ES2352509T3 - Nuevas estrategias de marcaje para la detección sensible de analitos. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar un analito, seleccionado de ácidos nucleicos, en una muestra, que comprende las etapas: (i) proporcionar una muestra; (ii) poner en contacto la muestra con un compuesto funcionalizado que comprende al menos un grupo funcional seleccionado de grupos alquino y azida que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre los grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3triazol, y en el que el grupo funcional está unido a una nucleobase de un compuesto nucleosídico o nucleotídico o un oligómero o polímero del mismo, en condiciones en las que dicho compuesto forma un producto de asociación con el analito a detectar, o su complemento, (iii) poner en contacto el producto de asociación con una segunda pareja de reacción para dicha reacción de Click, que comprende el grupo azida o alquino complementario, en condiciones en las que se produce una reacción de Click entre la pareja de reacción primera y segunda, en el que la segunda pareja de reacción comprende además un grupo marcador o un grupo precursor del marcador, (iv) si es necesario, convertir los grupos precursores del marcador en grupos marcadores, y (v) detectar dichos grupos marcadores.

Description

La presente invención se refiere a métodos y al uso de reactivos para detectar analitos, por ejemplo ácidos nucleicos. Los nuevos métodos y reactivos permiten una detección simple y sensible, incluso en muestras biológicas complejas.

Antecedentes de la Invención

El análisis rápido de material genético en busca de secuencias diana específicas, por ejemplo para determinar la presencia de polimorfismos de un solo nucleótido, la presencia de un cierto gen, por ejemplo un gen de resistencia, o de 10 ARNm, requiere nuevas herramientas fáciles de usar, eficaces y fiables. El principal problema es la necesidad de detectar el ADN o ARN de interés directamente en pequeñas muestras biológicas, tales como sangre del paciente o plantas. Estos proporcionan el analito sólo en cantidades minúsculas. A fin de alcanzar la sensibilidad requerida, habitualmente se requiere una etapa de amplificación, en la que el analito de ácido nucleico se amplifica antes del análisis, o se usa un método de detección, en el que se amplifica la señal minúscula de detección, directamente 15 obtenida del analito de ADN/ARN.

Los métodos para la amplificación del analito de ácido nucleico incluyen PCR y otros protocolos de amplificación de ácidos nucleicos. La amplificación mediante PCR tiene la ventaja principal de que, dentro de un conjunto de diferentes hebras de ADN obtenidas del material biológico, sólo se amplifica la secuencia de ADN de interés. Esto es la base para el análisis fiable de genes individuales en muestras biológicas complejas. Sin embargo, la amplificación mediante PCR 20 requiere etapas complejas de procedimiento que, en algunos casos, son demasiado inconvenientes y caras. La amplificación de la señal de detección se puede lograr uniendo una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante, al analito, que convierte continuamente un sustrato dado en un producto coloreado.

Otra manera de amplificar la señal de detección es la metalización de ADN. Una única partícula metálica unida a ADN/ARN (el núcleo) cataliza la deposición de cada vez más metal, que cataliza la deposición adicional de metal [1-9]. 25 La señal inducida por la deposición metálica crece en consecuencia de manera exponencial. La deposición metálica se puede detectar eléctricamente, si el analito se coloca entre los electrodos, u ópticamente (por ejemplo, con el ojo), debido a que el metal depositado da lugar a una mancha negra, por ejemplo sobre papel, en gel, o en el tubo de ensayo. En principio, la deposición metálica es el método de detección más sensible debido a que un pequeño agrupamiento metálico (núcleo) es suficiente para comenzar la reacción. Sin embargo, en la práctica, la sensibilidad del 30 método está limitada por la nucleación metálica no específica, por ejemplo a través de impurezas en vecindad espacial próxima al analito, por ejemplo en los electrodos, en el gel, o en el papel que tiene el analito. De hecho, la deposición metálica no específica es la razón principal por la que la tinción de ADN con plata no se usa de forma habitual en analítica de oligonucleótidos. La tinción con plata es complicada además por el hecho de que el ADN es incapaz de construir él mismo el núcleo de iniciación. Requiere una modificación previa. El método de elección actualmente es la 35 reacción de ADN con glutaraldehído, que se une covalentemente al ADN mediante unión inespecífica de la secuencia a grupos amina primaria en la nucleobase [7]. Este aducto, si se trata con una sal de plata, reduce la Ag+ de la sal a plata atómica, que, mientras está unida al ADN, funciona como el núcleo requerido. El tratamiento posterior del ADN nucleado con sales de plata y agentes reductores inicia la deposición metálica exponencial. Otra posibilidad es intercambiar los contraiones en la hebra de ADN por Ag+, que se reduce subsiguientemente para dar sitios de nucleación de Ag0. La 40 principal desventaja es que el glutaraldehído también reacciona con impurezas u otras especies químicas próximas al analito, lo que nuevamente induce la deposición no específica de plata.

Los agrupamientos metálicos tales como Au, partículas de Pd o complejos de Pt unidos a ADN también funcionan como sitios de nucleación para la deposición posterior de metal hasta la construcción de hilos conductores [1-9]. Aquí, los agrupamientos se unen a grupos reactivos que forman un enlace covalente con ADN, o unidades que sólo se intercalan 45 o unen de otro modo a ADN/ARN. Todos estos métodos marcan todo el ADN en una muestra biológica, y por lo tanto no permiten el marcaje específico de una secuencia y por tanto el análisis específico de una secuencia de un ADN diana, tal como un único gen en una muestra biológica compleja.

En [8] se describe la preparación de dominios de ADN marcados mediante una incorporación, mediada por telomerasas, de trifosfatos de nucleósidos modificados con amina en una repetición telomérica modificada iniciada por cebadores. 50 Los telómeros que contienen aminas se funcionalizan con ésteres N-succinimidílicos de nanopartículas de oro activadas, para producir hebras de ADN con nanopartículas de oro. El alargamiento de estos sitios de nanopartículas por deposición metálica posterior a lo largo del ADN produce de hecho un crecimiento rápido de los agrupamientos metálicos hasta la construcción de nanohilos moleculares templados de ADN. Sin embargo, la eficacia de la incorporación del trifosfato modificado con aminas en el extremo telomérico que crece es baja, y requiere el dopaje del 55 trifosfato, lo que da como resultado una distribución de los sitios de nucleación. De este modo, el procedimiento no permite el marcaje específico de secuencias.

También se ha intentado recientemente el marcaje de ADN específico de sitios vía un método litográfico complejo [4]. Según este método, se efectúa una protección parcial de las moléculas de ADN mediante la unión de RecA. Las secuencias de ADN desprotegidas se tratan entonces con glutaraldehído, que marca estas secuencias para la 60 metalización. La reducción específica del sitio de iones de plata por las funciones aldehído unidas a ADN da como resultado la formación de un hilo a lo largo de estas regiones. Sin embargo, no es posible un marcaje específico de secuencias de moléculas de ácido nucleico en una muestra biológica compleja.

H. C. Kolb et al. (H. C. Kolb, “The growing impact of click chemistry on drug discovery”, Drug Discovery Today, vol. 8, nº 24, 15 de diciembre de 2003, páginas 1128-1137) muestra, en la página 1135, en el esquema 4c, un cebador de 5 secuenciación directo universal que tiene unido un grupo funcional de Click. En este caso, sin embargo, el grupo funcional de Click se une mediante un ligador al grupo fosfato en el extremo 5’ del cebador, mientras que, según la presente invención, el grupo funcional de Click se une a una nucleobase. La diferencia es obvia cuando se tiene en cuenta la descripción de T. S. Seo et al. (T. S. Seo et al., “Click chemistry to construct fluorescent oligonucleotides for DNA sequencing”,
J. Org . Chem., vol. 68, nº 2, 21 de diciembre de 2002, páginas 609-612). Este documento se cita 10 como referencia [60] en la figura 4c por H. C. Kolb et al. T. S. Seo et al. muestran, en el esquema 1, en la página 610, la preparación de ácido nucleico 2 modificado con azida haciendo reaccionar el cebador de secuenciación directo universal M13-40 comercialmente disponible con 5-azidovalerato de succidinilo. El ADN marcado con azido mencionado por T. S. Seo et al. y H. C. Kolb et al. posee así un grupo azido en el grupo fosfato en el extremo 5’, pero no en una nucleobase. 15

Aunque estos documentos demuestran el interés en nuevas estrategias de marcaje de ADN, los procedimientos complicados implicados a fin de lograr el marcado evitan que estos sistemas se usen para cualquier aplicación real. En particular, estos métodos son incapaces de marcar selectivamente secuencias de ADN o ARN de interés directamente en una muestra biológica bruta.

De este modo, fue un objeto de la presente invención proporcionar nuevos métodos y reactivos que permitan una 20 detección simple, eficaz y específica de analitos, particularmente de ácidos nucleicos en muestras biológicas complejas.

Sumario de la Invención

La presente invención se refiere a métodos y kits de reactivos para detectar un analito, por ejemplo un ácido nucleico en una muestra, que implican el uso de un compuesto funcionalizado mediante Click que forma un producto de asociación con el analito a detectar. La introducción específica de secuencias de grupos marcadores se efectúa haciendo 25 reaccionar el compuesto funcionalizado mediante Click con una pareja de reacción adecuada que comprende grupos marcadores o grupos precursores del marcador.

Una realización de este aspecto se refiere a un método para detectar un analito, seleccionado de ácidos nucleicos, en una muestra, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una muestra; 30

(ii) poner en contacto la muestra con un compuesto funcionalizado que comprende al menos un grupo funcional seleccionado de grupos alquino y azida que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre los grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol, y en el que el grupo funcional está unido a una nucleobase de un compuesto nucleosídico o nucleotídico o un oligómero o polímero del mismo, en condiciones en las que dicho compuesto forma un producto de asociación con el 35 analito a detectar,

(iii) poner en contacto el producto de asociación con una segunda pareja de reacción para una reacción de Click que comprende el grupo azida o alquino complementario, en condiciones en las que se produce una reacción de Click entre la pareja de reacción primera y segunda, en el que la segunda pareja de reacción comprende además un grupo marcador o un grupo precursor del marcador, 40

(iv) si es necesario, convertir los grupos precursores del marcador en grupos marcadores, y

(v) detectar dichos grupos marcadores.

Una realización adicional de este aspecto se refiere a un kit de reactivo para detectar un analito en una muestra, que comprende:

(a) un compuesto funcionalizado que comprende 45

(i) al menos un grupo funcional de Click, seleccionado de grupos alquino y azida, que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol, y

(ii) un bloque constructor de un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico, en el que el grupo funcional está unido a una nucleobase, 50

(b) una segunda pareja de reacción para una reacción de Click, que comprende el grupo azida o alquino complementario, en el que dicha segunda pareja de reacción comprende además un grupo marcador o un grupo precursor de marcador, y

(c) opcionalmente un reactivo formador de marcador, capaz de convertir los grupos precursores de marcadores en grupos marcadores. 5

Todavía una realización adicional de este aspecto se refiere al uso de un compuesto de fórmula (II):

C-S-N

en la que C es un grupo funcional de Click seleccionado de grupos alquino y azida que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol, 10

S es un espaciador, y

N es un bloque constructor de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico, tal como un compuesto nucleosídico o nucleotídico, en el que el grupo funcional de Click se une a una nucleobase, en un método para detectar un analito de ácido nucleico en una muestra,

en el que el compuesto de fórmula (II) forma un producto de asociación con el analito a detectar. 15

Una realización adicional de este aspecto se refiere a una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico que tiene incorporado en ella al menos un compuesto de fórmula (II) como se define anteriormente, en la que el grupo funcional es un grupo alquino unido a las posiciones 5 y 6, preferiblemente la posición 5, de una nucleobase de pirimidina, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente posición 7, de una nucleobase de purina, y en el que la molécula de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico es capaz de hibridarse con un ácido nucleico complementario. 20

Una realización adicional de este aspecto se refiere a un método para sintetizar una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico que es capaz de hibridarse a un ácido nucleico complementario, que comprende incorporar un bloque constructor de nucleótidos o de un análogo de nucleótidos que comprende un compuesto (II) como se define anteriormente, en el que el grupo funcional es un grupo alquino unido a las posiciones 5 y 6, preferiblemente a la posición 5, de una nucleobase de pirimidina, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente posición 7, de una nucleobase de 25 purina en una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico.

Este método puede comprender además poner en contacto la molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico con una segunda pareja de reacción del compuesto (II) y llevar a cabo una reacción de Click entre las parejas de reacción primera y segunda, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol. 30

Una realización adicional de este aspecto se refiere a un producto de asociación de la molécula de ácido nucleico o del análogo de ácido nucleico como se define anteriormente con un analito.

Una realización adicional de este aspecto se refiere a un compuesto, obtenible como el producto de reacción del método para sintetizar una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico.

Una realización adicional de este aspecto se refiere a un producto de asociación del compuesto como se define 35 anteriormente con un ácido nucleico complementario.

La presente invención permite una detección muy sensible de un analito, por ejemplo ácidos nucleicos o proteínas que se unen a ácidos nucleicos, en muestras biológicas, por ejemplo muestras clínicas, muestras medioambientales o muestras agrícolas. Las aplicaciones preferidas incluyen, pero no se limitan a, la detección de variabilidades genéticas, por ejemplo polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), resistencias a pesticidas o medicamentos, tolerancias o 40 intolerancias, genotipado, por ejemplo la detección de especies o cepas de organismos, la detección de organismos o cepas genéticamente modificados, o la detección de patógenos o plagas, y el diagnóstico de enfermedades, por ejemplo enfermedades genéticas, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunitarias o enfermedades infecciosas. Una aplicación preferida adicional es la detección de ácidos nucleicos en muestras para la protección de marcas, en la que productos tales como productos agrícolas, productos alimentarios, o bienes de valor y/o los envases de estos productos 45 se codifican con una información específica del producto, por ejemplo, pero sin limitarse a, sitio de producción, fecha de producción, distribuidor, etc., y en la que esta información se detecta con los métodos como se describen anteriormente.

Descripción Detallada de Realizaciones Preferidas

La invención proporciona métodos y reactivos que permiten el marcaje específico de analitos con grupos marcadores, por ejemplo con grupos aldehído reactivos, en una muestra compleja. En una realización preferida, se puede efectuar 50 específicamente la deposición metálica, por ejemplo la deposición de plata, sobre los grupos aldehído asociados con el ácido nucleico a detectar. En una realización preferida adicional, la deposición metálica, por ejemplo la deposición de plata, se puede efectuar específicamente mediante transferencia de energía desde grupos fotosensibilizantes a un medio fotosensible, por ejemplo papel fotográfico. Debido al procedimiento de marcaje específico, el fondo se reduce fuertemente, y se obtienen mayores sensibilidades y fiabilidades.

La presente invención comprende la detección de un analito. La detección puede ser una detección cualitativa, por ejemplo la determinación de la presencia o ausencia de un analito, por ejemplo una secuencia de ácido nucleico 5 específica, en la muestra a analizar. Sin embargo, la invención también permite la detección cuantitativa de un analito, por ejemplo una secuencia de ácido nucleico, en la muestra a analizar. La detección cualitativa y/o cuantitativa puede comprender la determinación de grupos marcadores según los métodos conocidos en la técnica.

