difracción, resonancia del plasmón superficial, variación de superficie, variación del ángulo de contacto o métodos físicos como espectroscopía de fuerza atómica, efecto túnel,

:  moléculas radiactivas como 32P, 35S o 125I.

Preferentemente, el marcador no es un marcador radiactivo para evitar los problemas de seguridad vinculados 55

a estos marcadores.

En una realización particular de la presente invención, el marcador es detectable electroquímicamente, y en particular el marcador es un derivado de un complejo de hierro, como un ferroceno.

La expresión “ácido nucleico” significa una sucesión de al menos dos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que comprende eventualmente al menos un nucleótido modificado, por ejemplo al menos un nucleótido que comprende 5 una base modificada, tal como inosina, metil-5-desoxicitidina, dimetillamino-5-desoxiuridina, desoxiuridina, diamino-2,6-purina, bromo-5-desoxiuridina o cualquier otra base modificada que permita la hibridación. Este polinucleótido también puede estar modificado a nivel del enlace internucleotídico como por ejemplo fosforotioatos, H-fosfonatos, alquil-fosfonatos, a nivel del esqueleto, como por ejemplo alfa-oligonucleótidos (FR 2 607 507) o PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc, 114, 1895-1897, 1992 o 2' O-alqui ribosa y LNA (BW, Sun et al., Biochemistry, 4160-4169, 43, 2004). 10 El ácido nucleico puede ser natural o sintético, un oligonucleótido, un polinucleótido, un fragmento de ácido nucleico, un ARN ribosómico, un ARN mensajero, un ARN de transferencia, un ácido nucleico obtenido mediante una técnica de amplificación enzimática tal como:

:  PCR (Polymerase Chain Reaction [reacción en cadena de la polimerasa]), descrita en las patentes US-A-4.683.195, US-A-4.683.202 y US-A-4.800.159, y su derivada RT-PCR (Reverse Transcription PCR [PCR 15 asociada a transcripción inversa]), particularmente en un formato de una etapa, tal como se describe en la patente EP-B-0.569.272,

:  LCR (Ligase Chain Reaction [reacción en cadena de la ligasa]), expuesta por ejemplo en la solicitud de patente EP-A-0.201.184,

:  RCR (Repair Chain Reaction [reacción de reparación en cadena]), descrita en la solicitud de patente WO-A-20 90/01069,

:  3SR (Self Sustained Séquence Replication [replicación de secuencia autosostenida]) con la solicitud de patente WO-A- 90/06995,

:  NASBA (Nucleic Acid Séquence-Based Amplification [amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico]) con la solicitud de patente WO-A-91/02818, y 25

:  TMA (Transcription Mediated Amplification [amplificación mediada por transcripción]) con la patente US-A-5.399.491.

:  RCA (Rolling Circle Amplification [amplificación por círculo rodante] (US-6.576.448).

Se habla entonces de amplicones para designar a los ácidos nucleicos generados mediante una técnica de amplificación enzimática. 30

Cada una de estas modificaciones puede tomarse en combinación.

Las etapas de amplificación y de detección expuestas anteriormente pueden estar precedidas por una etapa de purificación. Por “etapa de purificación”, se entiende particularmente la separación entre los ácidos nucleicos de los microorganismos y los constituyentes celulares liberados en la etapa de lisis que precede a la purificación de los ácidos nucleicos. Estas etapas de lisis son bien conocidas, como ejemplo indicativo, pueden utilizarse métodos de lisis tales 35 como los descritos en las solicitudes de patente:

: - WO-A-00/60049 sobre lisis por sonicación,

: - WO-A-00/05338 sobre lisis mixta magnética y mecánica,

: - WO-A-99/53304 sobre lisis eléctrica, y

: - WO-A-99/15621 sobre lisis mecánica. 40

El experto en la materia podrá utilizar otros métodos de lisis bien conocidos tales como choques térmicos u osmóticos o los tratamientos con agentes caotrópicos, tales como sales de guanidio (patente US-A-5.234.809).