El analito a detectar se selecciona preferiblemente de ácidos nucleicos y moléculas que se unen a nucleósidos, a nucleótidos o a ácidos nucleicos, por ejemplo proteínas que se unen a nucleósidos, a nucleótidos o a ácidos nucleicos. 10 Más preferiblemente, el analito es un ácido nucleico, por ejemplo cualquier tipo de ácido nucleico que se puede detectar según técnicas conocidas, particularmente técnicas de hibridación. Por ejemplo, los analitos de ácido nucleico se pueden seleccionar de ADN, por ejemplo ADN bicatenario o monocatenario, ARN, o híbridos de ADN-ARN. Los ejemplos particulares de analitos de ácido nucleico son ADN genómico, ARNm o productos derivados de ellos, por ejemplo ADNc. 15

El método de la invención se puede llevar a cabo según cualquier formato de ensayo conocido que sea adecuado para la detección de analitos, particularmente analitos de ácido nucleico, en una muestra. Por ejemplo, el método puede implicar la detección de analitos inmovilizados sobre superficies sólidas tales como membranas, por ejemplo transferencias Southern o Northern, chips, matrices o partículas tales como perlas. Además, la detección se puede llevar a cabo en geles, por ejemplo después de la separación electroforética de la muestra en geles, por ejemplo geles 20 de agarosa o de poliacrilamida. El método puede implicar la detección de analitos individuales, o la detección paralela de una pluralidad de analitos, por ejemplo en un formato de chip o de micromatrices.

En una realización preferida, la detección implica irradiar un medio fotosensible en presencia de una muestra que contiene un producto de asociación indicativo para un analito, en la que el producto de asociación comprende grupos fotosensibilizadores capaces de efectuar una transferencia de energía al medio fotosensible en el que los grupos 25 marcadores se forman en el medio.

La muestra puede ser cualquier muestra que puede contener el analito a detectar. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra biológica, tal como una muestra agrícola, por ejemplo una muestra que comprende material vegetal y/o material asociado con el sitio en el que crecen las plantas, donde se almacenan o procesan materiales vegetales. Por otro lado, la muestra puede ser también una muestra clínica, tal como una muestra de tejido o una muestra de fluido 30 corporal tal como sangre, suero, plasma, etc., particularmente de origen humano. Otros tipos de muestras incluyen, pero no se limitan a, muestras medioambientales, muestras de suelo, muestras alimentarias, muestras forenses, o muestras de bienes valiosos que se ensayan para la protección de la marca.

Debido a su elevada sensibilidad, el método de la presente invención es adecuado para detectar directamente analitos sin amplificación. Según la invención, incluso se pueden determinar, incluso sin amplificación, cantidades minúsculas de 35 analitos, por ejemplo de ácidos nucleicos, por ejemplo 0,1 ng o menos, preferiblemente 0,01 ng o menos, más preferiblemente 1 pg o menos, aún más preferiblemente 0,1 pg o menos, incluso más preferiblemente 0,01 pg o menos, y lo más preferible 0,001 pg o menos. Se puede obtener una elevada sensibilidad incorporando en una molécula de ácido nucleico múltiples nucleótidos modificados usando grupos aldehído sin proteger y/o usando técnicas de tinción optimizadas. Por ejemplo, la detección de un analito, por ejemplo un gen, en una muestra biológica, se puede llevar a 40 cabo mediante una combinación de transferencia Southern y el método de la invención. Sin embargo, se debería observar que el método de la presente invención también permite la detección de ácidos nucleicos combinada con una etapa de amplificación, que se puede llevar a cabo según protocolos conocidos tales como PCR o sus modificaciones, tales como PCR asimétrica, PCR en tiempo real, PCR de transcripción inversa, etc., u otros protocolos de amplificación tales como LCR. 45

En una realización preferida de la invención, se lleva a cabo una detección del analito específica de secuencias, en la que por ejemplo se distingue un ácido nucleico que tiene una secuencia específica de otras secuencias de ácido nucleico en la muestra, o se distingue un polipéptido capaz de unirse a una secuencia de ácido nucleico específica de otros polipéptidos en la muestra. Tal detección específica de secuencias comprende preferiblemente una reacción de hibridación específica de secuencias mediante la cual la secuencia de ácido nucleico a detectar se asocia con un 50 compuesto que posee un grupo marcador o un grupo de un precursor del marcador. Sin embargo, se debería observar que la presente invención también permite la detección de ácidos nucleicos no específica de secuencias, por ejemplo la detección de cualesquiera ácidos nucleicos presentes en una muestra.

A fin de identificar el analito a detectar, la muestra se puede poner en contacto con un compuesto funcionalizado mediante Click, en condiciones en las que se forma un producto de asociación con el analito, por ejemplo un ácido 55 nucleico.

El compuesto funcionalizado puede comprender un único grupo funcional, o una pluralidad de grupos funcionales. Por ejemplo, un compuesto funcionalizado se puede acoplar a un resto dendrimérico que comprende una pluralidad, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más grupos funcionales como se indica anteriormente. Los restos dendriméricos se pueden sintetizar mediante técnicas conocidas. Preferiblemente, los restos dendriméricos se sintetizan vía reacciones de Click, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 5.

El grupo funcional se une a un compuesto que es capaz de formar un producto de asociación con el analito. El compuesto puede ser un compuesto nucleosídico o nucleotídico, por ejemplo un nucleósido o análogo nucleosídico o un 5 nucleótido o análogo nucleotídico o un oligómero o polímero que comprende al menos un compuesto funcionalizado, por ejemplo un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico. Un compuesto nucleosídico o nucleotídico es un nucleósido o análogo nucleosídico o un nucleótido o análogo nucleotídico capaz de incorporarse en ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, por ejemplo mediante métodos químicos o enzimáticos. El ácido nucleico o análogo de ácido nucleico resultante debería de ser capaz de formar productos de asociación, por ejemplo híbridos de ácidos nucleicos, con el 10 analito. Preferiblemente, el compuesto comprende un resto base, por ejemplo una nucleobase, u otro resto base heterocíclico capaz de formar pares de bases con una nucleobase, y un resto de cadena principal, por ejemplo que comprende un resto de azúcar y opcionalmente un resto de fosfato en nucleósidos o nucleótidos o un resto de cadena principal diferente en análogos nucleosídicos o nucleotídicos.

En la Figura 1, se muestran ejemplos preferidos de compuestos nucleosídicos funcionales, en los que la nucleobase es 15 7-dN-G, C, 7-dN-A o T y R es un grupo funcional.

Preferiblemente, el grupo funcional se une a un resto base, por ejemplo a una nucleobase. El grupo funcional, sin embargo, también se puede unir a un resto de cadena principal, por ejemplo un grupo azúcar, un grupo fosfato, o, en el caso de análogos nucleosídicos o nucleotídicos, un grupo azúcar modificado, un grupo fosfato modificado, o un resto de cadena principal peptídica, etc. Preferiblemente, el grupo funcional está unido covalentemente al compuesto vía un 20 enlace directo o vía un espaciador. Si la unión se efectúa vía un espaciador, el grupo funcional se puede enlazar a un grupo alifático o cicloalifático, un grupo aromático o heteroaromático, un grupo alqueno y/o un grupo alquino. Más preferiblemente, el grupo funcional se puede enlazar a grupos aromáticos o heteroaromáticos, o a grupos alquino. Los grupos aldehídicos especialmente preferidos incluyen grupos aldehídicos aromáticos y alifáticos tales como benzaldehído, o grupos aldehídicos en aldosas tales como triosas, tetrosas, pentosas o hexosas como glucosa o 25 manosa.

El grupo funcional también puede ser un grupo de tipo asa, es decir, un grupo para introducir un grupo aldehído, un grupo aldehído protegido o un grupo precursor de aldehído, o para introducir un grupo fotosensibilizador mediante reacción con una pareja de reacción adecuada, es decir, un compuesto que comprende uno de los grupos anteriores. Los grupos de tipo asa se seleccionan de grupos funcionalizados mediante Click, es decir, grupos que pueden 30 reaccionar con una pareja de reacción adecuada en una reacción de cicloadición en la que se forma un enlace cíclico, por ejemplo heterocíclico, entre el grupo funcional de Click y la pareja de reacción, y en la que la pareja de reacción comprende un aldehído o un grupo aldehído protegido o un grupo fotosensibilizador. Un ejemplo especialmente preferido de tal reacción de Click es una cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino, que da como resultado la formación de anillos 1,2,3-triazólicos. De este modo, los grupos aldehído se pueden generar llevando a cabo una 35 reacción de Click de un grupo de tipo asa azídico o alquínico y una pareja de reacción correspondiente, es decir, una pareja de reacción que comprende el grupo alquino o azida complementario y adicionalmente un aldehído, un grupo aldehído protegido o un precursor de aldehído. En una realización adicional de la invención, la pareja de reacción de una funcionalización de Click, sin embargo, también puede contener diferentes grupos marcadores o precursores de marcadores tales como grupos marcadores de fluorescencia o grupos fotosensibilizadores. 40

Una realización especialmente preferida de la reacción de Click comprende una cicloadición (3 + 2) catalizada por cobre entre una azida y un grupo alquino. La formación irreversible de 1,2,3-triazoles como resultado de la cicloadición de azida/alquino es ortogonal, los grupos químicos requeridos son pequeños (incorporación con interrupción mínima del entorno de la biomolécula), y selectiva debido a la falta de azidas y alquinos encontrados en la naturaleza.

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imagen1

en la que R1 y R2 son radicales orgánicos.

Los ejemplos específicos de compuestos funcionalizados mediante Click, y los métodos para preparar tales compuestos, se muestran en las Figuras 3b, 9a-c y 10. En la Figura 11 y 12 se muestran ejemplos específicos de parejas de reacción para compuestos funcionalizados mediante Click.

El grupo funcionalizado mediante Click se une preferiblemente a una nucleobase, que se puede seleccionar de bases 50 purínicas y pirimidínicas de origen natural y de origen no natural. Preferiblemente, las nucleobases se seleccionan de citidina, uracilo, timina, adenina, guanina, 7-desazaadenina, 7-desazaguanina, inosina y xantina. El grupo funcional se une preferiblemente a la posición 5 ó 6, más preferiblemente a la posición 5, de una nucleobase pirimidínica, o a la posición 7 u 8, más preferiblemente a la posición 7 de una nucleobase purínica, particularmente si se desea una incorporación enzimática en un ácido nucleico.

El grupo funcional se puede unir covalentemente al compuesto, por ejemplo vía un enlace directo o un espaciador, por ejemplo un espaciador que tiene una longitud de cadena de hasta 20 átomos. El espaciador puede ser un espaciador 5 flexible, por ejemplo un espaciador a base de alquileno, que contiene opcionalmente heteroátomos tales como O, S y/o N, o un espaciador al menos parcialmente rígido, por ejemplo un espaciador que comprende al menos un grupo rígido seleccionado de grupos alqueno, grupos alquino, grupos cíclicos, particularmente grupos aromáticos o heteroaromáticos, pero también grupos cicloalifáticos y sus combinaciones. Si el compuesto de funcionalización comprende un grupo de funcionalización mediante Click que es la primera pareja de reacción para una reacción de 10 Click, y se hace reaccionar subsiguientemente con una segunda pareja de reacción para una reacción de Click, se prefiere una unión del grupo funcional vía un enlace directo, un espaciador flexible o un espaciador parcialmente rígido, en la que el espaciador flexible podría tener por ejemplo una longitud de cadena de hasta 6 átomos, más particularmente hasta 4 átomos, y en la que un espaciador parcialmente rígido tiene preferiblemente una longitud de cadena de hasta 20 átomos, por ejemplo hasta 10 átomos, y comprende al menos un grupo rígido como se define 15 anteriormente, particularmente un grupo alquino, y al menos un grupo flexible, por ejemplo un grupo alquileno. Por otro lado, si el grupo funcional es un grupo aldehído o un grupo aldehído protegido o un grupo precursor de aldehído, se prefiere la unión vía un espaciador parcialmente rígido como se define anteriormente o un espaciador al menos parcialmente rígido que tiene una longitud de cadena de 2 a 10 átomos. La estructura de un espaciador que contiene un grupo rígido, por ejemplo un espaciador parcialmente rígido, es preferiblemente tal que el grupo rígido esté directamente 20 unido a la nucleobase. En la Fig. 15a y b se muestra un ejemplo preferido de un espaciador particularmente rígido.

El compuesto funcionalizado es capaz de formar un producto de asociación con el analito a detectar. Por otro lado, el compuesto funcionalizado se puede seleccionar de compuestos que se pueden incorporar en ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos, es decir bloques constructores de ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos. Tales compuestos son nucleótidos o análogos nucleotídicos funcionalizados mediante Click. Por otro lado, el compuesto 25 funcionalizado se puede seleccionar de ácidos nucleicos o análogos funcionalizados mediante Click.

El término “nucleótido”, según la presente invención, se refiere particularmente a ribonucleótidos, 2’-desoxirribonucleótidos o 2’,3’-didesoxirribonucleótidos. Los análogos nucleotídicos se pueden seleccionar de nucleótidos modificados con azúcar o de cadena principal modificada, particularmente de análogos nucleotídicos que se pueden incorporar enzimáticamente en ácidos nucleicos. En nucleótidos modificados con azúcar preferidos, el grupo 2’-30 OH o H del azúcar ribosa se sustituye por un grupo seleccionado de OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en el que R es alquilo C1-C6, alquenilo o alquinilo, y halo es F, Cl, Br o I. La propia ribosa se puede sustituir por otros grupos carbocíclicos o heterocíclicos de 5 ó 6 miembros, tales como un grupo ciclopentano o un ciclohexeno. En nucleótidos de cadena principal modificada preferidos, el grupo fosfo(tri)éster se puede sustituir por un grupo modificado, por ejemplo mediante un grupo fosforotioato o un grupo H-fosfonato. Otros análogos nucleotídicos preferidos incluyen bloques 35 constructores para la síntesis de análogos de ácidos nucleicos tales como ácidos nucleicos morfolínicos, ácidos nucleicos peptídicos o ácidos nucleicos bloqueados.

Los ácidos nucleicos funcionalizados mediante Click pueden ser oligonucleótidos, por ejemplo ácidos nucleicos que tienen una longitud de hasta 30 bloques constructores de nucleótidos (o análogos nucleotídicos), o polinucleótidos que tienen una longitud de más de 30 bloques constructores de nucleótidos (o análogos nucleotídicos). Preferiblemente, los 40 ácidos nucleicos y análogos nucleicos son capaces de unirse específicamente al analito, por ejemplo son capaces de hibridarse con un analito de ácido nucleico en las condiciones de ensayo. La longitud mínima es preferiblemente 12 o más, preferiblemente 14 bloques constructores de nucleótidos (o análogos nucleotídicos).

Los grupos constructores de ácidos nucleicos o de análogos de ácidos nucleicos funcionalizados se pueden incorporar en ácidos nucleicos mediante técnicas estándar para incorporación mediante síntesis química y/o enzimática. La 45 síntesis química se puede llevar a cabo por ejemplo mediante química de fosforamidito estándar, usando fosforamiditos nucleosídicos modificados como bloques constructores en protocolos de síntesis estándar. Otros tipos de bloques constructores preferidos para la síntesis química incluyen los nucleósidos modificados mediante H-fosfonato o fosforotriéster.

Por otro lado, los nucleótidos modificados se pueden incorporar en ácidos nucleicos mediante métodos enzimáticos. 50 Sorprendentemente, se encontró que los trifosfatos de nucleósidos funcionalizados mediante Click son aceptados como sustratos enzimáticos mediante enzimas que sintetizan ácidos nucleicos, tales como ADN polimerasas, ARN polimerasas, transcriptasas inversas o telomerasas. Por ejemplo, se encontró que los trifosfatos de nucleósidos modificados son aceptados por ADN polimerasas usadas habitualmente para protocolos de extensión y amplificación mediante cebadores, por ejemplo ADN polimerasas termoestables tales como Taq polimerasa, Vent polimerasa, Pfx 55 polimerasa, Pwo polimerasa o polimerasa Therminator, como se describe en el Ejemplo 7. Las enzimas aceptan trifosfatos modificados sin pérdida de la fidelidad, y permiten la incorporación a base de moldes en ácidos nucleicos tales como ADN y ARN.

El método de la presente invención proporciona diversas realizaciones de la detección de analitos. Por ejemplo, se pueden proporcionar bloques constructores de ácidos nucleicos funcionalizados, por ejemplo nucleótidos o análogos 60 nucleotídicos, junto con enzimas apropiadas, que se incorporan enzimáticamente en una molécula de ácido nucleico que forma el producto de asociación con el analito. En la presente invención, se puede emplear un único tipo de nucleótido funcionalizado, o una pluralidad de diferentes tipos de nucleótidos funcionalizados. Como alternativa, o adicionalmente, ya puede estar presente un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico funcionalizado, que se ha fabricado, por ejemplo mediante síntesis química o enzimática, y que se une específicamente, por ejemplo mediante 5 hibridación, al analito a detectar.

En una realización preferida, el método comprende una reacción de extensión de cebador, opcionalmente en combinación con etapas de amplificación subsiguientes del ácido nucleico, tales como PCR. Por ejemplo, se puede proporcionar al menos una molécula cebadora que se hibrida en las condiciones de ensayo con un analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento. El cebador unido se extiende entonces, en el que se obtiene un producto de 10 extensión detectable que indica la presencia y/o cantidad del analito de ácido nucleico a detectar. Según esta realización, se pueden usar cebadores funcionalizados y/o nucleótidos o análogos nucleotídicos funcionalizados, para la incorporación en el producto de extensión.

Como alternativa, y/o adicionalmente, el método de la invención puede comprender el uso de sondas de hibridación funcionalizadas, que se hibridan en las condiciones de ensayo con el analito de ácido nucleico a detectar, o su 15 complemento, en el que la formación de un producto de hibridación indica la presencia y/o cantidad del analito de ácido nucleico a detectar.

El método de detección de la invención se puede llevar a cabo mediante cualesquiera protocolos de detección de ácidos nucleicos conocidos, por ejemplo que implican el uso de soportes sólidos. Por ejemplo, se puede proporcionar un soporte sólido, por ejemplo un chip o matriz o un material en partículas, tal como una perla, al que se une una sonda de 20 captura capaz de hibridarse con el analito a detectar. El analito de ácido nucleico unido en fase sólida se puede detectar usando sondas de hibridación funcionalizadas que se hibridan con el analito de ácido nucleico en una parte de la secuencia diferente de como lo hace la sonda de captura, y detectando subsiguientemente la sonda de hibridación unida, por ejemplo con un reactivo de metalización. Este método es particularmente adecuado para las aplicaciones de diagnóstico en el campo agrícola y clínico, por ejemplo para la detección de ADN y/o ARNm de plantas, por ejemplo 25 plantas modificadas genéticamente, ADN de patógenos o plagas de plantas, etc.

En una realización específica, la detección puede implicar poner en contacto el producto de asociación del analito y un compuesto funcionalizado que comprende un grupo fotosensibilizador con un medio fotosensible, por ejemplo transfiriendo una muestra o una alícuota de muestra en la que puede estar presente un producto de asociación sobre el medio fotosensible, por ejemplo mediante manchado, pipeteado, etc. Con la irradiación, se efectúa una transferencia de 30 energía desde el grupo fotosensibilizador al medio fotosensible, de manera que se forman grupos marcadores tales como núcleos metálicos, por ejemplo de plata, en el medio fotosensible en presencia, pero no en ausencia, de grupos fotosensibilizadores. Si es necesario, los grupos marcadores se pueden someter a un procedimiento de desarrollo, por ejemplo un procedimiento de desarrollo químico o fotoquímico según técnicas fotográficas. El medio fotosensible puede ser cualquier soporte sólido, o cualquier material soportado capaz de formar grupos marcadores, por ejemplo núcleos 35 metálicos. Preferiblemente, el medio fotosensible es un medio sensible a la luz, tal como un papel sensible a la luz o una emulsión o gel sensible a la luz sobre un material soporte. Más preferiblemente, el medio fotosensible es un medio fotográfico, tal como papel fotográfico. La radiación se lleva a cabo en condiciones, por ejemplo de longitudes de onda y/o intensidad de la luz de irradiación, bajo las cuales tiene lugar la formación de grupos marcadores selectivos en presencia de grupos fotosensibilizadores. Preferiblemente, la irradiación tiene lugar con luz infrarroja y/o con luz visible 40 de onda larga, dependiendo de la sensibilidad del medio. La longitud de onda de la irradiación puede ser, por ejemplo, 500 nm o mayor, 520 nm o mayor, 540 nm o mayor, 560 nm o mayor, 580 nm o mayor para la luz visible, o 700 nm a 10 µm para la luz infrarroja.

Un aspecto importante de la invención es la detección de variabilidades genéticas, por ejemplo polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). El genoma de, por ejemplo, seres humanos contiene variaciones de la secuencia nucleotídica a una 45 frecuencia media de hasta 0,1%. Por lo tanto, estas variabilidades proporcionan excelentes marcadores para la identificación de factores genéticos que contribuyen a la susceptibilidad de enfermedades complejas [16, 17]. Aunque existe un amplio intervalo de técnicas disponibles para la detección de los SNP, la mayoría de estos métodos son lentos, requieren una gran instrumentación, y la amplificación mediante PCR [18]. El presente método, sin embargo, es tanto barato como suficientemente flexible para acomodarse a las necesidades de cribado de un resultado bajo, 50 moderado y elevado con elevada velocidad, sensibilidad y eficacia. Existen varias posibilidades para marcar selectivamente sólo las hebras que se emparejan completamente o las hebras desemparejadas permitiendo usar el método de la invención para la detección de los SNP.

Por ejemplo, la detección de emparejamientos o desemparejamientos de ácidos nucleicos, por ejemplo en los SNP, puede comprender el uso de sondas de hibridación funcionalizadas que se hibridan en las condiciones de ensayo con el 55 analito de ácido nucleico a detectar o su complemento, y puede comprender someter el producto de hibridación a un procedimiento de tratamiento en el que se disuelve un producto de hibridación que contiene al menos un desemparejamiento, y en el que la presencia de un producto de hibridación no disuelto indica la presencia y/o cantidad de un ácido nucleico que tiene una secuencia completamente complementaria (es decir, no desemparejada) a la sonda de hibridación. 60

El tratamiento para la disolución de los productos de hibridación que contienen desemparejamientos puede comprender un tratamiento de digestión de desemparejamientos, es decir, el uso de enzimas que detectan desemparejamientos, las cuales escinden el producto de hibridación dependiendo de la presencia de un desemparejamiento. Las enzimas adecuadas para tal tratamiento de digestión de desemparejamientos incluye glucosilasas de desemparejamiento, tales como las codificadas por los genes hMSH2 y hMLH1 y Mut S, Mut L y Mut H. Proteínas adicionales son MutY y 5 Mig.Mth1. Mig.Mth1 corta T de un desemparejamiento TG, MutY corta A en un desemparejamiento AG, y la enzyma TDG corta T en un desemparejamiento TG.

Como alternativa, o adicionalmente, los productos de hibridación que contienen desemparejamientos se pueden disolver mediante un tratamiento de hibridación diferencial que implica el ajuste de condiciones de hibridación, por ejemplo en vista de la temperatura, concentración salina y/o lavado con cloruro de dimetilamonio, en el que se disuelve un producto 10 de hibridación que contiene un desemparejamiento, y el producto de hibridación completamente complementario permanece estable.

En una realización todavía adicional, los desemparejamientos, por ejemplo los SNP, se pueden determinar mediante alargamiento de cebadores selectivo catalizado por enzimas. Para este fin, se proporciona un cebador, en el que el extremo 3’ del cebador está situado directamente en dirección 5’ de un sitio de desemparejamiento potencial en el 15 analito molde. Sólo es posible una extensión del cebador cuando está presente un nucleótido que es complementario a la siguiente base en el molde. Seleccionando un único tipo de nucleótido funcionalizado, y determinando si se incorpora en el cebador o no, se puede determinar la base en el sitio de desemparejamiento potencial.

El método de la invención comprende la detección de grupos marcadores que se incorporan en un producto de asociación del analito con un compuesto funcionalizado. Los grupos marcadores se seleccionan preferiblemente de 20 grupos formadores de deposición metálica, por ejemplo grupos funcionalizados con aldehído, a partir de grupos fluorescentes o formadores de fluorescencia, o a partir de grupos redox activos.

La formación de deposiciones metálicas requiere el tratamiento de grupos aldehídicos con un reactivo de metalización, por ejemplo un reactivo que comprende átomos y/o iones metálicos seleccionados de Ag, Au, Bi, Cu, Pd o Pt, que se pueden depositar selectivamente alrededor de grupos aldehído, por ejemplo mediante reducción. Preferiblemente, el 25 reactivo de metalización comprende una sal de Ag+, tal como un complejo de Ag-amonio, es decir el reactivo de Tollens. Otros ejemplos preferidos de reactivos de mealización son Cu(NO3)/I2, complejos de platino con terpiridina, tales como [Pt(terpy)Cl]Cl, Pd(OAc)2 o KAuCl4.

Además, los grupos funcionalizados también pueden funcionar como un asa para unir otros grupos marcadores, tales como grupos marcadores fluorescentes. Por ejemplo, los compuestos marcadores con grupos amino se pueden acoplar 30 a grupos aldehído mediante aminación reductora en presencia de un agente reductor tal como cianoborohidruro de sodio. Como alternativa, se puede usar la formación de hidrazonas u oximas para proporcionar grupos marcadores.

La detección de los grupos marcadores se puede llevar a cabo según métodos conocidos. Por ejemplo, las deposiciones metálicas se pueden determinar cualitativa y/o cuantitativamente por métodos ópticos y/o métodos eléctricos. En una realización preferida, las deposiciones metálicas sobre una superficie sólida se pueden determinar 35 midiendo parámetros eléctricos, por ejemplo la conductividad. Los grupos marcadores fluorescentes se pueden determinar cualitativa y/o cuantitativamente por métodos de medida fluorescentes conocidos, por ejemplo excitación vía una fuente de luz adecuada tal como un láser, y detectando la luz fluorescente emitida.

En una realización adicional, la invención comprende la detección de grupos marcadores que se forman específicamente en el sitio en un medio fotosensible en presencia de grupos fotosensibilizadores en un producto de 40 asociación del analito con un compuesto funcionalizado. Los grupos fotosensibilizadores se seleccionan preferiblemente de grupos fluorescentes o luminiscentes. Los grupos fotosensibilizadores se pueden incorporar directamente en el producto de asociación o vía un asa, por ejemplo vía una reacción de Click como se explica anteriormente con detalle. El medio fotosensible comprende grupos que, cuando se irradian en presencia de grupos fotosensibilizadores, forman grupos marcadores detectables, tales como núcleos metálicos, que se pueden desarrollar según técnicas fotográficas 45 estándar, por ejemplo mediante técnicas de desarrollo químicas o fotoquímicas.

La invención también se refiere a kits de reactivos para detectar analitos como se describe anteriormente, por ejemplo analitos de ácidos nucleicos, en una muestra, que comprenden un compuesto funcionalizado que tiene unido al menos un grupo funcional como se describe anteriormente.

El kit de reactivos puede contener opcionalmente un reactivo formador de aldehídos o una segunda pareja para una 50 reacción de Click, y un marcador o reactivos formadores de marcadores o un medio fotosensible. Los kits se usan preferiblemente en un método como se indica anteriormente.

Además, la presente invención se refiere al uso de un compuesto funcionalizado mediante Click de fórmula (II) como se indica anteriormente. Los compuestos funcionalizados pueden ser bloques constructores para la síntesis química o enzimática de ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos o sus precursores. Preferiblemente, los compuestos son 55 trifosfatos de nucleósidos, particularmente trifosfatos de ribosa, de 2’-desoxirribosa o de 2’,3’-didesoxirribosa, o sus análogos, que se pueden incorporar enzimáticamente en ácidos nucleicos.

Además, los compuestos pueden ser bloques constructores para la síntesis química de ácidos nucleicos, o análogos de ácidos nucleicos tales como ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos morfolínicos o ácidos nucleicos bloqueados. Para este fin, son adecuados fosforamiditos, H-fosfonatos, fosforotriésteres de nucleósidos, o aminoácidos de nucleobases protegidos con Fmoc y/o Boc.

La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico que tiene incorporada 5 en ella al menos un compuesto de fórmula (II): La molécula puede ser un ácido nucleico seleccionado de ADN y ARN, o un análogo de ácido nucleico, por ejemplo seleccionado de ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos morfolínicos o ácidos nucleicos bloqueados, como se describe con detalle anteriormente.

Además, la invención se refiere a un método para sintetizar una molécula de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico, que comprende incorporar al menos un bloque constructor nucleotídico o de análogo nucleotídico que 10 comprende un compuesto (II) en una molécula de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico. El método puede comprender una síntesis química y/o una síntesis enzimática.

Además, la invención se refiere a un producto de metalización de la molécula de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico como se indica anteriormente que es obtenible mediante el tratamiento de un compuesto funcionalizado con aldehído que contiene ácido nucleico con un reactivo de metalización como se indica más abajo con detalle. 15

Además, la invención se refiere a un producto de asociación de la molécula de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico como se indica anteriormente, con un analito como se describe anteriormente. Preferiblemente, el producto de asociación es un producto de hibridación con un ácido nucleico complementario.

En una realización preferida, los métodos y los kits de reactivos de la presente invención se usan para aplicaciones agrícolas. Por ejemplo, la invención es adecuada para la detección de ácidos nucleicos de plantas, patógenos vegetales 20 o plagas de plantas tales como virus, bacterias, hongos o insectos. Además, la invención es adecuada para detectar variabilidades genéticas, por ejemplo SNP en plantas o partes de plantas, patógenos de plantas o plagas de plantas, tales como insectos.

Una aplicación adicional es una detección o monitorización de resistencias a herbicidas, fungicidas o plaguicidas, tolerancias o intolerancias, por ejemplo resistencias, tolerancias o intolerancias en hongos, insectos o plantas en 25 organismos o poblaciones de organismos. La invención también es adecuada para genotipar rápidamente, por ejemplo para la detección y/o diferenciación rápidas de especies o cepas de hongos, insectos, o plantas. Además, es posible la detección y/o diferenciación de organismos o cepas genéticamente modificados, por ejemplo organismos o cepas de hongos, insectos o plantas.

Debido a la elevada sensibilidad de la invención, es posible un diagnóstico temprano de patógenos, es decir, el 30 diagnóstico antes de que sean visibles los primeros síntomas de la presencia de patógenos. Esto es particularmente importante para el diagnóstico de la roya de la soja (Phakospora pachyrizi) u otros patógenos, por ejemplo Blumeria graminis, Septoria tritici u Oomycetes, u otros patógenos para los cuales sólo es posible el control si se detecta su presencia antes de que se puedan reconocer visualmente.

Además, la invención es adecuada para aplicaciones médicas, de diagnóstico y forenses, por ejemplo en medicina 35 humana o veterinaria, por ejemplo para la detección de ácidos nucleicos de patógenos, por ejemplo patógenos humanos o patógenos de ganado o de animales de compañía.

Otras aplicaciones preferidas incluyen la detección de variabilidades genéticas, por ejemplo los SNP, en seres humanos, o la detección de resistencias, tolerancias o intolerancias, o alergias a medicamentos. Además, la invención es adecuada para el genotipado, particularmente el genotipado de seres humanos, a fin de determinar mutaciones 40 asociadas con predisposición o riesgo aumentado de trastornos, alergias e intolerancias. La invención también se puede usar para la detección de organismos o cepas genéticamente modificados, organismos o cepas de bacterias o virus, pero también animales de granja genéticamente modificados, etc. La invención es particularmente adecuada para el diagnóstico rápido de enfermedades, por ejemplo enfermedades genéticas, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunitarias o enfermedades infecciosas. 45

Además, la invención es adecuada para detectar la función y/o expresión de genes, por ejemplo con fines de investigación.