Esta etapa permite generalmente concentrar los ácidos nucleicos. Como ejemplo, pueden utilizarse soportes sólidos, tales como partículas magnéticas (véase a este respecto las patentes US-A-4.672.040 y US-A-5.750.338), y de este modo purificar los ácidos nucleicos, que se han fijado a estas partículas magnéticas, mediante una etapa de 45 lavado. Esta etapa de purificación de los ácidos nucleicos es particularmente interesante si se desea amplificar posteriormente dichos ácidos nucleicos. Una realización particularmente interesante de estas partículas magnéticas se describe en las solicitudes de patente WO-A-97/45202 y WO-A-99/35500.

La expresión “soporte sólido” tal como se utiliza en este documento incluye todos los materiales sobre los que puede fijarse un ácido nucleico. Materiales de síntesis o materiales naturales, eventualmente modificados 50 químicamente, pueden utilizarse como soporte sólido, particularmente los polisacáridos, tales como materiales a base de celulosa, por ejemplo papel, derivados de celulosa tales como acetato de celulosa y nitrocelulosa, o dextrano; polímeros, copolímeros, particularmente a base de monómeros de tipo estireno, fibras naturales tales como algodón, y fibras sintéticas tal como nylon; materiales minerales tales como sílice, cuarzo, vidrios, cerámicas; látex; partículas magnéticas; derivados metálicos, geles, etc. El soporte sólido puede tener forma de una placa de microvaloración, de 55 una membrana, de una partícula o de una placa prácticamente plana de vidrio o silicio o derivados.

Puede realizarse todo el protocolo (de la muestra extraída a los amplicones listos para hibridar) en un único y mismo tubo, tratado de forma manual o en un autómata.

Los ejemplos adjuntos representan realizaciones particulares y no pueden considerarse limitantes del alcance

de la presente invención.

En estos ejemplos se realizaron varios controles. En primer lugar un control negativo con agua, en este caso no hay ninguna señal ni para H5 ni para N1 que se detecte. Por otro lado, un control de especificidad con ARN del virus de la gripe H3N2, en este caso tampoco se detectó ninguna señal para H5 o N1.

Ejemplo 1: Experimento de evaluación de los cebadores H5N1 en un ARN H5N1 procedente de una muestra 5 clínica de Asia:

Las secuencias de los pares de oligonucleótidos (N1_P1 y N2_P2, utilizados para la amplificación y la detección de la secuencia N1, y H5_P1 y H5_P2, utilizados para la amplificación y la detección de la secuencia H5) y de las sondas de detección presentes en forma de sondas moleculares (sonda molecular N1 y sonda molecular H5) se indican a continuación: 10

N1_P2: 5'-GGAATGCTCCTGTTATCCTGA-3'

N1_P1: 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGATTGTCTCCGAAA-3'

Sonda N1: 5'-CGATCGGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGACGATCG-3'

H5_P2: 5'-GCCGAATGATGCCATCAA-3'

H5_P1: 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGTATGTTGTGGAATGGCA-3'

Sonda H5: 5'-CGATCGACACCAAGTGTCAAACTCCAATCGATCG-3'

La secuencia indicada en negrita corresponde a la secuencia promotora T7, reconocida por la ARN polimerasa T7 y se encuentra en los oligonucleótidos P1 para la realización de la técnica NASBA.

El tratamiento de la muestra se realiza con ayuda del sistema miniMAG, como se describe en el protocolo operatorio. Los kits utilizados son: 15

: - NucliSens Lysis Buffer, bioMérieux B. V. (Boxtel, Holanda), Nº de lote 200295, y

: - NucliSens Magnetic Extraction Reagents, bioMérieux B. V., Nº de lote 200297.

Protocolo operatorio del ensayo de detección:

De acuerdo con las instrucciones del kit Nuclisens EasyQ Basic Kit (bioMérieux B.V., Boxtel, Holanda, Nº de lote 285006), se prepararon dos mezclas de reacción, una que sirve para la amplificación y para la detección de la 20 secuencia H5 (“mix H5”) y la segunda para la amplificación y para la detección de la secuencia N1 (“mix N1”). Brevemente, a 64 l de diluyente se le añadieron 11 l de agua, 13 l de KCl 1,2 M, 4 l de cada oligonucleótido (H5_P1 y H5_P2 o N1_P1 y N1_P2, solución madre 10 M) y 0,8 l de la sonda de detección apropiada (la sonda molecular H5 o la sonda molecular N1, solución madre 2 M). Un volumen de 10 l de cada mezcla se añadió a continuación a 5 l del ARN diana. Paralelamente, se preparó una solución de enzimas, y se añadieron 5 l de esta 25 solución a la mezcla de reacción en el tubo, para un volumen final de 20 l. Las muestras se colocaron a continuación en las condiciones de reacción recomendadas por el kit Nuclisens EasyQ Basic Kit para permitir la amplificación y la detección de las secuencias de interés mediante la técnica NASBA isotérmica (Kievits T. et al. J. Virol. Methods (1991) vol. 35(3) p. 273-286).