Todavía una realización adicional es el uso del método para la protección de marcas, por ejemplo para detectar información específica codificada en productos tales como bienes valiosos como productos de protección de plantas, fármacos, cosméticos y química fina (por ejemplo vitaminas y aminoácidos) y productos de bebida, productos 50 combustibles, por ejemplo gasolina y diesel, aparatos electrónicos del consumidor. Además, se puede marcar el envasado de estos y otros productos. La información se codifica mediante ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos que se han incorporado en el producto y/o en el envase de un producto. La información se puede referir a la identidad del fabricante, a los sitios de producción, a la fecha de producción y/o al distribuidor. Por medio de la presente invención, se puede llevar a cabo la detección rápida de datos específicos del producto. Se puede preparar una muestra 55 a partir de una alícuota del producto, que entonces se pone en contacto con una o varias sondas de hibridación funcionalizadas específicas de secuencias, capaces de detectar en la muestra la presencia de información codificada por el ácido nucleico.

La invención también es adecuada para el campo de los nutrientes. Por ejemplo, en el área de piensos, los nutrientes para animales, por ejemplo maíz, se suplementan con una mayor cantidad de conservantes, tal como ácido propiónico. Aplicando el método de la invención, se puede reducir la adición de conservantes. Además, el análisis genómico con el 5 método de la invención permite la predicción de la capacidad de un individuo para utilizar nutrientes específicos (nutrigenómicos).

Todavía una realización preferida adicional se refiere al campo de la epigenética. Esta realización se refiere particularmente a un análisis de ADN, por ejemplo ADN genómico, con respecto a la metilación de bases de citosina. En esta realización, el ADN se puede tratar con un reactivo específico de citosina, por ejemplo hidrazina y/o hidroxilamina. 10 Por medio del tratamiento, se produce una reacción selectiva de los restos de citosina o metilcitosina. Por ejemplo, el tratamiento con hidroxilamina conduce a una modificación selectiva de restos de citosina. Preferiblemente, el reactivo se añade en una cantidad subestequiométrica, a fin de obtener una modificación parcial de, por ejemplo, restos de citosina. Subsiguientemente, el ADN tratado se analiza, por ejemplo mediante una reacción de extensión de cebador, usando al menos un bloque constructor de ácido nucleico modificado, como se indica anteriormente, por ejemplo una base dU y/o 15 dC. Preferiblemente, se usa una base modificada mediante Click, por ejemplo una base modificada mediante alquino. La reacción de extensión del cebador da una escalera de secuenciación característica que resulta de interrupciones de la reacción en las bases dC o 5-metil-dC modificadas (véase la Fig. 26).

Una realización preferida adicional se refiere a la aplicación de moléculas de ácido nucleico informadoras a un medio fotosensible, por ejemplo papel fotográfico o cualquier otro medio sensible a la luz. Preferiblemente, las moléculas 20 informadoras poseen un grupo fotosensibilizador y un grupo extintor. En ausencia de analito, el grupo fotosensibilizador se extingue. Por ejemplo, la molécula informadora puede tener una estructura de horquilla de pelo con el fotosensibilizador, y el grupo extintor en o cerca de los términos de la molécula en relación espacial estrecha. Cuando la molécula informadora está presente como la estructura de horquilla de pelo, el grupo fotosensibilizador se extingue (según la técnica de baliza molecular conocida). De este modo, una molécula informadora con una estructura de 25 horquilla intacta no puede efectuar una sensibilización cuando irradia luz al medio fotosensible. En presencia de un analito, se rompe la estructura de horquilla. El analito puede ser una hebra de ácido nucleico complementaria, o una enzima que escinde la estructura de horquilla, o una proteína que se une a la horquilla y de este modo rompe la estructura. El grupo fotosensibilizador se separa del grupo extintor, y de este modo es capaz de fotosensibilización. En este caso, la irradiación de luz conduce a una sensibilización del medio fotográfico, y de este modo a la detección del 30 analito (véase la Fig. 27).

La invención se explica adicionalmente mediante las siguientes Figuras y Ejemplos.

Descripción de las Figuras

Figura 1: Sitios de unión preferidos de grupos funcionales (R), por ejemplo grupos funcionalizados con aldehído sobre diferentes nucleobases 7-dN-G, C, 7-dN-A y T para la incorporación enzimática de grupos marcadores en 35 oligonucleótidos.

Figura 2: Representación esquemática de la síntesis de bloques constructores de nucleósidos funcionalizados con aldehído, para la síntesis en fase sólida de ácidos nucleicos.

Figura 3a: Representación esquemática de la síntesis de un trifosfato de nucleósido funcionalizado con acetal (aldehído protegido), para la síntesis enzimática de ácidos nucleicos. 40

Figura 3b: Un ejemplo de un trifosfato de nucleósido funcionalizado con alquino para la química eficaz de Click en ADN, en el que n es preferiblemente 0-4.

Figura 3c: Un ejemplo de un trifosfato funcionalizado con aldehído protegido. Los compuestos mostrados en la Figura 3 son adecuados para la incorporación eficaz mediante PCR en ADN.

Figura 4: Los resultados de una reacción de metalización poniendo en contacto el reactivo de Tollens con una base 45 modificada con aldehído: (1) disolución de azúcar como referencia, (2) ADN con otro grupo modificado con aldehído, (3) ADN con dos grupos aldehído, y (4) ADN sin modificar.

Figura 5: (1) Productos de extensión del cebador teñidos con Ag (a), o usando un colorante fluorescente estándar (b): I.1a: TTP modificado con aldehído en la extensión del cebador. I.1b: TTP modificado con acetal en la extensión del cebador. 1.3a: ADN sin modificar. Tinción con plata sólo positiva en la Línea 1 y 2. I.1b-3b mismo gel pero teñido de 50 forma no específica con un colorante de fluorescencia. (II) Un producto de PCR de 2142 pb teñido con un colorante fluorescente (a) o con Ag (b): II2a: TTP modificado con acetal en PCR. M: marcador; II1b: TTP modificado con aldehído en PCR, 2: TTP modificado con acetal en PCR, II3b: ADN sin modificar.

Figura 6: Resultados de una serie de dilución con una molécula de ADN sintética que contiene un único grupo funcional de aldehído. Detección mediante tinción con Ag. 55

Figura 7: Ejemplos de nucleósidos con nucleobases diferentes que poseen funciones acetal (aldehído protegido), que se pueden convertir en fosforamiditos, H-fosfonatos o triésteres correspondientes para la síntesis química de ácidos nucleicos, o en 5’-trifosfatos para la incorporación enzimática de ácidos nucleicos.

Figura 8: Derivatización de ADN o ARN modificado con aldehído con una etiqueta de fluorescencia, como una alternativa a la metalización vía aminación reductora. 5

Figura 9: Monómeros nucleosídicos y nucleotídicos modificados con alquino (a, b), modificados con azida (c) y modificados con aldehído protegido (d, e), en los que n es preferiblemente 0-4.

Figura 10: Representación esquemática de la síntesis de nucleósidos y trifosfatos de nucleótidos funcionalizados con alquinos.

Figura 11: Representación esquemática de la síntesis de dendrímeros funcionalizados con azida que comprenden 10 grupos aldehído protegidos.

Figura 12: Ejemplos de derivados de azida y de azida alquínica con grupos marcadores o grupos precursores de marcadores para la reacción de Click con nucleótidos o ácidos nucleicos modificados con alquino o azida.

Figura 13: En la parte superior: análisis de MALDI-TOF de la reacción de Click con oligonucleótidos que contienen la base modificada 2 (Figura 9b) y azidas de fluoresceína como la pareja de Click (m: 495). En la parte inferior: 15 electroforesis en gel de reacciones de Click de ADN modificado con el monómero 2 y azida de fluoresceína. A1: imagen de fluorescencia, Línea 1: material de partida antes de la reacción de Click; 2, 3: mezcla de reacción bruta; 4: azida en condiciones de Click; A2: mismo gel teñido con verde SYBR. B1: Línea 1, 2: mezcla de reacción bruta; 3: material de partida; B2: mismo gel pero teñido con verde SYBR.

Figura 14: Reacción de Click para introducir azida de cumarina en ADN da como resultado un producto fluorescente 20 (tubo de reacción derecho).

Figura 15: Un fosforamidito modificado con alquino (a), un nucleósido modificado con alquino (b), y una galactosa modificada con azida (c).

Figura 16: Ensayo de PCR que usa 200 µM de 8, dATP, dCTP y dGTP, 0,05 µg de ADN genómico procedente de S. cerevisiae 499, 10x tampón de polimerasa con magnesio, 0,3 mM de cada uno de los cebadores y 1,25 U de 25 polimerasas. Línea 1) Vent, 2) Vent (exo-), 3) Pwo, 4) Taq (exo-) de Roche, 5) Therminator, 6) Taq de Promega y 7) marcador.

Figura 17: Amplificación mediante PCR de ADN de 2142 pb con trifosfato modificado 1 u 8 (Figura 10) que sustituye dTTP. Se usó gel de agarosa (2%) y se tiñó con bromuro de etidio. Se realizó un total de 35 ciclos de PCR, usándose 45 segundos para cada incubación. Línea 1) NEB 2-log de ADN escalera (0,1-10,0 kb), Línea 2) control negativo (menos 30 dTTP), Línea 3) con sustrato (1) que sustituye dTTP, 4) con sustrato (8) que sustituye dTTP y 5) control positivo (usando dTTP).

Figura 18: Cromatograma de HPLC de (a) la digestión enzimática de fragmentos de PCR (318 mer) que incorporan trifosfato 8 (Figura 10); (b) la digestión enzimática de fragmentos de PCR que incorporan dTTP; (c) nucleósido 7 (Fig. 10). 35

Figura 19: Serie de dilución de fragmentos de PCR de 318 pb que incorporan los trifosfatos 1 y 2 seguido de la reacción de Click “sobre gel” y tinción con plata. (a) Serie de dilución de fragmentos de PCR que incorporan 1 (Línea 1 7,0 ng, Línea 2 3,5 ng, Línea 3 1,3 ng, Línea 4 0,7 ng) y 2 (Línea 5 7,0 ng, Línea 6 3,5 ng, Línea 7 1,3 ng, Línea 8 0,7 ng) realizado en un gel de TBE-urea PAAG. El gel se sometió a una reacción de Click “en el gel” con azida 3, y tinción subsiguiente con plata. (b) Detección comparativa de una serie de dilución de un fragmento de PCR que incorpora 2 vía 40 (i) el método de tinción con plata selectivo (como (a)) y vía (ii) verde SYBR II (Línea 1 7 ng, Línea 2 3,5 ng, Línea 3 1,3 ng, Línea 4 0,9 ng, Línea 5 0,5 ng, Línea 6 0,3 ng). (c) Serie de dilución de fragmentos de PCR que incorporan 2 (Línea 1 7 ng, Línea 2 3,5 ng, Línea 3 1,3 ng, Línea 4 0,9 ng, Línea 5 0,5 ng, Línea 6 0,3 ng) y 2 (Línea 1 7,0 ng, Línea 2 3,5 ng, Línea 3 1,3 ng, Línea 4 0,7 ng) realizado en un gel de TBE-urea PAAG. El gel se sometió entonces a una reacción de Click “en el gel” con azida 4 modificada con aldehído, y tinción subsiguiente con plata. (d) Serie de dilución de 45 fragmentos de PCR que incorporan 2 (Línea 1 7 ng, Línea 2 3,5 ng, Línea 3 1,3 ng, Línea 4 0,9 ng, Línea 5 0,5 ng, Línea 6 0,3 ng) realizado en un gel de TBE-urea PAAG. El gel se sometió entonces a una reacción de Click “en el gel” con azida 5 modificada con aldehído, y tinción subsiguiente con plata.

Figura 20: Fotografías de AFM de ADN natural (a) y ADN modificado con aldehído (b) tras la exposición a condiciones de tinción con Ag, y ADN modificado con aldehído tras la tinción con Ag sin desarrollo (c), después de 2 minutos de 50 desarrollo (d) y después de dos veces 2 minutos de desarrollo (e).

Figura 21: Representación esquemática de un método de detección de un analito, por ejemplo un analito de ADN, usando los principios de la fotografía de blanco y negro. La replicación inicial del analito de ADN en presencia de un cebador selectivo de secuencia produce una secuencia diana marcada con un sensibilizador (S). Tras la irradiación y desarrollo fotográfico subsiguiente, el analito se puede detectar en un medio fotosensible, por ejemplo un papel fotográfico.

Figura 22: Representación de colorantes de cianina (1), (2) y (3). Serie de dilución de colorantes de cianina irradiados durante 10 segundos usando una lámpara proyectora de la parte de arriba, equipada con un filtro de corte de 520 nm usando (a) 1; (b) 2; y (c) 3, o irradiación durante 5 minutos con una lámpara de infrarrojos usando (d) 1, (e) 2 y f (3). Los 5 experimentos de puntos corresponden a las siguientes diluciones: Punto 1: 1 x 10-11 moles, Punto 2: 1 x 10-12 moles, Punto 3: 3 x 10-13 moles, Punto 4: 1 x 10-13 moles, Punto 5: 3 x 10-14 moles, Punto 6: 1 x 10-14 moles, Punto 7: 3 x 10-15 moles, Punto 8: 1 x 10-15 moles, Punto 9: 3 x 10-16 moles, Punto 10: 1 x 10-16 moles.

Figura 23: Ensayos de punto de oligodesoxirribonucleótidos ODN-1 [5’-GCG ATT CGT TCG TCG C-3’], ODN-2 [5’-CGC GAA TGA ACA GCG C-3’] y ODN-3 [5’-GCG ACC GAT TCG C-3’], todos a 50 nmoles usando (a) irradiación de alta 10 energía y un filtro de corte (520 nm); y (b) irradiación de baja energía vía exposición prolongada (5 minutos) usando una lámpara de infrarrojos.

Figura 24: Representación de los colorantes de cianina Cy5 y Cy5.5. Serie de dilución de colorantes de cianina unidos a los ODN irradiados durante 10 segundos usando una lámpara proyectora para la parte de arriba, equipada con un filtro de corte de 520 nm usando (a) ODN-4 [5’-Cy5-GCG CTG TTC ATT CGC G-3’]; (b) ODN-5 [5’-Cy5.5-GCG CTG TTC 15 ATT CGC G-3’]; o irradiación durante 5 minutos con una lámpara de infrarrojos usando (c) ODN-4; (d) ODN-5. Los experimentos de puntos corresponden a las siguientes diluciones: Punto 1: 1 x 10-11 moles, Punto 2: 3 x 10-12 moles, Punto 3: 1 x 10-12 moles, Punto 4: 3 x 10-13 moles, Punto 5: 1 x 10-13 moles, Punto 6: 3 x 10-14 moles, Punto 7:1 x 10-14 moles, Punto 8: 3 x 10-15 moles.