Para validar este ensayo de detección, los ARN diana utilizados fueron los siguientes: 30

: - H5N1: Gripe A subtipo H5N1 Vietnam 1194/2004,

: - Gripe A: subtipo H3N2,

: - ARN de control H5: subtipo H5N3,

: - Gripe B.

Los controles apropiados (positivo y negativo) se incluyeron en el ensayo. 35

Después de la amplificación y detección en el sistema NucliSens EasyQ, se obtuvieron los siguientes resultados:

Virus: Resultados de NASBA para H5 Resultados de NASBA para N1

Control negativo: Negativo Negativo

Gripe A H3N2: Negativo Negativo

Negativo
Negativo
Negativo

Gripe A H5N1 Vietnam 1194/2004: Positivo Positivo

Control negativo: Negativo Negativo

Gripe A H5N1 Vietnam 1194/2004: Positivo Positivo

Gripe A H5N3 virus de control en pato: Positivo Negativo

Estos resultados muestran que los oligonucleótidos y sondas de detección H5N1 son específicos y detectan bien sus dianas respectivas H5 y N1.

Ejemplo 2: Experimento de evaluación de los cebadores y sondas de detección para H5N1 en un ensayo múltiple: 5

En el caso del ensayo múltiple, la sonda molecular N1 utilizada está marcada con CY5, mientras que la sonda molecular H5 sigue marcada con FAM.

Para información, para demostrar la funcionalidad de nuestras secuencias en un ensayo múltiple, se utiliza como diana un transcrito sintético que se ha construido a partir del ARN recombinante H5N1. Éste es un ARN que comprende únicamente las regiones H5 y N1. Se utiliza como ARN de referencia para evaluar el rendimiento de 10 nuestros cebadores de amplificación y sondas de detección para H5 y N1 (como es un transcrito sintético, está disponible en gran cantidad, lo que evita la utilización del ARN recombinante H5N1 que es muy valioso.

De acuerdo con las instrucciones del kit Nuclisens EasyQ Basic Kit (bioMérieux B.V., Boxtel, Holanda, Nº de lote 285006), se prepara una única mezcla de reacción que permite la detección simultánea del gen H5 y del gen N1. Brevemente, a 64 l de diluyente se le añadieron 11 l de agua, 13 l de KCl 1,2 M, 8 l de una solución de 15 oligonucleótidos y de sondas moleculares (que contiene los oligonucleótidos H5_P1 y H5_P2 para H5 5 M, los oligonucleótidos N1_P1 y N1_P2 para N1 a 20 M, la sonda molecular H5-FAM 2 M y la sonda molecular N1-CY5 2 M). Un volumen de 10 l de la mezcla se añadió a continuación a 5 l del ARN diana (transcrito H5N1 a 1000 copias/NASBA).

La diferencia de concentración entre los cebadores H5 y los cebadores N1 es prácticamente inversamente 20 proporcional a la diferencia de sensibilidad. La concentración de cebadores H5 es, por lo tanto, cuatro veces inferior a la de N1.

Paralelamente, se preparó una solución de enzimas, y se añadieron 5 l de esta solución a la mezcla de reacción en el tubo, para un volumen final de 20 l. Las muestras se colocaron a continuación en las condiciones de reacción recomendadas por el kit Nuclisens EasyQ Basic Kit para permitir la amplificación y la detección de las 25 secuencias de interés mediante la técnica NASBA isotérmica (Kievits T. et al. J. Virol. Methods (1991) vol. 35(3) p. 273-286).

Los resultados son visibles en la figura 1. Estos resultados muestran que la detección simultánea de H5 y de N1 en un solo tubo funciona muy bien en un transcrito sintético.