Figura 25: Representación esquemática del proceso de la metodología de “Click y fotografía”. Una secuencia, por 20 ejemplo un gen, de interés se selecciona específicamente y se amplifica vía PCR con trifosfatos modificados con alquino (dU*TP) y cebadores selectivos de genes. Estas funciones alquínicas se pueden etiquetar vía química de Click con un fotosensibilizador apropiado (S) que produce híbridos de ADN fotosensibilizados. La irradiación de la muestra sobre papel fotográfico, y el desarrollo subsiguiente, proporcionará un nuevo método para la detección ultrasensible y específica de genes. 25

Figura 26: Representación esquemática de un método para identificar patrones de metilación en ADN mediante modificaciones químicas específicas de citosinas. Se hace reaccionar un analito de ADN con un agente de modificación específico de citosina (o metilcitosina), por ejemplo hidroxilamina, preferiblemente en cantidades subestequiométricas, a fin de dar restos de citosina parcialmente modificados (C*). Se lleva a cabo una reacción de extensión de cebador con una base modificada con alquinilo. Esta reacción termina en los restos de citosina modificada, dando como resultado 30 una “escalera” de productos de extensión que tienen una longitud característica. Tras separar los productos de extensión del cebador, por ejemplo en un gel, se lleva a cabo una reacción de Click con un grupo marcador modificado con azida, por ejemplo un azúcar modificado, y una detección subsiguiente del grupo marcador (por ejemplo vía tinción con plata). El patrón de metilación de la muestra de ADN se puede determinar comparando los productos de extensión de una muestra de ADN metilada con los productos de extensión de una muestra de ADN no metilada, que se ha 35 sometido al mismo tratamiento.

Figura 27: Representación esquemática de un método de detección de baliza molecular en un medio fotosensible. Se proporciona una molécula informadora que tiene un grupo de fluorescencia (F) y un grupo de extinción (Q). En ausencia de analito, la molécula informadora tiene una estructura de horquilla, y la fluorescencia se extingue. En presencia del analito, el grupo extintor se elimina del grupo de fluorescencia, que ya no está extinguido (F*). La muestra se irradia en 40 presencia de un medio fotográfico, tal como papel fotográfico u otro material sensible a la luz, y se desarrolla.

Ejemplos

Ejemplo 1 (Referencia)

Síntesis de nucleósidos y nucleótidos modificados con aldehído

Se sintetizaron nucleósidos y trifosfatos de nucleósidos con nucleobases modificadas con aldehído a partir de 45 nucleósidos apropiadamente modificados que poseen un grupo saliente tal como I, preferiblemente en la posición 5 de las bases pirimidínicas, por ejemplo T, U y C, o en la posición 7 de bases purínicas, por ejemplo 7-desaza G, 7-desaza A, G y A, como se muestra en la Figura 1. Todas las modificaciones en estas posiciones sobresalen de la ranura principal de ADN.

La síntesis de un fosforamidito de nucleósido T (U) modificado con aldehído, primero vía alquilación mediada por 50 Sonogashira [20], seguido de la reacción con los grupos funcionales apropiados, se llevó a cabo como se muestra en la Figura 2. La función aldehídica se mantuvo protegida como un grupo acetal. El grupo protector de acetal se puede eliminar mediante tratamiento con ácido. El fosforamidito de nucleósido modificado se puede incorporar en ácidos nucleicos mediante síntesis química.

La síntesis de un trifosfato de nucleósido modificado con acetal se llevó a cabo como se muestra en la Figura 3a. En la Figura 3b se muestran otros trifosfatos de nucleósidos modificados con alquino (para la reacción de Click), con acetal y con hemiacetal. Los trifosfatos de nucleósidos modificados se pueden incorporar en ácidos nucleicos mediante síntesis enzimática.

El uso de reacciones de formación de C-C a base de Pd, tales como mediante Sonogashira/Suzuki [20], proporciona un 5 enfoque sintético general para la síntesis de nucleósidos y nucleótidos modificados con aldehído con diferentes grupos aldehído con diferentes nucleobases modificadas. Además, se pueden sintetizar grupos aldehído con diferentes características estéricas, electrónicas y funcionales.

Ejemplo 2 (Referencia)

Incorporación de nucleósidos y nucleótidos modificados con aldehído en oligonucleótidos 10

2.1 Incorporación mediante síntesis química

La incorporación del fosforamidito de nucleósido modificado con acetal/aldehído se logró mediante síntesis convencional en fase sólida [21]. Se prepararon varios oligonucleótidos de ADN que contienen una o múltiples nucleobases modificadas con acetal/aldehído, según se representa en la Tabla 1. La desprotección de los grupos acetal dio el oligonucleótido de ADN modificado con aldehído. 15

Los oligonucleótidos se ensayaron en busca de su capacidad para formar pares de bases con hebras de ADN complementarias, a fin de obtener moléculas de ADN bicatenario. Se encontró que la reducción de la estabilidad del dúplex debido a la presencia del grupo aldehído es baja. El punto de fusión de las cadenas dobles se reduce en alrededor de sólo 2ºC por modificación. Esta cantidad de desestabilización es, sin embargo, completamente aceptable para las aplicaciones pretendidas. 20

Tabla 1: Oligodesoxinucleótidos sintetizados mediante síntesis en fase sólida

Tm [ºC]

1

TTTTTTXTTTTT

2

TTTTTTXXTTTTT

3

GCCGAXGCGC 53,8 (56,5 control no modificado)

4

GCGXATAXATAXTCGC 48,4 (53,7 control no modificado)

5

TTXTTXTTXTTXTTX

2.2 Incorporación mediante métodos enzimáticos

Se prepararon monómeros de trifosfatos modificados con acetal según la Figura 3. El método más selectivo para sintetizar trifosfatos es el procedimiento seguido por Ludwig y Eckstein [11, 12]. Este procedimiento es ligeramente 25 ácido, así que se obtiene una mezcla de aldehído- y acetal-TTP, que se puede separar mediante HPLC si se desea [13].

Se realizaron estudios tanto con trifosfatos modificados con acetal y con aldehído como con una variedad de diferentes ADN polimerasas. Mostraron que todas las polimerasas aceptan el trifosfato modificado como sustrato, e incorporan selectivamente la base modificada. También se vio que las múltiples incorporaciones no eran problemáticas. Se ensayaron las siguientes polimerasas en estudios de extensión de cebador y PCR. Los experimentos se llevaron a cabo 30 con la timidina protegida con acetal, y también con la timidina funcionalizada con aldehído desprotegido.

Extensión de cebador

PCR

Therminator (NEB)

Pfx (A)

Vent

Taq (A)

Vent (exo-)

Vent (B)

Taq

También se llevaron a cabo estudios de PCR con TPP sustituido por los trifosfatos sintéticos (acetal y aldehído). El experimento de PCR mostró que la base modificada se puede incorporar en un gen completo de 2400 pares de bases de longitud, estableciendo que se pueden crear genes específicamente marcados con cientos de sitios de nucleación derivados de aldehído.

Ejemplo 3 (Referencia)

Detección de los oligonucleótidos y genes marcados

Un método preferido para la deposición metálica sobre aldehídos se basa en el ensayo de Tollens [14] 5

R-CHO + 2 Ag[NH3]OH → R-COO-NH4+ + 2 Ag(s) + H2O + NH3

En esta reacción, un complejo de plata-amonio es reducido por el aldehído. Si la concentración del aldehído es elevada, se puede observar una película de plata sólida en el interior del tubo de reacción.

Tanto el nucleósido que contiene el aldehído como los ácidos nucleicos modificados con aldehído sintetizados químicamente se pudieron detectar en un ensayo de tinción con plata que indica funciones aldehído (Fig. 4). Una hebra 10 de ADN sin marcar dio por el contrario un resultado claramente negativo en las mismas condiciones, mostrando que el aldehído introducido selectivamente en secuencias de ADN específicas permite la detección selectiva de estas secuencias modificadas.

También se llevó a cabo sobre geles la detección mediante la tinción con plata de ácidos nucleicos modificados con aldehído. Los grupos aldehído en el ADN fueron suficientes para reducir los iones plata en un gel. Las semillas 15 formadas por el proceso sobre el ADN se pudieron desarrollar hasta que se pudo observar en el gel una banda negra clara formada por la plata depositada.

Esto se demostró tiñendo ácidos nucleicos modificados con aldehído procedentes de reacciones de extensión de cebador y procedentes de PCR (Figura 5 (I) y (II), respectivamente).

Como se muestra en la Fig. 5, el ADN que contiene el nucleósido modificado está teñido exclusivamente con Ag, 20 mientras que el ADN sin modificar queda sin teñir. Esto es verdad para el producto de cebador extendido y para el producto de PCR. El procedimiento de tinción se basa en el kit SilverXPress (Invitrogen), pero con una disolución de Tollens más concentrada. También es posible la tinción después de otros procedimientos.

Ejemplo 4 (Referencia)

Determinación de la sensibilidad 25

A fin de determinar la sensibilidad del método de detección, se llevaron a cabo experimentos de dilución (Figura 6). Se encontró que la tinción de ADN funcionalizado con aldehído con un kit de tinción con Ag estándar fue al menos cinco veces más sensible que la tinción con bromuro de etidio (∼0,5 ng de ADN con una longitud de 50 pb).

Esta sensibilidad tremendamente impresionante se obtiene incluso con una detección visual normal.

Ejemplo 5 30

Síntesis de nucleósidos y nucleótidos modificados con azida y con alquino

Los nucleósidos y el trifosfato de nucleósido con bases modificadas con azida y alquino se sintetizaron sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1.

5.1 Síntesis de nucleótidos modificados con alquino

En la Figura 10 se muestra un esquema de reacción detallado para la síntesis de trifosfato de nucleósido modificado con 35 alquino.

La preparación del nucleósido (1) y su trifosfato correspondiente (2) se llevó a cabo como se hizo previamente [23, 24].

A una disolución desgasificada a conciencia de 3 (1,00 g, 1,72 mmoles)[3], Pd(PPh3)4 (0,198 g, 0,172 mmoles) y CuI (0,065 g, 0,344 mmoles) en DMF (3 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina desgasificada (1,5 ml, 8,59 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. A la mezcla de reacción se añadió gota a gota 40 una disolución desgasificada de 4-pentin-1-ol (320 µl, 3,44 mmoles) en DMF (1 ml), durante 1 hora. Después de terminar la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Después de concentrar a vacío, la mezcla bruta se diluyó con acetato de etilo (200 ml), y la capa orgánica se lavó con salmuera (3 x 50 ml) seguido de agua (50 ml). La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró a vacío. La cromatografía en columna ultrarrápida (SiO2) eluyendo con un gradiente de acetato de etilo:isohexano (1:1), seguido de acetato de 45 etilo:isohexano (2:1), proporcionó 4 (0,790 g, 86%) como una espuma amarilla pálida. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz): δ 0,01 (s, 3 H, OSiCH3), 0,00 (s, 3 H, OSiCH3), 0,05 (s, 3 H, OSiCH3), 0,07 (s, 3 H, OSiCH3), 0,81 (s, 6 H, OSi(CH3)3), 0,85 (s, 6 H, OSi(CH3)3), 1,74 (m, 2 H, CH2-CH2CH2-OH), 1,95 (m, 1 H, H-2β), 2,20 (m, 1 H, H-2α), 2,42(t, 2H, J = 6,0 Hz, C≡C-CH2CH2-), 3,67 (dd, 1 H, J = 11,4, 2,1 (CDCl3, 75,5 MHz): δ 5,4 (SiCH3), -5,3 (SiCH3), -4,8 (SiCH3), -4,6 (SiCH3), 16,7 (C≡C-CH2CH2), 18,0 (SiC(CH3)3), 18,5 (SiC(CH3)3), 26,1 (SiC (CH3)3), 26,4 (SiC(CH3)3), 31,5 (CH2-CH2-CH2-OH), 42,3 (C-2’), 61,9 (CH2-CH2CH2-OH), 63,3 (C-5’), 72,4 (C≡C), 72,7 (C-3’), 86,0 (C-1’), 88,7 (C-4’), 95,0 (C≡C), 100,9 (C-5), 101,0 (C≡C), 141,9 (C-6), 149,6 (C-2), 162,4 (C-4). HRMS (ESI, +ve) calc. para C26H46N2NaO6Si2 561,2792 [M+Na]+, encontrado 561,2803.

A una disolución agitada de 4 (0,300 g, 0,56 mmoles) en diclorometano (5 ml) se añadió una disolución de peryodinano 5 de Dess-Martin (0,378 g, 0,89 mmoles) en diclorometano (5 ml), gota a gota durante 5 minutos a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas, seguido de paralización con disolución de tiosulfato de sodio saturada (10 ml). La mezcla bruta se diluyó entonces con diclorometano (200 ml), y la capa orgánica se lavó con salmuera (2 x 30 ml) y agua (2 x 30 ml). La capa orgánica se secó entonces (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía en columna (sílice ultrarrápida), eluyendo con 35% de acetato de etilo en 10 isohexano, proporcionó 5 (0,193 g, 65%) como una espuma amarilla pálida. RMN 1H (CDCl3, 600 MHz): δ 0,07 (s, 3 H, OSiCH3), 0,00 (s, 3 H, OSiCH3), 0,05 (s, 3 H, OSiCH3), 0,06 (s, 3 H, OSiCH3), 0,81 (s, 6 H, OSi(CH3)3), 0,85 (s, 6 H, OSi(CH3)3), 1,95 (m, 1H, H-2β), 2,21 (m, 1H, H-2α), 2,61 (t, 2 H, J = 7,2 Hz, -CH2CH2-), 2,67 (t, 2H, J = 7,2 Hz, -CH2CH2-), 3,68 (dd, 1 H, J = 11,4, 2,4 Hz, H-5’), 3,81 (dd, 1 H, J = 11,4, 2,4 Hz, H-5’), 3,89 (m, 1 H, H-4’), 4,32 (m, 1 H, H-3’), 6,20 (dd, 1 H, J = 7,2, 6 Hz, H-1’), 7,84 (s, 1 H, H-6), 8,99 (bs, 1 H, N-H), 9,72 (s, 1 H, CHO). RMN 13C (CDCl3, 150,8 15 MHz): δ 3,8 (SiCH3), -3,7 (SiCH3), -3,1 (SiCH3), -2,9 (SiCH3), 14,4 (C≡C-CH2CH2), 19,7 (SiC(CH3)3), 20,1 (SiC (CH3)3), 27,4 (SiC(CH3)3), 27,7 (SiC(CH3)3), 43,7 (C-2’), 44,1 (CH2-CH2-CHO), 64,6 (C-5’), 74,0 (C-3’ y C≡C), 87,5 (C-1’), 90,0 (C-4’), 94,3 (C≡C), 101,9 (C-5), 143,8 (C-6), 150,9 (C-2), 163,7 (C-4), 201,6 (CHO). HRMS (ESI, +ve) calc. para C26H44N2NaO6Si2 559,2635 [M+Na]+ encontrado 559,2634.

A una disolución de 5 (0,530 g, 1,00 mmoles) y K2CO3 (0,269 g, 1,98 mmoles) en metanol seco (20 ml) se añadió una 20 disolución de éster dimetílico del ácido 1-diazo-2-oxo-propil-fosfónico (0,261 g, 1,19 mmoles) en metanol seco (5 ml) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche, se filtró y se concentró a vacío. La mezcla bruta se disolvió en acetato de etilo (200 ml), y la capa orgánica se lavó con salmuera (2 x 30 ml) y agua (2 x 30 ml), se secó (MgSO4) y se concentró a vacío. La cromatografía en columna (sílice ultrarrápida), eluyendo con 20% de acetato de etilo en isohexano, proporcionó 6 (0,290 g, 55%) como una espuma 25 incolora. RMN 1H (CDCl3, 600 MHz): δ 0,00 (s, 3 H, OSiCH3), 0,01 (s, 3 H, OSiCH3), 0,06 (s, 3 H, OSiCH3), 0,07 (s, 3 H, OSiCH3), 0,82 (s, 6 H, OSi(CH3)3), 0,86 (s, 6H, OSi(CH3)3) 1,93 (m, 1H, H-2β), 1,95 (s, 1 H, C≡C-H, 2,22 (m, 1H, H-2α), 2,39 (dt, 2H, J = 8,4, 2,4 Hz, -CH2CH2-), 2,55 (t, 2 H, J = 8,4 Hz, -CH2CH2-), 3,68 (dd, 1 H, J = 11,4, 2,4 Hz, H-5’), 3,81 (d, 1 H, J = 11,4, 2,4 Hz, H-5’), 3,89 (m, 1 H, H-4’), 4,33 (m, 1 H, H-3’), 6,20 (dd, 1 H, J = 7,8, 6 Hz, H-1’), 7,85 (s, 1 H, H-6), 8,33 (bs, 1 H, N-H. RMN 13C (CDCl3, 150,8 MHz): δ 7,0 (SiCH3), -6,9 (SiCH3), -6,4 (SiCH3), -6,2 (SiCH3), 16,5 (C≡C-30 CH2CH2), 16,9 (C=C-CH2CH2), 17,0 (SiC(CH3)3), 18,2 (SiC(CH3)3), 24,2 (SiC(CH3)3), 24,5 (SiC(CH3)3), 40,4 (C-2’), 61,4 (C-5’), 67,9 (C≡C-H), 70,8 (C-3’), 70,9 (C≡C), 80,9 (C=C), 84,1 (C-1’), 86,8 (C-4’), 91,2 (C≡C), 98,7 (C-5), 140,6 (C-6), 147,5 (C-2), 159,9 (C-4). HRMS (FAB, +ve) calc. para C27H43N2O6Si2 + H 533,28670 [M+H]+ encontrado 533,26009.

A una disolución enfriada (0ºC) de 6 (0,270, 0,51 mmoles) en THF (5 ml) se añadió TBAF (1,0 M, 1,52 ml, 1,52 mmoles) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas, se paralizó con ácido acético glacial (1,0 ml) 35 y se concentró a vacío. La cromatografía en columna (sílice ultrarrápida), eluyendo con 10% de metanol en acetato de etilo, proporcionó 7 (0,127 g, 82%) como un aceite incoloro. RMN 1H (d6-DMSO, 400 MHz): δ 1,88 (s, 1 H, C≡C-H), 2,07 (m, 2 H, H-2’), 2,36 (dt, 2 H, J = 7,2, 2,4 Hz, -CH2CH2-), 2,54 (t, 2 H, J = 6,8 Hz, -CH2CH2-), 3,53 (dd, 1 H, J = 12,0, 4,0 Hz, H-5’), 3,58 (dd, 1 H, J = 12,0, 4,0 Hz, H-5’), 3,76 (m, 1 H, H-4’), 4,19 (m, 1 H, H-3’), 5,07 (bs, 1 H, O-H), 5,23 (bs, 1 H, O-H), 6,08 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1’), 8,11 (s, 1 H, H-6), 11,55 (bs, 1 H, N-H). RMN 13C (CDCl3, 150,8 MHz): δ 17,6 40 (C≡C-CH2CH2), 18,9 (C≡C-CH2CH2), 39,5 (C-2’), 60,7 (C-5’), 70,0 (C-3’), 73,7 (C≡C-H), 75,1 (C≡C), 84,6 (C-1’), 87,3 (C-4’), 89,1 (C=C), 93,0 (C≡C), 100,2 (C-5), 144,7 (C-6), 151,0 (C-2), 163,2 (C-4). HRMS (FAB, +ve) calc. para C15H16N2O5 + Na [M+Na]+ 327,28771 encontrado 327,09635. HRMS (FT-ICR MS -) calc. para C15H16N2O5 + AcO- [M+AcO-]- 363,1198 encontrado 363,1221, MS-MS calc. para C15H15N2O5- [M-] 303,1 encontrado 303,1.

A una disolución enfriada (0ºC) de 7 (0,060 g, 0,197 mmoles) y 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (esponja de protón, 0,068 45 g, 0,316 mmoles) fosfato de trimetilo (2 ml) se añadió oxicloruro de fósforo (22 µl, 0,237 mmoles) gota a gota durante 5 min. en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas a 0ºC. A la mezcla de reacción se añadió una disolución de pirofosfato de tributilamonio (0,080 g, 0,237 mmoles) en DMF seca (2,0 ml), y se agitó durante 1 min., seguido de paralización con bicarbonato de trietilamonio (1,0 M, 20 ml, pH = 8,5). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h y se liofilizó toda la noche. La purificación RP-HPLC (0-50% de acetato de trietilamonio 0,1 M → 20:80 50 H2O:MeCN con gradiente de acetato de trietilamonio 0,1 M durante 45 min. a un caudal de 5 ml.min.-1) produjo 8 (17,7 min.) como la sal de trietilamonio. RMN 31P (D2O, 81 MHz): δ 22,4 (t, 1 P, J = 19,8 Hz, P-β), -10,5 (d, 1 P, J = 20,3 Hz, P-α), -9,7 (d, 1 P, J = 19,8 Hz, P-y). MALDI-TOF (matriz ATT, modo negativo): 271 [M + 2 H]2-, 542 [M + 2 H]-.

5.2 Síntesis de parejas de reacción de Click funcionalizadas con azida dendriméricas

En la Figura 11 se muestra un esquema de reacción detallado para la síntesis de dendrímeros funcionalizados con 55 azida que contienen una pluralidad de grupos hemiacetal (grupos aldehído protegidos).

Procedimiento general para la reacción de ligación de triazol catalizada por Cu(I)

A una disolución de 9 (7,31 g, 0,0256 moles), 10 (3,00 g, 0,0128 moles) en THF:H2O (3:1, 40 ml) se añadió una disolución de CuSO4 (0,103 g, 0,641 mmoles) en H2O (3 ml), seguido de ascorbato de sodio sólido (0,253 g, 1,28 mmoles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La suspensión se diluyó con H2O (50 ml), se enfrió hasta 0ºC y se trató con NH4OH concentrado (5 ml) durante 10 minutos. La mezcla de reacción se diluyó 5 con diclorometano (500 ml), y la capa orgánica se lavó con salmuera (2 x 50 ml), seguido de H2O (2 x 50 ml). La capa orgánica se retuvo, se secó (MgSO4) y se concentró a vacío. La cromatografía en columna (sílice ultrarrápida), eluyendo con 1:1 acetato de etilo: éter de petróleo, proporcionó 9 (2,76 g), producto mono-Click (11, 3,94 g) como una espuma incolora, seguido de 12 (4,92 g, 48%). El producto mono-Click (11) se hizo reaccionar entonces con un equivalente de 9 para proporcionar 12 cuantitativamente después del tratamiento y sin purificación adicional requerida. 10

RMN 1H (CDCl3, 600 MHz): δ 1,29 (s, 6 H, C-CH3), 1,35 (s, 6H, C-CH3), 1,38 (s, 6 H, C-CH3), 1,49 (s, 6 H, C-CH3), 4,19 (m, 4H, H4’/H5’), 4,32 (dd, 2 H, J = 4,8, 2,4 Hz, H 2’), 4,46 (dd, 2H, J = 14,4, 8,4 Hz, H6”), 4,50 (s, 2H, -CH2-), 4,62 (m, 2 H, H 3’), 4,64 (m, 2 H, H 6’), 5,18 (s, 4H, -CH2-), 5,51 (d, 2 H, J = 4,8 Hz, H 1’), 6,59 (t, 1 H, J = 1,8 Hz, Ar-H), 6,64 (d, 2H, J = 1,8 Hz, Ar-H), 7,79 (s, 2H, C=CH-). RMN 13C (CDCl3, 150,8 MHz): δ 24,4 (C-CH3), 24,7 (C-CH3), 25,9 (C-CH3), 26,0 (C-CH3), 46,1 (CH2-), 50,6 (-CH6’/H6”), 62,2 (Ar-CH2-), 67,0 (CH4’), 70,1 (CH2’), 70,5 (CH3’), 70,9 (CH5’), 96,0 15 (CH1’), 102,0 (Ar-CH), 107,9, 109,1, 110,0, 124,0 (C=CH), 139,6, 143,4, 160,0. ESI-MS m/z 806 [M + H]+.

La reacción de 13 (1,539, 1,88 mmoles) y 10 (0,220 g, 0,94 mmoles) en presencia de CuSO4 (0,008 g, 0,047 mmoles) y ascorbato sódico (0,019 g, 0,094 mmoles) proporcionó 14 (1,65 g, 95%) como una espuma incolora después de cromatografía en columna (SiO2 ultrarrápido; acetato de etilo:metanol 9:1). RMN 1H (CDCl3, 600 MHz): δ 1,26 (s, 12H, C-CH3), 1,27 (s, 6 H, C-CH3), 1,34 (s, 12 H, C-CH3), 1,35 (s, 12 H, C-CH3), 1,48 (s, 6 H, C-CH3), 4,19 (m, 8 H, H4’/H5’), 20 4,32 (m, 4 H, H2’), 4,46 (m, 4H, H6”), 4,47 (s, 2 H, -CH2-), 4,62 (m, 4 H, H 3’), 4,64 (m, 4H, H 6’), 5,12 (s, 8 H, -CH2-), 5,15 (s, 4 H, -CH2-), 5,40 (s, 4 H, -CH2-), 5,49 (bd, 4 H, J = 4,8 Hz, H 1’), 6,50 (m, 4 H, Ar-H), 6,55 (m, 2 H, Ar-H), 6,58 (m, 1 H, Ar-H), 6,61 (m, 2 H, Ar-H), 7,59 (s, 2 H, C=CH-), 7,78 (s, 4H, C=CH-). RMN 13C (CDCl3, 150,8 MHz): δ 24,4 (C-CH3), 24,9 (C-CH3), 25,9 (C-CH3), 26,0 (C-CH3), 45,9 (CH2-), 50,4 (-CH6/H6”), 53,9 (Ar-CH2-), 61,8 (Ar-CH2-), 61,9 (Ar-CH2-), 67,0 (CH4’), 70,1 (CH2’), 70,5 (CH3’), 71,1 (CH5’), 96,1 (CH1’), 101,6, 101,7, 107,2, 108,0, 109,0, 109,9, 122,9, 25 124,2, 136,7, 140,0, 143,2, 144,1, 159,5, 160,0. MALDI-TOF (ATT, modo positivo): m/z 1859 [M + H]+.

Procedimiento general para la conversión de cloruros dendríticos en azidas

A una disolución de 12 (4,84 g, 6,01 mmoles) en acetona:agua (4:1, 100 ml) se añadió NaN3 (0,586 g, 9,01 mmoles) y se calentó a reflujo en una atmósfera de nitrógeno durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (600 ml), y la capa orgánica se lavó con salmuera (2 x 50 ml) seguido de agua (2 x 50 ml). La capa orgánica se retuvo, 30 se secó (MgSO4) y se concentró a vacío para producir 13 (4,72 g, 97%) como un sólido amorfo blanco.

RMN 1H (d6-acetona, 400 MHz): δ 1,28 (s, 6H, C-CH3), 1,35 (s, 6 H, C-CH3), 1,36 (s, 6 H, C-CH3), 1,44 (s, 6 H, C-CH3), 4,30 (dd, 2 H, J = 3,6, 2,0 Hz, H 6’/6”), 4,32 (dd, 2 H, J = 3,2, 1,6 Hz, H 5’), 4,36 (dd, 2 H, J = 7,6, 1,6 Hz, H 4’), 4,39 (dd, 2 H, J = 4,8, 2,4 Hz, H 2’), 4,61 (d, 2 H, J = 3,6 Hz, H 6’/6”), 4,64 (s, 2H, -CH2), 4,70 (dd, 2 H, J = 7,6, 2,4 Hz, H 3’), 5,20 (s, 4 H, -CH2-), 5,47 (d, 2 H, J = 4,8 Hz, H 1’), 6,73 (m, 3 H, Ar-H), 8,07 (s, 2 H, C=C-H). RMN 13C (d6-acetona, 150,8 35 MHz): δ 25,7 (C-CH3), 26,1 (C-CH3), 27,2 (C-CH3), 27,4 (C-CH3), 47,6 (CH2-), 52,0 (-CH6’/H6”), 63,4 (Ar-CH2-), 68,8 (CH4’), 72,0 (CH2’), 72,5 (CH3’), 72,9 (CH5’), 98,2 (CH1’), 103,3 (Ar-CH), 109,9 (Ar-CH), 110,4, 111,2, 126,3 (C=CH), 141,9, 144,8, 161,8. HRMS (ESI, +ve) calc. para C37H49N9O12Na 834,3398 [M+Na]+ encontrado 834,3404.

La reacción de 14 (1,51 g, 0,81 mmoles) y NaN3 (0,079 g, 1,22 mmoles) proporcionó 15 (1,45 g, 96%) como un sólido amorfo blanco. RMN 1H (CDCl3, 600 MHz): δ 1,27 (s, 12 H, C-CH3), 1,34 (s, 12 H, C-CH3), 1,37 (s, 12 H, C-CH3), 1,48 40 (s, 12 H, C-CH3), 4,19 (m, 8 H, H4’/H5’), 4,24 (s, 2 H, -CH2-), 4,32 (m, 4 H, H2’), 4,46 (dd, 4 H, J = 13,8, 8,4 Hz, H6”), 4,62 (m, 4 H, H3’), 4,64 (m, 4 H, H 6’), 5,12 (s, 4H, -CH2-), 5,18 (s, 8 H, -CH2-), 5,43 (s, 4 H, -CH2-), 5,49 (bd, 4 H, J = 4,8 Hz, H 1’), 6,50 (m, 2 H, Ar-H), 6,55 (m, 4 H, Ar-H), 6,58 (m, 1 H, Ar-H), 6,60 (m, 2 H, Ar-H), 7,78 (s, 2 H, C=CH-), 7,79 (s, 4 H, C=CH-). RMN 13C (CDCl3, 150,8 MHz): δ 24,4 (C-CH3), 24,8 (C-CH3), 25,8 (C-CH3), 25,9 (C-CH3), 45,9 (CH2-), 50,4 (-CH6’/H6”), 54,6 (Ar-CH2-), 62,0 (Ar-CH2-), 62,1 (Ar-CH2-), 67,1 (CH4’), 70,3 (CH2’), 70,7 (CH3’), 71,1 (CH5’), 96,2 45 (CH1’), 101,7, 101,8, 107,4, 107,7, 109,0, 109,9, 124,0, 124,2, 137,8, 143,1, 143,4, 144,1, 159,7, 159,9. HRMS (ESI, +ve) calc. para C87H110N21O26Na 1886,7829 [M+Na+H]+, encontrado 1887,7862.

Procedimiento general para la desprotección de isopropilideno dendrítico

A una mezcla de TFA:agua (1:1; 10 ml) se añadió 13 (0,020 g, 24,7 µmoles) en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se calentó hasta 50ºC durante 4 horas, seguido de concentración a vacío. Se añadió agua (20 ml) a la 50 mezcla, y la capa acuosa se lavó varias veces con DCM (3 x 20 ml), se retuvo y se liofilizó toda la noche para producir 16 (0,015 g, 63%) como una espuma amarilla pálida. MALDI-TOF (ATT, modo positivo): m/z 652 [M +H]+.

La reacción de 15 (1,40 g, 0,75 mmoles) con TFA:agua (1:1; 20 ml) proporcionó 17 (1,05 g, 90%) como un sólido amorfo amarillo pálido. MALDI-TOF (ATT, modo positivo): m/z 1545 [M + H]+.

55

Ejemplo 6

Incorporación de nucleósidos y nucleótidos modificados con azida y con alquino en ácidos nucleicos

Los nucleósidos y nucleótidos modificados con azida y alquino se incorporan eficazmente en ácidos nucleicos mediante síntesis química o enzimática sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2. Los ácidos nucleicos modificados resultantes se pueden marcar específicamente según la aplicación deseada, por ejemplo mediante marcaje fluorescente 5 o deposición metálica.