LISTA DE SECUENCIAS 30

<110> bioMérieux

<120> Oligonucleótidos, utilización, método de detección y kit que permite diagnosticar la presencia de los genes H5 y N1 del virus de la gripe a

<130> H5N1 PI

<140> FR06/00843 35

<141> 30-01-2006

<150> FR05/11974

<151> 25-11-2005

<160> 10

<170> PatentIn versión 3.3 40

<210> 1

<211> 19

<212> ADN

<213> virus de la gripe A

<400> 1 45

tgtatgttgt ggaatggca 19

<210> 2

<211> 18

<212> ADN

<213> virus de la gripe A

<400> 2 5

gccgaatgat gccatcaa 18

<210> 3

<211> 18

<212> ADN

<213> virus de la gripe A 10

<400> 3

cgtggattgt ctccgaaa 18

<210> 4

<211> 21

<212> ADN 15

<213> virus de la gripe A

<400> 4

ggaatgctcc tgttatcctg a 21

<210> 5

<211> 45 20

<212> ADN

<213> virus de la gripe A

<400> 5

aattctaata cgactcacta taggggtgta tgttgtggaa tggca 45

<210> 6 25

<211> 44

<212> ADN

<213> virus de la gripe A

<400> 6

aattctaata cgactcacta taggggcgtg gattgtctcc gaaa 44 30

<210> 7

<211> 22

<212> ADN

<213> virus de la gripe A 35

<400> 7

acaccaagtg tcaaactcca at 22

<210> 8

<211> 25

<212> ADN 40

<213> virus de la gripe A

<400> 8

gcgaaatcac atgtgtgtgc aggga 25

<210> 9

<211> 34

<212> ADN 5

<213> virus de la gripe A

<400> 9

cgatcgacac caagtgtcaa actccaatcg atcg 34

<210> 10

<211> 37 10

<212> ADN

<213> virus de la gripe A

<400> 10

cgatcggcga aatcacatgt gtgtgcaggg acgatcg 37

Claims

REIVINDICACIONES

1. Doble par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de dos secuencias diana localizadas respectivamente en el gen H5 y en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen H5 constituido por:

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 5

SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria,

mientras que el par de oligonucleótidos para la amplificación del gen N1 está constituido por: 10

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 15

SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria.
2. Par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen H5 del genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos constituido por:

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 20

SEC ID Nº 1: TGTATGTTGTGGAATGGCA o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 2: GCCGAATGATGCCATCAA, o su secuencia complementaria.
3. Par de oligonucleótidos que permitirá la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen N1 del 25 genoma del virus de la gripe A, estando el par de oligonucleótidos constituido por:

- un primer oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 3: CGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria, y

- un segundo oligonucleótido de una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y que comprende al menos 30 un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 4: GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, o su secuencia complementaria.
4. Par(es) de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado(s) porque el primer oligonucleótido comprende adicionalmente una secuencia promotora que puede ser reconocida por una enzima ARN polimerasa dependiente de ADN. 35
5. Par(es) de oligonucleótidos, de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado(s) porque la secuencia promotora que puede ser reconocida por una enzima ARN polimerasa dependiente de ADN es una polimerasa T7.
6. Par de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que el primer oligonucleótido, cuando este oligonucleótido permite la amplificación de la secuencia diana localizada en el gen H5, se caracteriza porque está constituido esencialmente por la siguiente secuencia: 40

SEC ID Nº 5: AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGTATGTTGTGGAATGGCA o su secuencia complementaria.
7. Par de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el primer oligonucleótido, cuando este oligonucleótido permite la amplificación de la secuencia diana localizada en el gen N1, se caracteriza porque está constituido esencialmente por la siguiente secuencia: 45

SEC ID Nº 6: AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGATTGTCTCCGAAA, o su secuencia complementaria.
8. Par de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque cada oligonucleótido tiene una longitud comprendida entre 12 y 30 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 16 nucleótidos consecutivos, y preferentemente una longitud comprendida entre 15 y 26 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 18 nucleótidos. 50
9. Par de oligonucleótidos que se utilizará como sonda de detección de dos secuencias diana localizadas respectivamente en los genes H5 y N1 del genoma del virus de la gripe A, estando la sonda para la detección del gen H5 constituida por:

SEC ID Nº 7: ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, o su secuencia complementaria,

mientras que la sonda para la detección del gen N1 está constituida por: 5

SEC ID Nº 8: GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, o su secuencia complementaria,

comprendiendo cada secuencia al menos un medio de marcado.
10. Oligonucleótido, que se utilizará como sonda de detección de una secuencia de ácidos nucleicos amplificada que resulta de la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen H5 del genoma del virus de la gripe A, realizándose dicha amplificación por medio de un par de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las 10 reivindicaciones 2, 4 a 8, teniendo la sonda de detección una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y comprendiendo al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de:

SEC ID Nº 7: ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, o su secuencia complementaria a excepción del oligonucleótido de secuencia CAT TGG AGT TTG ACA CTT GGT GTT, comprendiendo la secuencia al menos un medio de marcado. 15
11. Oligonucleótido, que se utilizará como sonda de detección de una secuencia de ácidos nucleicos amplificada resultante de la amplificación de una secuencia diana localizada en el gen N1 del genoma del virus de la gripe A, realizándose dicha amplificación por medio de un par de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, teniendo la sonda de detección una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos y comprendiendo al menos un fragmento de 10 nucleótidos consecutivos obtenidos de: 20

SEC ID Nº 8: GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, o su secuencia complementaria, comprendiendo la secuencia al menos un medio de marcado.
12. Sonda de detección, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque está constituida por una sonda molecular.
13. Sonda de detección, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizada porque está 25 constituida por una sonda molecular, constituida preferentemente por:

SEC ID Nº 9: [6-FAM]-cgatcgaCACCAAGTGTCAAACTCCAAtcgatcg-[DabSyl], para la detección del gen H5,

SEC ID Nº 10: [6-FAM]-cgatcgGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGAcgatcg-[DabSyl], para la detección del gen N1.
14. Utilización de uno o dos pares de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 30 en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos o como sonda de detección del genoma del virus de la gripe A del que se sospecha que está presente en una muestra biológica.
15. Método de detección de ácidos nucleicos del virus de la gripe A que puede estar presente en una muestra, en el que la muestra se somete a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos utilizando un par de oligonucleótidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en presencia de los reactivos de amplificación necesarios 35 para dicha amplificación y se detecta la presencia de amplicones de interés.
16. Método, de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la reacción de amplificación utilizada es una RT-PCR.
17. Método, de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la reacción de amplificación utilizada es una técnica de amplificación transcripcional. 40
18. Método, de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque la reacción de amplificación utilizada es la técnica NASBA.
19. Método de amplificación de dos genes H5 y N1 del virus de la gripe A que puede estar presente en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

- incubar la muestra en un tampón de amplificación en presencia: 45

 de dos cebadores de amplificación de acuerdo con la reivindicación 2, teniendo cada uno una longitud comprendida entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo uno adicionalmente una secuencia promotora, el otro de polaridad opuesta al cebador asociado a la secuencia promotora, para hibridar respectivamente cadena arriba y cadena abajo de una zona de interés localizada en el gen H5 del virus de la gripe A,

 de dos cebadores de amplificación de acuerdo con la reivindicación 3, teniendo cada uno una longitud 50 comprendida entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo uno adicionalmente una secuencia promotora, el otro de polaridad opuesta al cebador asociado a la secuencia promotora, para hibridar respectivamente cadena arriba y cadena abajo de una zona de interés localizada en el gen N1 del virus de la gripe A,

- añadir los siguientes reactivos a la muestra:

 una enzima que tiene una actividad ADN polimerasa dependiente de ARN, 55

 una enzima que tiene una actividad ADN polimerasa dependiente de ADN,

 una enzima que tiene una actividad ARNasa H,

 una enzima que tiene una actividad ARN polimerasa dependiente de ADN, y

- mantener a la mezcla de reacción creada de este modo en condiciones apropiadas y durante un periodo de tiempo suficiente para que tenga lugar una amplificación.
20. Kit de detección de los genes H5 y N1 del virus de la gripe A que puede estar presente en una muestra, que 5 contiene:

- dos pares de oligonucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8,

- dos oligonucleótidos marcados o que pueden marcarse, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, y que tienen una secuencia de ácido nucleico sustancialmente complementaria con al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico amplificada, 10

- los reactivos necesarios para la realización de una reacción de amplificación.
21. Kit de acuerdo con la reivindicación 20, en el que los reactivos necesarios para la realización de una reacción de amplificación son reactivos que permiten una amplificación NASBA.