Esta estrategia de marcaje es un método rápido y extremadamente sensible para la detección de ácidos nucleicos, secuencias de ácidos nucleicos y genes, incluso sin la necesidad de la amplificación mediante PCR.

En un primer experimento, para investigar el comportamiento de la reacción de Click en una arquitectura de ADN, se prepararon los nucleósidos 1 y 2 (Figura 9a y b), y se incorporaron en oligonucleótidos vía protocolos sintéticos en fase 10 sólida estándar. La eficacia de la reacción de Click se investigó usando azida bencílica, CuSO4, o agente reductor (ascorbato o TCEP) y un ligando que estabiliza cobre (I). Los resultados de estos se resumen en la Tabla 2. Los oligonucleótidos que comprenden la base rígida 1 dieron consistentemente menores rendimientos del producto de Click en comparación con el alquino flexible 2. La temperatura (10 a 40ºC) no afectó a los rendimientos de las reacciones de Click. 15

La eficacia de la reacción de Click se evaluó entonces como una función del tipo de azida que muestra propiedades adecuadas para la detección (Figura 12). Las azidas de fluoresceína son marcadores fluorescentes extremadamente sensibles (rendimiento cuántico fluorescente de casi la unidad), mientras que la azida de cumarina proporciona una prueba de marcador de Click a medida que se enciende la fluorescencia con la formación de triazol [19].

Tabla 2: Sumario de las reacciones de Click que usan azida bencílica, CuSO4 y TCEP. 20

Secuencia de ODN

X = 1 X = 2

Rendimiento (%)

Material de partida

Producto deseado Otros productos Material de partida Producto deseado Otros productos

3’-GCG CTT ACX TGT CGC G-5’

3 97 - - 100 Reducción de azida

3’-GCG CTT ACX XGT CGC G-5’

84 16 (monoclick) - 100 Reducción de azida

3’-GCG CTT ACX TGX CGC G-5’

94 6 (monoclick) - 100 Reducción de azida

3’-GCG CTX ACX TGX CGC G-5’

84 16 (bisclick) NA NA NA

Consistente con los experimentos que implican el uso de azida bencílica, los oligodesoxinucleótidos que comprenden el alquino rígido dieron menores rendimientos de conversión de Click. Los oligonucleótidos que contienen el alquino flexible proporcionan, por el contrario, una conversión casi cuantitativa según HPLC y MALDI-TOF. El marcaje de ADN fue nuevamente posible de forma directa en el gel. El ADN que contiene la nucleobase modificada se separó de otras 25 hebras de ADN mediante electroforesis en gel, y el gel se trató entonces con la azida de fluoresceína y Cu(I) para llevar a cabo la reacción de Click. El lavado del gel eliminó el exceso de fluoresceína, dejando en el gel el ADN teñido (Figura 13).

A partir de estos experimentos se puede deducir claramente que el ADN que contiene las bases modificadas con alquino se puede marcar selectivamente con fluoresceína. El verde CYBR colorea el ADN de forma no específica, y por 30 lo tanto marca también al ADN sin modificar antes de la reacción de Click, como en la línea 1 de A2 y la línea 3 de B2 (Figura 13).

La fluoresceína es una molécula que fluoresce fuertemente tanto como un monómero como después de una reacción de Click con ADN. Después de la reacción de Click con fluoresceína, el gel ha de ser lavado por lo tanto a fin de eliminar el exceso de fluoresceína, que deja el ADN teñido.

La cumarina es una molécula fluorescente alternativa, que sin embargo no fluoresce como monómero. Comienza a emitir fluorescencia sólo después de la reacción de Click, cuando la azida se convierte en el triazol. La fluorescencia de 5 la cumarina se enciende efectivamente después de la reacción de Click, como se observa en el experimento más abajo en tubos de reacción (Figura 14). Se puede realizar un experimento similar en el gel.

En un experimento adicional, se investigó la eficacia de la reacción de Click con oligodesoxinucleótidos (ODN) que incorporan el nucleósido 2 (Figura 15). Este nucleósido se incorporó en oligonucleótidos vía protocolos sintéticos en fase sólida estándar, usando el fosforamidito correspondiente 1 (Figura 15). En la Tabla 3 se muestran los 10 oligonucleótidos que comprenden un único grupo informador de alquino o múltiples grupos informadores de alquino.

Tabla 3

Secuencias de ODN

X = 19

Masa

Material de partida

Producto

3’-GCG CTT ACXTGT CGC G-5’

ODN1 4952 (calc.) 4955 (obt.) ODN1-P 5157 (calc.) 5157 (obt.)

3’-GCG C-7 ACX XGT CGC G-5’

ODN2 5042 (calc.) 5042 (obt.) ODN2-P 5452 (calc.) 5455 (obt.)

3’-GCG CTT XXX XXX CGC G-5’

ODN6 5407 (calc.) 5413 (obt.) ODN6-P 6637 (calc.) 6646 (obt.)

El procedimiento de Click implicó la adición secuencial de disoluciones de azida 3 (Figura 15) (disolución en DMSO, 10 mM, 50 equiv.), complejo de CuSO4/ligando [29] (disolución en DMSO, 0,05 M, 20 equiv.) y TCEP (disolución acuosa, 15 0,1 M, 40 equiv.) a una disolución 0,2 mM del ODN correspondiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Las muestras se desalaron entonces mediante membrana, y su masa se determinó mediante MALDI-TOF (matriz de HPA)

Ejemplo 7

Amplificación mediante PCR de moldes de ADN con dNTP modificados 20

7.1 Amplificación mediante PCR de polη de levadura

El molde y los cebadores empleados para los experimentos de PCR:

Cebador directo primer 5’-GATTTGGGCCGGATTTGTTTC

Cebador inverso 3’-TTTTATGCTATCTCTGATACCCTTG

Molde: secuencia de 318 pb (nt483-800 de Rad30) de levadura: 25

El molde de 318 pb contiene 59,75% de [A + T] y 40,25% de [C + G].

Se evaluó una serie de polimerasas termoestables comercialmente disponibles en busca de la capacidad para incorporar los trifosfatos de desoxiuridina modificada 2 y 8 (Figura 10) usando la reacción de PCR. Las ADN polimerasas usadas fueron: 5

Pwo y Taq (exo-) ADN polimerasa (Roche)

Vent, Vent (exo-), Therminator polimerasa (de New England Biolabs) Taq (Promega).

Una reacción de PCR típica contenía 0,05 µg de ADN genómico de S. cerevisiae YPH 499 o 0,5 µg de molde de ADN (pDest17-Poleta de levadura [1-1889]), 0,3 mM de cada uno de los cebadores directo e inverso, 1,25 U de polimerasa y 10x tampón de polimerasa con magnesio, 200 µM de cada uno de los dNTP no modificados (dATP, dCTP y dGTP; 10 NEB) y 200 µM de dUTP modificado. Para el control, se usaron trifosfatos naturales (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen global de 50 µl. Los experimentos de PCR se llevaron a cabo en un Eppendorf Mastercycler Personal.

Para la amplificación, se usó un comienzo caliente (2 minutos a 94ºC), seguido de 10 ciclos de amplificación (15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 53ºC, 45 segundos a 72ºC), 25 ciclos (15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC, 45 15 segundos a 72ºC), y una incubación final durante 2 minutos a 72ºC. Los productos de la PCR se analizaron en un gel de agarosa al 2%, tiñendo con bromuro de etidio (Figura 16). Los productos de la PCR se purificaron en un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen), y se usaron para la tinción con plata, secuenciación o digestión. Los productos de la reacción de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% que contiene bromuro de etidio. Los productos se registraron con una cámara Ultra-Violet Products CCD. 20

7.2 Amplificación mediante PCR de polH procedente de ser humano

Una reacción de PCR típica contenía 0,5 µg de molde de ADN (pDest17-plH humano [1-2142]), 0,3 mM de cada uno de los cebadores directo e inverso, 1,25 U de Pwo polimerasa y 10x tampón de polimerasa con magnesio, 200 µM de cada uno de los dNTP no modificados (dATP, dCTP y dGTP; NEB) y 200 µM de dUTP modificado. Para el control, se usaron trifosfatos naturales (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen global de 50 µl. Los 25 experimentos de PCR se llevaron a cabo en un Eppendorf Mastercycler Personal.

Para la amplificación, se usó un comienzo caliente (2 minutos a 94ºC), seguido de 10 ciclos de amplificación (15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 53ºC, 210 segundos a 72ºC), 30 ciclos (15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC, 210 segundos a 72ºC), y una incubación final durante 7 minutos a 72ºC. Los productos de la PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1%, tiñendo con bromuro de etidio. Los productos de la PCR se purificaron en un kit de purificación de 30 PCR QIAquick (Qiagen), y se usaron para la digestión o secuenciación.

Los productos de la reacción de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio. Los productos se registraron con una cámara Ultra-Violet Products CCD. Los resultados se muestran en la Fig. 17.

Para el tratamiento, se añadieron 6 µl de HCl 0,1 M, y las sondas se centrifugaron (6000 rpm, 5 min.). La digestión se 35 analizó mediante HPLC (columna interchim Interchrom Uptisphere 3 HDO (150 x 2,1 mm), Tampón A: 2 mM de TEA/HOAc en H2O; Tampón B: 2 mM de TEA/HOAc en H2O:MeCN 1:4; 0 → 30 min.; 0% → 30% B; 30 →32 min.; 30% → 100% B; 32 → 36 min.; 100% B; 36 → 38 min.; 100% → 0% B; 38 → 60 min.; 0% B; caudal 0,2 ml/min.) (Figura 18). Los diferentes picos se asignaron mediante coinyección, UV y FT-ICR-HPLC-MS-MS, usando las mismas condiciones.

40

7.3 Digestión enzimática de fragmentos (318 mer) de PCR que incorporan un nucleótido mediado por alquino

Para la digestión enzimática, el molde de ADN de 318 pb que contiene el nucleótido modificado 8 (Figura 10) (aprox. 10 µg en 100 µl de agua) se incubó en 10 µl de Tampón A (300 mM de acetato de amonio, 100 mM de CaCl2, 1 mM de ZnSO4, pH 5,7), 22 unidades de nucleasa P1 (Penicilinum citrium) y 0,05 unidades de fosfodiesterasa II de bazo de ternera. La muestra se agitó a 37ºC durante 3 h. La digestión se completó añadiendo 12 µl de Tampón B (500 mM de 5 Tris-HCl, 1 mM de EDTA), 10 unidades de fosfatasa alcalina (CIP) y 0,1 unidades de fosfodiesterasa I de veneno de serpiente (veneno de Crotalus adamanteus). La muestra se agitó durante otras 3 h a 37ºC.

7.4 Procedimiento general para la reacción de ligación de triazol catalizada por Cu(I) de azidas de azúcar con ADNds modificado sobre geles de poliacrilamida

Todos los experimentos de Click se realizaron sobre fragmentos de PCR de 318 pb que comprenden 2 o 8 (Figura 10) 10 en lugar de dTTP. Los fragmentos de PCR modificados se separaron en geles de poliacrilamida al 5%, y después cada gel se colocó en un baño que comprende 1:1 MeOH:H2O (25 ml). Se añadió al baño una disolución de azida de azúcar (0,1 M, 3 ml), seguido de una disolución de CuSO4 (0,1 M, 600 µl), y finalmente TCEP (0,1 M, 1,2 ml). Estas disoluciones se agitaron suavemente a temperatura ambiente toda la noche.

7.5 Procedimiento general para la tinción con plata de azidas de azúcar enlazadas a ADN bicatenario 15

La disolución de Click se decantó, y cada gel se lavó con 1:1 MeOH:H2O (3 x 50 ml, 10 min. cada lavado), seguido de H2O (3 x 50 ml, 10 min. cada lavado). Cada gel se incubó entonces con el reactivo de Tollens* (400 ml) durante 30 minutos. Tras el lavado subsiguiente con H2O (3 x 50 ml, 10 min. cada lavado), los geles se desarrollaron con una disolución desarrolladora que comprende 100 ml de H2O, ácido cítrico (1%, 250 µl) y formaldehído (35%, 80-200 µl). Dependiendo de la concentración de formaldehído, el proceso de desarrollo puede variar de 2 minutos a 20 minutos. 20

* Preparación del reactivo de Tollens: a 80 ml de H2O se añadió AgNO3 (0,5 M, 5 ml), seguido de NaOH (3,0 M, 1,0 ml) y finalmente NH4OH (NH4OH conc.:H2O 1:1, 2,2 ml).

Conclusión

La actual invención propuesta implica un método nuevo y modular para el marcaje específico del sitio de ácidos nucleicos vía la incorporación eficaz de trifosfatos modificados. Estos trifosfatos modificados comprenden grupos que se 25 pueden funcionalizar adicionalmente, marcar o teñir, según las necesidades del usuario. Es previsible igualmente que se pudiese lograr el marcaje de ARN vía estos métodos usando ARN polimerasas y transcriptasa inversa, respectivamente. Por lo tanto, se podría efectuar una detección temprana y eficaz de genomas víricos en un hospedante. El nuevo protocolo dado a conocer del marcaje de ácidos nucleicos es simple, eficaz, sensible y muy selectivo.

Ejemplo 8 (Referencia) 30

Detección de ácidos nucleicos usando procedimientos fotográficos

El procedimiento fotográfico de blanco y negro es uno de los métodos químicos más sensibles conocido. Los fotones capturados sobre papel fotográfico inician la formación de pequeños núcleos de Ag, que catalizan la deposición posterior de plata durante un procedimiento de desarrollo subsiguiente [22]. Esto da lugar a factores de amplificación de señal entre 105 para la reducción química de Ag+ y 1011 para la reducción fotoquímica de Ag+, que son similares a los 35 obtenidos usando la PCR.

Se ha desarrollado un método sensible que utiliza colorantes fotosensibilizadores unidos a ácidos nucleicos, que permite detectar potencialmente un gen particular a una sensibilidad subfemtomolar (Figura 21). Este nuevo método es simple (puede usar materiales fotográficos convencionales), rápido (detección en minutos), eficaz (sólo se requiere una molécula fotosensibilizadora por biomolécula) y sensible (los niveles de sensibilidad no optimizados actuales son ∼10-14-40 10-15 moles). El acoplamiento de esta metodología con herramientas bioquímicas específicas de genes, tales como tecnologías de extensión de cebador y de PCR, proporciona un método nuevo y poderoso para la detección de ácidos nucleicos y otros analitos.

Se investigó un número de derivados colorantes de cianina indolina (1 y 2) y quinolina (3) fluorescentes en busca de su capacidad para actuar como fotosensibilizadores en un proceso fotográfico (Figura 22). Los máximos de absorción 45 visible para 1-3 son 546 nm, 646 nm y 607 nm, respectivamente.

El colorante de indolina (1) se detectó fácilmente hasta los 3 x 10-14 moles (30 fmoles), mientras que el límite de detección de (2) fue aproximadamente 1-3 fmoles (Figura 22a y 22b). Se encontró que la detección del colorante de cianina quinolínico (3) era más sensible (límite de detección – 0,3 fmoles) que los colorantes de indolina (Figura 22c). Se puede producir una niebla de fondo al irradiar con luz intensa; sin embargo, la niebla se puede suprimir usando una 50 fuente de luz infrarroja de baja intensidad, aunque la sensibilidad es en cierto modo menor (Figura 22d-f).

Experimentos de control (Figura 23), que usan oligodesoxirribonucleótidos no modificados (ODN-1, ODN-2, ODN-3), produjeron una pequeña respuesta fotográfica negativa de fondo con irradiación de alta energía a niveles de 50 nmoles (es decir, una diferencia de tres órdenes de magnitud). Los niveles de fondo negativos se pueden suprimir completamente si la irradiación se lleva a cabo con una lámpara de infrarrojos durante 5 minutos (Figura 23b). En resumen, el ADN no modificado no da ninguna tinción.

Entonces se ensayó una serie de diluciones de colorantes comercialmente disponibles Cy5 (λmax = 646 nm, ODN-4) y Cy5.5 (λmax = 646 nm, ODN-5) unidos a los ODN (Figura 16). Se encontró que el límite de detección de ODN-4 era 100 5 fmoles, mientras que la sensibilidad de la detección de Cy5.5 ODN-5 tuvo un factor diez veces mayor (límite de detección 10 fmoles). Por lo tanto, aunque se observó una ligera disminución en la sensibilidad con el colorante de cianina conjugado a los ODN en comparación con sus controles no unidos (Figura 24), los resultados demuestran claramente que la fotografía de biomoléculas conjugadas a fotosensibilizadores, tales como los ODN, se puede usar como una herramienta analítica muy sensible. 10

Los colorantes fotosensibles, por ejemplo los compuestos 4 ó 5, también se pueden introducir en ácidos nucleicos vía química de Click (Figura 25).

Conclusión

Se puede acoplar una metodología fotográfica con los ácidos nucleicos unidos a colorantes fotosensibilizados, para crear un método rápido, simple, eficaz y sensible para la detección de analitos, por ejemplo ácido nucleico. 15

Los ejemplos adecuados de grupos fotosensibilizadores son colorantes de cianina a base de quinolina (por ejemplo 3) o colorantes de indolina (por ejemplo 1 ó 2), como se muestra en la Figura 22, que ofrecen sensibilidades de al menos 10 fmoles (1), 1 fmol (2) o 0,1 fmoles (3).

Los colorantes a base de indolina, tales como Cy5 y Cy5.5, unidos a oligodesoxirribonucleótidos se pueden detectar a niveles de 100 fmoles y 10 fmoles, respectivamente. 20

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Claims (78)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un método para detectar un analito, seleccionado de ácidos nucleicos, en una muestra, que comprende las etapas:

   (i) proporcionar una muestra;

   (ii) poner en contacto la muestra con un compuesto funcionalizado que comprende al menos un grupo funcional 5 seleccionado de grupos alquino y azida que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre los grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol, y en el que el grupo funcional está unido a una nucleobase de un compuesto nucleosídico o nucleotídico o un oligómero o polímero del mismo, en condiciones en las que dicho compuesto forma un producto de asociación con el analito a detectar, o su complemento, 10

   (iii) poner en contacto el producto de asociación con una segunda pareja de reacción para dicha reacción de Click, que comprende el grupo azida o alquino complementario, en condiciones en las que se produce una reacción de Click entre la pareja de reacción primera y segunda, en el que la segunda pareja de reacción comprende además un grupo marcador o un grupo precursor del marcador,

   (iv) si es necesario, convertir los grupos precursores del marcador en grupos marcadores, y 15

   (v) detectar dichos grupos marcadores.
2. 2.-El método de la reivindicación 1, que comprende una detección cualitativa.
3. 3.-El método de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende una detección cuantitativa.
4. 4.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el analito a detectar es un ácido nucleico seleccionado de ADN y ARN. 20
5. 5.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra es una muestra biológica.
6. 6.-El método de la reivindicación 5, en el que la muestra es una muestra agrícola o nutricional.
7. 7.-El método de la reivindicación en el que la muestra es una muestra clínica.
8. 8.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la detección se lleva a cabo directamente sin amplificación. 25
9. 9.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la detección se lleva a cabo en combinación con una etapa de amplificación.
10. 10.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se lleva a cabo una detección de un analito de ácido nucleico específica de una secuencia.
11. 11.-El método de la reivindicación 10, en el que la formación de dicho producto de asociación comprende una reacción 30 de hibridación específica de una secuencia.
12. 12.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la nucleobase se selecciona de bases purínicas y pirimidínicas de origen natural y de origen no natural.
13. 13.-El método de la reivindicación 12, en el que el grupo funcional está unido a la posición 5 y 6, preferiblemente posición 5, de una nucleobase de pirimidina, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente posición 7, de una nucleobase de 35 purina.
14. 14.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el grupo funcional está unido al compuesto vía un enlace directo o un espaciador.
15. 15.-El método de la reivindicación 14, en el que dicho espaciador es un espaciador flexible, o un espaciador al menos parcialmente rígido. 40
16. 16.-El método de la reivindicación 15, en el que el espaciador comprende al menos un grupo seleccionado de grupos alqueno, grupos alquino, grupos cíclicos, particularmente grupos aromáticos y heteroaromáticos, y sus combinaciones.
17. 17.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho compuesto funcionalizado se selecciona de:

    (i) un bloque constructor de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico funcionalizado, y/o 45

    (ii) un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico funcionalizado.
18. 18.-El método de la reivindicación 17, en el que la formación de dicho producto de asociación comprende incorporar dicho bloque constructor funcionalizado en una molécula de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico.
19. 19.-El método de la reivindicación 18, en el que dicho nucleótido o análogo nucleotídico funcionalizado se incorpora enzimáticamente en una molécula de ácido nucleico. 5
20. 20.-El método de la reivindicación 18, en el que la formación de dicho producto de asociación comprende unir dicho ácido nucleico o análogo de ácido nucleico funcionalizado al analito a detectar.
21. 21.-El método de la reivindicación 20, en el que la unión comprende la hibridación a un analito de ácido nucleico.
22. 22.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17-21, que comprende una reacción de extensión de cebador, opcionalmente en combinación con una reacción de amplificación de ácido nucleico. 10
23. 23.-El método de la reivindicación 22, que comprende:

    proporcionar al menos una molécula de cebador que se hibrida, en las condiciones de ensayo, con el analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento, y

    extender dicho cebador,

    en el que se incorpora en el producto de extensión al menos un nucleótido o análogo nucleotídico funcionalizado. 15
24. 24.-El método de la reivindicación 22 ó 23, que comprende:

    proporcionar al menos una molécula de cebador funcionalizada, que se hibrida, en las condiciones de ensayo, con el analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento,

    extender dicha molécula de cebador,

    en el que se forma una molécula de cebador extendida. 20
25. 25.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21-24, que comprende:

    proporcionar una sonda de hibridación funcionalizada, que se hibrida, en las condiciones de ensayo, con el analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento,

    en el que se forma un producto de hibridación.
26. 26.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 19-25, que comprende: 25

    proporcionar una sonda de hibridación funcionalizada, que se hibrida, en las condiciones de ensayo, con el analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento, y

    someter el producto de hibridación a un tratamiento en el que se disuelve un producto de hibridación que contiene al menos un desemparejamiento, en el que la presencia de un producto de hibridación sin disolver indica la presencia y/o cantidad de un ácido nucleico que tiene una secuencia completamente complementaria a la sonda de hibridación. 30
27. 27.-El método de la reivindicación 26, en el que el tratamiento comprende un tratamiento de digestión de los desemparejamientos.
28. 28.-El método de la reivindicación 27, en el que el tratamiento de digestión de los desemparejamientos comprende poner en contacto el producto de hibridación con una glucosilasa de desemparejamiento.
29. 29.-El método de la reivindicación 26, en el que el tratamiento comprende un tratamiento de hibridación difererencial. 35
30. 30.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que la detección se lleva a cabo por medios ópticos.
31. 31.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en el que la detección se lleva a cabo por medios eléctricos.
32. 32.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, que comprende una detección paralela de una 40 pluralidad de ácidos nucleicos.
33. 33.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el que la detección se lleva a cabo sobre una superficie sólida, por ejemplo sobre un chip de una micromatriz.
34. 34.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en el que el grupo funcional se selecciona de grupos azida o grupos alquino.
35. 35.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en el que la segunda pareja de reacción comprende un grupo marcador seleccionado de grupos marcadores ópticamente detectables, particularmente grupos marcadores de fluorescencia, o de grupos marcadores activos para una redox. 5
36. 36.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, en el que la segunda pareja de reacción comprende un grupo precursor del marcador, seleccionado de grupos aldehído y grupos aldehído protegidos, y grupos precursores de aldehído.
37. 37.-El método de la reivindicación 36, en el que la conversión de los grupos precursores de marcadores en grupos marcadores comprende formar deposiciones metálicas alrededor de los grupos aldehído. 10
38. 38.-Un kit de reactivo para detectar un analito en una muestra, que comprende:

    (a) un compuesto funcionalizado que comprende

    (i) al menos un grupo funcional de Click, seleccionado de grupos alquino y azida, que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol, y 15

    (ii) un bloque constructor de un ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico, en el que el grupo funcional está unido a una nucleobase,

    (b) una segunda pareja de reacción para dicha reacción de Click, que comprende el grupo azida o alquino complementario, en el que la segunda pareja de reacción comprende además un grupo marcador o un grupo precursor de marcador, y 20

    (c) opcionalmente un reactivo formador de marcador, capaz de convertir los grupos precursores de marcadores en grupos marcadores.
39. 39.-Uso de un kit de reactivo de la reivindicación 38 en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37.
40. 40.-Uso de un compuesto de fórmula (II):

    C-S-N 25

    en la que

    C es un grupo funcional de Click seleccionado de grupos alquino y azida que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol,

    S es un espaciador, y 30

    N es un bloque constructor de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico, tal como un compuesto nucleosídico o nucleotídico, en el que el grupo funcional de Click se une a una nucleobase,

    en un método para detectar un analito de ácido nucleico en una muestra,

    en el que el compuesto de fórmula (II) forma un producto de asociación con el analito a detectar.
41. 41.-El uso de la reivindicación 40, en el que el compuesto de fórmula (II) se hace reaccionar con una pareja de reacción 35 que comprende grupos marcadores o grupos precursores de marcadores.
42. 42.-El uso de la reivindicación 40 ó 41, en el que la nucleobase se selecciona de bases purínicas y pirimidínicas de origen natural y de origen no natural.
43. 43.-El uso de la reivindicación 42, en el que la nucleobase se selecciona de adenina, 7-desazaadenina, guanina, 7-desazaguanina, citosina, timidina, uracilo, inosina y xantina. 40
44. 44.-El uso de las reivindicaciones 42 ó 43, en el que el grupo funcional se une a las posiciones 5 y 6, preferiblemente a la posición 5, de una nucleobase pirimidínica, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente a la posición 7, de una nucleobase purínica.
45. 45.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, en el que dicho espaciador es un espaciador al menos parcialmente rígido. 45
46. 46.-El uso de la reivindicación 45, en el que el espaciador comprende al menos un grupo seleccionado de grupos alqueno, grupos alquino, grupos cíclicos, particularmente grupos aromáticos y heteroaromáticos, y sus combinaciones.
47. 47.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 46, en el que el compuesto es un bloque constructor para la síntesis química o enzimática de ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos o un precursor de los mismos.
48. 48.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47, en el que el compuesto es un trifosfato de nucleósido, 5 particularmente un trifosfato de nucleósido de ribosa, de 2’-desoxirribosa o de 2’,3’-didesoxirribosa, o un fosforamidito, H-fosfonato o fosforotriésteres de nucleósido.
49. 49.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 48, en el que el compuesto es un bloque constructor para la síntesis de ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos morfolínicos, o ácidos nucleicos bloqueados.
50. 50.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 49, en el que el grupo funcional está unido a la nucleobase vía 10 un espaciador que tiene una longitud de cadena de hasta 10 átomos.
51. 51.-El uso de la reivindicación 50, en el que la longitud de cadena es de hasta 3 átomos.
52. 52.-Una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico, que tiene incorporada en ella al menos un compuesto de fórmula (II) como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 51, en la que el grupo funcional es un grupo alquino unido a las posiciones 5 y 6, preferiblemente a la posición 5, de una nucleobase 15 pirimidínica, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente a la posición 7, de una nucleobase purínica, y en la que la molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico es capaz de hibridarse con un ácido nucleico complementario.
53. 53.-La molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico de la reivindicación 52, que es un ácido nucleico seleccionado de ADN y ARN, o una molécula de un análogo de ácido nucleico seleccionada de ácidos nucleicos 20 peptídicos, ácidos nucleicos morfolínicos o ácidos nucleicos bloqueados.
54. 54.-Un método para sintetizar una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico complementario, que comprende incorporar un bloque constructor de nucleótido o de un análogo de nucleótido que comprende un compuesto (II) de una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 51, en el que el grupo funcional es un grupo alquino unido a las posiciones 5 y 6, preferiblemente a la posición 5, de una nucleobase 25 de pirimidina, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente posición 7, de una nucleobase de purina, en una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico.
55. 55.-El método de la reivindicación 54, que comprende una síntesis química y/o una síntesis enzimática.
56. 56.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones 54 a 55, que comprende además poner en contacto la molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico con una segunda pareja de reacción del compuesto (II), y llevar a 30 cabo una reacción de Click entre las parejas de reacción primera y segunda, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol.
57. 57.-Un producto de asociación molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 52 a 53 con un analito.
58. 58.-El producto de la reivindicación 57, que es un producto de hibridación con un ácido nucleico complementario. 35
59. 59.-Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o del kit de reactivo de la reivindicación 38, para aplicaciones agrícolas.
60. 60.-El uso de la reivindicación 59, para detectar ácidos nucleicos de plantas, patógenos vegetales o plagas de plantas tales como insectos.
61. 61.-El uso de las reivindicaciones 59 ó 60, para detectar variabilidades genéticas, por ejemplo SNP en plantas, 40 patógenos vegetales o plagas de plantas.
62. 62.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 61, para detectar o monitorizar resistencias, tolerancias o intolerancias a herbicidas, fungicidas o plaguicidas, por ejemplo resistencias, tolerancias o intolerancias a plaguicidas en hongos, insectos o plantas.
63. 63. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 62, para genotipar, por ejemplo para detectar y/o diferenciar 45 especies o cepas de hongos, insectos, o plantas.
64. 64.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 63, para detectar y/o diferenciar organismos o cepas genéticamente modificados, por ejemplo organismos o cepas de hongos, insectos o plantas.
65. 65.-Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o del kit de reactivo de la reivindicación 38, para aplicaciones de diagnóstico y forenses. 50
66. 66.-El uso de la reivindicación 65, para detectar variabilidades genéticas, por ejemplo SNP en seres humanos.
67. 67.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 66, para detectar resistencias, tolerancias o intolerancias, o alergias a medicamentos.
68. 68.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 66, para genotipado.
69. 69.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 68, para detectar organismos o cepas genéticamente 5 modificados, por ejemplo organismos o cepas de bacterias o virus.
70. 70.-El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 69, para diagnosticar enfermedades, por ejemplo enfermedades genéticas, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunitarias o enfermedades infecciosas
71. 71.-Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o el kit de reactivo de la reivindicación 38, para detectar la función y/o expresión de genes. 10
72. 72.-Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o el kit de reactivo de la reivindicación 38, para la protección de marcas.
73. 73.-El uso de la reivindicación 72, para detectar información específica codificada en productos.
74. 74.-El uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o del kit de reactivo de la reivindicación 38, para aplicaciones nutricionales, particularmente en el área de los piensos. 15
75. 75.-El uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o del kit de reactivo de la reivindicación 38, para un análisis epigenético.
76. 76.-El uso de la reivindicación 75, para el análisis de un patrón de metilación de ADN.
77. 77.-Un compuesto, obtenible como el producto de reacción del método de la reivindicación 56.
78. 78.-Un producto de asociación del compuesto de la reivindicación 77 con un ácido nucleico complementario. 20